DE2321461C3

DE2321461C3 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin

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Publication number: DE2321461C3
Application number: DE19732321461
Authority: DE
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-04-27
Filing date: 1973-04-27
Publication date: 1976-01-29

Description

einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als assimilierbare Quelle fur Kohlenstoff Essigsäure verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man als assimilierbare Quelle für Kohlenstoff Äthanol verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß man die für das Wachstum erforderlichen Substanzen in dem Medium in Form von diese enthaltenden natürlichen Substanzen einsetzt.

Der zweite Typ wird durch threonin- oder pfindliche Mutanten und durch threoninidiicne und Threonin erfordernde Mutanten, Wachstum durch eine niedrige Konzentration von Threonin oder Methionin inhibiert wird darstellt wobei die letztere Mutante zum Wachstum Threonin benötigt. Diese Mutanten sind in der FR PS 15 33 688 beschrieben. Der dritte Typ ist eine Mutantc'welche gegenüber S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein (nachstehend als AÄC abgekürzt) welches das SchwefelmaloBC von L-Lysin ist, beständig ist. Diese Mutane„ "huf in der L)S-PS 37 07 441 beschneben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, L-Lys.n ,us ohne weiteres verfügbaren Ausgangsmatenahen mit niedriaen Kosten herzustellen. .-Lysin ist bekanntlieh für die menschliche und tierische Ernährung „umiiänulich. so daß Tür diese Substanz ein weiter Xnw-ndunusbcrcich als Ergänzungsm.ttel fur Nahrungu.uf Futtermittel erwartet werden kann.

Fs wurde nun gefunden, daß cine Mulantc. welche oe«cnüber eine/ Rückkopplungs-Inh.b.erung von F vsin und Lysm-Analogcn beständig ist und die cm Nährstofferfordernis für mindestens eine Substanz aus der Gruppe Serin. Prolin. Alanin. Nikotinamid. Pantothensäure Thiamin. Guanin, !hpoxanlhm und Vitamin B_n" besitzt, bei der Kultivierung meinem Beeimictcn Medium, welches assimilierbare Kohlenstoffyucllcn. Stickstoffquellcn und Mineralien enthalt. ,-Lysin erzeugt, das in dem Medium in großen Mermen angesammelt wird. Das auf diese Weise erzeugte i.-Lysin kann leicht aus dem Medium izewonnen werden.

~ Beim Verfahren der Erlmdung werden nun die bestimmten nachfolgend angeführten Stämme verwendet, die dazu imstande sind, L-Lys.n zu erzeugen und die aus Mutanten ausgewählt wurden, welche eine Beständigkeit gegenüber Lysin und dem Lysin-AnaloBcn S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein !Abkürzung AAC) und eines oder mehrere der obengenannten Nahrstoffcrfordernisse besitzen. .

Der Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren z\ir Herstellung von i.-Lysin durch aerobe; Züchten eines Lysin erzeugenden Stammes von Brevibi-cterium oder'Corynebacterium in einem Medium welches assimilierbare Quellen für Kohlenstoff unc Stickstoff anorganische Salze, für das Wachstum erfor derliche Substanzen und organische wachstumsför dcrndc Substanzen enthält, bei einem pH-Wert vo. 5 bis 9. das dadurch gekennzeichnet ist, daß man al Lysin erzeugenden Stamm

60

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch aerobes Züchten eines Lysin erzeugenden Stammes von Brevibacterium oder Corynebacterium in einem Medium, welches assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Salze, für das Wachstum erforderliche Substanzen und organische wachstumsfordcrndc Substanzen enthält, hei einem nll-Wert von 5 bis 9.

Brevibacterium
Brevibacterium
Brevibacterium
Brevibacterium
Brevibacterium
Brevibacterium
Brevibacterium
Brevibacterium

lactofermentum ATCC 21 798, lactofermentum ATCC 21 799. laclofcrmentum ATCC 21 800, lactofermentum ATCC 21 801. lactofermcnlum FFRM P-1711. lactofermenlum FFRM P-1712, lactofermentum 1'FRM P-1857, laclofcrmenuim IERM P-1570.

Brevibacterium lactofermentum FERM P-1573, Brevibacterium laciofermentum FERM P-1574, Brevibacterium lactofermentum FERM P-1575, Brevibacterium lactofermentum FERM P-1571. Brevibacterium lactofermentum FbRM P-1572, Corynebaclerium glutamicum FERM P-1613, Corynebacterium lilium FERM P-2026. Corynebacterium acetoacidophilum FERM P-2027,

Corynebacterium glutamicum FERM P-1982. Corynebacterium glutamicum FERM P-1984 oder
Corynebacterium giutamicum FERM P-1985

einsetzt. ,₅

Die fermentative Herstellung von L-Lysin unter Berücksichtigung bestimmter Nährstoff-Erfordernisse ist bereits bekannt. Dagegen sind aber die Nährstoff-Erfordernisse der aufgezählten erfindungsgemäß zu verwendenden (s. unten) Mutanten völlig neue Erfordernisse. wobei bislang noch nicht bekannt war. daß diese einen spezifischen Effekt auf die Erzeugung von i.-Lysin ausüben.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stamme wurden durch Selektion oderdurch herkömmliehe Induzierungsmethoden für künstliche Muianten hergestellt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Stämme haben folgende Eigenschaften und die folgenden Nährstofferfordernisse: jo

Brevibacterium lactofermenlum ATCC 21 798 (ein Senn benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm).

Brevibacterium lactofermentum ATCC 2! 799 lein Pantothensäure benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm),

Brevibacterium laciofermentum ATC C 21 XOO (ein Thiamin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm).

Brevibacterium lactofermenlum ATCC 21 KOi (ein Adenin oder Guanin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm). Brevibacterium laciofermentum FERM P-1711 (ein Alanin benötigender und gegenüber AAC beständiger Stamm),

Brevibaclenum lactofermentum 1-'ERM P-1712 (ein Alanin oder Valin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm), Brevibacterium lactqfermentum FERM P-1857 (ein Alanin plus Leucin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm), Brevibacterium lactofermentum FERM P-1570 (ein Prolin benötigender und gegenüber AÄC beständiger S la mm I, Brevibacterimr. lactofermentum 1-'ERM P-1573 (ein Vitamin B₁, benötigender und gegenüber AAC beständiger Stamm),
Brevibacterium lactofermentum FHRM P-1574 (ein Nicotinamid benötigender und gegenüber AAC beständiger Stamm).

Brevibacterium lactofermentum FERM P-1575 (ein I lypoxanthin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm),

Brevibacterium lactofermentum FERM P-1571 (ein Nicotinamid und Leucin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm). Brevibacterium lactofermentum F'ERM P-1572 (ein Serin und Leucin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm),
Corynebacterium gluiamicum FERM P-1613 (ein Serin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm),

Corynebacterium glutamicum FERM P-1982 {ein Prolin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm),

Corynebacterium glutamicum FERM P-1984 (ein Guanin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm),

Corynebacterium glutamicum FERM P-1985 (ein Vitamin B₁₂ und Leucin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm),
Corynebacterium lilium FERM P-2026
(ein Ah'.nin benötigender und gegenüber AAC beständiger Stamm),
Corynebacterium acetoacidophilum
FERM P-2027

(ein Alanin benötigender und gegenüber AÄC beständiger Stamm).

Die angegebenen FERM P-Nummern sind die Niederlegungsnummern beim Fermentation Research Institute. Agency of Industrial Science of Technology, the Ministry of the Industrial Trade an Industry. Japan. Von dieser Hinterlegungsstelle sind diese Stämme mit den FERM P-Nummern erhältlich.

Ein Vorlcil der vorliegenden Erfindung gegenüber den herkömmlichen Methoden besteht darin, daß die bestimmten neuen Mutanten zur Verfügung gestellt werden, die erhebliche Mengen von i.-Lysin erzeugen können. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die L-Lysin-Produktivität nicht sehr stark durch Schwankungen der Menge von Threonin und der anderen Nährstoffe in dem Medium beeinflußt wird, da die erfindungsgemäß verwendeten Stämme gegenüber Lysin-Analogen beständig sind.

Die Zusammensetzung des Fcrmenlationsmediums und die Kultivicrungsnicthodc entsprechen den herkömmlichen Verfahren, welche zur Fermentation von Aminosäuren verwendet werden. Für die Zwecke der Erfindung sind sowohl Medien geeignet, die gewöhnlich für herkömmliche Aminosäurefermentationen verwendet werden, als auch die bekannten Medien für die Erzeugung von Lysin durch Fermentation. Somit ist für die Kultivierung der erfindungsgemäß verwendeten Stämme entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum der verwendeten Stämme enthält. Beispiele hierfür sind Kohlenstoffquellcn. Slickstoffquellen und anorganische Verbindungen, welche von den verwendeten Mikroorganismen in den entsprechenden Mengen verwertet werden.

Als Kohlenstoffquellcn können z. B. Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Maltose. Saccharose, Stärke. Stärkehydrolysate, Melassen u.dgl. sowie andere geeignete Kohlenstoffquellen wie organische Säuren. z. B. Essigsäure, Propionsäure, Fumarsäure usw.. organische Substanzen, /.. B. Benzoesäure, oder Alkohole, z. B. Methanol und Äthanol, genannt werden. Diese Substanzen können entweder für sich oder im Gemisch von zwei oder mehreren verwendet werden.

Je nach der Assimilierfähigkeit der verwendeten Stämme ist es möglich, in dem l'ermcnlalionsmedium als KohicnstolTquellc Kohlenwasserstoffe in größeren oder geringeren Mengen zu verwenden.

Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder von Verbindungen wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, z, B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphai 5 usw. sowie ein oder rncrrnre Aminosäuren oder natürlich stickstoffenthaltende Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Peptone, Bouillon, Caseinhydrolysat.^, lösliche Fischprodukte, Reiskleienextrakt usw. Diese Substanzen können entweder für sich oder im Gemisch von zwei oder mehreren verwendet werden.

Beispiele für anorganische Verbindungen, die zu dem Kulturmedium gegeben werden können, sind Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphai, Eisensulfat und andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid und Natriumchlorid.

In dem Kulturmedium müssen Nährstoffe und andere Substanzen vorhanden sein, die für das Wachsturn des Stammes notwendig sind. Die wachstumsfordernden Mittel und die Nebennährstoffc, welche die Ausbeute und die Herstellungsgeschwindigkeit von i.-Lysin verbessern, umfassen Aminosäuren, wie Serin. Prolin, Alanin. Leucin usw., verschiedene Vitamine 2s wie Vitamin B₁₂. Thiamin. Pantothensäure. Nicotinamid (oder Nicotinsäure) usw.. Purinbasen wie Guanin, Adenin und Hypoxanthin. Sojabohnen proteinhydrolysate, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit. Peptone. Caseinhydrolysat u. dgl.

Es stellt einen wichtigen Faktor dar. die Menge der benötigten Aminosäure und der anderen Nähr-j. stoffe auf weniger als die optimale Konzentration für das Wachstum des Stammes der Mikroorganismen zu begrenzen, was eine Technik darstellt, die bei Aminosäurefermentationen ziemlich allgemein angewendet wird.

Die Fermentation wird bei Temperaturen zwischen 24 und 37¹C über Zeitspannen von etwa 24 bis 96 Stunden und unter aeroben Bedingungen unter Schütteln oder Belüftung und Rühren durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird zwischen 5 und 9 eingestellt. Wenn der pH des Mediums unterhalb 5.0 abfällt, dann wird er mit Neutralisationsmitteln wie Calciumcarbonat und wäßrigem Ammoniak eingestellt. Wenn organische Säuren als Kohlenstoffquel'en verwendet werden, dann neigt der pH-Wert des Mediums dazu anzusteigen. Er wird dann durch Zusatz, von Säuren, z. B. solchen organischen Säuren, die als Kohlenstoffquelle dienen oder durch Chlorwasserstoff oder Schwefelsäure auf einen Wert innerhalb des obengenannten Berriches eingestellt. Die Isolierung des L-Lysins aus der Kulturbrühe kann nach bekannten Methoden erfolgen. Die Bakterienzellen können durch Filtrieren oder durch Zentrifugieren entfernt werden. Das i.-Lysin kann unter Verwendung von Kationenaustauscherharzen isoliert werden.

Die Menge des in der Kulturbrühe erzeugten Lysins wurde unter Verwendung von Lysin-Decarboxylasc bestimmt.

5 g/dl Calciumcarbonat sowie einem pH-Wert von 7,2 besitzend, wurde hergestellt. 20-ml-Ansätze des Mediums wurden in 500 ml Schüttelkolben gebracht und sterilisiert. Die in Tabelle 1 angegebenen Stämme wurden in das Medium inokuliert und jnter Schütteln 72Stunden bei 3PC kultiviert. Die Menge des gebildeten L-Lysins (als Hydrochlorid) ist in Tabelle 1 angegeben.

Die Kulturmedien Tür die Stämme ATCC 2i 799 und ATCC 21 801 enthielten 5 mg/ml Calciumpantothenat und 100 mg/1 Adenin bzw. Guanin.

Die Bakterienzellen und feste Calciumsalze wurden aus der Kulturbrühe des Stammes ATCC 21 798 durch Zentrifugierung entfernt. 1 1 der überstehenden Flüssigkeit wurde in eine Säule eingegeben, welche mit einem starken Kationenaustauscherharz (vernetztes Polystyrol mit —SO,H-Gruppen) in der Wasserstoff-Form gefüllt war. Das auf dem Harz adsorbierte L-Lysin wurde mit 3%igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wurde Salzsäure gegeben. Es wurde in einem Eisschrank abgekühlt, um das i.-Lysin auszufällen. Auf diese Weise wurde rohes kristallines L-Lysinhydrochlorid-dihydrat in einer Menge von 30,2 g erhalten.

Beispiel 2

Brevibacterium laclol'ermentum ATCC 21 798, ATCC 21 799, ATCC 21 8(X) und ATCC 21 801 wurden jeweils in ein Keimmedium inokuliert, welches 1.5 g/dl Glucose. 0.3 g/dl Ammoniumacetat. 0.1 g/dl KH₂PO₄. 0.04 u/dl MgSO₄ · 7H₂O, 2 ppm Fe- und Mn-Ionen. 50 !ig/1 Biotin, 200 ag fThiamin · HCl. 1.5 ml/dl Sojabohnen proteinhydrol) sat (mit einem Gesamlstickstoffgehalt von 7%) und 0.5 g/dl Hefeextrakt enthielt und das einen pH-Wert von 8,0 hatte. Es erfolgte eine 16stündige Kultivierung bei 31 C unter Rühren und Belüften.

15 ml der einzelnen Keimkulturen wurden zur Inokulierung zu 300 ml eines Hauptkulturmediums gegeben, welches 3 g/dl Glucose, 0.5 gdl Ammoniumacetat, 0,2 g/dl Harnstoff, 0,1 g/dl KH₁PO₄. 0,04 g/dl MgSO₄ ■ 7H₂O, 2 ppm Fe- und Mn-Ionen, 50 ;;.g/l Biotin, 15[xg/I Thiamin · HCl, 3 ml/dl Sojabohnenproteinhydrolysat und die in Tabelle 2 gezeigten Nährstoffe enthielt und das einen pH-Wert von 7,5 hatte. Es erfolgte eine Kultivierung bei 31,5 C unter Rühren bei 1500UpM, wobei ein gleiches Volumen von Luft je Minute eingeleitet wurde. Während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,2 und 8,0 durch automatische Zugabe einer Mischlösung von Essigsäure und Ammoniumacetat gehalten. Diese enthielt 0,25 Mol Ammoniumacetat je Mol Essigsäure. Ihre Essigsäurekonzentration betrug 60%.

Nach einer 48stündigen Kultivierung wurden in der Kulturbrühe jedes Stammes 4.8 bis 6,4 g/dl i.-Lysinhydrochlorid festgestellt, wie es in Tabelle 2 ge/cigt wird.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, enthaltend 10gdl Glucose. 5 g,-dl (NH₄I₂SO₄. 0,1 g/dl KH₂PO₄. 0.04g dl MgSO₄ ■ H₂O. 2 ppm Fe und Mn-Ioncn. 50 u.g I Thiamin-HCI. 50 ;ig/i Biotin. 1.5 ml dl Sojabohnenproteinlndrolysai (mit 7% Gesumisiickstoff) und

Beispiel 3

Brevibacterium lactofcrmentum ATCC 21 798.

(.5 ATCC 21 799, ATCC 2180 und ATCC 21 801 wurden jeweils 16 Stunden bei 31,5 C unter Schütteln in einer Keimkultur kultiviert, welche 1.5 u dl Glucose, 0.3 g dl Harnstoff, 0,1 g/dl KH₂PO₄. 0.04 g dl MuSO₄ · 7H₂O.

I ppm Fe- und Mn-Ioncii, 50 ag/1 Biotin, 200 ag I rhiaminhydrochlorid, 1,5 ml/dl Sojabohnenprotcinlydrolysat und 0.5 g/dl Kefeextrakt enthielt und das :incn pH-Wert von 8,0 hatte.

15 ml von jeder Kcimkultur wurden da/u verwendet, .im 300 ml eines Hauptkulturmediums /u inokulieren, welches folgende Bestandteile enthielt:

Glucose 1 i: dl

Äthanol 1,5 g dl

(NH₄),SÜ₄ 0,5 g/dl

Harnstoff 0.2 g/dl

KH₁PO₄ 0,1 g/dl

MgSO₄ · 7 H₂O 0,04 g/dl

Fe⁺^ 2 ppm

Mn^{4 +} 2 ppm

Biotin 50 ag/1

Vitamin B₁HC! 5()';xg/l

Sojabohnen proleinhydrolysat

(Gesamtstickstoff:'7%) 3 ml/dl

Nährstoffe gemäß Tabelle 3
(pH: 7,5)

Die Kultivierung erfolgte bei 31,5 C unter Rühren mit 1500UpM, wobei je Volumen des Mediums ein gleiches Luftvolumen eingeführt wurde.

Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,0 und 7,5 durch Einleiten von gasförmigem Ammoniak in das Medium gehallen.

Die Menge des restlichen Äthanols wurde durch Gaschromatographie bestimmt. Äthanol wurde in das Medium eingegeben, als das restliche Äthanol auf etwa 0,3 g/dl zurückgegangen war.

Nach 48 Stunden wurde die Kulturbrühe jedes Stammes untersucht. Es wurde festgestellt, daß sie i.-Lysinhydrochlorid in den in Tabelle 3 gezeigten Mengen enthielt.

Beispiel 4

Brevibacterium iaclofermentum FERM P-1570. FERM P-1571.FERM P-1572.FERM P-1573.FERM P-1574 und FERM P-1575 wurden als Keimstämme verwendet und in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 kultiviert, mit der Ausnahme, daß in den in Tabelle 4 angegebenen Mengen Sojabohnenproteinhydrolysat zugefügt wurde und daß zu dem Medium für den Stamm FERM P-1575 5 mg/ml Hypoxanthin gegeben wurden.

In Tabelle 4 werden die Mengen an i.-Lysin (als Hydrochloride welche nach einer 72stündigen lnkubierung in der resultierenden Brühe gebildet worden waren, zusammengestellt.

Beispiel 5

Brevibacterium lactofermentum FERM P-1570. FERM P-1571. FERM P-1572. FERM P-1573. FERM P-1574 und FERM P-1575 wurden jeweils als Keimstämme verwendet und unter Verwendung von Essigsäure als Hauplkohlenstoffquelle wie im Beispiel 2 kultiviert, mit der Ausnahme, daß 5 mg/ml Hypoxanthin zu dem Medium Tür den Stamm FERM P-1572 gegeben wurden.

In Tabelle 5 ist die Menge von L-Lysin (als Hydrochlorid) angegeben, welche nach einer 48stündigcn Inkubierung in der erhaltenen Brühe jedes Stammes gebildet worden war.

Nach einer 48stündigen Kultivierung des Stammes FERM P-1571 in der oben beschriebenen Weise waren 30 Volumprozent Essigsäure je Anfangsvolumen des Mediums verbraucht worden. Es wurde festgestellt, daß die Kullurbrühe 7,1 g/dl i.-Lysin-hydrochlorid enthielt. Aus einem Liter Kulturbrühc wurden 56.3 g i.-Lysin-hvdroehlorid-dihydrat nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 erhalten.

Beispiel 6

ίο Brevibacterium lactofermentum FERM P 1570. IERM P-1571, FERM P-1572, FERM P-1573, FERM P-1574 und FERM P-1575 wurden jeweils als Keimstämme verwendet und unter Verwendung von Äthanol als Hauptkohlenstoffquelle in derselben Weise wie im Beispiel 3 kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Medium Tür den Stamm FERM P-1575 5 mg/ml Hypoxanthin gegeben wurden.

In Tabelle 6 ist die in der erhaltenen Brühe der einzelnen Stämme nach 48stündiger Inkubierung erhaltene L-Lysinmenge(alsHydrochlorid)zusammengestelll.

Aus Tabelle 6 wird ersichtlich, daß sich in der Kulturbrühe nach einer 48stündigen Kultivierung 6,3 g L-Lysin-hydrochlorid (27,7% Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Äthanol) befanden. Aus einem Liter der Kulturbrühe wurden nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 50,4 g i.-Lysinhydrochlorid-dihydrat erhalten.

B e i s ρ i e 1 7

Brevibacterium lactofermentum FERM P-1711. FERM P-1712 und Nr. 872 (Kontrollprobe) wurden als Keimstämme verwendet und in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Medium für den Stamm FERM P-1711 200 ag/1 Thiaminhydrochlorid und 3% Sojabohnenproteinhydrolysat gegeben wurden.
Die Tabelle 7 zeigt die gebildete Menge von !.-Lysin (als Hydrochlorid) in der resultierenden Brühe jede; Stammes nach einer 72stünd;gen Inkubierung.

Beispiel 8

Brevibacterium lactofermentum FERM P-1711 FERM P-1712 und Nr. 872 (Kontrollprobe) wurdei jeweils in einem Keimkulturmedium der folgendei Zusammensetzung inokuliert, und unter Rühren un< Belüften bei 3Γ C kultiviert.

Keimkulturmedium

Glucose

Ammoniumacetat

Harnstoff

KH₂PO₄

1.5%

0.3%

0,1%

MgSO₄ · 7H,O 0,04%

Fe ^{+ +} 2 ppm

Mn ^{+ +} 2 ppm

Biotin 50 ag/1

Thiaminhydrochlorid 200 ag/!

Sojabohnenproteinhydrolysat

(mit 7% Gesamtstickstoff) 2%

(pH: 7.5)

300-ml-Ansätze eines Hauptkulturmediums mit de nachfolgenden Zusammensetzung wurden in 1-!-GIa: fermentationskolben gegeben.

509 685/31

/LD 6 9

IlauptkulUirmcdium

Glucose -"'<>

Ammoniumacetat 0.5%

Harnstoff 0.2"/,,

KH₂PO₄ 0.1%

MgSO₄- 71I₂O 0,04%

Fe^f ' ". 2 ppm

Mn^M - ppm

Biotin 50 ag I

Thiaminliydrochlorid 50 ag 1

Sojabohncnproteinhydrolysat

(mit 7% Gesamtstiekstoff) 2.5%

(pH: 7,5)

Nach der Sterilisierung wurde jedes Medium mit 15 ml der obigen Keimkulturbrühe jedes Stammes inokuliert. Unter Rühren mit 1500 UpM wurde bei 31 bis 33 ¹C kultiviert, wobei ein gleiches Luflvolunicn je Minute eingeleitet wurde. Während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7.2 und 8,0 durch automatische Zugabe einer Mischlösung aus Essigsaure und Ammoniumacetal gehalten, welche 0,25 Mol Ammoniumacetal je Mol Essigsäure enthielt und bei welcher die Essigsäurekonzentration 60% betrug.

Nach einer 55stündigen Kultivierung wurde i.-Lysinhydrochlorid in den in Tabelle S gezeigten Mengen gebildet.

Beispiel 9

Brcvibaclcrium laetofermentum FERM P-17II. PERM P-1712 und Nr, 872 (Kontrollprobe) wurden in ein Keimkulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 8 inokuliert, mit der Ausnahme, daß für diese 0.5% Äthanol an Stelle von Ammoniumacetat und 0,3% Harnstoff gegeben wurden. Es wurde 18 Stunden unter Rühren und Belüften bei 31 C kultiviert.

Die Fermentation erfolgte in der gleichen Weise wie im Beispiel 8 unter Verwendung der erhaltenen Keimkulturbrühe, mit der Ausnahme, daß zu dem Hauptkulturmeaium 1% Glucose, 1% Äthanol und 0.5% Ammoniumsulfat an Stelle von Ammoniumacetal gegeben wurden.

Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7.2 und 8.2 durch Einführung von gasförmigem Ammoniak indem Medium gehalten.

Die Menge an restlichem Äthanol wurde durch Gaschromalographie bestimmt. In das Medium wurde Äthanol eingegeben, als der restliche Äthanolgehalt auf etwa 0.3% zurückging.

Nach 48 Stunden enthielt die Kulturbrühe jedes Stammes L-Lysinhydrochlorid in den in Tabelle 9 angegebenen Mengen

Beispiel 10

Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt. 20-ml-Ansätze dieses Mediums wurden in 500-ml-Schüttelkolben gegeben und 5 Minuten bei 110 C sterilisiert.

Zusammensetzung des Mediums

Glucose 10%

(NH₄I₁SO₄ 4.5%

KH₁PO₄ 0.1%

MgSO₄- 7H₂O 0,04%

Fe ^{+ T} 2 ppm

Mn⁺ "" 2 ppm

1 VV

Biotin 50 iig/1

Thiaminhydrochlorid 200 [ig/1

Sojabohncnproleinhydrolysal

(mit 7% Gesamtstickslol'O 1%

CaCO, 5%

(pH 7.0)

Brevibacterium lactofermentuin FERM P-1857, welches zuvor auf einer Bouillon-SehrägkulUir kultiviert worden war. wurde in das obengenannte Kulturmedium inokuliert. Es wurde 72 Stunden unter Schütteln bei 31 C kultiviert.

Als Ergebnis haben sich 5,1 g dl i.-l.ysin (als Hydrochlorid) in der Kullurbrühc angesammelt (51% Ausbeute, bezogen auf die eingesetzte Glucose).

Beispiel 11

Corynchactcrium glutamicum FERM P-HiI3, FERM P-I9H2, FERM P-1984, FERM P-1985, Corynebacterium lilium FERM P-2026 und C'orynebacterium aceloacidophilum FERM P-2027 wurden als Keimstämme verwendet und, wie im Beispiel 10 beschrieben, kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Medium für den Stamm FERM P-1984 weiterhin noch 0,5% llefeextrakt gegeben wurde.

In Tabelle 10 sind die gebildeten Mengen von !.-Lysin (als Ilydrochlorid) nach einer 72stündigen Kultivierung in der resultierenden Brühe der einzelnen Stämme zusammengestellt.

Beispiel 12

Coryncbactcrium glutamicum FERM P-1613, FERM P-1982. FERM P-1984, FERM P-1985. Corynebacterium lilium IERM P-2026 und Corynebacterium aeetoacidophilum 1 ERM P-2027 wurden als Keimstämme verwendet und, wie im Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von Essigsäure als Hauptkohlenstoffquclle kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Keimkullurmedium noch 0.5% Hefeextrakt gegeben wurden, daß der pH-Wert des Kcimkullurmcdiums auf 7,0 eingestellt wurde und daß zu dem ilauplkuHurrnedium 2,5% Sojabohnenprotcinhydrolysat gegeben wurden.

In Tabellell sind die Mengen an !,-Lysin (als

Hydrochlorid) angegeben, welche nach einer 55stündigcn Kultivierung in der resultierenden Höhe der einzelnen Stämme gebildet worden waren

Beispiel 13

Coryncbactcrium glutamicum PERM P-1613, Coryncbactcrium lilium FERM P-2026 und Coryncbactcrium aeetoacidophilum FERM P-2027 wurden in das unten angegebene Kcimkulturmedium inokuliert und IX Stunden unter Rühren und Belüften bei 31 C kultiviert.

Kcimkulturmedium

Glucose 1.5%

Harnstoff ... 0.3'%.

KH₁PO₄ 0.1%

MgSO₄- 7H₁O 0.04%

Fe⁺^ ". 2 ppm

Mn^{+ 4} 2 ppm

Biotin 50 ;ig 1

Thiaminhydrochlorid 2(K) ;ig 1

Sojabohnenprotcinhydrolysat

(mit 7%, Gcsamtslickstoff) 1.5%

(pH 7.5)

23

300-ml-Ansat/e eines HauptkuKu. mediums mi¹, der lgenden Zusammensetzung wurden in l-l-GlasrmeiHationskolben gegeben.

Hauplkuluinnedium

(jlucose 1"»

Äthanol 1%

(Nl I₄I₁SO₄ 0.5" ο

Harnstoff 0.2%

KH₁PO₄ 0.1",,

MgSO₄- 7 II,O 0.04",,

Fc"" ' 2 ppm

Mn* ' 2 ppm

Biotin 50 ;j.g 1

1 hiaminhydrochlorid 50 ;j.g 1 '⁵

Soja bohnen proteinhydrolysat

(mit 7"„ Ciesamlstickstoff) 2.5"/,,

IpH 7.5)

Nach der Sterilisierung wurde jedes Medium mit 15 ml der ein/einen kultivierten Keimbrühen der verschiedenen Stumme inokuliert. Es wurde bei bis 33 C unter Rühren kultiviert, wobei ein gleiches Volumen von Luft je Minute eingeleitet wurde. Während der Kultivierung wurde der pH-Wert des 2s Mediums /wischen 7.2 und 7.H durch Einleiten von gasförmigem Ammoniak in das Medium gehalten.

Die Menge an restlichem Äthanol in dem Medium wurde durch Gaschromatographie bestimmt. In das Medium wurde Äthanol eingegeben, als die Kon/entration des restlichen Äthanols auf etwa 0.3% abgesunken war.

In Tabelle 12 ist die Menge von i.-Lysin (als H vdrochloridl angegeben, welche in der resultierenden Brühe der einzelnen Stamme nach einer 48stündigcn Kultivierung gebildet worden waren.

Tabelle 1

461

Tahelle 3

Tabelle 4

Sla mm

FERM P-1570 FERM P-1571 FERM P-1572 FERM P-1573 FERM P-1574 FERM P-1575

Tabelle 5

Menge an gebildetem L>sin Ig dl)

12

Zugabe von Hypoxanlhin

Img.'dl)

Stumm	21	79 H	Zugegebener Nährstoff	lOOmii/1 und 100 mg/1	Menge an gebildetem Lysin
	21	799		(g dl)
ATCC	21	KOO		5.5
ATCC	21	SOl		4.4
ATCC			5.5
ATCC		Ca-Pantothenat: 5 mg ml	5.7

	Adenin: Guanin:

Menge an Sojabohncn- proiein- hydrolysal	Menge an gebildetem l.-Lysin
(%)	Ig dll
3	2,9
1.5	5.0
1.5	4.6
3	3,5
2	3.1
3	3.0

Menge an gebildetem 1 -Lysin

(g dl)

Brevibacterium laetofermentum ATCC 21 798

Brevibacterium lactofermcnUim ATCC 21 799

Brevibacterium laetofermentum ATCC 21 800

Brevibuclerium laetofermentum ATCC 21 801

Tabelle 2

ATCC 21 798
ATCC 21 799

ATCC 21 800
ATCC 21 801

Zuüeucbener Nährstoff

Ca-Pantothenat: 5 mg'ml

Adenin: lOOmglund Guanin: 100 mg/1

4.1 2.5 3.0 2.8

Menge an gebildetem Lysin

lg dl)

6.4

4.8

5.7 6.0

45

55 IERM P-1570 FERM P-1571 FERM P-1572 FERM P-1573 FERM P-1574 FERM P-1575

Tabelle 6
Stamm

60 FERM P-1570 FERM P-1571 FERM P-1572 FERM P-1573 FERM P-1574 FERM P-1575

5.4 7,1 7.0 6,5 5.8 6.1

Zugabe von Hypoxanthin	Menge an gebildetem i -Lysin
(mg/dl)	tg-dll
	5.2
-	6.3
—	6,5
	6.1
	5,0
5	5.5

. MJ^i m &?

13

Tabelle 7

Sl LI 111 111

IHRM P-171 I
FFRM P-1712

Nr. K72

Tabelle X

Si am m

FERM P-17II
FERM P-1712

Nr. 872

Tabelle 9

Menge an gebildetem l -Lysin

Ig dl)

4.4 3.2

1,8

Menge an gebildetem l.-Lysin

(gdl)

7,2 6.1 4,0

*Δ0 <L*	1	^D 1	IO
		Tabelle
		Stamm
Ausheute.
bezogen auf die cinucsel/le
(ilueose I" '.,I			P-1613
44	IO	1'¹IiRM	P-1982
32		I FR M	P-198 5
18		FIiRM	P-1984
		1 HRM	P-2026
	15	I HRM	P-2027
		1"HRM	Il
		Tabelle

14

Verbraucht ₂₀ Slaiiuii Lssigsaurc

T)

24

32

FHRM P-1613 FHRM P-1982 FFRM P-1984 FERM P-1985 IFRM P-2026 FFRM P-2027

Tabelle 12

Menge an	Ausheule.
gebildelem	bezogen auf
1 -Lysin	die ein
	gesetzte
	lilUL'ose
Ig dl)	("nl
3.0	30
3.0	30
4.1	41
3.1	31
1 0	^Ί9

Menge an gebildetem 1 -Lysin	Yeihiauchli Lssigsäure
Ig dlI	("111
5.0	T)
5.2	23,5
4.7	25
6.4	23
5.5	24
5.8	T)

Stamm

FERM P-1711
FERM P-1712

Nr. 872

Menge an gebildetem 1 -Lysin

Igdll

6.6 5,6 3.6

Ausheule, bezogen auf das eingesetzte Äthanol

t " I₁ )

26 20 17

Slamin

1 ERM P-1613 FERM P-2026 IFRM P-2027

Menge an gebildetem I -Lysin	Ausheule, be/ogen in das ein gesetzte Äthanol
(g dll	1".. 1
4.S	23
4.1	20.5
4 6	24

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur He stellung von L-Lysin durch aerobes Züchten eines Lysin erzeugenden Stammes 5 von Brevibacterium oder Corynebacterium in einem Medium, welches assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Salze, für das Wachstum erforderliche Substanzen und organische wachstumsfordernde Substanzen ent- 10 hält, bei einem pH-Wert von 5 bis 9, d a d u r c h gekennzeichnet, daß man als L-Lysin-erzeugenden Stamm

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21 798, Brevibacterium lactofermentum ATCC 21 799, '⁵ Brevibacterium lactofermentum ATCC 21 800, Brevibacterium lactofermentu m ATCC 21 801, Brevibacterium lactofermentum

FERMP-1711.
Brevibacterium lactofermentum

FERM P-1712,
Brevibacterium lactofermentum

FERM P-1857.
Brevibacterium lactofermentum

FERM P-1570,
Brevibai erium lactofermentum

FERM P-1573.
Brevibacterium lactofermentum

FERM P-1574,
Brevibacterium !actofermenium

FERM P-1575.
Brevibacterium lactofermentum

FERM P-1571.
Brevibacterium laclofermentum

FERM P-1572. ^

Corynebacterium glutamicum FERM P-1613. Corynebacterium Hlium FERM P-2026. Corynebacterium acetoaeidophiluin FERM P-2027.

Corynebacterium glutamicum FERM P-1982, Corynebacterium glutamicum FERM P-1984 oder
Corynebacterium glutamicum FERM P-1985 Die Bildung von L-Lysin aus _ fermentierbaren Kohlenhydraten durch Mikroorganismen ist bere.ts Sannt Unter den L-Lysin bildenden Mikroorganismen sind drei Bakterientypen als repräsentativ be^m _. rw ,.«te Tvp stellt eine Mutante dar, die zum