DE2048811A1 - Verfahren zur Produktion von Protease durch Mikroorganismen - Google Patents

Description

2048811 PATENTANWALT DR.-ING. LOTTERHOS

«OOO FRANKFURT (MAIN)

Annastrasse 19 Ajinomoto Co., Ine · , No.7> 1-chome

Τ^Ι""tent Takara-cho, Ghuo-ku_s Tokyo, Japan

LANDESZENTRALBANK 4/951 DRESDNER BANK FFM., Nr. 5247« POSTSCHECK-KONTO FFM. 1667

FRANKFURT(MaIN)₁ 1

Verfahren zur Produktion von Protease durch. Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von Protease mittels Mikroorganismen.

Es ist bekannt, Protease durch Kultivieren von Mikroorganismen auf einemMedium zu produzieren, das als Kohlenstofflieferanten Kohlenhydrate, wie Stärke, Glucose oder Stärkehydrolysat, enthält»

Es wurde gefunden, dass "beim Kultivieren von Mikroorganismen der Genera Bacillus, Candida und Rhodotorula auf einem Medium^ das organische Säure als den einzigen oder den Hauptkohlenstoff lief eranten enthält, Protease in sehr hoher Ausbeute gebildet wirdo

Beispiele für Mikroorganismen, die auf Kulturmedien zu wachsen vermögen, die organische Säuren als den einzigen oder Hauptkohlensfeofflieferanten enthalten und die gemäss Erfindung Protease zu produzieren vermögen,iiήd Bacillus subtilis AJ-3168 ', (FEBM P-242) (die I¹ERM P-Nummern beziehen sich auf fortlaufende Nummern der Mikroorganismen in dem Fermentation Resaearch Institute, der Agency of Industrial Science and Technology, des Ministry of Industrial Trade and Industry, Japan), Bacillus sp AJ-3208 (NRRL B-3700), Bacillus sp AJ-32o5 (NRRL-B-3699), Candida lipolytica AJ-4555 (ATCG 16617), Candida lipolytica (ATCG 16618) und Rhodotorula glufcinis AJ-5193 (NRRL Y-722o). Die Stämme mit den fortlaufenden Nummern der öffentlichen Kultursammilungen sind von den Hinterlegungsstellen frei erhältlich»

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Beispiele für organische Säuren, die in dem Kulturmedium vorhanden sind, sind Essig-, i'umar-, Malein-, Aepfel—, Bernstein-, Gitronen-, a-Ketoglutar-, Milch- sowie Gluconsäure_e Die organische Säure kann in dem Kulturmedium in einer Menge von 1 bis 10 g/1oo ecm vorhanden sein_o Sie kann bereits zu Beginn der Fermentationsperiode vorliegen; sie kann aber auch nach und nach -ggf· zusammen mit einem Kohlenhydrat - bei fortschreitender Fermentation zugegeben werden» Der pH-Wert des Kulturmediums steigt mit fortschreitender Fermentation am '.Er kann durch Zusatz freier organischer Säure auf den gewünschten Punkt eingestellt werden.

Tabelle I betrifft die Verwendung von Essigsäure als Kohlenstoff lieferanten zur Produktion von Protease und zeigt, dass durch die pH-Einstellung mit Essigsäure die gebildete Protease nicht inaktiviert wird. Es wurde ein Kulturmedium hergestellt, das den in Tabelle I angegebenen Kohlenstofflieferanten,

1 g/1oo ecm Sojabohnen_pulver,

1,5 g/1oo ecm Gasein,

ο,ο5 g/1 oo ecm KHpPO₂, und

ο,2 g/1 oo ecm CaCl₂ο7 H>>0

enthält, pH 7,o hat. und mit 1 1 Impfkultur von Bacillus subtilis AJ-3168 (FERM P-242) beimpft, die zuvor in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie der des Versuchsansatzes Nr.1 bei 34⁰C für 12 Stunden hergestellt worden war» Die Kultivierung wurde bei 34°C 64 Stunden unter Belüftung und Rühren durchgeführt. In Versuchsansatζ Nr. 3 wurde Essigsäure - um den pH-Wert des Mediums bei 6,5 zu halten - 8 Stunden nach dem Beimpfen zugesetzt.

Die Proteaseaktivität wurde mittels einer modifizierten Anthon-Hagiwara-Methode unter Verwendung einer Boratpufferlösung von pH 9,5 bei 37^eC 1o Minuten bestimmt.

Tabelle I Versuchs- Kohlenstoff- _p

1 Stärke 3 7,0 6,3 - 7,5 12oo 75o

2 Stärke 8 7»0 6,3-7,5 *2oo 38oo

3 Stärke 3 + 7,ο 6,5* 48oo Essigsäure 5

	Stärke	3	7,0	6,5**	24-00	2οοο
5	Stärke	8	7,ο	6,5**	4·5οο	4-ΟΟΟ

* pH-Einstellung mit Essigsäure

** pH-Einstellung mit Schwefelsäure

Bei Versuchsansätzen Nr. 1 und 2 wurde keine pH-Einstellung vorgenommene

Das Kulturmedium sollte einen assimilierbaren Stickstofflieferanten, anorganische Salze und übliche organische Nährstoffe enthalten« Beispiele für geeignete Stickstofflieferanten sind Sojabohnenkuchen, Sojabohnenpulver, Sojabohnenextrakte, Milchkasein, Milchmoike, Polypepton, -t'leischextrakte, und Aminosäuremischungen ebenso wie Ammoniumsalze von Mineralsäuren« Die üblichen organischen Nährstoffe sind Maisquellwasser, Pepton,Hefeextrakte und Malzextrakte «

Nach den vorbekannten Verfahren, in denen Stärke als Kohlenstoff« lieferant benutzt wird, können so hohe Konzentrationen^ wie 7 bis 10 g/1oo ecm Stärke nicht angewandt werden, da dann das Medium zu viskos ist, um zur Einführung der Luft ge-rrührt zu werden. Gemäss Erfindung kann die organische Säure in gro&^sr ^üienge verwendet werden. Infolgedessen wird auch die Protease in grosser Menge produziert·

Die im Kulturmedium produzierte Protease kann in konventioneller Weise isoliert werden, Z.B. indem man die Bakterienzellen aus dem Kulturmedium abfiltriert oder abzentrifugiert, die Protease aus« salzt oder mit Lösungsmitteln fällt und durch Filtrieren oder Zentrifugieren isolierte

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium von pH 7»o hergestellt, das 1,5 g/1oo ecm Casein,

2,ο g/1oo ecm "AJIPRO'¹ (Handelsbezeichnung für wasserlösliches

Sojaprotein), o,25 g/100 ecm KHpPO^,,
o,o2 g/100 ecm MgSO^.7 H₂O,
o,2 g/100 ecm CaClo^HpO und

2 ccm/ccm "AJI-EKI* (Handelsbezeichnung für Sojabohnen«

proteinhydrolysate

1 O y 8 I b / i 7 d 7 BAD

enthielt, 30 1 des Mediums in einem Topffermenter (<jar fermentor) gegeben und 3o Minuten bei 12o°C sterilisierto Den pH-Wert des Mediums stellte man mit Natronlauge auf 6,7 ein, beimpfte mit einem der in Tabelle II angegebenen Bakterienstämme und führte die Kultivierung 64 Stunden bei 34⁰C unter Belüften und Rühren durch.

Während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Mediums durch Zusatz 50%iger Essigsäurelösung bei 6,7 gehalten« Die im Kulturmedium gebildete Protease ist in Tabelle II angegeben»

Tabelle Il

verwendeter Stamm eingesetzte gebildete Pro

Essigsäure (g/1oo ecm) tease (E/ccm)

Bacillus subtilis J¹ERM P-242 7,2 59oo

Bacillus sp NRRL B-3699 9,8 76oo

Bacillus sp NRRL B-37oo 15»3 1ο·3οο

Aus 2o 1 Kulturmedium von Bacillus sp NRRL B-37oo filtrierte man die Bakterienzellen ab, engte das "Filtrat bei 4o°C auf 1/3 des ursprünglichen Volumens ein und löste in der konzentrierten Lösung 18o g wasserfreies Natriumsulfat. Sodann gab man 5 1 Isopropanol zu, um Protease zusammen mit Natriumsulfat unter Kühlen bei 5°C zu fällen· Der aus Protease und Natriumsulfat bestehende Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wobei man 180 g eines Copropipitates erhielt (Isolationsausbeute 50%), dös 57 2ooE/g enthielt«! ·

Beispiel 2

Es wurde ein Kulturmedium hergestellt, das

3 g/1oo ecm Stärke,
1 g/1oo ecm Sojabohnenpulver,
1»5 g/ioo ecm Casein,
o»o5 g/1oo ecm KH₂PO^ und
o,2 g/1oo ecm CaCl₂. 7 H₂O

enthielt, der pH-Wert des Mediums mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium sterilisierte Sodann Btellte man den pH-Wert des Mediums auf 7,0 ein, beimpfte 20 1 des Mediums mit Bacillus sp ÄJ-3208 (NRRL B-3700) und führte die Kultivierung bei 34°C 64 Stunden unter Belüftung und Rühren durch. Den pH-Wert des

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Mediums hielt man durch. Zusatz 30%iger Aepfelsäurelösung während der Kultivierung unterhalb von 6,1« Die verbrauchte Aepfelsäuremenge betrug 4g/1oo ecm Mediunu

Das kultivierte Medium enthielt - wie gefunden wurde - 45ooE/ccm Protease©

Beispiel 3

Ein Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie das von Beispiel 2 wurde mit Bacillus subtilis I¹EHM P-242 beimpft und die Kultivierung 64 Stunden durchgeführt. Während der Kultivierung wurde gasförmiges Ammoniak eingeleitet, um zu verhindern, dass der pH-Wert auf weniger als 6,5 absank) und 5o%ige Essigsäurelösung zugeführt, um zu verhindern, dass der pE-Wert auf nicht mehr als 7>o stieg* Die Essigsäure wurde in einer Menge von 5g/ 1oo ecm verwendet. Das erhaltene kultivierte Medium enthielt — wie gefunden wurde - 52ooE/ccm Protease₀

Beispiel 4

Die in Tabelle III angegebenen organischen Säuren gab man zu einem Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie der des Beispiels 2. Alle Medien beimpfte man mit Bacillus subtilis AJ-3168 (FERM P-242) und führte die Kultivierung bei 34⁰O 64 Stunden unter Belüften und Rühren durch. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt·

	Tabelle III	End-pH- Wert	gebildete Prote ase (E/ccm)
Organische Säure	Kultivierungs dauer (Stde)	8,5	32oo
Kaliumacebat	64	8,3	28oo
Kaliumfumarat	64	8,3	28 oo
Kaliummaleat	64	7.5	12oo
	48

Beispiel 5

Es wurde ein Kulturmedium hergestellt, das

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1,o g/1oo ecm Casein,

1,0 g/1oo ecm "Ajipro" (Handelsbezeichnung),

o,25 g/1oo ecm KH₂PO.,

o,o2 g/1oo ecm MgBOΛο 7 H₂O,

o,2 g/1oo ecm CaCl₉ , 2 H_p0 und

2 ccm/1oo ecm "Aji-Eki" *

enthielt ,*3o 1 des Mediums mit Candida lipolytica AJ-4555 (ATCC 16617) beimpft und die Kultivierung bei 25⁰Q¹ 64- Stunden unter Belüften und Rühren durchgeführte Während der Kultivierung hielt man den pH-Wert des Mediums durch Zusatz von 5>0%iger Essigsäurelösung bei 7*0» Die Essigsä\ire wurde in einer Menge von 4,3 g/1oo ecm verwendet. Das Kulturmedium enthielt - wie gefunden wurde — 35o E/ccm schwach alkalischer Protease bei pH 8,5.

Beispiel 6

Man stellte ein Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie für das Beispiel 5 her, stellte den pH-Wert des Mediums auf 3,0 ein und kultivierte Rhodotorula glutinis AJ-5193 (NRRL Y-722o) auf dem Medium in der in Beispiel 5 angegebenen Weise« Den pH-Wert des Mediums hielt man durch Zusatz von 50%iger Essigsäurelösung bei 3|O_e Die Essigsäure war in einer Menge von 4,8 g/1 oo ecm nach 64- Stunden verwendet worden»

Die saure Proteaseaktivität wurde mittels Milchsäurepufferlösung von pH 3»o bei 37°C für 1o Minuten bestimmt. Das Kulturmedium enthielt - wie gefunden wurde - 85o E/ccm saure Protease»

* pH 7,o hatte

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Claims (3)

Patentansprüche

1) Verfahren zur Produktion von Protease, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus der Genera Bacillus, Candida oder Rhodotorula auf einem wässrigen Kulturmedium mit organischer Säure als Hauptlieferant für assimilierbaren Kohlenstoff, einem Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff, den notwendigen anorganischen Salzen und organischen Nährstoffenunter aeroben Bedingungen kultiviert und die gebildete Protease isoliert wird*

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass als organische Säure Essig-, Aepfel-, Fumar-, Malein-, Bernstein-, Gitronen-, a-Ketoglutar-, Milch- oder Gluconsäure verwendet wird *

3) Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Bacillus subtilis, Candida lipolytica oder Rhodotorula glutinis verwendet wird»

4-) Verfahren nach Ansprüchen 1,2 oder 3* dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Bacillus subtilis FERM P-242, Bacillus sp NRRL B-3699, Bacillus sp KRRL B-37oo, Candida lipolytica ATCC 16617, Candida lipolytica ATCC 16618 oder Rhodotorula glutinis NRRL Y-722o verwendet wirdo

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