BRPI0516299B1 - Formulação farmacêutica e uso de uma formulação farmacêutica - Google Patents

Abstract

formulações farmacêuticas, frascos, tanques de aço inoxidável, método de tratamento de uma doença ou disfunção, método para redução da deamidação ou agregação de um anticorpo monoclonal terapêutico, métodos de tratamento de câncer que expressa her2, método de preparação de uma formulação farmacêutica, método de tratamento de câncer e usos de uma formulação farmacêutica. a presente invenção refere-se a formulações de anticorpo, incluindo anticorpos monoclonais formulados em tampão histidina-acetato, assim como uma formulação que comppreende um anticorpo que se liga a domínio ll do her2 (por exemplo, pertuzumab), e uma formulação que compreende um anticorpo que se liga ao dr5 (por exemplo, apomab). além disso, a presente inveção refere-se a frascos com tampa perfurável por seringa e tanques de aço inoxidável contendo as formulações da presente invenção, assim como a método de tratamento de uma doença ou disfunção, método para tratamento de câncer, método para redução de deamidação ou agregação de um anticorpo monoclonal e método de preparação de uma formulação farmacêutica

Description

[001] Este é um pedido não provisório depositado com base em 37 CFR 1.53(b) reivindicando prioridade para o pedido provisório 60/620.413 depositado em 20 de outubro de 2004, cujos conteúdos são integralmente incorporados ao presente pedido como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a formulações de anticorpo, incluindo anticorpos monoclonais formulados em tampão histidina-acetato, assim como uma formulação que comppreende um anticorpo que se liga ao domínio II do HER2 (por exemplo, Pertuzumab), e uma formulação que compreende um anticorpo que se liga ao DR5 (por exemplo, Apomab).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Nos últimos dez anos, os avanços em biotecnologia tornaram possível produzir uma variedade de proteínas para aplicações farmacêuticas usando-se técnicas de DNA recombinante. Porque proteínas são maiores e mais complexas que fármacos orgânicos e inorgânicos tradicionais (isto é, possuindo grupos funcionais múltiplos além de estruturas tri-dimensionais complexas), a formulação de tais proteínas afirma problemas especiais. Para uma proteína permanecer ativa biologicamente, a formulação deve preservar intacta a integridade conformacional de pelo menos um núcleo da sequência dos aminoácidos da proteína enquanto protegendo ao mesmo tempo grupos funcionais múltiplos de proteína de degradação. Vias de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (isto é, qualquer processo que envolva modificação da proteína pela formação de ligações ou clivagem resultando em uma nova entidade química) ou instabilidade física (isto é, mudanças na estrutura de ordem mais alta da proteína). Instabilidade química pode resultar da deamidação, racemização, hidrólise, oxidação, eliminação beta ou troca bisulfeto. A instabilidade física pode resultar da desnaturação, agregação, precipitação ou absorção, por exemplo. As três vias de degração mais comuns são agregação, deamidação e oxidação. Cleland et al. Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993).

FORMULAÇÕES DE ANTICORPO

[004] Anticorpos são incluídos nas proteínas usadas para aplicações farmacêuticas. Um exemplo de anticorpo útil para terapia é um anticorpo que se liga ao antígeno HER2, tal como Pertuzumab.

[005] A Patente US 6.339.142 descreve uma composição do anticorpo HER2 que compreende uma mistura do anticorpo HER2 e um ou mais variantes deste, em que a quantidade de ácido(s) variante(s) é menor que aproximadamente 25%. Trastuzumab é um anticorpo HER2 exemplificado.

[006] As Patentes US 6.267.958 e US 6.685.940 (Andya et al.) descrevem formulações de anticorpo liofilizado, incluindo formulações de anticorpo HER2 e IgE. Documento WO 97/04807 e patente US 2004/0197326A1 (Fick et al.) descrevem métodos para tratamento de asma alérgica com um anticorpo IgE. Documento WO 99/01556 (Lowman et al.) relaciona-se ao anticorpo IgE com resíduos de aspartil sujeito a isomehzação, e variantes melhoradas desta. A Patente US 2002/0045571 (Liu et al.) fornece viscosidade reduzida para formulações de proteína concentrada, exemplificada pelas formulações anticorpo IgE humanizada, rhuMAb E25 e E26. Documento WO 02/096457 e patente US 2004/0170623 (Arvinte et al.) descrevem formulações de líquidos estáveis que compreende anticorpo E25 anti IgE. Ver, também, patente US 2004/0197324 (Liu e Shire) com respeito a formulação de alta concentração de anti-lgE.

[007] A Patente US 6.171.586 (Lam et al.) descreve formulações de anticorpo aquosas estável. Um anticorpo F(ab’)2 rhuMAb CD18 foi formulado em tampões acetato de sódio e histidina HC1. A formulação preferida para rhuMAb CD18 foi de 10mM de acetato de sódio, 8% de trealose, 0,01% de TWEEN 20™, pH 5,0. Acetato (pH 5,0) formulações de rhuMAb CD20 armazenados a 40°C por um mês demonstraram maior estabilidade do que aquelas amostras em histidina (pH 5,0 or 6,0).

[008] A Patente US 2003/0190316 (Kakuta et al.) preocupa-se com anticorpo formulado hPM-1, um anticorpo receptor IL-6 humanizado. Perda de monômero foi maior em citrato de sódio (pH 6,7), seguido pelo fosfato de sódio (pH 6,8), Tns-HC1 (pH 7,2), histidina-HC1 (pH 7,2) e glicina (pH 7,6) em ordem decrescente. O efeito do fosfato-Na (pH 6,5), fosfato-His (pH 6,0 ou 6.5), His-HCI (pH 6,5), e fosfato-Na (pH 6,0) na estabilidade de hPM-1 foi avaliado.

[009] O Documento WO 2004/071439 (Burke et al.) declara que impurezas apareceram no natalizumab (anticorpo monoclonal humanizado integrina anti alfa4) formulação de degradação do polisorbato 80, aparentemente por uma reação de oxidação que envolve íons de metal e hisitidina. Dessa forma, um tampão fosfato foi selecionado.

[010] O Documento W02000/066160 (duplicata língua inglesa EP 1 174 148A1) (Okada et al.) refere-se a formulação de anticorpo C4G1 humanizado o qual se liga a um receptor fibrinogênio de uma glicoproteína GPIIb/llla de membrana de plaqueta humana, em um tampão fosfato de sódio ou citrato de sódio.

[011] O Documento WO 2004/019861 (Johnson et al.) relaciona- se a CDP870, um fragmento Fab anti-TNFa peguilado, formulado em 200 mg/ml em 50 mM de acetato de sódio (pH 5,5) e 125 mM de cloreto de sódio.

[012] O Documento WO 2004/004639 (Nesta, P.) refere-se a formulações para huC242-DM1, uma imunotoxina ativada por tumor, em 50 mM de tampão ácido sucínico (pH 6,0) e sacarose (5% peso/volume).

[013] O Documento WO 03/039485 (Kaisheva et al.) constatou que Daclizumab (um anticorpo receptor IL-2 humanizado) teve a estabilidade mais alta em tampão sucinato de sódio em pH 6,0, e rapidamente perdeu potência na histidina como o tampão oxidável.

[014] O Documento WO 2004/001007 relaciona-se ao anticorpo monoclonal CD80 em uma histidina HCI, tampão acetato de sódio ou citrato de sódio.

[015] A Patente US 6.252.055 (Relton, J.) refere-se a anticorpos anti-CD4 e anti-CD23 formulados em tampões malato, sucinato, acetato de sódio ou fosfato, com fosfato sendo identificado como o tampão preferido.

[016] A Patente US 5.608.038 (Eibl et al.)refere-se a preparações de imunoglobulina altamente concentradas com imunoglobulina, glicose ou sacarose, e cloreto de sódio neste.

[017] O Documento W003/015894 (Oliver et al.)refere-se a uma formulação aquosa de 100 mg/mL de SYNAGIS®, 25mM de histidina-HCI, 1,6mM de glicina, pH 6,0, e um liofilizado de SYNAGIS® o qual quando formulado (antes da liofilização) contém 25 mM de histidina, 1,6mM de glicina e 3% p/v de manitol em pH 6,0.

[018] A Patente US 2004/0191243 A1 (Chen et al.) relata formulação de ABX-IL8, um anticorpo lgG2 humano.

[019] A Patente US 2003/0113316 A1 (Kaisheva et al.)refere-se a uma formulação de anticorpo receptor anti-lL2 liofilizado.

ANTICORPOS HER2

[020] A família HER de receptores tirosina quinase são importantes mediadores do crescimento celular, diferenciação e sobrevivência. A família do receptor inclui quatro membros distintos incluindo receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR, ErbB1, ou HER1), HER2 (ErbB2 ou p185neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2).

[021] EGFR, codificado pelo gene erbB1, foi casualmente envolvido em malignidade humana. Em específico, o aumento da expressão de EGFR foi observado em câncer de mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago assim como glioblastomas. O aumento da expressão do receptor EGFR é frequentemente associado com o aumento da produção do ligante EGFR que transforma o fator de crescimento alfa (TGF-a), pelas mesmas células tumorais que resultam na ativação do receptor por uma via estimulatória autócrina. Baselga e Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Anticorpos monoclonais dirigidos contra o EGFR ou seus ligantes, TGF-α e EGF foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento de tais malignidades. Ver, por exemplo, Baselga e Mendelsohn., supra; Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984); eWu et al. J. Clin. Invest.95:1897-1905 (1995).

[022] O segundo membro da família HER, p185neu, foi originalmente identificado como o produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos tratados quimicamente. A forma ativada do proto- oncogene neu resulta de um ponto de mutação (valina para ácido glutámico) na região da transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada em câncer de mama e ovário e correlacionada com um prognóstico pobre (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); e patente US 4.968.603). Até hoje, nenhum ponto de mutação análogo a este no proto-oncogene neu foi relatado para tumores humanos. A superexpressão de HER2 (frequentemente, mas não uniformemente devido à amplificação do gene) foi também observada em outros carcinomas incluindo carcinomas de estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireoide, pâncreas e bexiga. Ver, entre outros, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet:1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res.,3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991); e McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). HER2 pode ser superexpressado em câncer de próstata (Gu etal. Cancer Lett. 99:185- 9 (1996); Ross etal. Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross etal. Cancer79:2162- 70 (1997); e Sadasivan et al. J. Urol. 150:126-31 (1993)).

[023] Anticorpos dirigidos contra o p185neu de rato e produtos da proteína HER2 humana foram descritos. Drebin e colegas construiram anticorpos contra o produto do gene neu de rato, p185/?eu Ver, por exemplo, Drebin etal.,Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); e documento WO 94/22478. Drebin et al. Oncogene2:273-277 (1998) relata que misturas dos anticorpos reativos com duas regiões distintas do p185neü resulta em efeitos sinérgicos anti-tumor nas células NIH-3T3 neu-transformadas implantadas no camundongo nu. Ver também patente US 5.824.311 emitida em 20 de outubro de 1998.

[024] Hudziak et al., Mol. Cell. Biol.9(3): 1165-1172 (1989) descreve a geração de um painel de anticorpos HER2 que foram caracterizados usando-se a linhagem celular SK-BR-3. de tumor de mama humano. Proliferação celular relativa das células SK-BR-3 seguindo exposição aos anticorpos foi determinada por mancha cristal violeta de monocamadas após 72 horas. Usando-se este ensaio, a inibição máxima foi obtida com o anticorpo chamado 4D5 que inibiu proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no painel reduziram proliferação celular a uma extensão menor neste ensaio. Foi, além disso, constatado que o anticorpo 4D5 sensibiliza superexpressão de HER2 em linhagens celulares de tumor de mama para os efeitos citotóxicos do TNF-a. Ver também patente US 5.677.171 emitida em 14 de outubro de 1997. Os anticorpos HER2 discutidos em Hudziak et al. são, além disso, caracterizados em Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts etal. In Vitro26(3):59A (1990); Sarup etal. Growth Regulation1:72-82 (1991); Shepard et al.J. Clin. Immunol. 11 (3): 117-127 (1991); Kumar et al.Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); e Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997).

[025] Uma versão humanizada recombinante do anticorpo 4D5 murino HER2 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Trastuzumab ou HERCEPTIN®; patente US 5.821.337) é clinicamente ativo nos pacientes com câncer de mama metastático com superexpressão de HER2 que receberam prioridade extensiva na terapia anti-câncer (Baselga et al., J. Clin. Oncol.14:737-744 (1996)). Trastuzumab recebeu aprovação no mercado de Food and Drug Administration em 25 de setembro de 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores superexpressão a proteína HER2.

[026] Outros anticorpos HER2 com várias propriedades foram descritos em Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene4:543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res.51:5361-5369 (1991); Bacus etal. Molecular Carcinogenesis3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer53:401-408 (1993); documento WO 94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res.51:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res.54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); patente US 5.783.186; e Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997).

[027] A seleção de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família do receptor HER; HER3 (patente US 5.183.884 e US 5.480.968 assim como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) e HER4 (pedido de patente EP 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos receptores mostram aumento de expressão em pelo menos algumas linhagens celulares de câncer de mama.

[028] Os receptores HER são geralmente encontrados em várias combinações nas células e heterodimerização é pensado que aumenta a diversidade de respostas celulares para uma variedade de ligantes HER (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment35: 115-132 (1995)). EGFR é ligado por seis diferentes ligantes; fator de crescimento epidermal (EGF), fator transformação de crescimento alfa (TGF-a), anfiregulina, fator de crescimento epidermal de ligação heparina (HB-EGF), betacelulina e epiregulina (Groenen et al. Growth Factors11:235-257 (1994)). Uma família de proteínas heregulina que resultam da ligação alternativa de um único gene são ligantes para HER3 e HER4. A família heregulina inclui heregulinas alfa, beta e gama (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); patente US 5.641.869; e Schaefer et al. Oncogene15:1385-1394 (1997)); fatores de diferenciação de neu (NDFs), fatores de crescimento glial (GGFs); atividade de indução do receptor acetilcolina (ARIA); e fator derivado de neurônio sensorial e motor (SMDF). Para uma revisão, ver Groenen etal. Growth Factors11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. &Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) e Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Recentemente três ligantes HER adicionais foram identificados; neuregulina-2 (NRG-2) o qual é relatado ligar-se tanto a HER3 como HER4 (Chang etal. Nature 387 509-512 (1997); e Carraway et al. Nature387:512-516 (1997)); neuregulina- 3 que liga-se a HER4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)); e neuregulina-4 que liga-se a HER4 (Harari et al. Oncogene18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina e epiregulina também ligam-se a HER4.

[029] Enquanto EGF e TGFa não se ligam a HER2, EGF estimula EGFR e HER2 a formar um heterodímero, que ativa EGFR e resulta em transfosforilação do HER2 no heterodímero. Dimerização e/ou transfosforilação parece ativar o HER2 tirosina quinase. Ver Earp et al., supra. Da mesma forma, quando HER3 é co-expressado com HER2, um complexo de sinalização ativo é formado e anticorpos dirigidos contra HER2 são capazes de interromper este complexo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Além disso, a afinidade do HER3 para heregulina (HRG) é aumentada para um estado de maior afinidade quando co-expressado com HER2. Ver também, Levi et al, Journal of Neuroscience15:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); e Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) com respeito ao complexo de proteína HER2-HER3. HER4, como HER3, forma um complexo de sinalização ativo com HER2 (Carraway and Cantley, Cell 78:5-8(1994)).

[030] Para atingir a via de sinalização HER, rhuMAb 2C4 (Pertuzumab, OMNITARG™) foi desenvolvido como um anticorpo humano que inibe a dimerização do HER2 com outros receptores HER, através disso, inibindo a direção de fosforilação e ativação do ligante, e ativação a jusante das vias RAS e AKT . Na fase I de teste de Pertuzumab como um único agente para o tratamento de tumores sólidos, 3 sujeitos com câncer de ovário avançado foram tratados com Pertuzumab. Um teve uma resposta parcial durável, e um sujeito adicional teve doença estável por 15 semanas Agus et al. Proc Am Soc Clin Oncol22: 192, Resumo 771 (2003).

ANTICORPOS DR5

[031] Vários ligantes e receptores pertencentes à superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) foram identificados na técnica. Incluídos entre tais ligantes estão fator alfa de necrose tumoral ("TNF-alfa"), fator beta de necrose tumoral ("TNF-beta" ou "linfotoxina-alfa"), linfotoxina-beta ("LT-beta"), ligante CD30, ligante CD27, ligante CD40, ligante OX-40, ligante 4-1 BB, LIGHT, ligante Apo-1 (também referido como ligante Fas ou ligante CD95), ligante Apo- 2 (também referido como Apo2L ou TRAIL), ligante Apo-3 (também referido como TWEAK), APRIL, ligante OPG (também referido como ligante RANK, ODF, ou TRANCE), e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK) (Ver, por exemplo, Ashkenazi, Nature Review,2:420-430 (2002); Ashkenazi e Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255- 260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80- 82 (1992), documento WO 97/01633 publicado em 16 de janeiro de 1997; documento WO 97/25428 publicado em 17 de julho de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401- 32410 (1997); Hahne etal., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); documento WO 98/28426 publicado em 2 de julho de 1998; documento WO 98/46751 publicado em 22 de outubro de 1998; documento WO 98/18921 publicado em 7 de maio de 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

[032] Indução de várias respostas celulares mediadas por tais ligantes da família TNF é tipicamente iniciada por suas ligações aos receptores celulares específicos. Alguns, mas não todos, os ligantes da família TNF ligam-se a, e induzem várias atividades biológicas através dos “receptores da morte” da superfície celular para ativar caspases ou enzimas que realizam a morte celular ou via de apoptose. (Salvesen et al., Cell,91: 443-446 (1997)). Incluído entre os membros da superfamília de receptores TNF identificados até hoje são TNFR1, TNFR2, TACI, GITR,, CD27, OX- 40, CD30, CD40, HVEM, Fas (também referido como Apo-1 ou CD95), DR4 (também referido como TRAIL-R1), DR5 (também referido como Apo-2 ou TRAIL-R2), DcR1, DcR2, osteoprotegerina (OPG), RANK e Apo-3 (também referido como DR3 ou TRAMP).

[033] A maioria destes membros da superfamília de receptores TNF compartilha a mesma estrutura típica de receptores da superfície celular incluindo extracelular, de transmembrana e regiões intracelulares, enquanto outros são encontrados naturalmente como proteínas solúveis desprovidas de uma transmembrana e domínio intracelular. A porção extracelular de TNFRs típicos contém um padrão de sequência de aminoácido repetitivo de múltiplos domínios ricos em cisteína (CDRs), começando do NH2 terminal.

[034] O ligante referido como Apo-2L ou TRAIL foi identificado há muitos anos atrás como um membro da família TNF de citocinas. (ver, por exemplo, Wiley et al., Immunity,3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); documento WO 97/01633; documento WO 97/25428; patente US 5.763.223 emitida em 9 de junho de 1998; patente US 6.284.236 emitida em 4 de setembro de 2001). O polipeptídeo Apo2L/TRAIL humano de sequência nativa de comprimento total é um aminoácido longo 281, de proteína de transmembrana Tipo II. Algumas células podem produzir uma forma solúvel natural do polipeptídeo, através de clivagem enzimática da região extracelular do polipeptídeo (Mariani et al., J. Cell. Biol.,137:221-229 (1997)). Estudos cristalográficos de formas solúveis do Apo2L/TRAIL revelam uma estrutura homotrimérica similar às estruturas do TNF e outras proteínas relacionadas (Hymowitz etal., Molec. Cell,4:563-571 (1999); Cha etal., Immunity,11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology,6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry,39:633-644 (2000)). Apo2L/TRAIL, diferente de outros meios da família TNF, entretanto, foi constatado como tendo um aspecto único de estrutura em que três resíduos de cisteína (na posição 230 de cada subunidade no homtrímero) juntas coordenam um átomo de zinco, e que a ligação de zinco é importante para a estabilidade do trímero e atividade biológica. (Hymowitz etal., supra', Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).

[035] Foi relatado na literatura que Apo2L/TRAIL pode desempenhar um papel na modulação o sistema imune, incluindo doenças auto- imune tais como artrite reumatóide (ver, por exemplo, Thomas etal., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine,11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095- 1103 (2000)).

[036] Formas solúveis do Apo2L/TRAIL foram também relatadas para induzir apoptose em uma variedade de células cancerosas, incluindo cólon, pulmão, mama, próstata, bexiga, hm, ovário e tumores do cérebro, assim como melanoma, leucemia, e mieloma múltiplo (ver, por exemplo, Wiley et al., supra', Pitti et al., supra', patente US 6.030.945 emitida em 29 de fevereiro de 2000; patente US 6.746.668 emitida em 8 de junho de 2004; Rieger et al., FEBS Letters,427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest.,104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani etal., Clin. Cancer Res.,5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu etal., Cancer Res., 60:2384- 2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Estudos in vivoem modelos de tumor murino, além disso, sugerem que Apo2L/TRAIL, ou em combinação com quimioterapia ou radioterapia, podem exercer efeitos substanciais anti-tumor (ver, por exemplo, Ashkenazi et al., supra', Walzcak et al., supra', Gliniak et al., Cancer Res.,59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra', Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); Pedido PCT US 00/15512; Pedido PCT US 01/23691). Em contraste com muitos tipos de células cancerosas, muitos tipos de células humanas normais parecem ser resistentes à indução de apoptose por certas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra-, Walzcak et al., supra). Jo et al. relatou que uma forma solúvel de poli-histidina ligada do Apo2L/TRAIL induziu apoptose in vitroem hepatócitos humanos isolados normais, mas não em não humanos (Jo et al., Nature Med.,6:564-567 (2000); ver também, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Acredita-se que certas preparações de Apo2L/TRAIL recombinante podem variar em termos de propriedades bioquímicas e atividades biológicas nas células normais contra as doentes, dependendo, por exemplo, da presença ou ausência de uma molécula de ligação, conteúdo de zinco, e % de conteúdo de trímero (Ver, Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

[037] Foi encontrado que Apo2L/TRAIL liga-se a pelo menos cinco diferentes receptores. Pelo menos dois dos receptores que se ligam a Apo2L/TRAIL contêm um domínio da morte citoplasmático funcional. Aquele receptor foi referido como "DR4" (e alternativamente como TR4 ou TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113(1997); ver também documento WO 98/32856 publicado em 30 de julho de 1998; documento WO 99/37684 publicado em 29 de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 7 de dezembro de 2000; patente US 6.433.147 emitida em 13 de agosto de 2002; patente US 6.461.823 emitida em 8 de outubro de 2002, e patente US 6.342.383 emitida em 29 de janeiro de 2002).

[038] Outro tal receptor para Apo2L/TRAIL foi referido como DR5 (e também foi alternativamente referido como Apo-2; TRAIL-R ou TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPOδ, TRICK2 ou KILLER) (ver, por exemplo, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), documento WO 98/51793 publicado em 19 de novembro de 1998; documento WO 98/41629 publicado em 24 de setembro de 1998; Screaton etal., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics,17:141-143 (1997); documento WO 98/35986 publicado em 20 de agosto de 1998; patente EP 870.827 publicada em 14 de outubro de 1998; documento WO 98/46643 publicado em 22 de outubro de 1998; documento WO 99/02653 publicado em 21 de janeiro de 1999; documento WO 99/09165 publicado em 25 de fevereiro de 1999; documento WO 99/11791 publicado em 11 de março de 1999; patente US 2002/0072091 publicada em 13 de agosto de 2002; patente US 2002/0098550 publicada em 7 de dezembro de 2001; patente US 6.313.269 emitida em 6 de dezembro de 2001; patente US 2001/0010924 publicada em 2 de agosto de 2001; patente US 2003/01255540 publicada em 3 de julho de 2003; patente US 2002/0160446 publicada em 31 de outubro de 2002, patente US 2002/0048785 publicada em 25 de abril de 2002; patente US 6.342.369 emitida em fevereiro de 2002, patente US 6.569.642 emitida em 27 de maio de 2003, patente US 6.072.047 emitida em 6 de junho de 2000, patente US 6.642.358 emitida em 4 de novembro de 2003; patente US 6.743.625 emitida em 1 de junho de 2004). Como DR4, DR5 é relatado conter um domínio da morte citoplasmático e ser capaz de sinalizar apoptose sob ligação do ligante (ou sob ligação de uma molécula, tal como um anticorpo agonista que imita a atividade do ligante). A estrutura cristalina do complexo formado entre Apo-2L/TRAIL e DR5 é descrita em Hymowitz et al., Molecular Cell,4:563-571 (1999).

[039] Sob ligação do ligante, ambos DR4 e DR5 podem acionar apoptose independentemente pelo recrutamento e ativação do iniciador de apoptose, caspase-8, através da molécula adaptadora que contém o domínio da morte referida como FADD/Mort1 (Kischkel et al., Immunity,12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity,12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)).

[040] Apo2L/TRAIL foi também relatado ligar-se àqueles receptores referidos como DcR1, DcR2 e OPG, os quais acredita-se que funcionam como inibidores, ao invés de transdutores da sinalização (ver, por exemplo, DcR1 (também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane etal., J. Biol. Chem., 272:25417-25420(1997); Schneider etal., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); e Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)); DcR2 (também chamado de TRUNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan etal., FEBSLetters, 424:41-45(1998); Degli-Esposti etal., Immunity, 7:813-820 (1997)), e OPG. Em contraste com DR4 e DR5, os receptores DcR1 e DcR2 não sinalizam apoptose.

[041] Certos anticorpos que se ligam aos receptores DR4 e/ou DR5 foram relatados na literatura. Por exemplo, anticorpos anti-DR4 dirigidos ao receptor DR4 e tendo atividade agonística ou apoptótica em certas células de mamíferos estão descritos em, por exemplo, documento WO 99/37684 publicado em 29 de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 12 de julho de 2000; documento WO 03/066661 publicado em 14 de agosto de 2003. Ver, também, por exemplo, Griffith et al., J. Immunol.,162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol.,166:4891-4898 (2001); documento WO 02/097033 publicado em 2 de dezembro de 2002; documento WO 03/042367 publicado em 22 de maio de 2003; documento W0 03/038043 publicado em 8 de maio de 2003; documento W0 03/037913 publicado em 8 de maio de 2003. Certos anticorpos anti-DR5 foram da mesma forma descritos, ver, por exemplo, documento WO 98/51793 publicado em 8 de novembro de 1998; Griffith et al., J. Immunol.,162:2597-2605 (1999); Ichikawa etal., Nature Med.,7:954-960 (2001); Hylander et al., “An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice’’, Resumo, 2° Congresso Internacional em Anticorpos Monoclonais em Câncer, 29 de agosto a 1 de setembro de 2002, Banff, Alberta, Canada; documento W0 03/038043 publicado em 8 de maio de 2003; documento W0 03/037913 publicado em 8 de maio de 2003. Além disso, certos anticorpos que possuem interatividade a ambos os receptores DR4 e DR5 foram descritos (ver, por exemplo, patente US 6.252.050 emitida em 26 de junho de 2001).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[042] A invenção no presente pedido relata, pelo menos em parte, a identificação de histidina-acetato, pH 5,5 a 6,5, como um tampão especialmente útil para formular anticorpos monoclonais, especialmente anticorpos lgG1 de comprimento total que são suscetíveis a deamidação e/ou agregação. A formulação retarda degradação do produto anticorpo neste.

[043] Dessa forma, em um primeiro aspecto a invenção fornece uma formulação farmacêutica estável que compreende um anticorpo monoclonal em tampão histidina-acetato, pH 5,5 a 6,5. O anticorpo monoclonal preferencialmente liga-se a um antígeno selecionado do grupo que consiste de HER2, CD20, DR5, BR3, IgE, eVEGF.

[044] Além disso, a invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença ou disfunção em um sujeito que compreende administrar a formulação para um sujeito em uma quantidade efetiva para tratar a doença ou disfunção.

[045] Em outro aspecto, a invenção relaciona-se a uma formulação farmacêutica que compreende: (a) um anticorpo lgG1 de comprimento total suscetível à deamidação ou agregação em uma quantidade de aproximadamente 10mg/ml para cerca de 250 mg/ml; (b) tampão histidina- acetato, pH 5,5 a 6,5; (c) sacarídeo selecionado do grupo que consiste de trealose e sacarose, em uma quantidade de aproximadamente 60mM para cerca de 250mM; e (d) polisorbato 20 em uma quantidade de aproximadamente 0,01% para cerca de 0,1%.

[046] A invenção fornece também um método para redução da deamidação ou agregação de um anicorpo monoclonal terapêutico, que compreende formular o anticorpo em um tampão histidina-acetato, pH 5,5 a 6,5.

[047] Em ainda um aspecto adicional, a invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo que se liga ao domínio II do HER2 em um tampão histidina em um pH de cerca de 5,5 para cerca de 6,5, um sacarídeo e um tensoativo.

[048] A invenção também relata uma formulação farmacêutica que compreende Pertuzumab em uma quantidade de aproximadamente 20mg/ml para cerca de 40mg/ml, tampão histidina-acetato, sacarose, e um polisorbato 20, em que o pH da formulação é de aproximadamente 5,5 para cerca de 6,5.

[049] A invenção também pertence a uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo DR5 em um tampão histidina em um pH de aproximadamente 5,5 para cerca de 6,5, um sacarídeo e um tensoativo.

[050] Em outro aspecto, a invenção relaciona-se a uma formulação farmacêutica que compreende Apomab em uma quantidade de aproximadamente 10mg/ml para cerca de 30mg/ml, tampão histidina-acetato, trealose, e um polisorbato 20, em que o pH da formulação é de aproximadamente 5,5 para cerca de 6,5.

[051] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de câncer em um sujeito, que compreende administrar a formulação farmacêutica para o sujeito em uma quantidade efetiva para tratar o câncer.

[052] A invenção também se refere a um frasco com uma tampa perfurável por uma seringa ou um tanque de aço inoxidável que compreende a formulação dentro do frasco ou tanque, opcionalmente na forma congelada.

[053] Além disso, a invenção fornece um método para preparar uma formulação farmacêutica que compreende: (a) preparar a formulação do anticorpo monoclonal; e (b) avaliar a estabilidade física, estabilidade química ou atividade biológica do anticorpo monoclonal na formulação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[054] Figura 1 descreve Domínios l-IV (SEQ ID Nos. 19-22, respectivamente) do domínio extracelular de HER2.

[055] Figuras 2A e 2B descrevem os alinhamentos das sequências de aminoácidos dos domínios de variável leve (VL) (Fig. 2A) e variável pesada (VH) (Fig. 2B) do anticorpo 2C4 monoclonal murino (SEQ ID Nos. 1 e 2, respectivamente); domínios VL e VH da versão 574 2C4 humanizado (SEQ ID Nos. 3 e 4, respectivamente), e estrutura consenso humano VL e VH (hum ê1, subgrupo I kappa leve; humlll, subgroup III pesado) (SEQ ID Nos. 5 e 6, respectivamente). Asteriscos identificam diferenças entre versão 574 2C4 humanizado e anticorpo 2C4 monoclonal murino ou entre a versão 574 2C4 humanizado e a estrutura humana. Regiões Determinadas por Complementaridade (CDRs) estão entre parênteses.

[056] Figuras 3A e 3B mostram as sequências de aminoácidos de Pertuzamab de cadeia leve e cadeia pesada (SEQ ID Nos. 15 e 16, respectivamente). CDRs são mostradas em negrito. Massas moleculares calculada de cadeia leve e cadeia pesada são 23.526,22 Da e 49.216,56 Da (cisteínas em forma reduzida). O carboidrato componente está anexado a Asn 299 de cadeia pesada.

[057] Figuras 4A e 4B mostram as sequências de aminoácidos de Pertuzamab de cadeia leve e cadeia pesada, cada uma inclui uma sequência de peptídeo sinal terminal amino intacta (SEQ ID Nos. 17 e 18, respectivamente).

[058] Figura 5 descreve, esquematicamente, ligação de 2C4 no sítio de ligação heterodimérico de HER2, através disso, prevenindo heterodimerização com atividade EGFR ou HER3.

[059] Figura 6 descreve acoplamento de HER2/HER3 ao MAPK e vias Akt.

[060] A Figura 7 compara a atividade de Trastuzumab e Pertuzumab: Trastuzumab: - Liga-se ao IV próximo ao JM; - Proteje contra o refúgio do receptor - Afeta moderadamente a modulação negativa do receptor; - Efeito leve na função do HER2 como co-receptor. Pertuzumab: - Liga-se ao II no sítio de dimerização; - Não impede o refúgio do receptor; - Afeta moderadamente a modulação negativa do receptor; - Efeito maior na função do HER como receptor.

[061] Figura 8 descreve estabilidade da formulação de Pertuzumab pela análise de íon de troca (IEX).

[062] Figura 9 mostra estabilidade da formulação de Pertuzumab pela análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC).

[063] Figura 10 reflete estabilidade física de Pertuzumab em diferentes formulações.

[064] Figura 11 é de um estudo de agitação de fórmulas líquida de Pertuzumab.

[065] Figura 12 é de um outro estudo de agitação de fórmulas líquida de Pertuzumab.

[066] Figura 13 é de um estudo de congelamento- descongelamento da formulação de Pertuzumab.

[067] Figuras 14A e 14B mostram as sequências de aminoácidos de Trastuzumab de cadeia leve (SEQ ID No. 13) e cadeia pesada (SEQ ID No. 14).

[068] Figuras 15A e 15B descreve uma sequência de cadeia leve de Pertuzumab variante (SEQ ID No. 23) e uma sequência de cadeia pesada de Pertuzumab variante (SEQ ID No. 24).

[069] Figuras 16A e 16B mostram estruturas de oligossacarídeos geralmente observadas em anticorpos IgG.

[070] Figuras 17A e 17B mostram as sequências de cadeia leve e pesada (SEQ ID Nos. 37-44) de anticorpos E25, E26, HAE1 e Hu-901 anti-lgE específico. Na Fig. 17A, as extremidades de domínio variável leve com os resíduos VEIK, resíduos 111. Na Fig. 17B, as extremidades de domínio variável pesada com os resíduos VTVSS, ao redor do resíduo 120.

[071] Figura 18A é uma sequência de alinhamento que compara as sequências de aminoácidos de domínio variável leve (VL) de cada murino 2H7 (SEQ ID No. 25), variante 2H7v16 humanizada (SEQ ID No. 26), e o subgrupo I de cadeia leve kappa humano (SEQ ID No. 27). As CDRs de VL do 2H7 e hu2H7v16 são como segue: CDR1 (SEQ ID No. 57), CDR2 (SEQ ID No. 58), e CDR3 (SEQ ID No. 59).

[072] Figura 18B é uma sequência de alinhamento que compara as sequências de aminoácidos de domínio variável pesado (VH) de cada murino 2H7 (SEQ ID No. 28), variante 2H7v16 humanizada (SEQ ID No. 29), e a sequência consenso humana do subgrupo III de cadeia pesada (SEQ ID No. 30). As CDRs de VH do 2H7 e hu2H7v16 são como segue: CDR1 (SEQ ID No. 60), CDR2 (SEQ ID No. 61), e CDR3 (SEQ ID No. 62).

[073] Nas Fig. 18A e Fig. 18B, o CDR1, CDR2 e CDR3 em cada cadeia estão fechadas dentro de parênteses, ladeadas pelas regiões de estrutura FR1-FR4, como indicado. 2H7 refere-se ao anticorpo 2H7 murino. Os asteriscos entre duas linhas das sequências indicam as posição que são diferentes entre as duas sequências. A numeração de resíduo está de acordo com Kabat et al. Sequences of Immunological Interest,5aEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), com inserções mostradas como a, b, c, d, e e.

[074] Figura 19 descreve sequências de domínio variável de três diferentes anticorpos VEGF com SEQ ID Nos. 31-36.

[075] Figura 20 mostra perfil de eluição de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) seguindo amostras Apomab: (a) controle e fórmulas preparadas em (b) pH 4,0, (c) pH 5,0, (d) pH 6,0 e (e) pH 7,0. As amostras formuladas foram armazenadas a 40°C por 2 meses antes das análises.

[076] Figura 21 descreve perfil de faixa de pH para a perda no monômero anticorpo Apomab durante armazenamento. Cinética do monômero por SEC foi monitorada durante armazenamento a 30°C e 40°C e as constantes da taxa de primeira ordem foram calculadas.

[077] Figura 22 fornece perfil de de eluição de cromatografia de troca iônica de amostras de Apomab como segue: (a) controle e fórmulas preparadas em (b) pH 4,0, (c) pH 5,0, (d) pH 6,0 e (e) pH 7,0. As amostras formuladas foram armazenadas a 40°C por 2 meses antes das análises.

[078] Figura 23 mostra perfil de faixa de pH para a perda no pico principal IEC durante armazenamento. Cinética do pico principal por IEC foi monitorada durante armazenamento a 30°C e 40°C e as constantes da taxa de primeira ordem foram calculadas.

[079] Figura 24 mostra a sequência de nucleotídeo do cDNA ligante Apo-2 humano (SEQ ID No. 45) e sua sequência derivada de aminoácido (SEQ ID No. 46). O “N” na posição do nucleotídeo 447 (na SEQ ID No. 45) é usado para indicar que a base de nucleotídeo pode ser uma “T” ou “G”.

[080] As Figuras 25A e 25B mostram a sequência de aminoácido 411 do receptor DR5 humano (SEQ ID No. 47) como publicado no documento WO 98/51793 em 19 de novembro de 1998, e a sequência de nucleotídeo de codificação (SEQ ID No. 48).

[081] As Figuras 26A e 26B mostram a sequência de aminoácido 440 do receptor DR5 humano (SEQ ID No. 49) e a sequência de nucleotídeo de codificação (SEQ ID No. 50), como publicado no documento WO 98/35986 em 20 de agosto de 1998.

[082] Figura 27 mostra a sequência de aminoácido de cadeia pesada Apomab 7.3 (SEQ ID No. 51).

[083] Figura 28 mostra a sequência de aminoácido de cadeia leve Apomab 7.3 (SEQ ID No. 52).

[084] Figura 29 mostra o alinhamento das sequências de aminoácido 16E2 de cadeia pesada (SEQ ID No. 53) e Apomab 7.3 de cadeia pesada (SEQ ID No. 51).

[085] Figura 30 mostra o alinhamento das sequências de aminoácido 16E2 de cadeia leve (SEQ ID No. 54) e Apomab 7.3 de cadeia leve (SEQ ID No. 52).

[086] Figuras 31A e 31B descrevem a variável pesada da sequência de aminoácido (Fig. 31 A; SEQ ID No. 55) e variável leve da sequência de aminoácido (Fig. 31B; SEQ ID No. 56) do Apomab 7.3. Resíduos CDR são identificados em negrito.

[087] Figura 32 mostra um alinhamento das cadeias leves maduras 2H7v16 e 2H7v511 (SEQ ID Nos. 63 e 64, respectivamente). Sequências mostradas com numeração de resíduo de domínio variável Kabat e numeração de resíduo de domínio constante Eu.

[088] Figura 33 mostra um alinhamento das cadeias pesadas maduras 2H7v16 e 2H7v511 (SEQ ID Nos. 65 e 66, respectivamente). Sequências mostradas com numeração de resíduo de domínio variável Kabat e numeração de resíduo de domínio constante Eu.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS I. DEFINIÇÕES

[089] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma a permitir a atividade biológica do ingrediente ativo ser efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito para o qual a formulação sera administrada. Tais fórmulas são estéreis.

[090] Uma formulação “estéril” é asséptica ou livre de qualquer microorganismo vivo e seus esporos.

[091] No presente pedido, uma formulação “congelada” é aquela em uma temperatura abaixo de 0°C. Geralmente, a formulação congelada não é congelada a seco, nem é submetida antes ou subsequente liofilização. Preferivelmente, a formulação congelada compreende a substância fármaco congelado para armazenamento (em tanque de aço inoxidável) ou produto fármaco congelado (em configuração final de frasco).

[092] A formulação “estável” é uma em que a proteína neste essencialmente retém sua estabilidade física e/ou estabilidade biológica sob armazenamento. Preferivelmente, a formulação essencialmente retém sua estabilidade física e química, assim com sua atividade biológica sob armazenamento. O período de armazenamento é geralmente selecionado baseado na programação de tempo de vida em prateleira da formulação. Várias técnicas analíticas para medição de estabilidade da proteína estão disponíveis na técnica e estão revisadas em Peptide and Protein Drug Delivery,247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por exemplo. Estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Preferivelmente, a formulação é estável em aproximadamente 40°C por pelo menos cerca de 2-4 semanas, e/ou estável em aproximadamente 5°C e/ou 15°C por pelo menos 3 meses, e/ou estável em aproximadamente -20°C por pelo menos 3 meses ou pelo menos 1 ano. Além do mais, a formulação é preferivelmente estável seguindo congelamento (a, por exemplo, -70°C) e descongelamento da formulação, por exemplo, seguindo os ciclos 1, 2 ou 3 de congelamento e descongelamento. Estabilidade pode ser avaliada qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de maneiras diferentes, incluindo avaliação da formação de agregados (por exemplo, usando- se cromatografia de exclusão por tamanho, pela medição da turbidez, e/ou por inspeção visual); por avaliação de heterogeneidade de carga usando-se cromatografia de troca de cátions ou eletroforese de zona capilar; análise de sequência de amino-terminal ou carboxi-terminal; análise de espectrometria de massa; análise SDS-PAGE para comparar anticorpo reduzido e intacto; análise de mapa de peptídeo (por exemplo, tríptico ou LYS-C); avaliação da atividade biológica ou função de ligação de antígeno do anticorpo; etc. Instabilidade pode envolver qualquer uma ou mais de: Agregação, deamidação (por exemplo, deamidação Asn), oxidação (por exemplo, oxidação Met), isomerização (por exemplo, isomerização Asp), clipping/hidrólise/fragmentação (por exemplo, fragmentação da região de dobradiça), formação succinimida, cisteína(s) não pareada(s), extensão N-terminal, processo C-terminal, diferenças na glicosilação, etc.

[093] Um anticorpo monoclonal “deamidado” no presente pedido é aquele em que um ou mais resíduos asparagina neste foi derivado, por exemplo para um ácido aspártico ou um iso-ácido aspártico.

[094] Um anticorpo que é “suscetível a deamidação” é aquele que compreende um ou mais resíduos que foram encontrados ser orientados para deamidação.

[095] Um anticorpo que é “suscetível a agregação” é aquele que foi encontrado agregar-se com outra(s) molécula (s) de anticorpo, especilamente sob congelamento ou agitatação.

[096] Um anticorpo que é “suscetível a fragmentação” é aquele que foi encontrado ser clivado em dois ou mais fragmentos, por exemplo em uma região de dobradiça deste.

[097] Pela “redução de deamidação, agregação ou fragmentação” é intencionado prevenir ou diminuir a quantidade de deamidação, agregação ou fragmentação relativa ao anticorpo monoclonal formulado em um pH diferente ou em um tampão diferente.

[098] No presente pedido, atividade biológica de um anticorpo monoclonal refere-se à habilidade do anticorpo ligar-se ao antígeno e resultar em uma resposta biológica mensurável que pode ser medida in vitroou in vivo. Tal atividade pode ser antagônica (por exemplo, onde o anticorpo é um anticorpo HER2) ou agonística (por exemplo, onde o anticorpo se liga ao DR5). No caso do Pertuzumab, em uma realização, a atividade biológica refere-se à habilidade do anticorpo formulado inibir proliferação da linhagem celular MDA-MB-175-VII de câncer de mama humano. Onde o anticorpo é Apomab, a atividade biológica pode referir-se, por exemplo, a habilidade do anticorpo formulado destruir células Colo205 de carcinoma de cólon.

[099] Por “isotônico” é entendido que a formulação de interesse tem essencialemente a mesma pressão osmótica que sangue humano. A formulação isotônica irá geralmente ter uma pressão osmótica de aproximadamente 250 a 350mOsm (miliosmóis). A isotonicidade pode ser medida usando-se um osmômetro de pressão de vapor ou tipo congelamento, por exemplo.

[0100] Como usado no presente pedido, “tampão” refere-se a uma solução tamponada que resiste a mudanças no pH pela ação de seus componentes de conjugação ácido-base. O tampão desta invenção preferivelmente tem um pH na faixa de aproximadamente 5,0 para cerca de 7,0, preferivelmente de aproximadamente 5,5 para cerca de 6,5, por exemplo, de aproximadamente 5,8 para cerca de 6,2, e mais preferivelmente tem um pH de aproximadamente 6,0. Exemplos de tampões que irão controlar o pH nesta faixa incluem acetato, succinato, gluconato, histidina, citrato, glicilglicina e outros tampões de ácidos orgânicos. O tampão preferido no presente pedido é um tampão histidina.

[0101] Um “tampão histidina” é um tampão que compreende íons de histidina. Exemplos de tampões histidina icluem cloreto de histidina, histidina- acetato, fosfato de histidina, sulfato de histidina. O tampão histidina preferido identificado nos exemplos no presente pedido foi constatado como sendo acetado de histidina. Em realizações preferidas, o tampão histidina-acetato é preparado por titulação de L-histidina (base livre, sólida) com ácido acético (líquido). Preferivelmente, o tampão histidina ou tampão histidina-acetato está em pH 5,5 a 6,5, preferivelmente pH 5,8 a 6,2.

[0102] Um “sacarídeo” no presente pedido compreende a composição geral (CH2O)n e derivados deste, incluindo monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, açúcares de álcool, açúcares de redução, açúcares de não redução, etc. Exemplos de sacarídeos no presente pedido incluem glicose, sacarose, trealose, lactose, frutose, maltose, dextrano, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiose, melezitose, rafinose, manotriose, estaquiose, maltose, lactulose, maltulose, glucitol, maltitol, lactitol, iso-maltulose, etc. O sacarídeo preferido no presente pedido é um dissacarídeo de não redução, tal como trealose ou sacarose.

[0103] No presente pedido, um “tensoativo” refere-se a um agente ativo, preferivelmente um tensoativo não-iônico. Exemplos de tensoativos no presente pedido incluem polisorbato (por exemplo, polisorbato 20 e polisorbato 80); poloxamer (por exemplo, poloxamer 188); Triton; dodecil sulfato de sódio (SDS); lauril sulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil-, ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil-, ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isostearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-,palmidopropil-, ou isostearamidopropil- dimetilamina; metil cocoil- de sódio, ou metil oleiltaurato de sódio; e a série MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, New Jersey); polietil glicol, polipropil glicol, e copolimeros de etileno e propileno glicol (por exemplo, pluroπics, PF68 etc.); etc. 0 tensoativo preferido no presente pedido é polisorbato 20.

[0104] Um “receptor HER” é urn receptor proteína tirosina quinase que pertence a família do receptor HER e inclui receptores EGFR, HER2, HER3 e HER4 e outros membros desta família a serem identificados no futuro. O receptor HER irá geralmente compreender um domínio extracelular, que pode ligar-se a um ligante HER; um domínio de transmembrana lipofílico; um domínio tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização carboxil terminal que ancora diversos resíduos tirosina que podem ser fosforilados. Preferivelmente o receptor HER é receptor HER humano de sequência nativa.

[0105] O domínio extracelular do HER2 compreende quatro domínios, Domínio I (resíduos de aminoácidos de aproximadamente 1-195), Domínio II (resíduos de aminoácidos de aproximadamente 196-320), Domínio III (resíduos de aminoácidos de aproximadamente 321-488), e Domínio IV (resíduos de aminoácidos de aproximadamente 489-632) (numeração de resíduo sem peptídeo sinal). Ver Garrett et al. Mol. Cell.. 11: 495-505 (2003), Cho et al.Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell5:317-328 (2004), ou Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 90:1746-1750 (1993). Ver também Fig. 1 no presente pedido.

[0106] Os termos “ErbB1," “HER1", “receptor do fator de crescimento epidermal” e “EGFR” são usados indistintamente no presente pedido e referem-se ao EGFR como divulgado, por exemplo, em Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluindo formas mutantes deste que ocorrem naturalmente (por exemplo, deleção mutante de EGFR como em Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbB1 refere-se ao gene que codifica o produto proteína EGFR.

[0107] As expressões “ErbB2" e “HER2" são usadas indistintamente no presente pedido e referem-se à proteína humana HER2 descrita, por exemplo, em Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al. Nature319:230-234 (1986) (Genebank acesso número X03363). O termo “erbB2"refere-se ao gene que codifica ErbB2 humano e “neu” refere-se ao gene que codifica p185neu de rato. HER2 preferida é HER humana de sequência nativa.

[0108] “ErbB3" e “HER3"referem-se ao polipeptídeo receptor como divulgado, por exemplo, nas patentes US 5.183.884 e US 5.480.968 assim como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989).

[0109] Os termos “ErbB4" e “HER4"referem-se ao polipeptídeo receptor como divulgado, por exemplo, na patente EP pedido No 599.274; Plowman etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature,366:473-475 (1993), incluindo isoformas destes, por exemplo, como divulgado no documento WO99/19488, publicado em 22 de abril de 1999.

[0110] Por “ligante HER” é entendido um polipeptídeo que se liga a e/ou ativa um receptor HER. O ligante HER de interesse particular no presente pedido é um ligante HER humano de sequência nativa tal como um fator de crescimento epidermal (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); que transforma o fator alfa de crescimento (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); anfiregulina também conhecida como schwanoma ou fator de crescimento autócrino do queratinócito (Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura etal. Nature348:257-260 (1990); e Cook et al. Mol. Cell. Biol.11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); e Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); heparina de ligação do fator de crescimento epidermal (HB- EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); uma heregulina (ver abaixo); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari etal. Oncogene 18:2681-89 (1999)) ou cripto (CR-1) (Kannan etal. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). Ligantes HER que se ligam ao EGFR incluem EGF, TGF-α, anfiregulina, betacelulina, HB-EGF e epiregulina. Ligantes HER que se ligam a HER3 incluem heregulinas. Ligantes HER capazes de se ligar a HER4 incluem betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e heregulinas.

[0111] "Heregulina" (HRG) quando usado no presente pedido refere-se a um polipeptídeo codificado pelo produto gene heregulina como divulgado na patente US 5.641.869 ou Marchionni et al., Nature,362:312-318 (1993). Exemplos de heregulinas incluem heregulina-α, heregulina-β1, heregulina-β2 e heregulina-β3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); e patente US 5.641.869); fator de diferenciação neu (NDF) (Peles et al. Cell69: 205-216 (1992)); atividade de indução do receptor acetilcolina (ARIA) (Falls et al. Ce//72:801-815 (1993)); fatores de crescimento glial (GGFs) (Marchionni et al., Nature,362:312-318 (1993)); fator derivado sensorial e neuromotor (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); y-heregulina (Schaefer et al. Oncogene15:1385-1394 (1997)). O termo inclui fragmentos ativos biologicamente e/ou sequências variantes de aminoácidos de um polipeptídeo HRG de sequência nativa, tal como um fragmento deste de domínio similar ao EGF (por exemplo, HRGβl 177-244 ).

[0112] Um "dímero HER"no presente pedido é um dímero associado não covalentemente que compreende pelo menos dois receptores HER diferentes. Tais complexos podem se formar quando a célula expressa dois ou mais receptores HER é exposta a um ligante HER e pode ser isolada por imunoprecipitação e analizada por SDS-PAGE como descrito em Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994), por exemplo. Exemplos de tais dimeros HER incluem heterodímeros EGFR-HER2, HER2-HER3 e HER3-HER4. Além disso, o dímero HER pode compreender dois ou mais receptores HER2 combinados com um receptor HER diferente, tais como HER3, HER4 ou EGFR. Outras proteínas, tais como uma subunidade receptora de citocina (por exemplo, gp130) pode ser associada com o dímero.

[0113] Um “sítio de ligação heterodimérico” em HER2, refere-se a uma região no domínio extracelular de HER2 que contacta, ou conecta por meio de, uma região no domínio extracelular de EGFR, HER3 ou HER4 em formação de um dímero a partir disto. A região é encontrada no Domínio II de HER2. Franklin et al. Cancer Cell5:317-328 (2004).

[0114] “Ativação HER” ou “ativação HER2” refere-se à ativação, ou fosforilação, de qualquer um ou mais receptores HER, ou receptores HER2. Geralmente, ativação do HER resulta em sinal de transdução (por exemplo, aquele causado por um domínio quinase intracelular de um receptor HER de fosforilação de resíduos de tirosina no receptor HER ou um polipeptídeo substrato). Ativação HER pode ser mediada por ligação do ligante HER a um dímero HER que compreende o receptor HER de interesse. Ligação do ligante HER a um dímero HER pode ativar um domínio quinase de um ou mais dos receptores HER no dímero e através disso resultar na fosforilação de resíduos tirosina em um ou mais dos receptores HER e/ou fosforilação de resíduos tirosina no polipeptídeo(s) substrato(s), tais como quinases intracelulares Akt ou MAPK.

[0115] O termo "anticorpo" no presente pedido é usado no senso mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais de comprimento total, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos de comprimento total e fragmentos de anticorpo, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[0116] O termo "anticorpo monoclonal"como usado no presente pedido refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam-se ao mesmo epitopo, exceto por possíveis variantes que podem aparecer durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Além disso, para suas especificidades, os anticorpos monoclonais são vantajosos, pois eles não estão contaminados por outras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal"indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não sendo construído como produção requerida do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature,256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, patente US 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo em fago que utilizam as técnicas descritas em Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

[0117] Os anticorpos monoclonais no presente pedido especificamente incluem anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse particular de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse no presente pedido incluem anticorpos "primatizados" que compreendem sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, Macaco etc) e sequências de região constante humana.

[0118] “Fragmentos de anticorpo” compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, preferivelmente que compreende a ligação de antígeno ou região variável desta. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[0119] Um “anticorpo de comprimento total” é aquele que compreende uma região variável de ligação de antígeno assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes de sequência de aminoácido destes. Preferivelmente, o anticorpo de comprimento total possui uma ou mais funções efetoras.

[0120] O temo “tipo principal de anticorpo” no presente pedido refere-se à estrutura de anticorpo na composição que é a molécula de anticorpo predominante quantitativamente na composição. Em uma realização, o tipo principal de anticorpo é um anticorpo HER2, tal como um anticorpo que se liga ao Domínio II do HER2, anticorpo que inibe dimerização do HER mais efetivamente do que Trastuzumab, e/ou um anticorpo que se liga a um sítio de ligação heterodimérico do HER2. A realização preferida no presente pedido de um tipo principal de anticorpo HER2 é aquele que compreende variáveis leve e variáveis pesada de sequências de aminoácido na SEQ ID Nos. 3 e 4, e mais preferivelmente que compreende as sequências de aminoácido de cadeia leve e cadeia pesada.na SEQ ID Nos. 15 e 16 (Pertuzumab).

[0121] Um anticorpo de “sequência variante de aminoácido" no presente pedido é um anticorpo com uma sequência de aminoácido que difere de um tipo principal de anticorpo. Geralmente, sequências variantes de aminoácidos irão possuir pelo menos 70% de homologia com o tipo principal de anticorpo , e preferivelmente, eles irão ser pelo menos aproximadamente 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homólogos ao tipo principal de anticorpo As sequências variantes de aminoácido possuem substituições, deleções, e/ou adições em certas posições na ou adjacentes à sequência de aminoácido do tipo principal de anticorpo. Exemplos de sequências variantes de aminoácido no presente pedido incluem variante ácida (por exemplo anticorpo variante deamidado), variante básica, o anticorpo com uma extensão líder amino-terminal (por exemplo VHS-) em uma ou mais cadeias leves desta, anticorpo com um resíduo lisina C-terminal em uma ou duas cadeias pesadas desta, e inclui combinações de variações das sequências de aminoácidos de cadeia pesada e/ou leve. O anticorpo variante de interesse particular no presente pedido é o anticorpo que compreende uma extensão líder amino-terminal em uma ou duas cadeias leves deste, opcionalmente também compreende outra sequência de aminoácido e/ou diferenças de glicosilação relativas ao tipo principal de anticorpo.

[0122] Um “anticorpo monoclonal terapêutico” é um anticorpo usado para terapia de um sujeito humano. Anticorpos terapêuticos monoclonais divulgados no presente pedido incluem: Anticorpos HER2 para câncer e várias doenças ou disfunções não malignas; anticorpos CD20 ou BR3 para terapia de célula B maligna, doenças auto-imune, rejeição de transplante, ou bloqueio na resposta imune para um antígeno estranho; anticorpos IgE para terapia de uma doença mediada por IgE; anticorpos DR5 ou VEGF para terapia de câncer.

[0123] Um anticorpo de “glicosilação variante” no presente pedido é um anticorpo com uma ou mais unidades de carboidratos ligados a um tipo principal de anticorpo que difere em uma ou mais unidades de carboidratos ligados a um tipo principal de anticorpo. Exemplos de glicosilação variantes no presente pedido incluem anticorpo com uma estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2, no lugar de uma estrutura de oligossacarídeo GO, ligada à região Fc deste, anticorpo com uma ou duas unidades de carboidratos ligados a uma ou duas cadeias leves deste, anticorpo sem carboidrato ligado a uma ou duas cadeias pesadas de anticorpo, etc, e combinações de alterações de glicosilação.

[0124] Onde o anticorpo tem uma região Fc, uma estrutura de oligossacarídeo tal como aquela mostrada na Fig. 16 no presente pedido, pode ser ligada a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, por exemplo, no resíduo 299 (298, numeração Eu de resíduos). Para Pertuzumab, GO foi a estrutura de oligossacarídeo predominante, com outras estruturas de oligossacarídeo tal como GO-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1 (1-6), G1(1-3) e G2 sendo encontrado em menores quantidades na composição Pertuzumab.

[0125] A menos que indicado de outra forma, uma “estrutura de oligossacarídeo G1” no presente pedido inclui estruturas G-1, G1-1, G1(1-6) e G1(1-3).

[0126] Uma “extensão líder amino terminal” no presente pedido refere-se a um ou mais resíduos de aminoácido da sequência líder amino terminal que estão presentes nos aminos terminais de qualquer uma ou mais cadeias pesada ou leve de um anticorpo. Uma extensão líder amino-terminal exemplar compreende ou consiste de três resíduos de aminoácido, VHS, presentes em uma ou ambas cadeias leves de um anticorpo variante.

[0127] “Homologia” é definida como a porcentagem de resíduos na sequência variante de aminoácido que são idênticas após alinhamento de sequências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar a máxima porcentagem de homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um destes programas de computador é o "Align 2", criado pela Genentech, Inc. que foi depositado com documentação de usuário no United States Copyright Office, Washington D.C., 20559, em 10 de dezembro de 1991.

[0128] “Funções efetoras” do anticorpo refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de sequência variante) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem ligação C1q, citoxicidade dependente de complemento; ligação do receptor Fc; citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose, baixo controle de receptores de superfície celular (por exemplo receptor de célula B,BCR), etc.

[0129] Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos de comprimento total podem ser designados para diferentes “classes”. Existem cinco classes principais de anticorpos de comprimento total: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e vários destes podem mais adiante ser divididos em “subclasses” (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados de α, δ, ε, y, θ p, respectivamente. As subunidades de estruturas e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[0130] “Citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo” e “ADCC” referem-se à reação mediada por célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado na célula atingida e subsequentemente causam lise da célula atingida. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol9:457-92 (1991). Para avaliar atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio in vitrode ADCC, tal como descrito na patente US 5.500.362 ou US 5.821.337 pode ser apresentado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer(NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

[0131] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRI11 e desenpenham função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células natural killer(NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa destas, por exemplo, do sangue ou PBMCs como descrito no presente pedido.

[0132] Os termos "receptor Fc" ou “FcR” são usados para descrever um receptor que se liga a região Fc de um anticorpo. A FcR preferida é uma FcR humana de sequência nativa. Além disso, uma FcR preferida é aquela que se liga ao anticorpo IgG (um receptor gamma) e inclui as subclasses de receptores FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativas de splicing desses receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências similares de aminoácidos que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes. Receptor de ativação FcyRIIA contém uma unidade de ativação de imuno-receptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de ativação FcyRHA contém uma unidade de inibição de imuno-receptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver revisão M. em Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs foram revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel etal., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" no presente pedido. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer etal., J. Immunol.117:587 (1976) e Kim etal., J. Immunol.24:249 (1994)).

[0133] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” refere-se à habilidade de uma molécula lisar um alvo na presença de complemento. A via de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1q) para uma molécula complexa (por exemplo, um anticorpo) com um antígeno cognato. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods202:163 (1996), pode ser apresentado.

[0134] “Anticorpos nativos” são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compostas de duas cadeias idênticas leves (L) e duas cadeias idênticas pesadas (H). Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação bissulfeto covalente, enquanto o número de ligações bissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem regularmente espaçadas pontes bissulfeto inter-cadeia. Cada cadeia pesada tem em uma terminação um domínio variável (VH) seguida por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma terminação (VL) e um domínio constante em sua outra terminação. O domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Resíduos de aminoácido particular são acreditados formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada.

[0135] O termo “variável” refere-se ao fato que certas porções do domínio variável diferenciam-se extensivamente na sequência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através dos domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis ambos nos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas cada compreendem quatro FRs aceitando amplamente uma configuração β-folha, conectada por três regiões hipervariáveis, na qual formam loopsconectando, e em alguns casos formam parte da, estrutura β-folha. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação do antígeno dos anticorpos, (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5aEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[0136] O termo “região hipervariável” quando usado no presente pedido refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma “região determinada por complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5aEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de urn “loophipervariável” (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos de “região de estrutura” ou “FR” são aqueles resíduos de domínio variável exceto os resíduos de região hipervariável como definido no presente pedido.

[0137] Digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete sua habilidade para cristalizar de imediato. Tratamento por pepsina rende um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de ligação de antígeno e é ainda capaz de interligar-se ao antígeno.

[0138] “Fv” é um fragmento mínimo de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação de antígeno. Esta região consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação não covalente estreita. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivemente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até um unico domínio variável (ou metade de uma Fv que compreende somente três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a habilidade de reconhecer e ligar-se a um antígeno, embora com afinidade mais baixa que o sítio de ligação inteiro.

[0139] O fragmento Fab também contém o domínio constante de uma cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Fragmentos Fab’ diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminação carboxila de um domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente pedido para Fab' na qual o(s) resíduo(s) cisteína(s) dos domínios constantes produz pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos do anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem dobradiças cisteína entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.

[0140] As “cadeias leves” de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tipos claramente distintos, chamados kappa (K) e lambda(À), baseados na sequência de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0141] Fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única" ou “scFv” compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo Fv, além disso, compreende um ligante polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite o scFv formar a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv ver Plückthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Fragmentos csFv do anticorpo HER2 estão descritos no documento WO 93/16185; patente US 5.571.894; e patente US. 5.587.458.

[0142] O termo “diacorpos"refere-se a fragmentos de anticorpo pequeno com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável pesado (VH) conectado a um domínio variável leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Pelo uso de um ligante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos estão descritos mais inteiramente em, por exemplo, patente EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0143] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, roedor) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a desejada especificidade, afinidade, e capacidade. Em alguns exemplos, resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Além do mais, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os loopshipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente irá também compreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones et al., Nature321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).

[0144] Anticorpos humanizados HER2 incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 ou Trastuzumab (HERCEPTIN®) como descrito na tabela 3 da patente US 5.821.337 expressamente incorporada no presente pedido pela referência; anticorpos humanizados 520C9 (documento WO 93/21319) and anticorpos humanizados 2C4 como descrito no presente pedido.

[0145] Para os propósitos no presente pedido, “Trastuzumab,” “HERCEPTIN®,” e “huMAb4D5-8"referem-se a um anticorpo que compreende as sequências de aminoácido de cadeia leve e pesada na SEQ ID NOS. 13 e 14, respectivamente.

[0146] No presente pedido, “Pertuzumab,” ThuMAb 2C4," e “OMNITARG™” referem-se a um anticorpo que compreende as sequências de aminoácidos variáveis pesada e leve na SEQ ID Nos. 3 e 4, respeitosamente. Onde Pertuzumab é um anticorpo de comprimento total, preferivelmente compreende as sequências de cadeia leve e cadeia pesada na SEQ ID NOS. 15 e 16, respectivamente.

[0147] Um “anticorpo nu” é um anticorpo (como definido no presente pedido) que não é comjugado á uma molécula heteróloga, tal como um componente citotóxico ou radiomarcado.

[0148] Um anticorpo de “afinidade madura” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis destes que resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com um anticorpo parental que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos de afinidade madura preferidos terão afinidades nanomolar ou até afinidades picomolar para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por processos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por mistura de domínio VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por: Barbas et al. ProcNat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schieref al. Gene 169:147- 155 (1995); Yelton et al. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[0149] Um “anticorpo agonista” é um anticorpo que se liga e ativa um receptor. Geralmente, a capacidade de ativação do receptor do anticorpo agonista será pelo menos qualitativamente similar (e pode ser essencialmente quantitativamente similar) a um ligante agonista nativo do receptor. Um exemplo de um anticorpo agonista é aquele que se liga ao receptor da superfamília de receptor TNF, tal como DR5, e induz apoptose das células que expressam o receptor TNF (por exemplo DR5). Ensaios para determinação da indução de apoptose estão descritos no documento WO 98/51793 e documento WO 99/37684, ambos que são expressamente incorporados ao presente pedido pela referência.

[0150] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separdo e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir com usos diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo, e pode incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais que 95% por peso de anticorpo como determinada pelo método Lowry, e mais preferivelmente mais que 99% por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por FAGO-SDS sob condições de redução ou não redução utilizando-se Coomassie blueou, preferivelmente, silver stain.Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situdentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Geralmente, no entanto, anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0151] Um anticorpo HER2 que “inibe dimerização HER mais efetivamente que Trastuzumab” é aquele que reduz ou elimina dímeros HER mais efetivamente (por exemplo, pelo menos aproximadamente 2 dobras mais efetivamente) que Trastuzumab. Preferivelmente, um tal anticorpo inibe dimerização HER2 pelo menos tão efetivamente quanto um anticorpo selecionado do grupo que consiste de anticorpo 2C4 monoclonal murino, um fragmento Fab do anticorpo 2C4 monoclonal murino, Pertuzumab, e um fragmento Fab de Pertuzumab. Uma pessoa pode avaliar inibição de dimerização do HER diretamente pelo estudo dos dímeros HER, ou pela avaliação da ativação do HER, ou sinalização a jusante, que resulta da dimerização do HER, e/ou por avaliação do sítio de ligação do anticorpo HER2, etc. Ensaios para seleção de anticorpos com a habilidade de inibir dimerização HER mais efetivamente que Trastuzumab estão descrito em Agus et al. Cancer Cell2: 127-137 (2002) e documento WO 01/00245 (Adams et al.). Somente a título de exemplo, uma pessoa pode analisar inibição de dimerização do HER por avaliação, por exemplo, inibição da formação do dímero HER (ver, por exemplo, Fig. 1A-B de Agus et al. Cancer Cell2: 127-137 (2002); e documento WO 01/00245); redução na ativação do ligante HER de células que expressam dímeros HER (documento WO 01/00245 e Fig. 2A-B de Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002); por exemplo); bloqueio de ligação do ligante HER para células que expressam dímeros HER (documento WO 01/00245 e Fig. 2E de Agus etal. Cancer Cell2: 127-137 (2002), por exemplo); inibição de crescimento celular de células cancerosas (por exemplo, células MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD- MB-175, T-47D) que expressam dímeros HER na presença (ou ausência) do ligante HER (documento WO 01/00245 e Figs. 3A-D de Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo); inibição de sinalização a jusante (por exemplo, inibição de fosforilação AKT dependente de HRG ou inibição de HRG- ou fosforilação MAPK dependente de TGFa-) (ver, documento WO 01/00245, e Fig. 2C-D de Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo). Uma pessoa pode avaliar se o anticorpo inibe dimerização do HER pelo estudo do sítio de ligação anticorpo-HER2, por exemplo, avaliando uma estrutura ou modelo, tal como uma estrutura cristalina, do anticorpo ligado ao HER2 (Ver, por exemplo, Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).

[0152] O anticorpo HER2 pode “inibir fosforilação AKT dependente de HRG” e/ou inibir “fosforilação MAPK dependente de TGFa ou HRG-” mais efetivamente (por exemplo, pelo menos 2-dobras mais efetivamente) do que Trastuzumab (ver Agus et al. Cancer Cell2: 127-137 (2002) e documento WO 01/00245, a título de exemplo).

[0153] O anticorpo HER2 pode ser aquele que “não inibe divagem do ectodomínio HER2” (Molina et al.Cancer Res. 61:4744-4749(2001).

[0154] Um anticorpo HER2 que “se liga a um sítio de ligação heterodimérico” do HER2, liga-se aos resíduos no domínio II (e opcionalmente também se liga aos resíduos em outros domínios do domínio extracelular HER2, tais como domínios I e III), e podem sterically impedir, pelo menos até certo ponto, formação de um heterodímero HER2-EGFR, HER2-HER3, ou HER2- HER4. Franklin et al. Cancer Cell5:317-328 (2004) caracteriza a estrutura cristalina HER2-Pertuzumab, depositada com o RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78), que ilustra um anticorpo exemplar que se liga ao sítio de ligação heterodimérico do HER2.

[0155] Um anticorpo que “se liga ao domínio II” do HER2 liga-se aos resíduos no domínio II e opcionalmente aos resíduos em outro(s) domínio(s) do HER2, tais como domínios I e III. Preferivelmente o anticorpo que se liga ao domínio II liga-se à junção entre os domínios I, II e III do HER2.

[0156] Um "agente inibitório de crescimento" quando usado no presente pedido refere-se a um componente ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerosa que expressa HER tanto in vitrocomo in vivo. Dessa forma, o agente inibitório de crescimento pode ser aquele que reduz significantemente a porcentagem de células que expressam HER na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local exceto fase S), tais como agentes que induzem a interrupção G1 e interrupção da fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vimblastina), taxanos, e inibidores topo II tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, e bleomicina. Aqueles agentes que capturam G1 também se espalham na captura da fase S, por exemplo, agentes alcalinizantes de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluor uracila, e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, entitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, e antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.

[0157] Exemplos de anticorpos “inibitórios de crescimento” são aqueles que se ligam a HER2 e inibem o crescimento de células cancerosas que superexpressam HER2. Anticorpos HER2 inibitórios de crescimento preferidos inibem crescimento de células de tumor de mama SK-BR-3 em cultura celular mais que 20%, e preferivelmente mais que 50% (por exemplo, de aproximadamente 50% para cerca de 100%) em uma concentração de anticorpo de aproximadamente 0,5 a 30 pg/ml, onde a inibição de crescimento é determinada seis dias após exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (ver patente US 5.677.171 emitida em 14 de outubro de 1997). O ensaio de inibição de crescimento da célula SK-BR3 é descrito em maiores detalhes naquela patente e previamente mencionado. O anticorpo inibitório de crescimento preferido é um variante humanizado do anticorpo 4D5 monoclonal murino, por exemplo, Trastuzumab.

[0158] Um anticorpo que “induz apoptose” é aquele que induz morte celular programada como determinada pela ligação de anexina V, fragmentação do DNA, diminuição celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas na membrana (chamados corpos apoptóticos). A célula é usualmente aquela que expressa o antígeno para o qual o anticorpo se liga. Preferivelmente a célula é uma célula tumoral. Por exemplo, translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida por ligação anexina; fragmentação de DNA pode ser avaliada através de DNA em escada; e condensação nuclear/cromatina junto com fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento nas células hipodiplóides. Preferivelmente, o anticorpo que induz apoptose é aquele que resulta em aproximadamente 2 a 50 dobras, preferivelmente cerca de 5 a 50 dobras, e mais preferivelmente cerca de 10 a 50 dobras, indução de ligação de anexina relativa à célula não tratada em um ensaio de ligação de anexina usando-se células que expressam um antígeno ao qual o anticorpo se liga. Exemplos de anticorpos que induzem apoptose são os anticorpos HER2 7C2 e 7F3, e certos anticorpos DR5.

[0159] O “epitopo 2C4” é a região no domínio extracelular do HER2 para o qual o anticorpo 2C4 se liga. Com o objetivo de selecionar anticorpos que se ligam ao epitopo 2C4, uma rotina de ensaio de interbloqueio tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser executado. Alternativamente, o mapeamento do epitopo pode ser executado para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 2C4 do HER2. O epitopo 2C4 compreende resíduos do domínio II no domínio extracelular do HER2. 2C4 e Pertuzumab ligam-se ao domínio extracelular do HER2 na junção dos domínios I, II e III. Franklin et al.Cancer Ce//5:317-328 (2004).

[0160] O “epitopo 4D5” é a região no domínio extracelular do HER2 ao qual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) e Trastuzumab se ligam. Este epitopo está próximo ao domínio de transmembrana do HER2, e no Domínio IV do HER2. Para selecionar anticorpos que se ligam ao epitopo 4D5, uma rotina de ensaio de interbloqueio tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser executada. Alternativamente, o mapeamento do epitopo pode ser executado para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 4D5 do HER2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos na região de aproximadamente resíduo 529 a aproximadamente resíduo 625, incluindo, do HER2).

[0161] O “epitopo 7C2/7F3” é a região no amino terminal, no Domínio I, do domínio extracelular do HER2 aos quais os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 se ligam (cada um depositado com o ATCC, ver abaixo). Para selecionar anticorpos que se ligam ao epitopo 7C2/7F3, uma rotina de ensaio de interbloqueio tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser executada. Alternativamente, o mapeamento do epitopo pode ser executado para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 7C2/7F3 no HER2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos na região de aproximadamente resíduo 22 a aproximadamente resíduo 53, incluindo, do HER2).

[0162] “Tratamento” refere-se a ambos os tratamentos terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles já com a doença assim como aqueles em que a doença será prevenida. Portanto, o paciente a ser tratado no presente pedido pode ter sido diagnosticado como tendo a doença ou pode ser predisposto ou suscetível à doença.

[0163] Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo descontrole do crescimento celular. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluindo meduloblastoma e retinoblastoma), sarcoma (incluindo liposarcoma e sarcoma celular sinovial), tumores neuroendócrinos (incluindo tumores carcinóides, gastrinoma, e câncer de célula de ilhota), mesotelioma, schwannoma (incluindo neuroma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma, e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer celular escamoso (por exemplo, câncer celular escamoso epitelial) câncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, adenocarcinoma de pulmão e carcinoma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma anal, carcinoma de pênis, câncer testicular, câncer esofágico, tumores do trato biliar, assim como câncer de cabeça e pescoço.

[0164] O termo “quantidade efetiva” refere-se a uma quantidade de um fármaco efetivo para uma doença no paciente. Onde a doença é câncer, a quantidade efetiva do fármaco pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e preferivelmente parar) infiltração de células de câncer em órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e preferivelmente parar) metástases de tumor; inibir, até certo ponto, crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Até certo ponto o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou destruir células existentes de câncer, pode ser citostático e/ou citotóxicas. A quantidade efetiva pode estender sobrevivência livre de progressão, resultar em uma resposta objetiva (incluindo uma resposta parcial, PR, ou resposta completa CR), aumentar o tempo de sobrevivência completa, e/ou melhorar um ou mais sintomas do câncer.

[0165] Um “câncer que expressa HER2” é aquele que compreende células que possuem proteína HER2 presente na superfície celular delas.

[0166] Um câncer que “superexpressa” um receptor HER é aquele que tem níveis significativamente mais altos de um receptor HER, tal como HER2, na superfície celular deste, comparado a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou por aumento de transcrição ou tradução. A superexpressão do receptor HER pode ser determinada em um ensaio diagnóstico ou prognóstico por avaliação do aumento dos níveis da proteína HER na superfície de uma célula (por exemplo, via um ensaio imunohistoquímico; IHC). Alternativamente, ou adicionalmente, uma pessoa pode medir os níveis do ácido nucleico que codifica o HER na célula, por exemplo via hibridização in situfluorescente (FISH; ver documento WO 98/45479 publicado em outubro de 1998), southern blotting, ou técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Alguém pode também estudar a superexpressão pela medida do antígeno derramado em um fluido biológico tal como soro (ver, por exemplo, patente US 4.933.294 emitida em 12 de junho de 1990, documento WO 91/05264 publicado em 18 de abril de 1991, patente US emitida em 28 de março de 1995, e Sias et al.J.Immunol.Methods132: 73-80 (1990)). Ao lado dos ensaios acima, vários ensaios in vivo estão disponíves para os médicos técnicos no assunto. Por exemplo, alguém pode expor as células do corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com uma marca detectável, por exemplo um isótopo radioativo, e ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por exemplo por varredura externa por radioatividade ou por análise de uma biópsia tirada de um paciente previamente exposto ao anticorpo.

[0167] Reciprocamente, um câncer que “não superexpressa o receptor HER2” é aquele que não expressa níveis mais altos do que os normais do receptor HER2 comparado a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido.

[0168] Um câncer que “superexpressa” um ligante HER é aquele que produz níveis significativamente mais altos doquele ligante comparado a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou por aumento de transcrição ou tradução. A superexpressão do ligante HER pode ser determinada de forma diagnóstica pela avaliação dos níveis do ligante (ou ácido nucleico que o codifica) no paciente, por exemplo, em uma biópsia de tumor ou por vários ensaios de diagnóstico tais como IHC, FISH, southern blotting,PCR ou ensaios in vivo descritos acima.

[0169] O termo "agente citotóxico" como usado no presente pedido refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/ou causa destruição das células. O termo tem a intenção de incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, BÍ212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimeoterápicos, e toxinas tal como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimáticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas.

[0170] Um "agente quimioterápico" é um componente químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquiladores tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonados tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo suas análogas adozelesina, carzelesina e bizelesina sintética); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, πovembiquiπ, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas tais como carmustina, clorozotocina, fotemustiπa, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall e caliqueamicina ômega 11 (ver, por exemplo,Agnew, Chem Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como neocarzinostatina cromófora e antibióticos cromóforos de cromoproteínas enedina relacionadas), aclacinomisinas, actinomicinas, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorubicina (incluindo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, injeção de lipossomo HCI doxorubicina (DOXIL®), doxorubicina lipossomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorubicina lipossomal peguilada (CAELYX®), e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato, gencitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), uma epotilona, e 5-flúor uracil (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotane, trilostane; ácido fólico reabastecedor tais como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida ; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucila; bisaπtreπo; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucídio; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansiπoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxaπtrona; mopidaπmol; πitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxaπtrona; 2-etil hidrazido; procarbazina; complexo de polisacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxino; sizofirano; spirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2”-tricloro trietil lamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); tiotepa; taxóide, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulação de paclitaxel de nanoparticulas de albumina- engenherada (ABRAXANETM), e docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucila; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes platina tais como cisplatina, oxaliplatina, e carboplatina; vincas, que previnem polimerização da tubulina de formação de microtúbulos, incluindo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), e vinorelbina (NAVELBINE®); etoposideo (VP-16); ifosfamida; mitoxaπtrona; leucovovina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico, incluindo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrônico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), ou risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (um análogo citosina nucleosideo 1,3-dioxolana); oligonucleotideos antisense , particularmente aqueles que inibem expressão de genes nas vias de sinalização envolvidas na proliferação celular anormal, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia de gene, por examplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; inibidor topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por exemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (Pfizer); perifosina, inibidor COX-2 (por exemplo, celecoxib ou etoricoxib), inibidor proteosomo (por exemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Bcl-2 inibidor tai como oblimerseno de sódio (GENASENSE®); pixantrona; inibidores EGFR (ver definição abaixo); inibidor tirosina quinase (ver definição abaixo); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima tais como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinado com 5-FU e leucovovina.

[0171] Também incluídos nesta definição estão agentes anti- hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormônios em tumores tais como anti-estrogênio com mistura de perfil agonista/antagonista, incluindo, tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, queoxifeno, e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs) tal como SERM3; anti-estrogênios puros sem propriedades agonista, tais como fulvestrant (FASLODEX®), e EM800 (tais agentes podem bloquear a dimerização do receptor de estrogênio (ER), inibir a ligação do DNA, aumentar a rotatividade de ER, e/ou suprimir os níveis de ER); inibidores aromatase, incluindo inibidores aromatase esteroidais tais como formestano e exemestano (AROMASIN®), e inibidores aromatase não esteroidais tais como anastrazola (ARIMIDEX®), letrozola (FEMARA®) e aminoglutetimida, e outros inibidores aromatase incluindo vorozola (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozola, imidazola; hormônios agonistas de liberação de hormônio luteinizante, incluindo leuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), gosereliπa, buserelina, e tripterelina; esteróides sexuais, incluindo progestinas tais como acetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona, estrogênios tais como dietilstilbestrol e premarina, e andrógenos/retinóides tais como fluoximesterona, todo ácido transretiônico e fenretinida; onapristona; anti-progesterona; reguladores baixos do receptor de estrogênio (ERDs); anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; testolactona; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima.

[0172] Como usado no presente pedido, o termo “fármaco EGFR atingido” refere-se a um agente terapêutico que se liga a EGFR e, opcionalmente, inibe ativação EGFR. Exemplos de tais agentes incluem anticorpos e pequenas moléculas que se ligam ao EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (ver, patente US 4.943.533, Mendelsohn et al.) e variantes destes, tais como quimerizados 225 (C225 ou Cetuximab; ERBUTIX®) e 225 humano transformado (H225) (ver, documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que se ligam tipo II mutante EGFR (patente US 5.212.290); anticorpos quiméricos e humanizados que se ligam a EGFR como descrito na patente US 5.891.996; e anticorpos humanos que se ligam a EGFR, tal como ABX-EGF (ver documento WO 98/50433, Abgenix). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, dessa forma gerando um imunoconjugado (ver, por exemplo, patente EP 659.439A2, Merck Patent GmbH). Exemplos de pequenas moléculas que se ligam a EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca), CP-358774 ou Erlotinib HCL (TARCEVA™; Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen).

[0173] Um “inibidor tirosina quinase” é uma molécula que inibe de certa forma a atividade de tirosina quinase de uma tirosina quinase tal como um receptor HER. Exemplos de tais inibidores incluem os fármacos que atingem EGFR apontadas no parágrafo anterior assim como inibidor tirosina quinase HER2 de molécula pequena tal como TAK165 disponível por meio de Takeda, inibidores dual-HER tal como EKB-569 (disponível por meio da Wyeth) que preferencialmente se ligam ao EGFR mas inibem células que superexpressam HER2 & EGFR, GW572016 (disponível por meio da Glaxo) um inibidor oral HER2 e inibidor tirosina quinase EGFR, e PKI-166 (disponível por meio da Novartis); inibidores pan-HER tal como canertiniba (CI-1033; Pharmacia); inibidores Raf-1 tal como agente antisense ISIS-5132 disponível por meio da ISIS Pharmaceuticals que inibem sinalização de Raf-1; inibidores TK que não atingem HER tal como Imatinib mesylate (Gleevac™) disponível por meio da Glaxo; inhibidor C1-1040 quinase I regulado por MAPK extracelular (disponível por meio da Pharmacia); quinazolinas, tal como PD 153035,4-(3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tal como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)phtalimida); tirfostinas contendo unidades de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antisense (por exemplo, aqueles que se ligam ao ácido nucléico que codifica HER); quinoxalinas (patente US 5.804.396); trifostinas (patente US 5.804.396); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores pan-HER tal como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); Imatinib mesilato (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou como descrito em qualquer das seguintes publicações de patente: Patente US 5.804.396; documento WO 99/09016 (American Cyanimid); documento WO 98/43960 (American Cyanamid); documento WO 97/38983 (Warner Lambert); document WO99/06378 (Warner Lambert); documento WO 99/06396 (Warner Lambert); documento WO 96/30347 (Pfizer, Inc); documento WO 96/33978 (Zeneca); documento WO 96/3397 (Zeneca); e documento WO 96/33980 (Zeneca).

[0174] Um “agente anti-angiogênico” refere-se a um composto que bloqueia, ou interfere com algum grau, o desenvolvimento de vasos sanguíneos. O fator anti-angiogênico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou anticorpo que se liga ao fator de crescimento ou receptor do fator de crescimento envolvido na promoção de angiogênese. O fator anti-angiogênico preferido no presente pedido é um anticorpo que se liga ao Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF), tal como Bevacizumab (AVASTIN®).

[0175] O termo “citocina” é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que agem em outra célula como mediadora intercelular. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, e hormônios polipeptídeos tradicionais. Incluído entre as citocinas estão hormônios de crescimento tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionil, e hormônio de crescimento bovino; hormônio paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio folículo-estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH), hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento do fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator-a e -β de necrose tumoral; substância inibidora de mulleriana; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; inhibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento do nervo tal como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores transformantes do crescimento (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator-l e -II de crescimento de similar a insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoinductivo; interferons tais como interferon-α, -β, e -y; fatores de estimulação de colônia (CSFs) tal como macrófago-CSF (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM- CSF); e granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1 α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um fator de necrose tumoral tais como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeos incluindo LIF e ligante kit (KL). Como usado no presente pedido, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos da sequência nativa de citocinas.

[0176] O anticorpo que é formulado é preferivelmente essencialmente puro e desejável essencialmente homogêneo (isto é, livre de contaminar proteínas etc). Anticorpo “essencialmente puro” significa uma composição que compreende pelo menos aproximadamente 90% de peso de anticorpo, baseado no peso total da composição, preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% de peso. Anticorpo “essencialmente homogêneo” significa uma composição que compreende pelo menos aproximadamente 99% de peso do anticorpo, baseado no peso total da composição.

[0177] Um “marcador de superfície de célula B” ou “antígeno de superfície de célula B” no presente pedido é um antígeno expressado na superfície de uma célula B que pode ser atingido com um anticorpo que se liga a isto. Exemplares de marcadores de superfície de célula B incluem os marcadores de superfície de leucócitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, ver The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a Edição. 1997, ed. Barclay et al.Academic Press, Harcourt Brace &Co., New York). Outros marcadores de surpefície de célula B incluem RP105, FcRH2, célula B CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, e 239287. O marcador de surpefície de célula B de interesse particular no presente pedido é preferencialmente expressado nas células B comparado a outros tecidos de célula não B de um mamífero e pode ser expressado em ambos precursores de células B e células B maduras. O marcador de superfície de célula B preferido no presente pedido é CD20 ou BR3.

[0178] O antígeno “CD20", ou “CD20” é uma fosfoproteína não- glicosilada de aproximadamente 35 kDa, encontrada na superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico ou órgãos linfóides. CD20 está presente em ambas as células B normais assim como células B malignas, mas não é expressado em células tronco. Outros nomes para CD20 na literatura incluem “antígeno restrito de linfócito B” e “Bp35". O antígeno CD20 está descrito em Clark et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82:1766 (1985), por exemplo.

[0179] Puramente para os propósitos no presente pedido, “2H7 humanizado” refere-se a um variante humanizado do anticorpo 2H7 cuja sequência de CDR está divulgada na patente US 5.500.362 (Figs. 5 e 6), expressamente incorporada no presente pedido pela referência. Exemplos de anticorpos 2H7 humanizados no presente pedido incluem os variantes descritos no documento WO 2004/056312, também expressamente incorporado no presente pedido pela referência, assim como outros variantes, incluindo, mas não limitado a: 2H7v16, 2H7v31,2H7v73, 2H7v75, 2H7v96, 2H7v114, 2H7v115, 2H7v116, 2H7v138, 2H7v477, 2H7v375, etc.

[0180] Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis das seguintes sequências de CDR: CDR L1 sequência RASSSVSYX em que X é M ou L (SEQ ID No. 67), por exemplo, SEQ ID No. 57 (Fig. 18A), CDR L2 sequencia de SEQ ID No. 58 (Fig. 18A), CDR L3 sequência QQWXFNPPT em que X é S ou A (SEQ ID No. 68), por exemplo, SEQ ID No. 59 (Fig. 18A), CDR H1 sequência de SEQ ID No. 60 (Fig. 18B), CDR H2 sequência de AIYPGNGXTSYNQKFKG em que X é D ou A (SEQ ID No. 69), por exemplo, SEQ ID No. 61 (Fig. 18B), e CDR H3 sequência de VVYYSXXYWYFDV em que X na posição 6 é N, A, Y, W ou D, e o X na posição 7 é S ou R (SEQ ID No. 70), por exemplo SEQ ID No. 62 (Fig. 18B).

[0181] As sequências CDR acima estão geralmente presentes nas sequências de estrutura variável leve e variável pesada humanas, tais como substancialmente os resíduos de FR consenso humano do subgrupo I kappa cadeia leve humana I (Vi_6l), e substancialmente os resíduos de FR consenso humano do subgrupo III cadeia pesada humana (VHIII). Ver também documento WO 2004/056312 (Lowman etal.).

[0182] A região pesada variável pode estar ligada a uma região constante da cadeia IgG humana, em que a região pode ser, por exemplo, lgG1 ou lgG3, incluindo sequência nativa e regiões constantes variantes.

[0183] Em uma realização preferida, tal anticorpo compreende a sequência de domínio variável pesada da SEQ ID No. 29 (v16, como mostrado na Fig. 18B), opcionalmente também compreende a sequência de domínio variável leve da SEQ ID No. 26 (v16, como mostrado na Fig. 18A), que opcionalmente compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 56,100, e/ou 100a, por exemplo, D56A, N100A ou N100Y, e/ou S100aR no domínio variável pesado e uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 32 e/ou 92, por exemplo, M32L e/ou S92A, no domínio variável leve. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo intacto que compreende as sequências de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID Nos. 63 ou 64, e sequências de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID No. 65, 66, 71 ou 72.

[0184] Um anticorpo 2H7 humanizado preferido é ocrelizumab (Genentech).

[0185] O anticorpo no presente pedido pode, além disso, compreender pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que melhora atividade de ADCC, tal como aquele em que as substituições de aminoácido estão nas posições 298, 333, e 334, preferivelmente S298A, E333A, e K334A, usando-se numeração Eu de resíduos de cadeia pesada. Ver também patente US 6.737.056B1, Presta.

[0186] Qualquer um destes anticorpos pode compreender pelo menos uma substituição na região Fc que melhora ligação de FcRn ou meia vida do soro, por exemplo, uma substituição na posição 434 da cadeia pesada, tal como N434W. Ver também patente US 6.737.056B1, Presta.

[0187] Qualquer destes anticorpos pode ,além disso, compreender pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que aumenta atividade de CDC, por exemplo, que compreende pelo menos uma substituição na posição 326, preferivelmente K326A ou K326W. Ver também patente US 6.528.624B1 (Idusogie et al.).

[0188] Alguns variantes 2H7 humanizados são aqueles que compreendem o domínio variável leve da SEQ ID No. 26 e o domínio variável pesado da SEQ ID No. 29, incluindo aqueles com ou sem substituições em uma região Fc (se presente), e aqueles que compreendem um domínio variável pesado com alteração N100A; ou D56A e N100A; ou D56A, N100Y, e S100aR; na SEQ ID No. 29 e um domínio variável leve com alteração M32L; ou S92A; ou M32L e S92A; na SEQ ID No. 26.

[0189] M34 na cadeia pesada variável do 2H7v16 foi identificado como uma fonte potencial de estabilidade de anticorpo e é outro candidato potencial para substituição.

[0190] Em um resumo de várias realizações preferidas da invenção, a região variável de variantes baseada no 2H7v16 compreende as sequências de aminoácidos de v16 exceto nas posições de substituições de aminoácidos que estão indicadas na Tabela abaixo. A menos que indicado de outra forma, os variantes 2H7 terão a mesma cadeia leve como aquela de v16. VARIANTES DE ANTICORPO 2H7 HUMANIZADO EXEMPLARES

[0191] Um 2H7 humanizado preferido compreende sequência de domínio variável leve 2H7v16: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIK R (SEQ ID No. 26); e sequência de domínio variável pesada 2H7v16: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAI YPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYS NSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID No. 29).

[0192] Quando o anticorpo 2H7v16 humanizado é um anticorpo intacto, ele pode compreender a sequência de aminoácido de cadeia leve: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC (SEQ ID No. 63); e a sequência de aminoácido de cadeia pesada da SEQ ID No. 65 ou: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAI YPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYS NSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID No. 71).

[0193] Outro anticorpo 2H7 humanizado preferido compreende sequência de domínio variável leve 2H7v511: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIK R (SEQ ID No. 73) e sequência de domínio variável pesada 2H7v511: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAI YPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYS YRYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID No. 74).

[0194] Quando o anticorpo 2H7v511 humanizado é um anticorpo intacto, ele pode compreender a sequência de aminoácido de cadeia leve: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC (SEQ ID No. 64) e a sequência de aminoácido de cadeia pesada da SEQ ID No. 66 ou: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAI YPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYS YRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID No. 72).

[0195] Uma “célula B maligna” no presente pedido inclui linfoma não Hodgkin (NHL), incluindo NHL de baixo grau/folicular, NHL linfocítico pequeno (SL), NHL de grau intermediário/folicular, NHL de grau intermediário difuso, NHL de alto grau imunoblástico, NHL de alto grau linfoblástico, NHL de alto grau de célula não clivada pequena, NHL de doença volumosa, linfoma de célula do manto, linfoma relacionado a AIDS, e Macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia, incluindo aleucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), Leucemia de célula Cabeluda e leucemia mieloblástica crônica; e outras malignidades patológicas. Tais malignidades podem ser tratadas com anticorpos direcionados contra marcadores de superfície de célula B, tal como CD20.

[0196] O termo “linfoma não-Hodgkin” ou “NHL”, como usado no presente pedido, refere-se a um câncer do sistema linfático exceto lininfoma de Hodgkin. Linfomas de Hodgkin podem geralmente ser distinguidos dos linfomas não Hodgkin pela presença de células Reed-Sternberg nos linfomas de Hodgkin e a ausência de ditas células nos linfomas não Hodgkin. Exemplos de linfomas não-Hodgkin englobados pelo termo como usado no presente pedido incluem qualquer um daquele que seria identificado como tal por um técnico no assunto (por exemplo, um oncologista ou patologista) em conformidade com esquemas de identificação conhecidos na técnica, tal como o esquema Revised European- American Lymphoma (REAL) como descrito em Color Atlas of Clinical Hematology, Terceira Edição; A. Victor Hoffbrand e John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Limited 2000) (ver, em particular Fig. 11.57, 11.58 e/ou 11.59). Exemplos mais específicos incluem, mas não são limitados a, NHL refratário ou de recaída, NHL de grau de linha de frente, NHL de Estágio lll/IV, NHL resistente a quimioterapia, Leucemia e/ou linfoma linfoblástico B precursor, linfoma linfocítico pequeno, leucemia linfocítica crônica de célula B e/ou leucemia pró-linfocítica e/ou linfoma linfocítico pequeno, linfoma pró-linfocítico de célula B, imunocitoma e/ou linfoma linfoplasmacítico, linfoma de célula B de zona marginal, linfoma de zona marginal esplénico, linfoma MALT de de zona marginal extranodal, linfoma de zona marginal nodal, leucemia de célula cabeluda, plasmacitoma e/ou mieloma de célula plasmática, linfoma de baixo grau/folicular, NHL de grau intemediário/folicular, linfoma de célula de manto, linfoma do folículo central (folicular), NHL intermediário de grau difuso, linfoma de célula b grande difuso, NHL agressivo (incluindo NHL de linha de frente agressivo e NHL de recaída agressivo), NHL de recaída após ou refratário ao transplante de célula tronco autólogo, linfoma de célula b grande mediastinal primário, linfoma de efusão primária, NHL imunoblástico de alto grau, NHL de célula não clivada pequena de alto grau, NHL de doença volumosa, linfoma de Burkitt, leucemia e/ou linfoma linfoblástico de célula T precursora (periférica), linfoma de célula t adulta e/ou leucemia, leucemia linfocítica crônica de célula T e/ou leucemia pró- linfocítica, leucemia linfocítica granular grande, micoses fungóides e/ou síndrome de Sezary, linfoma extranodal naturalk/7/er/célula T (tipo nasal), linfoma de célula T tipo enteropatia, linfoma de célula T hepatoesplênico, linfoma de célula T similar a paniculite subcutânea, linfomas de pele (cutâneo), linfoma de célula grande anaplásica, linfoma angiocêntrico, linfoma de célula T intestinal, linfoma de célula T periférica (não especificado de outra maneira) linfoma de célula T angioimunoblástico.

[0197] Uma “doença auto-imune” no presente pedido é uma doença ou disfunção que surge do e dirigida contra os próprios tecidos do indivíduo ou uma co-secretada ou manifestação desta ou resultante de condições a partir deste ponto. Exemplos de doenças auto-imune ou disfunções incluem, mas não são limitados a artrite (artrite reumatóide, artrite reumatóide de princípio juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, e espondilite anquilosante), psoríase, dermatite incluindo dermatite atópica, urticaria idiopática crônica, incluindo urticaria auto-imune crônica, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidermal tóxica, escleroderma (incluindo escleroderma sistêmica), esclerose tal como esclerose sistêmica progressiva, doença inflamatória de intestino (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória de intestino auto-imune), pioderma gangrenoso, ehtema nodoso, colangite esclerosante primária, episclerite), síndrome de angústia respiratória, incluindo síndrome de angústia respiratória adulta (ARDS), meningite, doenças mediadas por IgE tal como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite tal como encefalite de Rasmussen, uveite ou uveite auto-imune, colite tal como colite microscópica e colite colagenosa, glomerulonefrite (GN) tal como GN membranosa (neupática membranosa), GN membranosa idiopática, GN proliferativa membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, e GN de progressão rápida, condições alérgicas, reações alérgicas, eczema, asma, condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, arterioesclerose, miocardite auto-imune, deficiência de adesão de leucócito, lupus eritematoso sistêmico (SLE) tal como SLE cutâneo, lupus eritematoso cutâneo sub-agudo, lupus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrica, não-renal, discóide, alopecia), diabetes melitus (Tipo I) de princípio juvenil, incluindo diabetes melitus dependente de insulina pediátrica (IDDM), diabetes melitus de princípio adulta (diabetes Tipo II), esclerose múltipla (MS) tal como MS ótica- espinhal, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocina e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatóide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite de Grandes Vasos (incluindo Polimialgia Reumática e Arterite de Célula Gigante (de Takayasu)), vasculite de Vaso Médio (incluindo Doença de Kawasaki e Poliarterite Nodosa), vasculite CNS, vasculitee necrosante sistêmica, e vasculite associada a ANCA, tal como vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS)), arterite temporal, anemia aplásica, anemia positiva Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica auto-imune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia de célula vermelha pura (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia auto-imune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócito, disfunções inflamatórias CNS, síndrome de lesão de órgão múltipla, doenças mediadas por complexo antígeno- anticorpo, doença da membrana basal anti-glomerular, síndrome de anticorpo antifosfolipídico, neurite alérgica, doença de Bechet, síndrome de Castleman, Síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide tal como penfigóide vesicular, penfigo (incluindo comum, foliáceo, e penfigo penfigóide muco-membranoso), poliendocrinopatias auto-imune, Doença de Reiter, nefrite de complexo imune, neuropatia crônica tal como polineuropatias IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (como desenvolvida por pacientes com infarto do miocardio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), e trombocitopenia auto-imune ou imune relacionada tal como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, doença auto- imune do testículo e ovário incluindo orquite auto-imune e ooforite, hipotiroidismo primário, hipoparatiroidismo, doenças endocrinas auto-imune incluindo tiroidite tal como tiroidite auto-imune, tiroidite crônica (Tiroidite de Hashimoto), ou tiroidite sub-aguda, doença de tireoide auto-imune, hipotiroidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndrome poliglandular tal como síndrome poliglandular auto-imune (ou síndrome endocrinopática poliglandular), síndrome parameoplásica, incluindo síndrome pareneiplásicas neurológicas tal como síndrome miastênica Lambert-Eaton ou síndrome Eaton-Lambert, síndrome do homem rígido ou pessoa rígida, encefalomielite tal como encefalomielite alérgica, miastenia gravis, degeneração cerebelar, encefalite de haste cerebral e/ou límbica, neuromiotonia, síndrome de mioclono opsoclono ou opsoclono (OMS), neuropatia sensorial, síndrome de Sheehan, hepatite auto-imune, hepatite crônica, hepatite lupóide, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica auto-imune, pneumonite intersticial linfóide, bronquiolite obliterante (sem- transplante) contra NSIP, Síndrome de Guillain-Barré, Doença de Berger (nefropatia por IgA), cirrose biliar primária, psilose celíaca (enteropatia de glúten), psilose refratária, dermatite herpetiforme, crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrófica (ALS; doença de Lou Gehrig), doença de artéria coronária, doença de ouvido interno auto-imune (AIED), ou perda de audição auto-imune, síndrome de mioclono opsoclono (OMS), policondrite tal como policondrite refratária, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, hepatite de célula gigante, esclerite, uma linfocitose não cancerosa, uma linfocitose primária, que indue linfocitose de célula B monoclonal (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significância indeterminada, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplásica, canalopatias tais como epilepsia, migraina, arritmia, disfunções musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e canalopatia do CNS, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose segmentai focal (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveoretinite, disfunção hepatológica auto-imune, fibromialgia, falha endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças demielinizantes, síndrome de Dressier, alopecia areata, síndrome CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismobilite esofágica, esclerodactilia, e telangiectasia), infertilidade auto-imune masculina e feminina, espondilite anquilosante, doença do tecido conjuntivo misto, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão de criador de pássaro, síndrome de Alport, alveolite tal como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença de pulmão intersticial, reação de transfusão, leprose, malaria, leishmaniose, quipanossomiose, esquistossomose, ascaridíase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose endomiocardial, endoftalmite, eritema elevado e reduzido, eritoblastose fetal, faciite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariase, ciclite tal como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, ou ciclite de Fuchs, púrpura Henoch-Schonlein, infecção por vírus de imunodeficiência humana (HIV), infecção por ecovírus, cardiomiopatia, doença de Alzheimer, infecção por parvovirus, infecção por vírus de rubéola, síndrome pós-vacinação, infecção de rubéola congênita, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, Falha gonadal auto-imune, coréia de Sydenham, nefrite pós-streptococal, tromboangite obliterante, tirotoxicose, tabes dorsalis, e polimialgia de célula gigante.

[0198] A “superfamília de receptor de fator de necrose tumoral” ou “superfamília de receptor TNF” no presente pedido refere-se a receptores polipeptídicos ligados por citocinas na família TNF. Geralmente, estes receptores são receptores de transmembrana Tipo I com uma ou mais sequências ricas em cisteína nos seus domínios extracelulares. A superfamília de receptor TNF pode, além disso, ser subdividida em (1) receptores da morte; (2) receptores isca, e (3) receptores de sinalização que são desprovidos de domínio da morte. Os “receptores da morte” contêm em suas regiões citoplasmáticas ou intracelulares um “domínio da morte”, isto é, uma região ou sequência que age para transduzir sinais na célula o qual pode resultar em apoptose ou em indução de certos genes. Os “receptores iscas” são desprovidos de um domínio da morte funcional e são incapazes de transduzir sinais que resultam em apoptose. Exemplos de citocinas na família do gene TNF incluem fator alfa de necrose tumoral (TNF- alfa), fator beta de necrose tumoral (TNF-beta ou linfotoxina), ligante CD30, ligante CD27, ligante CD40, ligante OX-40, ligante 4-1 BB, ligante Apo-1 (também referido como ligante Fas ou ligante CD95), ligante Apo-2 (também referido como TRAIL), ligante Apo-3 (também referido como TWEAK), osteoprotegerina (OPG), APRIL, ligante RANK, (também referido como ligante TRANCE), e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK). Exemplos de receptores na superfamília do receptor TNF incluem: Receptor do Fator de Necrose Tumoral tipo 1 (TNFR1), Receptor do Fator de Necrose Tumoral tipo 2 (TNFR2), Receptor do Fator de Crescimento de Nervos p75 (NGFR), o antígeno CD40 de superfície de célula B, o antígeno OX-40 de célula T, receptor Apo-1 (também chamado Fas ou CD95), receptor Apo-3 (também chamado DR3, swl-1, TRAMP e LARD), o receptor chamado “Ativador de Transmembrana e CAML-Interactor” ou “TACI”, proteína BCMA, DR4, DR5 (alternativamente referido como Apo-2; TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPOδ, TRICK2 ou KILLER), DR6, DcR1 (também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3), DcR2 (também chamado TRAIL-R4 ou TRUNDD), OPG, DcR3 (também chamado TR6 ou M68), CAR1, HVEM (também chamado ATAR ou TR2), GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, CD30, receptor linfotoxina beta (LTBr), receptor 4-1 BB e TR9 (EP988, 371A1).

[0199] Os termos "ligante Apo-2", "Apo-2L", “Apo2L”, “ligante Apo- 2/TRAIL” e “TRAIL” são usados no presente pedido intercambiavelmente para referir-se a uma sequência de polipeptídeo que inclui resíduos de aminoácidos 114-281, incluido, 95-281, incluido, resíduos 92-281, incluido, resíduos 91-281, incluido, resíduos 41-281, incluido, resíduos 39-281, incluido, resíduos 15-281, incluido, ou resíduos 1-281, incluido, da sequência de aminoácido mostrado na Fig. 24 (SEQ ID No. 46), assim como fragmentos ativos biologicamente, variantes delecionais, insercionais, ou substitucionais das sequências acima. Em uma realização, a sequência de polipeptídeo compreende resíduos 114-281 da Fig. 24 (SEQ ID No. 46). Opcionalmente, a sequência de polipeptídeo compreende resíduos 92-281 ou resíduos 91-281 da Fig. 24 (SEQ ID No. 46). Os polipeptídeos Apo-2L, podem ser codificados pela sequência de nucleotídeo nativa mostrada na Fig. 24 (SEQ ID No. 45). Opcionalmente, o códon que codifica resíduo Pro119 (Fig. 24; SEQ ID No. 45) pode ser “CCT” ou “CCG”. Opcionalmente, os fragmentos ou variantes são biologicamente ativos e têm pelo menos cerca de 80% de sequência idêntica de aminoácido, ou pelo menos cerca de 90% de sequência idêntica, ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de sequência idêntica com qualquer uma das sequências acima. A definição engloba variantes substitucionais de ligante Apo-2 em que pelo menos um destes aminoácidos nativos são substituídos por outro aminoácido tal como um resíduo alanina. A definição também engloba um ligante Apo-2 de sequência nativa isolado de uma fonte de ligante Apo-2 ou preparado por métodos recombinantes e/ou sintéticos. O ligante Apo-2 da invenção inclui os polipeptídeos referidos como ligante Apo-2 ou TRAIL divulgados no documento WO 97/01633 publicado em 16 de janeiro de 1997, documento WO 97/25428 publicado em 17 de julho de 1997, documento WO 99/36535 publicado em 22 de julho de 1999, documento WO 01/00832 publicado em 4 de janeiro de 2001, documento WO 02/09755 publicado em 7 de fevereiro 2002, documento WO 00/75191 publicado em 14 de dezembro de 2000, e patente US 6.030.945 emitida em 29 de fevereiro de 2000. Os termos são usados para geralmente se referir às formas do ligante Apo-2 que incluem monômero, dímero, trímero, hexamêro ou formas oligoméricas mais altas do polipeptídeo. Toda numeração de resíduos de aminoácido referida na sequência Apo-2L usa a numeração de acordo com Fig. 24 (SEQ ID No. 46), a menos que especificamente declarado de outra forma.

[0200] “Receptor do ligante Apo-2” inclui os receptores referidos na técnica como “DR4” e “DR5”. Pan et al. descreveram o membro da família de receptor TNF referido como "DR4"(Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); ver também documento WO 98/32856 publicado em 30 de julho de 1998; documento WO 99/37684 publicado em 29 de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 7 de dezembro de 2000; patente US 6.433.147 emitida em 13 de agosto de 2002; patente US 6.461.823 emitida em 8 de outubro de 2002, e patente US 6.342.383 emitida em 29 de janeiro de 2002). Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) e Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) descreveram outro receptor para Apo2L/TRAIL (ver também, documento WO 98/51793 publicado em 19 de novembro de 1998; documento WO 98/41629 publicado em 24 de setembro de 1998). Este receptor é referido como DR5 (o receptor também foi alternativamente referido como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPOδ, TRICK2 ou KILLER; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics,17:141-143 (1997); documento WO 98/35986 publicado em 20 de agosto de 1998; patente EP 870.827 publicada em 14 de outubro de 1998; documento WO 98/46643 publicado em 22 de outubro de 1998; documento WO 99/02653 publicado em 21 de janeiro de 1999; documento WO 99/09165 publicado em 25 de fevereiro de 1999; documento WO 99/11791 publicado em 11 de março de 1999; patente US 2002/0072091 publicada em 13 de agosto de 2002; patente US 2002/0098550 publicada em 7 de dezembro de 2001; patente US 6.313.269 emitida em 6 de dezembro de 2001; patente US 2001/0010924 publicada em 2 de agosto de 2001; patente US 2003/01255540 publicada em 3 de julho de 2003; patente US 2002/0160446 publicada em 31 de outubro de 2002, patente US 2002/0048785 publicada em 25 de abril de 2002; patente US 6.569.642 emitida em 27 de maio de 2003, patente US 6.072.047 emitida em 6 de junho de 2000, patente US 6.642.358 emitida em 4 de novembro de 2003). Como descrito acima, outros receptores para Apo-2L incluem DcR1, DcR2, e OPG. O termo "receptor Apo-2L" quando usado no presente pedido engloba receptor de sequência nativa e receptores variantes. Estes termos englobam receptor Apo-2L expressado em uma variedade de mamíferos, incluindo humanos. Receptor Apo-2L pode ser expressado de mameira endógena como ocorre naturalmente em uma variedade de linhagens de tecidos humanos, ou pode ser expressado por métodos recombinantes ou sintéticos. Um "receptor Apo-2L de sequência nativa" compreende um polipeptídeo que tem a mesma sequência de aminoácido de um receptor Apo-2L derivado da natureza. Dessa forma, um receptor Apo-2L de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácido de um receptor Apo-2L de ocorrência natural de qualquer mamífero, incluindo humanos. Tal receptor Apo-2L de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "receptor Apo-2L de sequência nativa"especificamente engloba formas de ocorrência natural secretadas ou retiradas do receptor (por exemplo, uma forma solúvel que contém, por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, alternativamente formas ligadas) e variantes alélicas de ocorrência natural. Receptores variantes podem incluir fragmentos ou mutantes de deleção da sequência nativa do receptor Apo- 2L. Figs. 25A-C mostram a sequência de aminoácido 411 do receptor DR5 humano, junto com sua sequência de nucleotídeo (SEQ ID Nos. 47 e 48) como publicado no documento WO 98/51793 em 19 de novembro de 1998. Uma variante ligada por transcrição do receptor DR5 humano é conhecida na técnica. Esta variante ligada codifica a sequência de aminoácido 440 do receptor DR5 humano como mostrado nas Figs. 26A-C, junto com sua sequência de nucleotídeo (SEQ ID Nos. 49 e 50), e como publicado no documento WO 98/35986 em 20 de agosto de 1998.

[0201] “Anticorpo receptor da morte” é usado no presente pedido para geralmente referir-se ao anticorpo ou anticorpos direcionados a um receptor na superfamília do receptor do fator de necrose tumoral e que contém um domínio da morte capaz de sinalizar apoptose, e tais anticorpos incluem anticorpo DR5 e anticorpo DR4.

[0202] “Anticorpo receptor DR5”, “anticorpo DR5”, ou “anticorpo anti- DR5” é usado em um amplo senso para referir-se aos anticorpos que se ligam a pelo menos uma forma de um receptor DR5 ou domínio extracelular destes. Opcionalmente o anticorpo DR5 é fundido ou ligado a uma sequência ou molécula heteróloga. Preferivelmente a sequência heteróloga permite ou ajuda o anticorpo a formar complexos de ordem mais alta ou oligomérica. Opcionalmente, o anticorpo DR5 liga-se ao receptor DR5, mas não se liga ou interage com qualquer receptor Apo-2L adicional (por exemplo, DR4, DcR1, ou DcR2). Opcionalmente o anticorpo é um agonista da atividade de sinalização de DR5.

[0203] Opcionalmente, o anticorpo DR5 da invenção liga-se a um receptor DR5 na faixa de concentração de aproximadamente 0,1 nM para cerca de 20 mM como medida em um ensaio de ligação BIAcore. Opcionalmente, os anticorpos DR5 da invenção exibem um valor IC50 de aproximadamente 0,6 nM para cerca de 18 mM como medido em um ensaio de ligação BIAcore.

[0204] Puramente para os propósitos no presente pedido, o termo “Apomab” refere-se a um anticorpo agonista que se liga ao DR5 e compreende sequências de aminoácido de variáveis pesada e variáveis leve da SEQ ID Nos. 55 e 56. Preferivelmente Apomab compreende as cadeias pesada e leve da SEQ ID Nos. 51 e 52, respectivamente.

II. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[0205] Técnicas para produção de anticorpos que podem ser formuladas de acordo com a presente invenção seguem.

(i) SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DE ANTÍGENO

[0206] Preferivelmente, o antígeno ao qual o anticorpo se liga é uma glicoproteína importante biologicamente e a administração do anticorpo para um mamífero que sofre de uma doença ou disfunção pode resultar em um benefício terapêutico naquele mamífero. No entanto, estão também contemplados anticorpos direcionados contra antígenos não polipeptídicos (tal como antígenos glicolipídicos associados com tumor; ver patente US 5.091.178).

[0207] Onde o antígeno é um polipeptídeo, pode ser uma molécula de transmembrana (por exemplo, receptor) ou ligante tal como um fator de crescimento. Antígenos exemplares incluem moléculas tais como renina; um hormônio de crescimento, incluindo hormônio de crescimento humano e hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; hormônio da paratireóide; hormônio estimulante da tireoide; lipoproteínas; alfa- 1 -antitripsina; insulina de cadeia A; insulina de cadeia B; pró-insulina; hormônio estimulante folicular; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores de coagulação tais como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido (TF), e fator von Willebrands; fatores anti-coagulante tal como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; um ativador plasminogênico, tal comoo uroquinase ou urina humana ou ativador plasminogênico tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoiético; fator -alfa e -beta de necrose tumoral; encefalinase; RANTES (regulado na ativação normalmente expressada e secretada de célula T); proteína (MIP-1-alpha) inflamatória de macrófago humano; um soro de albumina tal como soro de albumina humano; substância de inibição Muellerian; relaxina de cadeia A; relaxina de cadeia B; prorelaxina; peptídeo associado com gonadotrofina de camundongo; uma proteína microbial, tal como beta-lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado ao linfócito T citotóxico (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatóides; um fator neurotrófico tal como fator neurotrófico derivado ósseo (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT- 4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo tal como NGF-b; fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidermal (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-b4, ou TGF-b5; um fator de necrose tumoral (TNF) tais como TNF-alfa ou TNF-beta; fator de crescimento -I e -II similar a insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-l (IGF-I cerebral), proteínas de ligação do fator de crescimento similar a insulina; proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 e CD40; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon tais como interferon - alfa, -beta, e -gama; fatores de estimulação de colônia (CSFs), por exemplo, M- CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-10; dismutase superóxida; receptores de célula T; proteínas de surperfície de membrana; fator de aceleração de deterioração; antígeno virai tais como, por exemplo, uma porção do envelope AIDS; proteínas de transporte; receptores residentes; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tais como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antígeno associado a tumor tais como receptores HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer dos polpeptídeos listados acima.

[0208] Alvos moleculares exemplares para anticorpos englobados pela presente invenção incluem proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34 e CD40; membros da família de receptores ErbB tal como o receptor EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; antígenos de superfície de célula B, tal como CD20 ou BR3; um membro da superfamília do receptor de necrose tumoral, incluindo DR5; antígeno de célula tronco de próstata (PSCA); moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Mad, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina alfa4/beta7, e integrina alfav/beta3 incluindo uma subunidade alfa ou beta desta (por exemplo, anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento tal como VEGF assim como receptores destes; fator de tecido (TF); um fator de necrose tumoral (TNF) tal como TNF-alda ou TNF-beta, alfa interferon (alfa-IFN); uma interleucina, tal como IL-8; IgE; antígenos do grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3 ; receptor de obesidade(OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C etc.

[0209] Antígenos solúveis ou fragmentos destes, opcionalmente conjugados com outras moléculas podem ser usados como imunógenos para geração de anticorpos. Para moléculas de transmembrana, tais como receptores, fragmentos destes (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser usados como o imunógeno. Alternativamente, células que expressam a molécula de transmembrana podem ser usadas como o imunógeno. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagem celular de câncer) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula de transmembrana. Outros antígenos e formas destes úteis para a preparação de anticorpos serão aparentes para aqueles técnicos no assunto.

[0210] Para a produção de anticorpos HER2, o antígeno HER2 a ser usado para a produção deste pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular do HER2 ou uma porção deste, que contém o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam HER2 nas suas superfícies celulares (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para superexpressar HER2, ou uma linhagem celular de carcinoma tal como células SK-BR-3, ver Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691 -8695 (1991)); pode ser usada para gerar anticorpos.

(ii) ANTICORPOS MONOCLONAIS

[0211] Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam-se ao mesmo epitopo, exceto por possíveis variantes que podem aparecer durante a produção do anticorpo monoclonal. Dessa forma, o modificador "monoclonal"indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos.

[0212] Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser fabricados utilizando-se o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature256: 495 (1975) ou podem ser fabricados por meio de métodos de DNA recombinante (Patente US 4.816.567).

[0213] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado na forma descrita acima para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão ligar-se especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.Linfócitos são então fundidos com uma linhagem de células de mieloma, utilizando-se um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,págs. 59- 103 (Academic Press, 1986)).

[0214] As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultura apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não contêm a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selecionado para os hibridomas irá incluir tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

[0215] Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Entre estas, linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e SP-2 ou células X63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Americana de Tipos de Cultivo, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol.,133: 3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987)).

[0216] O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro,tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA).

[0217] A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada por meio da análise Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220(1980).

[0218] Após células de hibridoma serem identificadas para produção de anticorpos de especificidade desejada, afinidade e/ou atividade, os clones podem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição e cultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meio de cultura adequado para este propósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ou RPM 1-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.

[0219] Os anticorpos monoclonais separados por subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por meio de procedimentos de purificação de anticorpo convencional, tais como, por exemplo, cromatografia de afinidade, por exemplo, Sefarose de proteína A, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálises, ou cromatografia por afinidade.

[0220] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ligar-se especificamente aos genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida em células hospedeiras tais como células de E. coli, células de COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína do anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo incluem Skerra et al., Cure Opinion in Immunol.,5:256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

[0221] Em uma realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty etal., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) por meio de mistura de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia para a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res.,21:2265-2266 (1993)). Desta forma, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.

[0222] O DNA pode ser também modificado, por exemplo, pela substituição do código das sequências para domínios constantes de cadeia pesada e cadeia leve humanas no lugar das sequências de murino homólogas (patente US 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ou por ligação covalente para a seqüência que codifica a imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não- imunoglobulina.

[0223] Tipicamente tais polipeptídeos de não-imunoglobulina são substituídos pelo domínio constante de um anticorpo, ou eles são substituídos pelo domínio variável de um sítio de combinação de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antígeno que tem especificidade para um antígeno e um outro sítio de combinação de antígeno que tem especificidade para um antígeno diferente.

(ui) ANTICORPOS HUMANIZADOS

[0224] Métodos para humanização de anticorpos não humanos foram descritos na técnica. Preferivelmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", que são são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature,321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,332:323- 327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), pela substituição de sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente US 4.816.567) em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[0225] A escolha de domínios variáveis humano, ambos leve e pesado, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade. De acordo com o método também conhecido como "melhor ajuste", a sequência de domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em relação à completa biblioteca das sequências de domínio variável humana conhecida. A sequência humana V que é a mais próxima da do roedor é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol.,151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região de estrutura específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623(1993)).

[0226] É, além disto, importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais que usam modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tri-dimensional são comumente disponíveis e são familiares para aqueles técnicos no assunto. Programas de computador estão disponíveis os quais ilustram e exibem possíveis estruturas conform acionais tridimensionais das sequências de imunoglobulina candidata selecionada. Inspeção destas exibições permite análise do papel provável no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata ligar-se ao seu antígeno. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados das sequências do receptor e importada de forma que a característica do anticorpo desejada, tal como aumento de afinidade para o antígeno(s) alvo, é atingida. Em geral, resíduos de região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação do antígeno.

[0227] Documento WO 01/00245 descreve produção de anticorpos HER2 humanizados exemplares que se ligam ao HER2 e bloqueiam ativação do ligante de um receptor HER. O anticorpo humanizado de interesse particular no presente pedido bloqueia EGF, TGF-a e/ou ativação de MAPK mediada por HRG essencialmente como efetivamente como um anticorpo 2C4 monoclonal murino (ou um fragmento Fab deste) e/ou liga-se ao HER2 essencialmente como efetivamente como um anticorpo 2C4 monoclonal murino (ou um fragmento Fab deste). O anticorpo humanizado no presente pedido pode, por exemplo, compreender resíduos de região hipervariável não-humana incorporados em um domínio variável pesado humano e pode, além disso, compreender uma substituição na região de estrutura (FR) em uma posição selecionada do grupo que consiste de 69H, 71H e 73H utilizando o sistema de numeração de domínio variável apresentado em Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5aEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende substituições FR em duas ou todas das posições 69H,71He73H.

[0228] Um anticorpo humanizado exemplar de interesse no presente pedido compreende resíduos de região determinada por complementaridade de domínio variável pesado GFTFTDYTMX, onde X é preferivelmente D ou S (SEQ ID No. 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID No. 8); e/ou NLGPSFYFDY (SEQ ID No. 9), opcionalmente compreende modificações de aminoácidos daqueles resíduos CDR, por exemplo onde as modificações essencialmente mantêm ou melhoram afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante de interesse pode ter aproximadamente de uma a cerca de cinco substituições de aminoácido nas sequências CDR variável pesada acima. Tais anticorpos variantes podem ser preparados por maturação de afinidade, por exemplo, como descrito acima. O anticorpo humanizado mais preferido compreende a sequência de aminoácido de domínio variável pesado na (SEQ ID No. 4).

[0229] O anticorpo humanizado pode compreender resíduos determinados por complementaridade de domínio variável leve KASQDVSIGVA (SEQ ID No. 10); SASYXXX, onde o X como posição 5 é preferivelmente R ou L, em que X na posição 6 é preferivelmente Y ou E, e o X como posição 7 é preferivelmente T ou S (SEQ ID No. 11); e/ou QQYYIYPYT (SEQ ID No. 12), por exemplo, além disso, para aqueles resíduos CDR de domínio variável pesado no parágrafo anterior. Tais anticorpos humanizados opcionalmente compreendem modificações de aminoácidos dos resíduos CDR acima, por exemplo, onde as modificações essencialmente mantêm ou melhoram afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante de interesse pode ter aproximadamente de uma a cerca de sete substituições de aminoácido nas sequências CDR variável leve acima. Tais anticorpos variantes podem ser preparados por maturação de afinidade, por exemplo, como descrito acima. O anticorpo humanizado mais preferido compreende a sequência de aminoácido de domínio variável leve na SEQ ID No. 3.

[0230] O presente pedido também contempla afinidade de anticorpos maduros que se ligam a HER2 e bloqueiam ativação do ligante de um receptor HER. O anticorpo parental pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, por exemplo, aquele que compreende as sequências variáveis leve e/ou pesadas da SEQ ID Nos. 3 e 4, respectivamente (isto é, variante 574). Preferivelmente a afinidade do anticorpo maduro que se liga ao receptor HER2 com uma afinidade superior a aquela do murino 2C4 ou variante 574 (por exemplo, de aproximadamente duas ou cerca de quatro dobras, para aproximadamente 100 dobras ou cerca de 1000 dobras de melhoria de afinidade, por exemplo, como avaliado usando-se um domínio extracelular HER2 (ECD) ELISA). Resíduos de CDR de variável pesada exemplares para substituição incluem H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, ou sete destes resíduos). Exemplos de resíduos de CDR de variável leve para alteração incluem L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou até aproximadamente dez destes resíduos).

[0231] Várias formas do anticorpo humanizado ou afinidade de anticorpo maduro estão contempladas. Por exemplo, o anticorpo humanizado ou afinidade de anticorpo maduro pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxico(s) para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou afinidade de anticorpo maduro pode ser um anticorpo de comprimento total, tal como um anticorpo IgG 1 de comprimento total.

(iv) ANTICORPOS HUMANOS

[0232] Como alternativa para a humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene (JH) do sítio de ligação da cadeia pesada do anticorpo em camundongos de linhagem de origem mutante e quimérico resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da linhagem de origem humana do conjunto de gene de imunoglobulina em tal camundongo de linhagem de origem mutante irá resultar na produção de anticorpos humanos mediante desafio com antígenos. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature,362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno.,7:33 (1993); e patentes US 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.

[0233] Alternativamente, tecnologia de exibição por fago (McCafferty et al., Nature348:552-553 (1990)) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitroa partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio V do anticorpo são clonados em quadro tanto em um gene de proteína de revestimento maior como menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita única do genoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Dessa forma, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição por fago pode ser realizada em uma série de formatos; para análise dela, ver, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição por fago. Clackson et al., Nature,352:624- 628 (1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongo imunizado. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados seguindo- se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Moí. Biol. 222:581- 597 (1991), ou Griffith etal., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, também, patentes US 5.565.332 e 5.573.905.

[0234] Como discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro(ver patentes US 5.567.610 e 5.229.275).

[0235] Anticorpos HER2 humanos estão descritos na patente US 5.772.997 emitida em 30 de junho de 1998 e documento WO 97/00271 publicado em 3 de janeiro de 1997.

(v) FRAGMENTOS DE ANTICORPOS

[0236] Foram desenvolvidas várias técnicas de produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos de comprimento total (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab’-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab’)2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo da seleção é um fragmento de Fv de cadeia única (scFv). Ver documento WO 93/16185; patente US 5.571.894; e patente US 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser um “anticorpo linear”, por exemplo, como descrito na patente US 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos do anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

(vi) ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[0237] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se a dois epitopos diferentes da proteína HER2. Outros tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação do HER2 com sítio(s) de ligação para EGFR, HER3 e/ou HER4. Alternativamente, um braço do HER2 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula acionadora em um leucócito como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) assim como focalizar o mecanismo de defesa celular para a célula que expressa HER2. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam HER2. Estes anticorpos possuem um braço de ligação HER2 e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-a, alcalóide da vinca, ricina de cadeia A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab’)2).

[0238] Documento WO 96/16673 descreve um anticorpo HER2/FCYRIII biespecífico e patente US 5.837.234 divulga um anticorpo IDM1 HER2/FCYRI biespecífico (Osidem). Um anticorpo HER2/Fca biespecífico é mostrado no documento WO 98/02463. Patente US 5.821.337 ensina um anticorpo HER2/CD3 biespecífico . MDX-210 é um biespecífico HER2-FCYRIII Ab.

[0239] Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al., Nature,305:537-539 (1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são divulgados no documento WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

[0240] De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpos e antígenos) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. Preferencialmente, a fusão é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção fornecerem os rendimentos ótimos. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão único quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultarem em altos rendimentos ou quando as razões não forem de significância particular.

[0241] Em uma realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para maiores detalhes de geração de anticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh etal., Methods in Enzymology,121:210 (1986).

[0242] De acordo com outra abordagem descrita na Patente US 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser construída para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). “Cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo, pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

[0243] Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou “heteroconjugados”. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado, à avidina e o outro a biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para atingir células do sistema imunológico a células indesejadas (patente US 4.676.980), e para o tratamento de infecções por HIV (documento WO 91/00360, documento WO 92/200373 e patente EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulante conveniente. Os agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e descritos na patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas reticulantes.

[0244] As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando-se ligações químicas. Brennan etal., Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos de comprimento total são proteolicamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol arsenato de sódio para estabilizar ditiol vicinal e prevenir formação de bissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab'-TNB é então reconvertido para o Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado do Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[0245] Recente progresso facilitou a recuperação direta de fragmentos de Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula do anticorpo F(ab')2 biespecífico humanizado em sua totalidade. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E. coli e sujeitado a acoplamento químico direcionado in vitropara formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar células que superexpressam o receptor HER2 e células T humanas normais, assim como acionara atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de seios humano. Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente de cultura celular recombinante também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos utilizando-se zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol.,148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formarem monômeros e então reoxidados para formarem os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de “diacorpos” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear-se com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, através disto, formando dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver Gruber et al., J. Immunol.,152:5368 (1994).

[0246] Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J. Immunol.147: 60 (1991).

(vii) OUTRAS MODIFICAÇÕES DE SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO

[0247] Modificação(ões) de sequência de aminoácido dos anticorpos descritos no presente pedido estão contempladas. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Sequências de amino ácidos variantes do Anticorpo são preparadas por introdução apropriada de trocas de nucleotídeos no ácido nucléico do Anticorpo ou por síntese de pepitídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções na e/ou substituições de, resíduos no interior das sequências do aminoácido do Anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição é feita para chegar à construção final, ficando estabelecido que a construção final possue as características desejadas. As trocas de aminoácido também podem alterar processos pós-translacional do Anticorpo, tal como troca do número ou posição dos sítios de glicosilação.

[0248] Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do Anticorpo que estão em localizações preferidas para mutagênese é chamado “mutagênese de varredura alanina” como descrito por Cunningham e Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação de aminoácidos com antígeno. Aquelas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional para as substituições então são refinadas por introdução, além disto, ou outras variantes no, ou para, os sítios de substituições. Consequentemente, enquanto o sítio para a introdução da variação de sequência de aminoácido é pré-determinada, a natureza da mutação por si mesma não precisa ser pré-determinada. Por exemplo, para analizar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou sítio alvo e o Anticorpo variante expressado são selecionados para a atividade desejada.

[0249] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxil-terminal variando em comprimento de um resíduo para polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, assim como inserções intrasequência de simples ou múltiplos resíduos de aminoácido. Exemplos de inserções terminais incluem um Anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras inserções de variantes da molécula do Anticorpo incluem a fusão para o N- ou C-terminal do Anticorpo para uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do soro do anticorpo.

[0250] Outro tipo de variante é uma variante de substituição do aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do Anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de região FR ou Fc também são contempladas. Substituições conservatives são mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em uma troca na atividade biológica, então mais trocas substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1 ou como, além disto, descritos abaixo na referência para classes de aminoácido, podem ser introduzidos e os produtos selecionados. TABELA 1

[0251] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas por seleções de substituições que diferem significantemente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação folha ou helicoidal (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral. Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, in Biochemistry,segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) não polar: Ala (A), Vai (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polar descarregado: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q) (3) acidico: Asp (D), Glu (E) (4) básico: Lys (K), Arg (R), His(H)

[0252] Alternativamente, resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos baseados em propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) acidico: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[0253] Substituições não conservatives irão conferir troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

[0254] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do Anticorpo também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir interligação anormal. De modo oposto, cisteína(s) ligada(s) pode ser adicionada ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

[0255] Um tipo de variante substitucional particularmente preferida envolve substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a variante(s) resultante(s) selecionada(s) para posterior desenvolvimento terá propriedades biológicas melhoradas relativas ao anticorpo parental do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes substitucionais envolve maturação de afinidade usando-se exibição por fago. Resumidamente, diversos sítios de região hipervariável (por exemplo, sítios 6-7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácido em cada sítio. Os anticorpos variantes dessa forma gerados são exibidos em uma forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões para o gene III produto de M13 empacotado no interior de cada partícula. As variantes de fago exibidas são então selecionadas para suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação) como no presente divulgado. Com o objetivo de identificar candidatos para sítios de região hipervariável para modificações, mutagênese de varredura de alanina pode ser executada para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente para ligação do antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e seu antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituições de acordo com as técnicas elaboradas no presente pedido. Uma vez que tais variantes são geradas, as variantes do painel são sujeitas à seleção como descrito no presente pedido e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para posterior desenvolvimento.

[0256] Outro tipo de aminoácido variante do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Pela alteração é intencionado deletar uma ou mais unidades de carboidratos encontradas no anticorpo, e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.

[0257] Glicosilação de anticorpos é tipicamente tanto em N-ligado quanto em O-ligado. N-ligado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são sequências de reconhecimento para conexão enzimática do componente carboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença de ambas sequências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligado refere-se a conexão de um dos açucares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina podem também ser usadas.

[0258] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada por alteração de sequência de aminoácido tal como aquela que contém um ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligado). A alteração pode também ser feita por adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado).

[0259] Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato conectado a este pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato madura que é desprovida de fucose conectada à uma região Fc do anticorpo estão descritos no pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L. Ver também patente US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Anticorpos com uma N-acetilglucosamina dividida (GlcNAc) no carboidrato conectado a uma região Fc do anticorpo estão referidos no documento WO 03/011878, Jean-Mairet et al. e patente US 6.602.684 Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo galactose no oligossacarídeo conectado a uma região Fc do anticorpo estão relatados no documento WO 97/30087, Patel et al. Ver, também, documento WO 98/58964 (Raju, S.) e documento WO 99/22764 (Raju, S.) que relaciona anticorpos com carboidrato alterado conectado à região Fc deste.Composições de anticorpo que compreendem os principais tipos de anticorpo com tais estruturas de carboidrato conectadas à região Fc estão contempladas no presente pedido.

[0260] Moléculas de ácido nucléico que codificam sequências variantes de aminoácido do Anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de ocorrência natural de sequências de aminoácido variantes) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese de PCR e mutagênese cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo.

(viu) SELEÇÃO DE ANTICORPOS COM AS PROPRIEDADES DESEJADAS

[0261] Técnicas para geração de anticorpos foram descritas acima. Alguém pode, além disso, selecionar anticorpos com certas características biológicas, como desejadas.

[0262] Para identificar um anticorpo que bloqueia ativação ligante para um receptor HER, a habilidade do anticorpo para bloquear ligação do ligante HER às células que expressam o receptor HER (por exemplo, em conjugação com outro receptor HER com o qual o receptor HER de interesse forma um hetero-oligômero HER) pode ser determinada. Por exemplo, células que expressam naturalmente, ou são transfectadas para expressar, receptores HER do hetero-oligômero HER podem ser incubadas com o anticorpo e então expostas ao ligante HER marcado. A habilidade do anticorpo HER2 para bloquear ligação do ligante ao receptor HER no hetero- oligômero HER pode então ser avaliada.

[0263] Por exemplo, a inibição da ligação do HRG à linhagem celular de tumor de mama MCF7 a anticorpos HER2 pode ser executada usando- se culturas MCF7 de monocamadas no gelo em um formato 24 poços por placa format essencialmente como descrito no documento WO 01/00245. Anticorpos monoclonais HER2 podem ser adicionados a cada poço e incubados por 30 minutos. rHRGβl 177-224 (25 pm) marcado 125l pode então ser adicionado, e a incubação pode continuar por 4 a 16 horas. Curvas de resposta de dose podem ser preparadas e um valor ICso pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia ativação ligante de um receptor HER terá um ICso para inibição da ligação HRG às células MCF7 neste ensaio de aproximadamente 50nM ou menos, mais preferivelmente 10nM ou menos. Onde, o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como fragmento Fab, o ICso para inibição da ligação HRG às células MCF7 neste ensaio pode, por exemplo, ser aproximadamente 100nM ou menos, mais preferivelmente 50nM ou menos.

[0264] Alternativamente, ou adicionalmente, a habilidade do anticorpo HER2 bloquear fosforilação tirosina estimulada por ligante HER de um receptor HER presente em um hetero-oligômero HER pode ser avaliada. Por exemplo, células que expressam os receptores HER de maneira endógena ou transfectadas para expressá-los podem ser incubadas com o anticorpo e então analisadas para atividade de fosforilação de tirosina dependente do ligante HER usando-se um anti-fosfotirosina monoclonal (que é opcionalmente conjugado com uma marca detectável). O ensaio de atvação do receptor quinase descrito na patente US 5.766.863 está também disponível para determinar a ativação e bloqueio do receptor HER daquela atividade por um anticorpo.

[0265] Em uma realização, alguém pode selecionar um anticorpo que inibe estimulação HRG de fosforilação tirosina p180 em células MCF7 essencialmente como descrito no documento WO 01/00245. Por exemplo, as células MCF7 podem ser plaqueadas em placas de 24 poços e anticorpos monoclonais para HER2 podem ser adicionados a cada poço e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente; então rHRGβl 177-244 pode ser adicionado a cada poço em uma concentração adicional de 0,2 nM, e a incubação pode continuar por 8 minutos. O meio pode ser aspirado de cada poço, e reações podem ser interrompidas pela adição de 100 pl de tampão amostra SDS (5% de SDS, 25 mM de DTT, e 25 mM de Tris-HCI, pH 6,8). Cada amostra (25 pl) pode passar por eletroforese em um gel de gradiente 4-12% (Novex) e então transferidos por eletroforese para membrana bifluor polivinilidina. Antifosfotirosina (em 1 pg/ml) immunoblots podem ser desenvolvidos, e a intensidade da banda reativa predominante em Mr ~180.000 pode ser quantificada por densiometria de reflexão. O anticorpo selecionado irá preferivelmente inibir significativamente estimulação HRG de fosforilação tirosina p180 em aproximadamente 0-35% do controle neste ensaio. Uma curva de resposta de dose para inibição da estimulação HRG de fosforilação tirosina p180 como determinada por densiometria de reflexão pode ser preparada e um IC50 para o anticorpo de interesse pode ser calculado. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia ativação ligante de um receptor HER terá um ICso para inibição da estimulação HRG de fosforilação tirosina p180 neste ensaio de aproximadamente 50nM ou menos, mais preferivelmente 10nM ou menos. Onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como fragmento Fab, o ICso para inibição da estimulação HRG de fosforilação tirosina p180 neste ensaio pode, por exemplo, ser aproximadamente 100nM ou menos, mais preferivelmente 50nM ou menos.

[0266] Alguém pode também avaliar os efeitos inibitórios de crescimento do anticorpo em células MDA-MB-175, por exemplo, essencialmente como descrito em Schaefer et al. Oncogene15:1385-1394 (1997). De acordo com este ensaio, células MDA-MB-175 podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal HER2 (10 pg/mL) por 4 dias e manchados com cristal de violeta. Incubação com um anticorpo HER2 pode mostrar um efeito inibitório de crescimento nesta linhagem celular similar àquele mostrado pelo anticorpo 2C4 monoclonal. Em uma realização mais adiante, HRG exógeno não irá reverter significativamente esta inibição. Preferivelmente, o anticorpo será capaz de inibir prliferação celular de células MDA-MB-175 para uma maior extensão que o anticorpo 4D5 monoclonal (e opcionalmente para uma maior extensão que o anticorpo 7F3 monoclonal), ambos na presença e ausência de HRG exógeno.

[0267] Em uma realização, o anticorpo HER2 de interesse pode bloquear associação dependente de heregulina do HER2 com HER3 em ambas as células MCF7 e SK-BR-3 como determinado em um experimento de co- imunoprecipitação tal como aquele descrito no documento WO 01/00245 substancialmente mais efetivamente do que o anticorpo 4D5 monoclonal, e preferivelmente substancialmente mais efetivamente do que o anticorpo 7F3 monoclonal.

[0268] Para identificar anticorpos HER2 inibitórios de crescimento, alguém pode selecionar anticorpos que inibem o cresciemnto de células cancerosas que superexpressam HER2. Em uma realização, o anticorpo inibitório de crescimento da escolha é capaz de inibir o crescimento de células SK-BR-3 em cultura celular em aproximadamente 20-100% e preferivelmente cerca de 50-100% em uma concentração de anticorpo de aproximadamente 0.5 a 30 pg/ml. Para identificar tais anticorpos, o ensaio SK-BR-3 descrito na patente U.S. 5.677.171 pode ser executado. De acordo com este ensaio, células SK-BR- 3 são cultivadas em uma mistura 1:1 de um meio F12 e DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina e penicila-streptomicina. As células SK- BR-3 são plaqueadas em 20.000 células em um prato de cultura celular de 35mm (2mls/35mm prato). 0.5 a 30 pg/ml do anticorpo HER2 é adicionado por prato. Após seis dias, o número de células, comparado com células não tratadas são contadas usando-se um contador de células eletrônico COULTER™. Aqueles anticorpos que inibem o crescimento de células SK-BR-3 em aproximadamente 20-100% ou em cerca de 50-100% podem ser selecionados como anticorpos inibitórios de crescimento. Ver patente US 5.677.171 para ensaios de seleção de anticorpos inibitórios de crescimento, tal como 4D5 e 3E8.

[0269] Com o objetivo de selecionar anticorpos HER2 que induzem apoptose, um ensaio de ligação anexina usando-se células BT474 está disponível. As células BT474 são cultivadas e semeadas em pratos como discutido no parágrafo anterior. O meio é então removido e substituído por meio fresco sozinho ou meio contendo 10pg/ml do anticorpo monoclonal. Seguindo três dias do período de incubação, monocamadas são lavadas com PBS e descoladas por tripsinização. As células são então centrifugadas, resuspensas em tampão de ligação Ca2+ e alquotadas em tubos como discutido acima para o ensaio de morte celular. Os tubos então recebem anexina marcada (por exemplo anexina V-FTIC) (1 pg/ml). Amostras podem ser analisadas usando-se um citômetro de fluxo FACSCAN™ e programa CelIQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Aqueles anticorpos que induzem níveis estatisticamente significantes de ligação de anexina relativas ao controle são selecionados como anticorpos que induzem apoptose. Além disso, para o ensaio de ligação de anexina, um ensaio stainingde DNA usando-se células BT474 está disponível. Com o objetivo de executar este ensaio, células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de interesse como descrito nos dois parágrafos anteriores são incubadas com 9pg/ml de HOECHST 33342™ por 2 hr a 37°C, então analisadas em um citômetro de fluxo EPICS ELITE™ (Coulter Corporation) usando-se programa MODFIT LT™ (Verity Software House). Anticorpos que induzem uma mudança na porcentagem de células apoptóticas que é 2 dobras maior (e preferivelmente 3 dobras ou maior) do que células não tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser selecionados como anticorpos pró-apoptóticos usando-se este ensaio. Ver documento WO 98/17797 para ensaios de seleção de anticorpos HER2 que induzem apoptose, tais como 7C2 e 7F3.

[0270] Para selecionar anticorpos que se ligam a um epitopo no HER2 ligado por um anticorpo de interesse, uma rotina de ensaio de interbloqueio tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser executado para avaliar se o anticorpo interbloqueia ligação de um anticorpo, tai como 2C4 ou Pertuzumab, ao HER2. Alternativamente, ou adicionalmente, o mapeamento do epitopo pode ser executado por métodos conhecidos na técnica e/ou alguém pode estudar a estrutura HER2 do anticorpo (Franklin et al. Cancer Cell5:317- 328 (2004)). para ver qual domínio(s) do HER2 é/são ligados pelo anticorpo.

(ix) IMUNOCONJUGAÇÃQ

[0271] A invenção também se refere à imunoconjugação que compreende um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, toxina (por exemplo, uma toxina de molécula pequena ou uma toxina ativa enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas) ou um isótopo radioativo (isto é, uma radioconjugação).

[0272] Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, uma maitansina (patente US 5.208.020), um tricoteno, e CC1065 são também contemplados no presente pedido.

[0273] Em uma realização da invenção, o anticorpo é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 para cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). Maitansina pode, por exemplo, ser convertida para May-SS-Me que pode ser reduzida para May-SH3 e reagida com anticorpo modificado (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um imunoconjugado anticorpo maitansinóide .

[0274] Outra imunoconjugação de interesse compreende um anticorpo HER2 conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir quebra na fita dupla de DNA em concentrações sub-picomolar. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, yi1, «21, as1, N-acetil-yi1, PSAG e θ’i (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Ver, também, patentes US 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586; e 5.773.001, expressamente incorporada no presente pedido pela referência.

[0275] Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não ligantes de toxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteína de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana(PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor carantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Ver, por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.

[0276] A presente invenção, além disto, contempla uma imunoconjugação formada entre um anticorpo e um componente com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou um DNA endonuclease tal como uma deoxirribonuclease; DNase).

[0277] Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos HER2 radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, e isótopos radioativos de Lu.

[0278] Conjugados de anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos utilizando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCL dimetil adipimidato), ativos de ésteres (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutareldeído), compostos de bisazido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bisdiazônio (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), bisocianatos (tal como tolieno 2,6-bisocianato), e compostos de flúor biativos (tal como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrita em Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Carbono- 14-marcado ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeos com o anticorpo. Ver documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari etal. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) pode ser usado.

[0279] Alternativamente, uma fusão de proteína que compreende o anticorpo HER2 e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de pepitídeo.

[0280] Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor"(como estreptavidina) para utilização no tumor pré-direcionado em que a conjugação anticorpo receptor é administrada ao paciente, seguido por remoção de conjugação não ligada da circulação usando-se um agente de limpeza e então administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugada a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

(x) OUTRAS MODIFICAÇÕES DE ANTICORPO

[0281] Outras modificações do anticorpo estão contempladas no presente pedido. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo também pode ser capturado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial, (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), em sistemas de distribuição de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).

[0282] Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com respeito à função efetora, por exemplo, para aumentar citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser alcançado pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode ser introduzido na região Fc, através disso permitindo formação de ponte bissulfeto entre cadeia nesta região. O anticorpo homodimérico dessa forma gerado pode ter melhorado a capacidade de internalização e/ou aumento de morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et a!., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com aumento de atividade anti-tumor podem também ser preparados utilizando-se reticulante heterobifuncional como descrito em Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo que possui regiões Fc dual pode ser engenherado e pode através disso ter aumento de lise de complemento e capacidades de ADCC. Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

[0283] Documento WO 00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com melhora da função ADCC na presença de células efetoras humanas, onde os anticorpos compreendem substituições de aminoácidos na região Fc region deste. Preferivelmente, o anticorpo com ADCC melhorada compreende substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc. Preferivelmente, a região Fc alterada é uma região Fc lgG1 humana que compreende ou que consiste de substituições em uma, duas ou três destas posições.

[0284] Anticorpos com ligação C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) estão descritos no documento WO 99/51642, patente US 6.194.551 B1, patente US 6.242.195B1, patente US 6.528.624B1 e patente US 6.538.124 (Idusogie et al.). Os anticorpos compreendem uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições do aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 da região Fc deste.

[0285] Para aumentar a meia vida do soro do anticorpo, alguém pode incorporar um epitopo de ligação do receptor de resgate no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na patente US 5.739.277, por exemplo. Como usado no presente pedido, o termo " epitopo de ligação do receptor de resgate"refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula IgG (por exemplo, IgGi, lgG2, IgGs, ou lgG4) que é responsável por aumentar in vivo a meia vida do soro da molécula de IgG. Anticorpos com substituições em uma região Fc deste e meia vida do soro aumentada estão também descritos no documento WO 00/42072 (Presta, L).

[0286] Anticorpos engenherados com três ou mais (preferivelmente quatro) sítios de ligação antígeno funcional estão também contemplados (pedido US 2002/0004587 A1, Miller et al.).

[0287] Os anticorpos HER2 divulgados no presente pedido também podem ser formulados como imunolipossomos. Lipossomos que contêm o anticorpo são preparados pelos métodos conhecidos na técnica tal como descrito em Epstein etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); patentes US 4.485.045 e 4.544.545; e documento WO 97/38731 publicado em 23 de outubro de 1997. Lipossomos com tempo de circulação aumentado estão divulgados na patente US 5.013.556.

[0288] Em particular lipossomos úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo que compreende fosfatidicolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Lipossomos são expulsos através de filtros de tamanho de poro definido para render lipossomos com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomos como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reação bissulfeto entre cadeia. Um agente quimioterápico é contido opcionalmente no interior do lipossomo. Ver Gabizon et al. J. National Cancer /nst81 (19)1484 (1989).

(xi) ANTICORPOS EXEMPLARES

[0289] Anticorpos exemplares que podem ser formulados de acordo com a presente invenção incluem, mas não são limitados aos seguintes: Anticorpos anti-ErbB, incluindo anticorpos anti-HER2, tal como aqueles descritos em mais detalhes no presente pedido; Anticorpos que se ligam a um marcador de superfície de célula B, tais como CD19, CD20 (por exemplo Rituximab (RITUXAN®) e 2H7 humanizado ), CD22, CD40 ou BR3; Anticorpos que se ligam ao IgE, incluindo Omalizumab (XOLAIR®) commercialmente disponíveis por meio da Genentech, E26 (Figs. 17A-B no presente), HAE1 (Figs. 17A-B no presente), anticorpo IgE com uma substituição de aminoácido na posição 265 de uma região Fc deste (patente US 2004/0191244 A1), Hu-901 (Figs. 17A-B no presente pedido), um anticorpo IgE como no documento WO 2004/070011, ou um anticorpo (incluindo fragmentos de anticorpo e anticorpos de comprimento total) que compreende domínios variáveis de quaisquer daqueles anticorpos IgE. Ver, também, Presta et al., J. Immunol.151:2623-2632 (1993); Publicação Internacional documento WO 95/19181; patentes US 5.714.338, emitida em 3 de fevereiro de 1998; patente US 5.091.313, emitida em 25 de fevereiro de 1992; documento WO 93/04173 publicado em 4 de março de 1993; documento WO 99/01556 publicado em 14 de janeiro de 1999; e patente US 5.714.338; Anticorpos que se ligam ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou um receptor deste,incluindo Bevacizumab (AVASTIN™), comercialmente disponível por meio da Genentech, e Ranibizumab (LUCENTIS™); Anticorpos anti-IL-8 (St John et al., Chest,103:932 (1993), e Publicação Internacional documento WO 95/23865); Anticorpos anti-PSCA (documento WO 01/40309); Anticorpos anti-CD40, incluindo S2C6 e variantes humanizados deste (documento WO 00/75348); Anticorpos anti-CD11a, incluindo efalizumab (RAPTIVA®) (patente US. 5.622.700, documento WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), e Hourmant et al., Transplantation58:377-380 (1994)); anticorpos anti- CD18 (patente US 5.622.700, emitida em 22 de abril de 1997, ou como no documento WO 97/26912, publicado em 31 de julho de 1997); Anticorpo receptor anti-Apo-2 (documento WO 98/51793 publicado em 19 de novembro de 1998); Anticorpos anti-TNF-alfa incluindo cA2 (REMICADE®), CDP571 e MAK-195 (Ver, patente US 5.672.347 emitida em 30 de setembro de 1997, Lorenz et al. J. Immunol.156(4): 1646-1653 (1996), e Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23(9): 1461-1469 (1995)); Fator anti-tecido (TF) (Patente Européia 0 420 937 B1 concedida em 9 de novembro de 1994; Integrina anti-humana α4β7 (documento WO 98/06248 publicado em 19 de fevereiro de 1998); Anticorpos anti-EGFR, incluindo anticorpo 225 quimérico ou humanizado como no documento WO 96/40210 publicado em 19 de dezembro de 1996; Anticorpos anti-CD3, tal como OKT3 (patente US 4.515.893 emitida em 7 de maio de 1985); Anticorpos anti-CD25 ou anticorpos anti-tac antibodies tais como CHI-621 (SIMULECT®) e (ZENAPAX®) (Ver patente US 5.693.762 emitida em 2 de dezembro de 1997); Anticorpos anti-CD4 tal como o anticorpo cM-7412 (Choy et al. Arthritis Rheum39(1 ):52-56 (1996)); Anticorpos anti-CD52 tal como CAMPATH-1H (Riechmann et al. Nature332:323-337 (1988); Anticorpos receptores anti-Fc tais como o anticorpo M22 direcionado contra FcyRI como em Graziano et al. J. Immunol.155(10):4996- 5002 (1995); Anticorpos anti-antígeno carcino-embrionário (CEA) tal como hMN- 14 (Sharkey et al. Cancer Res.55(23Suppl): 5935s-5945s (1995); Anticorpos dirigidos contra células epiteliais de mama incluindo huBrE-3, hu-Mc 3 e CHL6 (Ceriani et al. Cancer Res.55(23): 5852s-5856s (1995); e Richman et al. Cancer Res.55(23 Supp): 5916s-5920s (1995); Anticorpos que se ligam a células de carcinoma de cólon tal como C242 (Litton etal. Eur J. Immunol.,26(1): 1-9 (1996); Anticorpos anti-CD38, por exemplo, AT 13/5 (Ellis et al. J. Immunol.,155(5):925-937 (1995)); Anticorpos anti-CD33 tal como o anticorpo Hu M195 (Jurcic et al. Cancer Res55(23 Suppl):5908s-5910s (1995) e CMA-676 ou CDP771; Anticorpos anti-CD22 tal como LL2 ou LymphoCide (Juweid et al. Cancer Res55(23 Suppl):5899s-5907s (1995); Anticorpos anti-EpCAM tal como 17-1A (PANOREX®); Anticorpos anti-Gpllb/llla tal como abciximab ou c7E3 Fab (REOPRO®); Anticorpos anti-RSV antibodies tal como MEDI-493 (SYNAGIS®); Anticorpos anti-CMV tal como PROTOVIR®; Anticorpos anti-HIV tal como PRO542; Anticorpos anti-hepatite tal como o anticorpo anti-Hep B OSTAVIR®; Anticorpos anti-CA 125 OvaRex; Anticorpo BEC2 epitopo anti-idiotípico GD3; Anticorpo anti-αvβ3 VITAXIN®; Anticorpo de carcinoma de célula renal anti-humano tal como ch- G250; ING-1; Anticorpo anti-humano 17-1A (3622W94); Anticorpo de tumor coloretal anti-humano (A33); Anticorpo R24 de melanoma anti-humano direcionado contra gangliosídeo GD3; Anti-humano de carcinoma celular escamoso (SF-25);e Anticorpos anti-humano de antígeno de leucócito (HLA) tais como Smart ID10 e o anticorpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1).

(xii) COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO VARIANTE

[0290] A presente invenção, em pelo menos um aspecto, relaciona- se à formulações que compreendem uma composição que compreende uma mistura de um tipo principal de anticorpo e uma ou mais variantes desta. Onde o tipo principal de anticorpo se liga ao HER2, preferivelmente o anticorpo HER2 (tanto ou ambos do tipo principal de anticorpo HER2 e anticorpo variante deste) é aquele que se liga ao Domínio II do HER2, inibe dimerização HER mais efetivamente que Trastuzumab, e/ou se liga a um sítio de ligação heterodimérico do HER2. A realização preferida no presente pedido de um tipo principal de anticorpo HER2 é aquele que compreende variável leve e variável pesada de sequências de aminoácido na SEQ ID Nos. 3 e 4, e mais preferivelmente que compreende uma sequência de aminoácido de cadeia leve selecionada da SEQ ID No. 15 e 23 e uma sequência de aminoácido de cadeia pesada.selecionada da SEQ ID No 16e24.

[0291] Em uma realização, a composição do anticorpo HER2 formulada compreende uma mistura do tipo principal de anticorpo HER2 e um sequência de amonoácido variante desta que compreende uma extensão líder amino-terminal. Preferivelmente, a extensão líder amino-terminal é aquela em uma cadeia leve do anticorpo variante (por exemplo, uma ou duas cadeias leves do anticorpo variante). O tipo principal de anticorpo HER2 ou o anticorpo variante pode ser um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo deste (por exemplo fragmentos Fab de F(ab’)2 ), mas preferivelmente ambos são anticorpos de comprimento total. O anticorpo variante no presente pedido pode compreender uma extensão líder amino-terminal em qualquer uma ou mais das cadeias pesada ou leve deste. Preferivelmente, a extensão líder amino-terminal é aquela em uma ou duas cadeias leves do anticorpo. A extensão líder amino- terminal preferivelmente compreende ou consiste de VHS-. A presença da extensão líder amino-terminal na composição pode ser deletada por várias técnicas analíticas, incluindo mas não limitadas a, análise de sequência amino- terminal, ensaio para heterogenidade de carga (por exemplo, cromatografia de troca catiônica ou eletroforese por capilaridade de zona), espectrômetro de massa, etc. A quantidade do anticorpo variante na composição geralmente varia em uma quantidade que constitui o limite de deleção de qualquer ensaio (preferivelmente análise de sequência N-terminal) usada para deletar a variante em uma quantidade menor que a quantidade do tipo principal de anticorpo. Geralmente, aproximadamente 20% ou menos (por exemplo, aproximadamente 1% para cerca de 155, por exemplo de 5% para cerca de 15%) das moléculas de anticorpo na composição que compreende uma extensão líder amino- terminal. Tais quantidades de porcentagem são preferivelmente determinadas usando-se uma análise de sequência N-terminal quantitativa ou análise de troca catiônica (preferencialmente usando-se uma alta resolução, coluna de troca catiônica fraca, tal como uma coluna de troca catiônica PROPAC WCX-1010™). Com exceção da extensão líder amino-terminal variante, além disto, alterações de sequências de aminoácido do tipo principal de anticorpo e/ou variante estão contempladas, incluindo mas não limitada a um anticorpo que compreende um resíduo lisina C-terminal em uma ou ambas cadeias pesadas deste, um anticorpo deamidado variante, etc.

[0292] Além disso, o tipo principal de anticorpo ou variante pode também, além disto, compreender variações de glicosilação, não limitando exemplos dos que incluem anticorpo HER2 que compreende uma estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2 conectada na região Fc deste, anticorpo HER2 que compreende um componente carboidrato conectado a uma cadeia leve deste (por exemplo um ou dois componentes carboidrato conectados a uma ou duas cadeias leves do anticorpo), anticorpo HER2 que compreende uma cadeia pesada não glicosilada.

(Ill) PREPARAÇÃO DA FORMULAÇÃO

[0293] A presente invenção fornece, em um primeiro aspecto, uma formulação farmacêutica estável que compreende um anticorpo monoclonal, preferivelmente um anticorpo lgG1 humano ou humanizado de comprimento total, em tampão histidina-acetato, pH 5,5 a 6,5, preferivelmente pH 5,8 a 6,2. No entanto, o anticorpo na formulação pode ser um fragmento de anticorpo que compreende um sítio de ligação de antígeno, tal como um fragmento Fab ou F(ab’)2.

[0294] Em outra realização, a invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende, ou que consiste essencialmente de, um anticorpo lgG1 de comprimento total suscetível à deamidação ou agregação em uma quantidade de aproximadamente 10mg/ml para cerca de 250 mg/ml; tampão histidina-acetato, pH 5,5 a 6,5; sacarídeo selecionado do grupo que consiste de trealose e sacarose, em uma quantidade de aproximadamente 60mM para cerca de 250mM; e polisorbato 20 em uma quantidade de aproximadamente 0,01% para cerca de 0,1%.

[0295] Em ainda uma outra realização adicional, a invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo que se liga ao domínio II do HER2 em um tampão histidina em um pH de cerca de 5,5 para cerca de 6,5, um sacarídeo e um tensoativo. Por exemplo, a formulação pode compreender Pertuzumab em uma quantidade de aproximadamente 20mg/ml para cerca de 40mg/ml, tampão histidina-acetato, sacarose, e polisorbato 20, em que o pH da formulação é de aproximadamente 5,5 para cerca de 6,5.

[0296] Em outro aspecto, a invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo DR5 em um tampão histidina em um pH de aproximadamente 5,5 para cerca de 6,5, um sacarídeo e um tensoativo. Tal formulação pode, por exemplo, compreender, Apomab em uma quantidade de aproximadamente 10mg/ml para cerca de 30mg/ml, tampão histidina-acetato, trealose, e polisorbato 20, em que o pH da formulação é de aproximadamente 5,5 para cerca de 6,5.

[0297] A formulação é especialmente útil para anticorpos que são suscetíveis a deamidação e/ou agregação e/ou fragmentação, na qual o tampão retarda deamidação e/ou agregação do anticorpo formulado nesta. Além disso, diferente de outros tampões histidina preparados usando-se HCL, o tampão histidina-acetato é desprovido de íon cloreto que foi constatado como sendo benéfico no presente pedido, com isso este tampão quando combinado com sacarídeo teve o mesmo efeito protetor no anticorpo como polisorbato 20, e foi estável e compatível com armazenamento em tanques de aço inoxidável. Dessa forma, além disso, a formulação propriamente dita que compreende o anticorpo suscetível a deamidação, agregação e/ou fragmentação, a invenção fornece um método para reduzir deamidação, agregação e/ou fragmentação de um anticorpo monoclonal terapêutico (por exemplo, relativo à composição em um pH diferente ou em um tampão diferente), que compreende formular o anticorpo em um tampão histidina-acetato, pH 5,5 a 6,5. Nesta realização, alguém pode determinar ou medir deamidação, agregação e/ou fragmentação antes e depois do anticorpo ser formulado, com o anticorpo formulado demonstrando deamidação aceitável, agregação e/ou fragmentação na formulação e sob armazenamento deste.

[0298] O anticorpo na formulação pode ligar-se a um antígeno incluindo mas não limitado a: HER2, CD20, IgE, DR5, BR3 e VEGF.

[0299] Onde o anticorpo formulado liga-se ao HER2, é preferivelmente aquele que se liga ao Domínio II do HER2, inibe dimerização do HER mais efetivamente que Trastuzumab, e/ou se liga a um sítio de ligação heterodimérico do HER2. A realização preferida no presente pedido de um anticorpo HER2 é aquele que compreende a variável leve e variável pesada de sequências de aminoácido nas SEQ ID Nos. 3 e 4, e mais preferivelmente que compreende as sequências de aminoácido de cadeia leve e cadeia pesada na SEQ ID Nos. 15 e 16 (Pertuzumab).

[0300] Exemplos de anticorpos CD20 que podem ser formulados no presente pedido incluem: “C2B8" que é agora chamado “Rituximab” (“RITUXAN®”) comercialmente disponível por meio da Genentech (ver também patente US 5.736.137, expressamente incorporada no presente pedido pela referência); o anticorpo murino 2B8 marcado com ítrio-[90] designado “Y2B8” ou “Ibritumomab Tiuxetan” ZEVALIN® comercialmente disponível por meio da Biogen-ldec (ver também patente US 5.736.137, expressamente incorporada no presente pedido pela referência); lgG2a “B1"murino, também chamado “Tositumomab,” opcionalmente marcado com 131l para gerar o anticorpo “1311- B1" (tositumomab iodo 1131, BEXXAR™) (patente US 5.595.721, expressamente incorporada no presente pedido pela referência); anticorpo “1F5"monoclonal murino (Press et al. Blood69(2):584-591 (1987) e variantes deste incluindo “estrutura remendada” ou 1F5 humanizado (documento WO 03/002607, Leung, S.); depósito ATCC HB-96450); anticorpo 2H7 murino e 2H7 quimérico (Clark et al. PNAS 82: 1766-1770 (1985); patente US 5.500.362, expressamente incorporada no presente pedido pela referência); 2H7 humanizado; huMax-CD20 (documento WO 04/035607, Genmab, Denmark); AME-133 (Applied Molecular Evolution); anticorpo A20 ou variantes deste tais como anticorpo A20 quimérico ou humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (patente US 2003/0219433, Immunomedics); e anticorpos L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ou NU-B2 monoclonais disponíveis por meio da International Leukocyte Typing Workshop (Valentine etal., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., pág. 440, Oxford University Press (1987)).

[0301] Em realizações preferidas de um anticorpo CD20 formulado, o anticorpo CD20 é um anticorpo 2H7 humanizado. Anticorpos 2H7 humanizados preferidos no presente pedido são 2H7v16 e 2H7v511. O 2H7v16 humanizado pode ser um anticorpo intacto ou fragmento de anticorpo que compreende a variável leve e variável pesada das sequências nas Figs. 18A-B (SEQ ID Nos. 26 e 29). Onde o anticorpo 2H7v16 humanizado é um anticorpo de comprimento total, preferivelmente este compreende as sequências de aminoácido de cadeia leve e pesada com SEQ ID Nos. 63 e 65.

[0302] Onde o anticorpo se liga a VEGF, este preferivelmente compreende as sequências de domínio variável como descrito na Fig. 19. O anticorpo anti-VEGF mais preferido é o anticorpo lgG1 humanizado de comprimento total, Bevacizumab (AVASTIN™), comercialmente disponível por meio da Genentech.

[0303] Onde o anticorpo formulado se liga a IgE, este é preferivelmente selecionado do grupo que consiste de: E25, Omalizumab (XOLAIR®) comercialmente disponível por meio da Genentech (ver também Figs. 17A-B), E26 (Figs. 17A-B no presente pedido), HAE1 (Figs. 17A-B no presente pedido), anticorpo IgE com uma substituição de aminoácido na posição 265 de uma região Fc deste (patente US 2004/0191244 A1), Hu-901 (Figs. 17A-B no presente pedido), um anticorpo IgE como no documento WO 2004/070011, ou um anticorpo (incluindo fragmentos de anticorpo e anticorpos de comprimento total) que compreende domínios variáveis de quaisquer daqueles anticorpos IgE.

[0304] Onde o anticorpo se liga a um receptor na superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) ou a um receptor da morte, este preferivelmente se liga ao DR5, e preferivelmente é um anticorpo agonista. Publicações nesta área incluem Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan etal., Science, 277:815-818 (1997), documento WO 98/51793 publicado em 19 de novembro de 1998; documento WO 98/41629 publicado em 24 de setembro de 1998; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu etal., Nature Genetics,17:141-143 (1997); documento WO 98/35986 publicado em 20 de agosto de 1998; patente EP 870.827 publicada em 14 de outubro de 1998; documento WO 98/46643 publicado em 22 de outubro de 1998; documento WO 99/02653 publicado em 21 de janeiro de 1999; documento WO 99/09165 publicado em 25 de fevereiro de 1999; documento WO 99/11791 publicado em 11 de março de 1999; patente US 2002/0072091 publicada em 13 de agosto de 2002; patente US 2002/0098550 publicada em 7 de dezembro de 2001; patente US 6.313.269 emitida em 6 de dezembro de 2001; patente US 2001/0010924 publicada em 2 de agosto de 2001; patente US 2003/01255540 publicada em 3 de julho de 2003; patente US 2002/0160446 publicada em 31 de outubro de 2002, patente US 2002/0048785 publicada em 25 de abril de 2002; patente US 6.342.369 emitida em fevereiro de 2002, patente US 6.569.642 emitida em 27 de maio de 2003, patente US 6.072.047 emitida em 6 de junho de 2000, patente US 6.642.358 emitida em 4 de novembro de 2003; patente US 6.743.625 emitida em 1 de junho de 2004). O anticorpo DR5 mais preferido é Apomab.

[0305] Cada uma das formulações notadas acima compreendem um tampão, preferivelmente um tampão histidina, e mais preferivelmente um tampão histidina-acetato com um pH de 5,5 a 6,5, preferivelmente 5,8 a 6,2, por exemplo, aproximadamente 6,0. A concentração do tampão é ditada, pelo menos em parte, pelo pH desejado. Concentrações exemplares para o tampão estão na faixa de aproximadamente 1 mM a cerca de 200 mM, preferivelmente de aproximadamente 10 mM a cerca de 40 mM, mais preferivelmente de aproximadamente 20 mM.

[0306] A concentração de anticorpo na formulação está preferivelmente na faixa de aproximadamente 10 mg/mL a cerca de 250 mg/mL. A concentração de anticorpo pode ser determinada baseada na intenção de uso e modo de administração da formulação. Por exemplo, onde a formulação é para administração IV (por exemplo, um anticorpo HER2), a concentração de anticorpo na formulação é preferivelmente de aproximadamente 20 mg/mL a cerca de 40 mg/mL. Na formulação de Pertuzumab exemplificada cuja intenção é para administração intravenosa (IV), a concentração de anticorpo foi de aproximadamente 20 mg/mL a cerca de 40 mg/mL, mais preferivelmente cerca de 30 mg/mL.

[0307] Onde o anticorpo é para administração SQ ou IM (por exemplo, para um anticorpo anti-lgE) concentrações mais altas do anticorpo podem ser desejadas. Tais concentrações de anticorpo substancialmente altas podem ser de aproximadamente 50 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, ou de aproximadamente 80 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, ou de aproximadamente 100 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

[0308] Onde a formulação compreende um anticorpo DR5, tal como Apomab, concentrações de anticorpo exemplar são de aproximadamente 10 mg/mL a cerca de 30 mg/mL, por exemplo, aproximadamente 20 mg/mL de anticorpo DR5; sendo tal formulação útil para administração intravenosa.

[0309] A formulação para administração é preferivelmente uma formulação aquosa (não liofilizada) e não foi sujeitada a liofilização anterior. Enquanto a formulação puder ser liofilizada, preferivelmente não é. No entanto, congelamento das formulações aquosas, sem secagem simultânea que ocorre durante o congelamento a vácuo, está especificamente contemplada no presente pedido, facilitando armazenamento deste por um longo período, por exemplo, em um tanque de aço inoxidável.

[0310] A formulação preferivelmente, além disso, compreende um sacarídeo, mais preferivelmente um dissacarídeo, tal como trihalose ou sacarose. O sacarídeo é geralmente incluído em uma quantidade que reduz formação de agregados solúveis, tal como aquela que ocorre sob congelamento/descongelamento. Concentrações de sacarídeo exemplar estão na faixa de aproximadamente 10 mM para cerca de 1 M, por exemplo, de aproximadamente 60 mM para cerca de 250 mM, e mais preferivelmente de aproximadamente 120 mM para uma formulação do anticorpo HER2, e aproximadamente 240 mM para uma formulação do anticorpo DR5.

[0311] Enquanto foi constatado no presente pedido que uma formulação que compreende tampão histidina-acetato e sacarídeo era estável, a formulação opcionalmente, além disso, compreende tensoativo, tal como polisorbato, mais preferivelmente polisorbato 20. O tensoativo é geralmente incluído em uma quantidade que reduz formação de agregado insolúvel (tal como aquela que ocorre sob agitação ou remessa). A concentração de tensoativo é preferivelmente de aproximadamente 0,0001% para cerca de 1,0%, mais preferivelmente de aproximadamente 0,01% para cerca de 0,1%, por exemplo, aproximadamente 0,02%.

[0312] Opcionalmente, a formulação não contém uma quantidade tonificante de um sal tal como cloreto de sódio.

[0313] A formulação é geralmente estéril, e isto pode ser alcançado de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica para a pessoa técnica no assunto para gerar formulações farmaceuticamente estéreis para administração em sujeitos humanos, incluindo filtração em membrana estéril, anterior a, ou seguindo preparação da formulação.

[0314] Além disso, a formulação é de forma desejável aquela que demonstrou ser estável sob armazenamento. Vários ensaios de estabilidade estão disponíveis para o médico técnico para confirmar a estabilidade da formulação. Além disso, a formulação pode ser aquela que é constatada sendo estável sob armazenamento, a aproximadamente 40°C por pelo menos cerca de 4 semanas, e/ou estável a aproximadamente 5°C e/ou 15°C por pelo menos 3 meses ou pelo menos 1 ano, e/ou estável a aproximadamente -20°C por pelo menos 3 meses. A estabilidade pode ser testada pela avaliação da estabilidade física, estabilidade química, e/ou atividade biológica do anticorpo na formulação por aproximadamente o tempo da formulação assim como seguindo armazenamento nas temperaturas apontadas. Física e/ou estabilidade podem ser avaliadas qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de maneiras diferentes, incluindo avaliação da formação de agregados (por exemplo, usando-se cromatografia de exclusão por tamanho, pela medição da turbidez, e/ou por inspeção visual); por avaliação de heterogeneidade de carga usando-se cromatografia de troca de catiônica ou eletroforese de zona capilar; análise de sequência de amino-terminal ou carboxi-terminal; análise de espectrometria de massa; análise SDS-PAGE para comparar anticorpo reduzido e intacto; análise de mapa de peptídeo (por exemplo, tríptico ou LYS-C); avaliação da atividade biológica ou função de ligação de antígeno do anticorpo; etc. Instabilidade pode resultar na agregação, deamidação (por exemplo, deamidação Asn), oxidação (por exemplo, oxidação Met), isomerização (por exemplo, isomerização Asp), ligação/hidrólise/fragmentação (por exemplo, fragmentação na região de dobradiça), formação de succinimida, cisteína(s) não pareada(s), extensão N-terminal, processo C-terminal, diferenças na glicosilação, etc. A atividade biológica ou função de ligação de antígeno pode ser avaliada usando-se várias técnicas disponíveis para os médicos técnicos no assunto.

[0315] Como apontado acima, congelamento da formulação é especificamente contemplado no presente pedido. Portanto, a formulação pode ser testada para estabilidade sob congelamento e descongelamento.

[0316] Consequentemente, a invenção também fornece um método de fabricação de uma formulação farmacêutica que compreende preparação da formulação como descrita no presente pedido, e avaliação da estabilidade física, estabilidade química ou atividade biológica do anticorpo monoclonal na formulação.

[0317] Na realização preferida, a formulação é fornecida dentro de um frasco com uma tampa perfurável por uma seringa, preferivelmente na forma aquosa. O frasco é armazenado de forma desejável a aproximadamente 2-8 °C até ser administrado para um sujeito com necessidade desta. O frasco pode, por exemplo, ser um frasco de 20 ml (20 cc) (por exemplo, para uma dose de 420 mg) ou frasco 50 ml (50 cc) (por exemplo, para uma dose de 1050 mg). Para um anticorpo DR5, tal como Apomab, a formulação pode ser fornecida em um frasco de vidro de 5 ml (5 cc) (por exemplo, preenchido com 5,5 ml).

[0318] Em outra realização, a formulação é fornecida dentro de um tanque de aço inoxidável. A formulação em tanque de aço inoxidável é opcionalmente congelada e não congelada a seco.

[0319] Um ou mais de outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes tais como aqueles descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980) podem ser incluídos na formulação fornecida contanto que eles não afetem as características desejadas da formulação. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabiliazantes não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem; agentes de tamponagem adicionais, co- solventes; anti-oxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes tais como EDTA; complexos de metal (por exemplo, complexos zinco- proteína); polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; conservantes; e/ou formação de sais contra íons tal como sódio.

IV. TRATAMENTO COM A FORMULAÇÃO DO ANTICORPO

[0320] Em uma realização, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou disfunção em um sujeito que compreende administração da formulação descrita no presente pedido para um sujeito em uma quantidade efetiva para tratar a doença ou disfunção.

[0321] Onde o anticorpo na formulação liga-se ao HER2, este é preferivelmente usado para tratar câncer. O câncer irá geralmente compreender células que expressam HER2, tal que o anticorpo HER no presente pedido é capaz de ligar-se às células cancerosas. Dessa forma, a invenção nesta realização relaciona-se a um método de tratamento de câncer que expressa HER2 em um sujeito, que compreende administrar a formulação farmacêutica do anticorpo HER2 para o sujeito em uma quantidade efetiva para tratar o câncer. Vários cânceres que podem ser tratados com a composição estão listados na seção de definições acima.

[0322] É também contemplado que a formulação do anticorpo HER2 pode ser usada para tratar várias doenças ou disfunções não malignas, tal como uma doença auto-imune incluindo (por exemplo, psoríase); endometriose; escleroderma; restenose; pólipos tais como pólipos de cólon, pólipos nasais e pólipos gastrointestinais; fibroadenoma; doença respiratória (ver definição acima); colecistite; neurofibromatose; doença de rim policístico; doenças inflamatórias; doenças de pele incluindo psoríase e dermatite; doença vascular (ver definição acima); condições envolvendo proliferação anormal de células epiteliais; úlceras gastrointestinais; doença de Menetrier, adenoma de secreção ou síndrome de perda de proteína; doenças renais; doenças angiogênicas; doenças oculares tais como degeneração macular relativa à idade, síndrome de histoplasmose ocular presumida, neovascularização da retina de retinopatia diabética proliferativa, vascularização da retina, retinopatia diabética, ou degeneração macular relativa à idade; patologias ósseas associadas tais como osteoartrite, raquitismo e osteoporose; dano seguindo um evento de isquem ia cerebral; doenças fibróticas ou edemias tais como cirrose hepática, fibrose pulmonar, carcoidose, tireoidite, síndrome de hiperviscosidade sistêmica, doença de Osler Weber-Rendu, doença pulmonar oclusiva crônica, ou edema seguindo queimadura, trauma, radiação, pancada, hipoxia ou isquemia; reação de hipersensibilidade de pele; retinopatia diabética e nefropatia diabética; síndrome de Guillain-Barre; doença do enxerto contra hospedeiro ou rejeição de transplante; doença de Paget; inflamação óssea ou nas articulações; fotoenvelhecimento (por exemplo, causado por radiação UV na pele humana); próstata hipertrófica benigna; certas infecções microbianas incluindo microbianas patogênicas selecionadas de adenovirus, hantavirus, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp. e Bordetella pertussis; trombose causada por agregação de plaquetas; condições reprodutivas tais como endometriose, síndrome de hiperestimulação ovariana, pré-eclampsia, sangramento uterino disfuncional, ou menometrorragia; sinovite; ateroma; nefropatias agudas e crônicas (incluindo glomerulonefrite proliferativa e doença renal induzida por diabete); eczema; formação de cicatriz hipertrófica; choque endotóxico ou infecção porfungo; polipose adenomatosefamiliar; doenças neurodegenerativas (por exemplo doença de Alzheimer, demência relacionada à AIDS, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal e degeneração cerebral); síndromes mielodisplásicas, anemia aplásica; lesão isquêmica; fibrose de pulmão, rim ou fígado; doença de hipersensibilidade mediada por célula T; estenose pilórica hipertrófica infantil; síndrome de obstrução urinária; artrite psoriática; e tireoidite de Hasimoto. Indicações não malignas preferidas para a terapia no presente pedido incluem psoríase, endometriose, escleroderma, doença vascular (por exemplo, restenose, arterioesclerose, doenças de artéria coronária, ou hipertensão), pólipos de cólon, fibroadenoma ou doenças respiratórias (por exemplo, asma, bronquite crônica, bronquiectasia ou fibrose cística).

[0323] Onde o anticorpo na formulação liga-se a um marcador de superfície de célula B tal como CD20 ou BR3, a formulação pode ser usada para tratar uma célula B maligna tal como NHL ou CLL, uma doença auto-imune, rejeição de enxerto ou para bloquear uma resposta imune a um antígeno estranho, tal como um anticorpo, uma toxina, um vetor viral de terapia de gene, um enxerto, um agente infeccioso, ou um aloantígeno (ver documento WO 01/03734, Grillo-Lopez et al.

[0324] Onde o anticorpo na formulação é um anticorpo IgE,pode ser usado para tratar uma disfunção mediada por IgE (patente USSN 2004/0197324 A1, Liu e Shire), tal como asma alérgica, Finite alérgica, dermatite atópica, gastroenteropatia alérgica, hipersensibilidade, eczema, urticária, aspergilose broncopulmonar alérgica, doença parasitica, síndrome de hiper-lgE, telangiectasia de ataxia, síndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tímica, mieloma de IgE, e reação do enxerto contra hospedeiro.

[0325] Anticorpos que se ligam a um receptor na superfamília TNF (por exemplo, que se liga ao DR5), ou que se liga ao VEGF (ou um receptor deste), podem ser usados para tratar câncer, várias formas destes estão descritas na seção de definições acima. Preferivelmente, o câncer tratado com uma formulação do anticorpo DR5 é um tumor sólido ou NHL.

[0326] Onde a indicação é câncer, o paciente pode ser tratado com uma combinação da formulação do anticorpo, e um agente quimioterápico. A administração combinada inclui co-administração ou administração concorrente, usando-se formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e adiministração consecutiva em qualquer ordem, em que preferivelmente exista um período de tempo enquanto ambos (ou todos) agentes ativos simultaneamente exerçam suas atividades biológicas. Dessa forma, o agente quimioterápico pode ser administrado antes da, ou seguindo, a administração da composição. Nesta realização, o tempo entre pelo menos uma administração do agente quimioterápico e pelo menos uma administração da composição é preferivelmente 1 mês ou menos, e mais preferivelmente 2 semanas ou menos. Alternativamente, o agente quimioterápico e a composição são administrados concorrentemente ao paciente, em uma única formulação ou formulações separadas.

[0327] O tratamento com a formulação irá resultar em uma melhora nos sinais ou sintomas do câncer ou doença. Por exemplo, onde a doença sendo tratada é câncer, tal terapia pode resultar em uma melhora na sobrevivência (sobrevivência completa e/ou sobrevivência livre de progressão) e/ou pode resultar em uma resposta clínica objetiva (parcial ou completa). Além disso, o tratamento com a combinação do agente quimioterápico e a formulação do anticorpo pode resultar em um benefício terapêutico sinérgico, ou mais que aditivo, do paciente.

[0328] Preferivelmente, o anticorpo na formulação administrado é um anticorpo nú. No entanto, o anticorpo administrado pode ser conjugado com um agente citotóxico. Preferivelmente, o imunoconjugado e/ou antígeno para o qual ele é ligado é/são internalizados pela célula, resultando em um aumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado em destruir a célula de câncer para a qual se liga. Em uma realização preferida, o agente citotóxico atinge ou interfere no ácido nucléico na célula cancerosa. Exemplos de tais agentes citotóxicos incluem maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleases e DNA endonucleases.

[0329] A formulação é administrada a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo, como uma pílula grande ou por infusão contínua sobre um período de tempo, por rotas intramuscular, intraperitoneal, intracérobro-espinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. Administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea da composição do anticorpo é preferida, com administração intravenosa sendo mais preferida.

[0330] Para distribuição subcutânea, a formulação pode ser administrada através de seringa; dispositivo de injeção (por exemplo, o dispositivo INJECT-EASE™ e GENJECT™); caneta injetora (tal como a GENPEN™); dispositivo sem agulha (por exemplo, MEDIJECTOR™ e BIOJECTOR™); ou sistema de distribuição de atadura subcutânea.

[0331] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção irá depender do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, a severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e a discrição do médico. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou sobre uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 50 mg/kg (por exemplo, 0,1 -20 mg/kg) de anticorpo HER2 ou DR5 é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. A dosagem do anticorpo será geralmente na faixa de aproximadamente 0,05 mg/kg para cerca de 10 mg/kg. Se um agente quimioterápico é administrado, este é usualmente administrado em dosagens conhecidas para isso, ou opcionalmente diminuída devido a ação combinada dos fármacos ou efeitos colaterais negativos atribuíveis à administração do agente quimioterápico. Preparação e programação de dosagens para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com instruções do fabricante ou como determinado empiricamente por um técnico no assunto. Preparação e programação de dosagens para tal quimioterapia são também descritas em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams &Wilkins, Baltimore, MD (1992).

[0332] Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com o anticorpo incluindo, mas não limitado a: um segundo (terceiro, quarto, etc) agente(s) quimioterápico(s) (isto é, “coquetéis” de diferentes agentes quimioterápicos); outro anticorpo monoclonal; um agente inibitório de crescimento; um agente citotóxico; um agente quimioterápico; um fármaco para atingir EGFR; inibidor tirosina quinase; agente anti- angiogênico; e/ou citocina, etc.

[0333] Além disso, para os regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido a remoção cirúrgica da célula cancerosa e/ou radioterapia.

V. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[0334] Em outra realização da invenção, um artigo de fabricação é fornecido, o qual contém a formulação farmacêutica da presente invenção e fornece instruções para seu uso. O artigo de fabricação compreende um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas (tal como seringas de câmara dupla) e tubos de teste. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais tais como garrafa ou plástico. O recipiente contém a formulação e o rótulo neste, ou associado com, o recipiente pode indicar intruções para uso. O recipiente contendo a formulação pode ser um frasco multi-uso, que permite administrações repetidas (por exemplo, de 2-6 administrações) da formulação reconstituída. O artigo de fabricação pode, além disso, incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e usuário, que inclui outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bula com instruções para uso como apontado na seção anterior.

[0335] A invenção será entendida mais completamente pela referência dos exemplos seguintes. No entanto, eles não deveriam ser construídos como limitação do escopo da invenção. Toda literatura e citações de patente estão incorporadas no presente pedido pela referência.

EXEMPLOS FORMULAÇÕES LÍQUIDAS ESTÁVEIS DE PERTUZUMAB

[0336] Estes exemplos descrevem o desenvolvimento e testes de estabilidade das formulações líquidas estáveis que compreendem Pertuzumab em concentrações de proteína na faixa de aproximadamente 10 mg/mL - 180 mg/mL. As formulações selecionadas possuem baixa turbidez, e eram fisicamente e quimicamente estáveis. Um íon cloreto foi removido da formulação para reduzir o risco de corrosão. A formulação era isotônica, e adequada para distribuição subcutânea ou intramuscular. Formação agregada insolúvel sob estresse de agitação foi prevenida utilizando-se formulação de histidiba-acetato e sacarose, sem a necessidade de incluir polisorbato 20.

MÉTODOS ANALÍTICOS COR, APARÊNCIA E CLARIDADE (CAC)

[0337] A cor, aparência, e claridade das amostras foram determinadas por inspeção visual dos frascos contra um fundo branco e preto sob luz fluorescente branca em temperatura ambiente.

MEDIDAS DE CONCENTRAÇÃO UV

[0338] A alíquota de produto líquido foi primeiro diluída com formulação tampão tal que o Amax perto de 278nm está na unidade de absorbância 0,5-1,0. A absorbância no UV das amostras diluídas foi medida em um quartz cuvette com 1 cm de extensão de trajetória em um espectofotômetro HP 8453. A absorbância foi medida em 278 nm e 320 nm. A absorbância de 320 nm é usada para corrigir o fundo de dispersão clara devido a grandes agregados, bolhas e partículas. As medidas foram apagadas contra a formulação tampão. A concentração de proteína foi determinada usando-se a absortividade de 1,50 (mg/ml_)-1cm-1.

MEDIDAS DE PH

[0339] O pH foi medido em temperatura ambiente usando-se um pHmetro RADIOMETER COPENHAGEN PHM82™. A sonda usada foi um eletrodo combinado vidro/eletrodo referência com conector radiômetro (Sigma, Cat# E-5759). Soluções padrão de pH 4,01 e pH 7,00 (EM Science) foram usados para calibração do pHmetro.

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÒNICA(IEX)

[0340] Cromatografia de troca catiônica foi empregada para medir trocas nas cargas variantes. Este ensaio utiliza uma coluna DIONEX PROPAC WCX-10™ em um sitema HP 1100™ HPLC. Amostras foram diluídas a 1 mg/mL com a fase A móvel contendo 20nM MES em pH 6,0. 50 ml_ das amostras diluídas foram então carregadas na coluna que foi mantida em temperatura ambiente. Os picos foram eluídos com um gradiente de NaCI raso usando-se móvel B contendo 20 mM MES, 250 mM NaCI, pH 6,0. O eluente foi monitorado em 280 nm. Os dados foram analizados utilizando-se o programa HP CHEMSTATION™ (RevA08.03).

ELETROFORESE CAPILAR DE ZONA (CZE)

[0341] A pureza de fragmentos Fab e F(ab’)2 foi determinado por CZE. Este ensaio foi executado em um sistema de eletroforese capilar BIORAD BIOFOCUS™ 3000™ com um BIOCAP XL™ capilar, 50 pm I.D., 44,6 cm de comprimento total e 40 cm do detector.

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE TAMANHO(SEC)

[0342] Cromatografia por exclusão de tamanho foi usada para quantificar agregados e fragmentos. Este ensaio utiliza um TSK G3000 SWXL™, 7,8 x 300 mm de coluna em funciona em um sistema HP 1100™ HPLC. Amostras foram diluídas a 10 mg/mL com a fase móvel e o volume de injeção foi de 20 pL. A fase móvel foi de 100 mM K2HPO4 em pH 6,8 e a proteína foi eluída com um gradiente isocrático em 0,5 mL/min por 45 minutos. A absorbância do eluente foi monitorada em 280 nm. Integração foi feita utilizando-se o programa HP CHEMSTATION™ (RevA08.03).

ATIVIDADE BIOLÓGICA

[0343] A atividade biológica do Pertuzumab foi determinada pela medição de suas habilidades de inibir proliferação da linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-175-VII.

EXEMPLO 1

[0344] Fragmentos de anticorpos Pertuzumab Fab e F(ab’)2 foram formulados em concentração de proteína de 1,0 mg/mL nas seguintes condições tampão: 10 mM de citrato, 140 mM de NaCl, pH 4,0; 10 mM de succinato, 140 mM de NaCl, pH 5,0; 10 mM de succinato, 140 mM de NaCl, pH 6,0; 10 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 7,0; e 10 mM de glicilglicina, 140 mM de NaCl, pH 8,0.

[0345] Cada formulação foi filtrada e então aliquotada em frascos de vidro 3 ml (3 cc) WHEATON™ USP Tipo I e selados com TEFLON™ revestidos com tampa cinza de butil. Amostras foram armazenadas a 40 ± 2 °C. A análise de estabilidade do produto fármaco mostrou que o Fab e F(ab’)2 foram mais estáveis entre pH 5,0 e 6,0. TABELA 2. EFEITO DO PH NA DEGRADAÇÃO DE FAB OU F(AB’)2 ARMAZENADO A 40°C

EXEMPLO 2

[0346] Pertuzumab foi formulado em 20 mM de tampão histidina- acetato com 120 mM de sacarose e 0,02 % de polisorbato 20. Os pHs das formulações foram ajustados com ácido acético para pH final entre 5,0 e 7,0. A concentração de proteína foi de 30 mg/mL. Cada formulação foi preenchida em frascos de vidro de 3 ml (3 cc) USP Tipo I e armazenadas em 40°C para análise de estabilidade. Os resultados mostraram que Pertuzumab foi mais estável ao redor de pH 6,0. TABELA 3. EFEITO DO PH NA DEGRADAÇÃO DE PERTUZUMAB ARMAZENADO A 40°C

EXEMPLO 3

[0347] Formulações Pertuzumab em concentrações de proteína de 100 mg/mL foram preparadas nos seguintes excipientes: (1) 10 mM de HCI de histidina, 240 mM de sacarose, 0,02% de polisorbato 20, pH 6,0; (2) 10 mM de histidina-acetato, 240 mM de sacarose, 0,02% de polisorbato 20, pH 6,0; (3) 10 mM de fosfato de histidina, 240 mM de sacarose, 0,02% de polisorbato 20, pH 6,0; (4) 10 mM de sulfato de histidina, 240 mM de sacarose, 0,02% de polisorbato 20 em pH 6,0.

[0348] Cada formulação foi preenchida em frascos de vidro 3 ml (3 cc) FORMA VITRUM™ USP Tipo I e fechados com FLUROTEC™ cobertos com tampa de borracha de butil. Amostras foram armazenadas em 30°C e 40°C e estabilidade foi avaliada para qualidade (CAC) e pureza (SEC, IEC). Os resultados de estabilidade mostraram que Pertuzumab em tampão fosfato de histidina degradou muito mais rápido que em outros tampões histidina sob armazenamento a 40°C (Fig. 8 e Fig. 9).

EXEMPLO 4

[0349] Pertuzumab foi concentrado por ultrafiltração/diafiltração para várias concentrações nos seguintes tampões: (1) 20 mM de histidina-acetato, pH 6,0; (2) 10 mM de HCI de histidina , pH 6,0, e (3) 10 mM de sulfato de histidina, pH 6,0.

[0350] A turbidez de cada formulação foi medida antes da filtração. Os resultados, como mostrado na Fig. 10, demonstraram que amostras de Pertuzumab formuladas em histidina-acetato e HCI de histidina tiveram menos quantidades de agregados insolúveis que aqueles em tampão sulfato de histidina.

EXEMPLO 5

[0351] Pertuzumab foi formulado em 30 mg/mL em 20 mM de histidina-acetato, 120 mM de sacarose, 0,02 % de polisorbato 20, pH 6,0. Pertuzmab foi preenchido em miniaturas de tanques de aço inoxidável 316L e HASTELLOY™. Todas as amostras foram armazenadas a -20°C e 5°C e avaliadas para qualidade (CAC), pureza (SEC, IEC) e resistência (UV-Vis). As análises de estabilidade mostraram que Pertuzumab era estável nesta formulação sob armazenamento a -20°C e 5°C por pelo menos 3 meses. A formulação livre de cloreto é compatível com tanque de aço inoxidável 316L e HASTELLOY™. TABELA 4. ESTABILIDADE DE PERTUZUMAB EM TANQUES DE Aço INOXIDÁVEL

aPass para Cor, Aparência e Claridade: Claro para levemente opalescente, sem cor para solução amarela pálida.

EXEMPLO 6

[0352] Pertuzumab foi formulado utilizando-se filtração de fluxo tangencial (TFF). A formulação final contém 20 mM de histidina-acetato, 120 mM de sacarose, 0,02 % de polisorbato 20, pH 6,0 em concentração de proteína de 30 mg/mL. Amostras foram preenchidas em um frasco de vidro de 20 Ml FORMA VITRUM™ USP Tipo I, tampadas com tampa de borracha foliada de butil de 20 mm FLUROTEC™, e selada com tampas flip-top de alumínio. Todas as amostras foram armazenadas a -70°C, 5°C, 15°, e estabilidade foi avaliada para qualidade (CAC), pureza (SEC, IEC), resistência (UV-Vis), e potência (Bioensaio). Os resultados mostraram que Pertuzumab é estável nesta formulação sob armazenamento a 5°C e 15°C por pelo menos 3 meses. TABELA 5. ESTABILIDADE DE PERTUZUMAB EM FRASCOS DE VIDRO

EXEMPLO 7

[0353] Pertuzumab foi formulado em 100 mg/mL nas seguintes condições tampão: (1) 10 mM de HCI de histidina, pH 6,0; (2) 10 mM de HCI de histidina, 240 mM de sacarose, pH 6,0; (3) 20 mM de succinato em pH 6,0; e (4) 20 mM de succinato, 240 mM de sacarose em pH 6,0.

[0354] Cada formulação foi adicionada com diferente concentração de polisorbato 20. Todas as amostras foram preenchidas em frascos de vidro de 3 ml (3 cc) USP Tipo I e foram agitadas horizontalmente a 70 rpm em temperatura ambiente por até 7 dias. A estabilidade de cada amostra foi avaliada em 7 dias do ponto no tempo para turbidez. Os resultados demonstraram que o uso de polisorbato 20 na formulação final preveniu efetivamente formação de agregados insolúveis. Ver Fig. 11.

EXEMPLO 8

[0355] Pertuzumab foi preparado nas seguintes formulações: (1) 25 mg/mL de Pertuzumab, 10 mM de HCI de histidina, 240 mM de sacarose, pH 6,0; (2) 50 mg/mL de Pertuzumab, 10 mM de HCI de histidina, 240 mM de sacarose, pH 6,0; (3) 60 mg/mL de Pertuzumab, 20 mM de histidina-acetato, 120 mM de sacarose, pH 6,0.

[0356] Várias quantidades de polisorbato 20 foram adicionadas para cada formulação. Todas as amostras foram preenchidas em frascos de vidro de 3 ml (3 cc) USP Tipo I e foram agitadas horizontalmente a 70 rpm em temperatura ambiente por até 7 dias. A estabilidade física de cada amostra foi avaliada em 7 dias do ponto no tempo para turbidez. Os resultados demonstraram que o uso de polisorbato 20 na formulação HCI de histidina e sacarose efetivamente preveniu formação de partículas insolúveis. A formulação que contém histidina-acetato e sacarose pareceu ter o mesmo efeito protetor na proteína como polisorbato 20. Ver Fig. 12.

EXEMPLO 9

[0357] Pertuzumab foi formulado como segue: (1) 100 mg/mL de proteína, 10 mM de HCI de histidina, pH θ g- (2) 100 mg/mL de proteína,20 mM de succinato, pH 6,0; (3) 60 mg/mL de proteína,20 mM de histidina-acetato, pH 6,0.

[0358] Cada formulação foi misturada com diferentes quantidades de sacarose. Todas as amostras foram preenchidas de forma esterilizante em frascos de vidro de 3 ml (3 cc) USP Tipo I. Eles foram então congelados a -70°C e descongelados a 5°C três vezes. A estabilidade física de cada amostra foi determinada após os três ciclos de congelamento e descongelamento. Os resultados demonstraram que sacarose previne formação de agregado solúvel durante o processo de congelamento-descongelamento. Ver Fig. 13.

EXEMPLO 10

[0359] A formulação de Pertuzumab preferida para uso terapêutico consiste essencialmente de 30mg/ml_ de Pertuzumab em 20mM de histidina- acetato, 120mM de sacarose, 0,02% de polisorbato 20, em pH 6,0.

MW: Peso molecular configuração de frasco de dose de 420mg: Frasco: 20 ml (20 cc) Formal Vitrum Tipo I de vidro Tampa: 20 mm DAIKYO GREY™, resina de flúor laminada Tampa: 20 mm de alumínio flip top Volume de preenchimento: 14,50 ml_ Distribuição: 14,0 ml_ de Pertuzumab em bolsa IV salina normal. configuração de frasco de dose de 1,050mg: Frasco: 50 ml (50 cc) Formal Vitrum Tipo I de vidro Tampa: 20 mm DAIKYO GREY™, resina de flúor laminada Tampa: 20 mm de alumínio flip top Volume de preenchimento: 36,0 ml_ Distribuição: 35,0 ml_ de Pertuzumab em bolsa IV salina normal.

EXEMPLO 11

[0360] Este exemplo relaciona-se a outra formulação de Pertuzumab que foi usada em testes clínicos de Fase I e Fase II. A composição consiste de 25 mg/mL de Pertuzumab, 10 mM de tampão HCI de histidina, 240 mM de sacarose, 0,02% de polisorbato 20, pH 6,0.

EXEMPLO 12

[0361] Apoptose celular é mediada pelas vias intrínsecas e extrínsecas. A quimioterapia pode causar dano celular e pode acionar apoptose pela via intrínseca em resposta ao dano celular. No entanto, células cancerosas frequentemente desenvolvem resistência à quimioterapia através de mutações no gene supressor de tumor p53 (Ashkenazi A. Targeting Death and Decoy Receptors of the Tumour-Necrosis Factor Superfamily. Nature Reviews 2:420- 430 (2002)). Receptores da morte, tais como DR4 e DR5, localizados na superfície das células acionam a via extrínseca de apoptose que não envolve p53. Moléculas agonísticas, tais como Apo2L, ligam-se aos receptores DR4 e DR5 e ativam caspases 8 e 10 através do domínio da morte associado a Fas. Caspases 8 e 10 então ativam 3,6 e 7 para induzir apoptose. A sinalização molecular dos receptores da morte em células tumorais têm potencial terapêutico para eliminação de células cancerosas que são resistentes às terapias convencionais e moléculas, como Apo2L, estão atualmente passando por avaliação clínica.

[0362] “Apomab” é um lgG1 humanizado derivado de CHO de comprimento total construído com uma cadeia leve lamda. É um anticorpo agonista contra DR5 que mostrou induzir apoptose de várias linhagens celulares de câncer. Estudos pré-clínicos usandos-se um modelo de implante de tumor murino mostrou que Apomab tem redução de tumor melhorada ou similar comparada ao Apo2L. Apomab está sendo avaliado como um agente anti-câncer nas indicações de tumores sólidos avançados e Linfomas não-Hodgkin (NHL). As sequências de aminoácido de cadeia pesada e cadeia leve do Apomab usadas nestes experimentos estão mostradas nas Figs. 27 e 28.

PREPARAÇÃO DA FORMULAÇÃO DO ANTICORPO

[0363] Apomab produzido recombinantemente teve muita concentração de proteína diluída e alto pH. O material foi concentrado em aproximadamente 20 mg/ml e trocado em 20 mM de tampão acetato de sódio, pH 5.0 usando-se um Millipore Labscale de sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) com MILLIPORE PELLICON™ XL, PLCGC10, membrana de 50 cm . Amostras de Apomab foram formuladas em vários sistemas tampão cobrindo faixa de pH de 4.0 a 7.0 usando-se acetato de sódio, histidina-acetato, e fosfato de sódio sem trealose e TWEEN 20® usando-se diálise com uma membrana cortada de peso molecular de 10,000 Da (Pierce, Inc). Trealose em 240 mM foi adicionada na última diálise. Após diálise, 0.02% de TWEEN 20™ foi adicionado na formulação e as amostras foram filtradas com filtros 0.22 pm (Millipore, Inc). Um volume de 0.5 mL de Apomab foi preenchido em frascos de vidro de 3 ml (3 cc) (Forma Vitrum, Inc.) e selados com tampas de 13 mm (Daikyo, Inc). Estabilidade da proteína foi avaliada a -70°C, 5°C, 30°C, e 40°C com armazenamento de até 3 meses.

ESTABILIDADE DA FORMULAÇÃO DE APOMAB

[0364] Para testar a estabilidade do produto fármaco, a massa de Apomab formulado preenchido em frascos de vidro de 5 ml (5 cc) FORMA VITRUM® foi formulado. Frascos foram preenchidos com 5.5 ml_ do anticorpo formulado, encaixados com tampas de 20 mm DAIKYO®, e armazenados a - 70°C, 5°C, 30°C, e 40°C na posição correta.

[0365] Para testar estabilidade da substância, a massa de Apomab formulada foi filtrada de forma estéril através de um filtro de 0,22 pm e 10 mL foi preenchido em 20 ml (20 cc) em mini-tanques de aço inoxidável autoclavados de 316L. Os tanques foram colocados em posição vertical a -20°C e 5°C. Uma alíquota de 1 ml foi removida de forma asséptica dos mini-tanques em intervalos de tempo especificados para avaliar a qualidade da proteína. Os frascos de controle eram alíquotas de 1 mL em frascos de vidro de 3 ml (3 cc) armazenados a -20°C.

COR, APARÊNCIA E CLARIDADE (CAC)

[0366] A claridade, aparência, e cor das amostras foram determinadas visualmente avaliadas sob luz fluorescente branca usando-se uma estação de inspeção de luz com fundo preto e branco. Para análises da substância fármaco, amostras de mini-tanques foram transferidas para um frasco de vidro de 3 ml (3 cc) para inspeção.

PH

[0367] O pH foi medido em temperatura ambiente com semi-micro eletrodo para pH THERMO ORION SURE-FLOW ROSS™ para medir tampões ou combinação de micro eletrodo para pH THERMO ORION GLS™ para medir pH de proteína da seleção de amostras, uma sonda de microeletrodo Beckman para amostras de estabilidade Toxicológica. O medidor de pH/lon METERLAB™ pHM240 (Radiometer Analytical) foi calibrado todos os dias com tampão padrão (EM Science) em pH 7 e pH 4.

CONCENTRAÇÃO

[0368] A concentração de proteína foi determinada por espectroscopia de absorção ultravioleta usando-se um espectrofotômetro AGILENT 8453™. As amostras foram diluídas com formulação tampão vazia apropriada para dar uma absorbância de 0,5 a 1,0. O instrumento foi apagado com a solução diluente e o espectro foi escaneado de 240 a 500 nm. O valor de absorbância a 320 nm foi subtraído da absorbância a 279 nm para corrigir compensação e dispersão de luz. As concentrações de proteína foram calculadas pela seguinte equação. Cone. (mg/mL) = (A279 - A320) X fator de diluição coeficiente de absorbância em crrr1(mg/mL)’1

[0369] O coeficiente de absorbância baseado na sequência foi inicialmente determinado para ser 1,32 cm-1(mg/mL)-1 e este valor foi usado para estudos de seleção de pH. Um valor posterior de 1,7 cm-1(mg/mL)-1 foi determinado por análise de aminoácido e métodos de proteólise e este valor foi usado para a análise de estabilidade do Apomab usado em estudos de Toxicologia.

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (IEX)

[0370] A cromatografia de troca iônica foi realizada em um 1100 series HPLC (Agilent Technologies, Inc.) equipado com um detector diode array. A cromatografia foi realizada em um PROPAC WCX-10™ (Dionex) coluna (4 x 250 mm) em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e com coluna de temperatura a 40°C. A fase móvel A foi 25 mM de fosfato de sódio, pH 6,5. A fase móvel B foi 100 mM de cloreto de sódio no mesmo tampão como fase móvel A. A coluna foi equilibrada com 100% da fase móvel A. Para seleção de amostras de pH uma quantidade de 20 mg de Apomab foi carregada na coluna e a absorbância foi monitorada a 214 nm. Proteína foi eluída de uma coluna com o seguinte gradiente:

[0371] Para análise de estabilidade do material usado nos estudos de Toxicologia uma quantidade de 30 mg de Apomab foi carregada na coluna e a absorbância foi monitorada a 280 nm. Proteína foi eluída de uma coluna com o seguinte gradiente:

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE TAMANHO

[0372] A cromatografia por exclusão de tamanho foi realizada em um 1100 series HPLC (Agilent Technologies, Inc.) equipado com um detector diode array. Uma quantidade de 50 pg de Apomab foi carregada em um TSK Gel 3000SWXL™ coluna (7.8 x 300 mm) e realizado em uma taxa de fluxo de 0,9 mL/min por 20 minutos para amostras de seleção de pH e 0,5 mL/min por 30 minutos para amostras de estabilidade Toxicológica com 0,20 M de fosfato de potássio, 0,25 M de cloreto de potássio, pH 6,2 como uma fase móvel. A absorbância foi monitorada a 280 nm.

POTÊNCIA

[0373] O propósito do bioensaio de potência foi medir a habilidade do Apomab para destruir células Colo205 usando-se ALAMARBLUE™. Colo205 é uma linhagem celular de carcinoma de cólon, que expressa ambos os receptores da morte DR5 e DR4. Este ensaio incorpora um indicador de crescimento fluorimétrico/colorimétrico baseado na deleção da atividade metabólica. ALAMARBLUE™ é um corante indicador de redução que é azul e não fluorescente em estado de oxidação. A redução metabólica intracelular converte este em uma cor vermelha que é também fluorescente. As mudanças na cor e fluorescência são proporcionais à atividade metabólica e número de células vivas. O sinal diminui quando as células morrem. Apomab foi diluído em um meio com anti-Fc e então células Colo 205 foram adicionadas às amostras de Apomab e incubadas a 37°C por 48 horas. ALAMARBLUE™ é adicionado por pelo menos 2-3 horas. A placa foi lida a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão para obter unidades relativas de fluorescência (RFU). Os dados foram analisados por KALEIDAGRAPH™. A curva de diluição de destruição foi gerada.

RESULTADOS FORMULAÇÃO DE ESTUDOS DE SELEÇÃO DE PH

[0374] O efeito do pH na estabilidade do anticorpo foi estudado usando-se Apomab produzido de uma linhagem celular estável não amplificada. Para esta análise, Apomab foi formulado com 20 mg/ml de anticorpo em 20 nM de tampão acetato de sódio em pH 4,0, 4,5, 5,5, 20 nM de tampão histidina-acetato em pH 6,0 e 6,5, e 20 nm de tampão fosfato de sódio em pH 7,0. Todas as formulações continham 240 mM de trealose e 0.02% de TWEEN 20®. As formulações foram armazenadas por até 3 meses em temperaturas de -70°C, 5°C, 30°C, e 40°C e a estabilidade da proteína foi determinada por vários ensaios analíticos, incluindo CAC, pH, concentração, SEC e IEC. Mudanças não significantes em CAC, pH ou concentração de proteína foram observadas durante o armazenamento das amostras.

[0375] Análises das amostras por SEC mostraram que mudanças não significantes ocorreram durante o armazenamento a 5°C e - 70°C. No entanto, degradação observada como a formação dos fragmentos de anticorpo e agregados solúveis ocorreu durante armazenamento a 30°C e 40°C (Fig. 20). Para comparar as formulações, cinéticas do monômero anticorpo durante o armazenamento foram monitoradas e as constantes da taxa de primeira ordem foram calculadas. O perfil das taxas de pH obtidos para a perda no monômero anticorpo é mostrada na Fig. 21. A condição ótima para a estabilidade do monômero anticorpo foi obtida pela formulação em tampão histidina-acetato em pH 6,0.

[0376] A heterogenidade de carga foi monitorada por IEC. Mudanças não significantes no perfil IEC ocorreram durante armazenamento a 5°C e -70°C. No entanto, degradação observada como a formação de variantes acídicas e básicas ocorreram dependendo da formulação (Fig.22). Geralmente, variantes básicas aumentadas foram formadas em formulação de pH mais baixo e mais variantes acídicas foram formadas em formulação de pH mais alto. Para comparar as formulações, cinética do pico principal IEC foi monitorada durante armazenamento e as constantes da taxa de primeira ordem foram calculadas. O perfil da taxa de pH obtido para a perda no pico principal IEC é mostrado na Fig.23. As constantes da taxa observada por IEC foi aproximadamente 10 dobras maior que aquela de SEC (Fig.21) Então, a perda no pico principal IEC era a degradação primária do anticorpo que irá em última análise limitar a vida de prateleira do produto. Além do mais, como observado por SEC, ótima estabilidade do anticorpo para estabilizar pico principal IEC foi obtida pela formulação em tampão histidina- acetato em pH 6,0.

[0377] Seguindo a análise dos dados de seleção de pH descritos acima, uma formulação de Apomab foi selecionada que compreendeu 20 mg/mL de anticorpo em 20 mM de histidina-acetato, 240 mM de trealose, 0,02% de polisorbato 20, pH 6,0. Para o produto fármaco, a configuração do frasco consistiu de 5,5 mL preenchido em um frasco de 5 ml (5 cc) FORMA VITRUM™ com uma tampa 20 mM DAIKYO™ West. Apomab foi armazenado em tanques de aço inoxidável.

[0378] A estabilidade do Produto fármaco Apomab foi avaliado na configuração de frasco de vidro de 5 ml (5 cc) descrito acima. Frascos foram armazenados a-70°C (controles), 5°C, 30°C, e 40°C. Amostras foram tiradas em intervalos de tempo específicos e analisadas pelos seguintes ensaios: Cor, aparência, claridade (CAC), pH, concentração de proteína, SEC, IEC, e potência. Os resultados destes ensaios estão mostrados na Tabela 6 para amostras armazenadas a -70°C e 5°C e Tabela 7 para amostras armazendas a 30°C and 40°C. TABELA 6. DADOS DE ESTABILIDADE PARA APOMAB ARMAZENADO A -70°C E 5°C

TABELA 7. DADOS DE ESTABILIDADE PARA APOMAB ARMAZENADOA -70°C E 5°C

[0379] Nenhuma mudança na qualidade da proteína foi observada após doze meses de armazenamento a -70°C e 5°C. Por exemplo, o pH mantido em 6,0 ± 0,3, Apomab mostrou-se como um líquido claro e sem cor, a concentração de proteína manteve-se em 20.0 ± 2.0 mg/mL, e a % de monômero foi imútavel. Além do mais, não existiram mudanças significantes na % do pico principal IEC e % específica de atividade determinada pelo ensaio de potência de destruição celular estava dentro da precisão do ensaio de 60% a 140% de atividade específica. Os resultados mostraram que Apomab armazenado em frascos de vidro de 5 ml (5 cc) era estável por pelo menos 12 meses a 5°C.

[0380] Tabela 7 mostra que mudanças na qualidade da proteína ocorreram a 30°C e 40°C. SEC mostrou uma diminuição na % de monômero com um aumento primeiramente nos tipos de fragmentos. Agregados aumentam assim como em altas temperaturas, mas a taxa foi muito mais baixa. No entanto, os agregados aumentam significativamente após 6 meses a 40°C. % do pico principal IEC diminuiu com um aumento correspondente nas variantes acídicas. Picos básicos diminuíram levemente após 2 meses a 40°C e 9 meses a 30°C. Após 6 meses de armazenamento a 40°C, ocorreu degradação a uma extensão que o pico principal IEC já não pôde ser integrado. O bioensaio de destruição celular mostrou perda de % de atividade específica em altas temperaturas com tempo de armazenamento mais longo. Concentração de proteína e pH foram imutáveis. A solução tornou-se levemente amarela após 3 meses a 40°C e 9 meses a 30°C e tornou-se amarela após 9 meses a 40°C.

ESTABILIDADE DA SUBSTÂNCIA FÁRMACO

[0381] Dados de estabilidade em congelamento-descongelamento para substância fármaco estão mostrados na Tabela 8. TABELA 8. DADOS DE ESTABILIDADE EM CONGELAMENTO-DESCONGELAMENTQ PARA APOMAB PREENCHIDO EM MINIATURAS DE TANQUES DE Aço INOXIDÁVEL

TABELA 9. DADOS DE ESTABILIDADE EM CONGELAMENTO-DESCONGELAMENTQ PARA APOMAB PREENCHIDO EM MINIATURAS DE TANQUES DE Aço INOXIDÁVEL

[0382] Mudanças não significantes nas características químicas da proteína foram observadas após serem congeladas a -20°C por pelo menos 15 horas e descongeladas em temperatura ambiente três vezes. Por exemplo, Apomab mostrou-se como um líquido claro e sem cor, o pH mantido em 6,0 ± 0,3, e a porcentagem de pico de monômero SEC foi imutável.

[0383] Estabilidade de Apomab em tanques de aço inoxidável foi avaliada a -20°C e 5°C (tabela 9).

[0384] Amostras foram tiradas de forma asséptica dos mini- tanques em intervalos específicos e analisadas.

[0385] Apomab não mostrou mudanças na qualidade da proteína a 5°C por pH, CAC, concentração de proteína e % do pico principal por IEC mas perdeu 0.1% de monômero por SEC a cada 3 meses. Diminuição da potência foi observada durante armazenamento a 5°C por 3 meses. No entanto, a potência da amostra aumentou novamente em 6 e 9 meses no ponto no tempo. Então, a diferença de potência observada em 3 meses no ponto no tempo foi atribuída à varição no ensaio. Apomab não mostrou mudanças na qualidade da proteína a 20°C por pH, CAC, concentração de proteína, % de monômero por SEC, % do pico principal por IEC, e sem mudança significante na potência. Os dados de estabilidade mostram que Apomab é estável por pelo menos 1 ano a -20°C e três meses a 5°C.

CONCLUSÃO

[0386] Estudos de seleção de formulação foram executados para selecionar uma formulação para Apomab. A seleção de pH que cobre a faixa de pH 4,0 a 7,0 usando acetato de sódio, histidina-acetato, e fosfato de sódio como tampões com 240 mM de diidrato de trealose e 0,02% de polisorbato 20 mostrou que Apomab é mais estável em solução de pH 6,0. Então, a formulação que consiste de 20 mM de histidina-acetato, 240 mM de trealose, 0.02% de polisorbato 2, pH 6.0 foi desenvolvida e demonstrou ser estável experimentalmente. Usando esta formulação, Apomab mostrou ser estável por pelo menos 12 meses a 5°C. Além do mais, Apomab mostrou ser estável por pelo menos 12 meses a -20°C e três meses a 5°C quando armazenado em recipientes de 316L de aço inoxidável. Apomab mostrou também ser estável quando submetido a até 3 ciclos de congelamento/descongelamento.

Claims (5)

1. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender Pertuzumab a uma concentração de 20 mg/mL a 40 mg/mL, tampão histidina-acetato a uma concentração de 10 mM a 40 mM, sacarose a uma concentração de 60 mM a 250 mM e polissorbato 20 a uma concentração de 0,01% a 0,1%, em que o pH da formulação é de 5,5 a 6,5 e em que o Pertuzumab compreende as sequências de aminoácidos leve variável e pesada variável mostradas como SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.

2. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo Pertuzumabe compreender uma sequência de aminoácidos de cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 15 e uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO: 16.

3. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo pH da referida formulação ser de 5,8 a 6,2.

4. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender 30 mg/mL de Pertuzumabe, 20 mM de histidina-acetato, 120 mM de sacarose e 0,02% de polissorbato 20, em que o pH da formulação é 6,0.

5. USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de um câncer que expressa HER2.

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