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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von L-Threonin unter Verwendung eines Mikroorganisinus der
Gattung Escherichia init Resistenz gegenüber Cystein oder Cystin
oder einer dazu analogen Verbindung, und mit der Fähigkeit,
L-Threonin zu produzieren.
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L-Threonin ist eine Aminosäure, die nicht nur als Medikament,
z.B. ein Aminosäurepräparat, nützlich ist, sondern auch als
Additiv für Tierfutter verwendbar ist.
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Bisher waren verschiedene Verfahren zur Herstellung von L-
Threonin durch Fermentation bekannt; beispielsweise ein
Verfahren unter Verwendung eines borrelidinempfindlichen
Mikroorganismus der Gattung Escherichia (veröffentlichte, geprüfte
Japanische Patentanmeldung Nr. 6752/76), ein Verfahren unter
Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia, der
Diaminopimelinsäure und Methionin benötigt, und dessen
Threonin-Biosynthesesystem gegenüber der Rückkopplungshemmung durch
Threonin resistent ist (veröffentlichte, geprüfte Japanische
Patentanmeldung Nr. 10037/81), ein Verfahren unter Verwendung
eines Mikroorganismus der Gattung Serratia, der
Threonindehydrogenase-defekt ist und gegenüber metabolischen
Threonin-Antagonisten resistent ist (veröffentlichte, geprüfte Japanische
Patentanineldung Nr. 48195/77), ein Verfahren unter Verwendung
eines Methionin bedürftigen Mikroorganismus der Gattung
Corynebacterium mit Resistenz gegenüber
α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure und S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (veröffentlichte, ungeprüfte
Japanische Patentanmeldung Nr. 19087/72), ein Verfahren unter
Verwendung eines Leucin bedürftigen Mikroorganisinus der Gattung
Brevibacterium init Resistenz gegenüber
α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure und S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (veröffentlichte,
ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 31093/75), ein Verfahren
unter Verwendung eines L-Isoleucin und L-Lysin bedürftigen
Mikroarganismus der Gattung Brevibacterium mit Resistenz
gegenüber α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure und S-(2-Aminoethyl)-L-
cystein (veröffentlichte, ungeprüfte Japanische Patentanmeldung
Nr. 224684/83) und ein Verfahren unter Verwendung eines
Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit Resistenz gegenüber
mindestens einer der Verbindungen Rifampicin, Lysin, Methionin,
Asparaginsäure und Homoserin, oder einer verminderten Fähigkeit
zum Abbau von L-Threonin (veröffentlichte, ungeprüfte
Japanische Patentanineldung Nr. 273487/88).
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Erfindungsgemäß kann L-Threonin in hohen Ausbeuten durch
Züchten eines Mikroorganisinus der Gattung Escherichia init Resistenz
gegenüber Cystein oder Cystin oder einer dazu analogen
Verbindung in einem Medium und mit der Fähigkeit zur Produktion von
L-Threonin, bis sich L-Threonin in der Kulturbrühe angereichert
hat, und Isolieren von L-Threonin daraus, hergestellt werden.
Bei dein erfindungsgeinäßen Verfahren kann jeder beliebige
Mikroorganismus verwendet werden, solange er zur Gattung
Escherichia gehört und gegenüber Cystein oder Cystin oder einer dazu
analogen Verbindung resistent ist und die Fähigkeit zur
Produktion von L-Threonin besitzt.
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Beispiele für Cystein- oder Cystin-analoge Verbindungen sind S-
methylcystein, S-Ethylcystein, Allylglycin, Homocystein,
Cystinhydroxamat, Cysteinsäure und Homocysteinsäure.
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Die mutierten Stämme, die gegenüber Cystein oder Cystin oder
einer dazu analogen Verbindung resistent sind, können dadurch
erhalten werden, daß man einem L-Threonin produzierenden
Mikroorganisinus der Gattung Escherichia nach einer herkömmlichen
Mutationstechnik Resistenz gegenüber Cystein oder Cystin oder
einer dazu analogen Verbindung verleiht.
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Beispiele für bevorzugte Mutantenstämme sind Escherichia coli
H-7256, Escherichia coli H-7263, Escherichia coli H-7293 und
Escherichia coli H-7294.
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L-Threonin produzierende Mikroorganismen der Gattung
Escherichia sind wegen der geringen Anzahl an anderen Aminosäuren, die
als Nebenprodukte gebildet werden, bevorzugt.
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Ein spezielles Beispiel des Verfahrens zum Erhalt der
vorstehenden Mutantenstämme ist in der folgenden Beschreibung
angegeben.
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Escherichia coli H-4258 (FERM BP-985), der Diaminopimelinsäure
und Methionin benötigt und gegenüber
α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure und Rifampicin resistent ist, wird mit 200 ug/ml N-
Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidin (NTG) 30 min lang bei 30ºC
behandelt.
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Die behandelten Zellen werden auf einem Minimalmedium [ 5 g/l
Glucose, 1 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 7 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,1 g/l
MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 20 mg/l Fe&sub2;(SO&sub4;)&sub3;, 50 mg/l Diaminopimelinsäure,
50 mg/l Methionin und 20 g/l Agar, pH 7,2], das 1 g/l
Cystinhydroxamat enthält, ausgestrichen und bei 30ºC 2 bis 6 Tage lang
gezüchtet, wobei Kolonien aus cystinhydroxamatresistenten
Mutanten, die darauf wachstumsfähig sind, erhalten werden. Dann
werden 50 Mutantenstämme aufgenommen und einem Test auf die
Produktion von L-Threonin unterworfen. Eine Mutante mit einer
höheren L-Threoninproduktivität als der Stamm H-4258 wird
ausgewählt. Der ausgewählte Stamm wurde als Escherichia coli H-
7256 be-zeichnet.
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Mutanten mit einer Resistenz gegenüber 0,5 g/l Allylglycin, 5
g/l Cystein bzw. 5 g/l Cystin wurden auf die gleiche Weise, wie
vorstehend beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß
Allylglycin, Cystein bzw. Cystin anstelle von Cystinhydroxamat
verwendet wurden. Sie wurden als Escherichia coli H-7263, H-
7293 bzw. H-7294 bezeichnet.
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Die so erhaltenen Stämme H-7256, H-7263, H-7293 und H-7294
wurden am 8. November 1988 bei dem Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan
gemäß dem Budapester Vertrag unter den Hinterlegungsnummern
FERN BP-2137, FERN BP-2138, FERN BP-2139 bzw. FERN BP-2140
hinterlegt.
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Die Tabelle 1 zeigt das Wachstum des vorstehend erwähnten
Elternstammes (Stamm H-4258) und der mutierten Stämme bei
Züchtung bei 30ºC für 24 Stunden auf Minimalagarplattenmedium, das
Cystein oder Cystin oder eine dazu analoge Verbindung enthält.
Tabelle 1
Konzentration (g/l)
Wachstum des Stammes
Keine Zugabe
Cystinhydroxamat
Allylglycin
Cystein
Cystin
++: ausreichendes Wachstum
-: kein Wachstum
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L-Threonin kann durch Züchten der vorstehenden Mutanten in
einem synthetischen oder natürlichen Medium, das
Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze,
Wachstumsfaktoren und dergleichen enthält, bis L-Threonin in der Kulturbrühe
angereichert ist, und Gewinnung von L-Threonin daraus erhalten
werden. Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate wie
Glucose, Fructose, Melassen, Stärkehydrolysat und
Rohzuckerhydrolysat, und organische Säuren wie Essigsäure, Propionsäure,
Ameisensäure, Fumarsäure und Äpfelsäure verwendet werden.
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Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsalze von
anorganischen und organischen Säuren, wie Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, Amine und
andere stickstoffhaltige Verbindungen, Pepton, Fleischextrakt,
Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Sojakuchenhydrolysat,
verschiedene gezüchtete Zellen und ihre Abbauprodukte etc.
verwendet werden.
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Als anorganische Verbindungen können Kaliumdihydrogenphosphat,
Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat,
Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat,
Calciumcarbonat etc. in geeigneten Mengen verwendet werden.
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Wenn der verwendete Stamm Nährstoffe benötigt, ist es auch
notwendig, die zum Wachstum benötigen Verbindungen dem Medium
zuzusetzen. In einigen Fällen können solche Nährstoffe
ausreichend von einem anderen Bestandteil des Mediums geliefert
werden, und so ist eine besondere Supplementierung nicht nötig.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise
durch eine Schüttelkultur oder Submerskultur, unter Belüftung
und Rühren bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC, vorzugsweise
28 bis 38ºC, durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird bei 5
bis 9, vorzugsweise um den Neutralpunkt, während der Züchtung
gehalten. Der pH-Wert wird mit Calciumcarbonat, anorganischen
oder organischen Säuren, alkalischen Lösungen, Ammoniak, pH-
Pufferlösungen oder dergleichen eingestellt.
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Üblicherweise wird L-Threonin nach 2- bis 7-tägiger Züchtung in
der Kulturbrühe angereichert. Nach Beendigung der Züchtung
werden Präzipitate, wie Zellen, aus der Kultur durch Filtration,
Zentrifugation etc. entfernt, und das L-Threonin kann aus der
entstandenen Brühe durch eine Kombination aus
Ionenaustauscherbehandlung, Konzentrieren, Aussalzen etc. isoliert werden.
Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung werden in den
folgenden repräsentativen Beispielen erläutert.
Beispiel 1
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Escherichia coli H-7256, Escherichia coli H-7263, Escherichia
coli H-7293, Escherichia coli H-7294 und Escherichia coli H-
4258 wurden als Impfstämme verwendet. Jeder Stamm wurde unter
Schütteln bei 30ºC 16 Stunden lang in einem Impfmedium
enthaltend 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l
NaCl und 0,1 g/l Diaminopimelinsäure gezüchtet. Dann wurden 2
ml der so erhaltenen Impfkultur in einen 250 ml
Erlenmeyerkolben, der 20 ml eines Fermentationsmediums der folgenden
Zusammensetzung enthielt, inokuliert und unter Schütteln bei 30ºC 72
Stunden lang gezüchtet.
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Zusammensetzung des Fermentationsmediums: 70 g/l Glucose, 14
g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 0,3 g/l
Diaminopimelinsäure, 0,1 g/l DL-Methionin, 2 g/l Maisquellwasser und
30 g/l CaCO&sub3; (pH 7,4).
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Die Mengen an in der Kultur gebildetem L-Threonin sind in der
Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Stamm
Eigenschaft
Menge an L-Threonin (g/l)
cystinhydroxamatresistent
allylglycinresistent
cysteinresistent
cystinresistent
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Die L-threoninhaltige Fermentationsbrühe, die unter Verwendung
von 200 ml des Stammes H-7256 erhalten worden war, wurde
zentrifugiert (3000 UpM, 10 min), um die Zellen und andere
Verunreinigungen zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde durch
eine Säule mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz Diaion
SKI (H&spplus;-Typ, ein Produkt von Mitsubishi Kasei Corporation)
geleitet, um das L-Threonin daran zu adsorbieren. Nachdem die
Säule mit Wasser gewaschen worden war, wurde mit 0,5 N
wässrigem Ammoniak eluiert. Die L-threoninhaltigen Fraktionen
wurden gewonnen und konzentriert und dann mit Ethanol versetzt.
Das Gemisch wurde unter Kühlen gelagert, und es wurden 2,5 g L-
Threoninkristalle mit einer Reinheit von 98 % oder darüber
erhalten.
Beispiel 2
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Es wurde mit den Stämmen H-7256, H-7263, H-7293, H-7294 und H-
4258 eine Impfkultur, wie in Beispiel 1, angesetzt. Die so
erhaltene Impfkultur (100 ml) wurde in einen 2 l Fermenter, der
1 l eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung
enthielt, inokuliert. Es wurde unter Rühren bei 30ºC und
Belüftung (700 UpM, 1 l/min) 80 h lang gezüchtet. Während dieser
Zeit wurde das Fermentationsmedium nach Bedarf mit 60 % Glucose
versetzt, und der pH-Wert des Kulturmediums wurde mit wässrigem
Ammoniak bei 6,5 gehalten.
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Zusammensetzung des Fermentationsmediums: 30 g/l Glucose, 12
g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g/l MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 6 g/l
Diaminopimelinsäure, 1 g/l DL-Methionin und 12 g/l Maisquellwasser.
Die Mengen an in der Kultur gebildetem L-Threonin sind in der
Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Stamm
Menge an L-Threonin (g/l)