DE2031387C3 - Verfahren zur biochemischen Produktion von L - Histidin - Google Patents

Description

L-Histidin ist eine der für die Nahrung wichtigsten Aminosäuren. Es ist bei medizinischen Untersuchungen zur Ergänzung der Nahrung eingesetzt worden und stellt ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Uroxansäure und Histamin dar. Bislang wurde es in großtechnischem Maßstab durch Extraktion von Proteinhydrolysaten mit relativ hohen Kosten in komplexer Prozedur hergestellt

Es wurde gefunden, daß bestimmte Mutanten, die nach Induzierung mittels konventioneller mutagener Agentien aus Mikroorganismen der Genera Brevibacterium, Corynebacterium und Arthrobacter erhalten wurden, die Fähigkeit haben, extracellular L-Histidin während der aeroben Fermentation konventioneller Nährmedien zu produzieren, und daß das durch die Fermentation gebildete L-Histidin in an sich bekannter Weise aus dem Fermentationsmedium isoliert werden kann. Einige Mutanten sind — wie gefunden wurde — gegenüber mehr als lOOOy/ccm 2-Thiazolalanin im Medium resistent.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Produktion /on L-Histidin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Brevibacterium flavum ATCC 21406, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21 407 oder Arthrobacter citreus ATCC 21 412 unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das assimilierbare Lieferanten von Kohlenstoff und Stickstoff und geringe Mengen organischer Nährstoffe und anorganischer Salze enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, bei einem pH-Wert so von 5 bis 9 so lange der Fermentation unterwirft, bis die L-Histidin-Konzentration im Medium mindestens 1 g/l beträgt

Einige Beispiele für die in dem Nährmedium benutzten Kohlenstofflieferanten sind Kohlenhydrate (Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysate, Melassen, Stärke), Essigsäure, Alkohole und Kohlenwasserstoff.

Zur Erzielung einer guten L-Histidinausbeute wird die Fermentation aerob unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Will man maximale Ergebnisse erzielen, muß man den pH so regeln, daß er im Bereich von 5 bis 9 gehalten wird. Der pH-Wert kann mittels gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak, Calciumcarbonat, Alkalihydroxyd, Harnstoff, organischen oder anorganischen Säuren, die dem Medium von Zeit zu Zeit zugeführt fts werden, aufrechterhalten werden, wobei bekanntlich auch assimilierbarer Stickstoff zugeführt werden kann. Wird die Fermentation bei 25 bis 37°C durchgeführt, erreicht man die maximale Konzentration an L-Histidir im Medium innerhalb von 2 bis 7 Tagen.

Das von dem Medium mittels konventioneller lonenaustauschertechnik isolierte L-Histidin wurde durch den Rf-Wert eines Papierchromatogramms durch die auf dem Chromatogramm mittels der Diazoreaktioti entwickelten Farbe und die Reaktion der L-Histidin benötigenden Mikroorganismen in einem minimalen Nährmedium identifiziert Das in dem Medium vorhandene L-Histidin wurde mittels Bioversuch unter Verwendung des L-Histidin benötigenden Leuconostoc citrovorum bestimmt

Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren gemäß Erfindung unter Einsatz der besten zur Zeil zur Verfügung stehenden L-Histidin produzierenden Mutanten.

Beispiel 1

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt das pro I

100 g Saccharose

2 g KH₂PO₄

15 g Ammoniumsulfat

0,4 g MgSO₄ · 7 H₂O

200 γ Biotin

50 yThiamin-Hydrochlorid

2 mg Fe⁺ +

2 mg Mn⁺ +

1 % Sojabohnenproteinhydrolysat

enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt 300-ccm-Ansätze der Lösung sterilisierte man mit Dampf in 1-1-Fermentationsgefäßen und beimpfte sie dann mit Brevibacterium flavum AJ 3225 (ATCC 21 406), das zuvor auf Bouillonschrägschnitten bei 30⁰C für 24 Stunden kultiviert worden war. Es wurde ein pH-Wert von 7.5 bei 32°C für 48 Stunden durch Zuführung von gasförmigem Ammoniak aufrecht erhalten. In dem Medium wurden 43 g/l L-Histidin gebildet

Die Mikroorganismenzellen wurden aus 51 des Mediums abzentrifugiert, die Flüssigkeit über ein stark saures lonenaustauscherharz geleitet, das das L-Histidin zurückhielt, das Harz mit Ammoniumhydroxydiösung eluiert und das erhaltene Eluat teilweise im Vakuum verdampft Beim Kühlen kristallisierte L-Histidin aus dem Konzentrat aus. Man erhielt schließlich 8,4 g kristallines L-Histidin.

Beispiel 2

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das pro!

100 g Glucose

1 g KH₂PO₄

0,4 g MgSO₄ · 7 H₂O
40 g Ammoniumsulfat
100 γ Biotin
200 yThiamin-Hydrochlorid

2 mg Fe + ♦
2 mg Mn^{+ +}

t g Hefeextrakt

enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. 20-ccm-Arisätze des Mediums sterilisierte man mit Dampf und mischte jeden mit 5 g getrennt sterilisiertem Calciumcarbonat. Alle Ansätze wurden in einem Fermentationsgefäß mit Corynebacterium acetoacido-

philum AJ 3227 (ATCC 21 407) beimpft, das zuvor auf Bouillonagarschrägschnitten bei 30° C 24 Stunden kultiviert worden war, und die Fermentation 48 Stunden bei 30°C durchgeführt Es hatte sich L-Kistidin in dem Medium in einer Konzentration von 1.2 g/l angereichert.

Beispiel 3

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das pro I

70 g Glucose
IgKH₂PO₄

0,4 g MgSCV 7 H₂O

30 g Ammoniumsulfat

50 γ Biotin

200 γ Thiarnin-Hydrochlorid

20 ecm Sojabohnenproteinhydrolysat

enthielt Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt 20-ccm-Ansätze wurden sterilisiert, mit 5 g getrennt sterilisiertem Calciumcarbonat gemischt und mit Arthrobacter citreus AJ 3229 (ATCC 21 4!2) beimpft, das zuvor kultiviert worden war, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 55 Stunden Fermentation bei 31,5° C enthielt das Medium 1,2 g/l !.-Histidin.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biochemischen Produktion von L-Histidin, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium flavum ATCC 21 406, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21407 oder Arthrobacter citreus ATCC 21 412 unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das assimilierbare Lieferanten von Kohlenstoff und Stickstoff und geringe Mengen organischer Nährstoffe und anorganischer Salze enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 so lange der Fermentation unterwirft, bis die L-Histidin-Konzentration im Medium mindestens 1 g/l beträgt.