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KR20220140786A - 클라우딘18.2 항체 및 그것의 사용 - Google Patents

클라우딘18.2 항체 및 그것의 사용 Download PDF

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KR20220140786A
KR20220140786A KR1020227031277A KR20227031277A KR20220140786A KR 20220140786 A KR20220140786 A KR 20220140786A KR 1020227031277 A KR1020227031277 A KR 1020227031277A KR 20227031277 A KR20227031277 A KR 20227031277A KR 20220140786 A KR20220140786 A KR 20220140786A
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KR
South Korea
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antibody
seq
ser
amino acid
variable region
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Pending
Application number
KR1020227031277A
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English (en)
Inventor
칭 저우
촨잉 쑤
웨이홍 니안
샹위 허
신통 정
신민 장
펭 허
징 시아오
Original Assignee
상하이 에스쿠겐 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 클라우딘18.2(CLDN18.2) 항체 및 위암, 췌장암 및 식도암과 같은 암 치료에서의 그것의 사용에 관한 것이다.

Description

클라우딘18.2 항체 및 그것의 사용
본 출원은 항체의 기술 분야에 관한 것이고, 또한 항체의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 클라우딘18.2 항체 및 그것의 사용에 관한 것이다.
클라우딘은 분자량이 20~30kDa인 막관통 단백질의 1종이다. 그 종은 24원이 있고, 다수의 조직에서 발현된다. 그것은 세포간 밀착 접합(TJ) 구조의 형성에 중요한 분자이다. 상피 세포 또는 내피 세포는 세포 표면에 발현되는 밀착 결합 분자(클라우딘 분자 포함), 즉 상피의 세포간 공간에서 분자의 흐름을 제어하는 세포간 밀착 접합을 통해 고도로 정렬된 조직 결합을 형성한다. TJ는 정상적인 생리적 조건 하에서 상피 세포나 내피 세포의 안정한 상태를 유지하고 세포 극성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이들 중, 가장 눈에 띄는 것은 CLDN18 스플라이스 변형 1(클라우딘 18.1, CLDN18.1) 및 CLDN18 스플라이스 변형 2(클라우딘 18.2, CLDN18.2)의 2개의 스플라이스 변형으로 이루어지는 클라우딘 18(CLDN18)이다.
이들 중, CLDN18.2(Genbank 수탁 번호 NM_001002026, NP_001002026)는 분자량 27.8kDa의 막관통 단백질이고, 단백질의 N-말단과 C-말단이 모두 세포 내 위치한다. 단백질의 주요 형태는 4개의 막횡단 도메인(TMD)과 2개의 세포외 루프(ECL)를 포함한다. CLDN18.2는 261개 아미노산의 전체 길이로 다양한 포유 동물에서 고도로 보존되며, 이 중 아미노산 1-6은 N-말단 세포내 도메인이고, 아미노산 7-27은 막횡단 도메인 1(TMD1)이고, 아미노산 28-78은 세포외 루프 1(ECL1)이고, 아미노산 79-99는 막횡단 도메인 2(TMD2)이고, 아미노산 123-144는 막횡단 도메인 3(TMD3)이고, 아미노산 100-122은 TMD2와 TMD3을 연결하기 위한 세포내 도메인이고, 아미노산 145-167은 세포외 루프 2(ECL2)이고, 아미노산 168-190은 막횡단 도메인 4(TMD4)이고, 아미노산 191-261은 C-말단 세포내 영역이다. 116 위치의 아스파라긴 상에 표준의 N-글리코실화 모티프가 있다.
CLDN18.1 및 CLDN18.2는 단백질의 N-말단-막횡단 영역 1-세포외 루프 1에서 N-말단의 처음 26개 아미노산만 상이하고, 나머지 서열은 동일하다.
CLDN18.2의 발현 수준이 위, 췌장, 식도 및 기타 조직의 종양 세포, 특히 선암종 아형 종양 세포에서 유의하게 활성화된다는 상당한 증거가 있다. 정상 조직에서 CLDN18.1은 폐 및 위 상피 세포에서 선택적으로 발현된다; CLDN18.2는 단명(short-lived)의 위 선상피 점막 조직(분화 선상피 세포)에서만 발현되고, 위 상피 줄기 세포에서는 발현되지 않으며, 분화된 선상피 세포는 위 상피 줄기 세포에 의해 지속적으로 보충될 수 있다. 이러한 분자 발현 특성은 CLDN18.2 관련 암의 항체 기반 치료에 대한 가능성을 제공한다.
본 출원은 위암, 췌장암 또는 식도암을 비롯한 암 병변을 효과적으로 치료할 수 있는 암 치료용 CLDN18.2 항체를 제공한다. 구체적으로는, 본 출원은 이하와 관련된다:
1. 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 CLDN18.2 항체로서,
상기 중쇄 CDR은:
SEQ ID NO:18에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:19에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:20에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
SEQ ID NO:21에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:22에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:23에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이고;
상기 경쇄 CDR은:
SEQ ID NO:24에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:25에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:26에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 SEQ ID NO:27에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:28에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:29에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3인, CLDN18.2 항체.
일부 실시형태에서, 본 출원은 하기 중 어느 하나에서 선택된 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CLDN18.2 항체에 관한 것이다:
여기서, 상기 중쇄 CDR은:
SEQ ID NO:18에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:19에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:20에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
SEQ ID NO:21에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:22에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:23에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이고,
여기서, 상기 경쇄 CDR은:
SEQ ID NO:24에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:25에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:26에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
SEQ ID NO:27에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:28에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:29에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이다.
일부 실시형태에서, 본 출원은 하기 중 어느 하나에서 선택되는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열의 보존적으로 돌연변이된 서열을 포함하는 CLDN18.2 항체에 관한 것이다.
여기서, 상기 중쇄 CDR은:
SEQ ID NO:18에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:19에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:20에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
SEQ ID NO:21에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:22에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:23에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이고;
여기서, 상기 경쇄 CDR은:
SEQ ID NO:24에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:25에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:26에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
SEQ ID NO:27에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:28에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:29에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이다.
2. SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36 또는 SEQ ID NO:40에 나타내어진 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항목 1의 항체.
일부 실시형태에서, 본 출원은 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36 또는 SEQ ID NO:40에 나타내어진 중쇄 가변 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CLDN18.2 항체에 관한 것이다.
3. SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:41 또는 SEQ ID NO:42에 나타내어진 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항목 1의 항체.
일부 실시형태에서, 본 출원은 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:41 또는 SEQ ID NO:42에 나타내어진 경쇄 가변 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CLDN18.2 항체에 관한 것이다.
4. 1) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:30에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:32에 나타내어지고; 또는
2) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:31에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:33에 나타내어지는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 항체.
일부 실시형태에서, 본 출원은,
1) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:30에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:32에 나타내어지고; 또는
2) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:31에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:33에 나타내어지는 것과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CLDN18.2 항체에 관한 것이다.
5. 1) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:34에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:35에 나타내어지고;
2) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:35에 나타내어고;
3) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:37에 나타내어지고;
4) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:40에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:41에 나타내어지고; 또는
5) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:40에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:42에 나타내어지는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항목 1 내지 3의 항체.
일부 실시형태에서, 본 출원은,
1) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:34에 나타내어지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:35에 나타내어지고;
2) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36에 나타내어지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:35에 나타내어지고;
3) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36에 나타내어지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:37에 나타내어지고;
4) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:40에 나타내 어지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:41에 나타내어지고; 또는
5) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:40에 나타내어지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:42에 나타내어지는 것과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CLDN18.2 항체에 관한 것이다.
6. 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체인 항목 1 내지 5 중 어느 하나의 항체.
7. 전장 항체인 항목 1 내지 6 중 어느 하나의 항체.
8. IgG 항체인 항목 7의 항체.
9. CLDN18.2에 결합하는 항체 단편인 항목 1 내지 6 중 어느 하나의 항체.
10. 상기 항체 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2인, 항목 9의 항체.
11. 다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체인 항목 1 내지 8 중 어느 하나의 항체.
12. 상기 다중특이적 또는 이중특이적 항체는 제 2 생체 분자에 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 상기 제 2 생체 분자는 세포 표면 항원인 항목 11의 항체.
13. 상기 세포 표면 항원은 종양 항원인 항목 12의 항체.
14. 상기 종양 항원은 CD3, CD20, FcRH5, HER2, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1 및 TenB2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항목 13의 항체.
15. 치료제, 인터페론 유전자 자극제(STING) 수용체의 아고니스트, 사이토카인, 방사성 핵종 또는 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 항체에 연결된 효소를 포함하는 면역접합체.
16. 상기 치료제는 화학요법 약물인 항목 15의 면역접합체.
17. 상기 치료제는 세포독성제인 항목 15의 면역접합체.
18. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 하나의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
19. 항목 1 내지 항목 14 중 어느 하나의 항체, 항목 15 내지 17 중 어느 하나의 면역접합체, 또는 항목 18의 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
20. SEQ ID NO:18-29 중 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
21. SEQ ID NO:30-33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 20의 핵산.
22. 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 항목 21의 핵산.
23. 항목 20 내지 22 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
24. 항목 20 내지 22 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 항목 23의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
25. 항목 24의 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항체를 단리하여 얻는 것을 포함하는 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 항체를 제조하는 방법.
26. 암 치료용 약제의 제조에 있어서의 약학적 조성물의 사용으로서, 상기 조성물은 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 항체, 항목 15 내지 17 중 어느 하나의 면역접합체, 또는 항목 18의 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 사용.
27. 상기 암은 소화기 계통의 암인 항목 26의 사용.
28. 상기 소화기 계통의 암은 위암, 췌장암 또는 식도암 중 어느 하나에서 선택되는 항목 27의 사용.
29. 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 암 검출 시약.
30. 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 화학적으로 표지되는 항목 29의 암 검출 시약.
31. 상기 표지는 효소 표지, 형광 표지, 동위원소 표지 또는 화학발광 표지인 항목 30의 암 검출 시약.
32. 항목 29 내지 31 중 어느 하나의 암 검출 시약을 포함하는 암 진단 키트.
33. 상기 암은 위암, 췌장암 또는 식도암인 항목 32의 키트.
34. 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 항체, 항목 18의 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 항목 29 내지 31 중 어느 하나의 검출 시약을 대상체로부터 유래된 조직 샘플과 접촉시키는 것을 포함하는 대상체에서의 암을 진단하기 위한 방법.
35. 상기 조직 샘플은 대상체의 체액(예를 들면, 혈액 및 소변) 및 조직 절편(예를 들면, 조직 생검 샘플)인 항목 34의 진단 방법.
36. 상기 암은 위암, 췌장암 또는 식도암 중 어느 하나에서 선택되는 항목 34 또는 35의 진단 방법.
37. 치료 유효량의 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 항체, 항목 15 내지 17 중 어느 하나의 면역접합체, 항목 18의 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 항목 19의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 대상체의 암을 치료하는 방법.
38. 상기 암은 소화기 계통의 암인 항목 37의 방법.
39. 상기 소화기 계통의 암은 위암, 췌장암 또는 식도암 중 어느 하나에서 선택되는 항목 38의 방법.
도 1은 인간 hCLDN18.2-TCE(T-세포 에피토프 펩티드) 레트로바이러스 발현 플라스미드가 HEK293-T 세포로 일시적 형질감염된 것을 나타낸다.
도 2는 hCLDN18.2-TCE 렌티바이러스 입자로 형질감염되었고, 유세포 분석에 의해 높은 레벨의 hCLDN18.2-TCE를 발현하는 마우스 종양 세포가 분류된 것을 나타낸다.
도 3은 hCLDN18.2, hCLDN18.1, 및 mCLDN18.2, mCLDN18.1 안정적 형질감염 세포주의 유세포 분석을 나타낸다.
도 4는 양성 대조군 항체 43A11, 175D10 및 163E12의 SDS-PAGE 검출을 나타낸다.
도 5는 확인 스크리닝에서 HEK293-hCLDN18.2 세포 및 HEK293-hCLDN18.1 세포에 대한 양성 하이브리도마 양성 클론의 결합을 나타낸다.
도 6은 검증 스크리닝에서 5개 세포주에 대한 일부 양성 하이브리도마 클론의 유세포 분석을 나타낸다.
도 7은 일부 양성 하이브리도마 클론의 상청액의 ADCC 효과를 나타낸다.
도 8은 하이브리도마 모노클로날 상청액에 의한 HEK293-hCLDN18.2 세포의 유세포 분석을 나타낸다.
도 9는 양성 하이브리도마 모노클로날 중쇄 및 경쇄 V 영역의 PCR 증폭을 나타낸다.
도 10은 정제된 모노클로날 항체 단백질의 감소된 CE-SDS 순도 검출을 나타낸다.
도 11은 정제된 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체 단백질의 데글리코실화 환원 LC/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 정제된 인간-마우스 키메라 모노클노날 항체의 ADCC 효과를 나타낸다.
도 13은 일부 위암 조직 절편에 대한 3-L4 및 4-I17의 IHC 염색을 나타낸다.
도 14는 정상 위 조직의 동결 절편에 대한 하이브리도마 클론 상청액의 IHC 염색을 나타낸다.
도 15는 인간 정상 조직에 대한 4-B23 하이브리도마 클론 상청액의 비특이적 IHC 염색을 나타낸다.
도 16은 5-M9 및 9-D1 Fv 영역의 상동 3D 모델링을 나타낸다.
도 17은 CDR에 대한 이식 수용체 프레임워크로서 인간 생식계열 유전자와 5-M9 및 9-D1의 VH 및 VL의 서열 정렬을 나타낸다.
도 18은 9-D1 인간화 항체 분자 단백질의 정제 후 감소된 SDS-PAGE 검출을 나타낸다.
도 19는 미열처리/열처리 후 HEK293-hCLDN18.2에 대한 5-M9 키메라 항체 및 인간화 항체의 결합을 나타낸다.
도 20은 곤충 배큘로바이러스에 대한 5-M9 키메라 항체 및 인간화 항체의 비특이적 결합을 나타낸다.
도 21은 hCLDN18.2 저발현 위 종양 세포주 KATO III에 대한 9-D1 및 그것의 인간화 항체의 결합을 나타낸다.
도 22는 인간화 항체 h5M9V7의 DSF 및 SLS 패턴을 나타낸다.
도 23은 9-D1 인간화 항체의 DSC 스캔 패턴을 나타낸다.
도 24는 9-D1 인간화 항체 분자의 SEC 패턴을 나타낸다.
도 25는 위암의 동결 절편에 대한 9-D1 및 5M9 인간화 항체의 IHC 염색을 나타낸다.
도 26은 정상 인간 주요 장기 조직에 대한 9-D1 및 5M9 인간화 항체의 IHC 염색을 나타낸다.
도 27은 종양 보유 마우스에 대한 9-D1 인간화 항체의 항종양 효과를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 출원의 구체적인 실시예를 더욱 구체적으로 설명한다. 본 출원의 구체적인 실시예가 도면에 의해 도시되어 있지만, 본 출원은 다양한 형태로 구현될 수 있으며 본원에서 설명하는 실시예에 의해 한정되지 않아야 함을 이해해야 한다. 오히려, 이들 실시예는 본 출원이 보다 명확하게 이해될 수 있도록 하고, 당업자에게 본 출원의 범위가 충분히 전달될 수 있도록 제공되는 것이다.
1. 정의
용어 "항체"는, CLDN18.2에 결합하고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 폴리클로날 특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체) 및 CLDN18.2에 대한 원하는 결합 활성을 나타내는 한, 항체 단편(예를 들면, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, 및 F(ab')2), 선형 항체 및 단일 사슬 항체 분자(예를 들면, scFv) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 본원에 개시된 CDR 도메인 중 하나 이상을 포함하는 다양한 항체 구조 분자를 포괄하는 넓은 의미로 본원에 사용된다.
당업자는 본 출원에 개시된 하나 이상의 CDR 도메인을 하나 이상의 다른 폴리펩티드 서열과 융합하여 CLDN18.2 분자, 예를 들면 백신, 세포막 수용체 안타고니스트, 신호전달 경로 조절제 및 키메라 항원 수용체 분자 등에 결합하는 기능성 융합 단백질 또는 폴리펩티드 분자를 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 출원에 개시된 하나 이상의 CDR 도메인을 사용하여 CLDN18.2 CAR-T(키메라 항원 수용체 T-세포 면역요법) 분자를 제조할 수 있다. 본 출원에 개시된 서열에 기초하여 유도 및 제조된 이러한 융합 단백질 분자도 본 출원의 보호 범위에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"에서 수식어 "모노클로날"은 항체가 미량의 자연 발생 돌연변이 또는 모노클로날 항체의 제조 동안에 발생하는 돌연변이만을 포함하는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 것을 의미한다. 전형적으로 상이한 에피토프에 특이적인 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제조와 비교해서, 모노클로날 항체 제조에서의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 특이적이다. 본 출원의 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "전장 항체" 및 "무손상 항체"는 자연 항체와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 나타내며, 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
항체의 "클래스"는 그것의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 나타낸다. 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스(동형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나눌 수 있다. 다양한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 한다.
"키메라 항체"는 하나의 종으로부터 유래된 중쇄 가변 영역의 적어도 일부와 경쇄 가변 영역의 적어도 일부 및 다른 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 갖는 항체이다. 예를 들면, 하나의 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 적어도 하나, 통상적으로 2개, 또는 실질적으로 전체 가변 도메인을 포함할수 있고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들면, CDR)은 비인간 항체의 것에 상응하고, 또한, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 선택적으로, 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화 형태"(예를 들면, 비인간 항체)는 인간화를 거친 항체를 의미한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발견되는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 서브그룹은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 기재된 것과 같다. 하나의 실시형태에 있어서, VH의 경우, 서브그룹은 Kabat et al.에 의해 기재된 것(상기 참조)과 같은 서브그룹 III이다.
"인간 항체", "완전 인간 유래 항체" 또는 "완전 인간 항체"로도 언급될 수 있는 "인간 항체"는 아미노산 서열이 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 것에 상응하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581(1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95(1991)에 기재된 바와 같이, 파지 디스플레이 라이브러리 기술을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되지만, 내인성 유전자좌가 비활성화된 트랜스제닉 동물(예를 들면, 면역화된 이종 마우스)에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(XENOMOUSETM 기술에 대해서는 예를 들면, 미국특허번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 대해서는, 또한 예를 들면 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562(2006)를 참조한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 초가변 영역("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 지칭됨)의 서열을 갖는 및/또는 구조적으로 규정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체의 가변 도메인의 영역 및/또는 항원 접촉 잔기("항원 접촉")를 포함하는 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR(CDR 영역): VH에 3개(H1, H2 및 H3) 및 VL에 3개(L1, L2 및 L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 HVR(CDR 영역)은 다음을 포함한다:
(a) 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에서 발생한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987));
(b) HVR(CDR 영역)은 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에서 발생한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991));
(c) 항원 접촉은 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)에서 발생한다(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996)); 및
(d) HVR(CDR 영역)의 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)을 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
달리 명시되지 않는 한, 가변 도메인의 HVR(CDR 영역) 잔기 및 다른 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 Kabat et al.(상기 참조)에 따라 본원에서 넘버링된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 나타낸다. 자연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR 영역)을 포함한다. (예를 들면, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed. 참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고, 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그 단편, 예를 들면 핵산분해 효소, 항생제; 독소, 예를 들면 그 단편 및/또는 변이체를 포함하는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소; 당업계에 공지된 다양한 항종양 약물 또는 항암제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 이종 분자를 지닌 항체의 접합체이다.
인터페론 유전자 자극제(STING) 수용체의 아고니스트는, STING 의존적 신호전달 경로를 활성화하여 I형 인터페론의 분비를 촉진하고, 항바이러스 및 항종양 면역과 관련된 단백질의 발현을 촉진하고, 바이러스 복제를 차단하고, 암세포에 대한 면역 반응을 촉진한다. 이러한 분자는 환상 디뉴클레오티드, 아미노벤즈이미다졸, 크산톤, 아크리디논, 벤조티오펜 및 벤조디옥솔과 같은 구조적 클래스의 STING 아고니스트이다.
"대상체" 또는 "개체"는 포유동물이다. 포유동물에는 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에 있어서, 대상체 또는 개체는 인간이다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 지시, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적 패키지에 전형적으로 포함된 지침을 나타내는데 사용된다.
"친화도"는 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그것의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 파트너 구성원(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리상수(Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 예시 및 예시적 실시형태가 이하에 기재된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 상동성의 퍼센트"는 후보 서열을 참조 폴리펩티드 서열과 정렬시키고, 최대 퍼센트 서열 상동성을 달성하기 위해 필요한 경우 및 임의의 보존적 치환이 서열 상동성의 일부로 간주되지 않는 경우에 갭을 도입한 후, 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 규정된다. 아미노산 서열 상동성 퍼센트의 결정은 당업계의 다양한 방식으로 달성될 수 있으며, 예를 들면 상동성 정렬은 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR)과 같은 소프트웨어를 사용하여 행해질 수 있다. 당업자는 정렬되는 서열의 전장을 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적합한 매개변수를 결정할 수 있다.
예를 들면, ALIGN-2를 사용한 아미노산 서열 정렬의 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 아미노산 서열 상동성의 퍼센트는 다음과 같이 계산된다.
100×분수 X/Y
여기서, X는 프로그램이 A를 B와 정렬할 때 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않으면, B에 대한 A의 아미노산 서열 상동성의 퍼센트는 A에 대한 B의 아미노산 서열 상동성의 퍼센트와 같지 않음을 이해할 수 있다. 달리 명시되지 않은 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 상동성의 퍼센트값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 얻어진다.
2. 항체, 제조 방법, 조성물 및 그 물품
1) 항체
본 출원은 항-CLDN18.2 항체에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 본 출원은 이하의 것 중 임의에서 선택된 초가변 영역(HVR) 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 나타내는 결합 도메인을 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 포함하는 항-CLDN18.2 항체를 제공한다: (a) SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO:21에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO:19 또는 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:19 또는 SEQ ID NO:22에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO:20 또는 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:20 또는 SEQ ID NO:23에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:27에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:28에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:29에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 경우에, 항-CLDN18.2 항체에 의해 소유되는 중쇄 가변(VH) 도메인(영역)은 SEQ ID NO:30 또는 SEQ ID NO:31에 대해 적어도 90%(예를 들면, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:30 또는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 항-CLDN18.2 항체에 의해 소유되는 경쇄 가변(VH) 도메인(영역)은 SEQ ID NO:32 또는 SEQ ID NO:33에 대해 적어도 90%(예를 들면, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:32 또는 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 항-CLDN18.2 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
2) 항체 단편
특정 실시형태에 있어서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, (Fab')2, Fv 및 scFv 단편 및 이하에 기재된 다른 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토는 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134(2003)을 참조한다. scFv 단편에 대해서는, 예를 들면 WO 93/16185를 참조한다.
이중기능성 항체는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 지닌 항체 단편이다. 예를 들면, EP 404,097; WO1993/01161을 참조한다. 삼중기능성 및 사중기능성 항체는, 예를 들면 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134(2003)에서 확인할 수 있다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시형태에 있어서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다(예를 들면, 미국특허번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 무손상 항체 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, E. coli 또는 파지) 생성의 단백질 가수분해 소화를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 각종 기술에 의해 생성될 수 있다.
3) 키메라 및 인간화 항체
특정 실시형태에 있어서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체의 제조는 예를 들면, 미국특허번호 4,816,567에서 확인할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 통상, 비인간 항체는 인간화되어 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는, 모든 HVR(CDR) 영역 또는 그 일부가 비인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 그 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 항체의 친화도를 복구하거나 개선하기 위해 비인간 항체로부터의 상응하는 잔기로 대체될 수 있다.
인간화 항체 및 그 생성 방법에 대해서는, 미국특허번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.
4) 인간 항체
특정 실시형태에 있어서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체는 변형된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여한 후, 항원을 챌린지함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체 외에 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에 있어서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법에 대해서는, 예를 들면 미국특허번호 6,075,181 및 6,150,584(XENOMOUSE™ 기술을 설명함); 미국특허번호 5,770,429; 미국특허번호 7,041,870(K-M 기술을 설명함); 및 미국출원공개번호 2007/0061900를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터 유래된 인간 가변 영역은, 예를 들면 이들을 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더욱 변형시킬 수 있다.
또한, 인간 항체는 하이브리도마 기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 하이브리드 골수종 세포주는, 예를 들면 Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991)을 참조하여 기재되어 있다. 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는, 또한 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562(2006)에 기재되어 있다. 다른 방법은, 예를 들면 미국특허번호 7,189,826(하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 IgM 항체의 생성을 설명함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268(2006)(인간-인간 하이브리도마를 설명함)에 기재된 방법을 포함한다.
또한, 인간 항체는 인간 유래의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 제조될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 소망의 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다.
구체적으로, CLDN18.2에 대한 결합 활성을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 친화도가 높은 본 출원의 항체를 단리할 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 소망의 결합 특성을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들면 Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al., eds., Human Press, Totowa, NJ, 2001), Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Edited by Lo, Human Press, Totowa, NJ, 2003) 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에서 확인할 수 있다.
일부 파지 디스플레이 방법에 있어서, VH 및 VL 유전자 계통은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합된 후, 항원 결합 파지에 대해 스크리닝된다. 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허에는, 예를 들면 미국특허번호 5,750,373 및 미국특허공개번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360이 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
5) 다중특이적 항체
임의의 상기 양태에 있어서, 본원에 제공된 항-CLDN18.2 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시형태에 있어서, 하나의 결합 특이성은 CLDN18.2에 대한 것이고, 다른 결합 특이성은 임의의 다른 항원(예를 들면, 제 2 생체분자, 예를 들면 세포 표면 항원, 예를 들면 종양 항원)에 대한 것이다. 따라서, 이중특이적 항-CLDN18.2 항체는 CLDN18.2 및 종양 항원, 예를 들면, CD3, CD20, FcRH5, HER2, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1 또는 TenB2에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현이 포함되지만 이에 한정되지 않으며, WO93/08829, WO2009/08025, 및 WO2009/089004A1 등을 참조한다.
6) 항체 변이체
본 출원의 항체는 본 출원의 항-CLDN18.2 항체의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 더 개선하기 위해 제조된 항체 변이체가 요구될 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 CLDN18.2 항원에 대한 결합 특성과 같은 소망의 특성을 갖는다면, 최종 구축물을 얻기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이체(보존적 치환 돌연변이체 또는 비보존적 치환 돌연변이체를 포함함)는 HVR(CDR) 영역 및/또는 FR 영역의 하나 이상의 부위에서의 치환에 의해 얻어질 수 있다.
아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다.
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 뉴트럴 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe
보존적 치환은 동일한 아미노산의 그룹 간의 치환으로 규정되며, 비보존적 치환은 다른 클래스의 아미노산이 다른 클래스의 아미노산으로 치환되는 것으로 규정된다. 본 출원의 항체 변이체는 본 출원의 항체에 아미노산 치환을 도입하고 소망의 활성(예를 들면, 항원 결합의 유지/개선 또는 ADCC 또는 CDC의 개선)에 대해 생성물을 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다.
본 출원은 변이체가 소망의 CLDN18.2 결합 활성을 여전히 보유하는 한, 비보존적 돌연변이 및/또는 보존적 돌연변이를 포함하는 본원에 개시된 항체에 따라 얻어진 항체 변이체를 포함한다.
하나의 유형의 치환 변이체는 모항체(parent antibody)(예를 들면, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 항체 변이체를 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 얻어진 변이체는 특정 생물학적 특성(예를 들면, 증가된 친화도)과 관련하여 모항체에 비해 변형(예를 들면, 개선)될 것이고, 및/또는 모항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는 예를 들면 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이 기반의 친화도 성숙 기술을 사용하여 간편하게 생성될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 이상의 HVR(CDR) 잔기가 돌연변이되고, 돌연변이된 항체가 파지에 디스플레이되고, 돌연변이된 항체가 특정 생물학적 활성(예를 들면, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
특정 실시형태에 있어서, 이러한 변화가 CLDN18.2에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 손상시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 HVR(CDR) 내에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경이 HVR(CDR)에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, 이러한 변화는 HVR의 항원접촉 잔기 외부에 있을 수 있으며, 예를 들면 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환은 FR 영역의 1, 2, 3, 4, 5개 아미노산 잔기에서 발생할 수 있다.
7) 재조합 방법
본 출원의 항-CLDN18.2 항체는, 예를 들면 미국특허번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 항-CLDN18.2 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL 아미노산 서열 및/또는 VH 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 다른 실시형태에 있어서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터; 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를, (예를 들면, 갖도록 형질전환된다) 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프성 세포(예를 들면, Y0, NSO, Sp20 세포)이다. 하나의 실시형태에 있어서, 항-CLDN18.2 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에 상기 제공된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항-CLDN18.2 항체의 재조합 생성을 위해, 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고(예를 들면, 상기 기재된 바와 같이), 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다.
항체-인코딩 벡터를 클로닝하거나 발현하기에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같은 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 특히, 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않는 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들면 미국특허번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. 발현 후, 가용성 부분의 항체는 박테리아 세포질로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵 생물에 추가하여, 사상성 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 또한 글리코실화 경로가 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 가진 항체를 생성하기 위해 "인간화"된 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215(2006)를 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포에의 결합, 특히 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.
또한, 식물 세포 배양물이 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국특허번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429(트랜스제닉 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명함)를 참조한다.
또한, 척추동물 세포가 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서의 성장에 적합한 포유동물 세포주가 적합할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포 균주의 다른 예는 SV40-형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 균주(COS-7); 인간 배아 신장 세포 균주(예를 들면, 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 셀토 세포(예를 들면, TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); TRI 세포; MRC 5 세포; DHFR-CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NSO 및 Sp2/0 등의 골수종 세포 균주이다.
8) 면역접합체
또한, 본 출원은 화학요법제 또는 화학요법 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들면, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적으로 활성인 독소 또는 그 단편) 또는 방사성 동위원소와 같은 하나 이상의 세포독성제와 조합된 본원의 항-CLDN18.2 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 실시형태에 있어서, 면역접합체는 항체-약물 접합체(ADC)이고, 상기 항체는 메이탄신, 오르리스타틴, 돌라스타틴, 메토트렉세이트, 빈데신, 탁산, 트리코테센 및 CC1065를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된다.
다른 실시형태에 있어서, 면역접합체는 디프테리아 A쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄 및 트리코테센 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 효소적으로 활성인 독소, 또는 그 단편과 본원에 기재된 바와 같은 항-CLDN18.2 항체의 접합체를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 항-CLDN18.2 항체를 방사성 원자와 결합함으로써 형성된 방사성-접합체를 포함한다. 방사성 접합체를 생성하기 위해, 다양한 방사성 동위원소를 사용할 수 있다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들면 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디페이트 하이드로클로라이드), 활성 에스테르(예를 들면, 디숙신이미딜수베레이트), 알데히드(예를 들면, 글루타르알데히드), 비스아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일)헥사메틸렌디아민), 이중 질소 유도체(예를 들면, 비스(p-디아조벤조일)에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 이중 활성 불소 화합물(예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들어질 수 있다.
9) 약학적 제제
본 출원의 항-CLDN18.2 항체의 약학적 제제는 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 소망의 순도의 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 채용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산 등의 완충액; 아스코르브산 및 메틸술피드 아미노산을 포함하는 항산화제; 방부제(예를 들면 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사하이드로카본 4차 암모늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탄올 또는 벤질 알코올; 메틸파라벤 또는 프로필파라벤 등의 p-하이드록시벤조산 알킬 에스테르; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루탐산, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 푸코오스 또는 소르비톨 등의 당류; 나트륨 등의 염-형성 반대이온; 금속 착체(예를 들면, 아연-단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이것에 한정되지 않는다.
예시적인 동결건조된 항체 제제는 미국특허번호 6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국특허번호 6,171,586호 및 WO2006/044908호에 기재된 것을 포함한다.
또한, 본원의 제제는 치료되는 특정 증상에 필요한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가 치료제(예를 들면, 화학요법제, 세포독성제, 성장 억제제, 및/또는 항호르몬제)를 더 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절히 조합되어 존재한다.
10) 제조품
본 출원의 다른 양태에 있어서, 본 출원의 항체 또는 약학적 조성물을 포함하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면 보틀, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 이러한 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 다양한 재료로 형성될 수 있다. 상기 용기는 본 출원의 조성물을 단독으로 보유하거나, 다른 조성물과 조합하여 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알 또는 정맥 내 용액 백일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 출원의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 선택된 종양을 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 본 출원의 항체를 포함하는 조성물을 내부에 포함하는 제 1 용기; 및 (b) 다른 종양 치료 약물 또는 다른 항체를 포함하는 조성물을 내부에 포함하는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 출원의 이 실시형태에서의 제조품은 이러한 조성물이 종양을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 더 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 정균 주사용수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들 및 시린지를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1. 면역 및 스크리닝 물질의 제조
(1) 인간 hCLDN18.2-TCE(T세포 에피토프 펩티드) 레트로바이러스 발현 플라스미드의 구축
hCLDN18.2 cDNA(SEQ ID NO:1)를 클로닝하고, C-말단에서 T-세포 에피토프 펩티드와 융합시켜 hCLDN18.2-TCE를 얻었다. T-세포 에피토프 펩티드는 항원이 면역 관용을 돌파하고 항체 생성을 촉진하게 할 수 있다(Percival-Alwyn J. et al, mAbs, 2015, 7(1), 129-137). hCLDN18.2-TCE를 레트로바이러스 벡터에 클로닝하여 hCLDN18.2-TCE 레트로바이러스 발현 플라스미드를 얻었다. hCLDN18.2-TCE 레트로바이러스 발현 플라스미드를 HEK293-T 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 형질감염 72시간 후에 HEK293-T 세포의 표면 상의 hCLDN18.2 발현을 유세포 분석에 의해 분석했다. 1차 항체(제 1 Ab)는 자제 제작한 양성 대조군(Benchmarker) 키메라 항체 163E12이었다. 세포를 먼저 1차 항체(1㎍/mL)와 함께 4℃에서 45분간 배양하고 PBS로 세척한 후, 알렉사 플루오르 488-표지된 염소 항-인간 IgG 2차 항체(Thermofisher, Cat. No. A-11013))(제 2 Ab, 1:200 희석)를 4℃에서 45분간 배양했다. PBS로 2회 세척한 후 유세포 분석(FACS)을 행했고, 음성 대조군 세포는 2차 항체만으로 배양했다. 결과는 도 1에 나타내어졌고, 이는 야생 HEK293-T 세포의 표면 상에 hCLDN18.2 발현이 없음을 나타내며; hCLDN18.2-TCE 레트로바이러스 발현 플라스미드(HEK293T CLDN18.2 TCE)로 일시적으로 형질감염된 HEK293-T 세포의 80.9%는 hCLDN18.2를 발현하는 양성 세포이었다. 이 벡터 플라스미드는 실시예 2의 (1) DNA 면역 프로토콜에서 사용될 것이다.
(2) 높은 레벨의 hCLDN18.2-TCE를 발현하는 마우스 종양 세포
hCLDN18.2-TCE 레트로바이러스 발현 플라스미드를 렌티바이러스 패키징 플라스미드와 혼합하고, 293-T 세포에 형질감염시켜 hCLDN18.2-TCE 렌티바이러스 입자를 제조했다. hCLDN18.2-TCE 렌티바이러스 입자를 마우스 종양 세포주에 형질감염시키고, 72시간 후, 유세포 분석에 의해 hCLDN18.2-TCE의 높은 발현을 갖는 마우스 종양 세포 풀을 검출 및 분류했다. 1차 항체(제 1 Ab)는 자체 제작한 양성 대조군(Benchmarker) 키메라 항체 163E12이었다. 세포를 먼저 1차 항체(1㎍/mL)와 함께 4℃에서 45분간 배양하고 PBS로 세척한 후, 알렉사 플루오르 488-표지된 염소 항-인간 Fc 2차 항체(제 2 Ab, 1:200 희석)와 함께 배양했다. PBS로 2회 세척한 후, 유세포 분석(FACS)을 수행했고, 음성 대조군 세포는 2차 항체만으로 배양했다. 결과는 도 2에 나타내어졌고, 야생형 마우스 종양 세포(UBER 모체)의 16.8%만이 표면 상에 양성 신호를 가졌고, hCLDN18.2-TCE 레트로바이러스 형질감염된 마우스 종양 세포(UBER CLDN18.2 TCE)는 82.7%의 양성 세포를 가졌다. 유세포 분석에 의해 분류한 후, 최대 95.7%의 마우스 종양 세포가 높은 레벨의 hCLDN18.2-TCE 발현을 가졌다. hCLDN18.2-TCE의 마우스 종양 세포는 (2) 실시예 2의 세포 면역 프로토콜에 사용될 것이다.
3) hCLDN18.2 세포외 루프 클래스 1 바이러스 입자의 제조
Thorsten K.에 의해 공개된 방법(Thorsten K., et al, Cancer Res, 2011, 71(2), 515-527)에 따르면, hCLDN18.2의 세포외 루프1(ECL1)(SEQ ID NO:2)이 B형 간염 바이러스 핵심 항원(HBcAg)의 주요 면역 우성 영역(MIR)에 삽입되었고, ECL1의 N-말단과 C-말단에 각각 G4SG4 링커를 도입하고, 전장 융합 단백질의 C-말단에 6xHis 태그(SEQ ID NO:3)를 추가했다. 융합 단백질의 전장 유전자를 합성하고, pET24a(+) 플라스미드에 클로닝한 후, 융합 단백질의 발현을 위해 BL21(DE3) E. coli 발현 시스템에 형질감염시켰다. 융합 단백질의 정제 후, HBV hCLDN18.2 세포외 루프 1의 바이러스-유사 입자를 재생 완충액에서 제조했다. hCLDN18.2의 세포외 루프 1의 바이러스 유사 입자의 제조는 실시예 2의 (3) 바이러스-유사 입자 다점 반복 면역-세포 면역 프로토콜 및 (4) 바이러스-유사 입자 족근 관절 면역-세포 면역 프로토콜에 사용될 것이다.
(4) CLDN18 안정적 형질감염된 세포주의 구축
hCLDN18.2(SEQ ID NO:4), hCLDN18.1(SEQ ID NO:5), 마우스 mhCLDN18.2(SEQ ID NO:6), 및 mCLDN18.1(SEQ ID NO:7)의 전장 유전자를 각각 합성하였고, pcDNA3.4 벡터 플라스미드에 각각 클로닝했다. 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시키고, 가압 선별을 위해 네오마이신(G418)을 첨가했다. hCLDN18.2, hCLDN18.1, m hCLDN18.2 및 mCLDN18.1의 높은 발현을 갖는 안정적 형질감염 HEK293 세포주는 제한된 희석 방법에 의해 선택되었다. 유세포 분석의 결과는 hCLDN18.2 및 mCLDN18.2로 형질감염된 안정적 형질감염 HEK293 세포 균주(HEK293-hCLDN18.2, HEK293-mCLDN18.2)를 나타내었고, 파라포름알데히드-고정 및 비고정 세포 양방은 자체 제작한 항-CLDN18.2 양성 대조군 항체 163E12 또는 175D10에 의해 특이적으로 인식될 수 있고(도 3의 A, C), 또한 상업적인 광범위한 항-CLDN18 항체(34H14L15, Abcam Cat. No. ab203563)에 의해 인식될 수 있었다(도 3의 A, C). hCLDN18.1 및 mCLDN18.1(HEK293-hCLDN18.1, HEK293-mCLDN18.1)로 형질감염된 안정적 형질감염 HEK293 세포 균주, 파라포름알데히드-고정 및 비고정 세포는 자체 제작한 항-CLDN18.2 양성 대조군 항체 163E12 또는 175D10에 의해 특이적으로 인식될 수 없었지만(도 3의 B, D), 상업적인 광범위한 항-CLDN18 항체(34H14L15)에 의해 인식될 수 있었다(도 3의 B, D). 상기 안정적 형질감염 HEK293은 실시예 3에서 하이브리도마 스크리닝에 사용될 것이다.
(5) 양성 대조군 항체 43A11, 175D10 및 163E12의 제조
인간-마우스 키메라 양성 대조군 항체 43A11 중쇄(SEQ ID NO:8) 및 경쇄(SEQ ID NO:9), 175D10 중쇄(SEQ ID NO:10) 및 경쇄(SEQ ID NO:11), 163E12 중쇄((SEQ ID NO:12)) 및 경쇄(SEQ ID NO:13) 항체 전장 유전자를 각각 합성하였고, 각각 N-말단에 신호 펩티드를 첨가한 후, pcDNA3.4 진핵생물 발현 벡터에 클로닝했다. 43A11, 175D10 및 163E12 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 혼합하였고, 일시적인 단백질 발현을 위해 CHOS 세포에 공동 형질감염시켰고, 상청액을 수집하여 단백질 A로 친화도 정제하고, SDS-PAGE 검출했다. 그 결과는 도 4에 나타내어졌다.
실시예 2 마우스 면역 프로그램 및 하이브리도마 제조
총 4개 면역 프로토콜이 사용되었으며(표 1), 각 면역 프로토콜에 대해 적어도 2개의 다른 계통의 마우스가 사용되었다(표 2). 각각의 면역 프로토콜에 있어서, 일부 마우스 개체는 더 높은 레벨의 혈청 면역 역가를 나타냈다. 각각의 면역 프로토콜에서 높은 레벨의 면역 역가를 가진 마우스 개체를 희생시키고 그들의 비장을 제거했다. B 림프구를 단리, 혼합한 다음, 마우스 골수종 세포주와 전기 융합하여 하이브리도마를 제조했다. 총 3개의 배치의 하이브리도마 제조를 행했다(표 2).
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 3 하이브리도마 스크리닝
3개 배치로부터의 하이브리도마가 클로닝되었고, 제한된 희석 방법으로 배양되었고, 클로닝된 상청액을 유세포 분석에 의해, 3회의 결합 또는 역결합 스크리닝, 항체 타이핑 및 항체-의존적 세포독성 분석을 위해 취해졌다. 하이브리도마 클론은 CLDN18.2에 특이적으로 강하게 결합할 수 있지만 CLDN18.1에는 결합하지 않거나 약하게 결합하였고, 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 기능이 선택되었다. 스크리닝 단계 및 각각의 단계에서의 스크리닝에 의해 얻어진 하이브리도마 클론을 표 3에 요약했다.
Figure pct00003
1) 1차 스크리닝: 높은 레벨의 CLDN18.2-TCE(UBER CLDN18.2 TCE)를 발현하는 마우스 종양 세포주에 대한 각각의 클론의 상청액 발현 생성물의 결합을 유세포 분석을 사용하여 분석했다. 융합된 하이브리도마를 제한된 희석법에 의해 384-웰 플레이트에 접종하고, 배양 10일 후에 상청액을 수집하여 유세포 분석에 의해 양성 하이브리도마 클론을 스크리닝했다. 상청액을 UBER CLDN18.2 TCE 세포(20,000개 세포/웰)와 함께 4℃에서 45분간 공동 배양한 후, 플레이트를 세척하였고, 알렉사 플루오르-488-염소 항-마우스 IgG(ThermoFisher Cat. No. A28175)는 세포측정 검출을 위한 2차 항체로 사용되었고, 평균 형광 강도가 100,000 이상인 클론을 증폭을 위해 스크리닝하고, 확인 스크리닝을 위해 포화 상청액을 수집했다.
3개 배치의 하이브리도마를 배치당 10개의 384-웰 플레이트에서 제한된 희석 방법을 사용하여 클로닝했다. 1차 스크리닝 후, CLDN18.2-TCE의 마우스 종양 세포주에 양성으로 결합하는 341개(MFI>100,000), 336개(MFI>75,000 또는 MFI>80,000) 및 89개(MFI>90,000)의 하이브리도마 클론을 3개 배치의 하이브리도마로부터 얻었다.
2) 확인 스크리닝: 이전 단계에서의 1차 스크리닝된 양성 클론의 상청액 발현 생성물을 각각 HEK293-hCLDN18.2 세포, HEK293-hCLDN18.1 세포 및 HEK293 야생형 세포와 함께 배양했고(20,000개 세포/웰, 4℃, 45분), 증폭을 위한 유세포 분석에 의해 HEK293-hCLDN18.2 세포에 대해서는 양성 결합이지만, HEK293-hCLDN18.1 세포 및 HEK293 야생형 세포에 대해서는 음성 결합인 클론에 대한 스크리닝을 위해 알렉사 플루오르-488-염소 항-마우스 IgG(ThermoFisher Cat. No. A28175)가 2차 항체로서 사용되었고, 검증 스크리닝을 위해 포화 상청액을 수집했다.
확인 스크리닝 후, 3개 배치의 하이브리도마는 HEK293-hCLDN18.2 세포에는 강하게 특이적으로 결합할 수 있지만 HEK293-hCLDN18.1 세포에는 약하게 결합하고 HEK293 야생형 세포에는 결합하지 않는 165개(HEK293-hCLDN18.2 MFI>200,000, HEK293-hCLDN18.1 MFI<100,000), 120개(HEK293-hCLDN18.2 MFI>50,000，HEK293-hCLDN18.1 MFI<40,000) 및 21개(HEK293-hCLDN18.2 MFI>70,000，HEK293-hCLDN18.1 MFI<30,000) 클론을 얻었다. 일부 양성 클론의 FACS 분석은 도 5에 나타내어졌다.
3) 검증 스크리닝: 3개 배치의 하이브리도마의 확인 스크리닝에서 얻은 306(165+120+21)개 양성 하이브리도마의 상청액 발현 생성물을 HEK293-hCLDN18.2 세포, HEK293-hCLDN18.1 세포, HEK293-mCLDN18.2 세포, HEK293-mCLDN18.1 세포, 및 HEK293 야생형 세포와 함께 배양하고(20,000개 세포/웰, 4℃, 45분), 알렉사 플루오르-488-염소 항-마우스 IgG(ThermoFisher, Cat. No. A28175)를 유세포 분석에 의한 분석을 위해 2차 항체로서 사용했다. 5개 세포주에 대한 일부 클론의 유세포 분석 결과를 도 6에 나타냈고, HEK293-hCLDN18.2 세포 및 HEK293-mCLDN18.2 세포에서 양성 클론의 평균 형광 강도(MFI)가 500,000을 초과하는 반면, HEK293-hCLDN18.1 세포, HEK293-mCLDN18.1 세포 및 HEK293 야생형 세포주의 평균 형광 강도는 모두 20,000 미만이었고, HEK293-hCLDN18.2 세포 및 HEK293-mCLDN18.2 세포에서 대부분의 클론(16/20)의 평균 형광 강도(MFI)는 HEK293-hCLDN18.1 세포 및 HEK293-mCLDN18.1 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 50배 초과했다.
4) 항체 타이핑: IgG 분자의 상이한 서브타입은 ADCC 효과를 매개하는 능력도 다르기 때문이다. 3개 배치의 하이브리도마의 확인 스크리닝에서 얻은 306(165+120+21)개 양성 하이브리도마의 상청액 항체 발현 생성물은 항체-의존적 세포 사멸 분석 전에 마우스 항체 서브타입 검출 키트를 사용하여 마우스 항체 서브타이핑이 행해졌다. 306개 클론의 대부분의 서브타입은 ADCC 기능을 가진 마우스 IgG2a, IgG2b 또는 IgG3에 속하며, 몇몇(26/306)만 ADCC 기능을 갖지 않은 IgG1 서브타입(인간 항체 IgG4 서브타입에 대응함)이었다. 일부 클론은 혼합된 서브타입이었고, 하이브리도마 클론이 모노클로날이 아니였기 때문일 것이다. 경쇄는 모두 마우스 κ 서브타입이었다.
5) ADCC 효과 검출
상술한 확인 스크리닝, 검증 스크리닝 및 항체 타이핑 결과를 고려하여, 항체-의존적 세포독성 기능 검출을 위해 128개 양성 클론의 포화 상청액을 선택했다. 이펙터 세포는 2명의 기증자(45번 및 46번)로부터 유래된 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)이었다. 실험 전날 기증자로부터 혈액을 채취했다. 채취한 혈액은 상온에서 보관하고, PBMC는 피콜 구배(Ficoll gradient)를 통해 신선하게 단리했다. 표적 세포는 CLDN18.2(HEK293-hCLDN18.2)를 발현하는 HEK293 세포이었다. 하이브리도마 발현 생성물을 균일하게 4배 희석했다. 신선하게 얻은 PBMC 세포 및 표적 세포를 25:1의 효과 대 표적 비율로 4시간 동안 각각의 샘플과 함께 배양했다. 항체의 ADCC 효과는 세포독성과 관련된 락테이트 데하이드로제나아제(LDH)를 측정함으로써 특성화되었다. 표적 세포가 자발적으로 용해되었을 때 검출된 흡광도값을 0%로 규정하고, 표적 세포가 완전히 용해되었을 때 검출된 흡광도값을 100%로 규정했으며, ADCC 효과는 각각의 테스트 샘플의 상대적 백분율 활성으로 특성화되었다. 일부 클론의 ADCC 효과 결과를 도 7에 나타냈다. 클론의 ADCC 사멸 효과는 평균 20%보다 높았고, 일부 클론(9D-1, 8-O11)의 ADCC 효과는 50%보다 높았다. ADCC 효과는, 마우스 IgG1 서브타입 6-G11 및 4-O2에 대해 10% 미만이었다.
실시예 4. 양성 하이브리도마 클론의 서브클로닝 및 항체 분자 서열의 시퀀싱
동결 보존된 양성 하이브리도마 클론을 회수하여 서브클로닝하였다. 각각의 양성 하이브리도마 클론을 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. 현미경으로 단일 클론을 증폭 및 배양을 위해 선택한 후, 상청액을 수집하고 유세포 분석에 의해 분석하여 HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 서브클론 상청액의 특이적 결합을 검출하였다. 4℃에서 45분 동안 HEK293-CLDN18.2 세포(20,000개 세포/웰)와 상청액을 공동 배양한 후, 플레이트를 유세포 분석 검출을 위한 2차 항체로서 알렉사 플루오르-488-염소 항-마우스 IgG(ThermoFisher, Cat. No. A28175)로 세척하였다. 후속 시퀀싱의 성공률을 보장하기 위해서, 각 하이브리도마에 대해 2개의 단일 클론(클론 A 및 클론 B)을 선택하여 증폭하고, 동결 보존하였다. 서브클로닝된 양성 모노클로날 상청액에 의한 HEK293-hCLDN18.2 세포의 유세포 분석은 도 8에 나타나 있으며, 이는 선택된 모노클로날 상청액이 HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 특이적 결합을 유지함을 나타낸다.
하이브리도마 모노클로날의 VH 및 VL의 DNA 서열은 RACE(rapid amplification of cDNA ends) 방법을 사용하여 증폭되었다. 증폭된 하이브리도마 모노클로날 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA로 역전사시키고 중쇄 또는 경쇄 V 영역을 5'-범용 프라이머와 3'-H, L(κ) 또는 L(λ) FR1 영역 퇴화 프라이머의 조합을 사용한 5'-RACE 반응에 의해 PCR이 실시되었고, 양성 증폭 밴드는 아가로스 겔 전기영동으로 확인되었다. 결과는 도 9에 나타내어지고, PCR 표적 밴드가 모두 합리적인 범위 내에 있음을 보여준다. 아가로스 겔 전기영동 상의 PCR 양성 밴드는 겔을 절단하여 회수되었고, PCR 증폭 단편을 TOPO 클로닝 방법에 의한 시퀀싱을 위해 시퀀싱 벡터에 결찰하였다. 표 4 및 5는 각각 5M9-A 및 9D1-A 클론의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타내었다(5-M9-A 및 9-D1-A는, 클론을 나타내고, 5-M9 및 9-D1은 5-M9-A 및 9-D1-A 클론의 해당 항체를 나타내었다). 여기서, 경쇄 및 중쇄의 CDR 영역은 초티아(Chothia) 넘버링 시스템에 따라 분할되었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 5. 인간-마우스 키메라 항체의 제작 및 특성화
후보 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄의 V영역을 인간 IgG1형 중쇄(G1m17)의 불변 영역(HC) 영역과 인간 카파형 경쇄의 불변 영역(LC)에 각각 융합시키고, 인간-마우스 키메라 중쇄 전장 유전자 및 경쇄 전장 유전자를 합성하고 발현 벡터에 클로닝하여 검증을 위해 시퀀싱하였다. 각 후보 분자의 구성 발현 플라스미드를 증폭시키고 추출하여 아가로스 겔 전기 영동에 의해 검증하였고, 형질감염 물질로서 사용하였다. HEK293 세포(Tuna 293TM)를 무혈청 및 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 현탁액 종자 배양을 위해 진탕 플라스크에 접종하였다. 형질 감염 하루 전, 증폭된 HEK293 세포를 새로운 진탕 플라스크에 접종하고 새로운 배지로 교체하였다. 각각의 후보 마우스 키메라 항체 분자의 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 HEK293 세포에 공동 형질감염시키고, 세포 생존율이 감소할 때까지 유가 배양을 행하였고, 생성물 정제를 위해 상청액을 수집하였다.
우선, 대부분의 세포 잔해 및 불용성 입자가 상청액의 원심분리 및 여과에 의해 제거된 후, 공급 용액을 단백질 A 컬럼에 로딩하였고, 여기서, 필러 상의 단백질 A에 결합된 항체 분자 및 대부분의 불순물은 평형 단계 후에 제거되었다. 낮은 pH 용리액을 사용하여 항체 단백질을 용리하고 분획을 수집하였다. pH를 조정하였고, 한외 여과에 의해 처방 완충액으로 교환하였다. 마지막으로 OD280을 결정하여 단백질 농도를 산출하였다. 정제된 항체 단백질은 모세관 전기영동 나트륨 도데실 설페이트(CE-SDS)를 환원시켜 순도를 테스트하였다. 환원 CE-SDS 검출은 20개의 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체 분자의 순도가 >95%임을 나타내었다(표 6). 일부 항체 단백질의 환원 CE-SDS는 도 10에 나타내어졌다.
Figure pct00006
데글리코실라제(PNGase F)를 사용한 정제된 모노클로날 항체의 데글리코실화 및 디티오트레이톨(DTT)로 경쇄 및 중쇄의 환원 후, 역 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(RP-UPLC/MS)에 의해 분자량 측정을 행하였다. 액상 부분은 Waters ACQUITY UPLC H-Class 시스템을 사용했으며, 이동상 A는 0.1% 포름산(FA)/물이었고, 이동상 B는 0.1% FA/아세토니트릴(ACN)이었고, 크로마토그래피 컬럼은 Waters ACQUITY UPLC Protein BEH C4이었고, 질량 분석법은 전기분무 이온화(ESI; electrospray ionization) 이온 소스가 장착된 Waters Xevo G2-XS Qtof이었고, 스캔 모드는 리솔루션(Resolution)이었다. 표적 피크 화합물의 다중 하전 원자가 상태의 수집된 원시 질량 분석 데이터는 MassLynx 소프트웨어에 의해 디노이징, 평활화 및 디콘볼루션되었으며, 일부 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 총이온 크로마토그램 및 디콘볼루션 스펙트럼은 도 11에 나타내어졌다. 20개의 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체 분자의 분자량 측정 결과를 표 6에 나타내었다. 모든 모노클로날 항체의 질량분석 분자량과 이론분자량의 오차에 대해서, 중쇄가 5Da 이내, 경쇄가 1Da 이내이었고, 이것은 이론치와 일치한다고 간주할 수 있다. 샘플 처리 및 액상 측정 동안에 항체 단백질의 구조적 변화 정도가 다르기 때문에, 크로마토그래피 컬럼에서 중쇄 피크의 체류 시간이 변경되어 피크 분할 현상으로 나타났으며, 질량 분석법에 의해 분할된 2개의 중쇄 피크의 분자량은 일치하였다.
실시예 6. 세포 표면 CLDN18.2에 대한 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체의 친화도 측정
이 실시예에서, 세포 표면 CLDN18.2에 대한 20개의 정제된 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체의 친화도를 유세포 분석에 의해 결정하였다. 세포 표면 단백질 친화도 측정 방법은 Hunter S.A. et al, Methods in Enzymology, 2016, 580, 21-44에 기재된 직접적인 FACS 결합 방법을 참조한다. CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포(HEK293-hCLDN18.2)를 소생시킨 후, 일정 수의 세포에 도달할 때까지 배양 및 계대하였다. 세포를 5×104/mL의 밀도로 1mL 원심분리 튜브에 분배하였고, 원심분리하여 사용하였다. 일련의 항체 농도가 각 모노클로날 항체에 대해 제조되었다(10㎍/mL, 3.3㎍/mL, 1.1㎍/mL, 0.37㎍/mL, 0.1123㎍/mL, 0.0041㎍/mL, 0.0013㎍/mL). 리간드 고갈 효과(리간드 고갈)를 제거하기 위해, 해당하는 리간드 고갈 부피로 희석된 PBS 결합 완충액을 사용하여 항체 농도 시리즈를 제조하였다. HEK293-hCLDN18.2 세포를 혼합하고 리간드 제거 부피로 처방된 일련 농도의 항체와 배양하였고, 평형이 될 때까지 4℃에서 배양하였다. 세포를 4℃에서 원심분리하여 수집하였고, 미리 냉각된 PBS로 세척하고, 4℃에서 30분 동안 형광 염료를 지닌 항-인간 IgG 2차 항체와 배양하고, 미리 냉각된 PBS로 1회 세척한 후, FACS 결합 분석이 실시되었고, 비선형 곡선 회귀 분석을 결과에 따라 행하여 결합 동역학 상수(KD)값을 산출하였다. 결과를 표 7에 나타내었고, 모든 항체의 친화도(KD)가 서브나노몰 수준에 있음을 보여주었다. 일부 항체는 양성 대조군 항체(Benchmark, BM으로도 알려진다) 163E12(중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12이고 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:13이다) 및 175D10(중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10이고, 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11이다)보다 친화도가 3 내지 5배 낮아 거의 피코몰 친화도에 도달하였다.
Figure pct00007
실시예 7. 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체의 항체 의존적 세포독성(ADCC) 기능
본 실시예에서, 정제된 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체의 ADCC 기능은 이펙터 세포 리포터 유전자 방법에 의해 분석되었다. 이 방법의 이펙터 세포는 루시퍼라제(NFAT-RE-Luc)의 유도성 발현에 반응하여 인간 Fc 수용체(FcγRIIIa V158) 및 NFAT(활성화된 T 세포에 대한 핵 인자)를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포주(Promega, G7018)이다. 이펙터 세포가 표적 세포에 결합된 관련 시험 항체의 Fc 영역에 결합하면, 반응 세포 상의 FcγRIIIa 수용체를 활성화하고, 세포내 NFAT 세포 신호전달 경로를 추가로 활성화하고, NFAT 상응하는 루시퍼라제의 발현을 매개한다. ADCC 효과는 이 형광 활성을 정량화하여 결정되었다.
항체 농도를 2㎍/mL부터 5회 연속 희석하여 연속 희석된 항체 샘플의 8개 농도(각각 2000ng/mL, 400ng/mL, 80ng/mL, 16ng/mL, 3.2ng/mL, 0.64ng/mL, 0.128ng/mL, 0.0256ng/mL)를 얻었다. 항체 샘플을 인간 CLDN18.2(HEK293-hCLDN18.2)를 안정적으로 발현하는 표적 세포와 혼합한 후, 이펙터 세포를 첨가하였다. 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 이펙터-표적비는 5:1(75000:15000)이었다. 반응 시스템을 37℃에서 6시간 동안 배양하였고, 플루오레세인 기질을 첨가하였고, 형광 강도(RLU)를 판독하였다. 세로 좌표의 유도 배수는 이하의 식으로 산출되었다:
유도 배수 = (유도 형광 강도-배경 형광 강도)/(무항체 대조군 형광 강도-배경 형광 강도)
20개의 정제된 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체의 ADCC 효과 결과를 도 12에 나타내었고, 상응하는 ADCC 최대 사멸 및 절반 유효 용량(EC50)을 표 8에 나타내었으며, 대부분의 항체(17/20)가 양성 대조군 항체(163E12)보다 절반 유효 용량에서 더 강한 ADCC 효과를 가짐을 보여주었다. 2-B8-A 클론의 최대 사멸은 대조군 항체보다 현저히 낮았다. 이들 중, 5-M9-A 모노클로날 항체의 EC50(0.287pg/mL)은 양성 대조군 항체(19.5pg/mL)보다 현저히 높았고, 그 최대 사멸(40배)도 대조군 항체(36.3배)보다 현저히 높았다.
Figure pct00008
실시예 8. 위암 조직 동결 조직 칩, 정상 위 조직 및 중요 장기 조직에 대한 하이브리도마 항체의 면역조직화학(IHC) 연구
본 실시예에서, 면역조직화학적 방법을 사용하여 동결 조직 칩 상의 위암 조직 및 정상 위 조직에 대한 20개의 하이브리도마 항체의 결합을 검출하였다. 우선, 20개의 하이브리도마 상청액 중 마우스 IgG 항체의 농도를 ELISA법으로 정량한 후, 하이브리도마 상청액의 마우스 IgG 정량 결과에 따라 하이브리도마 상청액을 희석하였고, 위점막 상피샘 상의 하이브리도마 상청액의 IHC는 정상 위 조직의 동결 절편에 대해 검증하였고, 검증된 IHC 조건을 사용하여 인간 정상 위 조직 및 위암 조직 동결 칩(Tissue Micro Array, TMA)(BioMax, FST401)에 대한 20개의 하이브리도마 상청액의 IHC 연구를 행했다. 동결된 조직 칩을 검증된 농도의 각 하이브리도마의 상청액과 37℃에서 배양하였고, 이어서 PBS 완충액으로 3회 세척한 후, HRP 표지 항마우스 IgG 2차 항체와 37℃에서 배양하여 디아미노벤지딘(DAB)을 이용해서 발색시켰다. 표 9는 16개의 위암 조직과 4개의 정상 위 조직을 포함하는 동결 TMA에 대한 20개의 하이브리도마 클론의 상청액의 IHC 결과를 요약한 것이다. 이들 중, 위암 조직에서의 5-M9, 3-N12, 3-L4, 9-D1 및 4-B23의 양성 염색률은 모두 67%보다 높았지만, 정상 위 조직 상피 세포의 염색에서, 9-D1의 양성 염색률은 단지 25%이었고, 이것은 다른 4개 클론보다 현저히 낮았고(>50%), 이는 9-D1 항체가 위 종양 조직에서 더 높은 양성 염색을 가짐과 동시에, 정상 위 점막 상피에 약하게 결합하는 것을 나타내었다. 이는 치료용 항체로서 9-D1이 종양외 표적에 대해 발현된 정상 조직에서 더 낮은 독성(on target off tumor)을 갖는다는 것을 의미하며, 이는 9-D1 항체가 약물성에서 강한 이점을 가질 수 있음을 시사하였다. 최근 몇 년 동안 치료 항체를 스크리닝함에 있어서, 종양 조직의 표적에 대한 강한 결합과 정상 조직의 표적에 대한 약한 결합을 갖는 스크리닝 항체가 새로운 경향이었다. 종양 조직의 특수한 생리학적 환경 때문에, 종양 세포 상의 다수의 표적의 분자 구조는 정상 조직에서 정상 기능을 유지하는 표적의 분자 구조와 다르며, 종양 표적 특이적 항체의 스크리닝은 이러한 차이를 구체적으로 인식할 수 있다(Garrett T.P.J. et al, PNAS, 2009, 106(13), 5082-5087). 일부 위암 칩 조직에 대한 3-L4 및 4-I17의 IHC 염색의 예는 도 13에 나타내어졌다.
Figure pct00009
참고: 칩 절편에서 * 괄호 안의 숫자는 염색 강도이고, # 백분율은 양성 세포의 백분율이다. 양성 통계(Pos. Rate) 부분에서, $ 백분율은 모든 위암 칩과 정상 위 조직 칩에서의 항체의 양성률이다. 현미경으로 관찰한 C5-6 조직점에는 위암 세포가 없으며 통계에 포함되지 않는다.
4-B23이 정상 위 동결 조직 절편에 대해 IHC 조건 탐색을 실시했을 때, 매우 명백한 비특이적 강한 IHC 염색이 확인되었고, 비특이적 염색은 주로 위 조직의 평활근에 집중되었다는 점은 주목할 가치가 있다. 도 14는 정상 위 조직의 동결 절편에 대한 B23 및 일부 다른 클론의 IHC 염색을 나타내었다. 화살표는 위선 하층의 평활근과 혈관의 평활근에서의 4-B23의 강한 비특이적 착색을 나타내었다. 다른 클론의 양성 염색은 위선에 위치한 상피 세포에 특이적이었다.
정상 인간 심장, 간, 비장, 폐 및 신장 동결 조직에 대한 5개의 하이브리도마(4-B23, 3-N12, 5-M9, 8-O11 및 3-L4)의 모노클로날 상청액의 IHC 염색 결과는 이하 표 10에 나타낸 바와 같이 요약되었다. 이들 중, 양성 대조군 항체(163E12), 3-N12, 5-M9, 8-O11 및 3-L4는 정상 인간 심장, 간, 비장, 폐 및 신장의 동결 조직에 대한 IHC 염색에 대해 음성이었고, 4-B23에 대해서는 상기 언급한 모든 중요한 장기의 조직에 대해 강한 양성 염색이 나타났다. 도 15는 HEK293-hCLDN18.2 세포 블록의 동결 절편에서 4-B23에 대한 양성 염색 및 HEK293-hCLDN18.1 및 HEK293에 대한 음성 염색을 나타내었지만, 강한 염색 부위를 갖는 심장, 폐 및 신장에 대한 양성 염색은 모두 정상 위 조직의 점막하 평활근의 비특이적 염색과 일치하는 평활근에 위치하였다. 이것은 4-B23이 비특이적 결합으로 인한 예상치 못한 임상 독성을 가질 수 있어 약물 가능성이 없음을 시사하였다.
Figure pct00010
실시예 9. 모노클로날 항체 5-M9 및 9-D1의 서열 인간화
항체 5-M9 및 9-D1의 서열 인간화는 항체 3D 모델링에 기초한 방식으로 행해졌고(Kurella et al., Methods Mol. Biol., 2018, 1827, 3-14), 설계 프로세스는 상용 Schrodinger의 Bioluminate 소프트웨어를 사용하여 행해졌다. 우선, 항체의 중쇄 V 영역과 경쇄 V 영역의 상동성 모델링을 행하였고, 가장 높은 서열 상동성을 갖는 VH 및 VL 구조를 PDB(Protein Data Bank) 데이터베이스에서의 기존 항체 서열과 서열 정렬시킴으로써 탬플릿으로서 선택하였다. 모델링되는 항체의 VH 및 VL을 별도로 3D로 모델링하였다. 이어서, 3D 모델링된 VH 및 VL 프레임워크 영역을 분석하였고, CDR 영역, 캐노니칼 폴드, 버니어 영역 및 VH/VL 결합 영역(계면)의 중요한 아미노산 잔기를 할당하였다. 인간화될 항체의 VH 및 VL을 인간 항체의 생식계열 유전자와 정렬시킴으로써, 가장 높은 수준의 상동성을 갖는 인간 생식계열 유전자가 인간화를 위한 탬플릿으로서 확인되었고, 이어서 인간화될 항체의 CDR을 상응하는 인간 생식계열 유전자 프레임워크 영역 내로 이식되었다. CDR 이식된 인간 프레임워크 영역에서 중요한 아미노산을 복원할지 여부를 결정하기 위해 3개의 기본 원리가 사용되었다: 1) 3D 구조 상의 인간 프레임워크 영역의 아미노산 잔기가 CDR 영역, 캐노니칼 폴드, 버니어 영역 및 VH/VL 결합 영역(계면)에 대한 새로운 접촉 부위(이온 결합, 수소 결합 및 소수성 상호작용)를 생성하면, 프레임워크 영역의 상응하는 인간 아미노산 잔기가 마우스 프레임워크 영역의 상응하는 잔기로 돌연변이되었다; 2) 3D 구조의 원래 마우스 유래 프레임워크 영역 및 CDR 영역, 캐노니칼 폴드, 버니어 영역 및 VH/VL 결합 영역(계면)에 원래 접촉 부위의 아미노산 잔기(이온 결합, 수소 결합 및 소수성 상호작용)가 있는 경우, 상응하는 인간 프레임워크 영역의 아미노산 잔기로 대체 후, 접촉 부위가 약화되거나 사라지고, 프레임워크 영역의 상응하는 인간 유래 아미노산 잔기가 마우스 유래 프레임워크 영역에 상응하는 것으로 재돌연변이되었다; 3) 일반적인 마우스 유래 캐노니칼 폴드, 버니어 영역 및 VH/VL 결합 영역(계면)의 아미노산 잔기를 인간 유래 아미노산 잔기로 대체하려면, 신중한 연구와 신중한 치환을 요구한다.
상기 원리에 의해 예측된 인간화 항체에 대해, 3차원 구조에 기초하여 슈뢰딩거(Schrodinger) 소프트웨어는 1) 단백질 표면 분석을 추가로 수행하고 인간화 후 마우스 유래 항체의 표면에 비해 더 큰 소수성 노출 영역을 형성하는 아미노산에 주석을 달았다. 인간화 항체가 후속 제조 및 특성화에서 더 많은 응집체를 형성하는 경우, 더 큰 소수성 노출 영역을 갖는 아미노산 잔기가 상응하는 표면 소수성 영역을 파괴하도록 변형되었다; 2) 아미노산 번역 후 변형 분석은 인간화 후, 번역 후 변형이 일어나기 쉬운 아미노산 측쇄에 대해, 3D 구조 표면에 > 50% 노출된 아미노산 잔기에 주석을 달았다. 인간화 항체가 후속 제조 및 특성화에서 번역 후 변형이 있는 경우, 표면 노출이 있는 고위험 번역 후 변형 아미노산 잔기가 변형되었다; 3) 항체 서열의 면역원성 분석은 T 세포 에피토프 분석, B 세포 에피토프 분석 및 MHC II 에피토프 분석으로 이루어졌으며, 항-약물 항체(ADA) 생산을 위한 면역원성이 높은 펩타이드의 위치에 주석을 달았다.
도 16은 PBD 데이터베이스의 3KJ4 및 4M61을 각각 템플릿으로 사용하여 5-M9 및 9-D1 Fv 영역의 상동 3D 모델을 나타내고, 진한 적색 영역은 CDR 영역이었고, 백색 및 회색 영역은 VH/VL 계면-결합된 아미노산 잔기이었고, 황색 영역은 캐노니칼 폴드 아미노산 잔기이었고, 녹색 영역은 버니어 영역 아미노산 잔기이었다. 도 17은 각각 5-M9 및 9-D1에 대해 가장 높은 VH 및 VL 상동성을 갖는 인간 항체 생식계열 유전자 IGHV4-4*8, IGKV4-1*01, IGHV1-46*01 및 IGKV4-1*01을 나타내었고, 인간 생식계열 유전자에 상응하는 프레임워크 영역은 각각 5-M9, 및 9-D1 VH 및 VL CDR의 이식을 위한 수용 프레임워크가 될 수 있다. 어두운 영역은 CDR 영역, 캐노니칼 폴드 및 버니어 영역에서의 민감한 아미노산이었고, 어두운 영역을 제외한 황색 영역은, 아미노산 잔기가 인간 생식계열 유전자와 마우스 유래 항체 서열 사이의 차등 아미노산인 것을 나타내었다.
각각의 항체 서열의 VH 및 VL에 대해 각각 3-4개의 인간화 서열을 제공하였다. 표 11은 VH 및 VL의 마우스 유래 서열과 이에 상응하는 인간화 서열의 인간화 정도를 나타낸 것이고, VH의 인간화 정도는 마우스 유래 서열의 약 60%에서 최대 약 80%까지 증가되었으며, VL의 인간화 정도는 마우스 유래 서열의 약 80%에서 최대 약 90%로 증가되었다. 인간화 중쇄 및 경쇄에 대해 전장 유전자 합성을 행하였고, 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 각각 인간 IgG1(G1m17) 중쇄 및 인간 κ유형 경쇄이었다. 전장 유전자를 발현 플라스미드에 클로닝하고, 항체 발현을 위해 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 치환하고, 결합하고, HEK293으로 공동 형질감염시켰다. 표 12는 VH/VL 인간화 서열의 순열 및 조합에 따른 인간화 분자의 발현을 나타낸 것으로, 5-M9는 총 12개의 인간화 분자를 발현하고, 9-D1은 총 9개의 인간화 분자를 발현함을 나타내었다. 도 18은 정제된 9-D1 인간화 항체 분자 단백질의 환원 SDS-PAGE 전기 영동도를 보여주었으며, 이는 9개 인간화 버전의 전기 영동 순도가 >95%이었고, 중쇄 및 경쇄 밴드의 분자량이 대조군 인간 유래 IgG1 항체의 위치와 일치한다는 예상에 따랐다.
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 10. 세포 표면 hCLDN18.2에 대한 인간화 항체의 결합 활성 분석
본 실시예에서, 세포 표면 상의 hCLDN18.2에 대한 5-M9 및 9-D1 인간화 항체의 결합 활성을 결정하기 위해 유세포 분석을 사용하였다. 양호하게 성장된 HEK293-hCLDN18.2 안정적으로 형질감염된 세포주와 유세포 분석에 의해 분류 및 강화된 hCLDN18.2 저발현 KATO III 인간 위암 세포주를 트립신으로 분해하였고, 재현탁하여 세포 농도를 1.5×106~2×106/mL로 조정하였고, 96웰 U-플레이트에 100μL/웰(150,000~200,000개 세포/웰)로 첨가되었다. 1% 소태아 혈청(FBS)이 포함된 PBS 완충액으로 1회 세척하였다. PBS(+1% FBS)에 제조된 시험 농도의 항체 용액(100μL/웰)을 첨가하였고, 세포와 혼합하였고, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 200g에서 원심분리하였고, PBS(+1% FBS)로 1회 세척하였다. PBS(+1% FBS) 또는 알렉사 플루오르 488-접합 염소 항인간 IgG(H+L) 2차 항체(Thermofisher, Cat. No. A-11013)에 1000배 희석된 Cy3-Conjugated AffiniPure 염소 항인간 IgG 2차 항체(Jackson labs, Cat. No. 109-165-003)를 100μL/웰로 첨가하였고, 세포와 혼합하였고, 4℃에서 45분 동안 배양하였다. 세포를 200g에서 원심분리하였고, PBS(+1% FBS)로 2회 세척한 후, 유세포 분석을 위해 100μL의 PBS(+1% FBS)에 재현탁하였다. 5-M9의 12개 인간화 분자의 예비 FACS 결합 분석에서, HEK293 세포의 항체 발현 상청액을 사용하였고, 상청액 중 항체 농도를 Problife로 정량화하고 ELISA로 보정하였다. 열처리가 항체의 결합 특성에 미치는 영향에 대한 연구에서 테스트할 항체를 PCR 기기에서, 70℃에서 5분 동안 열처리한 후, 결합을 위해 세포와 함께 배양하였다.
다당류, 지질 및 단백질에 대한 인간화 항체의 비특이성을 평가하기 위한 연구에서, ELISA 방법을 사용하여 곤충 배큘로바이러스(BV)의 결합 능력에 대한 항체의 효과를 검출하였다(Hotzel et al, mAbs, 2012, 4(6), 753-760). 곤충 바이러스 외피는 많은 지질, 다당류 및 단백질을 함유하였고, 인간 세포 및 조직과 유사한 생화학적 혼합물 특성을 가졌다.
곤충 배큘로바이러스에 대한 항체의 결합 능력은 생체내 항체의 비특이적 결합 위험을 어느 정도 평가할 수 있다. 곤충 배큘로바이러스는 곤충 세포에 배큘로바이러스 플라스미드를 감염시켜 얻었다. 곤충 배큘로바이러스를 PBS로 1:500 희석하였고, 96-웰 플레이트에 밤새 4℃에서 50μL/웰로 코팅하였다. 플레이트를 PBS(300μL/웰)로 3회 세척하였고, 실온에서 1시간 동안 1% BSA(200μL/웰)로 블로킹하였고, 상기 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 상이한 농도(100μL/웰)의 항체를 첨가하였고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS(300μL/웰)로 6회 세척하였다. 1:5000 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 2차 항체(100μL/웰)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트를 PBS(300μL/웰)로 6회 세척하였다. H2O2-Amplx(100μL/well)를 첨가하였고, 암소에서 실온에서의 값을 판독하였다.
표 13은 h5M9V7, h5M9V10 및 h5M9V12가 12개의 인간화 분자 모두에서 높은 결합 활성을 갖는 미열처리/열처리 후의 HEK293-hCLDN18.2에 대한 5-M9 인간화 항체 발현 상청액의 결합 특성을 나타내었고, 상기 안정한 결합 특성은 항체를 70℃에서 5분간 열처리한 후에도 여전히 유지되었다.
Figure pct00013
h5M9V7, h5M9V10 및 h5M9V12의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 이하와 같다:
Figure pct00014
미열/열 처리 후의 HEK293-hCLDN18.2에 대한 5-M9 키메라 항체(Chi 5-M9), h5M9V7, h5M9V10 및 h5M9V12(각각 h5M9-V7, h5M9-V10 및 h5M9-V12라고도 함)의 정제된 항체의 결합 특성은 도 19에 나타내었고, 정제된 인간화 항체 h5M9V7, h5M9V10 및 h5M9V12는 Chi 5-M9 항체와 유사한 결합 특성을 가졌다. 70℃ 열처리 후 3개의 인간화 분자의 결합 특성은 Chi 5-M9와 일치하였고, 열적 불안정성을 나타내지 않았다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 5-M9 및 그의 인간화 항체의 비특이적 결합의 위험을 평가하기 위한 연구에서, 참조 대조군(Rituxan) 및 Chi 5-M9 항체와 비교하여, 인간화 항체는 상대적으로 향상된 고농도로 비-특이적 결합을 나타내었고, 이는 h5M9V7이 가장 약한 비특이적 결합을 나타내었다.
hCLDN18.2 저발현 세포주에 대한 시험된 항체의 결합 특성은 항체의 임상 적용을 평가하는데 가치가 있었고, 환자의 위 종양에서 CLDN18.2의 발현 수준이 임상 실습에서 균일하지 않았고, 거의 1/3은 저수준 발현이었기 때문에, 단일 종양 발현은 불균일하였다(Zhu G. et al, Sci Rep, 2019, 9, 8420-8431). 도 21은 hCLDN18.2 저발현 위 종양 세포주 KATO III에 대한 9-D1 및 그 인간화 항체의 결합을 나타내었다. KATO III에 대한 9-D1 및 그의 인간화 분자의 결합은 유사하였고, 양방 모두 강한 결합능을 나타내었고(도 21, A), EC50(0.4~0.5μg/mL)은 양성 대조군(Benchmark) 175D10의 절반에 불과하였고(약 0.8μg/mL), 최대 결합 강도(800~1000MFI)는 175D10(300~600MFI)의 2배이었다. 9-D1 및 KATO III에 결합된 그의 인간화 분자의 최대 양성 세포율(80%-95%)은 양성 대조군 175D10(30%-40%)의 2배이었다(도 21, B).
Figure pct00015
실시예 11. 인간화 항체의 물리화학적 특성 분석
이 실시예에서, 다양한 방법을 사용하여 5-M9 및 9-D1 및 이들의 인간화 항체 분자의 열 안정성, 응집체 형성 및 순도에 대한 물리화학적 특성을 분석하였다.
항체 열안정성 분석: 시차 주사 형광(DSF) 및 정적 광주사(SLS)는 Uncle 시스템(UNCCHAINED LABS)에서 분석되었으며, DSF 및 SLS의 온도 검출 범위는 20℃~95℃, 가열 속도는 1℃/분이었고, 파장 266nm 및 473nm에서의 정적 광산란을 검출하였고, 융점(Tm) 및 열응집(Tagg)을 Uncle 시스템 소프트웨어로 분석하였다. 시차 주사 열량계(DLC) 검출 기기는 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC이었다. 가변 온도 범위는 25℃~100℃이었고, 스캔 속도는 1℃/분이었다. 블랭크 용액으로서 테스트 샘플 완충액을 사용하여 스캐닝한다. 원시 데이터는 MicroCal VP-Capillary DSC 자동 분석 소프트웨어로 처리되었다.
항체 응집체 분석: Uncle 시스템에서 동적 광산란(DLS)을 행했으며, 테스트 온도는 25℃이었고, 분석은 Uncle 시스템 소프트웨어로 행하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 검출 장비는 PDA 검출기가 장착된 Waters Alliance e2695 시스템이었다. 컬럼은 TOSOH TSKgel G3000SWXL, Cat. No. 0008541이었다. 이동상은 0.1M 인산염 완충액, 0.1M 염화나트륨, pH 6.8이었다. 유속은 1.0mL/분, 등용매 용리이었다. 컬럼 온도는 25℃이었고, 검출 파장은 280nm이었고, 주입 부피는 100μg이었다.
IgG 항체에는 각각 고유한 용융 온도(Tm)를 갖는 다중 단백질 도메인을 가졌다. 중쇄 불변 영역 2(CH2)은 일반적으로 PBS 용액에서 약 70℃의 Tm을 갖고, 중쇄 불변 영역 3(CH3)은 약 80℃의 Tm으로 비교적 안정하였다. 항체 Fab 영역은 큰 서열 차이로 인해 약 50℃~85℃의 넓은 범위의 Tm을 가졌다. 그러나, 각 도메인의 Tm은 과도기적이며, 도메인의 Tm값이 가까우므로 도메인이 분리되지 않는 경우가 있다. 5-M9 및 그 인간화 항체의 열안정성 분석 결과를 표 14에 나타내었다. 각 항체는 2개 또는 3개의 Tm을 가지며, 여기서 Tm1은 약 70℃이고, 이는 CH2 도메인의 Tm이어야 한다; Tm2 또는 Tm3은 CH3 또는 Fab 도메인의 Tm이었고; 일반적으로 h5M9V7은 더 높은 Tm값(도 22)과 더 높은 열 안정성을 가졌다. Tagg는 정적 광산란이 응집체의 모양을 감지하기 위해 시작할 수 있는 온도 시작점이었고, 여기서 Tagg 266nm는 작은 응집체 입자의 검출에 민감한 266nm에서 SLS를 측정하였고; Tagg 473nm는 큰 응집체의 검출에 민감한 473nm에서 SLS를 측정하였다. h5M9V7의 Tagg 266nm 및 Tagg 473nm는 다른 인간화 항체 및 5-M9 키메라 항체보다 현저하게 높았다(도 22).
Figure pct00016
9-D1 항체 및 이의 인간화 항체의 시차 주사 열량계(DSC) 검출 패턴을 도 23에 나타내었고, 상응하는 융점(Tm값)을 표 15에 나타내었다. 결과는 각 후보 항체가 우수한 열 안정성을 나타냄을 보여주었다. 항체의 CH2 영역의 열적 안정성을 나타낼 수 있는 Tm1값에 대해서는 모든 후보 항체가 >50℃이었다. 항체의 Fab 영역의 열적 안정성을 나타낼 수 있는 Tm2값에 대해서는 모든 후보 항체가 >65℃이었다. h9D1V1은 다른 인간화 항체보다 Tm값이 현저하게 높았고, Tm1은 다른 인간화 항체보다 5℃ 이상 높았고, Tm2는 다른 인간화 항체보다 3℃ 이상 높아 다른 9-D1에 비하여, 인간화 항체 h9D1V1은 명백한 열적 안정성 이점을 갖는 것을 나타낸다.
Figure pct00017
5-M9 인간화 항체의 응집체 분석은 동적 광산란(DLS) 방법을 사용하였고, DLS 데이터를 표 16에 요약하였다. 항체 모노머의 반경 범위에 부합한, 25℃에서의 각 항체 분자의 입자 반경은 약 9.5nm(피크 1)이었고, IgG 모노머 분자이었으며, 함량%는 약 100%이었다. 다분산 지수 (PDI)는 입자의 분산성을 반영하고, PDI<0.25는 단일 균질 입자로서 고려될 수 있다. h5M9V7 및 h5M9V12 모두에 대한 PDI는 0.25 미만이었고, Chi 5-M9 및 h5M9V10보다 상당히 작았으며, 이는 이들이 양호한 모노머 분산성을 가지며 응집체 형성이 용이하지 않았음을 나타내었다.
9-D1 인간화 항체의 응집체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하였다. SEC 검출 패턴을 도 24에 나타내었다. 9-D1의 각 인간화 항체는 양호한 모노머 순도를 가졌고, 명백한 응집체 및 단편화된 단편은 나타나지 않았음을 알 수 있었다. 여기서, h9D1V3, h9D1V6, h9D1V7 및 h9D1V9 항체의 주요 피크는 약간 테일링되었다. h9D1V1의 주요 피크 형상은 어떠한 태일링 현상없이 최적이었다.
Figure pct00018
실시예 12. 위암 조직 및 정상 인간 주요 장기 조직에 대한 인간화 항체의 IHC 염색
본 실시예에서는 정제된 9D1 및 5M9 인간화 항체를 사용하였고, 항체를 폴리-HRP-폴리머(WO2015171938)와 직접 접합시킨 후 면역조직 화학법을 이용하여 16개 위암 조직 및 5개 정상 인간 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장, 각 조직당 3개) 조직의 동결 절편에 대해 인간화 항체 염색을 검출하였다. Poly-HRP-폴리머-접합된 hIgG 이소타입 항체(ThermoFisher, Cat. No. 12000C)는 음성 대조군으로 사용되었고, Poly-HRP-폴리머-접합된 175D10 항체는 참조 항체(Benchmark)로서 사용되었다. 면역조직 화학법은 동결된 조직 절편을 동결된 아세톤으로 5분 동안 고정한 다음 3% H2O2 PBS 완충액으로 5분 동안 불활성화시키고, PBS로 세척하였고, 5μg/mL Poly-HRP-폴리머 항체 접합체와 함께 5분 동안 배양하였다. 절편을 PBS로 세척하였고, DAB 기질 발색 3분 후 반응을 종결시키고, 현미경으로 촬영하였다. 표 17은 위암 16개 예의 동결 절편에 대한 9D1 및 5M9 인간화 항체의 IHC 염색 결과를 요약한 것으로, 음성 대조군(hIgG 이소타입 항체)의 염색 결과는 모든 조직에서 음성이었고, 참조 항체(Benchmark) 175D10의 양성 염색률은 31.3%(-5/16)이었고, h9D1-V1, h9D1-V2, h5M9-V7 및 h5M9-V10의 양성 염색 비율은 75%(12/16), 62.5%(10/16), 75%(12/16) 및 81.25%(13/16)에 도달하여 참조 항체 175D10보다 현저하게 높았고, 인간화 9D1 및 5M9 항체의 염색 강도는 양성으로 염색된 조직에서 175D10의 염색 강도보다 현저하게 더 강했다(도 25에 도시됨).
다음은 h9D1-V1 및 h9D1-V2(h9D1V1 및 h9D1V2로도 알려짐)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이었다. 이들의 중쇄 불변 영역 서열 및 경쇄 불변 영역 서열은 각각 SEQ ID NO:38 및 SEQ ID NO:39이었다.
Figure pct00019
Figure pct00020
정상 인간 심장(3건), 간(3건), 비장(3건), 폐(3건) 및 신장(3건)의 동결 절편에 대한 9D1 및 5M9 인간화 항체 및 대조군 항체의 IHC 염색 결과를 이하의 표 18에 나타난 바와 같이 요약하였고, 모든 염색 결과는 음성이었다. 도 26은 정상 신장 조직(#125) 및 정상 간 조직(#128)에 대한 항체의 음성 염색 결과를 각각 나타낸 것이다.
Figure pct00021
상기 결과는 인간화 9D1 및 5M9 항체가 참조 항체(Benchmark) 175D10 항체와 비교하여 위암 조직에 대한 특이적 양성 염색률 및 염색 강도가 현저하게 개선되었고, 비표적 주요 장기 조직에 대해 비-특이적 조직 교차 반응성을 갖지 않는 것으로 나타났다. 이는 표적외(off-target) 독성없이 종양 표적화를 최대화하는 9D1 및 5M9 항체의 높은 약물성 특성을 시사하였다.
실시예 13. 종양 보유 마우스에 대한 항체의 항종양 효과
이 실시예는 종양 보유 마우스에 대한 h9D1V1 항체 및 양성 대조군 항체 175D10의 항종양 효과를 연구한다. CB17-SCAD 마우스(Vitamin Lihua, 균주 코드 404)를 실험 동물 사육실에 투입하여 7일간 격리한 후, 세포를 격리하고 테스트에 통과시킨 후 실험에 들어갔다. 마우스에 100μl 부피의 5×106 HEK293-hCLDN18.2 세포(Matrigel(Biocoat, Cat. No. 356234): PBS = 1:1)를 옆구리 중앙에 접종하고, 1일 동안 관찰하였으며, 접종 후 2일째에 무작위로 3그룹(PBS군, 175D10, h9D1V1)으로 나누어 각 그룹 9마리에 복강내 투여(200㎍/마우스, 투여 농도 1mg/mL, 투여량 200μL) , 4주 동안 주 2회)가 시작되었다. 종양 부피는 접종 1주일 후, 그 다음에는 3일마다 측정하고, 체중은 6일마다 1회 측정하였다. One-way-ANOVA, Tukey post-hoc 테스트가 통계, **p<0.01, ***p<0.001에 사용되었다. 결과는 도 27에 나타내었다. PBS 그룹과 비교하여, 175D10 투여 그룹은 종양 성장을 현저하게 억제할 수 있었고 h9D1V1도 종양 성장을 현저하게 억제할 수 있었다. 175D10과 h9D1V1 사이에는 현저한 차이가 없었다. 투여 기간 동안 마우스의 체중은 동일한 경향을 보였고, 투여와 관련된 유의한 변화는 없었다.
서열목록
SEQ ID NO:1
Atggccgtgactgcctgtcagggcttggggttcgtggtttcactgattgggattgcgggcatcattgctgccacctgcatggaccagtggagcacccaagacttgtacaacaaccccgtaacagctgttttcaactaccaggggctgtggcgctcctgtgtccgagagagctctggcttcaccgagtgccggggctacttcaccctgctggggctgccagccatgctgcaggcagtgcgagccctgatgatcgtaggcatcgtcctgggtgccattggcctcctggtatccatctttgccctgaaatgcatccgcattggcagcatggaggactctgccaaagccaacatgacactgacctccgggatcatgttcattgtctcaggtctttgtgcaattgctggagtgtctgtgtttgccaacatgctggtgactaacttctggatgtccacagctaacatgtacaccggcatgggtgggatggtgcagactgttcagaccaggtacacatttggtgcggctctgttcgtgggctgggtcgctggaggcctcacactaattgggggtgtgatgatgtgcatcgcctgccggggcctggcaccagaagaaaccaactacaaagccgtttcttatcatgcctcaggccacagtgttgcctacaagcctggaggcttcaaggccagcactggctttgggtccaacaccaaaaacaagaagatatacgatggaggtgcccgcacagaggacgaggtacaatcttatccttccaagcacgactatgtgtaa
SEQ ID NO:2
TQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPA
SEQ ID NO:3
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAVLCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAGGGGSGGGGSRELVVSYVNINMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRGGSHHHHHH
SEQ ID NO:4
Atggccgtgactgcctgtcagggcttggggttcgtggtttcactgattgggattgcgggcatcattgctgccacctgcatggaccagtggagcacccaagacttgtacaacaaccccgtaacagctgttttcaactaccaggggctgtggcgctcctgtgtccgagagagctctggcttcaccgagtgccggggctacttcaccctgctggggctgccagccatgctgcaggcagtgcgagccctgatgatcgtaggcatcgtcctgggtgccattggcctcctggtatccatctttgccctgaaatgcatccgcattggcagcatggaggactctgccaaagccaacatgacactgacctccgggatcatgttcattgtctcaggtctttgtgcaattgctggagtgtctgtgtttgccaacatgctggtgactaacttctggatgtccacagctaacatgtacaccggcatgggtgggatggtgcagactgttcagaccaggtacacatttggtgcggctctgttcgtgggctgggtcgctggaggcctcacactaattgggggtgtgatgatgtgcatcgcctgccggggcctggcaccagaagaaaccaactacaaagccgtttcttatcatgcctcgggccacagtgttgcctacaagcctggaggcttcaaggccagcactggctttgggtccaacaccaaaaacaagaagatatacgatggaggtgcccgcacagaggacgaggtacaatcttatccttccaagcacgactatgtgtaa
SEQ ID NO:5
Atgtccaccaccacatgccaagtggtggcgttcctcctgtccatcctggggctggccggctgcatcgcggccaccgggatggacatgtggagcacccaggacctgtacgacaaccccgtcacctccgtgttccagtacgaagggctctggaggagctgcgtgaggcagagttcaggcttcaccgaatgcaggccctatttcaccatcctgggacttccagccatgctgcaggcagtgcgagccctgatgatcgtaggcatcgtcctgggtgccattggcctcctggtatccatctttgccctgaaatgcatccgcattggcagcatggaggactctgccaaagccaacatgacactgacctccgggatcatgttcattgtctcaggtctttgtgcaattgctggagtgtctgtgtttgccaacatgctggtgactaacttctggatgtccacagctaacatgtacaccggcatgggtgggatggtgcagactgttcagaccaggtacacatttggtgcggctctgttcgtgggctgggtcgctggaggcctcacactaattgggggtgtgatgatgtgcatcgcctgccggggcctggcaccagaagaaaccaactacaaagccgtttcttatcatgcctcaggccacagtgttgcctacaagcctggaggcttcaaggccagcactggctttgggtccaacaccaaaaacaagaagatatacgatggaggtgcccgcacagaggacgaggtacaatcttatccttccaagcacgactatgtgtaa
SEQ ID NO:6
Atgtcggtgaccgcctgccagggcttggggtttgtggtgtcactgatcgggtttgcgggcatcattgcagccacttgtatggaccagtggagcacccaggatttatacaacaacccggtgaccgctgtattcaactaccaagggctatggcgttcatgcgtccgagagagctctggcttcaccgagtgccgaggctacttcaccctgttggggttgccagccatgctgcaagctgtacgagccctgatgatcgtgggcattgttctgggggtcatcggtatcctcgtgtccatcttcgccctgaagtgcattcgcattggtagcatggatgactctgccaaggccaagatgactctgacttctgggatcttgttcatcatctccggcatctgtgcaatcattggtgtgtctgtgtttgccaacatgctggtgaccaacttctggatgtccacagctaacatgtacagcggcatgggcggcatgggtggcatggtgcagaccgttcagaccaggtacacctttggtgcagctctgttcgtgggctgggttgctggaggcctcaccctgattgggggagtgatgatgtgcatcgcctgccgtggcctgacaccagatgacagcaacttcaaagctgtgtcttaccatgcctctggccaaaatgttgcctacaggcctggaggctttaaggccagcactggctttgggtccaacaccagaaacaagaagatctacgatgggggtgcccgcacagaagacgatgaacagtctcatcctaccaagtatgactatgtgtag
SEQ ID NO:7
Atggccaccaccacgtgccaggtggtagggcttctcctgtccctcctgggtctggccggctgcatagccgccactgggatggacatgtggagcactcaagacctgtatgacaacccagtcaccgccgtgttccagtatgaagggctctggaggagttgcgtgcaacagagctcggggttcaccgagtgccggccatacttcaccatcctgggccttccagccatgctgcaagctgtacgagccctgatgatcgtgggcattgttctgggggtcatcggtatcctcgtgtccatcttcgccctgaagtgcattcgcattggtagcatggatgactctgccaaggccaagatgactctgacttctgggatcttgttcatcatctccggcatctgtgcaatcattggtgtgtctgtgtttgccaacatgctggtgaccaacttctggatgtccacagctaacatgtacagcggcatgggcggcatgggtggcatggtgcagaccgttcagaccaggtacacctttggtgcagctctgttcgtgggctgggttgctggaggcctcaccctgattgggggagtgatgatgtgcatcgcctgccgtggcctgacaccagatgacagcaacttcaaagctgtgtcttaccatgcctctggccaaaatgttgcctacaggcctggaggctttaaggccagcactggctttgggtccaacaccagaaacaagaagatctacgatgggggtgcccgcacagaagacgatgaacagtctcatcctaccaagtatgactatgtgtag
SEQ ID NO:8
Atggaatggacctgggtctttctcttcctcctgtcagtaactgcaggtgtccactcccaggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtgaagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaagcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtactaactacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagatatgattacccctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagcctctacaaagggccccagcgtgtttccactggctccctcctctaagagcacaagcggcggcaccgctgccctgggctgtctggtgaaggactactttccagagcctgtgacagtgagctggaattccggcgctctgacctctggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagtcttccggcctgtactccctgtctagcgtggtgaccgtgcccagctcctctctgggcacccagacatatatctgcaacgtgaatcacaagccttccaatacaaaggtggacaagaaggtggagccaaagtcctgtgacaagacccatacatgccccccatgtcctgctcccgagctgctgggcggcccttccgtgttcctgtttcccccaaagcccaaggataccctgatgatcagcagaaccccagaggtgacatgcgtggtggtggacgtgtcccatgaggatcccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataacgccaagacaaagcctagagaggagcagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtgtctaataaggccctgcctgctccaatcgagaagacaatctctaaggctaagggccagcctcgggagccccaggtgtataccctgcctccatccagagacgagctgaccaagaatcaggtgtctctgacatgcctggtgaagggcttctatccatccgatatcgctgtggagtgggagagcaatggccagcctgagaacaattataagacaaccccacctgtgctggattctgacggcagctttttcctgtattccaagctgaccgtggataagtctagatggcagcagggcaacgtgttctcctgtagcgtgatgcacgaggcactgcataatcactacacccagaagtcactgtcactgagtccaggcaaataa
SEQ ID NO:9
Atgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtccagaggacaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccataacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggttccagcagaagccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtggatctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttacccacccacgttcggaggggggaccaagctggaaataaagagaaccgtggctgccccaagcgtgtttatcttccctccatctgatgagcagctgaagtctggcacagctagcgtggtgtgcctgctgaataacttctaccccagagaggccaaggtgcagtggaaggtggataacgctctgcagtctggcaactcccaggagtctgtgacagagcaggattccaaggacagcacatactccctgtctagcaccctgacactgagcaaggctgactacgagaagcacaaggtgtacgcttgcgaggtcactcatcagggactgtcatctcctgtcactaagagttttaatcgcggcgagtgttga
SEQ ID NO:10
atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccaggtccaactgcagcagcctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagctactggataaactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggatcggaaatatttatccttctgatagttatactaactacaatcaaaagttcaaggacaaggccacattgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcccgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagatcgtggaggggtaactcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagcctctacaaagggccccagcgtgtttccactggctccctcctctaagagcacaagcggcggcaccgctgccctgggctgtctggtgaaggactactttccagagcctgtgacagtgagctggaattccggcgctctgacctctggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagtcttccggcctgtactccctgtctagcgtggtgaccgtgcccagctcctctctgggcacccagacatatatctgcaacgtgaatcacaagccttccaatacaaaggtggacaagaaggtggagccaaagtcctgtgacaagacccatacatgccccccatgtcctgctcccgagctgctgggcggcccttccgtgttcctgtttcccccaaagcccaaggataccctgatgatcagcagaaccccagaggtgacatgcgtggtggtggacgtgtcccatgaggatcccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataacgccaagacaaagcctagagaggagcagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtgtctaataaggccctgcctgctccaatcgagaagacaatctctaaggctaagggccagcctcgggagccccaggtgtataccctgcctccatccagagacgagctgaccaagaatcaggtgtctctgacatgcctggtgaagggcttctatccatccgatatcgctgtggagtgggagagcaatggccagcctgagaacaattataagacaaccccacctgtgctggattctgacggcagctttttcctgtattccaagctgaccgtggataagtctagatggcagcagggcaacgtgttctcctgtagcgtgatgcacgaggcactgcataatcactacacccagaagtcactgtcactgagtccaggcaaataa
SEQ ID NO:11
Atggaatcacagactcaggtcctcatgtccctgctgttctgggtatctggtacctgtggggacattgtgatgacacagtctccatcctccctgactgtgacagcaggagagaaggtcactatgagctgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagaactacttgacctggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattatagttatccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaagagaaccgtggctgccccaagcgtgtttatcttccctccatctgatgagcagctgaagtctggcacagctagcgtggtgtgcctgctgaataacttctaccccagagaggccaaggtgcagtggaaggtggataacgctctgcagtctggcaactcccaggagtctgtgacagagcaggattccaaggacagcacatactccctgtctagcaccctgacactgagcaaggctgactacgagaagcacaaggtgtacgcttgcgaggtcactcatcagggactgtcatctcctgtcactaagagttttaatcgcggcgagtgttga
SEQ ID NO:12
atggattggctgtggaacttgctattcctgatggcagctgcccaaagtatccaagcacagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacaccaacactggagagccaacatatgctgaagagttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaagactgggttttggtaatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcctctacaaagggccccagcgtgtttccactggctccctcctctaagagcacaagcggcggcaccgctgccctgggctgtctggtgaaggactactttccagagcctgtgacagtgagctggaattccggcgctctgacctctggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagtcttccggcctgtactccctgtctagcgtggtgaccgtgcccagctcctctctgggcacccagacatatatctgcaacgtgaatcacaagccttccaatacaaaggtggacaagaaggtggagccaaagtcctgtgacaagacccatacatgccccccatgtcctgctcccgagctgctgggcggcccttccgtgttcctgtttcccccaaagcccaaggataccctgatgatcagcagaaccccagaggtgacatgcgtggtggtggacgtgtcccatgaggatcccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataacgccaagacaaagcctagagaggagcagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtgtctaataaggccctgcctgctccaatcgagaagacaatctctaaggctaagggccagcctcgggagccccaggtgtataccctgcctccatccagagacgagctgaccaagaatcaggtgtctctgacatgcctggtgaagggcttctatccatccgatatcgctgtggagtgggagagcaatggccagcctgagaacaattataagacaaccccacctgtgctggattctgacggcagctttttcctgtattccaagctgaccgtggataagtctagatggcagcagggcaacgtgttctcctgtagcgtgatgcacgaggcactgcataatcactacacccagaagtcactgtcactgagtccaggcaaataa
SEQ ID NO:13
atggaatcacagactcaggtcctcatgtccctgctgttctgggtatctggtacctgtggggacattgtgatgacacagtctccatcctccctgactgtgacagcaggagagaaggtcactatgagctgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagaactacttgacctggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattatagttatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaagagaaccgtggctgccccaagcgtgtttatcttccctccatctgatgagcagctgaagtctggcacagctagcgtggtgtgcctgctgaataacttctaccccagagaggccaaggtgcagtggaaggtggataacgctctgcagtctggcaactcccaggagtctgtgacagagcaggattccaaggacagcacatactccctgtctagcaccctgacactgagcaaggctgactacgagaagcacaaggtgtacgcttgcgaggtcactcatcagggactgtcatctcctgtcactaagagttttaatcgcggcgagtgttga
SEQ ID NO:14
CAGGTACAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGTCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTCATTAACCACCTATGGTGTACAGTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGCAATATGGGCTGGTGGAAACACAAATTATAATTCAGCTCTCATGTCCAGACTGAGCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAAAGGGGGTTACGGGAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCGCCTCA
SEQ ID NO:15
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTATTCATTCACTGACTACCACATGAACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTGATCCTTACTATGGTAGTCCTACCTACAATCATAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCTTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCATCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAACTACGGAAGGGGAAATTCGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO:16
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAGGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAACAGAAATCAGGGCAGCCTCCTAAATTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATTTTTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:17
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTACTCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:18
GFSLTTY
SEQ ID NO:19
WAGGN
SEQ ID NO:20
GGYGNAMDY
SEQ ID NO:21
GYSFTDY
SEQ ID NO:22
DPYYGS
SEQ ID NO:23
YGRGNSFPY
SEQ ID NO:24
KSSQSLLNSGNQKNYLT
SEQ ID NO:25
WASTRES
SEQ ID NO:26
QNDYFFPFT
SEQ ID NO:27
KSSQSLLNSGNQRNYLT
SEQ ID NO:28
WASTRES
SEQ ID NO:29
QNDYSFPFT
SEQ ID NO:30
QVQLKESGPVLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVQWVRQPPGKGLEWLGAIWAGGNTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKGGYGNAMDYWGQGTSVTVAS
SEQ ID NO:31
EIQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYSFTDYHMNWVRQSHGKSLEWIGNIDPYYGSPTYNHKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLISLTSEDSAVYYCANYGRGNSFPYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:32
DIVMTQSPSSLTVTAGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKSGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYFFPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:33
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLLYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSFPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:34
QVQLKESGPGLVAPSETLSITCTVSGFSLTTYGVQWVRQPPGKGLEWLGAIWAGGNTNYNSALMSRLTISKDNSKSQVSLKMSSVTAADTAIYYCAKGGYGNAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:35
DIVMTQSPSSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYFFPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:36
QVQLKESGPGLVAPSETLSITCTVSGFSLTTYGVQWVRQPPGKGLEWLGAIWAGGNTNYNSALMSRLTISKDNSKSQVSLKMSSLTAADTAIYYCAKGGYGNAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:37
DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYFFPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:38
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:39
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:40
QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTDYHMNWVRQAPGKGLEWIGNIDPYYGSPTYNHKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYGRGNSFPYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:41
DIVMTQSPSSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSFPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:42
DIVMTQSPSSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLLYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQNDYSFPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:43
QVQLKESGPVLVAPSQSLSITCTVS
SEQ ID NO:44
GVQWVRQPPGKGLEWLGAI
SEQ ID NO:45
TNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAK
SEQ ID NO:46
WGQGTSVTVAS
SEQ ID NO:47
EIQLQQSGAELVKPGASVKISCKAS
SEQ ID NO:48
HMNWVRQSHGKSLEWIGNI
SEQ ID NO:49
PTYNHKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLISLTSEDSAVYYCAN
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SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI ESCUGEN BIOTECHNOLOGY CO. 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<223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 15 gagatccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactaccaca tgaactgggt gaggcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaaat attgatcctt actatggtag tcctacctac 180 aatcataaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 240 atgcagctca tcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aaactacgga 300 aggggaaatt cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 16 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 16 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gagggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccaac agaaatcagg gcagcctcct aaattgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttattttttt 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 17 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 17 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttac tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagtttt 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 18 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 19 Trp Ala Gly Gly Asn 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 20 Gly Gly Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 21 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 22 Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 23 Tyr Gly Arg Gly Asn Ser Phe Pro Tyr 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 24 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 25 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 26 Gln Asn Asp Tyr Phe Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 27 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 28 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 29 Gln Asn Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 30 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ala Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Gly Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ala Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 31 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Pro Thr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Gly Arg Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Phe Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 33 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 34 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 34 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ala Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Gly Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 35 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Phe Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 36 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 36 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ala Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Gly Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 37 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Phe Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 38 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 39 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 40 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Pro Thr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Gly Arg Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 42 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 43 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 43 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 44 Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 1 5 10 15 Gly Ala Ile <210> 45 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 45 Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp 1 5 10 15 Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp 20 25 30 Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys 35 40 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 46 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ala Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 47 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 48 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 48 His Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 1 5 10 15 Gly Asn Ile <210> 49 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 49 Pro Thr Tyr Asn His Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp 1 5 10 15 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu 20 25 30 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn 35 40 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 50 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Ser Cys 20 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 52 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 53 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 54 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 55 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys 20 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 56 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 57 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 58 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10

Claims (27)

  1. 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 CLDN18.2 항체로서,
    상기 중쇄 CDR은,
    SEQ ID NO:18에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:19에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:20에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
    SEQ ID NO:21에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:22에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:23에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이고,
    상기 경쇄 CDR은,
    SEQ ID NO:24에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:25에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:26에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
    SEQ ID NO:27에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:28에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:29에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR3인, CLDN18.2 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36 또는 SEQ ID NO:40에 나타내어진 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:41 또는 SEQ ID NO:42에 나타내어진 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:30에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:32에 나타내어지고; 또는
    2) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:31에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:33에 나타내어지는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:34에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:35에 나타내어지고;
    2) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:35에 나타내어지고;
    3) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:37에 나타내어지고;
    4) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:40에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:41에 나타내어지고; 또는
    5) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:40에 나타내어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:42에 나타내어지는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체인, 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전장 항체인, 항체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    IgG 항체인, 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CLDN18.2에 결합하는 항체 단편인, 항체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 항체 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2인, 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체인, 항체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 다중특이적 또는 이중특이적 항체는 제 2 생체 분자에 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 상기 제 2 생체 분자는 세포 표면 항원인, 항체.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 세포 표면 항원은 종양 항원인, 항체.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 종양 항원은 CD3, CD20, FcRH5, HER2, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1 및 TenB2로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항체.
  15. 치료제, 인터페론 유전자 자극제(STING) 수용체의 아고니스트, 사이토카인, 방사성 핵종 또는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에 연결된 효소를 포함하는 면역접합체.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 치료제는 화학요법 약물인, 면역접합체.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 치료제는 세포독성제인, 면역접합체.
  18. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
  19. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 하나에 기재된 항체, 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 면역접합체, 또는 제 18 항에 기재된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는, 약학적 조성물.
  20. SEQ ID NO:18-29 중 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  21. 제 20 항에 있어서,
    SEQ ID NO:30-33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
  22. 제 21 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
  24. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 제 23 항에 기재된 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  25. 제 24 항에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항체를 단리하는 것을 포함하는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 제조하는 방법.
  26. 암 치료용 약제의 제조에 있어서의 약학적 조성물의 사용으로서, 상기 조성물은 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 면역접합체, 또는 제 18 항에 기재된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는, 사용.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 암은 위암, 췌장암 또는 식도암인, 사용.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020023702A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 AskGene Pharma, Inc. Novel il-21 prodrugs and methods of use thereof
WO2023045997A1 (zh) * 2021-09-24 2023-03-30 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种抗Claudin18.2抗体及其应用
CN119101162A (zh) * 2023-06-07 2024-12-10 江苏奥赛康生物医药有限公司 一种抗cldn18_2的抗体及体外诊断试剂盒
CN121532213A (zh) * 2023-07-07 2026-02-13 上海诗健生物科技有限公司 一种连接子-药物分子及抗体药物偶联物、其制备方法和应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3167349A (en) * 1961-12-06 1965-01-26 White Automotive Corp Convertible vehicle top construction
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
ITCL20070039A1 (it) 2007-07-10 2009-01-11 Michele Neri Bombolo a pressione costante con tubo estrusore a proboscide e valvola dosatrice, agganciato ad una struttura su cui scorre, azionato da una fonte di pressione controllata, utilizzabile in particolare per la estrusione-lavorazione di tutte le paste:
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
DK3140653T3 (da) 2014-05-08 2022-06-20 Novodiax Inc Direkte immunhistokemianalyse
CA3030257A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Carsgen Therapeutics Co., Ltd. Antibody for anti-claudin 18a2 and use thereof
KR102784161B1 (ko) * 2018-03-08 2025-03-19 페인스 테라퓨틱스 인코포레이티드 항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 용도
EP3765522A4 (en) * 2018-03-14 2022-05-18 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. ANTI-CLAUDIN 18.2 ANTIBODIES
KR20220103820A (ko) * 2018-05-18 2022-07-22 라노바 메디신즈 리미티드 컴파니 항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 사용
EP3808376A4 (en) * 2018-06-17 2021-09-01 L&L Biopharma Co., Ltd. TARGET ANTIBODIES CLDN18.2, BISPECIFIC ANTIBODIES, ADC AND CAR, AND THEIR APPLICATIONS
CN110606891B (zh) * 2018-06-17 2022-12-06 上海健信生物医药科技有限公司 一种针对人cldn18.2的抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
WO2021160154A1 (zh) * 2020-02-10 2021-08-19 上海诗健生物科技有限公司 Cldn18.2抗体及其用途
CN121532213A (zh) * 2023-07-07 2026-02-13 上海诗健生物科技有限公司 一种连接子-药物分子及抗体药物偶联物、其制备方法和应用

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