DE2137071C - Verfahren zur Herstellung von 1 Phenylalanin - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen.

Bekannte Verfahren der beschriebenen Gattung arbeiten mit Escherichia coli ATCC 13281 (deutsche Offenlegungsschrift 1 915 855) und mit einem Kohlenwasserstoff assimilierenden und Tyrosin-erfordernden Mikroorganismus wie z. B. Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21226 (USA. - Patentschrift 2 973 304).

Die Ausbeute an L-Phenylalanin ist nicht befriedigend. Das gilt auch für ein bekanntes Verfahren (vgl. japanische Patentanmeldung 6345/62) welches einen Mikroorganismus verwendet, der Tyrosin zu seinem Wachstum benötigt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin anzugeben, welches bei geringem Aufwand zu hoher Ausbeute führt.

Ausgehend von dem bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen besteht die Erfindung darin, daß man dabei als Mikroorganismus Brevibacterium divaricatum ATCC 21643, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 21645, Arthrobacter citreus ATCC 21646, Corynebacterium glutamicum ATCC 21668, Corynebacterium glutamicum ATCC 21676, Corynebacterium glutamicum ATCC 21677 oder einen der Stämme aus der Tyrosinauxotrophen Gruppe von Corynebacterium glutamicum ATCC 21669 bis einschließlich 21775 einsetzt. Die produzierte Menge an L-Phenylalanin ist größer, als es bei Einsatz der eingangs genannten, bekannten Bakterien der Fall ist.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Ausfuhrungsbeispielen, die auch die aufgezeigten Fortschritte erkennen lassen, ausführlicher erläutert.

Beispiel 1

Es wurde ein L-Phenylalanin produzierender Stamm von Corynebacterium glutamicum (Synonym von Micrococcus glutamicus) ATCC 21668, bei dem vorher festgestellt wurde, daß er einem Analogen des Phenylalanine (4-Fluorphenylalanin) gegenüber resistant ist, in 24 Stunden bei 30⁰C in einem Impfbett gezüchtet, das Glukose (2%), Pepton (1%), Hefeextrakt (1%) und NaCl (0,3%) enthielt. Der entstandene Impfstoff (1 ml) wurde auf ein Fermentationsmedium (10 ml) in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben geimpft und 4 Tage bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet. Man erhielt 6,2 mg/ml 1-Phenylalanin. Die Zusammensetzung des verwendeten Fermentationsmediums (pH = 7,2) war:

Glukose (10%),

K₂HPO₄ (0,05%),

KH₂PO₄ (0,05%),

MgSO₄-7H₂O (0,025%),

(NH₂)SO₄ (2%),

NZ-Amin (0,5%),

Biotin (30 μ^/\) und

CaCO₃ (2%).

Nach Vollendung der Fermentation wurde 1 1 der Zuchtbrühe zwecks Entfernung der Mikrobenzellen und des CaCO₃ zentrifugiert. Die anfallende Lösung wurde tüchtig mit Aktivkohle vermischt, welche vorher mit Essigsäure behandelt worden war, um das Phenylalanin daran zu adsorbieren. Dann wurde die Tierkohle abfiltriert, mit Wasser gewaschen und mit 20% (v/v) Essigsäure, die Phenol (5% v/v) enthielt, eluiert. Das Eluat wurde mit Äther behandelt. Nach Entfernung des Phenols wurde das Eluat konzentriert und durch eine Kolonne mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz (Diaion SK-I A) (in der H ⁺-Form) geschickt, um das Phenylalanin zu adsorbieren, welches anschließend mit 0,3%igem wäßrigem Ammoniak eluiert wurde. Die Phenylalanin-Fraktion des Eluats wurde konzentriert, und mit Alkohol wurden zwecks der angestrebten Gewinnung 2,1 g 1-Phenylalanin ausgefällt.

Beispiel 2

Es wurden die 1-Phenylalanin produzierende Stämme verwendet, die zu Corynebacterium glutamicum gehören und Eigenschaften haben, die in Tabelle 1 gezeigt sind. Jeder von diesen wurde 24 Stunden lang in dem im Beispiel 1 aufgeführten Impfmedium gezüchtet. Das erhaltene Impfgut (je 1 ml) wurde jeweils auf 10 ml Fermentationsmedium in einem großen Testkolben geimpft und 4 Tage lang bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet. Die Mengen des jeweils produzierten 1 - Phenylalanine sind in Tabelle 1 gezeigt.

Die Zusammensetzung des Fermentationmediums (pH = 7,2) war:

Rohrzucker-Melasse (10% als Glukose),

K₂HPO₄ (0,05%),

KH₂PO₄. (0,05%),

MgSO₄ ■ 7H₂O (0,025%),

(NH₄)SO₄ (2%),

Maisquellwasser (0,5%) und

CaCO₃ (2%).

Tabelle 1

Stamm	Menge an produziertem !-Phenylalanin (mg/ml)
Tyr", PEPR (ATCC 21 669) Tyr", TAR (ATCC 21 670)...: Tyr-, PEPR (ATCC 21 671)	6,9 6,4 10,6

Fortsetzung

Stamm

Tyr-, TA^R, 3AT^R (ATCC 21 672) yr-, PEP^R,TA^R, 3AT^R

(ATCC 21 673)

Tyr, PEP^R, PAP^R,3AT^R

(ATCC 21 674)

Tyr, PEP^R, PAP^R, TA^R, 3AT^R

(ATCC 21 675)

PEP^R, TA^R (ATCC 21 676) PEP^R, TA^R, 3AT^R

(ATCC 21 677)

Menge an produziertem 1-Phenylalanin

(mg/ml)

10,2 12,6 13,2

13,3 5,7

6,1

Anmerkung Tyr" = Tyrosin-erfordernd, PEP = resistenl gegen 4-Fluorphenylalanin, TA ^ = resistent gegen /J-2-Thionylalanm, 3AT = resistent gegen 3-Aminotyrosin, PAP^R = resistenl gegen 4-Aminophenylalanin, ATCC = American Type Culture Collection.

mehl-Hydrolysatlösung (0,9% als Sojabohnenmehl: Sojabohnenmehl, zersetzt durch 6 η H₂SO₄. und neutralisiert mit NH₄OH). Die anfallende Impfkultur (300 ml) wurde auf ein Fennentationsmedium (3 1) in einem 5-1-Fermenterkolben geimpft und 72 Stunden unter Belüften (3 l/Min.) und Rühren (600 UpM) bei 30⁰C gezüchtet. Man erhielt 16,8 mg/ml 1-Phenylalanin.

Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums ίο (pH = 7,2) war:

Rohrzucker-Melasse (15% als Glukose),
Maisquellwasser (0,1 %),
KH₂PO₄ (0,1%),
K₂HPO₄ (0 1%),
MgSO₄ · 7H₂O (0,05%)

und eine Lösung von aufgeschlossenen Sojabohnen (0,9% als Sojabohnenmehl).

Beispiel 4

ίο Die Stämme der nachfolgenden Tabelle 2 wurden jeweils auf die gleiche, im Beispiel 1 beschriebene Weise gezüchtet, um 1-Phenylalanin zu produzieren.

Tabelle 2

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Beispiel 3

Ein 1-Phenylalanin produzierender Stamm (ATCC 674), der zu Corynebacterium glutamicum gehört und gegen 4-Fluorphenylalanin, 4-Aminophenylalanin und 3-Aminotyrosin resistent ist, wurde als Impfstoff verwendet. Dieser Stamm wurde 24 Stunden iang in einem Impfmedium gezüchtet, das die Zusammensetzung hatte: Rohrzucker-Melasse (7% als Glukose), Maisquellwasser (0,3%), K₂HPO₄ (0,1%), KH₂PO₄ (0,1%), MgSO₄ · 7H₂O (0,05%) und eine Sojabohnen-

Stamm	Menge an produziertem 1-Phenylalanin (mg/ml)
Brevibacterium divaricatum PEPR (ATCC 21 643) Arthrobacter citreus PEP R (ATCC 21 646) Microbacterium ammoniaphilum PbPR (ATCC 21 645)	5,6 4,9 4,7

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Brevibacterium divaricatum ATCC 21643, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 21645, Arthrobacter citreus ATCC 21646, Corynebacterium glutamicum ATCC 21668, Corynebacterium glutamicum ATCC 21676, Corynebacterium glutamicum ATCC 21677 oder einen der Stämme aus der Tyrosinauxotrophen Gruppe \on Corynebacterium glutamicum ATCC 21669 bis einschließlich 21775 einsetzt.