DE2031387B2

DE2031387B2 - Verfahren zur biochemischen produktion von l - histidin

Info

Publication number: DE2031387B2
Application number: DE19702031387
Authority: DE
Inventors: Shinji Meguro Kubota Koji Fuchu Kamijo Hirotaka Koto Tokio Okumura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1969-06-25
Filing date: 1970-06-25
Publication date: 1977-09-01
Also published as: US3716453A; FR2051264A5; DE2031387A1; GB1259444A; DE2031387C3

Description

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L-Histidin ist eine der für die Nahrung wichtigsten Aminosäuren. Es ist bei medizinischen Untersuchungen zur Ergänzung der Nahrung eingesetzt worden und stellt ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Uroxansäure und Histamin dar. Bislang wurde es in i$ großtechnischem Maßstab durch Extraktion von Proteinhydrolysaten mit relativ hohen Kosten in komplexer Prozedur hergestellt.

Es wurde gefunden, daß bestimmte Mutanten, die nach Induzierung mittels konventioneller mutagener Agentien aus Mikroorganismen der Genera Brevibacterium, Corynebacterium und Arthrobacter erhalten wurden, die Fähigkeit haben, extracellular L-Histidin während der aeroben Fermentation konventioneller Nährmedien zu produzieren, und daß das durch die Fermentation gebildete L-Histidin in an sich bekannter Weise aus dem Fermentationsmedium isoliert werden kann. Einige Mutanten sind — wie gefunden wurde — gegenüber mehr als lOOOy/ccm 2-Thiazolalanin im Medium resistent.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Produktion von L-Histidin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Brevibacterium flavum ATCC 21 406, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21 407 oder Arthrobacter citreus ATCC 21 412 unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das assimilierbare Lieferanten von Kohlenstoff und Stickstoff und geringe Mengen organischer Nährstoffe und anorganischer Salze enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 so lange der Fermentation unterwirft, bis die L-Histidin-Konzentration im Medium mindestens 1 g/l beträgt.

Einige Beispiele für die in dem Nährmedium benutzten Kohlenstofflieferanten sind Kohlenhydrate (Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysate, Melassen, Stärke), Essigsäure, Alkohole und Kohlenwasserstoff.

Zur Erzielung einer guten L-Histidinausbeute wird die Fermentation aerob unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Will man maximale Ergebnisse erzielen, muß man den pH so regeln, daß er im Bereich von 5 bis 9 gehalten wird. Der pH-Wert kann mittels gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak, Calciumcarbonat, Alkalihydroxyd, Harnstoff, organischen oder anorganischen Säuren, die dem Medium von Zeit zu Zeit zugeführt h.s werden, aufrechterhalten werden, wobei bekanntlich auch assimilierbarer Stickstoff zugeführt werden kann. Wird die Fermentation bei 25 bis 37°C durchgeführt, erreicht man die maximale Konzentration an L-Histidin im Medium innerhalb von 2 bis 7 Tagen.

Das von dem Medium mittels konventioneller Ionenaustauschertechnik isolierte L-Histidin wurde durch den Rr-Wert eines Papierchromatogramms durch die auf dem Chromatogramm mittels der Diazoreaktion entwickelten Farbe und die Reaktion der L-Histidin benötigenden Mikroorganismen in einem minimalen Nährmedium identifiziert. Das in dem Medium vorhandene L-Histidin wurde mittels Bioversuch unter Verwendung des L-Histidin benötigenden Leuconostoc citrovorum bestimmt.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren gemäß Erfindung unter Einsatz der besten zur Zeit zur Verfugung stehenden L-Histidin produzierenden Mutanten.

Beispiel 1

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das pro 1

100 gSaccharose

2 g KH₂PO₄

15 g Ammoniumsulfat

0,4 g MgSO₄ · 7 H₂O

200}- Biotin

50}'Thiamin-Hydrochlorid

2 mg Fe⁺ +

2 mg Mn ⁺ +

1 % Sojabohnenproteinhydrolysat

enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt. 300-ccm-Ansätze der Lösung sterilisierte man mit Dampf in 1-l-FermentationsgefäBen und beimpfte sie dann mit Brevibacterium flavum AJ 3225 (ATCC 21 406), das zuvor auf Bouillonschrägschnitten bei 30°C für 24 Stunden kultiviert worden war. Es wurde ein pH-Wert von 7,5 bei 32°C für 48 Stunden durch Zuführung von gasförmigem Ammoniak aufrecht erhalten. In dem Medium wurden 4,3 g/l L-Histidin gebildet.

Die Mikroorganismenzellen wurden aus 51 des Mediums abzentrifugiert, die Flüssigkeit über ein stark saures Ionenaustauscherharz geleitet, das das L-Histidin zurückhielt, das Harz mit Ammoniumhydroxydlösung eluiert und das erhaltene Eluat teilweise im Vakuum verdampft. Beim Kühlen kristallisierte L-Histidin aus dem Konzentrat aus. Man erhielt schließlich 8,4 g kristallines L-Histidin.

Beispiel 2

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das pro 1

100 g Glucose

1 g KH₂PO₄

0,4 g MgSO₄ ■ 7 H₂O

40 g Ammoniumsulfat

!0Oy Biotin

200 yThiamin-Hydrochlorid

2 mg Fe + ⁺
2 mg Mn+ +

1 g Hefeextraki:

enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. 20-ccm-Ansätze des Mediums sterilisierte man mit Dampf und mischte jeden mit 5 g getrennt sterilisiertem Calciumcarbonat. Alle Ansätze wurden in einem Fermentationsgefäß mit Corynebacterium acetoacido-

philum A| 3227 (ATCC 21 40/) beimpft, das zuvor auf Bouillonagarschrägschnitten bei 30⁰C 24 Stunden kultiviert worden war, und die Fermentation 48 Stunden bei 3O⁰C durchgeführt. Es hatte sich L-Histidin in dem Medium in einer Konzentration von 1,2 g/l angereichert.

Beispiel 3

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das pro I

70 g Glucose
1 g KH₂PO₄

0,4 g MgSO₄ · 7 H₂O

30 g Ammoniumsulfat

50 γ Biotin

200 yThiamin-Hydrochlorid

20 ecm Sojabohnenproteinhydrolysat

enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. 20-ccm-Ansätze wurden sterilisiert, mit 5 g getrennt sterilisiertem Calciumcarbonat gemischt und mit Arihrobacter citreus A] 3229 (ATCC 21 412) beimpft, das zuvor kultiviert worden war, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 55 Stunden Fermentation bei 31,5"C enthielt das Medium 1,2 g/l L-Histidin.

Claims

I/

Patentanspruch:

Verfahren zur biochemischen Produktion von L-Histidin, dadurch gekennzeichnet, daß s man Brevibacterium flavum ATCC 21 406, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21 407 oder Arthrobacter citreus ATCC 21 412 unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das assimilieibare Lieferanten von Kohlenstoff und Stickstoff und geringe Mengen organischer Nährstoffe und anorganischer Salze enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 so lange der Fermentation unterwirft, bis die L-Histidin-Konzentration im Medium mindestens 1 g/l beträgt.