DE2708112C3

DE2708112C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Protein

Info

Publication number: DE2708112C3
Application number: DE19772708112
Authority: DE
Inventors: Masahiro Hamada; Tamotsu Kano; Katsuhisa Ohsugi; Daizo Takeuchi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1977-02-25
Filing date: 1977-02-25
Publication date: 1979-11-29
Also published as: DE2708112B2; DE2708112A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Protein und dessen Verwendung als Nahrungs- und Futtermittel.

Der zunehmende Bedarf an Protein hat zur Entwicklung zahlreicher mikrobiologischer Züchtungsverfahren geführt, mit denen aus Nährlösungen und Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquellen Proteine erzeugt werden.

Die Verwendung von Normalpraffinen als Kohlenstoffquellen für mikrobiologisches Wachstum ist jedoch mit vielen Nachteilen verbunden, wie Unlöslichkeit der Paraffine im Kulturmedium, starke Wärmeerzeugung, Entfernung bedenklicher Substanzen, wie z. B. von 3,4-Benzpyren und Schwierigkeiten bei der Isolierung der Mikroorganismenzellen. Andere Kohlenstoffquellen wie Essigsäure, Äthanol und Abfallprodukte aus der Verarbeitung von landwirtschaftlichen und Fischereiprodukten bringen hinsichtlich Kosten und Vorratshaltung Schwierigkeiten mit sich. Methan und Kohlendioxid stehen zwar als Kohlenstoffquellen im Überfluß bei niedrigen Kosten zur Verfügung, haben jedoch den Nachteil, daß die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen unbefreidigend ist und die Kosten für die Produktionsanlagen wegen des gasförmigen Zustandes dieser Verbindungen hoch sind.

In jüngster Zeit wurde festgestellt, daß für die Erzeugung von Mikroorganismenwachstum Methanol nicht die obengenannten Schwierigkeiten ergibt und sich daher sehr gut als Kohlenstoffquellen eignet, zumal Methanol in großem Maßstab aus Petroleum, Kohle und Erdgas gewonnen werden kann, als beständiger Vorrat zur Verfugung steht; Methanol ist außerdem in Wasser löslich und eignet sich ausgezeichnet als Kohlenstoffquellen für das Kulturmedium von Mikroorganismen.

Typische Beispiele für Mikroorganismen, die Methanol als Kohlenstoffquellen zu assimilieren vermögen, sind Schimmelpilze, Hefen und Bakterien. Jedoch ist die Wachstumsgeschwindigkeit von Schimmelpilzen und Hefen geringer als die von Bakterien, außerdem erfordern Hefen für ihr Wachstum kostspielige Materialien, so daß sie für die wirtschaftliche Herstellung von Mikroorganismenzellen ausscheiden. Schimmelpilze und Hefen weisen auch einen geringeren Gehalt an Rohprotein sowie einen geringeren Gehalt an

ίο schwefelhaltigen Aminosäuren im Zellprotein als Bakterien auf, was die Ernährungsqualität der erhaltenen Mikroorganismenzellen vermindert

Es sind bereits verschiedene Bakterienarten, die als Kohlenstoffquellen Methanol verwerten, bekannt wie z.B. »Preparation of Cells by Use of Bacteria Belonging to Pseudomonas«, von Kono und Mitarbeitern (Collection of Summaries of Lectures at Japan Agricultural Chemistry Society Congress lH-23, 1970); »Production of Cells by Use of Achromobacter methanolophia and Pseudomonas insneta«, von K u ras a w a und Mitarbeiten! (Collection of Summaries of Lectures at Japan Agricultural Chemistry Society Congress 41-31, 1970) und »Production of Cells Using Pseudomonas methanolica, von Terui und Mitarbeitern (Collection of Summaries of Lectures at Japan Agricultural Chemistry Society Congress 2E-07, 1971). Ferner ist aus der DE-OS 24 02 217 die Verwendung von verschiedenen Stämmen von Pseudomonas utilis und Pseudomonas inaudita bekannt; die Produktivität dieser Stämme ist jedoch gering. Letztlich ist aus der DE-OS 24 58 851 der Einsatz eines Bakteriums Methylomonas sp DSM 580 bekannt dessen Produktivität ebenfalls zu wünschen übrig läßt und nur bei hohen Rührgeschwindigkeiten mit Hochleistungsrührern an-

H nehmbare Werte erreicht.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Proteinen vorzuschlagen, bei dem Methanol als Kohlenstofflieferant eingesetzt werden kann, hohe

-to Ausbeuten erzielt werden, der Einsatz von Hochleistungsrührern nicht erforderlich ist und ein gut verträgliches Eiweißprodukt erhalten wird.

Die Erfindung beruht darauf, daß bei der Suche nach Bakterien, die sich unter Verwendung Methanol zu

4^r> vermehren vermögen, eine neue Bakterienart isoliert wurde, die eine außerordentlich wirksame Verwertung von Methanol ermöglicht, eine sehr hohe Wachstums· geschwindigkeit besitzt und reich an Zellprotein ist. Die neue Bakterienart erhielt die Bezeichnimg Methylomonas probus NB-2000 und wurde mit der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3193 am 14 August 1975 beim Fermentation Research Institute of Agency, Industrien Science and Technology (Chiba-shi, Japan) hinterlegt.
Zur Lösung der obigen Aufgabe wird daher ein

5) Verfahren zur Erzeugung von proteinreichen Mikroorganismenzellen vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Methylomonas probus FERM-P Nr. 3193 in einem anorganische Nährstoffe sowie Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium

to züchtet und dann die gebildeten Zellen abtrennt und sammelt.

Methylomonas probus FERM-P Nr. 3193 hat die folgenden Eigenschaften:

a) Morphologische Eigenschaften

(I) Form und Größe der Zellen:

Ein einzelner oder 2 bis 3 Kcttenbazillus mil einer Größe von 0,5 bis 0,7 χ 1,0 bis 1,5 u.

27 08 3	3	112 4
(2) Polymorphe Formen der Zellen;		(9) Pigmentbildung;
Keine,		In King-Kulturmedien A oder B wird kein
(3) Beweglichkeit;		Farbpigment erzeugt Eine geringe Menge wasser
Beweglich mit einzigem polarem Bewegungsorgan.		lösliches gelbes Pigment wird bei Verwendung
(4) Sporen;	10	eines synthetischen flüssigen anorganischen Salz-
Nicht-sporentragend		Mediums freigesetzt Die gebildeten Bakterienzel
(5) Gram-Farbreaktion:		len sind gräulich-rosa.
Gram negativ		(10) Assimilierung von Stickstoffquellen:
		Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, primäres
Die Prüfung der obengenannten morphologischen	15	Ammoniumphosphat, sekundäres Ammonium
Eigenschaften erfolgte an Zellen, die in einem		phosphat Harnstoff, Ammoniumnitrat Ammoni
synthetischen anorganischen Salz-Medium (1) bei 30⁰C		umcarbonat und Polypepton werden in anorgani
24 bis 48 Stunden gezüchtet worden waren. Die		schen Nährlösungen als Stickstoffquelle gut assimi
Zusammensetzung dieses Medium ist später angegeben.		liert
	20	Nitrat Nitrit Methylamin, Casamlnosäure und
(6) Säurebeständigkeit:		Hefeextrakt werden ebenfalls assimiliert, jedoch ist
— (minus)		der Assimilierungsgrad dieser Substanzen verhält
		nismäßig gering.
b) Wachstum in Kulturmedien		(11) Urease +
	25	(12) Oxidase +
(ί) Agarplatte mit synthetischem anorganischem SaIz-		(13) Katälase +
Medium(l):		(14) Wachstumsbedingungen:
Das erfindungsgemäße Bakterium wächst reichlich		PH 5,3 bis 9,1; optimaler PH-Bereich 6,3 bis 7,0.
und bildet glatte vollständige und konvex kreisför		Temperatur 15 bis 41°C, optimaler Temperaturbe
mige Kolonien. Die Kolonien sind halbdurchsichtig	JO	reich 35 bis 37° C.
und glänzen. Die Farbe ist gräulich-weiß oder rosa.		(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff:
(2) Agar-Schrägnährboden mit synthetischem anorga		Aerob.
nischem Salz-Medium (1):		(16) O-F-Test(Hugh Leifson-Methode):
Mittleres Bakterienwachstum. Die gebildeten Ko		Keine Erzeugung von Gas und Säure.
lonien sind fadenförmig und glänzend. Die Farbe ist	Jj	(17) Assimilierung von
gräulich-weiß oder rosa. Es wird kein diffundieren		p-Hydroxybenzoat: —
des Pigment gebildet		(18) Ammoniakbildung: —
(3) Bouillon-Agarplatte:		(19) Zuckerfermentierung:
Kein Wachstum oder nur sehr geringes Wachstum.		Keiner der nachfolgend aufgeführten Zucker war
Falls sich ein geringes Wachstum öildet, sind die	40	nicht fermentierbar (nach 30tägiger Beobachtung
gebildeten Kolonien weniger als 0,5 mm groß		einer Peptonlösung der jeweils 1% der angegebe
(48stündige Kultivierung bei 30⁰C). Die Kolonien		nen Zucker zugefügt war):
sind glatt, kreisförmig, glänzend und transparent.		L-Arabinose
(4) Bouillon-Agarschrägnährboden:		D-Xylose
Kein Wachstum oder nur geringes Wachstum. Im	4 j	D-Glucose
letzeren Fall ist die gebildete Kolonie fadenförmig		D-Mannose
und transparent.		D-Fruktose
(5) Flüssige Bouillon:		D-Galactose
Kein Wachstum.		Maltose
(6) Festes Bouillon-Gelatine-Medium:	■50	Saccharose
Kein Wachstum, die Gelatine wird nicht verflüssigt.		Lactose
(7) Lackmus-Milch (Lackmus-Milch, mfd.-Proben von		Trehalose
der Difco Inc.):		L-Rhamnose
Keine Veränderung. Auch die Zugabe von 1%		Mannit
Methanol verursacht keine Veränderung.	55	Sorbit
		Glycerin
		S'ärke
c) Physiologische Eigenschaften		(20) Assimilierung verschiedener Kohlenstoff quellen:
		Methanol 0,5 +
Da in herkömmlichem Medium kein ausreichendes	(iO	Äthanol 0,5
Wachstum erfolgte, wurde in den folgenden Tests (1) bis		n-Propanol 0,5
(8) ein herkömmliches Medium mit 1% zugefügtem		Isopropanol 0,5
Methanol verwendet.		n-Butanol 0,5
		Natriumformiat 0,01
I (1) Nitratreduktion +		Formaldehyd 0,01
(2) Dcnitrifizierung -		Natriumacetat 0,5
I (3) VP-Test		Natriumlactat 0,5
;. (4) MR-Test		Natriumsuccinat 0,5
'f.- (5) Indolbildung -	Natriumpyruvat 0,5
f (6) H₂S-Bildung	Monomethylamin 0,5 +
ί (7) Stärke-Hydrolysierung -	Methan
ta (8) Assimilierung von	(belüftet mit I : 1
ft. Zitronensäure	Luft-Methan-Gemisch)

n-Tetradecan

n-Hexadecan

n-Octadecan

Arabinose

Glucose

Fructose

Galactose

Maltose

Saccharose

Lactose

Rhamnose

Mannit

Sorbit

Stärke

Natriumalginat

Phenol

Pepton

Casaminosäure Hefeextrakt

Indol

Nährbrühe

0,5

0.5

0,5

0,01

0,5

Jede der obengenannten Substanzen wurde in der angegebenen Menge zu dem nachfolgend angegebenen synthetischen anorganischen Salz-Medium (1) gegeben, aus dem der Methylalkohol weggelassen worden war. Das Bakterienwachstum wurde 30 Tage lang beobachtet Diejenigen Substanzen, die zu einem feststellbaren Grad an Bakterienwachstum führten, wurden mit einem Pluszeichen versehen.

Zusammensetzung des synthetischen anorganischen Salz-Mediums (1)

(NH₄J₂HPO₄ KH₂PO₄ K₂HPO₄ MgSO₄ · 7 H₂O CaCI₂ · 2 H₂O FeSO₄ · 7 H₂O Methanol Wasser

34 g 14g 14g 03 g 0,01g 0,01g 2% (V/V) 11

Vergleicht man die oben beschriebenen bakteriologischen Eigenschaften mit »Berge/s Manual of Determinative Bacteriology, Band 8«, so stellt man fest, daß das erfindungsgemäße Bakterium zur Gattung Methylomonas gehört Nach dem gleichen Handbuch existieren drei Gattungen Methylomonas Bakterien, nämlich Methylomonas methanica, Methylomonas methanoloxidans und Methylomonas methanitrificans. Aus den oben aufgeführten verschiedenen Eigenschaften ergibt sich jedoch, daß das erfindungsgemäße Bakterium zu keiner dieser Gattungen gehört. Das erfindungsgemäße Bakterium unterscheidet sich von den bekannten analogen, Methanol-verwertenden, Protein-Iiefernden Bakterien in den folgenden Punkten.

Das erfindungsgemäße Bakterium unterscheidet sich von Pseudomonas utilis (offengelegte japanische Patentanmeldung 93 589/1974) in der Wachstumstemperatur, der optimalen Wachstumstemperatur sowie in der Ureasebildung (-) und in der Pigmentbildung (-).

Das erfindungsgemäße Bakterium unterscheidet sich auch von Pseudomonas inaudita (offengelegte japanische Piitentanmeldung 93 589/1974) in der optimalen Wachstumstcnineratur um 2 bis 10° C, ferner hinsichtlich der Pigmentbildung (-) und der Verwertung von p-Hydroxybenzoat Ebenso unterscheidet sich das erfindungsgemäße Bakterium von Methylomonas methanoiica nov. Sp, (T e r u i und Mitarbeiter in Journal of Fermentation Technology, Band 53, Seite 315,19/5) im Wachstumstemperaturbereich, der optimalen Wachstumstemperatur dem pH-Bereich des Wachstums, der Farbe der Kolonien und der Fähigkeit, Monomethylamin in eine brauchbare Ernährungsquelle umzuwandeln.

Das erfindungsgemäße Bakterium ist auch von ίο Melhylomonas methanolica verschieden (offengelegte japanische Patentanmeldung 1 03 795/1973), nämlich in der Farbe der Kolonie auf dem synthetischen anorganischen Salz-Medium und auch darin, daß das erfindungsgemäße Bakterium lebhaft selbst in 40° C Sekundärkulturen wächst, und daß die optimale Wachstumstemperatur um 5 bis 7°C höher ist als die für das bekannte Bakterium. Die Tatsache, daß die. optimale Wachstumstemperatur für das erfindungsgemäße Bakterium 5 bis 7⁰C höher ist als die für das andere bekannte Bakterium, stellt einen anerkannten wesentlichen Unterschied sowohl in mikrobiologischer Hinsicht als auch im Hinblick auf eine wirksame Kühlung bei der Erzeugung der Bakterienzellen dar.

Das erfindungsgemäße Bakterium unterscheidet sich auch von den von Whittenbury und Mitarbeitern in J. Gen. Microbiol. Band 61, Seite 205 (1970) beschriebenen Bakterien, z. B. Methylomonas albus, Methylomonas methanica, Methylomonas agile und Methylomonas rubrun, da alle diese Bakterien Methan assimilieren und ihre spezifische maximale Wachstuimgeschwindigkeit (μ max) mit Methanol in der Größenordnung von 0,17 bis 0,23 Stunden-' liegt, während das erfindungsgemäße Bakterium Methan nicht zu assimilieren vermag und die spezifische maximale Wachstumsgeschwindigkeit μ max mit Methanol 0,82 Stunden - ■ beträgt, bzw. mehr als das Doppelte der Wachstumsgeschwindigkeit der bekannten Bakterien.

Aus diesen Gründen kann man berechtigterweise schließen, daß das erfindungsgemäß verwendete Bakterium eine neue Art von Methylomonas-Bakterien ist.

Das für die Kultivierung der erfindungsgemäß verwendeten neuen Bakterienart eingesetzte Medium kann aus jedem wäßrigen Medium bestehen, das üblicherweise für die Kultivierung von Bakterien eingesetzt wird, vorausgesetzt, Methanol wird als Kohlenstoffquelle verwendet. Das Medium kann außer der Kohlenstoffquelle Stickstoff und anorganische Nährstoffquellen enthalten.

Die Methanolkonzentration des Mediums kann sich über einen weiten Bereich erstrecken, von einer niedrigen Konzentration bis zu einer hohen Konzentration von etwa 4%, um eine zufriedenstellende Wachstumsgeschwindigkeit des Bakteriums zu erzielen. Die Wachstumsgeschwindigkeit sinkt jedoch allmählich ab, wenn die Methanolkonzentration 4% überschreitet. Da die Methanolkonzentration im Medium mit fortschreitendem Bakterienwachstum absinkt, kann, falls notwendig, wahrend der Züchtungsperiode dem Medium Methanol zugefügt werden.

Die Kultivierung und Vermehrung der Bakterienzellen gemäß der Erfindung erfolgt unter aeroben Bedingungen bei pH 53 bis 9,1 und vorzugsweise 63 bis 7,0 bei einer Temperatur von 15 bis 41 'C, vorzugsweise 35 bis 37⁰C. Eine bevorzugte Menge Bakterienzellen kann in etwa 48 Stunden nach Beginn der Kultivierung erhalten werden. Die Ausbeute steigt, wenn die Belüftungsgeschwindigkeit während der Kultivierung erhöht wird. Da eine hohe Kultivierunestemoeratur.

maximal 41'C. angewandt werden kann, ist die Kühlcffizienz beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Bakterienzellen höher als bei anderen bekannten Verfahren dieser Art.

Der Gehalt an Rohprotein in den erfindungsgemäß ■■ erhaltenen Bakterienzellen kann bis zu 80% betragen und, wie aus den nachfolgenden Beispielen hervorgeht, haben diese Bakterienzellen hohen Nährwert und sind nicht toxisch, so daß sie bei ihrer Einmischung im NarKungs- und Futtermittel ausgezeichnete Protein- m quellen darstellen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

3.0 g (Nm)₂HPO₁. 1.SgKH₂PO₁. 1.SgK₂HPO₄. ι -, 0.5 g MgSO₄ · 7 H₂O und 0.1 g FeSO₄ · 7 H₂O wurden in I I lonenaustauschwasser zu einer Lösung gelöst (pH: 7.0). worauf man jeweils 100 ml dieser Lösung in 300 ml konische Flaschen emiüiiie, (Jenen ιιΐίΐιι nach uei Sterilisation 1,6 g Methanol zufügte. Dann wurde jedes _>o der so hergestellten Kulturmedien mit Methylomonas probus FFRM-P Nr. 3193 beimpft und 2 Tage bei 30⁰C geschüttelt. Der Impfstoff war auf einem Agar-Schrägnährboden der gleichen Zusammensetzung wie oben hergestellt worden. Nach der Kultivierung wurden die .?> Bakterienzellen in einem Zentrifugalabscheider gesammelt, darauf mit lonenaustauschwasser gewaschen und bei 11OC getrocknet, bis das Gewicht konstant war. Man erhielt 7.2 g trockene Zellen je Liter der Kulturlösung. Damit betrug die Ausbeute 45,0%. jn bezogen auf das zugefügte Methanoi.

Beispiel 2

Durch Zugabe von 200 ml Methanol (1,0% V/V) in ein 30 I Fermentationsgefäß, das 20 I einer Lösung (pH: 7,0) j-, aus 4.0 g (NH₄J₂HPO₄. 1.0 g KH₂HPO₄. 1,0 g K₂HPO₄. 0.5 g MgSOi 7 H₂O und 0.1 g FeSO₄ · 7 H₂O in 1 I lonenaustauschwasser enthielt, wurde ein Kulturmedium hergestellt. Nach der Sterilisation wurde mit 2% (V/V) mit im gleichen Medium gezüchtetem Methylo- 4<> monas probus FF.RM-P Nr. 3193 beimpft und die Knltivieninp hpi IVC nntpr Riihrpn mit pinpr Geschwindigkeit von 500 U/min und unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 30 1/20 l/Min (1.5 V/V/ Min) 48 Stunden durchgeführt, wobei man die .n Belüftungsgeschwindigkeit allmählich von der zuvor genannten Geschwindigkeit auf 40 1/20 l/Min (2,0 V/V/ Min), dann auf 50 1/20 l/Min (2.5 V/V/Min) und schließlich auf 60 1/20 l/Min (3.0 V/V/Min) erhöhte. Während der Kultivierung wurde der pH-Wert mit 14%igem Ammoniakwasser aut-matisch aus 6,6 bis 7,2 gehalten, und Methanol automatisch in der Weise zugeführt, daß es. wie gaschromatographisch festgestellt wurde, in einer Menge von 0.3 bis 1,0% verbraucht wurde.

Nach der Kultivierung wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gesammelt, mit lonenaustauschwasser gewaschen und bei i!0°C getrocknet, bis das Gewicht konstant war. Nach 28stündiger Kultivierung wurden trockene Bakterienzellen in einer Ausbeute von 25,0 g/l. nach 40 Stunden in einer Ausbeute von 40,7 g/l und nach 48 Stunden in einer Ausbeute von 53,8 g/l erhalten.

Beispiel 3
Die folgenden Substanzen:

MgSO₄ ■ 7 H₂O	0.7 g
MnSO₄ · 4-6H₂O	0,01 g
CuSO₄ ■ 5 H₂O	0,01 g
CoCI₂ ■ 6 H₂O	0.01 g
(NH₄J₂SO₄	0,8 g
K₂HPO₄	1.0 g
FeSO, 7 H₂O	0,1 g
ZnSO₄ ■ 7 H₂O	0,01 g
CaCI₂ ■ 2 H₂O	0.01 g
(NH₄J₆Mo₇O₂₄ · 4 H₂O	0,01 g

(NH^)₂HPO₄
KH₂PO₄

4g

wurden in den angegebenen Mengen in lonenaustauschwasser unter Erzielung von 1-l-Lösungen gelöst, 201 dieser Lösung wurden in ein 30 I Fermentationsgefäß gegeben, und nach 15 Minuten langer Sterilisation bei 120''C wurde Methanol in einer Menge von 2% (V/V) zur Herstellung eines Kulturmediums zugegeben. Dieses Medium wurde mit einer Kulturlösung von *vleiliy!uiMUiiah |>iuuu;> FERm-" Ni. ji'-tj tii ciüci Menge von 2% (V/V) beimpft. Der Impfstoff war durch 18 Stunden langes Kultivieren als Schüttelkultur im gleichen Medium wie oben (Methanolgehalt: 1,0% (V/V)) erhalten worden. Dann wurde 28 Stunden bei 37⁰C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 500 U/Min und unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 30 1/20 l/Min (1,5 V/V/Min) kultiviert, wobei man den pH-Wert des Mediums automatisch mit 14%igem Ammoniakwasser auf 6,6 bis 7,2 hielt.

Da mit fortschreitendem Wachstum der Bakterien das Methanol verbraucht wird, wurde die Methanolkonzentration in der Kulturlösung gaset.romatographisch gemessen und Methanol kontinuierlich über eine Mikroabgabepumpe in der Weise zugeführt, daß die Methanolkonzentration während der Kultivierung auf 0.3 bis 2,0% (V/V) gehalten wurde. Insgesamt wurden 1,035 g Methanol bis zum Abschluß der Kultivierung zugefügt.

Die erzeugten Bakterienzellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, abgetrennt und nach dem Waschen mit lonenaustauschwasser bei 110°C getrocknet, bis das Gewicht konstant war. Man erhielt 25,6 g trockene 7p 11 pn ip I itpr K πΙίιιΗηςιιησ Damit hptrncr Hip Aiishpiitp

49,5%, bezogen auf das zugefügte Methanol.

Der Gehalt an Rohprotein betrug 803% (N% χ 6,25).

Die Geschwindigkeit des Bakterienwachstums wurde durch Messung der Trübung der Kulturlösung mit einem Colorimeter festgestellt (610 ιημ). Die maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit betrug 0,82 Stunden-' und die Generationszeit 51 Minuten.

Beispiel 4

Bakterien des gleichen Stammes wie in den vorstehenden Beispielen wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 kultiviert. Da die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Kultur mit fortsenreitendem Zellwachstum absinkt, wurde die mittlere Belüftungsgeschwindigkeit auf 40 1/20 l/Min (2,0 V/V/Min), dann auf 50 1/20 l/Min (2,5 V/V/Min) und schließlich auf 60 i/20 l/Min (3,0 V/V/Min) erhöht. An dem Punkt, an dem die Zellkonzentration (Xg/l) in der Kulturlösung 43,6 g/l erreicht hatte, wurde die zunächst chargenweise durchgeführte Kultivierung in eine kontinuierliche Kultivierung übergeführt, indem man kontinuierlich das gleiche Medium, wie es für die chargenweise Kultivierung verwendet worden war, in einer Verdünnungsgeschwindigkeit (D: Std.~') von 0,28 Stunden-' in die Kulturlösung einführte, wobei man gleichzeitig die gleiche Menge der Kulturlösung aus'

10

dem Fermentationsgefäß abzog. Der pH-Wert des Mediums wurde automatisch mit I4%igem Ammoniakwasser auf 6,6 bis 7,2 gehalten. Das mit fortschreitender Zellproduktion verbrauchte Methanol wurde automatisch in der Weise ergänzt, daß die Methanolkonzentration in der Kulturlösung stets auf 0,3 bis 1,0% (V/V) gehalten wurde, wie man durch Gaschromatographie fesioiRllte. Die kontinuierliche Kultivierung verlief mit einer außerordentlich hohen Produktivität von D ■ X= 8,1 g/l · Std.

Die folgenden Beispiele 5 bis 10 veranschaulichen die Beziehung zwischen der Belüftungsgeschwindigkeit und der Zellproduktion im erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 5

Bakterien des gleichen Stammes wie in Beispiel 3 wurden unter den gleichen Bedingungen wie in diesem Beispiel gezüchtet. Die kontinuierliche Kultivierung bei einer Beiuftungsgeschwindigkeit von 3ö i/2ö i/Min (1,5 V/V/Min) ergab eine Produktivität von 4,2 g/l · Std.

Beispiel 6

Die mit Bakterien des gleichen Stammes und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 40 1/20 l/Min (2,0 V/V/ Min) kontinuierlich durchgeführte Kultivierung führte zu einer Produktivität von 5,6 g/l · Std.

Beispiel 7

Die in gleicher Weise wie in Beispiel 3 bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 50 1/20 l/Min (25 V/V/ Min) kontinuierlich durchgeführte Kultivierung ergab eine Produktivität von 7,3 g/l · Std.

Beispiel 8

Bei einer mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 60 1/20 l/Min (3,0 V/V/Min) kontinuierlich durchgeführten Kultivierung betrug die Produktivität 8.1 g/l · Std.

Beispiel 9

Die kontinuierliche Kultivierung wurde mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 80 1/20 I/Min (4,0 V/V/ Min) mit Bakterien des gleichen Stammes unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 durchgeführt. Die Produktivität betrug 9,3 g/l · Std.

Beispiel 10

Führte man die kontinuierliche Kultivierung bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 100 1/20 l/Min (5 V/V/ Min) in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 durch, so erzielte man eine überraschend hohe Produktivität von 12.2 g/l · Std.

Beispiel 11

Unter Verwendung von Methylomonas probus FERM-P Nr. 3193 Zellen, die nach den obigen Verfahren erhalten worden waren, wurden Ritterungstests an mannlichen Ratten durchgeführt:

Als Versuchstiere wurden fiO Wistnr- K.it; 'Π (i Wochen alt) verwendet, an die das folgende Grundfutter verfüttert wurde:

Vitaminfreies Casein	12.0%
Zucker	5,O¹Vo
Sojabohnenöl	6,0%
Vitamin B Gruppe	0,3%
Na₂SeO,	0,2 ppm
Maisstärke	61,0%
Zellulosepulver	11.5%
Vitamin A und D	0,2%
Mineralstoffe	4,0%

Nachdem man die Ratten 5 Tage lang mit dem Grundfutter gefüttert hatte, wurden sie in drei Gruppen von je 20 Tieren unterteilt. Die Ratten der ersten Gruppe erhielten als Kontrollgruppe weiterhin das Grundfutter, während die anderen beiden Gruppen in die Testgruppe I und die Testgruppc 11 unterteil·, wurden. Die Ratten der Testgruppe I erhielten das Grundfutter, aus dem das vitaminfreie Casein (12,0%) weggelassen worden war, und 20% erfindungsgemäßen trockenen Bakterienzellen, während die Ratten der Testgruppe II das Grundfutter erhielten, aus dem 6.0% des vitaminfreien Caseins weggelassen worden waren und dem man 10% der trockenen Bakterienzelle", zugefügt hatte.

Ar» r\\e* P-»Mert Ae*r HrAI nAr.anntPIl ΓΊπΐηηΡΠ U/ΙΙΓίΙρΠ . ... _._ . -_ .. . _. -- _o- - , ,

die vorstehend genannten Futtermittel 5 Wochen lang verfüttert, wobei man das Körpergewicht und die Futteraufnahme der Ratten der einzelnen Grupper, während dieser Zeit feststellte. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt.

Tabelle

	Körpergewicht	Durchschnitt	durchschnittliche	Futter	durchschnitt
	Durchschnitt	nach 5 Wochen	Körpergewichts	durchschnittliche	licher Futter
	zu Beginn		zunahme	Futteraufnahme	bedarf
		(g)	(g)		Cg)
	(g)	175,2 ±16,6	115,3±17,O	(g)	4.20 ±0,41
Kontrolle	59.9 ±3,0	175,5± 1,45	II 5,4 ±14,9	484,8	4,04+0,34
Testgruppe I	60,1 ±3,1	176,3 + 15,5	116,5 + 15,4	466,1	4,01 ±0.31
Testgruppe II	59,8 ±3,0		467,2

Vergleicht man die Ratten der Testgruppen I und II 65 im äußeren Erscheinungsbildung und der Bewegliehkeit

mit denen der Kontrollgruppe, so stellt man überhaupt fest, z. B. im Glanz des Felles und der Lebhaftigkeit,

keinen Unterschied in der Zunahme des Körperge- Auch die nach dem Test durchgeführte Sezierung der

wichts. der Futteraufnahme und im Futterbedarf sowie inneren Organe zeigte absolut keine Abnormität und

11 12

damit die ausgezeichnete Verträglichkeit der erl'in- Ferner wurde di^p Produktivität in Abhängigkeit von

dungsgemäß erzeugten Bakterienzellen als Proteinquel- der Rührgeschwindigkeit wie folgt festgestellt: Ie für Nahrungs- und Futtermittel.

Vergleichsbeispiel .

A. Es wurde die Produktivität an Zellen einmal gemäß Verfahren Rührgeschwindig- Produktivität

Erfindung (Beispiel 10) und zum Vergleich gemäß keit

DE-OS 24 02.?17 bestimmt, wobei mit den vorbe- U/min g/l/h

kannten Bakterien der Pseudomonas-Stämme nur

eine Ausbeute von 6,99 g/Liter/h gegenüber 12,2 g/ in
Liter/h erhalten wurde. DE-OS 24 58 851

B. Es wurden die Produktivitäten und Riihrgeschwin- Beispiel 1 300 6,48

digkeiten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfah- Beispiel 3 1200 0,8

ren und zum Vergleich gemäß DE-OS 24 58 851 Beispiel 2 1800 14,0

wie folgt bestimmt: r> Gemäß Erfindung

Beispiel 3 500 25,6

Verfahren Produktivität h Protein- ^BeisP^{iel l0 50}° ¹²·²

Trockenzellen konzentration

in g/l

Diese Vergleiche zeigen eindeutig die bessere

DE-OS 24 58851 14,0g 25 60-76 Gew.-% Produktivität, die höhere Eiweißkonzentration und den

(Beispiel 2) geringeren Rühraufwand des erfindungsgemäßen VerErfindung 25.6g 28 —80 Gew.-% fahrens gegenüber dem nächstliegenden bekannten

(Beispiel 3) _>-> Verfahren gemäß DE-OS 24 58 851.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Protein, dadurch gekennzeichnet, daß man Methylomonas probus FERM-P Nr. 3193 in einem Methanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoff und anorganische Nährstoffe enthaltenden Medium unter aeroben Bedingungen züchtet und die so erzeugten Bakterienzellen abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung unter Belüftung bei einer Temperatur von 35 bis 37° C und einem pH-Wert der Kulturlösung von 6,3 bis 7,0 durchführt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methanolkonzentration im Medium nicht mehr als 4 Vol.-% beträgt

4. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß man die Belüftungsgeschwindigkeit allmählich auf 401/20 l/Min, dann auf 501/20 l/Min und schließlich auf 60 L/20 L/Min erhöht

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man die Belüftung stetig mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 101/20 l/Min bis 100 1/20 l/Min durchführt

6. Die Verwendung der nach Anspruch 1 bis 3 erzeugten Zellen von Methylomonas probus FERM-P Nr. 3193 als Proteinquellen für Nahrungsund Futtermittel.