DE1911470A1

DE1911470A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

Info

Publication number: DE1911470A1
Application number: DE19691911470
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hagino; Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-03-15
Filing date: 1969-03-06
Publication date: 1970-11-12
Also published as: GB1200587A; ES364661A1; FR2003971A1; CH492783A; NL6903994A; YU33887B; JPS4810234B1; IT994505B; DK118122B; SE358182B; US3595751A; YU63169A; BE729882A

Description

_D . 191U70

Patantanwciiie

Dr.-lng. HANS RUSCHKE
DipL-!ng. HEINZ AGULAR

8 Müp'-iirti: --Π. Pisn/eti'suerstr 2 Q j/·'-" --, 'i--j!jy

K 886 - S/B

Kyowa Hakko Kogyo, Oo<,, Ltd₀ Tokyo (Japan)

Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

Zusammenfas sung

Das Verfahren zur Herstellung von L-Lysin duroh Fermentation besteht in der Kultivierung eines L-Lysin erzeugenden Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das Äthylalkohol als das überwiegend kohlenstoffhaltige Substrat enthält. Zu den als Mikroorganismen verwendeten Genera gehören Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter_f Bacillus und Nocardiac

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin» -insbesondere zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentationο Im speziellen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L*-Lysin durch Fermentation unter Verwendung von Äthylalkohol als ein Substrat,

L-Lysin ist eine als essentielle: Aminosäure äusserst brauchbare Aminosäure_o Es sind bereits Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation bekannt, jedoch

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bestanden keine Anweisungen oder Vorschläge zur Herstellung von I-Lysin aus Äthylalkohol (Äthanol)als ein Substrat« Ein derartiges Verfahren ist besonders vorteilhaft, da Äthylalkohol mit geringem Kostenaufwand in der Erdölindustrie erzeugt wird und in einem Kultivierungsverfahren leicht zuhandhaben ist« Darüberhinaus weist Äthylalkohol den Vorteil auf, daß er wasserlöslich ist im Gegensatz zu Stoffen, wie z«B» Kohlenwasserstoffe, die in Wasser unlöslich sind, und er kann in weitem Bereich von den verschiedensten Mikroorganismen verwendet werden. Ausgehend von diesen Paktoren wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation aus Äthylalkohol als Ausgangsmaterial untersucht, das zur vorstehenden Erfindung führte»

, Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von I-Lysin, das die bisherigen Nachteile und Unzulänglichkeiten beseitigt·

Ferner liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L—Lysin durch Fermentation, das in wirksamer und relativ einfacher Weise durchgeführt werden kann.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zu Herstellung von L-Lysin durch Fermentation, das in vorteilhafter Weise in industriellem Maßstab unter _ geringem Kostenaufwand und unter Erzielung hoher Produktausbeute durchgeführt werden kann. .

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von L-Lysin«

Aufgrund der Untersuchungen hinsichtlich der Herstellung von L-Lysin durch Kultivierung verschiedener Mikröorganis-

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men in Äthylalkohol als ein Substrat enthaltenden Kulturmedien wurde gemäß der Erfindung gefunden, daß Bakterien^die zu den Genera Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus und Nocardia gehören, zur Herstellung von L-Lysin aus Xthylalkohol in ausgezeichneten Ausbeuten befähigt sind· Demzufolge sind die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen L-Lysin erzeugende Stämme,die zu diesen Genera gehören und die eine Äthylalkohol-assimilierende Eigenschaft aufweisen*

Sowohl ein synthetischen Kulturmedium als auch ein natürliches Mhrmedium ist zur Kultivierung der erfindungsgemäß verwendeten Stämme geeignet,solange es die zum Wachstum der verwendeten Stämme wesentlichen Nährstoffe enthält· Derartige Nährstoffe sind bekannt und dazu gehören Stoffe, wie ζ·Β· eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff quelle, anorganische Verbindungen und dergl·, die von den verwendeten Mikroorganismen in geeigneten Mengen gebraucht werden. Wie in der Torstehenden Beschreibung bemerkt, wird Xthylalkohol in dem Medium als die Hauptkohlenstoffquelle verwendet. Andere Kohlenstoffquellen können ebenso in dem Medium verwendet werden, und dazu gehören Stoffe, wie beispielsweise Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse, Mannose, Glycerin und dergl·, oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie z.B. organische Säuren, beispielsweise Essigsäure, Milchsäure,

und dergl·· Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren eingesetzt werden»

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Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie z«B_e flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze,, z»B« Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und dergl», oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie beispielsweise Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Oaseinhydrolysate, Ca.seinaminosäure, gelöste Fischsubstanzen, Reiskleieextrakt, entfetteter Sojabohnenkuchen, Chrysalishydrolysate oder verschiedene Verdauungs- oder Zersetzungsstoffe davon, verwendet werden. Diese Substanzen können wiederum entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren angewendet werden·

Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, .Zinksulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat und dergl«#

Falls der in dem Fermentationsverfahren der Erfindung verwendete Mikroorganismus zu seinem Wachstum einen speziellen Nährstoff benötigt, sollte dieser natürlich dem Nährmedium, falls dieses den Stoff nicht bereits enthält, wie z.B· die in dem Medium enthaltenen stickstoffhaltigen organischen Verbindungen, zugesetzt werden. Auch können dem Medium andere Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Aminosäuren, Vitamine, wie z#B. Thiamin, Cobalamin, und dergl,», oder Biotin zugegeben werden. Es ist somit ersichtlich, daß die Zusammensetzung des erfindungsgemäß angewendeten

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Mhrmedium das gleiche ist, wie das üblicherweise bei der Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation verwendete Nährmedium«,

Der Äthylalkohol wird dem Kulturmedium zu Beginn der Kultivierung oder während des Verlaufs der Kultivierung auf einmal oder in Abständen in einer Menge zugesetzt, die die Erzeugung von L-lysin nicht hemmt₀ Vorzugsweise liegt die dem Medium zugesetzte Äthylalkoholmenge im Bereich von 10 bis 200 g/lo

Die Bedingungen der angewendeten Kultivierung entsprechen den üblicherweise bei AminsoSäurefermentationen ange~ wendeten Bedingungen« Die Kultivierung wird also unter aeroben Bedingungen, wie z,B· aerobes Schütteln der Kultur oder unter Belüften und Rühren einer Submerskultur, bei einer (Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von beispielsweise etwa 5»5 bis 9,5 durchgeführt. Die besten Ergebnisse werden durch Beibehaltung eines etwa neutralen pH~Bereichs (710) während der Kultivierung erhaltene Die Kultivierung wird unter diesen Bedingungen durchgeführt,bis L-Lysin in beträchtlichen Mengen in der sich ergebenden Kulturflüssigkeit erzeugt ist, was im allgemeinen etwa 30 bis 150 Stunden dauert«

Nach beendeter Kultivierung wird das L-Lysin aus der Permentationsflüssigkeit durch übliche Mittel, wie beispiels«- weise Ionenaustauschbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption, Chromatographie, Konzentrierung oder derglo, gewonnene Eine besonders geeignete Methode ist die Ionenaustauschharzbehandlung, die im

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folgenden Beispiel 1 beschrieben ist_e

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu begrenzen« Falls nichts anderes angegeben, beziehen sich die Prozentangaben in den Beispielen und der Beschreibung auf das Gewicht pro Liter Wasser. Beispiele für Mikroorganismenstämme, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders vorteilhaft eingesetzt werden, sind darin beschriebene

Beispiel 1

Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicus: Japanische veröffentlichte Patentschrift 3698/57) ATCC 13287» eine L-Lysin-erzeugende Mutante, wird als Impfmikroorganismus verwendet· Dieser Mikroorganismus wird in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben, der 20 ml eines Kulturmediums (pH 7»4) enthält, eingeimpft, wobei das Kulturmedium die folgende Zusammensetzung aufweist:

15 ml/1 Äthylalkohol

2,5 g/l Harnstoff

0,5 g/l

0,5 g/l
0,25 g/l
0,01 g/l

0,01 g/l

5Οχι g/l Biotin

10 g/l NZ-Amin (Handelsbezeichnung für ein

Casein-Enzymhydrolysat)

0,02 g/l Phenolrot

K₂HPO₄	7H₂O
KH₂PO₄	7H₂O
MgSO₄.	4H₂O
FeSo₄ ·
MnSO. · 4

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Die Kultivierung wird dann unter aerobem Schütteln bei 30⁰C während 96 Stunden durchgeführt« Während dieser Kultivierung wird ein Gemisch aus drei Teilen Äthylalkohol und einem Teil 50#iger (Gew_#/V) Harnstoff lösung, bezogen auf das Volumen,zu-dem Medium in 4 ml-Mengen auf einmal zu vier verschiedenen Zeitpunkten zugesetzt, wobei ein Anzeichen von Gelb in der Färbung der Kulturflüssigkeit aufgrund des Phenolrots auftrat. Die Konzentration an L-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit nach Beendigung der Kultivierung betragt 8,4 mg/ml»

1,1 1 des nach Entfernen der Mikroorganismenzellen aus der Kulturflüssigkeit erhaltenen Filtrats wird durch ein schwach basisches ^ionenaustauschharz (Amberlite IRC-50) geleitet, das vorher mit einer 0,5 m Buffer-Lösung auf pH 7,0 präpariert war, und die Harzkolonne wird mit Wasser gewaschen. Durch Elution mit 0,15 n-Ammoniakwasser, Konzentrierung unter vermindertem Druck, Einstellung auf einen sauren pH-Wert (4,0) und weitere Konzentrierung werden L-Lysin enthaltende Fraktionen gewonnen. Man erhält dabei 5,6 g Kristalle aus L-LysinmonohydroChlorid»

BeJBpi«! 2

Der L-Lysin-erzeugende Mutantenstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19350, wird als Impfmikroorganismus verwendet» Die Kultivierung wird unter den gleichen Bedingungen und in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1, beschrieben, mit der Ausnahme durchgeführt, daß 5 mg/l Thiamin zu dem Fermentationsmedium gemäß Beispiel 1 zugegeben werden. Die Konzentration an L-Lysin in der

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ORIGINAL INSPECTED

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Kültivierungsfiüssigkeit nach Beendigung äir fermentation beträgt 3*1 lüg/ml,

Beispiel^

Die If-IiySin-erzeugende Mutante Bacillus megäteriüm KY 8110 (Bac-11) ATOC 21029 wird als Impfmikröbrganismüs verwendet* Dieser Stamm wird in einen Erleniüeyerkolben, mit 20 ml eines Kulturmediums mit den in foigendeü angegebenen Bestandteilen eingeimpft:

15 ml/l Äthylalkohol 20 g/l (M₄J₂SO₄

0*5 g/L K₂HPO₄ Öj5 g/l KH₂PO₄

0,25 g/1 MgSO₄ * 7H₂O

0*01 g/l FeSO₄ * 7H₂O

0*01 g/1 MnSO₄ , 4H₂O

20 g/1 GaCO^

15jtt g/1 Biotin 10 g/1 NZ-Amin 100 mg/1 Meso-diaminopimeiinsäüre Phenöirot

Die Kultivierung wird unter aerobem Schüttgin bei J>QK während 96 Stunden durchgeführt. Während der Kultivierung wird der pH-Wert dee MeäiUins iia wesentlichen im Neütraipunkt gehalten^ indem ein Geinisbh äüi 3 ieiieä Äthylalkohol und 1 Teil Ammoniakwasser^ bezögeh auf das Voiümihj je nach Erfordernis in Ö0 Mi-intfeilfeh auf

ORSGfNAL fNSPECTEO

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einmal zugegeben wird, wobei ein Anzeichen von Gelb in der Färbung des Phenolrots auftrat. Die Konzentration an L-Lysin in der Kulturflüssigkeit nach Beendigung der Fermentation beträgt 2,3 mg/ml.

Beispiel 4

Die in der folgenden Tabelle wiedergegebenen L-Lysinerzeugenden Stämme verschiedener Bakterien werden als Impfmikroorganismus verwendet· Die Kultivierung wird unter den gleichen Bedingungen und in der gleichen Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben,mit der Ausnahme durchgeführt, daß ein durch Weglassen der Meso-diaminopimelinsäure aus dem Fermentationsmedium nach Beispiel 1 hergestelltes Kulturmedium verwendet wird· Die Mengen an in der erhaltenen Kulturflüssigkeit nach Beendigung der Fermentation angesammeltem L-Lysin sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Tabelle

Verwendete Stämme

Menge an erzeugtem L-Lysin (mg/ml)

Arthrobacter paraffineus ATOC 21298

Nocardia sp. ATCO 21337

2,1 2,7

Die vorstehend beschriebene Erfindung kann in vielfältiger Weise abgeändert werden, wobei derartige Variationen von der Erfindung umfasst werden©

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß ein L-Lysin-erzeugenderjZur Assimilierung von Äthylalkohol befähigter Mikroorganismus, der zu einem Genus Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus oder Nocardia gehört, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Äthylalkohol als das -&ett£*kohlen8toffhaltige Substrat enthaltenden Nährmedium kultiviert wird und L—Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angesammelt wird·

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis AOK und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9,5
durchgeführt wird·

5· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei etwa 7 gehalten wird«

4» Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß etwa 10 g/l bis 200 g/l Äthylalkohol zu dem Medium zugesetzt werden·

5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet. daß der Äthylalkohol zu dem Medium zu Beginn der
Kultivierung zugegeben wird«

6· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnetj daß der Äthylalkohol zu dem Medium nach Beginn der Kultivierung zugesetzt wird·

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7. Verfahren zur Herstellung von L-Lyöin§ dadurch gekennzelfchnett daß ein i-Lysih erzeugeriderj ztir As-similierung von Äthylalkohol befähigter Mikroorganismus, der zu einem Genus Cörynebacterium^ Brevibacterium, Arthröbäcter, P&eudomonas, Bacillus, Äzotobäcter oder NoGärdia gekört» unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis AO⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9»5 in einem wäßrigen Äthylalkohol als das itattptkolilehstoffhaltige Substrat enthaltenden Nähr-» medium kultiviert wird, L-Lysin in der erhaltöiien Kulturflüssigkeit angesammelt und das L-Lysin daraus •gewonnen wird«

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium glütamicum JfcTGG 13287 verwendet wird*

9* Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium ammonlagenes ATCC 19350 verwendet wird.

10. Verfahren nach Anepruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus megateriuin ATCC 21029 verwendet wird»

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet. daß als Mikroorganismus Arthröbäcter paraffineus ATCC 21298 verwendet wird»

12. Verfahren nach Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet. daß als Mikroorganismus Nöcardia sp* AIiCC 21337 verwendet wird»

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