DE2500876A1

DE2500876A1 - Verfahren zur herstellung von hefezellen

Info

Publication number: DE2500876A1
Application number: DE19752500876
Authority: DE
Inventors: Reiko Michimi; Teizi Urakami
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1974-01-14
Filing date: 1975-01-10
Publication date: 1975-07-17
Also published as: GB1461234A; DE2500876C3; CA1030468A; JPS50100283A; DE2500876B2; IT1028323B

Description

Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc., Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung von Hefezellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefezellen unter Verwendung einer neuen Hefe. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Hefezellen durch Kultivieren einer neuen Hefe, die zu Saccharomyces gehört, in einer Kulturflüssigkeit, welche Methanol und/oder Äthanol als Hauptkohlenstoffquellen enthält, und durch Abtrennung der Zellen der Hefe von der Kulturflüssigkeit.

Bislang werden Abfallmolassen, Sulfitpulpenabfallflüssigkeiten und η-Paraffine als Kohlenstoffquellen in Kulturmedien zur Herstellung von Hefezellen verwendet. Neuer-

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dings sind jedoch viele Arbeiten erschienen, die Herstellungsverfahren von Hefezellen durch Kultivieren von Hefen mit billigen Kohlenstoffquellen betreffen. In den letzten Jahren sind mit dem Fortschreiten der organischen synthetischen chemischen Industrie Methanol und Äthanol in großen Mengen hergestellt worden, so daß diese Alkohole mit niedrigen Kosten erhältlich sind. Diese Alkohole sind wasserlöslich und können daher als Kohlenstoffquellen für Hefekultivierungsmedien verwendet werden. Als Materialien für die Fermentierung von Hefen sind sie am meisten zu bevorzugen.

Durch die Erfindung wird nun ein Verfahren zur Herstellung von Hefezellen zur Verfügung gestellt, bei dem eine neue Hefe gezüchtet wird, die dazu imstande ist, Methanol und/oder Äthanol als Hauptkohlenstoffquellen zu assimilieren.

Aus Erden der Reisfelder von Kashiwazaki, Niigata, Miyagi, Nakanoguchigawa, Niigata und Kamo, Niigata, wurden einige wenige Stämme isoliert. Man nimmt an, daß sie zur Art Saccharomyces gehören, sie unterscheiden sich jedoch in verschiedenen Punkten von bekannten Hefen dieser Art, wie sie nachstehend aufgeführt werden sollen. Es wurde daher die Schlußfolgerung gezogen, daß es sich um neue Arten handelt, und sie wurden als Art Saccharomyces aganobii bezeichnet. Beispiele dieser Stämme werden als Saccharomyces aganobii Y-16, Y-145, Y-410 und Y-1023 bezeichnet. Sie wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, hinterlegt. Ihre Hinterlegungsnummern sind FERM-P Nr. 2427, FERM-P Nr. 2428, FERM-P Nr. 2429 und FERM-P Nr. 2430. Der Hinterlegungstag ist der 25. Dezember 1973.

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Nachstehend sind die mikrobiologischen Eigenschaften der obengenannten Stämme angegeben:

Mikrobiologische Eigenschaften von Saccharomyces aganobii Y-16:

(a) Wachstumszustand auf verschiedenen Medien:

1. MY-Flüssigkeitsmedium, 2- bis 7-tägige Kultivierung bei 28°C:

Vegetative Zellen mit einer Größe von 2 bis 5 x 2 bis 5 jx . Runde, ovale bis kurzellipsoide Gestalt, wobei sie einzeln oder in Paaren auftreten. Keine Bildung eines Häutchens bzw. einer Membran. Keine Bildung von Arthrosporen. Reproduktion durch multilaterales Knospen.

2. MY-Agarmedium, 4-tägige Kultivierung bei 28⁰C:

(1) Wachstumsgrad: üppiges Wachstum.

(2) Gestalt des Umfangs der Kolonien: gesamter Umfang.

(3) Erhabener Zustand der Kolonien: gepolstert oder konvex.

(4) Gestalt der Oberfläche der Kolonien: glatt.

(5) Glanz der Kolonien: glänzend.

(6) Natur der Kolonien: butterartig bzw. buttersäureartig.

(7) Farbton: gelblich-weiß.

3. Methanolhaltiges Agarmedium (* Fußnote Nr. 2), 7-tägige Kultivierung bei 28⁰C:

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(1) Wachstumsgrad: üppiges Wachstum.

(2) Gestalt des Umfangs der Kolonien: gesamter Umfang.

(3) Erhabener Zustand der Kolonien: gepolstert oder konvex.

(4) Gestelt der Oberfläche der Kolonien: glatt.

(5) Glanz der Kolonien: Glänzend.

(6) Natur der Kolonien: butterartig bzw. buttersäureartig.

(7) Farbton: gelblich-weiß.

4. Riesige Kolonien auf MY-Agarmedium, 20-tägige Kultivierung bei 2O⁰C:

(1) Wachstumsgrad: üppiges Wachstum.

(2) Gestalt des Umfangs der Kolonien: gesamter Umfang.

(3) Erhabener Zustand der Kolonien: erhaben.

(4) Gestalt der Oberfläche der Kolonien: glatt.

(5) Glanz der Kolonien: kreideartig.

(6) Natur der Kolonien: butterartig bzw. buttersäureartig.

(7) Farbton: weiß.

5. Ob₁J ektträgerkultür auf Maisextrakt-Agarmedium, 4-wöchige Kultivierung bei 28⁰C:

Keine Bildung eines echten Mycels noch eines Pseudomycels.

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(b) Bildung von Ascosporen:

Die Bildung von Ascosporen wurde auf einem Malzagarmedium und einem Natriumacetatagarmedium beobachtet, Die Ascosporen hatten eine ovale bis ellipsoide Gestalt und eine Anzahl von 1 bis 4.

(c) Bildung von Ballistosporen:

Auf einer MY-Agarplattenkultur wurde keine Bildung von Ballistosporen beobachtet.

(d) Physiologische Eigenschaften:

1. Optimale Wachstumsbedingungen:

Gutes Wachstum bei 20 bis 35°C. Ein gutes Wachstum wurde bei einem pH von 2 bis 7,5 beobachtet.

2. Wachstumsbereiche:

Das Wachstum wurde bei oberhalb 35°C schlecht. Das Wachstum wurde bei einem pH-Wert von oberhalb 7»5 schlecht.

3. Assimilierung von Nitraten: negativ.

4. Assimilierung von Arbutin: positiv.

5. Verflüssigung von Gelatine: negativ.

6. Bildung von karotinoidem Pigment: negativ.

7. Bildung von stärkeartigen Verbindungen: negativ.

8. Vitaminerfordernde Eigenschaften: Biotin war absolut erforderlich. Thiamin wurde stimulativ benötigt.

9. Koagulierung von Milch: negativ.

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10. Osmotoleranz: Salztoleranz, wobei in einer wäßrigen Lösung, die nicht mehr als 8 Gew.-% Natriumchlorid enthielt, ein Wachstum festgestellt wurde.

1'1. Assimilierung von Methanol oder Äthanol (* Fußnote Nr. 3): Ausgezeichnetes Wachstum unter Assimilierung von Methanol als Kohlenstoffquelle selbst in Abwesenheit von anderen Kohlenstoffquellen. Gutes Wachstum unter Assimilierung von Äthanol, obgleich, nur langsam.

12. Ureasetest: negativ.

13. Fettspaltung: negativ.

14. Erzeugung überschüssiger Säure: negativ.

15. Bildung von Ester: negativ.

(e) Fermentation von Sacchariden:

D-Glukose +

D-Galactose

Saccharose

Maltose

Cellobiose

Trehalose

Lactose

Inulin

Raffinose

Melibiose -

06-Methyl-D-glucosid

lösliche Stärke

(f) Assimilierung von verschiedenen Kohlenstoffquellen:

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Kohlenstoffquelle Assimilierung

D-Arabinose + (langsam)

L-Arabinose ++

D-Ribose ++

D-XyIose ++

D-Glukose ++

D-Mannose ++

D-Galactose ++

L-Rhamnose
Maltose
Saccharose
Lactose
Melibiose

Cellobiose ++

Trehalose ++

Raffinose
Melezitose
06-Methyl-D-glucosid
lösliche Stärke
Inulin

Erythrit ++

Inosit

D-Mannit ++

Glyzerin ++

DL-Milchsäure

Salicin ++

Bernsteinsäure ++

Zitronensäure + (langsam)

Arbutin ++

D-Glycitit ++

Mikrobiologische Eigenschaften von Saccharomyces aganobii Y-410:

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Es werden nur diejenigen Eigenschaften angegeben, die sich von denjenigen von Saccharomyces aganobii Y-16 unterscheiden.

(f) Assimilierung von verschiedenen Kohlenstoffquellen: Zitronensäure

Mikrobiologische Eigenschaften von Saccharomyces aganobii Y-.145:

(f) Assimilierung von verschiedenen Kohlenstoffquellen:

DL-MiIchsäure + (langsam)

Zitronensäure

Mikrobiologische Eigenschaften von Saccharomyces aganobii Y-1023:

Es werden nur diejenigen Eigenschaften angegeben, die sich von denjenigen von Syccharomyces anganobii Y-16 unterscheiden.

(e) Fermentation von Sacchariden: Saccharose +

(f) Assimilierung von verschiedenen Kohlenstoffquellen: Zitronensäure

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Fußnoten:

1. Die Tests wurden entsprechend den Angaben in Lodder's "The Yeasts, A Taxonomic Study", 1970 und Hiroshi Iizuka und Shoji Goto: "Method for Classification and Identification of Yeasts", 1969, durchgeführt.

2. Das methanol- (oder äthanol-) haltige Agarschrägmedium wurde auf folgende Weise hergestellt:

In 1 1 destilliertem Wasser wurden 4 g· KH₂PO₄, 3 g (NH₄)₂S0₄, 0,4 g MgSO₄-7H₂O, 0,2 mg FeSO₄'7H₂O, 5 mg CaCl₂«2H₂0, 0,5 mg MnS0₄'4H₂0, 0,5 mg ZnS0₄*7H₂0, 4 ug Biotin, 200 u g Thiaminhydrochlorid und 20 g Agar aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde auf einen pH-Wert von 4,7 eingestellt, 20 min lang bei 1 atü sterilisiert und sodann aseptisch mit 10 g Methanol (oder Äthanol) versetzt.

3. Es wurde das gleiche Flüssigkeitsmedium wie bei Fußnote 2 verwendet, mit der Ausnahme, daß das Agar weggelassen wurde.

Aufgrund der Tatsache, daß die obigen Stämme alle runde bis ellipsoide Ascosporen und keine Arthrosporen oder Ballistoporen bilden und die Zellen rund oder oval sind, daß die Stämme durch eine multilaterale Verknospung reproduziert werden, daß sie kein Pseudomycelium bilden, keine Nitrate assimilieren und kein Häutchen bilden, werden sie nach Lodder: "The Yeasts, A Taxonomic Study" (1970) als zu der Art Saccharomyces gehörig angesehen.

Beim Vergleich der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Hefen mit denjenigen der bekannten Stämme, die in der Arbeit

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von Lodder "beschrieben sind, stellt sich heraus, daß die Hefen darin den Stämmen ähnlich sind, die zu der Art Saccharomyces aceti gehören, daß sie keine Galactose, Saccharose, Maltose und Melibiose fermentieren, 1 bis 4 Ascosporen bilden und Trehalose assimilieren. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Hefen darin den Stämmen der Art Saccharomyces bisporus ähnlich, daß sie keine Galactose, Saccharose, Maltose und Melibiose fermentieren, Vitamine erfordern, keine Lactose assimilieren und eine kleine Zellgröße haben.

Die erfindungsgemäßen Hefen unterscheiden sich jedoch von den Stämmen der Art Saccharomyces aceti in der Form der Zellen, den Eigenschaften der Kolonien, der Spaltung von Arbutin, der Fermentierung von Saccharose, Maltose und Trehalose und der Assimilierung von L-Arabinose, D-Arabinose, D-Ribose, D-Xylose, D-Galactose, Saccharose, Cellobiose, Erythrit, D-Mannit, Salicin, Bernsteinsäure und D-Glycitit und sie unterscheiden sich weiterhin von den Stämmen der Art Saccharomyces bisporus in der Form der Zellen, der Eigenschaften der Kolonien, der Spaltung von Arbutin, der Fermentation von Saccharose und Maltose und der Assimilierung von Cellobiose, D-Ribose, Erythrit, Trehalose, L-Arab.inose, D-Arabinose, Salicin, Bernsteinsäure, D-Galactose, Saccharose und Glyzerin.

Aus den oben angegebenen Unterschieden wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Hefen nicht zu den bekannten Hefen gehören, wie sie in der Art von Lodder zusammengestellt sind. Aufgrund der Tatsache, daß die erfindungsgemäßen Hefen Methanol und/oder Äthanol assimilieren, gibt es auch keine Übereinstimmung der erfindungsgemäßen Hefen mit bekannten Stämmen. Daraus kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die erfindungsgemäßen Hefen zu einer

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neuen Art gehören, die als Saccharomyces aganobii bezeichnet wird.

Die Kulturflüssigkeit, die zur Kultivierung der erfindungsgemäßen Hefe verwendet wird, kann jedes beliebige synthetische oder natürliche Medium sein, sofern es Methanol und/oder Äthanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Es kann weiterhin geeignete Mengen von Stickstoffquellen, anorganischen Stoffen, Vitaminen und anderen wachstumsfördernden Substanzen enthalten.

Als Stickstoffquellen werden stickstoffhaltige Substanzen verwendet, wie Ammoniumsalze, Harnstoff, Maisquellflüssigkeit, Kasein, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Weiterhin ist es vorzuziehen, anorganische Salze, wie Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Phosphate, Mangansalze, Zinksalze, Eisensalze und Kupfersalze, und Substanzen, die für das Wachstum erforderlich sind, oder wachstumsfördernde Substanzen, wie Vitamine und Aminosäuren, zuzusetzen.

Die Kulturflüssigkeit kann 6 Gew.~% oder weniger, vorzugsweise 3 Gew.-% oder weniger, Methanol und/oder Äthanol enthalten. Die Fortpflanzungsinduktionsperiode der erfindungsgemäßen Hefe ist geringer und die Verdampfungsverluste von Methanol und/oder Äthanol aus der Kulturflüssigkeit sind niedriger, da die Anfangsalkoholkonzentration in der Kulturflüssigkeit niedriger ist und vorzugs weise 0,5 Gew.-% oder weniger beträgt. Die Fortpflanzungs- induktionsperiode ist länger, da die Methanol- und/oder Äthanolkonzentration größer ist, wenn die Alkohole die einzige Kohlenstoffquelle sind. Die Periode kann auch durch weitere Einarbeitung von bis zu 10 Gew.-% weiteren

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assimilierbaren Kohlenhydraten, wie Glukose, in die Kulturflüssigkeit zusätzlich zu dem Alkohol kontrolliert werden. Aufgrund der obigen Umstände ist es besser, die Alkoholkonzentration in der Kulturflüssigkeit am Beginn der Kultivierung so niedrig wie möglich einzustellen und die Alkoholkonzentration bei einem konstanten Wert zu halten, indem man nur so viel Alkohol ergänzend zusetzt, wie verbraucht wird. Weiterhin wird die Kultivierung unter aerobischen Bedingungen bei Temperaturen von vorzugsweise 10 bis 37⁰C, in der Praxis von 20 bis 33⁰C, mehr bevorzugt von 27 bis 32⁰C, und bei einem pH-Wert von 7,5 oder weniger, vorzugsweise von 2 bis 7, durchgeführt.

Die Kultivierung kann absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Im Falle der Verwendung eines Ammonium*· salzes als Stickstoffquelle wird Ammoniak während der Kultivierung verbraucht, weil Zellen gebildet werden, wodurch der pH-Wert der Kulturflüssigkeit verringert wird. Um den pH-Wert der Kulturflüssigkeit während der Kultivierung bei einem konstanten Wert zu halten, sollte der pH-Wert der Kulturflüssigkeit daher durch Zugabe von Ammoniak, Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid von Zeit zu Zeit kontrolliert werden. Vqn diesen Substanzen wird Ammoniak am meisten bevorzugt.

Nach beendigter Kultivierung auf die obige Weise werden die resultierenden Zellen von der Kulturflüssigkeit durch Filtrierung oder Zentrifugierung abgetrennt. Erforderlichenfalls werden die Zellen gewaschen«

Die auf diese Weise erhaltenen nassen Zellen werden getrocknet und sie können als Beschickungen verwendet werden, entweder wie sie sind oder nach verschiedenen Be-

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handlungen. Alternativ können aus den so erhaltenen Zellen endozelluläre Substanzen, wie Nucleinsäuren, Vitaraine, Koenzyme, Proteine und Lipide, als Reinsubstanzen oder Gemische extrahiert werden, worauf diese als Futtermittel, Nahrungsmittel, Arzneimittel und technische Materialien verwendet werden können.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1

In 1 1 reinem Wasser wurden 4 g KH₂PO^, 3 g (NH^)2^S04> ⁰^ S MgSO^-YH₂O, 0,2 mg FeSO₄*7H₂O, 5 mg CaCl₂'2H₂O, 0,5 mg MnSO^·4H₂O, 0,2 mg CuSO^*5H₂O, 20 ug Biotin und 1 mg Thiaminhydrochlorid aufgelöst und die resultierende Lösung wurde auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt, um eine Kulturflüssigkeit herzustellen. 500 ml der Kulturflüssigkeit wurden in einen 1-1-Minikolben gegeben und 20 min bei 1 atü sterilisiert. Sodann wurden 5 g Methanol zugesetzt. In diese Kulturflüssigkeit wurden 2 Vol.-% einer Vorkulturflüssigkeit inokuliert, die die Zellen der Hefe Saccharomyces aganobii Y-16 enthielt. Die Vorkultur war hergestellt worden, indem die Hefe 48 std bei 28⁰C in einem methanolhaltigen Medium der gleichen Zusammensetzung wie oben bei einem Anfangs-pH-Wert von 5 vorkultiviert worden war. Es wurde eine aerobische Rührkultur 53 std lang bei 32°C vorgenommen, während Ammoniakwasser zugesetzt wurde, um den pH-Wert der Kulturflüssigkeit bei 4,5 zu halten. Nach beendigter Kultivierung wurde die Kulturflüssigkeit zentrifugiert, wodurch nasse Zellen gesammelt wurden. Diese wurden 24 std bei 80⁰C getrocknet, wodurch trockene Zellen in einer Menge von 3,4 g/l Kulturflüssigkeit erhalten wurden.

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Beispiel 2

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Saccharomyces aganobii Y-16 Saccharomyces aganobii Y-410 verwendet wurde und daß die aerobische Rührkultur 46 std bei 28°C anstelle 53 std bei 32⁰C durchgeführt wurde. Es wurden 3,5 g Zellen pro 1 Kulturflüssigkeit erhalten.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Saccharomyces aganobii Y-16 Saccharomyces aganobii Y-145 verwendet wurde und daß die aerobische Rührkultur 55 std bei 28°C anstelle von 53 std bei 32°C durchgeführt wurde. Es wurden 3,3 g Zellen pro 1 der Kulturflüssigkeit erhalten.

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit derAusnahme, daß anstelle von Saccharomyces aganobii Y-16 Saccharomyces aganobii Y-1023 verwendet wurde. Es wurden 3,5 g Zellen pro 1 der Kulturflüssigkeit erhalten.

Beispiel 5

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Kulturflüssigkeit 2,5 g Äthanol anstelle von 5 g Methanol enthielt und daß die Vorkultivierung 4 Tage anstelle von 48 std durchgeführt wurde und daß schließlich die aerobische Rührkultur 4 Tage bei 28⁰C anstelle von 53 std bei 32⁰C durchgeführt wurde. Es wurden 3,1 g Zellen pro 1 der KuIturflüssigkeit erhalten.

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Beispiele 6 bis 8

Das Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Saccharomyces aganobii Y-16 Saccharomyces aganobii Y-410, Y-145 und Y-1023 verwendet wurden. Es wurden 3,2 g, 3,3 g bzw. 3,2 g Zellen pro 1 der Kulturflüssigkeit erhalten.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von Hefezellen, dadurch gekennzeichnet , daß man aerobisch eine Hefe der Art Saccharomyces aganobii in einer Kulturflüssigkeit kultiviert, welche Methanol und/oder Äthanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährquellen enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Saccharomyces aganobii Y-16 (FERM-P 2427), Y-145. (FERM-P 2428), Y-410 (FERM-P 2429) oder Y-1023 (FERM-P 2430) verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturflüssigkeit bis zu 6 Gew.-% Methanol und/oder Äthanol enthält und daß man die Kultivierung bei 10 bis 37⁰C und bei einem pH-Wert von 7,5 oder weniger durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anfangskonzentration von Methanol und/oder Äthanol auf 0,5 Gew.-96 kontrolliert und daß man die Konzentration von Methanol und/oder Äthanol während der Kultivierung auf einem konstanten Wert hält, indem man so viel Methanol und/oder Äthanoü, wie verbraucht wird, zusetzt.
5. Verfahren.nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der Kulturflüssigkeit von Zeit zu Zeit Ammoniak zusetzt, wenn Ammoniumsalze als Stickstoffquelle verwendet werden.

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man zu der Kulturflüssigkeit ein assimilisierbares Kohlenhydrat zusetzt.

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