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L-Arginin ist ein wichtiger Bestandteil pharmazeutischer Präparate zur
Stimulierung von Leberfunktionen, von Aminosäureinfusionen,
Aminosäuregesamtpräparaten usw. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein
verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Fermentation.
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Um Mikroorganismen des Genus Brevibacterium oder des Genus
Corynebacterium L-Arginin-Produktivität zu verleihen, wird der Mikroorganismus
bekanntermaßen mit Resistenz gegen 2-Thiazolalanin (hiernach einfach als 2-TA
bezeichnet), Argininhydroxamat usw. ausgestattet. Es ist ebenso bekannt, daß
die Produktivität für L-Arginin verbessert wird, indem Resistenz gegen
Sulfonamidpräparate oder Argininol-Resistenz, Resistenz gegen Chemikalien
wie 8-Azaguanin, α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure usw., zusätzlich zu der oben
beschriebenen Chemikalien-Resistenz, verliehen wird, und indem Auxotropie für
Aminosäuren wie L-Histidin, L-Prolin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Lysin usw.
verliehen wird.
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Um die Herstellungskosten für L-Arginin zu verringern, ist es wichtig, die
Ausbeute der Fermentation zu verbessern.
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Das Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst wird, ist, ein
Fermentationsverfahren zu liefern, das die Herstellung von L-Arginin in höheren
Ausbeuten gestattet.
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Als ein Ergebnis von Untersuchungen, um bekannte Mikroorganismen des
Genus Brevibacterium oder des Genus Corynebacterium, die zur Bildung von
L-Arginin fähig sind, zu verbessern und um Stämme zu finden, die eine weiter
verbesserte Fermentationsausbeute bewirken, wurde gefunden, daß Stämme,
die zur Bildung von L-Arginin in einer höheren Ausbeute als herkömmliche
L-Arginin-produzierende Stämme fähig sind, unter Stämmen gefunden werden
die Resistenz gegen X-Guanidin (worin X eine aliphatische Kette oder ein
Derivat einer aliphatischen Kette ist) (hiernach einfach als X-GN bezeichnet) haben.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von L-Arginin, welches das Züchten eines L-Arginin produzierenden
Mikroorganismus des Genus Brevibacterium oder des Genus Corynebacterium in
einem flüssigen Kulturmedium, die Bildung und Anreicherung von L-Arginin in
dem Kulturmedium und die Gewinnung von L-Arginin aus dem Kulturmedium
umfaßt, worin ein L-Arginin produzierender Mikroorganismus verwendet wird,
welcher Resistenz gegen X-Guanidin hat, worin X eine aliphatische Kette oder
ein Derivat einer aliphatischen Kette ist.
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Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind
Varianten des Genus Brevibacterium oder des Genus Corynebacterium, welche
zur Bildung von L-Arginin fähig sind und X-GN-Resistenz haben. Um die
Varianten der vorliegenden Erfindung zu erhalten, kann den unten
beschriebenen Wildstämmen vorher die Produktivität für L-Arginin verliehen
werden, und dann kann ihnen X-GN-Resistenz verliehen werden; alternativ kann
zuerst X-GN-Resistenz verliehen werden, und dann kann L-Arginin-Produktivität
verliehen werden.
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Die Verbindungen der Formel X-GN sind Guanidine, die aliphatische Ketten
haben, wie Butenylguanidin, Hexylguanidin, Octylguanidin usw. und Derivate von
Guanidinen, die aliphatische Ketten haben, wie z.B. 4-Methyl-3-butenylguanidin
usw.
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Wildstämme, die Elternstämme der Varianten der vorliegenden Erfindung
sein können, sind als Bakterien des Genus Brevibacterium oder des Genus
Corynebacterium, insbesondere als coryneforme L-Glutaminsäure produzierende
Bakterien bekannt und werden durch die folgenden Bakterien beispielhaft
erläutert.
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Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
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Brevibacterium flavum ATC C 14067
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Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
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Brevibacterium saccharolyticum ATC C 14066
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Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
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Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
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Um Varianten der vorliegenden Erfindung von diesen Elternstämmen
herzustellen, kann zur Mutation zweckmäßig ein herkömmliches
Mutationsverfahren verwendet werden, welches den Kontakt dieser Stämme mit
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin usw. umfaßt. Die Isolierung der Variante der
vorliegenden Erfindung kann ausgeführt werden, indem Stämme gewonnen
werden, die in einem Medium, welches X-GN enthält, wachsen können.
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Ein konkretes Mutationsverfahren, um die Variante der vorliegenden
Erfindung herzustellen, und die Beziehung zwischen der Konzentration von
Octylguanidin (hiernach einfach als O-GN bezeichnet) als einer der
Verbindungen X-GN und dem Wachstum des Stammes sind unten gezeigt.
Mutationsverfahren
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Bakterienzellen von Brevibacterium flavum AJ 11169, FERM P-4161 (2-TA
resistenter Stamm abgeleitet von ATCC 14067) und Corynebacterium
glutamicum AJ 12092, FERM P-7273 (2-TA resistenter Stamm abgeleitet von ATCC
13032), die auf Schrägagar (bouillon agar slants) bei 30 ºC für 24 h gewachsen
waren, wurden in M/30 Phosphatpufferlösung in einer Zelldichte von 10&sup8; bis
10&sup9;/ml suspendiert. Zu der Zellsuspension wurden 500 ug/ml
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Minuten bei 30 ºC
gehalten. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen. Nach
gründlichem Waschen mit M/30 Phosphatpufferlösung wurden die Zellen auf ein
Medium, welches die folgende Zusammensetzung hat, aufgeimpft und bei 31,5 ºC
für 4 bis 10 Tage gezüchtet.
Zusammensetzung des Mediums (pH 7.0)
Komponente
Gehalt
Glucose
Harnstoff
Biotin
Thiaminhydrochlorid
O-GN
(O-GN = Octylguanidin)
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Von den im Agar-Medium gewachsenen Stämmen wurden Brevibacterium
flavum AJ 12429, FERM BP-2227 (2-TA resistent, O-GN resistent) und
Corynebacterium glutamicum AJ 12430, FERM BP-2228 (2-TA resistent, O-GN
resistent) mit hoher Produktivität für L-Arginin erhalten.
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Die O-GN-Resistenz der so erhaltenen Varianten wurde mit der der Eltern-
Stämme verglichen.
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Auf ein Medium, zusammengesetzt aus 0,5 g/dl Glucose, 0,15 g/dl
Harnstoff, 0,15 g/dl Ammoniumsulfat, 0,3 g/dl KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 g/dl K&sub2;HPO&sub4;, 0,01 g/dl
MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,1 mg/dl CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 100 ug/l Biotin, 100 ug/l
Thiaminhydrochlorid, 0,002 g/dl FeSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,002 g/dl MnSO&sub4; 7H&sub2;O und O-GN in der
in der Tabelle gezeigten Menge und eingestellt auf pH 7,0, wurde eine
Suspension der Zellen in sterilem Wasser aufgeimpft, welche durch Züchten auf
einer schrägen Fläche natürlichen Mediums (1 g/dl Pepton, 1 g/dl Hefeextrakt
und 0,5 g/dl NaCl pH 7,0) für 24 Stunden erhalten wurden. Nach 24-stündigem
Züchten wurde der Wachstumsgrad in Form von Trübung bestimmt.
Tabelle 1
Stamm
Inhibitor
O-GN-Konzentration (ug/ml)
Brevibacterium flavum AJ 11169 (FERM P-4161)
Brevibacterium flavum AJ 12429 (FERM BP-2227)
Corynebacterium glutamicum AJ 12092 (FERM P-7273)
Corynebacterium glutamicum AJ 12430 (FERM BP-2228)
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In vielen Fällen nimmt die Ausbeute zu, indem den oben erwähnten
Varianten weiterhin Eigenschaften verliehen werden, welche bereits bekannt
dafür sind, die Produktivität für L-Arginin zu verbessern, wie z.B. Sulfaguanidin-
Resistenz, Argininol-Resistenz oder 8-Azaguanin-Resistenz.
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Medien, die zur Züchtung solcher Varianten verwendet werden, sind
herkömmliche Medien, welche Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen,
anorganische Ionen, Substanzen, die der oben beschriebenen Auxotropie Genüge
leisten, und, falls notwendig, andere organische Spuren-Nährstoffe
einschließlich Vitamine usw. enthalten.
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Als Kohlenstoff-Quellen werden vorzugsweise Kohlenhydrate wie Glucose,
Saccharose usw., organische Säuren wie Essigsäure usw. verwendet. Als
Stickstoff-Quellen, werden vorzugsweise Ammoniak-Wasser, Ammoniak-Gas,
Ammonium-Salze usw. verwendet. Als anorganische Ionen werden dem Medium
geeigneterweise Kalium-Ionen, Natrium-Ionen, Magnesium-Ionen, Phosphat-
Ionen und ähnliche hinzugefügt, je nach Notwendigkeit.
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Die Beimpfung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen
durchgeführt. Wird die Beimpfung, während der pH des Mediums auf einen
Bereich von 4 bis 8 eingestellt wird, bei einer Temperatur von 25 ºC bis 37 ºC
durchgeführt, können stärker bevorzugte Ergebnisse erhalten werden. Somit
werden, während einer Züchtungsperiode von 1 bis 7 Tagen, bemerkenswerte
Mengen an L-Arginin in dem Medium gebildet und angereichert.
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Zur Gewinnung von L-Arginin aus der Kulturlösung können herkömmliche
Verfahren benutzt werden, wie z.B. ein Verfahren, welches ein
Ionenaustauscher-Harz usw. verwendet.
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Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf das folgende Beispiel weiter
beschrieben.
Beispiel
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Ein Medium, welches 10 g/dl Glucose, 7 g/dl (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 g/dl KH&sub2;PO&sub4;,
0,04 g/dl MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 1 mg/dl FeSO&sub4; 7H&sub2;O, 1 mg/dl MnSO&sub4; 4H&sub2;O, 100 pg/l
Thiamin HCl, 100 ug/l Biotin, 60 mg saures Hydrolysat von Sojabohnenprotein
(berechnet als Gesamtstickstoff) und 5 g/dl Calciumcarbonat (getrennt
sterilisiert) enthält, wurde auf pH 7,0 eingestellt, und 20 ml des Mediums wurden in
einen 500 ml Kolben mit einer Schulter (shoulder) übertragen, gefolgt von
Sterilisation durch Erhitzen. Eine Platin-Öse [voll] des in Tabelle 1 gezeigten
Stammes wurde auf das Medium aufgeimpft und unter Schütteln für 4 Tage bei
31,5 ºC gezüchtet L-Arginin wurde in der Kulturlösung jedes Stammes in der in
Tabelle 2 gezeigten Menge gebildet und angereichert.
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AJ 12429 wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren gezüchtet, um
1 Liter der Kulturlösung zu ergeben. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um die
Zellen und ähnliches zu entfernen. Der Überstand wurde durch ein schwach
saures Ionenaustauscherharz "Amberlite" C-50 (NH&sub4;-Typ) laufen gelassen. Nach
Waschen des Harzes mit Wasser, wurde L-Arginin mit 2 N NH&sub4;OH eluiert und
das Eluat wurde aufkonzentriert. Aus dem Konzentrat wurden 19,5 g L-Arginin
als Rohkristalle erhalten.
Tabelle 2
Eigenschaft
Menge an angereichertem L-Arginin (g/dl)
Brevibacterium flavum AJ 11169 (FERM P4161)
Brevibacterium flavum AJ 12429 (FERM BP-2227)
Corynebacterium glutamicum AJ 12092 (FERM P-7273)
Corynebacterium glutamicum AJ 12430 (FERM BP-2228)
2-TAr : 2-Thiazolalanin-Resistenz
O-GNr : Octylguanidin-Resistenz