DE3121926A1

DE3121926A1 - Verfahren zur herstellung von l-prolin durch fermentierung

Info

Publication number: DE3121926A1
Application number: DE19813121926
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokyo Hagino; Toshihide Hofu Yamaguchi Nakanishi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1980-06-05
Filing date: 1981-06-03
Publication date: 1982-02-25
Also published as: US4444885A; IT1172243B; JPS572690A; GB2077262A; FR2483948A1; GB2077262B; IT8167770A0; JPS641116B2; DE3121926C2; CA1166588A; FR2483948B1

Description

Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen ' ^ ' " ^ 6

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolir. durch Fermentierung, wobei ein Mikroorganismus verwendet wird.

Zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentierung sind verschiedene Verfahren bekannt. So wird beispielsweise L-Prolin dadurch hergestellt, daß ein Wildstamm, ein Nährstoff erfordernder Starmr. oder ein Stamm gezüchtet wird, welcher gegen einen bestimmten chemischen Wirkstoff widerstandsfähig ist, wobei ein derartiger otamm aus den Bakterien der Genen Brev!bacterium, Microbacterium, Micrococcus, Paracolobacterium, Bacillus, Escherichia, Kurthia, Microbacterium und Corynebacterium oder einer Hefe des Genus Saccharomyces ausgewählt wird, wie dies in den japanischen Patentschriften 11751/68, 13679/68, '1193/69, II98/69, 6631/69, 26911/69, 38876/73, 28431/74, 33190/76, 40158/76, 41386/79 und 105293/79 beschrieben ist. In den japanischen Patentschriften 38557/71 und 42597/71 ist ein weiteres Verfahren offenbart, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Konzentration anorganischer Salze, welche in dem Medium enthalten sind, auf einen speziellen Bereich eingestellt wird. Andererseits ist es bekannt, daß die Biosynthese von L-Prolin über L-GIutaminsäure durchgeführt wird und daß die Absonderung von L-Prolin von einem Mikroorganismus der Escherichia coli durch Zusatz von L-Glutaminsäure zum Medium begünstigt werden kann. Der praktische Wert eines derartigen Verfahrens ist jedoch sehr gering, da die Menge des abgesonderten L-Prolin sehr gering ist und nur etwa 0,03 g/i beträgt (Biochimica et Biophysica Acta, vol. 104, 397 (I965)).

Berichte besagen auch, daß die Produktionsausbeute an L-Prolin durch Fermentierung von Kurthia catenaforma durch Zusatz eines

NACHQEREICHT

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oberflächenaktiven Wirkstoffes und L-Glutaminsäure zum Nährmedium verbessert werden kann (siehe Microbiology, vol. 23, 759-764 (1972)). .Es ist jedoch bisher niemals bekannt geworden, daß eine größere Menge an L-Prolin in der gezüchteten Flüssigkeit angereichtert werden kann, wenn die Fermentierung durch Verwendung einer Gruppe bestimmter Bakterien, und zwar der sogenannten Glutaminsäure erzeugenden Bakterien wie sie zu den Genen Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, und Microbacterium gehören, in einem Medium durchgeführt wird, welchem L-Glutaminsäure zugesetzt wird (J. of the Japanese Agricultural Chem. Sac, vol. 42, 703-710 (I968); Amino Acids and Nucleic Acids, No. 16, 126-133 (1967)).

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß es möglich ist> die Ausbeute an L-Prolin zu verbessern, ohne daß irgendein oberflächenaktiver Wirkstoff dem Nährmedium zugesetzt wird, wenn ein Nährmedium, welches wenigstens einen Stoff enthält, der aus L-Glutaminsäure und L-, D- und DL-Pyrrolidonkarbonsäure ausgewählt ist, mit einem Mikroorganismus geimpft wird, der aus den Bakterien der Genen Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter und Microbacterium und einer Hefe des Genus Saccharomyces ausgewählt wird.

Da L-Prolin in weitem Umfange beispielsweise zur Herstellung von Medikamenten, Nahrungsmitteln und dgl. verwendet wird, hat die Erfindung sich die Aufgabe gestellt, ein wirtschaftliches Verfahren zu schaffen, mittels welchem L-Prolin durch Fermentierung herstellbar ist.

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Gekennzeichnet ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentierung im wesentlichen dadurch, ; daß ein Mikroorganismus gezüchtet wird, welcher aus Bakterien ; und Hefen ausgewählt wird und fähig ist, L-Prolin in einem Nähr- ^; medium zu erzeugen, welches wenigstens einen der Stoffe enthält, . die aus L-Glutaminsäure und D-, L- sowie DL-Pyrrolidonkarbon- [ säure ausgewählt sind, um in der entstehenden Flüssigkeit L-Prolin anzusammeln, und daß aus dieser Flüssigkeit L-Prolin j gewonnen wird. :

Verwendet wird erfindungsgemäß ein Nährmedium, welches außerdem · wenigstens einen Stoff enthält, der aus L-Glutaminsäure und | D-, L- und DL-Pyrrolidonkarbonsäure ausgewählt ist, und zwar j in Verbindung mit einem Kohlenstofflieferanten, einem Stickstofflieferanten und anorganischen Verbindungen. S

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbaren Mikroorganismen umfassen L-Prolin erzeugende Organismen, welche zu den

Genen Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Micro- | bacterium und Saccharomyces gehören, wobei beispielsweise ι

folgende Stämme bevorzugt werden: · '

Corynebacterium glutamicum ATCC 21157

C. glutamicum ATCC 21158

C. glutamicum ATCC 21159 I

C. glutamicum ATCC 21355

C. acetophilum FERM-P 4o45

C. acetoacidophilum FERM-P 4962 <

Arthrobacter citreus FERM-P 4963 \

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4964 ; Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4965

Saccharomyces cerevisiae ATCC 20169. ■

^: · ■:. ^:\ -'■': 312192G

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Für das erfindungsgemäße Verfahren können entweder synthetische oder organische Medien verwendet werden, so lange das Medium eine geeignete Menge an assimilierbaren Kohlenstofflieferanten, Stickstofflieferanten und andere organische Substanzen sowie weitere Nährstoffe enthält, wie sie für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen benötigt werden. Bevorzugte Kohlens.tofflieferanten sind beispielsweise Kohlehydrate wie Glukose, Fruktose. Sucrose, Sorbitol, Glycerol, Maltose, Mannitol, Stärkehydrolysat, .MeIlassen und dergleichen; ferner organische Sauren wie Essigsäure, Pyruvinsäure, Milchsäure, Fumarsäure, Zitronensäure und dgl.; sowie Alkohole wie beispielsweise Methanol.* Äthanol usw.. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind beispielsweise Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze wie beispielsweise Ammonlumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumazetat und dgl.; ferner verschiedene Stickstoff enthaltene Verbindungen wie beispielsweise Harnstoff und dgl., Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Reisquellwasser, Caselnhydrolysat, Sojamehlhydrolysat, fermentierte Mikrobenkörper und deren Hydrolysate. Bevorzugte anorganische Substanzen Sind beispielsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat. Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kalziumkarbonat und dergleichen. Zusätzlich können Spurenmengen an Nährstoffen wie Biotin, Thiaminpantothensäure und dgl., falls gewünscht, verwendet werden. Bei Nährstoff erfordernden Mikroorganismen muß dem Medium eine geeignete Menge eines derartigen Nährstoffes zugesetzt werden, wie er für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich ist. Ein derartiger Zusatz ist allerdings dann nicht erforderlich, wenn, der erforderliche Nährstoff in der als Stickstofflieferant verwendeten natürlich vorkommenden Substanz enthalten ist.

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Die Lieferanten für L-Glutaminsäure und L-, D- und DL-Pyrrolidonkarbonsäure, welche dem Nährmedium zugesetzt werden können, iiind beispielsweise isolierte L-Glutarainsäure und Natriumglutamat sowie L-, D- und DL-Pyrrolidonkarbonsäure, ferner L-Glutaminijäure-Fermentierungsflüsslgkeit wie beispielsweise Glutaminsäure-Fermentierungsbrühen, Filtrat durch Entfernung von Mikrobenzellen aus den Fermentierungsbrühen, Mutterlauge aus der Trennung von Glutaminsäure aus Glutaminsäure-FermentierungsflUssigkeit, Mutterlauge aus der Trennung von Natriumglutamat, gemahlene Melassen und deren Ablauge, welche eine große Menge an Glutaminsäure oder Pyrrolidonkarbonsäure sowie andere Substanzen enthalten, welche Glutaminsäure oder Pyrrolidonkarbonsäure enthalten.

Die Menge an im Medium enthaltener Glutaminsäure oder Pyrrolidonkarbonsäure kann je nach der Art der verwendeten Mikroorganismen und der Zeit des Zusatzes der Säure und auch aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung des Mediums schwanken und beträgt gewöhnlich mehr als 5 g/l des Mediums. Die obere Grenze dürfte kaum kritisch sein. Bei Konzentrationen von mehr als 150 g/l können allerdings negative Auswirkungen des zur Einstellung des pH-Wertes verwendeten Salzes sowie der Viskosität beobachtet werden. Die Säure kann dem Medium auf einmal oder nach Impfung intermittierend zugesetzt werden, bis die Mikroorganismen ständig wachsen. Die Bedingungen der L-Prolin-Fermentierung können je nach den verwendeten Mikroorganismen schwanken, und die Temperatur beträgt vorzugsweise 25 bis 4o C. Während der Fermentierung wird vorzugsweise der pH-Wert des Mediums auf 6 bis 9 gehalten, indem beispielsweise anorganische oder organische Substanzen verwendet werden, welche einen sauren oder

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alkalischen pH-Wert besitzen, wie Harnstoff, Kalziumkarbonat und dergleichen. Unter diesen Bedingungen wird die Fermentierung ä/erobisch durchgeführt, um eine möglichst große Menge an L-Prolin Vorzugsweise in etwa 24 bis 120 Stunden anzureichern. Die Gewinnung von L-Prolin aus den fermentierten Brühen kann durch an sich bekannte Verfahren erfolgen, wie beispielsweise durch Verwendung von lonentauscherharz, Kristallisierung aus Methanol und dgl. oder durch Kombination beider Methoden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger keineswegs als Begrenzung anzusehender Beispiele im einzelnen erläutert, wobei die Prolinmenge durch die Methode bestimmt wurde, welche irn J, Biol. Chem., 199, 91^95 (1952) berichtet wird.

Beispiel 1

Ein Zuchtmedium (30 ml) mit untenstehender Zusammensetzung wurde in einen 250 ml-Krlenmeyerkolben eingefüllt, sterilisiert und mit Corynebacterium acetophilum FERM-P 4o45 geimpft. Die Fermentierung würde 24 h lang bei 28⁰C durchgeführt, wobei mit 220 U/min geschüttelt wurde.

^: Fleischextrakt ... 10 g/l, Pepton ... 10 g/l, Hefeextrakt ... 3 g/l, Natriumchlorid ... 3 g/l (pH ... 7,2).

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Das Hauptmedium hatte nachstehende Zusammensetzung:

Ablaugen ... 170 g/l (wie Glukose)

Sojamehlhydrolysat ... 20 g/l

KH₂PO₁₁ ... 0,6 g/l, MgSO₂₁-TH₂O ... 0,6 g/l,

₂SO₄ ... 23,4 g/l,
₂₁^H₂O ... 0,012 g/l,
Thiaminhydrochlorid ... 100/ug/l CaCO, ... 30 g/l (pH =7,4).

Dem Hauptmedium wurde eine vorgegebene Menge von Natrium L-GIutamat oder DL-Pyrrolidonkarbonsäure gemäß Tabelle 1 zugesetzt. Das Medium (300 ml) wurde dann in einen 2 1-Erlenmeykerkolben übergeführt, welcher in jedem Fall mit einer Prallfläche ausgerüstet war. Nach der Sterlisierung wurde jedes Hauptmedium jeweils mit 30 ml dieser Zuchtkultur geimpft und dann bei 28°C 4 Tage lang unter Schütteln mit 220 U/min gezüchtet. Für jeden Fall ist die angereicherte Menge an L-Prolin in nachstehender Tabelle 1 angegeben.

	■ - - -	312192G	"Beispiel 2	A	Zusatz von	B	FERM-P 4964 und	, (NH₁J)₂SO₄	. 0,5 g/l, .
		Partner, Patentanwälte in Essen	'Arthrobacter citreus FERM.-P	(g/D		(g/l)	jeweils nach dem	,,,20 g/l,	... 30 g/l,
Andrejewski, Hönke &		- 11 -	FERM-P 4965, Brevibacterium	25,1	Medium.)	24,8	Verfahren gemäß Beispiel 1 behandelt, wobei das Hauptmedium
	Tabelle 1	Saccharomyces otyevisiae ATCC	25,3	25,1	jedoch nachstehende.Zusammensetzung hatte:
	L-Frolin durch	26,9	27,7	Glukose ... 100 g/l, KH₂PO₂, ..
Angehäufte Menge an	oder	31,4	30,1	K₂HPO₂J ... 0,5 g/l
(A-) Natriumglutamat	(B) L-Pyrrolidonkarbonsäure (g/l	35,6	34,8	Sojamehlhydrolysat
Zusatz	39,1	35,4
(g/l)	4o,5	36,6
0	40,7	36,8
1
3		4963, Microbacterium ammoniaphilum
10		lactofermentum
20	2QI69 wurden
50
90
100

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Biotin ... 100/Ug/l, MgSO^HgO ... 0,25 g/1, -TH₂O ... 12 mg/1,

MnSO^"4HgO ,,, 12 mg/1, ZnSO^*7HgO ... 10 mg/1, Thiaminhydrochlorid ... 100/Ug/l, CaCO₃ ... 30 g/1 (pH = 7,2).

Vor der Verwendung wurde dem Hauptmedium Natrium L-Glutamat (20 g/l) oder L-Pyrrolidonkarbonsäure (20 g/l) zugesetzt, um L-Prolin gemäß Tabelle 2 anzureichern.

Tabelle

Angehäufte Menge an L-Prolin durch Zusatz von

(A) Natriumglutamat oder

(B) L-Pyrrolidonkarbonsäure (g/l)

(1) Arthrobacter citreus FERM-P 4963 · '

(2) Brevibacterium lactofermentatum FERM-P 4964 O) Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4965 (4) Saccharomyces cerevrsiae ATCC 20169

Zusatz (g/1) (1) " (2) * Ο).' (4)

ohne		4,3	6,8	3,2	2,1
A	20	13,1 -	17,4	16,1	11,3
B	20	12,9 ■	16,2	15,3	10,5

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Seispiel 3

Die gleiche Behandlung wie im Beispiel 1 beschrieben wurde unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum ATCC 21355 und eines Mediums durchgeführt, welches nachstehende Zusammensetzung hatte:

Glukose ,,, l?0 g/l, Urea ... 3 g/l, Ammoniumsulfat ... ^O g/l, Ammoniumchlorid ,,, 30 g/l, KH₂PO₄ ... 1,5 g/l, K₂HPO₄ ... 0,5 g/l,

MgSO₂₊-TH₂O ... 0,5 g/l, PeSO₄-7H₂O ... 0,02 g/l, MnSO₄«4H₂O ... 0,02 g/l, Biotin ... 50/Ug/l, Thiaminhydrochlorid ,,, 1 mg/1, Pepton ... 10 g/l, (pH=7,2)

24 h nach Beginn der Fermentierung wurde dem Medium Paraldehyd (4o g/l) zugesetzt. Die Fermentierung wurde bei 28⁰C 4 Tage lang unter Schütteln (220 U/min) durchgeführt und es sammelte sich 27,0 g/l an L-Prolin. Die gleiche Behandlung unter Zusatz von 20 g/l an Natriuinglutamat ergab 38,9 g/l an angesammelten L-Prolin.

Beispiel 4

Ein Zuchtmedium (200 ml), bestehend aus

Sucrose ... 6o g/l, KH₂PO₄ ... 2 g/l, MgSO₄-TH₂O ... 0,5 g/l, FeS0₄-7H₂0 ... 0,01 g/l, MgSO₄-4H₂O ... 0,01 g/l, Maisquellwasser ... 5 g/l, Thiaminhydrochlorid ... 100,ug/l, Biotin ... 100/Ug/l, Sojamehlhydrolysat ... 20 g/l, Urea ... 3 g/l (pH=7,4)

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wurde in einen 2 1-Erlenmeyerkolben gefüllt, der mit einer Prallfläche ausgestattet war, und sterilisiert. Danach wurde das Medium mit Corynebacterium acetophilum PERM-P 4o45 oder C. acetoacidophilum FERM-P 4962 beimpft und bei 28°C unter Schütteln (220 U/min) 24 h lang gezüchtet.

Einem Hauptmedium, bestehend aus

Sucrose ... 20 g/l, Ammoniumazetat ... 7 g/l, MgSO₄-7H₂O ... 0,6 g/l, KH₂FO₄ ... 4 g-'l, (NH^)₂SO₄ ... 4o g/l, Sojamehlhydrolysat ... 20 g/l, FeS0₄'7H₂0 ... 0,012 g/l, MnSO₄^H₂O ... 0,012 g/l,

ZnS0₄*7H₂0 0,01 g/l, Biotin .... 100/Ug/l,

Thiaminhydrochlorid ... 100/Ug⁷I (pH=7,4)

wurde eine Mutterlauge zugesetzt, die durch Kristallisierung und Trennung von Natriumglutamat in einer Menge von 20 g/l, berechnet als Glutaminsäure, erhalten wurde. Jeweils 700 ml der Mischung wurde in eine Gärflasche gefüllt und sterilisiert. Danach wurde das Hauptmedium mit jeweils 200 ml der Zuchtkultur geimpft und bei 30⁰C unter aerobischen Bedingungen gezüchtet. Während der Fermentierung wurde der pH-Wert des Mediums automatisch auf 7,0 durch Zusatz von Essigsäurelösung eingestellt.

72 Stunden nach Beginn der Fermentierung betrug der Essigsäureverbrauch 15$ auf Basis des AusgangsVolumens des Mediums, und die angereicherte L-Prolinmenge betrug ^>ö,8 g/l bei FERM-P 4o45 bezw. 30,1 g/l bei FERM-P 4962. Zum Vergleich wurde die gleiche

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Behandlung ohne Zusatz von Glutaminsäurelösung durchgeführt, wobei die entsprechende L-Prolin-Werte 25,4 g/1 bei FERM-P 4045 bezw. 21,3 g 1 bei FERM-P 4962 betrugen.

Claims

Andrejewski, Honke & Partner Patentanwälte Diplom-Physiker Dr. Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur Dr.-Ing. Manfred Honke Diplom-Physiker Dr. Karl Gerhard Masch Anwaltsakte: 4300 Essen 1, Theaterplatz 3, Posff. 100254 57 2o8/R+th 1. Juni I981 Patentanmeldung KYOWA HAKKO KOGYO KABUSHIKI KAISHA 6-1, Ohte-machi 1-chome, Chiyoda-ku, Tokto-to, Japan Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentierung. Patentansprüche.

1. Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentierung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus gezüchtet wird, welcher aus Bakterien und Hefen ausgewählt wird und fähig ist, L-Prolin in einem Nährmedium zu erzeugen, welches wenigstens einen der Stoffe enthält, die aus L-Glutaminsäure und D-, L- sowie DL-Pyrrolidonkarbonsäure ausgewählt sind, um in der entstehenden Flüssigkeit L-Prolin anzusammeln, und daß aus dieser Flüssigkeit L-Prolin gewonnen wird.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ■ Mikroorganismus zum Genus Corynebacterium gehört.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Corynebacterium ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch J>, dadurch gekennzeichnet, daß der ■ Mikroorganismus aus Corynebacterium glutamicum ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der' j Mikroorganismus aus Corynebacterium glutamicum ATCC 21157, ■ Corynebacterium glutamicum ATCC 21158 > Corynebacterium glutamicumj ATCC 2115S und Corynebacterium glutamicum ATCC 21355 ausgewählt I wird. \

6. Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Corynebacterium acetophilum und Corynebacterium acetoacidopftili/7n ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Corynebacterium acetophilum FERM-P 40¥F und Corynebacterium acetoaeidopffilum PERM-P h^6Z ausgewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Arthrobacter, Brevibacterium und Microbacterium ausgewählt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Arthrobacter citreus, Brevibacterium lactofermentum und Microbacterium ammoniaphilum ausgewählt wird.

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10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Arthrobacter citreus FERM-P 4963, Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4964 und Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4965 ausgewählt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus den Hefen der Saccharomyces ausgewählt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Saccharomyces certwsiae ATCC 20169 verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei einer Temperatur von 25 bis 40°C und bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an wenigstens einem der Stoffe Glutaminsäure, D-, L- und DL-Pyrrolidonkarbonsäure 3 bis I50 g/l des Nährmediums beträgt.