DE2155658C3

DE2155658C3 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper

Info

Publication number: DE2155658C3
Application number: DE2155658A
Authority: DE
Inventors: Antonius Hermanus Wilhelmus Maria Dr. Schuurs; Bauke Klaas Van Weemen
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1970-11-10
Filing date: 1971-11-09
Publication date: 1978-09-14
Also published as: ZA717192B; IT986829B; AU468060B2; FR2113733A5; GB1348935A; SE451162B; NL154598B; FI54033C; BR7107459D0; DE2155658B2; AU3508271A; DE2155658A1; CA967464A; NL7016396A; DK140268B; CH617774A5; ES396741A1; DK140268C; FI54033B; BE775187A

Description

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Zum Nachweis und zur Bestimmung niedermolekularer Substanzen, die in geringen Konzentrationen vorliegen, wie Steroidhormonen in Körperflüssigkeiten, wurden Verfahren entwickelt, bei denen Proteine verwendet werden, die fähig sind, die nachzuweisende 3<> Substanz spezifisch zu binden. Diese Verfahren beruhen auf der Konkurrenz zwischen der nachzuweisenden Substanz in der Probe und einer bekannten Menge der gleichen Substanz, die radioaktiv markiert ist, mit einer begrenzten Menge des spezifischen bindenden Proteins. Durch die unbekannte Menge der bindungsfähigen Substanz wird bestimmt, welcher Anteil der radioaktiv markierten Substanz an das spezifische bindende Protein gebunden wird.

Es ist auch möglich, mit Hilfe dieser Verfahren, eine unbekannte Menge eines spezifischen bindenden Proteins durch Umsetzung einer Probe, die eine unbekannte Menge des spezifischen bindenden Proteins enthält, mit einer bestimmten Menge einer bindungsfähigen radioaktiv markierten Substanz zu bestim- *5 men.

In der Literatur ist es üblich, diese Bestimmungsverfahren, je nach Art des verwendeten spezifischen bindenden Proteins zu unterscheiden, obwohl das grundlegende Prinzip all dieser Bestimmungen das gleiche ist. So wird z. B. von »konkurrierenden Protein-Bindungsversuchen« gesprochen, wenn Rezeptor- oder Transportproteine verwendet werden, die im Körper vorkommen und von »radioimmunologischen Bestimmungen«, wenn Antisubstanzen verwen- ^5S det werden.

Für beide Arten von Bestimmungen sind radioaktiv markierte Substanzen erforderlich. Das Arbeiten mit diesen Substanzen erfordert das Vorhandensein präziser Meßvorrichtungen, gut ausgerüstete Laboratorien und ein qualifiziertes Personal. Diese hohen Anforderungen machen eine allgemeine Anwendung dieser Bestimmungsverfahren besonders in kleineren Laboratorien unmöglich.

Aus der USA.-Patentschrift 35 05 019 ist ein Ver- ⁶S fahren zur Bestimmung von Vitamin B 12 in einer wäßrigen Probe bekannt, bei dem ein wasserunlösliches Polymer, an das Intrinsicfaktor gebunden ist, mit der zu untersuchenden Probe und radioaktiv markiertem B 12 zusammengebracht wird. In Bull. Soc. Chem. Biol., 50, 1968, Nr. 5/6, S. 1169 bis 1178 ist angegeben, daß es möglich ist, ein Antigen mit einem Enzym zu markieren und dann mit dem entsprechenden Antikörper auszufällen. In Science, Vol. 168, 1970, S. 1347 und 1348 ist ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Morphin bekannt, bei dem Morphin mit einem Protein gekuppelt und das Konjugat mir einem radioaktiv markierten Antikörper ausgefällt und die Radioaktivität des Niederschlages gemessen wird.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper zu entwickeln, das einfach und bequem durchgeführt werden kann, kein Arbeiten mit radioaktiven Substanzen erfordert und in kurzer Zeit zu zuverlässigen reproduzierbaren Ergebnissen führt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper unter Ausnutzung der für derartige Substanzen bekannten Bindungsaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bestimmung mit einer bestimmten Menge eines Kopplungsproduktes aus dem Hapten und einem Enzym und einem in unlösliche Form gebrachten Bestandteil der Reaktion Hapten-Antikörper durchgeführt wird und die Enzymaktivität in der flüssigen oder festen Phase bestimmt wird.

Haptene sind nach der Definition von K. Landsteiner proteinfreie Substanzen mit einem Molekulargewicht bis zu ungefähr 1500, die mit spezifischen Antikörpern reagieren, jedoch nicht selbst zur Bildung von Antikörpern führen können. Um jedoch trotzdem Antikörper zu Haptenen bilden zu können, müssen die Haptene, bevor sie dem Testtier injiziert werden, an Polypeptide gekuppelt werden. Daraus resultieren besondere Schwierigkeiten beim Arbeiten mit Haptenen. Da es bekannt ist, daß durch die Kupplung einer immunogenen Komponente, z. B. eines Antikörpers an ein unlösliches Polymer die Reaktionsfähigkeit einer solchen Komponente gegenüber dem entsprechenden Antigen vermindert wird, war zu befürchten, daß ein Antikörper der gegen das Kupplungsprodukt eines Haptens mit einem Protein (z. B. Albumin) gebildet worden ist und der anschließend durch Binden an ein unlösliches Polymer unlöslich gemacht worden ist, mit dem reinen Hapten nicht mehr reagieren würde.

Umso mehr mußte der Fachmann davon ausgehen, daß ein solcher unlöslich gemachter Antikörper mit einem Hapten, das auch noch an ein Enzym gekuppelt ist, nicht mehr reagieren würde. Da ein Hapten eine niedermolekulare Substanz und ein Enzym ein voluminöser Proteinkomplex ist, mußte angenommen werden, daß sowohl eine zu starke sterische Hinderung als auch besondere Schwierigkeiten beim Nachweis des Haptens eintreten wurden. Das ist überraschenderweise nicht der Fall, sondern es hat sich gezeigt, daß durch Verwendung eines derartigen Hapten-Enzym-Komplexes ein sehr empfindliches genau reproduzierbares und einfaches Testverfahren zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper möglich wird.

Bei der Bestimmung eines Haptens konkurriert dieses Hapten und sein Kopplungsprodukt mit einem Enzym um eine bestimmte Menge des unlöslichen spezifischen Antikörpers. Je mehr Hapten die Probe enthält, um so geringer ist die Chance, für das

Kopplungsprodukt aus dem löslichen Enzym und dem Hapten sich mit dem unlöslichen spezifischen Antikörper zu verbinden und um so mehr des Kopplungsproduktes bleibt in der flüssigen Phase zurück, in der die Enzymaktivität auf einfache Weise gemessen werden kann.

Bei der Bestimmung eines spezifischen Antikörpers mit den gleichen Reagentien treten der zu bestimmende lösliche Antikörper und der unlösliche Antikörper in Konkurrenz um eine bestimmte Menge des Kopplungs-Produktes ays dem Hapten und dem Enzym. Wenn der Gehalt an Antikörper in der Probe höher ist, wird der unlösliche Antikörper weniger von dem Enzym-Kopplungsprodukt binden und folglich bleibt mehr Enzym in der flüssigen Phase zurück.

Ein spezifischer Antikörper mit zwei oder mehr bindenden Stellen kann ebenfalls nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen und bestimmt werden, d. h. mit dem Enzym-Kopplungsprodukt und dem Hapten in unlöslicher Form. Die flüssige Phase ao des Reaktionsgemisches kann dann das Kopplungsprodukt an den Antikörper gebunden enthalten und in der festen Phase kann der Komplex aus Enzym-Kopplungsprodukt und Antikörper und dem in Wasser unlöslichen Hapten enthalten sein. Je mehr des »5 zu bestimmenden Proteins in der Probe enthalten ist, um so mehr Enzymaktivität besitzt die flüssige Phase.

Mit Hilfe einer Bestimmungskurve für ein bestimmtes System, bei dem der zunehmende Gehalt an dem zu bestimmenden Hapten oder Antikörper gegen die gefundene Enzymaktivität, vorzugsweise in der flüssigen Phase, aufgetragen ist, kann die Menge des in der Probe enthaltenen Haptens oder Antikörpers für den gefundenen Wert für die Enzymaktivität abgelesen werden.

Das wichtigste Reagens für dieses Bestimmungsverfahren ist das Kopplungsprodukt aus dem Hapten und einem Enzy.n, im folgenden auch Enzym-Kopplungsprodukt genannt, das einerseits mit dem spezifisehen Antikörper über das Hapten reagieren kann und andererseits Enzymaktivität besitzt. Dieses Reagens wird nach einem für ähnliche Produkte beschriebenen Verfahren hergestellt. Das zweite Reagens, die unlösliche Komponente in dem Reaktionssystem dient zur Erleichterung der Trennung der verschiedenen enzymhaltigen Fraktionen des Reaktionsgemisches. Die Zugabe dieses Reagenses führt zur Bildung einer festen Phase neben einer flüssigen Phase.

Die Enzymaktivität einer Fraktion des Reaktions- 5<> gemisches kann bestimmt werden, indem diese Fraktion mit einem Substrat und anderen Substanzen zur Durchführung einer Enzymreaktion inkubiert wird. Besonders geeignet ist dabei eine Reaktion, bei der eine gefärbte Verbindung gebildet oder entfernt wird, deren Absorption auch leicht quantitativ gemessen werden kann. Vorzugsweise wird als Enzym eine Oxidoreduktase verwendet.

Haptene, die nach dem neuen Verfahren nachgewiesen werden können sind z. B. Steroide, Vitamin B₁₂, Folinsäure, Thyroxin und Trijodothyronin, releasing factors, Histamin, Serotonin und andere biogene Amine, Digoxin, Digitoxin, Prostaglandine, Adrenalin, Nor-Adrenalin, pflanzliche Hormone, wie Auxin, Kinetin, GibereMinsäure und Antibiotika, wie Peni- ^e5 cillin.

Das Verfahren zum Nachweis spezifischer Antikörper für Haptene kann angewandt werden, z. B. zur Bestimmung von Antikörpern gegen Penicillin oder zur Bestimmung des Intrinsik-Faktors.

Im Folgenden wird die Erfindung durch allgemeine und spezielle Beispiele näher erläutert.

Die Herstellung von Kopp.'ungsprodukten von Enzymen und Haptenen kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Einige Haptene können schon Gruppen besitzen, die mit reaktionsfähigen Gruppen an der Oberfläche des Enzyms vernetzt werden können, während andere erst derartige Gruppen durch chemische Reaktion erhalten müssen. Es ist selbstverständlich, daß die ursprünglichen Bindungseigenschaften des Haptens und die Aktivität des Enzyms während dieses Verfahrens nicht wesentlich geändert werden können. Die Gruppen des Enzyms, die besonders geeignet sind für Kopplungsreaktionen sind Amino- und Carboxylgruppen. Wenn das modifizierte oder nichtmodifizierte Hapten ebenfalls derartige Gruppen besitzt, kann die Kopplung z. B. durch Reaktion, wie sie aus der Peptidsynthese bekannt sind, durchgeführt werden. Darüberhinaus können solche Substanzen, wie Glutaraldehyd, Difiuordinitrodiphenylsulfon, Toluoldiisocyanat, Di- und Trichlor-s-triazin für die Kopplungsreaktion verwendet werden.

Spezielle Beispiele für die Kopplung von Haptenen mit Proteinen sind z. B. in Methods in Immunology and Immunochemistry, Bd. 1, beschrieben. Die dort beschriebenen Verfahren werden angewandt zur Herstellung von Kopplungsprodukten zur Immunisierung, sie können jedoch auch zur Herstellung von Kopplungsprodukten des Haptens mit einem Enzym angewandt werden, die für das erfindungsgemäße Verfahren wichtig sind.

Die Wahl des Enzyms, das eine Komponente für das Kopplungsprodukt aus Hapten und Enzym ist, hängt ab von Eigenschaften wie der spezifischen Aktivität (eine hohe Umwandlungsrate vergrößert die Empfindlickheit des Testsystems) und der Einfachheit der Bestimmung des Enzyms. Die Bestimmung eines Enzyms, das eine Umwandlung katalysiert, bei der gefärbte Produkte entstehen oder verschwinden, ist einfach. Derartige colorimetrische Bestimmungen können auf einfache Weise automatisiert werden.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Enzyme zu verwenden, die Umwandlungen katalysieren, bei denen Komponenten auftreten oder verschwinden, die spektrophotometrisch oder fluorimetrisch bestimmt werden können. Diese Bestimmungen können ebenfalls automatisiert werden.

Für die Herstellung der Kopplungsprodukte sind Enzyme wie Katalase, Peroxidase, /3-Glukuronidase, /?-D-Glukosidase, /S-D-Galactosidase, Urease, GIukose-oxidase und Galactose-oxidase geeignet, bevorzugt wird die Gruppe der Oxidoreduktasen.

Der unlösliche spezifische Antikörper oder das unlösliche Hapten, die bei der erfindungsgemäßen Bestimmung verwendet werden, können auf bekannte Weise, z. B. durch Vernetzung mit Chlor-ameisensäure-äthylester, durch kovalente Bindung mit unlöslichen Trägern wie Agarose, Vernetzung mit Dextran oder Filterpapier oder durch physikalische Kopplung an unlösliche Träger, wie Kunststoffe, hergestellt werden.

Die Form, in der die Reagentien verwendet wenden können, ist vielfältig. Die Komponente des Reaktionssystems, die mit einem Enzym gekoppelt ist, kann gefriergetrocknet oder in einem Puffer gelöst sein. Darüberhinaus kann ein fester Träger, z. B. ein Papier-

streifen, der mit dem Kopplungsprodukt imprägniert ist, verwendet werden.

Die unlösliche Komponente kann in Form von Teilchen verschiedener Form, wie Körner, Kugeln und Stäbchen oder in Form eines Streifens des einen oder anderen Trägermaterial gebracht werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Testpackung verwendet werden, die hauptsächlich bestellt aus:

a) einer bestimmten Menge des Kopplungsproduktes aus einem Hapien und einem Enzym;

b) einer entsprechenden Menge einer der Komponenten des Reaktionssystems in unlöslicher Form;

c) einem Substrat zur Bestimmung der Aktivität des verwendeten Enzyms.

Wenn erforderlich, kann die Testpackung auch die notwendigen Hilfsmittel zur Herstellung einer Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Probe für eine quantitative Bestimmung, wie Reagenzgläser, Pipellen und Kolben mit Verdünnungsmittel, enthalten.

Die Erfindung wird durch die folgenden speziellen Beispiele noch näher erläutert:

Beispiel I

Bestimmung von Testosteron
A) Herstellung von Testosteron-3-HRP

100 mg Testosteron-3-(0-earboxymethyl)-oxim und 0,143 ml Tri-n-buiylamin wurden in 5ml Dioxan gelöst. Die Lösung wurde auf 2 C abgekühlt und dann wurden 0.0" ml Isobutylchlorcarbonat zugegeben. Nach 30 min wurde die Lösung zu 100 mg HRP (Meerrettichperoxidase) in einem Gemisch von 9 ml Wasser und 6 ml Dioxan zugegeben und mit 0,1 η NaOH auf einem pH-Wert von 9 eingestellt. Diese Lösung wurde 4 h bei 2 C gerührt und über Nacht dialysiert. Der Niederschlag, der nach Einstellung des Dialysats auf einen pH-Wert von 4.6 erhalten worden war, wurde nachdem er über Nacht stehengelassen worden war. zentrifugiert, in 10 ml Wasser suspendiert und mit Hilfe von Natronlauge gelöst. Das Material wurde dreimal mit 15 ml Aceton bei einem pH-Wert von 4,5 ausgefällt, in 15 ml Wasser, das mit Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt war, gelöst, dialysiert und schließlich lyophilisiert.

B) Herstellung von Testosteron-3-BSA

Dieses Kopplungsprodukt wurde auf die gleiche Weise wie das Testosteron-3-HRP hergestellt, wobei so jedoch als Ausgangsmaterial 50 mg Testosteron-3-(O-carboxymethyl)-oxim und 150 mg BSA (Rinderserumalbumin) verwendet wurden.

C) Herstellung von Antikörpern gegen Testosteron-3-BSA

5 Kaninchen wurden intramuskulär zunehmende Dosen von Testosteron-3-BSA in vollständigem Freund'schen Adjuvans (0,5,1 und 2 mg) in Intervallen von 3 Wochen injiziert. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurden den Tieren intravenös 2 mg Antigen in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Eine Woche danach wurde den Tieren Blut abgenommen. Die gegen BSA gebildeten Antikörper wurden entfernt, indem das Serum anteilweise mit BSA-m-amino- ^6s benzyloxymethylcellulose, die nach dem Verfahren von Gurvich (siehe D) hergestellt worden war, behandelt wurde.

D) Herstellung von Antitestosteroncellulose

Diese Substanz wurde entsprechend dem von Gurvich in Biokhimiya 26,934(1961) beschriebenen Vcrfahren hergestellt.

1. Herstellung von »Aminocellulose«:

50 g Whatman Cellulose, die mehrfach gewaschen und dekantiert worden war, wurden in 100 ml

ίο einer 0,7"„igen Natriumacetatlösung suspendiert, die 2 g N(m-Nitrobenzoxy)-methylpyridin enthielt. Das Gemisch wurde bei 60 bis 80 C getrocknet und 40 min auf 125 C erhitzt. Das entstehende Produkt wurde gründlich mit deslilliertem Wasser gewaschen, bei 80 C getrocknet, mit Benzol gewaschen und erneut getrocknet. 50 g des getrockneten Produktes wurden durch Suspension in 300 ml einer 15%igen Na₂S₂O₄-Lösung reduziert und 30 min bei 50 bis 60 C gerührt. Das

»o Produkt wurde filtriert und nacheinander mit destilliertem Wasser, 30%iger Essigsäure und wieder mit destilliertem Wasser gewaschen.

2. Behandlung mit ammoniakalischer Kupferlösung:

>5 40 ml 10%iger Schwefelsäure, 20 ml 50%iger Salpetersäure und 140 ml destilliertes Wasser wurden unter Rühren auf 90' C erhitzt. Anschließend wurden 5,9 g CuO in kleinen Anteilen zugegeben. Die Lösung wurde 2 h zum Sieden erhitzt

)o und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt. 80 ml dieser Lösung wurden in ein Eisbad gegeben und unter Rühren zu 160 ml kalter 4 η NaOH zugegeben. Nach 30minütigem Rühren wurde der Niederschlag zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in 80 ml 25 %igem Ammoniak gelöst. Zu dieser Lösung wurde nach und nach I g »Aminocellulose« zugegeben. Das Gemisch wurde 1V₂ h gerührt und anschließend wurden 40 ml siedendes Wasser zugegeben und die Lösung schnell auf 0⁰C abgekühlt. Die Lösung wurde mit 10%iger Schwefelsäure neutralisiert, worauf die Aminocellulose ausflockte. Sie wurde mit kaltem destillierten Wasser gewaschen.

3. Herstellung von y-Globulin:

Zu Kaninchen Antitestosteronserum wurden 180 mg Na₂SO₄ pro ml Serum zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und der entstehende Niederschlag zentrifugiert, zweimal mit einer 18%igen Na₂SO₄-LoSUHg gewaschen und in so viel 0,05 m Natriumborat mit einem pH-Wert von 8,6 aufgenommen, daß die Proteinkonzentration ungefähr 10 mg/ml betrug.

4. Bindung des /-Globulins an Aminocellulose:

350 mg »Aminocellulose« wurden in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde auf 0⁰C abgekühlt. 10 ml 36%ige Salzsäure wurden zugegeben und anschließend 10 ml I0%ige NaNO₂-Lösung zugetropft. Die Suspension wurde zentrifugiert, mit kaltem destillierten Wasser und anschließend mit 0,05 m Natriumborat mit einem pH-Wert von 8,6 gewaschen. Die Cellulose wurde in 43 ml 0,05 m Natriumborat mit einem pH-Wert von 8,6 suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 7 ml der wie oben hergestellten y-JGlobulinlösung zugegeben. Das Gemisch wurde 26 h bei 4° C gerührt, zentrifugiert und mit 0,02 m Phosphatpuffer

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mit einem pH-Wert von 6,0 gewaschen. Von dem Antiseruni jedes der 5 immunisierten Kaninchen wurde eine Cellulosesuspension hergestellt (A bis E).

E) Bestimmung von Testosteron mit Hilfe von Testosieron-3-HRP und Antiteslosteroncelliilose

Das folgende System wurde aufgebaut:

I) Immunrcaktioii

0,5 ml einer Probe, enthüllend Testosteron, 0,2 ml Testosteron-.i-HRl¹ {[00 mg/ml) und 0.3 ml einer Aniitestosteroncellulose-Suspension wurden 2 h bei Raumtemperatur rotiert und dann 5 min mit 1000 g zentrifugiert.

Die Immunreaklion fand in 0,02 in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,0, enthaltend 2% Schafserum, statt.

II) Enzymrcaktion

0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit wurden bei Raumtemperatur mit 1,5 ml Substrat 30 min inkubiert. Die Extinktion wurde bei 460 nm gemessen.

Das Enzymsubstrat enthielt 10 μΐ, 30%iges Wasserstoffperoxid und 20 mg 5-Aminosalicylsäure in 150 ml 0,02 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,2.

Die Fig. I zeigt Meßwerte, bei denen Testosteron-3-HRP an die Antitestosteroncellulose-Zubereitungen gebunden worden ist. In diesem Falle wurde nur Puffer als Probe in dem Testsystem zugegeben. Wenn Cellulose an Stelle von Antitestosteroncellulose zugegeben wird, bleiben mehr als 95% der Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit enthalten. Die Zubereitungen B, D und E zeigten, daß fast kein Testosteron-3-HRP gebunden worden war, jedoch bei den Zubereitungen A und C.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Inkubation einer Testosteronverdünnungsreihe mit Testosteron-3-HRP bei vier verschiedenen Konzentrationen von Antistestosteroncellulose C.

mg/ml (I), 2 mg/m! (II), 4 mg/ml (III) und 16 mg/ml (IV). Es ist offensichtlich, daß mit diesem System eine Menge von ungefähr 10 ng Testosteron gezeigt werden kann.

Beispiel 2
Bestimmung von Östradiol

A) Östradiol-n-succinyl-HRP wurde hergestellt durch die in Beispiel 1 A) beschriebene gemischte Anhydrid-Methode, wobei 50 mg Östradiol-17-hemisuccinat und 50 mg HRP als Ausgangsmaterialien verwendet wurden.

B) Östradiol-H-succinyl-BSA wurde nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen gemischten Anhydrid-Methode hergestellt, wobei 100 mg Östradiol-17-hemisuccinat und 150 mg BSA als Ausgangsmaterialien verwendet wurden.

C) Zur Herstellung der Antikörper geten östradiol-17-succinyl-BSA wurden 5 Kaninchen nach dem in Beispiel 1 C) beschriebenen Schema immunisiert. Die Sera wurden mit BSA-m-Ammobenzyloxymethylcellulose absorbiert.

D) Antiöstradiolcellulose wurde auf die in Beispiel 1 D) für Anlitestosteroneellulose beschriebene Weise hergestellt. Von jedem der immunisierten Kaninchen wurde eine Cellulosezubereitung hergestellt, die mit 16 bis einschließlich 20 numeriert wurden.

IZ) Die Untersuchung wurde analog derjenigen für Testosteron in Beispiel 1 L·) durchgeführt.

Die Fig. 3 und 4 zeigen einige Ergebnisse. Die ίο Fig. 3 zeigt, daß drei verwendbare Antisera durch die Immunisierung erhalten wurden, on denen 17 den höchsten Titel besitzt. Die l-'ig. 4 zeigt das Testsystem, bei dem Antiöstradiolcellulose 17 in einer Konzentration von 8 mg/ml verwendet wurde. Das System unterscheidet nicht zwischen östron und 17 /3-Östradiol. 17 ,/-Östradiol, besonders Östriol, zeigen eine geringere Kreuzreaktion. Testosteron und Progesteron beeinflussen das System nur in sehr hohen Konzentrationen.

Beispiel 3

Bestimmung von Antikörpern gegen Penicillin
Penicilloyl-Katalase

30 mg Benzylpenicillinsäure wurden in 5ml96%igem Äthanol gelöst und zu 200 mg Katalase in 45 ml 0,1 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 zugetropft. Die Reaktion wurde 2 h fortgesetzt, wobei der pH-Wert mit 0,5 η NaOH zwischen 7,2 und 8,2 gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde gegen 6-31 0,02 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 dialysiert.

Auf die gleiche Weise wurden 250 mg Benzylpenicillinsäure an 5 g m-Aminobenzyloxymethylcellulose, die nach dem Verfahren von Gurvich (Biokhitniya 26, 934 ['%!]) hergestellt worden war, gekoppelt. Das Kopplungsprodukt wurde jedoch nicht dialysiert. sondern auf einem Glasfilter gewaschen.

Eine Überempfindlichkeit von Menschen gegenüber Penicillin konnte auf folgende Weise gezeigt werden: 0,2 ml einer Probe von nicht-hämolysiertem Serum wurden mit 0,5 ml einer Lösung von Penicilloyl-Katalase (1:800) vermischt. Nach 30 min wurden 10 mg Penicilloyl-m-aminobenzyloxymethylcellulose zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min rotiert und anschließend die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, indem 0,02 ml dieser Flüssigkeit zu 2,8 ml 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 zugegeben wurden, der 1,2 μΐ 30%iges H₂O₂ enthielt und anschließend die Abnahme der Extinktion bei 240 nm gemessen wurde. Im Serum von Patienten, die gegenüber Penicillin überempfindlich waren, wurde eine geringere Enzymaktivität in der Flüssigkeit gefunden als bei Kaninchenserum. Die Werte für Menschen, die nicht überempfindlich waren, wichen nicht wesentlich von denjenigen mit Kaninchenserum ab.

Beispiel 4

Bestimmung von Folinsäure A) Herstellung von Folatglukoseoxidase 200 mg Glukoseoxidase (140 IU/mg) wurden in 10 mg PBS (mit Phosphat gepufferte Salzlösung, eine phosphathaltige physiologische Kochsalzlösung) mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst. 30 mg 1 -Cyclohexyl -3- (2-morpholinoäthyl) - carbodiimi d (MCDI) wurden zugegeben und anschließend 24 mg Folinsäure. Die Reaktion dauerte 2 h und anschließend wurde eine sorgfältige Dialyse gegen PBS mit einem pH-Wert von 7,0 durchgeführt.

B) Herstellung von Folat-MBSA (methyliertes Rin derserumalbumin) Folat-MBSA wurde hergestellt nach dem von Ricker und StoI lar beschriebenen Verfahren (Biochemistry 6, 2001 [1967]). 25 mg MCDI wurden zu 50 mg BSA in 50 ml Wasser zugegeben und anschließend 20 mg Folinsäure. 2 h später hatte sich ein gelber Niederschlag gebildet. Schließlich wurde das ganze Reaktionsgemisch eine beträchtliche Zeit gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.

C) Herstellung von Antiserum gegen Folat-MBSA

Am Tage 0, 21 und 42 wurden jeweils 4 Kaninchen intramuskulär 2 mg Folat-MBSA in vollständigem Freund'schen Adjuvans und am Tage 35 intravenös 2 mg Folat-MBSA in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Am Tage 49 wurde den Tieren Blut abgenommen.

D) Antifolatcellulose wurde entsprechend dem in Beispiel 1 D) beschriebenen Verfahren hergestellt.

E) Bestimmung von Folinsäure

100 μΙ der zu untersuchenden Probe und 700 μΙ einer Antifolatcellulose-Suspension wurden 3 h rotiert. 200 μΐ Folatglukoseoxidase (1: !500) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde nochmals 3 h rotiert und zentrifugiert und anschließend die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt. Diese Bestimmung wurde durchgeführt durch Vermischen von 0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit mit einer Lösung von 50 mg Glukose, 10 μg HRP und 1 mg 5-Aminosalicylsäure in 2,5 ml 0,05 η Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und Messung der Extinktion nach 30 min bei 460 nm.

Fig. 5 zeigt den Prozentsatz des gebundenen Enzyms gegen die Konzentration der Antifolatcellulose.

Fig. 6 zeigt die Empfindlichkeit des Testsystems in einer Antifolatcellulose-Konzentration von 2 mg/ml und die Wirkung von Glycin, Asparagin, Alanin und Glutaminsäure.

Beispiel 5
Bestimmung von Digoxin

A) Herstellung von Digoxin-HRP

Zu 22 mg Digoxin, in 1 ml abs. Äthanol suspendiert, wurde unter Rühren I ml 0,1 m Natriummetaperjodat zugetropft. Nach 25 min wurden 0,3 ml 0,1 m Äthylenglykol zugegeben. 5 min spätur wurde dieses Gemisch unter Rühren zu einer Lösung von 32 mg Meerrettichperoxidase (HRP) in I ml destilliertem Wasser zugetropft, das mit 5%iger K₂CO₃-Lösung auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt war. Während der Reaktion wurde der pH-Wert durch Zugabe 5%iger K₂CO₃-Lösung auf 9 bis 9,5 gehalten. Als der pH-Wert stabil war, wurden 15 mg NaBH₁ in 1 ml destilliertem Wasser zugegeben. Nach 3 h wurde der pH-Wert mit 1 m Ameisensäure auf 6,5 eingestellt. 1 h später wurde 1 m NH₄OH zugegeben, bis ein pH-Wert von 8,5 erreicht war. Das Gemisch wurde über Nacht gegen kaltes fließendes Wasser dialysiert. Schließlich wurde der pH-Wert mit 0,1 η Salzsäure auf 4,5 eingestellt. Das Gemisch wurde I h bei Raumtemperatur und 4 h bei 4°C stehengelassen, um einen Niederschlag zu erhalten, der 1 h bei 1000 g zentrifugiert wurde. Der Niederschlag wurde in 5 ml 0,1 m NaHCO₃ gelöst, gründlich dialysiert und gefriergetrocknet.

B) Herstellung von Digoxin-BSA

Dioxiii-Rinderserumalbiimin (BSA) wurde auf die gleiche Weise, wie sie oben für Digoxin-HRP angegeben ist, hergestellt, wobei jedoch von 436 mg Digoxin und 560 mg BSA ausgegangen wurde und die Mengen der anderen Reagenzen in gleichem Verhältnis erhöht wurden wie das Dioxin.

C) Herstellung von Antikörpern gegen Dioxin

5 Kaninchen wurden 400, 800 bzw. 1600 μg Dioxin-BSA im Abstand von 14 Tagen injiziert.

Das Immunogen wurde mit vollständigem Freund'-schen Adjuvans vermischt und intramuskulär verabreicht. 14 Tage nach der letzten Injektion wurde den Tieren intravenös 800 μg Digoxin-BSA in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. 10 Tage später wurde den Tieren das Blut entnommen. Das Serum wurde mit BSA-m-Aminbenzyloxymethylcellulose adsorbiert.

^a5 D) Herstellung von Antidigoxincellulose

Antidigoxincellulose wurde nach dem Gurvich-Verfahren, wie unter 1 D) beschrieben, hergestellt.

E) Bestimmung von Digoxin

Eine Verdünnungsreihe wurde mit Digoxin in 0,1 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 hergestellt, enthaltend 0,9% NaCi, 0,5% Tween-20 und 1,0% BSA. Die Verdünnungsreihe ging von 0,1 bis 100 ng/ml. 1 ml einer Digoxin-Lösung wurde mit 0,1 ml Digoxin-HRP in einer geeigneten Verdünnung vermischt und anschließend wurden 2 mg Antidigoxincellulose, die in 0,4 ml Puffer suspendiert war, zugegeben. Das Gemisch wurde 6 h bei Raumtemperatur rotiert und anschließend zentrifugiert und die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt.

Zugabe von 0,8 ng Digoxin führte zu einer meßbaren Zunahme der Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit. Digoxin allein zeigte eine geringe Kreuzreaktion in dem System während Cholesterin, Cortisol, Östradiol, Testosteron und Progesteron keine Kreuzreaktion in dem System zeigten.

Beispiel 6
Bestimmung von Cortisol

A) Herstellung von CortisoI-21-gaIactose-oxidase

50 mg Cortisol-21-hemisuccinat und 100 mg Galactoseoxidase wurden nach dem in Beispiel 1 A) beschriebenen gemischten Anhydridverfahren hergestellt.

B) Herstellung von unlöslichem Transcortin

100 mg Transcortin, das durch Chromatographie mit DEAE, Cellulose bzw. Hydroxylapatit gereinigt worden war, wurden folgendermaßen mit Hilfe des CNBr-Verfahrens an 3 g Sepharose 4 B gekoppelt: 3 g Sepharose 4 B-Suspension wurden aktiviert durch Vermischen mit 4 ml einer 2,5%igen (Gewicht/Volumen) CNBr-Lösung in destilliertem Wasser und anschließend wurde der pH-Wert mit 1 η NaOH auf 10 bis 11 eingestellt

und 6 min auf diesem Wert gehalten. Die Sepharose wurde mit Eiswasser und 0,1 m NaHCO₃ gewaschen. Dann wurden 100 mg Transcortin in 20 ml 0,1 m NaHCO₃ zugegeben und die Suspension 24 h bei 4 C geschüttelt. Dann wurde nacheinander mit 0,5 m NaHCO₃, 0,05 m Citratpuffer mit einem pH-Wert von 1,1 und 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6 gewaschen und die Sepharose in dem letzten Puffer gelassen, zu dem 0,1 % Merthiolat zugegeben worden war.

C) Bestimmung von Cortisol

0,5 ml einer cortisolhaltigen Probe (Standard, Plasma oder Urin) wurden zweimal mit Methylenchlorid extrahiert (2 · 3 ml). Die vereinigten Auszüge wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und mit 0,2 ml Cortisol-21-galactose-oxidase in einer geeigneten Konzentration und 0,3 ml Transcortin-Sepharose-Suspension ^ao (5 mg/ml) vermischt. Das Gemisch wurde 15 min bei 4 C rotiert und zentrifugiert. Anschließend wurde die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit durch Zugabe von 0,5 ml dieser Flüssigkeit zu 1,5 ml eines Substrats bestimmt. Das »5 Substrat bestand aus 100 mg D-Galactose, 20 mg 5-Aminosalicylsäure und 10 ,ug Peroxidase in 450 ml 0,02 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0. 30 min später wurde die Extinktion bei 460 mn gemessen.

5 ng/ml Cortisol in der Probe führten zu einer meßbaren Zunahme der Enzymaktivilät in der überstehenden Flüssigkeit. Corticosteron und Progesteron beeinflussen d"s System nur, wenn größere Mengen zugegeben wurde. Testosteron und Aldosteron besaßen kaum einen Einfluß.

Beispiel 7
Bestimmung von Transcortin

Die zur Bestimmung von Cortisol, wie in Beispiel 6 beschrieben, verwendeten Reagentien wurden ebenso zur Bestimmung von Transcortin verwendet.

Von einer Verdünnungsreihe von Transcortin von 0 bis 1280 ng/ml wurden 0,5 ml 15 min bei 4"C mit 0,2 ml Cortisol-21-galactose-oxidase in einer entsprechenden Verdünnung inkubiert. Zu dieser Verdünnungsreihe wurden 0,3 ml Transcortin-Sepharose (15 mg/ml) zugegeben und das Gemisch 15 min bei 4 C rotiert. Die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, gemessen.

Eine Probe, enthaltend 40 ng/ml Transcortin, zeigte eine meßbare Zunahme der Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit, während sich bei Gegenwart von 320 ng/ml die gesamte Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit fand.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von einem Hapten oder dessen Antikörper unter Ausnutzung der für derartige Substanzen bekannten Bindungsaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mit einer bestimmten Menge eines Kopplungsproduktes aus dem Hapten und einem Enzym und einem in unlösliche Form gebrachten Bestandteil der Reaktion Hapten-Antikörper durchgeführt wird und die Enzym-Aktivität in der flüssigen oder festen Phase bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vitamin oder Hormon als Hapten verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eineOxidoreduktase als Enzym verwendet wird. *>