DE2031387A1

DE2031387A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Histidin durch Fermentation

Info

Publication number: DE2031387A1
Application number: DE19702031387
Authority: DE
Inventors: Shinji Tokio; Kubota Koji Fuchu; Kamijo Hirotaka Tokio; Yoshinaga Fumihiro Kawasaki Kanagawa; Okumura (Japan)
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1969-06-25
Filing date: 1970-06-25
Publication date: 1971-01-07
Also published as: US3716453A; FR2051264A5; DE2031387B2; GB1259444A; DE2031387C3

Description

PATENTANWALT DR.-ING. LOTTERHOS

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DRESDNER IANK FFM., Nr. 5847« POSTSCHECK.KONTO FFM. 16«

Y/K FRANKFURT (MAlHh 23.6.7ο

Verfahren zur Herateilung von L-Histidin durch Fermentation

Die Erfindung betrifft die Herstellung von L-Histidin, insbesondere durch Fermentation·

L-Histidin ist eine der für die Nahrung wichtigen Aminosäuren, ist bei medizinischen Untersuchungen zur Ergänzung der Nahruag eingesetzt worden und stellt ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Uroxansäure (urocanic acid) und Histamin dar. L-Histidin wurde bislang in grosstBchnischem Masstab durch Extraktion von Proteinhydrolysaten mit relativ hohen Kosten in komplexer Prozedur hergestellt.

Es wurde gefunden, dass bestimmte Mutanten, die nach Induzierung mittels konventioneller mutagener Agentien aus Mikroorganismen der Genera Brevibacterium, Corynebacterium und Arthrobacter erhalten wurden, die Fähigkeit haben, extracellular Histidin während der aeroben Fermentation konventioneller Nährmedien zu produzieren, dass die Mutanten sich leicht durch Routinemethoden auf der Basis ihrer Fähigkeit, L-Histidin zu produzieren, auswählen lassen, und dass das durch die Fermentation gebildete L-Histidin in an sich bekannter Weise aus dem Fermentationsmedium isoliert werden kanne Einige Mutanten sind - wie gefunden wurde - gegenüber mehr als 1ooo γ/ccm 2-Thiazol-alanin im Medium resistant·

Die wirksamsten, L-Histidin produzierenden Mutanten sind — soweit gefunden wurde - Brevibacterium flavum AJ 5225 (ATGG 214o6), Gorynebacterium aoetoacidophilum AJ 3227 (AOJCG 214o7) und Arthrobacter citreus AJ!3229 (ATGG 21412). Probekulturen dieser Mikroorganismen sind qualifizierten Personen ohne Erlaubnis der Anmelderin von der American Type Culture Collec-b-

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tion in Washington D.O. frei zugänglich« Sie wurden aus Brevibacterium flavum ATCG Ήο67» Corynebacterium acidophilum ATGC 138?o bzw. Arthrobacter citreus ITGC 17775 erhalten, indem man vegetative Zellen oder Sporen der Mutterstämme (parent strains) UV-Licht, Röntgen- oder γ-Strahlen in mutagenenDosen oder Natriumaitrit, Witr©s®gua»idin oder Diäthylsulfatlösung, die bekanntlich chemische smtagene Agentien darstellen, aussetzte® Die Mut teilst amme klnnen nicht extracellular L-Histidin produzieren» Sie sind auch ohne Erlaubnis der.Anmelderin von ATCG frei erhältlich»

Für die Fermentation der Hikr©Organismen der Erfindung werden konventionelle Nährmedien benutzt«, Sie enthalten assimilierbare Lieferanten von Kohlenstoff und Stickstoff ebenso wie geringe Mengen von organischen, das Wachstum begünstigenden Substanzen und anorganische Salze»

Beispiele für Kohlenstofflieferanten sind Kohlenhydrate (Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysate, Melassen, Stärk©), Essigsäure, Alkohole und Kohlenwasserstoffe«

Zur Erzielung einer guten L-Histidiiiansfeeute wird die Fermentation aerob unter Belüftung und Rühren durchgeführt. W«ill man maximale Ergebnisse erzielen, muss man den pH so r©gela₉ dass er im Bereich von 5 bis 9 gehalten wird. Der pH-Wert kann mittels gasförmigem oder wässrigem Ammoniak, Galciumcarbonat, Alkalihydroxyd, Harnstoff, organischen oder anorganischen Säuren, die dem Medium von Zeit zu Zeit zugeführt werden, aufrecht erhalten werden, wobei bekanntlich auch assimilierbarer Stickstoff zugeführt werden kann. Wird die leuesiantation bei 25 bis 37°G durchgeführt, erreicht man die maximale Konzentration an L-Histidin im Medium innerhalb von 2 bis 7 Tagen»

Das von dem Medium mittels konventioneller Ionenaustauscher»« technik isolierte L-Histidin wurd© durcfe den !»-Wert eines Papierchromafcogramms durch di© auf dem Gar©maii@gE©äis mittels der Diazoreakfcion entwickelten Farbe und die Heaktion der

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L-Histidin benötigenden Mikroorganismen in einem minimalen Nahrmedium identifiziert. Das in dem Medium vorhandene L-Histiäin wurde mittels Bioversuch unter Verwendung des L-Histidin benötigenden Leuconostoc citrovorum bestimmt.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren gemäss Erfindung unter Einsatz der besten zur Zeit zur Verfügung stehenden L-Histidin produzierenden Mutanten«.

'Beispiel 1

Es wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, das pro 1

1oo g Saccharose " "

2 g KH₂PO₄
15 g Amaoniuinsulfat
o,4 g MgS0₄.7H₂0
2oo γ Biotin

5o γ Thiaiain-Hydrochiorid
2 mg Fe⁺*
2 mg Mn⁺*

1 56 Sojabohnenproteinhydrolyeat

enthielt· Der pH-Wert wurde auf 70 eingestellt. 3oo ccm-Ansätze der Lösung sterilisierte man mit Dampf in 1 l-Fennentationsgofässen und beimpfte sie dann mit Brevibacterium fIavum AJ 3225 (ATCG 214o6), das zuvor auf Bouillonschräg- g schnitten bei $o^eC für 24 Stunden kultiviert worden war. Es ' wurde ein pH-Wert von 7_S5 bei 32°C für 46 Stunden durch Zuführung von gasförmige» Ammoniak aufrecht erhalten. In dem Medium wurdan 4,3 g/l L-Histidin gebildet.

ab

Die Mikroorganismenzellen wurden aus 5 1 des Mediums/zentrifugiert, die Flüssigkeit über ein stark saures lonenaustauscherharz geleitet, das das L-Histidin zurückhielt, das Harz mit Ammoniumhydroxydlosung eluiert und das erhaltene EIuat teilweise im Vakuum verdampft. Beim Kühlen kristallisierte L-Histidin aus dem Konzentrat aus. Man erhielt schliesslich 8,4 g kristallines L-Histidin.

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Beispiel 2

Es wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, das pro 1 1oo g Glucose

1 g KH₂PO₄

o,4 g MgSO₄.TH₂O

4-0 g Ammoniumsulfat
1oo γ Biotin
2oo γ Thiamin-Hydrochlorid

2 mg Fe⁺⁺
2 mg Mn⁺⁺

1 g Hefeextrakt

enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7*9 eingestellt. 2o ccm-AnsStze des Mediums sterilisierte man mit Dampf und mischte jeden mit 5 g getrennt sterilisiertem Calciumcarbonat. Alle Ansätze wurden in einem Fermentationsgefäss mit Oorynebacterium acetoacidophilum AJ 3227 (ATCC 214o7) beimpft, das zuvor auf Bouillonagarschrägschnitten bei 3o°C 24 Stunden kultiviert worden war, und die Fermentation 48 Stunden bei 3o°C durchgeführt. Es hatte sich L-Histidin in dem Medium in einer Konzentration von 1,2 g/l angereichert.

Beispiel 3

Es wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, das pro 1 7o g Glucose
1 g KH₂PO₄
0,4 g MgSO₄.TH₂O

3o g Ammoniumsulfat

5o γ Biotin
2oo γ Thiamin-Hydrochlorid

2o ecm Sojabohnenproteinhydrolysat

enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. 2o ccm-Ansätze wurden sterilisiert, mit 5 g getrennt sterilisiertem Calciuncarbonat gemischt und mit Arthrobacter citreus AJ 3229 (ATCC 21412) beimpft, das zuvor kultiviert worden war, wie in Beispiel 1 beschriebem. Wach 35 Stunden Fermentation bei 31,5°C aalhielt äaH Medium 1,2 g/l L-Histidin.

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Claims

Pat ent anspräche .

1) Verfahren zur Herstellung von L-Histidin , dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus der Genera Brevibacterium, Cory-neb act erium oder Arthrobacter unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert wird, das assimilierbare Lieferanten von Kohlenstoff und Stickstoff und geringe Mengen organischer Nährstoffe und anorganischer Salze enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, und der pH-Wert des Mediums im Bereich von 5 bis 9 gehalten wird, bis L-Histidin im Medium produziert ist·

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganisnraa Brevibacterium flavum ATCG 214o6 benutzt wird. ä

3) Verfahrest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Gorynebjuoterium aeetoacidophilum ATGC 214o7 benutzt wird©

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Arthrobacter citreus ATCC 21412 benutzt wird·

5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Histidin aus dem Medium isoliert wird.

6) Verfahren nach -Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass* die Kultivierung der Mikroorganismen in dem Medium so lange fortgeführt wird, bis die Konzentration an L-Histidin mindestens Λ 1 g/l beträgt ο

7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung der benutzten Mikroorganismen ein Mutterstamm (parent strain) der Genera Brevib act erium, Coryneb act erium oder Arthrobacter - ohne Fähigkeit, bei der Kultivierung auf Nährmedien L-Histidin zu bilden - der Einwirkung von mutagenen Agentien unterworfen wird, bis sich Mutanten gebildet haben, die aus den der Einwirkung der mutagenen Agentien ausgesetzten Mutter- -stammen aufgrund ihrer Fähigkeit, L-Histidin in Kulturmedien zu bilden, ausgewählt werden.

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θ) Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, dass als Mutterstamm ein Stamm von Brevibacterium flavum, Corynebacterium acetoacidophilum oder Arthobacter citreus benutzt wird·

9) Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Mikroorganismen auf dem Medium bei einer Temperatur von 25 bis 37*0 so lange durchgeführt wird, bis die Konzentration an L-Histidin in dem Medium mindestens 1 g/l beträgt,und danach das gebildete L-Histidin aus dem Medium isoliert wird·

10) Verfahren nach Anspruch 7% dadurch gekennzeichnet, dasa als Mutante ein Stamm benutzt wird, der gegenüber mehr als 1ooo γ/ccm 2-Thiazol-alanin im Medium resistent ist«,

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