DE2054310C3 - Verfahren zur Herstellung von (-)-(cis-1 ^-EpoxypropyO-phosphonsaure - Google Patents

Description

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Die Epoxypropylphosphonsäure und ihre Derivate sind wertvolle Antibiotika, die gegenüber grampositiven und gramnegativen Bakterien wirksam sind.

Verfahren zur Herstellung von (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und deren Salzen sind bereits bekannt. Diese Phosphonsäure wurde z. B. dadurch erhalten, daß man bestimmte Streptomyces-Arten, wie Streptomyces· fradiae, in geeigneten Fermentationsmedien züchtete. Ferner wurde sie auch durch chemische Synthese der racemischen Säure und Aufspaltung des racemischen Gemisches hergestellt. Beide Methoden zur Herstellung der antibiotischen Substanz besitzen Nachteile; die Ausbeuten des Fermentationsverfahrens sind niedrig und die Aufspaltung des racemischen Gemisches beim synthetischen Verfahren ist im technischen Maßstab schwierig durchzuführen. Es wurde daher nach anderen Methoden zur Herstellung der antibiotischen Substanz und deren Salzen gesucht, die die Schwierigkeiten der bekannten Verfahren umgehen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Umwandlung von cis-Propenylphosphonsäure und ihren Salzen in ( —)-(cis-l,2-EpoxypropyI)-phosphonsäure und deren Salze in guter Ausbeute, ohne daß dabei gleichzeitig das nicht gewünschte ( + )-Isomere erzeugt wird.

Der Gegenstand der Erfindung ist im Patentanspruch definiert.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man den Schimmelpilz in einem geeigneten Nährmedium züchten und das Phosphonat zu Beginn der Fermentationsperiode zugeben. Alternativ kann das Phosphat aseptisch zugefügt werden, nachdem der Schimmelpilz bereits einige Zeit lang gezüchtet worden ist.

Das für die Züchtung der epoxydierenden Stämme geeignete wäßrige Nährmedium sollte für den Schimmelpilz assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten sowie geringere Mengen anorganischer Salze, die für ihr Wachstum erforderlich sind. Es können die üblicherwebe bei Fermentationsverfahren fa5 verwendeten Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, wie Dextrose, Invertmelasse und Rübenmelasse, verwendet werden. Ebenso können die bei Fermentationsverfahren verwendeten Stickstoffquellen, wie Peptone, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser. Polypeptide und enzymatische Caseinauszüge, verwendet werden. Darüber hinaus kann das Medium geringe Mengen mineralische Bestandteile, wie lösliche Salze des Magnesiums, Natriums, und Kaliums, sowie Wachstumsfaktoren, wie Vitamine enthalten oder es können andere wachstumsstimulierende Substanzen dem Medium zugesetzt werden. Geeignete Medien sind weiter unten in den Beispielen beschrieben.

Das Nährmedium wird gewöhnlich mit einer vegetativen Zucht des Schimmelpilzes inokuliert, obgleich es auch dadurch inokuliert werden kann, daß man Schimmelpilzsporen zum Medium gibt. Das Wachstum der Mikroorganismen wird dadurch gefördert, daß man die Inkubation bei Temperaturen zwischen etwa Raumtemperatur und 30° C durchführt, obgleich auch höhere oder niedrigere Temperaturen angewendet werden können, je nach der für die Züchtung spezieller Schimmelpilze optimalen Temperatur. Der pH des Mediums ist nicht entscheidend und wird auf den Wert eingestellt, der für das optimale Wachstum des speziellen Schimmelpilzes benötigt wird und liegt gewöhnlich zwischen etwa 6,0 und 8,0. Die Züchtung des Schimmelpilzes wird aerob nach bekannten Methoden durchgeführt. Die Zeit, die erforderlich ist, um die gewünschte Epoxydierung durchzuführen, schwankt mit dem speziell verwendeten Schimmelpilz, im allgemeinen aber ist es wünschenswert, die Fermentation so lange vonstatten gehen zu lassen, bis ein gutes Wachstum des Schimmelpilzes erreicht worden ist. Es kann daher erforderlich sein, die Fermentation bis zu 10 Tage lang zu betreiben.

Die Konzentration des cis-Propenylphosphonates im Medium ist nicht übermäßig kritisch und es können Konzentrationen von 0,1 bis 5g/Ltr. angewendet werden; die optimale Menge für jeden Pilz läßt sich leicht durch wenige einfache Versuche bestimmen. Das Phosphonatsalz kann in Form einer Lösung in einem geeigneten biologisch verträglichen Lösungsmittel, z. B. Wasser, einem niedrigen Alkohol oder einem Glykol, in Form einer Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit oder in fester Form, vorzugsweise in sehr fein verteilter Form dem Medium zugesetzt werden, das die epoxydierenden Enzyme enthält oder einem Medium, in welchem sie erzeugt werden. Im allgemeinen zieht man es vor, das Phosphonat in Form einer wäßrigen Lösung eines löslichen Salzes, wie eines Alkalimetallsalzes oder eines Aminsalzes, dem Medium zuzusetzen, obgleich es auch als unlösliches Salz oder als die Säure per se zugegeben werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert hauptsächlich die ( — )-Form der (cis-l^-EpoxypropylJ-Phosphonsäure, die dann leicht nach an sich bekannten Verfahren aus dem Medium gewonnen werden kann. So kann sie an einem basischen Anionenaustauscherharz der Chlorid-Form adsorbiert werden und dann mit wäßrigem Natriumchlorid eluiert werden. Alternativ kann die Epoxyphosphonsäure durch Adsorption an aktiviertem Aluminiumoxyd abgetrennt werden, aus dem sie mit wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Ammoniumhydroxydlösungen eluiert werden kann.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch einzuschränken.

Beispiel 1

Man stellte ein Medium her, das 0,8% Nährbrühe, 0,2% Hefeextrakt, 3% Dextrose und 0,3% Malzextrakt

in destilliertem Wasser enthielt und stellte den pH auf 7,0 ein. 10 ml des entstandenen Mediums wurden in 25 χ 200 mm Teströhrchen gegeben, die dann 15 Minuten lang bei 121° C im Autoklaven sterilisiert wurden.

Man stellte eine Impf-Suspension her, indem man eine lyophilisierte Kultur von Penicillium purpurrescens NRRL-720 zu 5 ml des oben beschriebenen sterilisierten Mediums gab. Die entstandene Impf-Suspension wurde zum Animpfen eines Teströhrchens, das 10 ml sterilisiertes Medium enthielt und zum Animpfen eines zweiten Röhrchens verwendet, das 10 ml sterilisiertes Medium enthielt, zu dem 1 ml einer sterilen wäßrigen Lösung, die 250 γ Natrium-cis-propenylphosphonat enthielt gegeben wurde.

Die inokulierten Röhrchen wurden bei 28° C auf einer mechanischen Schüttelvorrichtung, die bei 220 bpM arbeitete, inkubiert bis gutes Wachstum der Kultur feststand. Nach 6 Tagen wurden die inkubierten Brühen zentrifugiert (25 000 χ G), um die Zellen abzutrennen. Die überstehende Brühe wurde durch Scheibenprobe mit sensitiven und resistenten Stämmen von Proteus vulgaris auf biologische Aktivität untersucht, wobei man die folgenden Ergebnisse erhielt:

Inhibierungszone (mm)
sensitiv resistent

Vergleichsmedium 0

Phosphonathaltiges 21

Medium

Bei- Pilz
spiel

Inhibierungszone
(mm)

sensitiv

2 P.crustosum NRRL-949

3 P.charesii NRRL-778

4 P.soppiiNRRL-912

5 P. funiculosum NRRL-1132

6 P.puberulum NRRL-988

7 P.funiculosum NRRL-1768

8 P.frequentans NRRL-1189

9 P.spinulosum NRRL-727

10 P.spinulosum NRRL-728

11 P.frequentans NRRL-763

12 P.palitansNRRL-966

24,0	0
35,0	0
42,0	0
23,0	0
16,0	0
33,0	0
20,0	0
32,0	0
41,0	0
34,0	0
32,0	0

10

15

20

30

Ein nicht angeimpftes Röhrchen, das 10 ml des sterilisierten Mediums und 1 ml einer wäßrigen 250y Natrium-cis-propenylphosphonsäure enthaltenden Lösung enthielt, wurde zusammen mit den beiden angeimpften Röhrchen inkubiert. Nach 6 Tagen wurde zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit er-vvies sich als inaktiv bei den Proteus-vulgaris-Tests.

Beispiele 2 bis 12

Gemäß Beispiel 1 wurden bei Verwendung der nachstehend aufgeführten Schimmelpilze die folgenden Ergebnisse mit angeimpften Röhrchen, die 250 γ Natrium-cis-propenylphosphonat enthielten, erzielt:

50

resislent

55

60

65

NRRL = Northern Utilization Research and Development Division, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois.

In jedem Falle besaß die geklärte Brühe des im gleichen Medium durchgeführten Vergleichsversuches ohne zugefügtes Phosphonatsalz beim Test nach dem gleicher. Prüfungsverfahren keine Aktivität

Beispiel 13

Es wurde ein Medium aus 0,8% Nährbrühe, 0,2% Hefeextrakt, 3% Dextrose und 0,3% Malzextrakt hergestellt Der pH-Wert wurde auf 7,0* eingestellt Jeweils 40 ml dieses Mediums wurden in einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und 15 Minuten lang bei 121°Cund 1,05 kg/cm² autoklavisiert Sodann wurde das Medium mit einer Öse voll Inokulum aus einem Schrägagar mit einem der folgenden Mikroorganismen angeimpft: Penicillium purpurrescens NRRL-720, P. s'oppii NRRL-912, P. spinuiosum NRRL-728.

Die Kolben wurden auf einer mechanischen Schüttelvorrichtung (220 UpM) bei 28° C bebrütet, bis die Kulturen gut gewachsen waren (2 bis 4 Tage). Diese Impfsuspension wurde verwendet, um Kolben anzuimpfen, die 40 ml des oben beschriebenen Mediums bzw. 40 ml dbses Mediums, das mit cis-Propenylphosphonsäure (200 y/ml) versetzt worden war, enthielten. Die Kolben wurden auf einer mechanischen Schüttelvorrichtung (220UpM) bei 28°C inkubiert bis die Kulturen gut gewachsen waren (6 bis 10 Tage). Na-h dem Brüten wurden die Zellen durch Zentrifugieren (25 000 χ G) entfernt und die überstehenden Flüssigkeiten nach dem Scheibentest mit empfindlichen und resistenten Proteus-vulgaris-Stämmen auf biologische Aktivität hin untersucht.

Kultur

cis-Propenylphosphonat

Inhibierungszone
(mm)

sensitiv

resistenl

P. purpurrescens
P. purpurrescens

P.spinulosum
P.spinulosum

P. soppfi
P. soppii

-ι-

30

0
35

0
40

Die Aktivität von 450 ml Fermentationsbrühe, die durch Züchtung von Penicillium soppii NRRL-912 in Schüttelkolben wie oben beschrieben erhalten wurde, adsorbierte man auf einer 36 cm Kolonne eines stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharzes in der Chlorid-Form. Das Harz-Adsorbat wurde dann mit 3%igem wäßrigem Natriumchlorid in 5-ml-Fraktionen eluiert. Die Fraktionen 15 bis 24, welche die gesamte Bioaktivität enthielten, wurden vereinigt und der Gefriertrocknung unterworfen, wobei man 1,94 g Festsubstanz erhielt. Die Festsubstanz wurde in 10,0 ml Wasser gelöst, durch Zugabe von 1,65 ml einer 2,5 η HCl wurde der pH auf 5,70 eingestellt. Diese Lösung schickte man über eine 15 cm Kolonne eines Aluminiumoxyds, das sauer gewaschen, dann mit 15 ml Wasser und schließlich mit 15 ml eines 3:1-Methanol/Wasser-Gemisches gewaschen worden war. Die gesamte Bioaktivität wurde auf der Aluminiumoxyd-Kolonne adsorbiert und mit 1 η Ammoniumhydroxyd in einem 3 : 1-Methanol/Wasser-Gemisch in Fraktionen von jeweils 5 ml eluiert. Die Bioaktivität, die

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in Fraktion 3 aufzutreten begann, lag in den Fraktionen Extrakte wurden konzentriert, wobei man 120,6 mg

3 bis 8 vor, der größte Teil der Aktivität war in den eines weißen, amorphen Feststoffs vom F. 94°C erhielt,

Fraktionen 3 und 4 vorhanden. Fraktion 3, die gemäß der gemäß biologischem Test 1,85% (—)-(cisl,2-

biologischem Test 3,00 mg (-)-(ris-l,2-Epoxypropyl)- Epoxypropyl)-phosphonsäure enthielt. Die Dampfpha-

phosphonsäure enthielt, wurde der Gefriertrocknung 5 senchromatographie der amorphen Festsubstanz

unterworfen und ergab 324,0 mg festen Rückstand. zeigte, daß die Festsubstanz 1,2% (—)-(cis-l,2-Epoxy-

Dieses feste Produkt wurde unter leichtem Erwärmen propyl)-phosphonsäure und nich's von dem ( + )-

dreimal mit 3 ml Methanol aufgeschlämmt. Die Isomeren enthielt.

Claims (1)

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Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von (-)-(cis-],2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und ihren Salzen unter Verwendung der Züchtung eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Penicillium purpurrescens NRRL-720, P. crustosum NRRL-949, P. charesii NRRL-778, P. soppii NRRL-912, P. funiculosum NRRL-1132 und NRRL-1768, P. puberulum NRRL-988, P. spinulosum NRRL-727 und NRRL-728, P. frequentans NRRL-1189 und NRRL-763 oder P. palitans NRRL-966 verwendet und die Fermentation in Gegenwart von cis-Propenylphosphonsäure oder von einem ihrer Salze durchführt