Si è diplomato all’Accademia nazionale di arte drammatica Silvio D'Amico prima di farsi le ossa al Teatro di Roma sotto la regia di Luca Ronconi. Ha iniziato la sua carriera a teatro (diretto da artisti come Ronconi e Gigi Proietti), prima di esordire al cinema nel 1995 nel dramma sulla boxe Pugili di Lino Capolicchio. Nel corso dell’ultimo decennio, Favino ha mostrato le sue doti versatili sia nel dramma che nella commedia in pellicole dirette da registi giovani e veterani, tra cui Luigi Magni (La Carbonara), Marco Bellocchio (Il Principe di Homburg, presentato in concorso a Cannes), Gabriele Muccino (L’Ultimo bacio, premio del pubblico al Sundance Film Festival del 2002 e nominato ai David di Donatello come miglior film), Giuseppe Tornatore (La Sconosciuta), Francesco Apolloni (La Verità, vi prego, sull'amore), Gianni Amelio (Le Chiavi di casa, Premio Pasinetti al Festival di Venezia del 2004), Michele Placido (Romanzo criminale), Ferzan Ozpetek (Saturno Contro) e Maria Sole Tognazzi (L'uomo che ama).

Tra i film americani a cui ha lavorato, figurano il grande successo Una notte al museo (Night at the Museum), in cui interpretava Cristoforo Colombo; Le cronache di Narnia: Il principe Caspian (The Chronicles of Narnia – Prince Caspian), nei panni di Lord Glozelle, e il dramma di Spike Lee sulla seconda guerra mondiale Miracolo a S. Anna (Miracle at St. Anna). Si è aggiudicato il David di Donatello come non protagonista per il ruolo del Libanese, un criminale senza scrupoli che punta a conquistare l’ambiente della malavita di Roma in Romanzo criminale, che ha ricevuto 14 candidature, compresa quella per il miglior film. Favino si è anche aggiudicato il Nastro d'Argento come miglior attore per la sua interpretazione, ottenendo un’altra candidatura allo stesso riconoscimento per Le chiavi di casa, questa volta come miglior non protagonista. Ha vinto il premio Diamanti come miglior attore al Festival di Venezia per Saturno Contro, mentre ha ricevuto la sua prima nomination ai David per il suo ruolo di supporto nei panni di un soldato della seconda guerra mondiale che combatte in Africa in El Alamein, diretto da Enzo Monteleone. In televisione, è stato impegnato con le storie biografiche Gino Bartali, l'Intramontabile e Pane e Libertà (sulla vita del sindacalista Giuseppe Di Vittorio). Ha anche partecipato a Padre Pio ed Enzo Ferrari assieme a Sergio Castellitto.