ES2292682T3 - Purificacion de anticuerpos mediante cromatografia de intercambio ionico. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la purificación de un anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y un contaminante, en el que el contaminante es una variante ácida del anticuerpo, cuyo procedimiento comprende las siguientes etapas realizadas de manera secuencial: (a) la unión del anticuerpo a una resina de intercambio catiónico utilizando un tampón de carga, donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH, donde la cantidad de anticuerpo cargado en la resina de intercambio catiónico varía de 20 mg a 35 mg del anticuerpo por ml de resina de intercambio catiónico; (b) el lavado de la resina de intercambio catiónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH que son superiores a las del tampón de carga para eluir el contaminante del material de intercambio iónico; (c) el lavado de la resina de intercambio catiónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH que son inferiores a las del tampón intermedio; y (d) el lavado de laresina de intercambio catiónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH que son superiores a las del tampón intermedio para eluir el anticuerpo de la resina de intercambio iónico.
Description
Purificación de anticuerpos mediante
cromatografía de intercambio iónico.
La presente invención se refiere, de manera
general, a la purificación de proteínas. En particular, la presente
invención se refiere a un procedimiento para purificar un anticuerpo
de una composición que comprende el polipéptido y por lo menos un
contaminante utilizando el procedimiento de cromatografía de
intercambio iónico.
La purificación a gran escala económica de
proteínas se está convirtiendo en un problema importante en la
industria biotecnológica. En general, las proteínas son producidas
en cultivos celulares, utilizando líneas celulares de mamíferos o
bacterias manipuladas genéticamente para producir la proteína de
interés, mediante la inserción de un plásmido recombinante que
contiene el gen para esa proteína. Puesto que las líneas celulares
utilizadas son organismos vivos, estos deben ser alimentados con un
medio de crecimiento complejo que contenga azúcares, aminoácidos y
factores de crecimiento, frecuentemente procedente de preparaciones
de suero animal. Es un gran reto la separación de la proteína
deseada de la mezcla de compuestos de alimento para las células y
de los subproductos de las células con una pureza suficiente para
ser utilizada como terapéutico humano.
Los procedimientos de purificación de proteínas
procedentes de debris celulares dependen inicialmente del lugar de
expresión de la proteína. Se pueden estimular algunas proteínas para
que se secreten, de manera directa, de la célula al medio de
crecimiento que la rodea; otras están producidas de manera
intracelular. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un
procedimiento de purificación implica la lisis de la célula, lo
cual se puede realizar mediante una serie de procedimientos,
incluyendo la agitación mecánica, el choque osmótico o tratamientos
enzimáticos. Dicho rompimiento libera los contenidos enteros de la
célula en el homogenado y, además, produce fragmentos subcelulares
que son difíciles de extraer debido a su pequeño tamaño. Estos se
eliminan, generalmente, mediante centrifugación diferencial o
filtración. El mismo problema se plantea, aunque a menor escala,
con las proteínas que se secretan directamente, debido a la muerte
natural de las células y a la liberación de las proteínas
intracelulares de la célula huésped en el curso de la producción de
la proteína.
Una vez se ha obtenido una solución clarificada
que contenga la proteína de interés, se consigue su separación de
las otras proteínas producidas por la célula utilizando, en general,
una combinación de diferentes técnicas cromatográficas. Estas
técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga, grado
de hidrofobicidad o tamaño. Son asequibles varias resinas de
cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas,
permitiendo una adaptación precisa del esquema de purificación para
una determinada proteína implicada. La esencia de cada uno de estos
procedimientos de separación es que se puede provocar que las
proteínas eluyan a diferentes velocidades a lo largo de la columna,
consiguiendo una separación física que aumenta a medida que pasan
por la columna, o una adhesión, de manera selectiva, al medio de
separación, siendo, a continuación, eluída, de manera diferencial,
mediante diferentes disolventes. En algunos casos, se separa la
proteína deseada de las impurezas cuando las impurezas se adhieren
de manera específica a la columna y la proteína de interés no, esto
es, la proteína de interés está presente en el "flujo
continuo".
La cromatografía de intercambio iónico es una
técnica cromatográfica que se utiliza frecuentemente para la
purificación de proteínas. En la cromatografía de intercambio
iónico, los parches cargados en la superficie del soluto son
atraídos por cargas contrarias unidas a una matriz de cromatografía,
con la condición de que la fuerza iónica del tampón circundante sea
baja. La elución se consigue, en general, incrementando la fuerza
iónica (es decir, la conductividad) del tampón para que compita con
el soluto por los sitios cargados de la matriz de intercambio
iónico. Otra manera de conseguir la elución del soluto es cambiando
el pH y, de este modo, alterando la carga del soluto. El cambio en
la conductividad o pH puede ser gradual (elución por gradiente) o
escalonada (elución por etapas). En el pasado, estos cambios habían
sido progresivos; es decir, el pH o la conductividad se aumentaba o
disminuía en una única dirección.
Graf et al. (1994), Bioseparation 4:
7-20 describen resinas de intercambio iónico para la
purificación de anticuerpos monoclonales de cultivos de células
animales. Se compararon varios intercambiadores iónicos. Los
autores proponen que la productividad se puede mejorar teniendo en
cuenta la velocidad de flujo, la concentración de la muestra y el
tamaño de la columna.
El documento WO95/22389 (Smithkline Beecham
Corporation) se refiere a la purificación de anticuerpos. La
solicitud describe la aplicación de la Cromatografía de Interacción
Hidrofóbica (HIC) a la separación de monómeros de Inmunoglobulina G
y a la integración de HIC en un protocolo cromatográfico de
combinación, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, para
la purificación de moléculas de anticuerpo IgG.
La presente invención da a conocer un
procedimiento para la purificación un anticuerpo de una composición
que comprende el anticuerpo y un contaminante, en el que el
contaminante es una variante ácida del anticuerpo, cuyo
procedimiento comprende las siguientes etapas realizadas de manera
secuencial:
(a) la unión del anticuerpo a una resina de
intercambio catiónico utilizando un tampón de carga, donde el
tampón de carga está a una primera conductividad y pH, donde la
cantidad de anticuerpo cargado en la resina de intercambio
catiónico varía de 20 mg a 35 mg del anticuerpo por ml de resina de
intercambio catiónico;
(b) el lavado de la resina de intercambio
catiónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o
pH que son superiores a las del tampón de carga para eluir el
contaminante del material de intercambio iónico;
(c) el lavado de la resina de intercambio
catiónico con un tampón de lavado que está a una tercera
conductividad y/o pH que son inferiores a las del tampón
intermedio; y
(d) el lavado de la resina de intercambio
catiónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o
pH que son superiores a las del tampón intermedio para eluir el
anticuerpo de la resina de intercambio iónico.
La figura 1 es un diagrama de flujo que muestra
cómo se podría llevar a cabo una cromatografía de intercambio
catiónico mediante la alteración de la conductividad (por ejemplo,
hasta las concentraciones de NaCl del Ejemplo 1 siguiente) o
mediante la alteración del pH (por ejemplo, hasta los valores de pH
tal y como se muestran en el diagrama de flujo).
La figura 2 es comparativo y representa un
diagrama de flujo que muestra cómo se podría llevar a cabo una
cromatografía de intercambio aniónico mediante la alteración de la
conductividad (por ejemplo, hasta las concentraciones de NaCl tal
como se representa en la figura) o mediante la alteración del pH
(por ejemplo, hasta los valores de pH tal y como se muestran).
La figura 3 es una representación de la
absorbancia de una cromatografía de intercambio catiónico realizada
en el Ejemplo 1 a una escala de fabricación completa. Los puntos en
los que se lava la columna con los diferentes tampones descritos en
la presente invención están marcados con flechas.
La figura 4 representa el anticuerpo monoclonal
anti-HER2 humanizado recombinante (rhuMAb HER2)
recuperado en cada fracción de la cromatografía (calculada como el
porcentaje de la suma total de todas las fracciones de la
cromatografía pertinente). Las fracciones de flujo continuo, etapas
de lavado y previas a la recolección ("prepool") son todas las
muestras de efluente recogidas desde el comienzo de la carga hasta
el inicio de la recolección ("pooling"). La fracción de
recolección es la muestra de eluyente con un volumen de cinco el de
la columna de elución empezando en el punto de inflexión del
saliente. La fracción de regeneración contiene el efluente
capturado desde el final de la recolección hasta el final de la
regeneración.
La Figura 5 muestra la cualidad de rhuMAb HER2
en cada muestra de recolección de la cromatografía de intercambio
catiónico cuando se evalúa por cromatografía líquida de alta presión
de intercambio catiónico carboxi sulfona (CSx HPIEX). Los picos a,
b y 1 son formas desamidadas de rhuMAb HER2. El pico 3 es rhuMAb
HER2 no desamidada. El pico 4 es una combinación de rhuMAb HER2d
que contiene lisina C-terminal y las variantes
iso-aspartato.
La Figura 6 muestra los perfiles de absorbancia
(280 nm) del lavado con 0,025 M MES/0,070 M NaCl, pH 5,6 para cada
cromatografía. La masa de rhuMAb HER2 aplicada a la resina de
intercambio catiónico afecta al nivel de absorbancia del pico en el
ápice, así como la cantidad de tampón requerida hasta alcanzar el
ápice. Debido a los pocos picos que aparecen (como se observa mejor
en la carga de 30 mg/mL) en este lavado, el ápice se define como
los niveles de absorbancia de por lo menos 0,5 unidades de
absorbancia (AU).
Las figuras 7A y 7B muestran las secuencias de
aminoácidos de cadena ligera de humMAb4D5-B (SEC ID
No: 1) y la cadena pesada de humMAb4D5-8 (SEC ID
No: 2), respectivamente.
La "composición" a purificar en la presente
invención comprende el polipéptido de interés y uno o más
contaminantes. La composición puede estar "parcialmente
purificada" (es decir, haberse sometido a una o más etapas de
purificación, tales como Cromatografía en Proteína A como en el
Ejemplo 1 siguiente) o se puede obtener directamente de una célula
huésped u organismo que produce el polipéptido (por ejemplo, la
composición puede comprender el fluido del cultivo de células
recogidas).
\newpage
Tal y como se utiliza en el presente documento,
"polipéptido" se refiere en general a un anticuerpo. Se
prefiere un anticuerpo anti-HER2. Se prefiere aún
más un anticuerpo de longitud completa que se une a HER2
humano.
Un "contaminante" es un material que es
diferente del producto de polipéptido deseado. El contaminante
sujeto a la presente invención es una variante ácida del
anticuerpo.
Una "variante" o "variante de secuencia
aminoacídica" de un polipéptido de partida es un polipéptido que
comprende una secuencia aminoacídica diferente de la del polipéptido
de partida. En general, la variante poseerá por lo menos un 80% de
identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos un 90% de
identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos un 95% de
identidad de secuencia y, más preferiblemente por lo menos un 98%
de identidad de secuencia con el polipéptido nativo. El porcentaje
de identidad de secuencia se determina, por ejemplo, mediante Fitch
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
1382-1386 (1983), versión del algoritmo descrito
por Needleman et al., J. Mol. Biol.
48:443-453 (1970), después del alineamiento de las
secuencias para dar la máxima homología. Las variantes de secuencia
aminoacídica de un polipéptido se pueden preparar introduciendo los
cambios de nucleótidos apropiados en el DNA codificante del
polipéptido o por síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por
ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de,
residuos en la secuencia aminoacídica del polipéptido de interés.
Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se
realiza para llegar a la construcción final, con tal de que la
construcción final posea las características deseadas. Los cambios
aminoacídicos también pueden alterar los procesos
post-traduccionales del polipéptido, tal como
cambiar el número o posición de sitios de glicosilación.
Procedimientos para generar variantes de secuencias aminoacídicas
de polipéptidos, se describen en la patente US Nº 5.534.615, que se
incluye aquí por referencia, por ejemplo.
Una "variante acídica" es una variante de
un polipéptido de interés que es más acídico (por ejemplo cuando se
determina mediante cromatografía de intercambio catiónico) que el
polipéptido de interés. Un ejemplo de variante acídica es una
variante desamidada.
Una variante "desamidada" de una molécula
polipeptídica es un polipéptido en donde uno o más residuo(s)
de asparagina del polipéptido original seb ha(n) convertido
en aspartato, es decir, la cadena lateral amida neutra se ha
convertido en un residuo con un carácter completamente acídico. El
anticuerpo humMAb4D5 desamidado del Ejemplo de más abajo tiene
Asn30 en CDR1, en cualquiera o ambas regiones V_{L} de la misma,
convertida en aspartato. El término "DNasa humana desamidada"
tal y como se utiliza en el presente documento significa Dnasa
humana que está desamidada en el residuo de asparagina que se
encuentra en la posición 74 de la secuencia aminoacídica de la
DNasa humana nativa madura (patente US 5.279.823; incorporada
expresamente aquí por referencia).
El término "mezcla" tal y como se utiliza
en el presente documento, en referencia a una composición que
comprende un anticuerpo anti-HER2, significa la
presencia de tanto el anticuerpo anti-HER2 deseado
como de una o más variantes acídicas del mismo. Las variantes
acídicas pueden comprender predominantemente un anticuerpo
anti-HER2 desamidado, con cantidades mínimas de
otra(s) variante(s) acídica(s). Se ha
encontrado, por ejemplo, que en las preparaciones de anticuerpo
anti-HER2, obtenidas de la expresión recombinante,
se desamidada tanto como aproximadamente un 25% del anticuerpo
anti-HER2.
En realizaciones preferidas de la invención, el
polipéptido es un polipéptido recombinante. Un "polipéptido
recombinante" es uno que ha sido producido en una célula huésped
que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico
codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como resultado
de la recombinación homóloga. "Transformación" y
"transfección" se utilizan de manera intercambiable para
referirse al procedimiento de introducción del ácido nucleico en
una célula. Después de la transformación o transfección, el ácido
nucleico puede integrarse en el genoma de la célula huésped o puede
existir como un elemento extracromosomal. La "célula huésped"
incluye una célula en un cultivo celular in vitro así como
una célula en un animal hospedador. En la patente US 5.534.615,
incorporada expresamente aquí por referencia, se describen, por
ejemplo, procedimientos para la producción recombinante de
polipéptidos.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales
(incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa),
anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo
anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos tan largos
como para que exhiban la actividad biológica deseada.
El anticuerpo aquí descrito se dirige contra un
"antígeno" de interés. Preferiblemente, el antígeno es un
polipéptido biológicamente importante y la administración del
anticuerpo a un mamífero que sufra de una enfermedad o alteración
puede resultar en un beneficio terapéutico al mamífero. Sin embargo,
también se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos no
polipeptídicos (tales como antígenos glicolípidos asociados a
tumor; véase patente US 5.091.178). Cuando el anticuerpo es un
polipéptido, este puede ser una molécula transmembrana (por ejemplo
un receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento.
Antígenos ejemplificantes incluyen los polipéptidos discutidos más
arriba. Objetivos moleculares preferidos para los anticuerpos
comprendidos en la presente invención incluyen los polipéptidos CD
tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34; miembros de la familia
de receptores de HER tales como el receptor de EGF, HER2, HER3 o
HER4; moléculas de adhesión celular tales como
LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4,
ICAM-1, VCAM y la integrina av/b3, incluyendo las
subunidades a o b del mismo (por ejemplo anticuerpos
anti-CD 11a, anti-CD 18 o
anti-CD 11b); factores de crecimiento tal como
VEGF; IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3;
receptor de la obesidad (OB); receptor mpl;
CTLA-4; polipéptido C, etc. Se pueden utilizar
antígenos o fragmentos de los mismos solubles como inmunógenos,
opcionalmente conjugados a otras moléculas para generar anticuerpos.
Para las moléculas transmembrana, dichos receptores, fragmentos de
estos (pe. El dominio extracelular de un receptor).
Alternativamente, las células que expresan la molécula
transmembrana se pueden utilizar como inmunógeno. Dichas células
pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo líneas celulares
cancerígenas) o pueden ser células que se han transformado mediante
técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana.
El término "anticuerpo monoclonal" tal y
como se utiliza en el presente documento, se refiere a un
anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente
homogénea, es decir, anticuerpos individuales que comprenden la
población son idénticos excepto en las mutaciones que se pueden dar
de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores.
Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando
dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con
las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que
típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal
está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El
modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo,
por ser obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente
homogénea y que no es para ser construido cuando se requiere la
producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento
determinado. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser
utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden preparar
mediante el primer procedimiento de hibridoma descrito primero por
Kohler et al., Nature 256:495(1975), o se
pueden preparar mediante procedimientos de DNA recombinantes (véase,
por ejemplo patente US 4.816.567). En otra realización, se pueden
aislar los "anticuerpos monoclonales" de librerías de fagos
generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et
al., Nature, 348:552-554 (1990). Claxon
et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y
Marks et al., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991) describen el asilamiento de
anticuerpos de murina y humanos, respectivamente, utilizando
librerías de fagos. Publicaciones posteriores describen la
producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (rango de nM)
mediante "chain shuffling" (Marks et al.,
Biol. Technology, 10:779-783 (1992)), así
como la infección combinatoria y la recombinación in vivo
como estrategia para la construcción de librerías de fagos muy
amplias (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res.,
21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas
son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos
monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos
monoclonales. De manera alternativa, ahora es posible producir
animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, en la
inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos
humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por
ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigoto del gen de la
región de unión de cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en
ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal resulta en una
inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La
transferencia del gen de la inmunoglobulina de la línea germinal
humana se basa en que dichos ratones mutantes en la línea germinal
resultará en la producción de anticuerpos humanos en el reto del
antígeno. Véase, pe., Jakobovits et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al.,
Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann
et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal
et al., Nature 355: 258 (1992).
Los anticuerpos monoclonales aquí especificados
incluyen, de manera específica, anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una región de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes
en anticuerpos procedentes de un especie determinada o perteneciente
a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que
la(s) cadena(s) restante(s) es(son)
idéntica(s) a, o homóloga(s) a, las secuencias
correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o
pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como
fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad
biológica deseada (patente US 4.816.567; y Morrison et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855
(1984)).
El término "región hipervariable" cuando se
utiliza en el presente documento, se refiere a los residuos de
aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a
antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos
de una "región determinante de complementariedad" o "CDR"
(por ejemplo residuos 24-34 (L1), 50.56 (L2) y
89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y
95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena
pesada; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of
Immunological Interest, 5th Edition Public Health Service,
National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) y/o aquellos
residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena
pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987)). Los residuos de sostén (en
inglés "framework") o "FR" son aquellos residuos
del dominio variable diferentes de los residuos de la región
hipervariable, tal y como se han definido en el presente documento.
Los residuos CDR y FR del anticuerpo rhuMAb HER2 del ejemplo de más
abajo (humAb4D5-8) se identifican en Carter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)).
Formas "no humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo murina) son anticuerpos quiméricos que
contienen una secuencia mínima procedente de una inmunoglobulina no
humana. En la mayoría de casos, los anticuerpos humanizados son
inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en los que los
residuos de las regiones hipervariables del receptor se han
sustituido por residuos de una región hipervariable de una especie
no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o un
primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad
deseadas. En algunos casos, los residuos de sostén (FR) de la región
(F_{V})de inmunoglobulina humana se sustituyen por los
correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos
humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el
anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones
se realizan para refinar más la función del anticuerpo. En general,
el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo
menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que todos
o prácticamente todos los bucles hipervariables corresponden a los
de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas
las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana.
El anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, por lo
menos una parte de una región constante de la inmunoglobulina (Fc),
en general de una inmunoglobulina humana.
La elección de dominios variables humanos, tanto
de cadena ligera como pesada, para ser utilizados en la preparación
de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la
antigenicidad. De acuerdo con el denominado procedimiento de
"best-fit", la secuencia del dominio variable
de un anticuerpo de roedor se criba en la librería completa de
secuencias de dominios variables humanas conocidas. La secuencia
humana que está más cercana a la del roedor es, a continuación,
aceptada como la sostén humana (FR) para el anticuerpo humanizado
(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al,
J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).
Otro procedimiento utiliza un framework
determinado procedente de la secuencia consenso de todos los
anticuerpos humanos de un determinado subgrupo de cadenas ligeras o
pesadas. El mismo framework se puede utilizar para varios
anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J.
Immunol., 151:2623 (1993)).
Es además importante que los anticuerpos sean
humanizados con retención de una elevada afinidad por el antígeno y
otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este
objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los
anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de
análisis de secuencias parenterales y varios productos humanizados
conceptuales, utilizando modelos tridimensionales de las secuencias
parenterales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina
tridimensionales son comúnmente asequibles y familiares para
aquellos expertos en la materia. Los programas de ordenador son
asequibles, ilustran y exhiben estructuras conformacionales
tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas
candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones
permiten el análisis del papel similar de los residuos en el
funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es
decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la
inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno.
De esta manera, los residuos de FR se pueden
seleccionar y combinar del receptor e importar las secuencias de
tal manera que se consiga la característica deseada del anticuerpo,
tal como un incremento de la afinidad para el(los)
antígeno(s) objetivo. En general, los residuos CDR están
implicados de manera directa y muy sustancialmente en influenciar
la unión a antígeno.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la
región de unión a antígeno o variable, del mismo. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F_{v}; homodímeros bivalentes (en inglés
"diabodies"); anticuerpos lineales; moléculas de
anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos
formados por fragmentos de anticuerpos. Se han desarrollado varias
técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos.
Tradicionalmente, estos fragmentos proceden de la digestión
proteolítica de anticuerpos intactos (véase por ejemplo Morimoto
et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods
24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science,
229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir
ahora, de manera directa, mediante células huéspedes recombinantes.
Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las
librerías de fagos de anticuerpos discutidas más arriba. De manera
alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden
recuperar, directamente, de E. coli y unirse, químicamente,
para formar fragmentos
F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma utilizando la cremallera de leucinas GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otra aproximación, se pueden aislar directamente los fragmentos de F(ab')_{2} del cultivo de células huéspedes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los practicantes expertos.
F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma utilizando la cremallera de leucinas GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otra aproximación, se pueden aislar directamente los fragmentos de F(ab')_{2} del cultivo de células huéspedes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los practicantes expertos.
En otras realizaciones, el anticuerpo de
elección es un fragmento F_{v} de cadena sencilla (scFv). Véase
WO 93/16185. El "Fv de cadena sencilla" o los ``fragmentos de
anticuerpos "scFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L}
del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una
cadena polipeptídica sencilla. En general, el polipéptido F_{v}
comprende, además, un engarce polipeptídico entre los dominios
V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada
para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun
en Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg
and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pág.
269-315 (1994).
El término "homodímeros bivalentes" se
refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de
unión a antígeno, comprendiendo estos fragmentos un dominio variable
de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de
cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica
(V_{H}-V_{L}). Utilizando un engarce que sea
demasiado corto para dejar que se emparejen los dos dominios en la
misma cadena, se fuerzan los dominios a emparejarse con los
dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión
a antígeno. Los homodímeros bivalentes se describen, con más
detalle en, por ejemplo, EP 404.097, WO 93/11161; y Hollinger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448 (1993).
La expresión "anticuerpos lineales" cuando
se utiliza en esta solicitud, se refiere a los anticuerpos
descritos en Zapata et al., Polypeptide Eng.
8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos
anticuerpos comprenden un par de segmentos tándem Fd
(V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1)
que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos
lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Los "anticuerpos multiespecíficos" tienen
especificidades de unión para, por lo menos, dos epítopos
diferentes, en donde los epítopos son, normalmente, de antígenos
diferentes. Mientras que tales moléculas normalmente se unirán solo
a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs),
anticuerpos con especificidades adicionales tales como los
anticuerpos triespecíficos, se engloban dentro de la expresión
cuando es utilizada en el presente documento. Ejemplos de BsAbs
incluyen aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de
célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula
citotóxica inductora tal como
anti-Fc\gammaRI/anti-CD15,
anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII (CD16),
anti-CD3/anti-célula B maligna
(1D10), anti-CD3/anti-p185^{HER2},
anti-CD3/anti-p97,
anti-CD3/anti-célula renal de
carcinoma,
anti-CD3/anti-OVCAR-3,
anti-CD3/L-D1
(anti-carcinoma de colon);
anti-CD3/análogo de la hormona
anti-melanocitoestimuladora, receptor
anti-EGF/anti-CD3,
anti-CD3/anti-CAMA1,
anti-CD3/anti-CD19,
anti-CD3/MoV 18, anti-molécula de
adhesión de una célula neuronal (NCAM)/anti-CD3;
proteína de unión anti-folato
(FBP)/anti-CD3; antígeno asociado a carcinoma
anti-pan
(AMOC-31)/ANTI-CD3, BsAbs con un
brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo
que se une a una toxina tal como
anti-saporina/anti-Id-1,
anti-CD22/anti-saporina,
anti-CD7/anti-saporina,
anti-CD38/anti-saporina,
anti-CEA/cadena A de anti-ricina,
anti-interferón \alpha
(IFN-\alpha)/idiotipo
anti-hibridoma, anti-CEA/alcaloide
anti-vinca; BsAbs para la conversión de profármacos
activados por enzima tales como
anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina,
(que cataliza la conversión del fármaco fosfato de mitomicina en el
alcohol mitomicina); BsAbs que se pueden utilizar como agentes
fibrinolíticos tales como
anti-fibrina/anti-activador tisular
de plasminógeno (tPA),
anti-fibrina/anti-activador de
plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA); BsAbs para la designación de
complejos inmunes a receptores de superficie celular tales como
anti-lipoproteínas de baja densidad
(LDL)/anti-receptor Fc (por ejemplo Fc\gammaRI o
Fc\gammaIII); BsAbs para utilizar en la terapia de enfermedades
infecciosas tales como
anti-CD3/anti-virus del herpes
simple (HSV), anti-receptor de célula T; complejo
CD3/anti-gripe,
anti-Fc\gammaR/anti-HIV; BsAbs
para la detección de tumores in vitro o in vivo tales
como anti-CEA/anti-EOTUBE,
anti-CEA/anti-DPTA,
anti-p185^{HER2}/anti-hapteno;
BsAbs como adyuvantes de vacunas; y BsAbs como herramientas de
diagnóstico, tales como anti-IgG de
conejo/anti-ferritina,
anti-peroxidasa de rábano
(HRP)/anti-hormona,
anti-somatostatina/anti-sustancia
P, anti-HRP/anti-FITC,
anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa.
Ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen
anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37,
anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37
y
anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de
longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo
anticuerpos biespecíficos F(ab')2).
En el estado de la técnica se conocen
procedimientos para la preparación de anticuerpos biespecíficos. La
producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud
completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulinas, en donde
las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et
al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la
variedad aleatoria de cadenas de inmunoglobulinas pesadas y
ligeras, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial
de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una
tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la
molécula correcta, que se realiza frecuentemente por etapas de
cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos
de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO
93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991)).
De acuerdo con una aproximación diferente, los
dominios variables de los anticuerpos con las especificidades de
unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias
del dominio constante de la inmunoglobulina. Preferiblemente, la
fusión tiene lugar con un dominio constante de la cadena pesada de
la inmunoglobulina, comprendiendo, por lo menos, parte de las
regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferido tener la primera región
constante de la cadena pesada (CH1) conteniendo el sitio necesario
para la unión de la cadena ligera, presente en por lo menos una de
las fusiones. Los DNAs codificantes de las fusiones de cadenas
pesadas de inmunoglobulinas y, si se desea, de cadenas ligeras de
inmunoglobulinas se insertan en vectores de expresión separados y
son co-transfectados en un organismo hospedador
adecuado. Esto da lugar a una gran flexibilidad en el ajuste de las
proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en
realizaciones donde las proporciones no igualadas de las tres
cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción, proporciona
los rendimientos óptimos. Es posible, sin embargo, insertar las
secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas
en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos
cadenas polipeptídicas en relaciones iguales resulta en unos
rendimientos mayores o cuando las relaciones no son especialmente
significativas.
En una realización preferida de esta
aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por
una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera
especificidad de unión en un brazo y un par de cadena
ligera-cadena ligera de una inmunoglobulina híbrida
(proporcionando una segunda especificidad) en el otro brazo. Se
encontró que la estructura asimétrica facilita la separación del
compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de
inmunoglobulinas no deseadas, así como la presencia de una cadena
ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula
biespecífica proporciona una manera sencilla de separación. Esta
aproximación se describe en WO94/04690. Para más detalles de la
generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh
et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otra aproximación descrita en
WO96/27011, se puede manipular genéticamente la interfase entre un
par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de
heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La
interfase preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3
de un dominio constante de un anticuerpo. En este procedimiento,
una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase
de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas de
tamaño mayor (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean
"cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a
la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s)
en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante
sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras
más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un
mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero respecto
otros productos finales no deseados tales como homodímeros.
Anticuerpos biespecíficos incluyen los
anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno
de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina,
el otro a biotina. Dichos anticuerpos han sido propuestos, por
ejemplo, para designar células del sistema inmune hacia células no
deseadas (patente US Nº 4.676.980) y para el tratamiento de la
infección por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los
anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar utilizando
cualquiera de los procedimientos de reticulación adecuados. Son
bien conocidos en el estado de la técnica agentes de reticulación
adecuados y se describen en la patente US Nº 4.676.980 junto con
una serie de técnicas de reticulación.
También se han descrito en la literatura
técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir
de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar los
anticuerpos biespecíficos utilizando engarces químicos. Brennan
et al., Science, 229: 81 (1985) describe un
procedimiento en donde los anticuerpos intactos se cortan
proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos
fragmentos se reducen en presencia del agente complejante ditiol
arsenito sódico para estabilizar los ditioles vicinales y prevenir
la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab'
generados se convierten, a continuación, en derivados del
tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados
Fab'-TNB se reconvierte, a continuación, en el
Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y
se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado
Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los
anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como
agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Un progreso reciente ha facilitado la
recuperación directa de fragmentos Fab'-SH
procedentes de E. coli, los cuales se pueden acoplar
químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et
al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)
describen la producción de una molécula de anticuerpo
F(ab')_{2} biespecífico completamente humanizado. Cada
fragmento Fab' se secreta separadamente de E. coli y se
somete al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar
el anticuerpo biespecífico.
También se han descrito diversas técnicas para
preparar y aislar directamente fragmentos de anticuerpos
biespecíficos de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se
han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de
leucina. Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de la
cremallera de leucina procedentes de proteínas Fos y Jun se unen a
regiones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión
génica. Los homodímeros de anticuerpos se reducen a la región
bisagra para formar monómeros y, a continuación, se vuelven a
oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este
procedimiento se puede utilizar para la producción de homodímeros
de anticuerpos. La tecnología del homodímero bivalente descrita por
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para la preparación de anticuerpos biespecíficos. Los
fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada
(V_{H}) conectado a un dominio variable de la cadena ligera
(V_{L}) mediante un engarce que es demasiado corto para dejar que
se emparejen los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con
esto, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan para
que se emparejen con los dominios complementarios V_{L} y V_{H}
del otro fragmento, formando, de este modo, dos sitios de unión a
antígeno. También ha sido publicada otra estrategia para la
preparación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el
uso de dímeros de cadena sencilla Fv (sFV). Véase Gruber et al.,
J. Immnuol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
La frase "material de intercambio iónico"
se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente (es
decir, resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es
decir, una resina de intercambio aniónico). La carga se puede
proporcionar mediante la unión de uno o más ligandos cargados a la
fase sólida, por ejemplo, mediante unión covalente. De manera
alternativa, o además, la carga puede ser una propiedad inherente de
la fase sólida (por ejemplo es el caso de la sílice que tiene una
carga neta negativa).
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se pueden adherir uno o más ligandos cargados. La
fase sólida puede ser una columna de purificación, una fase
discontínua de partículas discretas, una membrana, un filtro, etc.
Ejemplos de materiales para formar la fase sólida incluyen
polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices
estables mecánicamente tales como el sílice (por ejemplo cristal de
poro controlado), poli(estirendivinil)benceno,
poliacrilamida, partículas de cerámica y derivados de cualquiera de
lo anterior.
Una "resina de intercambio catiónico" se
refiere a una fase sólida que está cargada negativamente y que,
además, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en
una solución acuosa pasada por o través de una fase sólida. Un
ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la
resina de intercambio catiónico, puede ser por ejemplo un
carboxilato o sulfonato. Resinas de intercambio catiónico
comercialmente disponibles incluyen carboximetilcelulosa, BAKERBOND
ABX^{TM}, sulfopropil(SP) inmovilizado en agarosa (por
ejemplo SP-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM} o
SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE^{TM}, de Pharmacia)
y sulfonil inmovilizada en agarosa (por ejemplo
S-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM} de Pharmacia).
El término "resina de intercambio aniónico"
se utiliza aquí para referirse a una fase sólida que está cargada
positivamente, por ejemplo teniendo uno o más ligandos cargados
positivamente, tales como grupos amonio cuaternarios, unidos a los
mismos. Resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente
incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX^{TM} y FAST Q
SEPHAROSE^{TM} (Pharmacia).
\newpage
Un "tampón" se una solución que resiste
cambios de pH por la acción de componentes conjugados
ácido-base. Se pueden utilizar diferentes tampones
que dependiendo de, por ejemplo, el pH deseado del tampón, se
describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of
Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ED. Calbiochem
Corporation (1975). En una realización, el tampón tiene un pH en el
rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 (por ejemplo como en
el Ejemplo 1 de más abajo). Ejemplos de tampones que controlarán el
pH en este rango incluyen los tampones MES, MOPS, MOPSO, fosfato,
acetato, citrato, succinato y amonio, así como combinaciones de
estos.
El "tampón de carga" es aquel que se
utiliza para cargar la composición que comprende la molécula
polipeptídica de interés y uno o más contaminantes en la resina de
intercambio iónico. El tampón de carga tiene una conductividad y/o
pH tal que la molécula polipeptídica de interés (y generalmente uno
o más contaminantes) se une(n) a la resina de intercambio
iónico.
Ej "tampón intermedio" se utiliza para
eluir uno o más contaminantes de la resina de intercambio iónico,
antes de la elución de la molécula polipeptídica de interés. La
conductividad y/o pH del tampón intermedio es/son tal(es)
que el contaminante eluye de la resina de intercambio iónico pero no
en cantidades significativas del polipéptido de interés.
El "tampón de lavado" cuando se utiliza en
el presente documento se refiere a un tampón utilizado para lavar o
volver a equilibrar la resina de intercambio iónico, antes de la
elución de la molécula polipeptídica de interés. Convenientemente,
el tampón de lavado y de carga pueden ser el mismo, pero esto no es
un requisito.
El "tampón de elución" se utiliza para
eluir el polipéptido de interés de la fase sólida. La conductividad
y/o pH del tampón de elución es/son tal(es) que el
polipéptido de interés eluye de la resina de intercambio iónico. Un
"tampón de regeneración" se puede utilizar para regenerar la
resina de intercambio iónico de tal manera que puede volverse a
utilizar. El tampón de regeneración tiene una conductividad y/o pH
requerido para eliminar sustancialmente todos los contaminantes y
el polipéptido de interés de la resina de intercambio iónico.
El término "conductividad" se refiere a la
capacidad de una solución acuosa a conducir una corriente eléctrica
entre dos electrodos. En solución, la corriente fluye mediante un
transporte iónico. De esta manera, con un incremento de la cantidad
de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una
mayor conductividad. La unidad de medición de la conductividad es
mmhos (mS/cm) y se puede medir utilizando un medidor de
conductividad vendido, por ejemplo, por Orion. La conductividad de
una solución se puede alterar cambiando la concentración de iones
en la misma. Por ejemplo, la concentración de un agente tamponante
y/o concentración de una sal (por ejemplo NaCl o KCl) en la
solución se pueden alterar con el fin de conseguir la conductividad
deseada. Preferiblemente, la concentración de sal de los diversos
tampones se modifica para conseguir la conductividad deseada como
en el Ejemplo de más
abajo.
abajo.
Por "purificar" un polipéptido de una
composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes
se entiende incrementar el grado de pureza del polipéptido en la
composición mediante eliminación (completa o parcial) de por lo
menos un contaminante de la composición. Una "etapa de
purificación" puede ser parte de todo el proceso de purificación
que resulte en una composición "homogénea", que se utiliza en
el presente documento para referirse a una composición que
comprende por lo menos un 70% en peso del polipéptido de interés,
basado en el peso total de la composición, preferiblemente por lo
menos aproximadamente un 80% en peso.
A menos que se indique lo contrario, cuando se
utiliza en el presente documento el término "HER2", se refiere
a la proteína HER2 humana y "HER2" se refiere al gen
HER2 humano. El gen HER2 y la proteína HER2 humanas se describen en
Semba et al., PNAS (Estados Unidos)
82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al.,
Nature 319:230-234 (1986) (Número de Acceso en el
Banco de Genes X03363), por ejemplo.
El término "humMAb4D5-8"
cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un
anticuerpo anti-HER2 humanizado que comprende la
secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEC ID Nº:1 y la
secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEC ID Nº:2 o
variantes de secuencia de aminoácidos de las mismas que mantienen
la capacidad de unirse a HER2 e inhibir el crecimiento de células
tumorales que sobreexpresan HER2 (véase la patente de Estados
Unidos Nº 5.677.171, incorporada expresamente en el presente
documento por referencia).
El "pI" o "punto isoeléctrico" de un
polipéptido se refiere al pH al cual la carga positiva del
polipéptido se equilibra con su carga negativa. El pI se puede
calcular a partir de la carga neta de los residuos de aminoácidos
del polipéptido o se puede determinar mediante focalización
isoeléctrica (por ejemplo, utilizando la cromatografía CSx como en
el Ejemplo de más abajo).
Por "unión" de una molécula a un material
de intercambio iónico se entiende exponer la molécula al material
de intercambio iónico en condiciones apropiadas (pH/conductividad)
de tal manera que la molécula se inmoviliza de manera reversible en
o dentro del material de intercambio iónico en virtud de las
interacciones iónicas entre la molécula y un grupo cargado o grupos
cargados del material de intercambio iónico.
Por "lavado" del material de intercambio
iónico se entiende hacer pasar un tampón adecuado a través o por
encima del material de intercambio iónico.
Para "eluir" una molécula (por ejemplo un
polipéptido o contaminante) de un material de intercambio iónico se
entiende extraer la molécula de ahí, alterando la fuerza iónica del
tampón que circunda el material de intercambio iónico de manera que
el tampón compite con la molécula por los sitios cargados en el
material de intercambio iónico.
"Tratamiento" se refiere a tanto el
tratamiento terapéutico como el profiláctico o medidas preventivas.
Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con
alteraciones así como en aquellas en las que se previene la
alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se
beneficiaría del tratamiento con el polipéptido purificado tal y
como se describe en el presente documento. Esto incluye alteraciones
o desórdenes crónicos y agudos que incluyen aquellas condiciones
patológicas que predisponen al mamífero a la alteración en
cuestión.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
el presente documento se refiere a un compuesto o composición
detectable que está conjugado de manera directa o indirecta al
polipéptido. El marcador puede ser por sí mismo detectable (por
ejemplo marcadores radioisótopos o marcajes fluorescentes) o, en el
caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración
química de un compuesto o composición sustrato que sea
detectable.
El término "agente citotóxico" cuando se
utiliza en el presente documento se refiere a una sustancia que
inhibe o previene la función de las células y/o causas de
destrucción celular. El término intenta incluir isótopos
radiactivos (por ejemplo I^{131}, I^{125}, Y^{90} y
Re^{186}), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como las
toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico,
vegetal o animal, o fragmentos de los mismos.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de
agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, doxorubicina,
epirubicina, 5-fluoruracil, citosinarabinósido
("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán,
citoxina, taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOLTM,
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y
doxetaxel, toxoteto, metotrexato, cisplatín, melfalán, vinblastina,
bleomicina, etoposida, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona,
vincristina, vinorelbina, carboplatin, teniposida, daunomicina,
carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas,
esperamicinas (véase patente US Nº 4.675.187), melfalán y otros
mostazas de nitrógeno relacionados. También están incluidos en esta
definición los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir
la acción hormonal en tumores, tales como tamoxifen y
onapristona.
La invención del presente documento proporciona
un procedimiento para la purificación de un polipéptido (es decir,
un anticuerpo) de una composición (por ejemplo, una solución acuosa)
que comprende el polipéptido y un contaminante, donde el
contaminante es una variante ácida del anticuerpo. La composición es
la resultante, generalmente, de la producción recombinante del
polipéptido, pero puede ser resultante de la producción del
polipéptido mediante síntesis peptídica (u otros medios sintéticos)
o se puede purificar el polipéptido a partir de una fuente nativa
del polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo
que se une al antígeno HER2.
Para la producción recombinante del polipéptido,
se aísla el ácido nucleico que lo codifica y se inserta en un
vector replicable para la posterior clonación (amplificación del
ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el polipéptido se
aísla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, cuando el polipéptido es un
anticuerpo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos
que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Hay muchos vectores
disponibles. Los componentes del vector incluyen, generalmente, pero
no se limitan a, uno o más de los siguientes componentes: una
secuencia señal, un origen de replicación, uno o más marcadores
genéticos, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de
finalización de la transcripción (por ejemplo, según se describe en
la patente de Estados Unidos No. 5.534.615, incorporada
específicamente en el presente documento por referencia).
Células huéspedes adecuadas para la clonación o
expresión del DNA en los vectores del presente documento son las
células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores
descritas más arriba. Procariotas adecuados para este fin incluyen
eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o
Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae como
Escherichia, por ejemplo E. coli, Enterobacter,
Erwinia, Klebsiella, Proteus,
Salmonella, e.g. Salmonella typhimurium,
Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y
Shigella, así como Bacilli, tales como B.
subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis
41P descrito en DD 266.710 publicado el 12 de Abril de 1989),
Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces.
Un hospedador de E. coli preferido para la clonación es E.
coli 294 (ATCC 31.446) aunque son adecuadas otras cepas tales
como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E.
coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos más
que limitativos.
Además de procariotas, otros microbios
eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes
apropiados para la clonación o expresión de vectores codificantes de
polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de pan
común, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos
hospedadores inferiores. Sin embargo, son asequibles y útiles, en
el presente documento, una serie de otros géneros, especies y cepas,
tales como los hospedadores Schizosaccharomycespombe;
Kluyveromyces, tales como, por ejemplo, K. lactis,
K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC
16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC
56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K.
thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP
402.226); Pichia pasloris (EP 183.070); Candida;
Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa;
Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis;
y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora,
Penicillium, Tolypocladium y hospedadores
Aspergillus tales como A. nidulans y A.
níger.
Células huéspedes adecuadas para la expresión de
polipéptidos glicosilados proceden de organismos multicelulares.
Ejemplos de células invertebradas incluyen las células de plantas e
insectos. Han sido identificadas numerosas cepas de baculovirus y
variantes y las células huéspedes de insectos permisivas
correspondientes procedentes de hospedadores tales como
Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti
(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila
melanogaster (mosca de la fruta) y Brombyx mori. Están
disponibles públicamente una variedad de cepas virales para la
transfección, por ejemplo la variante L-1 de
Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de
Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden utilizar aquí como
el virus de acuerdo con la presente invención, en particular para
la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También
se pueden utilizar como hospedadores cultivos celulares vegetales de
algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células
de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en
cultivo (cultivo tisular) se ha vuelto un procedimiento rutinario.
Ejemplos de líneas de células huéspedes de mamíferos útiles son la
línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónica
humana (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en un
cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59
(1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10);
células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sartoli
de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.
23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1
ATCC CCL70); células de riñón de mono verde africano
(VERO-76, ATCC CRL-1587); células de
carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón
caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata bufalo (BRL
3A, ATCC CRL 2); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75);
células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón
(MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.
Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5;
células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep G2).
Las células huéspedes se transforman con los
vectores de expresión o clonación más arriba descritos para la
producción del polipéptido y se cultivan en medios de nutrientes
convencionales modificados de manera apropiada para inducir a los
promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes
codificantes de las secuencias deseadas.
Las células huéspedes utilizadas para producir
el polipéptido de esta invención se puede cultivar en una variedad
de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's 10
(Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM), (Sigma),
RPMI-1640 (Sigma) y Medio Eagle Modificado por
Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células
huéspedes. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et
al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal.
Biochem. 102:255 (1980), Patentes US Nº 4.767.704; 4.657.866;
4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o
patente US Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo
para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios se puede
suplementar cuando sea necesario con hormonas y/o otros factores de
crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de
crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio,
calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como el HEPES),
nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales
como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como
compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones
finales en el rango de micromolar) y glucosa o una fuente
equivalente de energía. Se puede incluir cualquier otro suplemento
necesario en las concentraciones adecuadas que sean conocidas para
los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como
la temperatura, pH y similares son las utilizadas previamente con la
célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes
para un técnico especialista ordinario.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el
polipéptido se puede producir intracelularmente, en el espacio
periplásmico, o secretado directamente al medio. Si el polipéptido
se produce intracelularmente, como primera etapa, el debris
particulado, ya sea de células huéspedes o células lisadas (por
ejemplo resultantes de la homogeneización) se extrae, por ejemplo,
mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando el polipéptido se
secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión
se concentran, generalmente, primero utilizando un filtro de
concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo,
una unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Pellicon.
El polipéptido se somete, a continuación, a una
o más etapas de purificación, incluyendo el procedimiento de
cromatografía de intercambio iónico según se reivindica en el
presente documento. Ejemplos de procedimientos de purificación
adicionales que se pueden ejecutar antes de, durante o después del
procedimiento de intercambio iónico incluye el fraccionamiento en
una cromatografía de interacción hidrofóbica (por ejemplo en fenil
sefarosa), precipitación con etanol, enfoque isoeléctrico, HPLC de
fase reversa, cromatografía en sílice, cromatografía en HEPARIN
SEPHAROSETM, además de la cromatografía de intercambio aniónico y/o
adicionales cromatografías de intercambio catiónico,
cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato
de amonio, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel,
diálisis y cromatografía de afinidad (por ejemplo utilizando
proteína A, proteína G, un anticuerpo, un sustrato específico,
ligando o antígeno como reactivo de captura).
La cromatografía de intercambio iónico se
realiza tal y como se reivindica en el presente documento.
La resina de intercambio catiónico se prepara
según los procedimientos conocidos. Habitualmente, se pasa un
tampón de equilibrio a través de la resina de intercambio iónico
antes de la carga en la resina de la composición que comprende el
polipéptido y uno o más contaminantes. De forma conveniente, el
tampón de equilibrio es el mismo que el tampón de carga, pero no
necesariamente.
Con especial referencia a la Figura 1, que
muestra las etapas ejemplificadas para llevar a cabo cuando se
utiliza una resina de intercambio catiónico, el pH y/o la
conductividad de cada tampón se incrementa(n) respecto al
tampón anterior, excepto para el tampón de lavado donde la
conductividad y/pH es/son inferior(es) a la conductividad
y/o pH del tampón intermedio anterior. La solución acuosa que
comprende el polipéptido de interés y contaminante(s)
cargado(s) en la resina de intercambio catiónico utilizando
el tampón de carga que está a un pH y/o conductividad de manera que
el polipéptido y el contaminante se unen a la resina de intercambio
catiónico. Como en el ejemplo de más abajo, el tampón de carga puede
estar a una primera conductividad baja (por ejemplo de
aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,6 mmhos). Un pH
ejemplificante para el tampón de carga puede ser aproximadamente
5,0 (véase Figura 1). De aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente
35 mg/mL del polipéptido (por ejemplo un anticuerpo de longitud
completa) se puede cargar, por ejemplo, en la resina de intercambio
iónico.
La resina de intercambio catiónico se lava, a
continuación, con un tampón intermedio que está a una segunda
conductividad y/o pH con el fin de eluir esencialmente el
contaminante y no una cantidad sustancial del polipéptido de
interés. Esto se puede conseguir incrementando la conductividad o
pH, o ambas, del tampón intermedio. El cambio del tampón de carga
al tampón intermedio puede ser escalonado o gradual, según se desee.
En el Ejemplo del presente documento, el tampón intermedio tenía
una conductividad mayor que la del tampón de carga (es decir, la
conductividad del tampón intermedio estaba en el rango de
aproximadamente 7,3 a aproximadamente 8,4 mmhos). Alternativamente,
como se muestra en la Figura 1, el pH del tampón intermedio puede
exceder el del tampón de carga en esta realización de la invención,
donde se utiliza una resina de intercambio catiónico. Por ejemplo,
el tampón intermedio puede tener un pH de aproximadamente 5,4.
Después del lavado con el tampón intermedio, la
resina de intercambio catiónico se lava o se vuelve a equilibrar
con el tampón de lavado que tiene una conductividad o pH, o ambas,
que es/son inferior(es) a la del tampón intermedio (es
decir, la conductividad, o pH, o ambas, se cambia(n) en
dirección opuesta, es decir, inversa, a la etapa anterior, a
diferencia de las etapas de cromatografía de intercambio iónico de
la literatura). En el Ejemplo de más abajo, el tampón de lavado
tenía aproximadamente la misma conductividad que la del tampón de
carga (es decir, en el rango de aproximadamente 5,2 a
aproximadamente 6,6 mmhos) y su conductividad era, por tanto,
inferior a la del tampón intermedio. En otra realización, uno puede
reducir la conductividad del tampón de lavado a una conductividad
que sea inferior a, o mayor a, la del tampón de carga, con la
condición de que la conductividad del tampón de lavado sea inferior
a la del tampón intermedio. En otra realización, el pH del tampón
de lavado puede ser inferior al pH del tampón intermedio (por
ejemplo el pH del tampón de lavado puede ser aproximadamente 5,0).
El cambio en la conductividad y/o pH del tampón de lavado comparado
con el del tampón intermedio se puede conseguir mediante cambio
gradual o escalonado de cualquiera o todos estos parámetros.
Después de la etapa de lavado del párrafo
anterior, la resina de intercambio catiónico se prepara para la
elución de la molécula polipeptídica deseada. Esto se consigue
utilizando un tampón de elución que tenga un pH y/o conductividad
tal que el polipéptido deseado no se una más a la resina de
intercambio catiónico y, de esta manera, eluya. El pH y/o
conductividad del tampón de elución excede, generalmente, el pH y/o
conductividad del tampón de carga, el tampón intermedio y el tampón
de lavado utilizados en las etapas previas. En el Ejemplo de más
abajo, la conductividad del tampón de elución estaba en el rango de
aproximadamente 10,0 a aproximadamente 11,0 mmhos.
Alternativamente, o además, el pH del tampón de elución se puede
incrementar respecto al tampón de lavado y al tampón intermedio
(por ejemplo, el pH del tampón de elución puede ser aproximadamente
6,0). El cambio de conductividad y/o pH puede ser escalonado o
gradual, según se desee. De esta manera, se recupera el polipéptido
deseado de la resina de intercambio catiónico en esta etapa del
procedimiento.
En un procedimiento preferido, se cambia un
único parámetro (es decir, la conductividad o el pH) para conseguir
la elusión de tanto el polipéptido como el contaminante, mientras
que el otro parámetro (es decir, el pH o la conductividad,
respectivamente) permanece aproximadamente constante. Por ejemplo,
aunque puede variar la conductividad de los diversos tampones
(tampón de carga, tampón intermedio, tampón de lavado y/o tampón de
elución), los pH de los mismos pueden ser esencialmente los
mismos.
En una realización opcional del procedimiento,
la resina de intercambio iónico se regenera con un tampón de
regeneración después de la elución del polipéptido, de manera que la
columna pueda ser reutilizada. Generalmente, la conductividad y/o
el pH del tampón de regeneración es/son de tal manera que
prácticamente todos los contaminantes y el polipéptido de interés
se eluyen de la resina de intercambio iónico. Generalmente, el
tampón de regeneración tiene una conductividad muy elevada para
eluir los contaminantes y el polipéptido de la resina de intercambio
iónico.
El procedimiento del presente documento es
particularmente útil para separar una molécula polipeptídica de
interés de por lo menos un contaminante, donde el contaminante y la
molécula polipeptídica de interés difieran sólo ligeramente en la
carga iónica. Por ejemplo, los pI del polipéptido y el contaminante
pueden ser sólo "ligeramente diferentes", por ejemplo, pueden
diferir solamente en aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2
unidades de pI. En el Ejemplo de más abajo, este procedimiento se
podría utilizar para separar un anticuerpo
anti-HER2 que tiene un pI de 8,87, de una variante
desamidada por separado del mismo que tiene un pI de 8,79.
La preparación del polipéptido obtenida de
acuerdo con el procedimiento de cromatografía de intercambio iónico
del presente documento, se puede someter a etapas de purificación
adicionales, si es necesario. Etapas de purificación adicionales
ejemplificativas se han discutido más arriba.
Opcionalmente, el polipéptido se conjuga a una o
más moléculas heterólogas cuando se desee. La molécula heteróloga
puede ser una que, por ejemplo, incremente el tiempo de vida media
del polipéptido en suero (por ejemplo polietilenglicol, PEG) o
puede ser un marcador (por ejemplo un enzima, un marcador
fluorescente y/o radionuclido) o una molécula citotóxica (por
ejemplo una toxina, fármaco quimioterapéutico o isótopo radiactivo,
etc).
Se puede preparar una formulación terapéutica
que comprenda el polipéptido, opcionalmente conjugado con una
molécula heteróloga, mezclando el polipéptido que tiene el grado de
pureza deseado con vehículos farmacéuticamente aceptables
opcionales, excipientes o estabilizantes (Remington's
Pharmaceutical Sciences 16th Edition, Osol, A. Ed. (1980)), en
forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas.
Vehículos "farmacéuticamente aceptables", excipientes o
estabilizantes no son tóxicos para los receptores a las dosis y
concentraciones utilizadas e incluyen tampones tales como fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el
ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como el cloruro
de octadecildimetil bencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro
de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol; alcohol butílico o
fenílico; alquil parabenos como el metil o propil paraben; catecol;
resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y
m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular
(inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como la
albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros
hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como
glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina;
monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen
glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares
como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; sales formadoras de
contraiones como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo
complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no
iónicos como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol
(PEG). El anticuerpo humMAb4D5-8, de particular
interés en el presente documento, se puede preparar como una
formulación liofilizada, por ejemplo según se describe en WO
97/04801; incorporada expresamente aquí por referencia.
La formulación del presente documento puede
también contener más de un compuesto activo, si es necesario, para
la indicación a ser tratada, preferiblemente aquellas con
actividades complementarias que no se afectan adversamente entre
ellas. Tales moléculas se presentan adecuadamente en combinación, en
cantidades que son efectivas para un determinado propósito. Por
ejemplo, para un anticuerpo anti-HER2, se puede
añadir a la formulación un agente quimioterapéutico, tal como
taxoide o tamoxifén.
Los ingredientes activos se pueden también
entrampar en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, una microcápsula de hidroximetilcelulosa o de gelatina y
microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en microemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, Osol,
A. Ed. (1980).
La formulación a ser utilizada en la
administración in vivo debe ser estéril. Esto se cumple
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
sostenidas. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenidas incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos
hidrofóbicos que contienen la variante polipeptídica, estando estas
matrices en forma de artículos moldeados, por ejemplo películas o
microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida
incluyen poliésteres, hidrogeles, (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente US Nº
3.773.919) copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etilenvinil acetato no degradable, copolímeros degradables de ácido
láctico-ácido glicólico como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas
inyectables compuestas de copolímeros de ácido láctico-ácido
glicólico y acetato leuprólido) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
El polipéptido purificado tal y como se ha
descrito aquí o la composición que comprende el polipéptido y un
vehículo farmacéuticamente aceptable se utilizan, a continuación,
para diversos usos de diagnóstico, terapéutico u otros conocidos
para dichos polipéptidos y composiciones. Por ejemplo, el
polipéptido se puede utilizar para tratar un trastorno en un animal
mediante la administración de una cantidad terapéuticamente
efectiva del polipéptido a un mamífero.
Los siguientes ejemplos se muestran a modo de
ilustración y no de limitación.
La IgG rhuMAb HER2 humana de longitud completa
(humAb4D5-8 en Carter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 89: 4285-4289 (1992) que comprende la
secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la SEC ID Nº: 1 y la
secuencia aminoacídica de la cadena pesada de la SEC ID Nº: 2) se
produjo de manera recombinante en células CHO. Después de la
producción de la proteína y la secreción al medio de cultivo
celular, se separaron las células COS del medio de cultivo celular
mediante filtración de flujo tangencial (PROSTACK^{TM}). A
continuación, se llevó a cabo una cromatografía de Proteína A
aplicando directamente el fluido del cultivo celular recogido (HCCF)
de las células CHO a una columna PROSEP A^{TM} equilibrada
(Bioprocessing, Ltd).
Después de la cromatografía de Proteína A, se
llevó a cabo la cromatografía de intercambio catiónico utilizando
una columna de sulfopropil (SP)-SEPHAROSE FAST
FLOW^{TM} (SPSFF) (Pharmacia) para separar, además, la molécula
de anticuerpo anti-HER2 deseado. La operación de
cromatografía se llevó a cabo en el modo de unión y elución.
La columna SPSFF se preparó para cargar,
mediante lavados secuenciales con tampón de regeneración (0,025 M
MES/1,0 M NaCl, pH 5,6) seguido del tampón de equilibrio (0,025 M
MES/50 mM NaCl, pH 5,6). La columna se cargó, a continuación, con
el pool de Proteína A ajustado a un pH de 5,60 \pm 0,05 y
una conductividad de 5,8 \pm 0,2 mmhos. Antes de la elución, la
columna se lavó en tres etapas: (1) tampón de carga (0,025 M MES/50
mM, pH 5,6) por un un volumen mínimo de una columna; (2) tampón
intermedio (0,025 M MES/70 mM NaCl, pH 5,6) hasta que se alcanza un
ápice de un pico de 280 nm y; (3) tampón de lavado (0,025 M MES/50
mM NaCl, pH 5,6) para un mínimo de 1,2 volúmenes de columna. A
continuación, se eluye de la columna rhuMAb HER2 con un tampón de
elución (0,025 M MES/95 mM NaCl pH 5,6). El perfil de elución a 280
nm tiene un saliente en el borde frontal (Figura 3). En el punto de
inflexión de este saliente, empieza la agrupación y continúa durante
5 volúmenes más de columna. La columna, a continuación, se regeneró
con un tampón de regeneración (0,0025 M MES/1,0 M NaCl, pH
5,6).
Columna y preparación de carga: se
empaquetó una columna SPSFF a escala reducida. Las dimensiones
eran: volumen de 27,0 mL, diámetro de 1,0 cm altura del lecho de
34,5 cm. Se tituló el pH de una alícuota del pool de
Proteína A a 5,6 con base Tris 1,5 M. La conductividad del
pool se redujo mediante la adición de un volumen igual de
agua estéril para la inyección (SWFI).
Cromatografía: la cromatografía para este
estudio se llevó a cabo con el sistema FPLC de UNICORN^{TM}. Las
etapas de equilibrio, carga y lavado inicial se llevaron a cabo a
una velocidad de flujo lineal de 200 cm/h. Todas las etapas de
cromatografía se llevaron a cabo a una velocidad de flujo lineal de
100 cm/h. La secuencia de etapas de cromatografía se definen en la
Tabla 1. Se llevaron un total de seis cromatografías con densidades
de carga de 15, 20, 25, 30, 35 y 40 mg de rhuMAb HER2 por mL de
resina SPSFF.
\vskip1.000000\baselineskip
Proteína total: La concentración de
proteína de cada fracción cromatográfica (flujo continuo, etapas de
lavado, elución, de "prepool", "pool" de elución y
regeneración) se determinó por escaneados espectrofotométricos de
cada muestra. Los resultados se utilizaron para calcular los
rendimientos de recuperación de producto. El coeficiente de
extinción para rhuMAb HER2 es 1,45. Los cálculos utilizados para
derivar los resultados (Figura 4) son:
Concentración
de Proteína (mg/mL)= \frac{280 \ nm}{1.45} x factor de
dilución
Masa de
Proteína (mg) en cada fracción = Concentración de Proteína (mg/mL) x
Volumen de Fracción
(mL)
Rendimiento (%)
= \frac{Masa \ de \ Fracción \ (mg)}{Masa \ Total \ (mg)} x
100
Determinación de las variantes del anticuerpo
rhuMAb HER2 (CSxHPIEX): la columna de cromatografía de SPSFF de
rhuMAb HER2 resuelve las variantes del anticuerpo. Se analizaron las
fracciones de cada una de las cromatografías en estudio se ensayó
por la cantidad relativa de anticuerpo variante por cromatografía
CSxHPIEX. Se hizo correr una columna BAKERBOND
WIDE-PORE^{TM} CSx HPIEX (4,6 x 250 mm) a 1 mL/min
a 55ºC. La fase móvil se formó a partir de un gradiente terciario
(Tabla 2).
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La columna se hace correr a 1 mL/min a 55ºC.
El tampón A era MES 0,025M, pH 5,9; el tampón B
era acetato de amonio 1M, pH 7,0; y al disolución C era agua
estéril para la inyección. La columna se equilibró con las
condiciones iniciales de gradiente (49% A; 1% B; y 50% C) y se
inyectaron 200 \mul de muestra, diluidos con SWFI y que contenía
<300 \mug de proteína. Cada cromatograma resultante se integró
para determinar el porcentaje de área de cada pico para cada
fracción (Tabla 3 y Figura 5).
Cromatogramas comparados: los valores de
absorbancia (AU 280 nm) para cada archivo de cromatografía se
exportó a Unicorn en el formato ASCII. Los valores del lavado con
0,025 M MES/0,07 M NaCl, pH 5,6 se tradujo al formato Excel y se
copió en KALEIDAGRAPH^{TM}. Utilizando KALEIDAGRAPHTM, los
perfiles de lavado se cubren (Figura 6) y se compararon con cada
uno.
La variantes desamidadas y otras acídicas de
rhuMAb HER2 se produjeron cuando cuando el anticuerpo se preparó
mediante tecnología recombinante de DNA (véase, por ejemplo, CSx
picos a, b y 1 en la Figura 5). Las variantes desamidadas y otras
acídicas constituían aproximadamente un 25% (calculado como el área
bajo la curva integrada o el perfil obtenido por cromatografía CSx)
de la composición obtenida de la etapa de cromatografía inicial de
Proteína A. Se descubrió que el procedimiento de intercambio iónico
descrito en el presente documento se podría utilizar para reducir,
de manera sustancial, la cantidad de variantes desamidadas y otras
variantes acídicas en la composición anti-HER2, es
decir, hasta aproximadamente un 13% o menos (es decir, la cantidad
de variantes acídicas en la preparación sometida a la cromatografía
de intercambio catiónico según se ha descrito aquí disminuyó en por
lo menos aproximadamente un 50% o más).
El trazado de absorbancia de la columna de
intercambio catiónico ejecutada según se ha descrito más arriba se
muestra en la Figura 3. Este procedimiento resolvía una variante
desamidada del anticuerpo anti-HER2 que solo
difería ligeramente del anticuerpo anti-HER2 no
desamidado. El incremento en la conductividad de las condiciones
iniciales hasta el lavado intermedio empezó a eluir el anticuerpo
anti-HER2 desamidado. Sin embargo, el lavado
continuado a esta conductividad hizo eluir el anticuerpo
anti-HER2 no desamidado, resultando en una pérdida
de producto. Procediendo directamente del tampón intermedio al
tampón de elución se observó que resultaba en una extracción
inaceptablemente baja del anticuerpo anti-HER2
desamidado del producto si la recolección "pooling"
empezaba pronto o rendimientos inaceptablemente bajos del producto
anticuerpo anti-HER2 si la recolección
"pooling" decaía hasta que se reducía el anticuerpo
anti-HER2 desamidado. Se descubrió que volviendo a
una conductividad más baja como la utilizada inicialmente, la
elución del anticuerpo anti-HER2 desamidado
continuó, sin la elución significativa del producto anticuerpo
anti-HER2.
Se evaluó el efecto de cargar rhuMAb HER2 en (a)
requisitos del tampón, (b) recuperación del producto en el pool y
(c) la cualidad del producto en el pool.
A densidades de carga de 15 mg/mL hasta 35
mg/mL, el rendimiento de producto en el pool de elución es
aproximadamente del 75%. Para la densidad de carga de 40 mg/mL, el
rendimiento de producto en el pool disminuyó hasta un 65% (Figura
4). La recuperación reducida en el pool se atribuye ampliamente a un
incremento del anticuerpo en las dos etapas de lavado (a 70 mM NaCl
y 50 mM NaCl, respectivamente).
La cualidad de rhuMAb HER2 en todos los pools de
elución es equivalente cuando se determina mediante análisis de CSx
HPIEX (Figura 5). Comparado al material de carga: existe un
enriquecimiento del anticuerpo no desamidado (pico 3), no existe un
cambio en la cantidad de anticuerpo con
Iso-Asp^{102} o Lys^{450} (pico 4) y una
reducción de la cantidad del anticuerpo desamidado en Asp^{30}
(picos a, b y 1).
La cualidad en estos pools catiónicos de rhuMAb
HER2 se mejora mediante la etapa intermedia de lavado. Según se
incremente la masa de rhuMAb HER2 unido a la resina, se reduce el
consumo en volumen de tampón intermedio necesario para alcanzar el
ápice en el pico a 280 nm. El volumen de tampón requerido para una
densidad de carga de 40 mg/mL es aproximadamente de 2,5 volúmenes
de columna. El volumen de tampón requerido para una densidad de
carga de 15 mg/mL es aproximadamente 15 volúmenes de columna. El
incremento exacto del tampón requerido no es lineal con los cambios
incrementados de 5 mg/mL entre estos dos extremos. El incremento
mayor se observa entre las densidades de carga de 20 mg/mL y 15
mg/mL. Aquí el requerimiento dobla los 7,5 volúmenes de columna a
los previamente mencionados 15 volúmenes de columna de tampón. Si se
alcanza el ápice del pico de lavado con 70 mM de NaCl, sin embargo,
la cualidad del producto es equivalente para cualquiera de las
densidades de carga examinadas.
Este estudio determinó cuánto rhuMAb se puede
cargar en la resina SPSFF. Entre los rangos de 15 a 40 mg de
anticuerpo por mL de resina, no existe diferencia en la cualidad del
rhuMAb HER2 recuperado en el pool de elución. La cantidad de rhuMAb
HER2 recuperada, sin embargo, se reduce en aproximadamente un 10%
cuando se carga la resina con más de 35 mg/mL. Para rendimientos
consistentes se recomienda que 35 mg/mL sea la carga máxima para la
fabricación de rhuMAb HER2. Además, debido al incremento sustancial
en el requerimiento de volumen de lavado a 70 mM NaCl entre 20 y 15
mg/mL, se recomienda que 20 mg/mL sea la carga mínima para la
fabricación de rhuMAb HER2.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
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<210> 1
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<211> 214
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Se sintetiza la secuencia
\newpage
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 449
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Se sintetiza la secuencia
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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Claims (4)
1. Procedimiento para la purificación de un
anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y un
contaminante, en el que el contaminante es una variante ácida del
anticuerpo, cuyo procedimiento comprende las siguientes etapas
realizadas de manera secuencial:
(a) la unión del anticuerpo a una resina de
intercambio catiónico utilizando un tampón de carga, donde el
tampón de carga está a una primera conductividad y pH, donde la
cantidad de anticuerpo cargado en la resina de intercambio
catiónico varía de 20 mg a 35 mg del anticuerpo por ml de resina de
intercambio catiónico;
(b) el lavado de la resina de intercambio
catiónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o
pH que son superiores a las del tampón de carga para eluir el
contaminante del material de intercambio iónico;
(c) el lavado de la resina de intercambio
catiónico con un tampón de lavado que está a una tercera
conductividad y/o pH que son inferiores a las del tampón
intermedio; y
(d) el lavado de la resina de intercambio
catiónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o
pH que son superiores a las del tampón intermedio para eluir el
anticuerpo de la resina de intercambio iónico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la resina de intercambio catiónico comprende sulfopropilo
inmovilizado sobre agarosa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
anti-HER2.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el anticuerpo es humMAb4D5-B.
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