HUP0300810A2 - Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása - Google Patents
Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0300810A2 HUP0300810A2 HU0300810A HUP0300810A HUP0300810A2 HU P0300810 A2 HUP0300810 A2 HU P0300810A2 HU 0300810 A HU0300810 A HU 0300810A HU P0300810 A HUP0300810 A HU P0300810A HU P0300810 A2 HUP0300810 A2 HU P0300810A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- smooth muscle
- nucleic acid
- vascular graft
- endothelial cells
- Prior art date
Links
- 230000002792 vascular Effects 0.000 title claims abstract description 250
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 101
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 232
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 144
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 114
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 65
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 54
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 133
- 102100028065 Fibulin-5 Human genes 0.000 claims description 132
- 101001060252 Homo sapiens Fibulin-5 Proteins 0.000 claims description 132
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 75
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 74
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 66
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 66
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 66
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 55
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 18
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 17
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 229920000295 expanded polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 15
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 5
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims description 5
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims description 5
- 101710170766 Fibulin-5 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 5
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 claims description 5
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 claims description 5
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 claims 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 claims 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 158
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 72
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 69
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 64
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 60
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 239000000463 material Substances 0.000 description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 24
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 23
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 23
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 22
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 19
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 18
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 14
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 13
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 13
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 8
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 8
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 6
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 108091033411 PCA3 Proteins 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 6
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 6
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 6
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 4
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 4
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 3
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000001349 mammary artery Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 208000014173 thrombophilia due to thrombin defect Diseases 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-[(4-methyl-2-nitrophenyl)diazenyl]-N-(3-nitrophenyl)naphthalene-2-carboxamide Chemical compound Cc1ccc(N=Nc2c(O)c(cc3ccccc23)C(=O)Nc2cccc(c2)[N+]([O-])=O)c(c1)[N+]([O-])=O MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 description 1
- 102000012545 EGF-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002150 EGF-like domains Proteins 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000809413 Homo sapiens ADP-ribosylation factor-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000616876 Homo sapiens Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000003881 arterial anastomosis Effects 0.000 description 1
- 210000005249 arterial vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N chloroethene;ethenyl acetate Chemical compound ClC=C.CC(=O)OC=C HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002565 electrocardiography Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 1
- KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N epoprostenol Chemical compound O1C(=CCCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000002106 pulse oximetry Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000685 uterine artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3808—Endothelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3826—Muscle cells, e.g. smooth muscle cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
- A61F2/06—Blood vessels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
A jelen találmány mesterséges ér transzplantátumot, valamint ennek azelőállítására szolgáló módszert biztosít. A mesterséges értranszplantátum egy olyan szintetikus tubuláris elem, melyendoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek sokaságával burkoltluminális felszínnel rendelkezik, az említett sejteket genetikailagúgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedésifaktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak. Ó
Description
Telefon: 461-1000, Fax: 461-1099
76.203/ZSO
I
MESTERSÉGES ÉR TRANSZPLANTÁTUM VALAMINT ENNEK LÉTREHOZÁSA ÉS ALKALMAZÁSA
Az alábbiakban ismertetjük a jelen találmány hátterét.
A jelen találmány mesterséges ér transzplantátumokkal kapcsolatos. Részletesebben, a jelen találmány olyan genetikailag transzformált sejtekkel és ezek előállításával kapcsolatos, melyek hasznosak a javított mesterséges ér transzplantátumok létrehozásában. A jelen találmány ezen kívül a mesterséges ér transzplantátumok érbetegségek terápiájában való használatával is kapcsolatos.
Az alábbiakban az érbetegségeket ismertetjük röviden.
Az érbetegségek a fejlett világ betegségeinek és elhalálozásainak jelentős okai közé tartoznak, és így a populáció nagy részét érintik. A bypass sebészeti beavatkozásban gyakran vénás, artériás vagy szintetikus cső transzplantátumokat használnak az ilyen betegségek klinikai következményeinek csökkentésére azáltal, hogy lehetővé teszik, vagy helyreállítják a véráramot egy blokkolt vagy sérült véredények környékén. Becslések szerint évente több, mint 1 millió ilyen eljárást hajtanak végre a fejlett országokban, és az ilyen beavatkozások 30-50 %a 5-7 éven belül kudarcba fullad (1-4).
Az alábbiakban az artériás ér transzplantátumokat ismertetjük.
Az artériás ér transzplantátumok hosszútávon tartósabbak, mint a vénás vagy a szintetikus ér transzplantátumok (5). Ennek ellenére az artériás ér transzplantátumokat csupán korlátozott klinikai körülmények között lehet alkalmazni, például aorta-szívkoszorúér bypass sebészeti beavatkozáskor. Egyre fokozódik az igény a tartós, biológiai szempontból kompatibilis felszínnel rendelkező szintetikus ér transzplantátumok iránt, melyek meghosszabbított ideig használhatók fel. A kis átmérőjű ér transzplantátum iránti igény különösen nagy a femorális artéria alatti lézióknál és olyan betegek esetében, akik korlátozott számú természetes érrel rendelkeznék, mint például a visszeres vagy korábban bypass beavatkozáson átesett betegek (2, 3). A politetrafluoretilén (PTFE) és a szintetikus ér transzplantátumok egyéb anyagai nagy népszerűségnek örvendenek, mivel az anyag biokompatibilis és tartós. A szintetikus anyag módosítását írták le számos állatokkal végzett kísérletben és néhány humán vizsgálatban (5-10).
A szintetikus ér transzplantátumok funkciójának és tartósságának növeléséhez autológ endoteliális sejteket (EC) használtak az ér transzplantátum implantáció előtti beoltásához. Az endoteliális sejtek jobb biokompatibilis felszínt biztosítanak, és hozzájárulhatnak a trombózissal szembeni hosszú távú védelemhez trombolitikus kapacitásuk révén (11, 12). Ezen kívül, az EC borítás megakadályozhatja az ér transzplantátumban kialakuló neointimális proliferációt és a gyulladásos reakciókat (13). Azonban ezideig a random, nagyszámú vizsgálat nem bizonyította, hogy az EC-vel való beoltás javíthatja az ér transzplantátum tartósságát (8-10).
Az ér transzplantátum implantáció előtti beoltásához használt endoteliális sejteket tipikusan a zsírszövet rövid vénás szegmenseiből gyűjtik össze. Egyéb forrásként szolgálhatnak a transzgénikus állatok sejtjei, melyek humán jellemzőkkel vagy az egyes betegből származó autológ EC-kel rendelkeznek. Egyéb lehetséges EC forrásként szolgálnak a perifériás vérből vagy a csontvelőből izolált őssejtek.
A mesterséges ér transzplantátum tervezés és előállítás területén új stratégiákkal kísérleteznek a humán érbetegségek kezelésében használt mesterséges ér transzplantátumok hatékonyságának tovább fejlesztéséhez. A mesterséges ér transzplantátum luminális felszínének teljes endotelializálása még mindig nagyon lassú, és ez komoly hatással van az ér transzplantátum használhatóságára. Ezért, kiemelt feladat az ér transzplantátum burkolásának javítása, és az ér transzplantátum mátrixához való sejt tapadás javítása. A korábbi kísérletek, ahol EC-t oltottak a szintetikus ér transzplantátumokra, nem tökéletes endotelializálást eredményeztek, valamint sejt leválást a véráram körülményeinek való kitevés hatására.
Az ér transzplantátum endotelializálás javítására irányuló egyik legújabb technika az ér transzplantátum olyan genetikailag transzformált sejtekkel való burkolását célozza meg, mely sejtek jobb proliferációs kapacitással rendelkeznek (lásd például az 5.785.965 számú US szabadalmi alkalmazást).
Az csontvelő őssejtek differenciálódásának fokozásához és a rövid és megbízható módszerekhez, melyekben a mesterséges ér transzplantátum készítményekben használható EC létrehozását célozzák az ilyen sejteket tipikusan vasculáris endoteliális növekedési faktor (VEGF) expressziós vektorral transzformálják, melyek azután a sejtekben expresszálódnak, és így fokozhatják az EC izolálás és szaporodás hatékonyságát. így, a specifikus EC mitogének, mint a VEGF, alkalmazása lerövidítheti a sejtek összegyűjtésétől a beoltásig terjedő időszakot, és lehetővé teszik az alacsonyabb kezdeti ér transzplantátum beoltási sűrűségek alkalmazását is, miután a VEGF által indukált gyors proliferáció gyorsabb ér transzplantátum burkoláshoz vezet.
Az endoteliális sejt proliferáció és migráció a VEGF receptorok aktiválásával indítható meg (16). Bár három VEGF receptort azonosítottak és jellemeztek, a KDR receptor játszik kulcs szerepet az angiogén átállásban, mely proliferációból és migrációból áll (16, 17).
A VEGF meghatározott előnyt biztosít az egyéb, kevésbé ECspecifikus növekedési faktorokkal szemben, melyek fokozhatják az ér transzplantátum endotelializációját, miután az csökkent hatással van az egyéb vasculáris sejtekre, különösen a simaizom sejtekre (SMC), és mint ilyen csökkentik a káros stimuláló hatások potenciálját. így a mesterséges ér transzplantátumra oltott, genetikailag módosított sejtek által felszabadított VEGF szaporítja az EC-t, azonban az SMC-t nem az anasztomozisos helyektől.
Bár a genetikailag transzfektált, és VEGF-et túlexpresszáló EC képes a fokozott szaporodásra a nem transzformált EC-hez viszonyítva, az ilyen transzformált sejteket magába foglaló mesterséges ér transzplantátumok funkcionálisan korlátozottak, mivel az ér transzplantátum luminális felszínét burkoló transzformált sejtek nem képesek ellenállni az implantációt követő áramlási erőknek.
Az UP50 egy olyan új protein, melyet ha felületek, például szövettenyésztő műanyagok burkolására használnak, úgy tűnt, fokozza az EC felszínekhez való tapadási képességét (51). Ez a protein hat kalcium-kötő EGF-szerű doménből áll, melyek közül az egyik egy ArgGly-Asp (RGD) motívumot foglal magába. Erről a motívumról tudott, hogy részt vesz az integrinek, például az EC-n expresszált integrinek, specifikus kötésében, és így részt vesz az EC sejt mátrixhoz és egyéb sejtekhez való adhéziójának közvetítésében (52). Például, az ezen RGD szekvenciát tartalmazó szintetikus peptidekről tudott, hogy antagonizálják az integrin kötést, és ily módon gátolják az olyan folyamatokat, mint az angiogenezis vagy a trombózis (53).
Az epidermális növekedési faktor (EGF) szerű motívumot megtalálták az érfal különféle extracelluláris mátrix (ECM) proteinjeiben (54) és részt vesz a kalcium-kötésben számos, az érfalban jelen levő ECM proteinnel (55). Ez a motívum jelen van a vér koaguláció szabályzóiban, a kis sűrűségű lipoprotein receptorban, a TGF-/? kötő proteinben és a Notch-ban és ligandumaiban, melyek részt vesznek a celluláris differenciálódásban (56).
Bemutatták, hogy az embrionális vasculáris EGF-szerű ismétlődést tartalmazó protein (EVEC), a huán UP50 patkány homológja, az embrionális angiogenezis alatt expresszálódik. Ezen protein embriogenezis alatti expressziójáról kimutatták, hogy elsősorban az artériás érrendszerben zajlik, főként a fejlődő artériák ér SMC-jében. Kifejlett egerekben ezen protein expressziójáról bemutatták, hogy lefelé szabályozódik, kivéve a méh artériáiban. Egy ballon-sérült patkány modellben a carotid artéria EVEC expresszió felfelé szabályozódott (57). Ezek az eredmények az UP50 egy lehetséges szerepét jelzik az EC-SMC kölcsönhatásokban, ECM érésben és szaporodás szabályozásban. így, az UP50 olyan új, adherens molekula, mely vasculáris ligandumként használható az EC adhéziójának közvetítésében integrin receptorain keresztül, és elősegítheti a vasculáris fejlődést és újramodellezést Azonban az EC, szintetikus ér transzplantátumok endotelializációjának elősegítésében szerep vállalásra képes ilyen adhéziós faktorok expresszálását célzó, genetikai módosításának stratégiájára még nem tettek kísérletet.
így széles körben elismert, hogy szükségesek, és igen előnyösek az olyan mesterséges ér transzplantátumok, melyek képesek támogatni a véráramlást az implantáció után, és ennek ellenére mentesek a fent említett, korábbi ér transzplantátumok korlátáitól.
Az alábbiakban összefoglaljuk a jelen találmányt.
A jelen találmány egy aspektusa szerint egy olyan mesterséges ér transzplantátumot biztosítunk, mely olyan endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elemmel rendelkezik, ahol a sejteket genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
A jelen találmány egy másik aspektusa szerint módszert biztosítunk egy egyén érrendszere legalább egy részének helyettesítésére vagy „bypasszolására, mely módszer során az egyén érrendszerébe egy mesterséges ér transzplantátumot ültetünk be oly módon, hogy folyadék kommunikáció legyen az érrendszer és a mesterséges ér transzplantátum között, a mesterséges ér transzplantátum endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elemmel rendelkezik, ahol a sejteket genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint egy mesterséges ér transzplantátum előállítására szolgáló módszert biztosítunk, mely az alábbiakból áll: (a) genetikailag transzformálunk endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak, és (b) az endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket oltjuk és szaporítjuk a luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elemben, míg a luminális felszínen elegendő burkolást kapunk.
A jelen találmány előnyös kiviteli alakjainak egy további jellemzője szerint az endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek sokaságának első részét genetikailag úgy transzformáljuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort expresszáljanak, és az endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek sokaságának második részét genetikailag úgy transzformáljuk, hogy legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a luminális felszín az alábbi anyagok valamelyikéből áll: politetrafluoretilén (PTFE), expandált politetrafluoretilén (ePTFE), poliészter rostok, Dacron™, feldolgozott állati véredény vagy bármilyen mesterséges tartó anyag, melyet az ér transzplantátum gyártásához használnak.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a szintetikus tubuláris elem egy olyan belső keresztmetszeti terület, mely lényegében megfelel egy véredény belső keresztmetszeti területének.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a szintetikus tubuláris elem belső keresztmetszeti területe körülbelül 7 - 700 mm2 értékek között van.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az endoteliális sejtek sokasága az alábbi forrásokból származik: véna szegmensből, csontvelőből, perifériás vér őssejtekből, vagy keringő endoteliális sejtekből.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a simaizom sejtek sokasága az alábbi forrásokból származik: humán rózsaér vénákból, és bal belső emlő artériákból, csontvelőből, vagy perifériás vér őssejtekből.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az endoteliális sejtek és/vagy a simaizom sejtek sokasága a mesterséges ér transzplantátumot kapó alanyból származik.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az endoteliális sejtek és/vagy a simaizom sejtek sokasága egy humán vagy egy állati donor embrionális vagy érett szöveteiből származik.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az endoteliális sejtek sokasága a belső luminális felszínen összefüggő monoréteget képez.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint legalább egy proliferációs növekedési faktort választunk az alábbiak közül: VEGF, savas vagy bázikus FGF, HGF és bármely endoteliális növekedési faktor.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint legalább egy celluláris tapadási faktor DANCE, UP50, vitronectin, albumin, l-es kollagén, IV-es kollagén, fibronectin és laminin, vagy bármely egyéb olyan molekula, mely képes elősegíteni a celluláris tapadást az ér transzplantátum anyagához.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az endoteliális sejtek és/vagy a simaizom sejtek sokaságát a továbbiakban genetikailag úgy transzformáljuk, hogy legalább egy marker polipeptidet is expresszáljanak.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint egy olyan nukleinsav expressziós szerkezetet biztosítunk, ahol (a) az első polinukleotid szegmens egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol; és (b) egy második polinukleotid szegmens egy celluláris tapadási faktort kódol.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint olyan nukleinsav expressziós szerkezetet biztosítunk, ahol (a) az első nukleinsav expressziós szerkezet magába foglal egy első polinukleotid szegmenst, mely egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol; és (b) egy második nukleinsav expressziós szerkezetet, mely magába foglal egy második polinukleotid szegmenst, mely egy celluláris tapadási faktort kódol.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az első és a második nukleinsav expressziós szerkezetek továbbá magukba foglalnak legalább egy további polinukleotid szegmenst, mely egy marker polipeptidet kódol.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint egy olyan kitet biztosítunk, mely tartalmaz legalább egy cső tartására szolgáló állványt, a legalább egy cső magába foglal egy olyan nukleinsav expressziós szerkezetet, ahol (a) az első nukleinsav expressziós szerkezet magába foglal egy első polinukleotidot, mely egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol; és (b) egy második nukleinsav expressziós szerkezetet, mely magába foglal egy második polinukleotidot, mely egy celluláris tapadási faktort kódol.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint egy olyan kitet biztosítunk, mely tartalmaz legalább egy cső tartására szolgáló állványt, a legalább egy cső magába foglal egy olyan nukleinsav expressziós szerkezetet, ahol a nukleinsav expressziós szerkezet magába foglal (a) egy első polinukleotidot, mely egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol; és (b) egy második polinukleotidot, mely egy celluláris tapadási faktort kódol.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint egy genetikailag transzformált endoteliális sejtek és/vagy a simaizom sejtek létrehozására szolgáló módszert biztosítunk, melynek során (a) endoteliális sejteket és/vagy a simaizom sejteket nyerünk egy emlős szövet forrásból; és (b) az endoteliális sejteket úgy transzformáljuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktor expresszáljanak egy időben vagy külön-külön.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a nukleinsav expressziós szerkezet továbbá tartalmaz legalább egy promoter szekvenciát, mely az első és a második polinukleotid szegmens legalább egyike expressziójának irányítására szolgál.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az első polinukleotid szegmens transzkripciósán kötődik a második polinukleotid szegmenshez, mivel az első és a második polinukleotid szegmens legalább egy promoter szekvencia egyetlen promoter szekvenciájának transzkripciós szabályozása alatt áll.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a nukleinsav szerkezet továbbá magába foglal egy kötő szekvenciát, melyet az első és a második polinukleotid szegmensek közé helyezünk.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a kötő szekvencia IRES és egy proteáz hasítási felismerő hely lehet.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint legalább egy promoter eukarióta sejtekben funkcióképes.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint legalább egy promoter konstitutív promoter, vagy indukálható promoter vagy egy szövet specifikus promoter lehet.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a nukleinsav expressziós szerkezet továbbá tartalmaz még (c) egy első promoter szekvenciát, mely az első polinukleotid szegmens expressziójának irányítására szolgál; és (d) egy második promoter szekvenciát, mely a második polinukleotid szegmens expressziójának irányítására szolgál.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az első pormóter és a második promoter lehet konstitutív promoter, vagy indukálható promoter vagy egy szövet specifikus promoter.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az indukálható promótereket ugyanaz az effector molekula szabályozhatja.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a nukleinsav expressziós szerkezet tartalmaz még legalább egy további polinukleotid szegmenst, mely egy marker polipeptidet kódol.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a marker polipeptid lehet szelekciós polipeptid vagy egy riporter polipeptid.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a legalább egy polinukleotid szegmens transzkripciósán kötődik legalább egy első és egy második polinukleotid szegmens valamelyikéhez.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint legalább egy további polinukleotid szegmens transzkripciósán kötődik legalább egy első és egy második polinukleotid szegmens valamelyikéhez, egy kötő szegmensen keresztül.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a kötő szekvencia IRES és egy proteáz hasítási felismerő hely lehet.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a legalább egy további polinukleotid szegmens transzlációsán fuzionál legalább egy első és egy második polinukleotid szegmens valamelyikéhez.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint olyan transzformált endoteliális sejteket és/vagy a simaizom sejteket biztosítunk, melyeket genetikailag úgy transzformáljuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a transzformált endoteliális sejteket és/vagy a simaizom sejteket a továbbiakban genetikailag úgy transzformáljuk, hogy legalább egy marker polipeptidet is expresszáljanak.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az endoteliális sejtek egy véna szegmensből, csontvelőből, perifériás vér őssejtekből vagy keringő endoteliális sejtekből származnak.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint az endoteliális sejtek vagy a simaizom sejtek humán vagy állati donor embrionális vagy érett szöveteiből származnak.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a sejt proliferációs növekedési faktor VEGF, savas vagy bázisos FGF, HGF, vagy bármilyen egyéb endoteliális sejt növekedési faktor lehet.
A leírt előnyös kiviteli alakok további jellemzői szerint a celluláris tapadási faktor DANCE, UP50, vitronectin, albumin, l-es kollagén, IV-es kollagén, fibronectin és laminin, vagy bármely egyéb molekula lehet, mely képes az ér transzplantátum anyagához való celluláris tapadást fokozni.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint, egy olyan mesterséges ér transzplantátumot biztosítunk, mely endoteliális sejtekkel és simaizom sejtekkel burkolt luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elemet tartalmaz, az endoteliális sejtek és simaizom sejtek legalább egyikét genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljon.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint olyan módszert biztosítunk egy mesterséges ér transzplantátum előállításához, mely az alábbiakból áll: (a) endoteliális sejteket és simaizom sejteket biztosítunk, az endoteliális sejtek és simaizom sejtek legalább egyikét genetikailag úgy transzformáljuk, hogy UP50-et és VEGF-et expresszáljanak; és (b) ezt követően, vagy ezzel egy idejűleg az endoteliális sejteket és a simaizom sejteket a luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elemen belül szaporítjuk, míg az endoteliális sejtek és a simaizom sejtek elegendő mértékben beburkolják a luminális felszínt.
A jelen találmány egy megint más aspektusa szerint olyan mesterséges ér transzplantátumot biztosítunk, mely endoteliális sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel és simaizom sejtek sokaságával burkolt külső felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elemet tartalmaz.
A jelen találmány előnyös kiviteli alakjai szerint az endoteliális sejtek sokaságát genetikailag úgy transzformáljuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
A jelen találmány előnyös kiviteli alakjai szerint a simaizom sejtek sokaságát genetikailag úgy transzformáljuk, hogy legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
A jelen találmány sikeresen kezeli a jelenleg ismert konfigurációk hibáit, amikor az érhelyettesítéshez vagy ér bypass eljáráshoz használható mesterséges ér transzplantátumot és ennek előállítására szolgáló módszert biztosít.
Az alábbiakban megadjuk a jelen találmányban szereplő rajzok rövid leírását.
A jelen találmányt a csatolt rajzokkal csupán a példa kedvéért írjuk le. A csatolt rajzokra való részletes hivatkozással azt hangsúlyozzuk, hogy a részletek csupán az előnyös kiviteli alakok példáiként és illusztratív céljaira szolgálnak, és azért adjuk meg ezeket, mert úgy véljük, a jelen találmány elmélete és fogalmi aspektusai így érthetők meg a legjobban és legkönnyebben. Ebben a tekintetben nem szándékozzuk a jelen találmány szerkezeti részleteit a jelen találmány alapvető megértéséhez szükségesnél részletesebben bemutatni. A tudomány e területén képzett szakember számára a rajzokból egyértelműen kiderül, hogyan lehet a jelen találmány különböző formáit a gyakorlatban megvalósítani.
Az 1. ábra a jelen találmány egy mesterséges ér transzplantátumának perspektivikus képét mutatja.
A 2. ábra egy folyamatábra, ami a jelen találmány hibrid biológiaiszintetikus ér transzplantátum megszerkesztésének stratégiáját mutatja be.
A 3a-b. ábrák a VEGF-GFP expressziójához való adenovirális és retrovirális sémát mutatja be (sorrendben 3a, és 3b ábrák).
A 4a-d. ábrák az Urine p50 protein (UP50) expressziójához való virális expressziós vektorok sematikus rajzát mutatják be. A 4a és a 4b. ábrák sorrendben az UP50 és az UP50-GFP expressziójához való adenovirális vektorokat, és a 4c. és 4d. ábrák sorrendben az UP50 és az UP50-GFP expressziójához való retrovirális vektorokat mutatják be.
Az 5a-b. ábrák a PTFE (politetrafluoretilén) ér transzplantátumok mikrofotóit mutatják be, a transzplantátumokat nukleáris célzott LacZ gént (5a. ábra) és VEGF és zöld fluoreszcensz protein (GFP) géneket (5b. ábra) kódoló rekombináns adenovirális vektorokkal fertőzött humán ECvel oltottunk be.
A 6a-b. ábrák a PTFE (politetrafluoretilén) ér transzplantátumok mikrofotóit mutatják be, a transzplantátumokat nukleáris célzott LacZ gént (6a. ábra) és VEGF és zöld fluoreszcensz protein (GFP) géneket (6b. ábra) kódoló rekombináns retrovirális vektorokkal transzdukált humán EC-vel oltottunk be.
A 7a-d. ábrák az Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC (7a-b. ábrák) és SMC (7b-d. ábrák) mikrofotóit mutatják. A sejteket fény (7a. és 7c. ábrák) vagy fluoreszcensz mikroszkópiával (7b. ás 7d. ábrák) tesszük láthatóvá.
A 8a-d. ábrák a retrovirálisan az UP50-GFP expressziójához transzdukált EC (8a. és 8b. ábrák) és SMC (8c. és 8d. ábrák) mikrofotóit mutatják. A sejteket fény (8a. és 8c. ábrák) vagy fluoreszcensz mikroszkópiával (8b. ás 8d. ábrák) tesszük láthatóvá.
A 9a-b. ábrák az UP50 mRNS expresszió RT-PCR analízisének felvételeit mutatja be EC-ben és SMC-ben, melyeket adenovirálisan fertőztünk, hogy expresszálják az UP50-et (sorrendben 9a és 9b. ábrák). A 9a. ábrán a sávok a következők: 1. az UP50 DNS plazmid pozitív kontrollja; 2. a reverz transzkriptáz reakció negatív kontrollja; 3. a PCR reakció negatív kontrollja; 4. Ad.GFP fertőzött EC; 5. Ad.UP-GFP fertőzött EC; 6. nem fertőzött EC. A 9b. ábrán a sávok a következők: 1. pozitív kontroll plazmid UP50 eDNS; 2. a reverz transzkriptáz reakció negatív kontrollja; 3. Ad.GFP fertőzött SMC; 4. Ad.UP50-GFP fertőzött SMC; 5. nem fertőzött SMC.
A 10a-b. ábrák az UP50 mRNS expresszió RT-PCR analízisének felvételeit mutatják be retrovirálisan transzdukált EC-ben és SMC-ben (sorrendben 10a. ás 10b. ábrák). A 10a. ábra sávjai a következők: 1. Retro-GFP transzdukált EC; 2. az UP50et expresszálására rertovirálisan fertőzött EC; 3. az UP50 DNS plazmid pozitív kontrollja. A 10b. ábra sávjai a következők: 1. marker; 2. nem transzdukált SMC; 3. retroGFP transzdukált SMC; 4. retro UP50-GFP transzdukált SMC.
A 11. ábra az UP50 expresszálására adenovirálisan fertőzött EC és SMC által történő UP50 protein expresszió Western immunolenyomat analízisének felvételét mutatja. A sávok a következők: 1. kontroll, nem fertőzött EC; 2. Ad.GFP fertőzött EC; 3. Ad.UP50-GFP fertőzött EC; 4. Ad.Ang1-GFP fertőzött EC; 5. kontroll, nem fertőzött SMC; 6. Ad.GFP fertőzött SMC; 7. Ad.UP50-GFP fertőzött SMC; 8. Ad.Ang1-GFP fertőzött SMC; 9. az UP50-GFP-t expresszáló 293-FLYA stabil transzformáns pozitív kontrollja.
A 12. ábra a retrovirálisan transzdukált EC és SMC UP50 protein expresszió Western immunolenyomat analízisének felvételét mutatja. A sávok a következők: 1. nem transzdukált EC; 2. retroGFP transzdukált EC; 3. retroUP50-GFP transzdukált EC; 4. nem transzdukált SMC; 5. retroGFP transzdukált SMC; 6. retroUP50-GFP transzdukált SMC; 7. az UP50-GFP-t expresszáló 293-FLYA stabil transzformáns pozitív kontrollja.
A 13a-d. ábrák az Ad.UP50-GFP-vel (13b. és 13d. ábrák) vagy kontroll plazmiddal (13a. és 13a. ábrák) fertőzött EC-ben (13a. ábra és 13b. ábra) és SMC-ben (13c. ábra és 13d. ábra) való UP50 felszíni expresszió immunohisztokémiai analízisének fluoreszcensz mikrofotóit mutatják be.
A 14a-c. ábrák fluoreszcensz scanning konfokális mikrofotók, melyek Ad.UP50-nel fertőzött EC-t (14a. ábra) vagy Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC-t (14b. és 14c. ábrák) mutatnak be. A 14b. és 14c. ábrák sorrendben a sejt-sejt kontaktusban vagy anélkül szaporodó EC-ben levő UP50 festődését mutatják be. A zöld és vörös fluoreszcencia sorrendben a GFP és az UP50 festődését képviselik.
A 15. ábra egy az Ad.UP50-GFP-fel fertőzött EC-vel létrehozott ECM-ben levő UP50 protein immunohisztokémiai analízisét ábrázoló fluoreszcensz mikrofotók.
A 16a-b. ábrák az adenovirlisan fertőzött EC és SMC közös tenyészeteivel létrehozott VEGF és UP50 expresszió (sorrendben 16a. és 16b. ábrák) Western immunolenyomat analízisét mutatják be. A sávok a következőket jelentik: 1. Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött EC + Ad.UP50-GFPvel fertőzött EC; 2. Ad.Ang1-GFP-vel fertőzött EC + Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC; 3. Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött EC + Ad.UP50-GFP fertőzött SMC; 4. Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött EC + Ad.Ang1-GFP-vel fertőzött SMC; 5. az UP50-et expresszáló 293-FLYA stabil transzfektáns pozitív kontrollja.
A 17a-b. ábrák a retrovirálisan fertőzött EC és SMC közös tenyészeteivel létrehozott VEGF és UP50 expresszió (sorrendben 17a. és 17b. ábrák) Western immunolenyomat analízisét mutatják be. A sávok a következőket jelentik: A 17a. ábrán: 1. retroUP50-GFP transzdukált EC + retroGFP transzdukált EC; 2. retroVEGF-GFP transzdukált EC + retroUP50-GFP transzdukált EC; 3. retroVEGF-GFP transzdukált EC; 4. retroUP50-GFP transzdukált EC; 5. retroGFP transzdukált EC; 6. EC kontroll; 7. retroUP50-GFP transzdukált SMC + retroVEGF-GFP transzdukált EC; 8. retroUP50-GFP transzdukált SMC + retroGFP transzdukált EC; 9. SMC kontroll; 10 rekombináns VEGF pozitív kontroll. A 17b ábrán: 1. SMC kontroll; 2. retroGFP transzdukált SMC; 3. retroUP50-GFP transzdukált SMC + retroVEGF-GFP transzdukált EC; 4.
retroUP50-GFP transzdukált SMC + retroGFP transzdukált EC; 5. retroUP50-GFP transzdukált SMC; 6. VEGF kontroll; 7. UP50 kontroll.
A 18. ábra az UP50-GFP-t, a VEGF-GFP-t vagy a GFP-t kódoló adenovirális vektorokkal fertőzött EC proliferációját bemutató hisztogramm.
A 19a-c. ábrák a retroGFP-vel transzdukált EC-ben (19a. ábra) és a retrollP-GFP-vel transzdukált, majd ezt követően Ad.GFP-vel vagy Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött EC-ben levő (sorrendben 19b. és 19c. ábrák) GFP expressziót bemutató mikrofotók.
A 20a-b. ábrák a retrollP50-GFP-vel transzdukált, majd közvetlenül utána adenovirális vektookkal fertőzött EC-ben levő VEGF és UP50 protein expressziók Western immonolenyomat analízisét bemutató felvételek (sorrendben 20a. és 20b. ábrák). A sávok jelentése a következő. 1. az UP50-et stabilan expresszáló 293-FLYA pozitív kontrollja; 2. nem fertőzött kontroll EC; 3. Ad.GFP fertőzött EC; 4. Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött EC; 5. retroUP50-GFP-vel transzdukált EC; 6. retroUP50-GFP-vel transzdukált, és Ad.GFP-vel fertőzött EC; 7. retroUP50-GFP-vel transzdukált és Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött EC; C. a rekombináns VEGF pozitív kontrollja.
A 21a-h. ábrák fény (21a., 21c., 21 e. és 21 g. ábrák) vagy fluoreszcensz (21b., 21d., 21f. és 21h. ábrák) mikrofotók, melyek az AdGFP-vel (21a-d. ábrák) vagy az Ad.UP50-GFP-vel (21e-h. ábrák) fertőzött EC háromdimenziós in vitro angiogenezisét mutatják 100 ng/ml VEGF hozzáadásával (21c., 21 d., 21 g. és 21 h. ábrák) vagy anélkül (21a., 21b., 21e. és 21f. ábrák). Az egyes kísérleti csoportok reprezentatív vizsgálatait bemutatjuk.
A 22a-h. ábrák az Ad.GFP-vel (22a-d. ábrák) vagy Ad.UP50-GFP + Ad.GFP-vel (22e-h. ábrák) fertőzött EC háromdimenziós in vitro angiogenezisét bemutató fény (22a., 22c., 22e. és 22g. ábrák) vagy fluoreszcensz (22b., 22d., 22f. és 22h. ábrák) mikrofotók, Ad.VEGF-GFP vei fertőzött EC 50 %-os közös tenyészetével (22c., 22d., 22g. és 22h. ábrák) vagy anélkül (22a., 22b., 22e. és 22f. ábrák). Az egyes kísérleti csoportok reprezentatív vizsgálatait bemutatjuk.
A 23. ábra az Ad.UP50 (mély vörös oszlop), Ad.GFP (kék oszlop) vagy nem fertőzött (sárga oszlop) EC adhéziós vizsgálatát bemutató hisztogramm. Két különböző, három ismétlésben végzett kísérletet mutatunk be.
A 24. ábra az EC, UP50-et tartalmazó ECM-hez való adhézióját bemutató hisztogramm. Az eredményeket korrigált OD értékekként mutatjuk a háttér érték kivonása után.
A 25a-g. ábrák az UP50-et túlexpresszáló, folyamatos nyírási stressznek kitett EC adhézióját mutatják. A random kiválasztott mezők a kontroll nem fertőzött (25a. és 25b. ábrák), a retroGFP-vel fertőzött (25c. és 25d. ábrák), és a retroUP50-nel fertőzött (25e. és 25f. ábrák) EC-t mutatják 24 órával a rázatás előtt (25a., 25c. és 25e. ábrák) és a rázatás után (25b., 25d. és 25f. ábrák). A 25h. ábra a rázatás után 24 órával megmaradó sejtek számát mutató hisztogramm. A kísérlet elvégzése előtt, az egyes csoportokból (UP50-GFP, GFP, és kontroll) két-két üreget megszámolunk. Az eredményeket a megmaradt sejtszám rázatás megkezdése előtti teljes sejtszámhoz viszonyított százalékaként fejezzük ki.
A 26. ábra az in vitro laminális áramlási körülmények közé helyezett sejtek retenciójának tesztelésére szolgáló jelen találmányban alkalmazott rendszer sematikus bemutatása.
A 27a-d. ábrák a jelen találmányban alkalmazott rendszer különböző komponenseinek bemutatására szolgálnak, mely módszer a laminális áramlási körülmények közé helyezett sejtek retenciójának in vitro tesztelésére szolgál. A 27a. ábra az áramlási rendszert tartalmazó szövet tenyésztő inkubátrot mutatja be, a 27b. ábra a nyomás és áramlás monitorokat, a 27c. ábra az adat gyűjtő rendszert és a pumpát, és a 27d. ábra az endoteliális sejt beoltó készüléket mutatja be.
A 28a-d. ábrák a GFP (28a. és 28b. ábrák) vagy az UP50-GFP (28c. és 28d. ábrák) expresszálására retrovirálisan transzdukált EC-vel beoltott, és laminális áramlási rendszerben pulzáló laminális áramlási körülmények alá helyezett ePTFE szintetikus ér transzplantátumok fluoreszcensz mikrofotóit mutatják.
A 29. ábra egy genetikailag módosított humán EC-vel beoltott, és implantált ePTFE szintetikus ér transzplantátumot hordozó birka femorális artériát bemutató felvétel.
A 30a-b. ábrák a PTFE ér transzplantátum artériás anasztomózis sebészeti mezőjét, valamint a bal és jobb femorális artériába (sorrendben 30a. és 30b. ábrák) beültetett ér transzplantátum akadálymentességét bemutató angiogrammok.
A 31a-f. ábrák olyan fluoreszcensz mikrofotók, melyek az in vivo beültetett ér transzplantátumok luminális felszínén mutatkozó sejt retenciót mutatják be, ahol az ér transzplantátumokat a GFP (31a. és 31b. ábrák), a VEGF-GFP (31c. és 31 d. ábrák) vagy az UP50-GFP (31 e. és 31 f. ábrák) expresszálására retrovirálisan transzdukált EC-vel oltjuk be. Két reprezentatív mezőt mutatunk be az egyes vizsgálati körülmények esetében.
Az alábbiakban bemutatjuk a jelen találmány előnyös kiviteli alakjait.
A jelen találmány egy olyan mesterséges ér transzplantátummal kapcsolatos, mely bypass károsodott és/vagy elzáródott véredények helyettesítésére használható, valamint ezen ér transzplantátum létrehozására és transzplantálására szolgáló módszerrel kapcsolatos. Specifikusan a jelen találmány emlős endoteliális sejtekkel burkolt szintetikus ér transzplantátumok létrehozására szolgáló módszerrel 20 %><· lekapcsol atos, mely ér transzplantátumok megvalósítható alternatívát jelentenek a jelenleg használt természetes és szintetikus ér transzplantátumokhoz.
A jelen találmány elméletei és kivitelezése jobban érthető a rajzokra és a csatolt leírásokra való hivatkozással.
A jelen találmány legalább egy kiviteli alakjának részletes leírása előtt, el kell fogadni, hogy a jelen találmány nem korlátozódik alkalmazásában a szerkesztés részleteire, és a következő leírásban megadott, vagy a rajzokban bemutatott komponensek elrendezésére. A jelen találmány megvalósítható más kiviteli alakokban, kivitelezhető vagy elvégezhető más módokon is. Azt is el kell fogadni, hogy a jelen találmányban használt kifejezések a jelen találmány leírását célozzák és nem tekinthetők korlátozó jellegűnek.
A mesterséges ér transzplantátumok széles körben felhasználhatók a sebészeti bypass eljárásokban. A jelenleg rendelkezésre álló mesterséges, vagy néhány természetes ér transzplantátumot sújtó korlátozások egyike az, hogy nem rendelkeznek hosszú élettartammal. Bár az endoteliális sejtek alkalmazása jelentősen fokozza a burkolt mesterséges ér transzplantátumok minőségét az általános teljesítmény javulása révén, valamint különösen a trombolitikus aktivitás javulása révén, az ilyen ér transzplantátumok tipikusan a vér áramlási erőinek következtében fellépő sejtburkolat elvesztésétől szenvednek, miután a burkoló sejtek nem képesek ellenállni az áramló vér által kiváltott nyírási erőknek.
Különböző kísérletet tettek az ér transzplantátum élettartamának növelésére. Az 5.785.965 számú US szabadalmi alkalmazásban a VEGF expresszálása céljából genetikailag transzformált endoteliális sejtekkel burkolt mesterséges ér transzplantátumot írtak le. Bár az ilyen sejtek jobb ér transzplantátum beoltási tulajdonságokkal rendelkeznek, amint azt az alábbiakban bemutatott példa részben leírjuk, a VEGF-et expresszáló endoteliális sejtekkel beoltott ér transzplantátumok nem képesek tartósan ellenállni az áramló vér által kiváltott erőknek.
Az ér transzplantátum beoltási kísérletek közben a jelen találmány leírói felfedezték, hogy az endoteliális sejtek és/vagy a simaizom sejtek genetikailag transzformált populációja, melyek egy celluláris tapadási faktort, például az UP50-et közösen expresszálják, olyan celluláris növekedési faktorral együtt, mint a VEGF, vagy ha a genetikailag módosított endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek két alpopulációját összekeverjük - ahol az egyik a celluláris tapadási faktort, a másik pedig a növekedési faktort expresszálja - az előnyös a mesterséges ér transzplantátumok beoltásában való alkalmazáskor.
Amint az az alábbiakban megadott példák leírásában bemutatott eredményekből egyértelmű, egy celluláris tapadási faktor expressziója a sejtekkel beoltott ér transzplantátumban nem retardálja a sejt proliferációt, miközben jelentősen növeli az ilyen sejtek tapadását a mesterséges ér transzplantátum luminális felszínéhez, és mint ilyen, jelentősen növeli az ér transzplantátum élettartamát. Ezen kívül, amint az egyértelmű a példa részben leírtak alapján, a celluláris tapadási faktor és a sejt proliferáció faktor együttes expressziója az ér transzplantátum luminális felszínének olyan endoteliális sejtekkel való teljes beburkolásához vezet, melyek képesek ellenállni az áramló vér által kiváltott erőknek.
A korábbi ér transzplantátumokkal éles ellentétben, melyeket azért előkezeltek, hogy magukba foglaljanak egy celluláris tapadási faktort, például a fibronectint (35-37 és 39), egy celluláris tapadási faktor, például az UP50 expressziója ér transzplantátumra oltott sejtekből, egy olyan sejt proliferációs faktor, mint a VEGF, együttes expressziójával ezekből vagy más oltott sejtekből, lényegesen javítja a sejt-sejt és sejt-ér transzplantátum tapadást, és ez jelentősen javítja az ér transzplantátum élettartamát.
4-* 4,-Ml·
Ezen kívül, mivel a jelen találmány oltott sejtei által expresszált celluláris tapadási faktor(ok) a sejt-sejt és sejt-ér transzplantátum kölcsönhatásokat irányító extracelluláris mátrix részét képezik, az ilyen faktorok keringésbe való felszabadulása az ér transzplantátum implantálása után, minimalizálódik. Ezzel éles ellentétben, az ilyen faktorok beépülése az ér transzplantátum anyagába, amint az a korábbi ér transzplantátumokban megvalósul, az ilyen faktorok implantáció utáni keringésbe való felszabadulásához, és ezen faktorok gyors felhígulásához, és így az aktivitás elvesztéséhez vezethet.
Az ér transzplantátum mobilizált tapadási faktorok ilyen felszabadulása szintén trombózishoz vezethet, mivel az ilyen faktorok aktivizálhatják a koagulációs rendszert és/vagy helyi gyulladást okoznak, melyek olyan folyamatok, amik lényegesen megrövidítik az ér transzplantátum életét és súlyosan kockáztatják a beteg egészségét.
így a jelen találmány egy aspektusa szerint, és ahogy az 1. ábrán bemutattuk, egy olyan mesterséges ér transzplantátumot biztosítunk, melyre a későbbiekben 10 ér transzplantátumként hivatkozunk.
A 10 ér transzplantátum egy 12 szintetikus tubuláris elemet foglal magába, mely egy 14 luminális felszínnel rendelkezik. Előnyösen, a 12 szintetikus tubuláris elem egy körülbelül 7 - 700 mm2-es belső keresztmetszeti terület, vagy bármilyen keresztmetszeti terület, vagy átmérő, mely lényegében megegyezik a véredény belső keresztmetszeti területével, vagy átmérőjével.
A 14 luminális felszínt az ezekre való korlátozás nélkül az alábbi anyagokból állíthatjuk elő: politetrafluoretilén (PTFE), expandált politetrafluoretilén (ePTFE), poliészter rostok, Dacron™, vagy lehet egy állatból vagy emberből származó feldolgozott véredény.
A 14 luminális felszín előnyösen gödröket és/vagy nyúlványokat jelentő szerkezeteket foglal magába, melyek elősegítik/fokozzák a sejtek ezekre való ráoltását.
Amint a példa szekcióban a későbbiekben bemutatjuk, a 14 luminális felszínt 16 sejtek sokaságával burkoljuk, ideértve az endoteliális sejteket és/vagy a simaizom sejteket, melyek legalább egy részét genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
Másik lehetőségként, a 14 luminális felszín burkolható endoteliális sejtekkel és adott esetben simaizom sejtekkel, melyek mindegyikét genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak, miközben a 12 tubuláris elem 15 külső felszíne transzformált vagy nem transzformált simaizom sejtekkel burkolható. Egy ilyen konfiguráció lényegesen javíthatja az ér transzplantátum élettartamát és elfogadását.
A jelen találmány előnyös kiviteli alakjainak megfelelően a sejt proliferációs növekedési faktor például VEGF (AB021221 GenBank katalógusszám), savas vagy bázikus FGF (sorrendben S67291 és M27968 GenBank katalógusszámok), vagy HGF (D14012 GenBank katalógusszám), míg a celluláris tapadási faktor például az UP50 (1. számú szekvencia), DANCE (AF112152 GenBank katalógusszám), vitronectin (NM000638 GenBank katalógusszám), albumin (NM000477 GenBank katalógusszám), l-es kollagén (J00114 GenBank katalógusszám), IV-es kollagén (M15524 GenBank katalógusszám), fibronectin (X02761 GenBank katalógusszám), vagy laminin (NM005560 GenBank katalógusszám) lehet, vagy bármely egyéb molekula, mely képes elősegíteni az endoteliális sejtek/simaizom sejtek ér transzplantátum anyagához való tapadását. Az irodalmi hivatkozások szekcióban megadott 34-45 hivatkozások a továbbiakban olyan bizonyítékokként szolgálnak, melyek alátámasztják, hogy a fent említett proliferációs növekedési faktorok és celluláris tapadási faktorok felhasználhatók a jelen találmány 10 ér transzplantátumában.
Előnyösen, amikor endoteliális sejteket és simaizom sejteket is használunk, a sejt proliferációs növekedési faktor specifikus az endoteliális sejtekre oly módon, hogy elkerüljük a simaizom sejtek nem kívánatos proliferációját.
A jelen találmány 10 ér transzplantátumának előállításához a 16 sejteket a 12 elemre oltjuk, vagy azon belül tenyésztjük, míg elérjük a 14 luminális felszín megfelelő mértékű burkolását. Előnyösen, a 16 sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, melyek a 14 luminális felszínen egy összefüggő monoréteg kialakulásához vezetnek.
Számos beoltási eljárás használható a jelen találmány 10 ér transzplantátuma 14 luminális felszínének burkolására.
Azokban az esetekben, amikor endoteliális sejteket és simaizom sejteket is használunk, előnyös, ha a 14 luminális felszínt egymás után oltjuk be. Ilyen esetben, előnyösen transzformált vagy nem transzformált simaizom sejteket oltunk először, majd ezt követően transzformált endoteliális sejteket.
Másik lehetőségként a 10 ér transzplantátum beoltható transzformált simaizom sejtekkel, majd ezt követően beültethető a testbe és így lehetővé tesszük, hogy a keringő endoteliális sejtek beburkolják (endotelializálják) a 14 luminális felszínt.
Az is előnyös, ha a 16 sejteket sejt proliferációs növekedési faktorral és celluláris tapadási faktorral transzformáljuk, vagy másik lehetőségként az ilyen sejtek első részét a sejt proliferációs növekedési faktorral, míg ezen sejtek második részét a celluláris tapadási faktorral transzformáljuk.
A jelen találmányban használt endoteliális sejtek és simaizom sejtek származhatnak különböző emlős szövet forrásokból.
A jelen találmány egy előnyös kiviteli alakjának megfelelően, az endoteliális sejteket például egy véna szegmensből, csontvelő őssejtekből, perifériás vér őssejtekből, vagy keringő endoteliális sejtekből állítjuk elő.
A jelen találmány egy másik előnyös kiviteli alakjának megfelelően, a simaizom sejteket például humán rózsaér vénákból, bal belső emlő artériákból, csontvelő őssejtekből vagy perifériás vér őssejtekből állítjuk elő.
Bármelyik esetben, a jelen találmány által használt sejteket tipikusan a 10 ér transzplantátum tervezett recipiense, vagy egy szingeneikus donor szöveteiből nyerjük ki.
Másik lehetőségként, xenogénikus szövet is felhasználható az ilyen sejtek kinyerésére, feltéve, hogy a 10 ér transzplantátum előállítása előtt vagy után megtesszük a szükséges lépéseket a sejt kilökődés elkerülése céljából. A kilökődés megelőzésére vagy csökkentésére szolgáló számos módszer ismert a tudomány e területén, ezért azt a továbbiakban nem részletezzük.
Amint azt a példa szekcióban, az alábbiakban részletesen leírjuk, a celluláris tapadási faktor egy celluláris növekedési faktor együtes expressziója képessé teszi a jelen találmány 10 ér transzplantátum 16 sejtjeit arra, hogy ellenálljanak az áramlási erőknek, ami normálisan a korábbi ér transzplantátumok luminális felszínéről a sejtek elvesztését eredményezné.
így, a korábbi szintetikus ér transzplantátumoktól eltérően, a jelen találmány 10 ér transzplantátuma sikeresen felhasználható az érsebészeti eljárásokban, melyek a károsodott vagy elzáródott véredény helyettesítését vagy „bypassolását célozza. Az ilyen eljárásokban a 10 ér transzplantátumot az egyén érrendszerébe implantáljuk oly módon, hogy folyadék kommunikáció jöjjön létre az érrendszer és a 10 ér transzplantátum között.
Amint korábban már említettük, a jelen találmány leírása szerinti transzformált endoteliális sejtek és/vagy a simaizom sejtek legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszálnak.
Az ilyen faktorokat kódolhatják a humán sejtekből vagy bármilyen egyéb emlős sejtekből származó szekvenciák, feltéve, hogy az expresszált faktorok funkcionálnak az endoteliális/simaizom sejtekben.
Az ilyen faktorok expresszálhatók a sejtekbe bejuttatott exogén polinukleotid szekvenciákból, vagy másik lehetőségként, az ilyen faktorok lehetnek a sejt által természetesen expresszált endogén faktorok, mely esetben a sejtet olyan szekvenciákkal transzformáljuk, melyek az endogén faktorok túlexpresszióját eredményezik.
A találmány szerinti használatban a „túlexpresszió” olyan expressziós szintekre utal, ami meghaladja a sejtben normálisan talált szinteket. A túlexpresszió megvalósítható oly módon, hogy egy endogén gén további kópiáit juttatjuk be a sejtbe, és így megnöveljük a sejtben expresszált endogén gén, vagy gének kópiaszámát, vagy enhancer szekvencia elemeket juttatunk be gén „knock-in” eljárásokkal, mely elemek felfelé szabályozzák az endogén gén transzkripcióját vagy transzlációját.
Az exogén polinukleotid szekvenciák előnyösen egy vagy több nukleinsav szerkezetet foglalnak magukba, melyeket a sejtek genetikai transzformálására használunk.
A jelen találmány szerinti használatban a „genetikai transzformálás” kifejezés exogén polinukleotid szekvenciák sejtbe való bejuttatására utal. Az ilyen szekvenciák integrálódhatnak a sejt genomjába, vagy másik lehetőségként az ilyen exogén szekvenciák átmeneti jelleggel létezhetnek a sejt sejtmagjában vagy citoplazmájban.
így, a jelen találmány egy megint más aspektusa szerint olyan nukleinsav expressziós szerkezetet biztosítunk, mely hasznos a jelen találmány 16 sejtjeinek létrehozásában. A szerkezet magába foglal egy első polinukleotid szegmenst, mely egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol, valamint egy második polinukleotid szegmenst, mely egy celluláris tapadási faktort kódol.
A jelen találmány ezen aspektusa szerinti szerkezet magába foglalhat egy vagy több promoter szekvenciát is, melyek az első és a második polinukleotid szegmens expresszióját irányítják a transzformált sejtekben. Az ilyen promoter lehet bármilyen emlős funkcionális promoter, mely lehet konstitutív, szövet specifikus, vagy indukálható promoter.
Amint azt a továbbiakban, a példa szekcióban leírjuk, a sejt proliferációs növekedési faktor és a celluláris tapadási faktor előnyösen különböző időbeli mintákban expresszálódik.
Mint ilyen, a szerkezet két promoter szekvenciát foglal magába, melyek mindegyike egyetlen polinukleotid szegmens expresszióját irányítja. Előnyösen az ilyen promóterek indukálható promóterek, melyek ugyanazzal az effektor molekulával szabályozhatók. Előnyösen, a promoter szekvenciákat úgy választjuk meg, hogy az egyik promótert felfelé szabályozhatja egy effektor molekula, míg a második promótert lefelé szabályozhatja ugyanez az effektor molekula.
A megfelelő indukálható promóterek példái magukba foglalják, az ezekre való korlátozás nélkül a kémiailag (effektor molekula) indukálható promótereket, például a Clontechtől a kereskedelemben beszerezhető Tet-On (TM) és a Tet-Off (TM) gén expressziós rendszerek által használt promótereket, vagy a nyírási stressz által indukált promótereket, mint amiket már leírtak (46-50).
Anélkül, hogy a fentieknek ellent mondanánk, előnyös az is, ha egyetlen promoter szekvenciát használ a jelen találmány szerkezete, feltéve, hogy az első és a második polinukleotid szegmensek transzkripcionálisan kötődnek és biztosítják, hogy a belső riboszóma belépési hely (IRES) is rész vesz az átírt policisztonos üzenet második szegmense transzlációjának irányításában.
A jelen találmány ezen aspektusa szerinti szerkezet két polinukleotid szegmense transzlációsán fúzionált is lehet, feltéve, hogy egy proteáz hasítási helyet biztosítunk közöttük, ami lehetővé teszi az expresszáló sejtekben a két polipeptid hasítását és szeparálását.
Azt is előnyösnek tartjuk, ha a két polinukleotid szegmenst elkülönült nukleinsav szerkezetekbe helyezhetjük, melyek aztán közösen juttathatók be a sejtekbe.
így a jelen találmány egy megint más aspektusa szerint a jelen találmány 16 sejtjeinek létrehozásában hasznos nukleinsav expressziós rendszert is biztosítunk. A jelen találmány ezen aspektusának szerkezet rendszere magába foglal egy első nukleinsav expressziós szerkezetet, mely magába foglalja a sejt proliferációs növekedési faktort kódoló első polinukleotid szegmenst, valamint egy második nukleinsav expressziós szerkezetet, mely magába foglalja a celluláris tapadási faktort kódoló második polinukleotid szegmenst.
A jelen találmány szerkezete vagy szerkezet rendszere előnyösen további polinukleotid szegmenseket is magába foglal, melyek marker géneket, szelekciós marker géneket és más hasonlókat kódolnak, hogy lehetővé tegyék a transzformált sejtek szelektálását és/vagy a sejt proliferációs növekedési faktor és/vagy a celluláris tapadási faktor expressziójának nyomon követését. A megfelelő riporter gének példái magukba foglalják az ezekre való korlátozás nélkül a beta-galaktozidázt, a luciferázt, a GFP-t és más hasonlókat. A szelekciós markerekre példák az antibiotikum rezisztencia gének és más hasonlók.
Előnyös, hogyha a sejt proliferációs növekedési faktor és/vagy a celluláris tapadási faktor expressziójának nyomon követéséhez a riporter gént transzkripciósán vagy transzlációsán a faktort kódoló polinukleotid szegmenshez fúzionálva biztosítjuk, vagy egy olyan promoter szekvencia transzkripciós szabályozása alá is helyezhető, mely azonos a faktor transzkripcióját irányító szekvenciával.
Előnyös, ha a sejt proliferációs növekedési faktort és/vagy a celluláris tapadási faktort kódoló polinukleotid szegmensek egy a kereskedelemben beszerezhető expressziós vektor rendszerbe ligálhatók, mely alkalmas az emlős sejtek transzformálására és ezen faktorok transzformált sejteken belüli expressziójának irányítására. Az is előnyös, ha az ilyen kereskedelemben beszerezhető vektor rendszerek könnyen módosíthatók általában használatos rekombináns technikákkal, melynek során a meglevő promótereket és/vagy enhancer szekvenciákat helyettesítjük, duplikáltatjuk, vagy mutáltatjuk, és/vagy bármilyen további polinukleotid szekvenciákat juttatunk be.
A megfelelő emlős expressziós vektorok közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a pcDNS3, a pcDNS3,1(+/-), a pZeoSV2(+/-), a pSecTag2, a pDisplay, a pEF/myc/cyto, a pCMV/myc/cyto, a pCR3,1, melyek az Invitrogen-től szerezhetők be, a pCI, mely a Promega-tól, a pBK-RSV és pBK-CMV, melyek a Stratagen-től, és a pTRES, mely a Clontech-től szerezhető be, valamint ezek származékai.
Amint azt korábban már említettük, a jelen találmány transzformált sejtjei magukba foglalhatnak olyan exogén polinukleotid szekvenciákat is, amelyek az endogén módon kódolt faktorok túlexpresszálásához vezetnek.
így, a jelen találmány egy megint más aspektusának megfelelően, olyan nukleinsav szerkezetet, vagy szerkezet rendszert biztosítunk, mely az endogén módon kódolt faktorok expresszióját felfelé szabályozza. Egy ilyen szerkezet vagy szerkezet rendszer magába foglalhat transzkripciós szabályzó szekvenciákat, melyeket, ha cisz pozícióban biztosítjuk a sejt proliferációs növekedési faktort és/vagy a celluláris tapadási faktort kódoló endogén szekvenciákhoz képest, felfelé szabályozhatják ezek transzkripcióját.
Másik lehetőségként, az ilyen szerkezet, vagy szerkezetek transzlációs szabályozó szekvenciákat is kódolhatnak, melyeket, ha transz pozícióban biztosítjuk a sejt proliferációs növekedési faktort és/vagy a celluláris tapadási faktort kódoló endogén szekvenciákhoz képest, felfelé szabályozhatják ezek transzkripcióját.
A standard gén „knock-in” technikák felhasználhatók arra, hogy cisz ható transzkripciós szabályzó szekvenciákat juttassanak be az endoteliális sejtek vagy simaizom sejtek genomjába. A gén „knock-in” technika áttekintéséhez lásd például az 5.487.992, az 5.646.764, az 5.387.742, az 5.360.735, az 5.347.075, az 5.298.422, az 5.288.846, az 5.221.778, az 5.175.385, az 5.175.384, az 5.175.383, a 4.736.866 számú US szabadalmi alkalmazásokat, valamint Burke and Olson, Methods in Enzymology, 194:251-270, 1991; Capecchi, Science 244:1288-1292, 1989; Davies et al., Nicleic Acids Research, 20(11) 2693-2698, 1992; Dickinson et al., Human Molecular Genetics, 2(8):1299-1302, 1993; Duff and Lincoln, „Insertation of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human ARP gene and expression in ES Cells”, Research Advances in Alzheimer’s Desease and Related Disorders, 1995; Huxley et al., Genomics, 9:742-750, 1991; Jacobovits et al., Nature, 362:255-261, 1993; Lamb et al., Nature Genetics, 5:22-29, 1993; Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10578-82; Rothstein, Methods in Enzymology, 194:281-301, 1991; Schedl et al., Nature, 362:258-261, 1993; Strauss et al., Science, 259:1904-1907, 1993; valamint a WO 94/23049, a W093/14200, a WO 94/06908 és a WO94/28123 számú szabadalmi alkalmazások szintén biztosítanak információkat.
A jelen találmány nukleinsav szerkezetei bejuttathatok az endoteliális/simaizom sejtekbe bármilyen standard emlős transzformációs módszer segítségével. Az ilyen módszerek magukba foglalják, az ezekre való korlátozás nélkül, a közvetlen DNS felvételi technikákat és a vírus vagy liposzóma által közvetített transzformációt (részletes ismertetéshez lásd például a „Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press).
így, a jelen találmány javított mesterséges ér transzplantátumot biztosít, melyet belülről olyan genetikailag transzformált sejtek burkolnak, melyek egy celluláris növekedési faktort és egy celluláris tapadási faktort expresszáló endoteliális és/vagy simaizom sejteket foglalnak magukba. A celluláris tapadási faktor celluláris növekedési faktoron túli expressziója lehetővé teszi, hogy a transzformált sejtek nagyobb erővel tapadjanak a mesterséges ér transzplantátum luminális felszínéhez, és így tartós celluláris burkolatot hozzanak létre, ami megnövelt időtartamon keresztül ellent tud állni az implantációt követően a mesterséges ér transzplantátum luminális felszínére gyakorolt áramlási erőknek.
A jelen találmány további céljai, előnyei és új tulajdonságai nyilvánvalóak lesznek a tudomány e területén képzett szakember számára a következőkben megadott példák tanulmányozása után, mely példákkal nem szándékoztuk a jelen találmány körét korlátozni. Ezen kívül, a jelen találmány különböző kiviteli alakjai és aspektusai a fenti leírások és a későbbiekben megadott igénypontok alapján kísérletesen alátámasztják a következőkben megadott példákat.
A következőkben példákkal mutatjuk be a jelen találmányt.
A következőkben megadjuk a példákra való hivatkozásokat, melyek a fentiekben megadott leírással együtt a jelen találmány illusztálására és nem korlátozására szolgálnak.
Általában a jelen találmányban használt nomenklatúra és a jelen találmányban alkalmazott laboratóriumi eljárások molekuláris, biokémiai, mikrobiológiai és rekombináns DNS technikákat foglalnak magukba. Az ilyen technikákat alaposan megmagyarázzák az irodalomban. Példaként lásd a következőket: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); „Current Protocols in Molecular Biology” Vol l-lll, Ausubel,
R, M., ed., (1994); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, „A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., „Recombinant DNS” Scientific American Books, New York; Birren et al., (eds) „Genome Analysis: A Laboratory Manual Series” Vol.14, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); módszerek, amiket például az alábbiakban írtak le: 4.666.828, 4.683.202, 4.801.531, 5.192.659 és 5.272.057 számú US szabadalmi alkalmazások; „Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Vol. I-III, Cellis, J. E., ed (1994); „Current Protocols in Immunology” Vol. I-III, Coligan J.E., ed. (1994); Stites et al., (eds.), „Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds.), „Selected Methods in Cellular immunology” W. H. Freeman and Co., New York (1980); a rendelkezésre álló immunovizsgálatokat alaposan leírták a szabadalmakban és a tudományos irodalomban, lásd például a 3.791.932, a 3.839.153, a 3.850.752, a 3.850.578, a 3.853.987, a 3.867.517, a 3.879.262, a 3.901.654, a 3.935.074, a 3.984.533, a 3.996.345, a 4.034.074, a 4.098.876, a 4.879.219, az 5.011.771 és az 5.281.521 számú US szabadalmi alkalmazásokban; „Oligonucleotid Synthesis” Gait, M.J. ed. (1984); „Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D„ and Higgins S. J., eds. (1985); „Transcription and Translation” Hames, B.D. and Higgins S. J., eds. (1984); „Animal Cell Culture” Freshney, R.I. ed. (1986); „Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); „A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B„ (1984); és „Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; „PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., „Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); melyek mindegyike a hivatkozás révén teljes egészében részét képezi a találmánynak. Egyéb általános hivatkozásokat is megadunk a jelen leírásban. Az ezekben leírt eljárások, úgy véljük jól ismertek a tudomány e területén, és a kényelem kedvéért adjuk meg az aolvasónak. Az ezekben szereplő információk a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak.
Bár a jelen találmányt ennek specifikus kiviteli alakjaival együtt írtuk le, egyértelmű, hogy számos alternatíva, módosítás és variáció lesz nyilvánvaló a tudomány e területén képzett szakember számára. Ennek megfelelően, szándékunk szerint az összes ilyen alternatíva, módosítás és variáció a csatolt igénypontok szellemébe és széles körébe tartozik. Az ezen specifikációban említett összes publikció, szabadalom, szabadalmi alkalmazás és a katalógusszámokon megadott szekvencia a hivatkozás révén teljes egészében a jelen találmány részét képezi, olyan mértékben, mintha az egyes publikációk, szabadalmak, szabadalmi alkalmazások vagy katalógusszámon megadott szekvenciák esetében specifikusan és egyenként megemlítettük volna, hogy a hivatkozás révén részét képezik a jelen találmánynak. Ezen kívül, az idézések, vagy bármilyen a jelen találmányban szereplő referencia nem értelmezhető annak elismeréseként, hogy az ilyen hivatkozások elsőbbséget élveznek a jelen találmánnyal szemben.
1. példa
Az ér transzplantátumok létrehozásának stratégiája
A jelen találmány javított szintetikus ér transzplantátuma (1. ábra) előnyeinek demponstrálása céljából, szükség volt a vasculáris sejtek genetikai transzformációs stratégiájának létrehozására, valamint olyan kísérletek megtervezésére, melyek az itt leírt megközelítés kivitelezhetőségét bizonyítják. Ezért a 2. ábrán bemutatott folyamatábra leírja azokat a kísérleteket, melyeket a jelen találmány megnövelt élettartamú ér transzplantátumok létrehozására szolgáló módszereinek kapacitása demonstrálása céljából végzünk el.
2. példa
Az ér transzplantátumok genetikai módosítására szolgáló virális vektorok megszerkesztése
Két típusú virális vektort használunk a vasuláris sejtekbe való gén transzferáláshoz; az első egy nagy hatékonyságú rekombináns adenovirális rendszer, ami magas szintű transzgén expresszióhoz vezet. A rekombináns adenovirális készítmények azzal az előnnyel bírnak, hogy kevésbé komplexek, mint az egyéb vektorok, mint például az adenorokon vektorok (AAV) és a lentivirális alapú vektorok (21, 22), és más virális vektor rendszerektől elétrően, az adenovirális vektorok felhasználhatók az ér transzplantátumok celluláris beoltása után is, mivel a sejt osztódás nem alapvető fontosságú a transzgén expresszíóhoz. A másik alkalmazott vektor a GALV glikoporteinnel pszeudotipizált retrovirális vektor. Az ilyen pszeudotipizált vektorok nagy affinitást mutatnak a humán és a birka EC és SMC-vel szemben (23), és az adenovirális vektoroktól eltérően a retrovirális vektorokkal végzett transzdukció stabil transzgén expresszióhoz, és a leány sejtekben a gén expresszió transzmissziójához vezet.
Ennélfogva, virális vektorokat készítettünk a pro-endotelializálási faktorokat túlexpresszáló genetikailag módosított vasculáris sejetk előállításához, melyeket az ér transzplantátumok beoltásához használunk, amint azt az alábbiakban leírjuk.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
A LacZ gént kódoló rekombináns adenovirális vektorokat az alábbiak szerint hozzuk létre.
A bakteriális nukleáris-célzott ^-galaktozidáz gén expressziójához való rekombináns adenovirális vektorokat több lépésben hozzuk létre, melyek magukba foglalják a rutin prokarióta klónozást és a homológ rekombinációs eljárást a 293-sejtvonalban. Egy a bakteriális βgalaktozidáz gént (LacZ)(Clontech, CA, USA) tartalmazó 3700 bázispár hosszúságú HindlII-BamHI fragmentet a pCA3 plazmidba inzertáljuk a konstitutív expresszióhoz a CMV közvetlen-korai promoter szabályozása alatt. A kapott plazmidot a pJM17 plazmiddal ko-transzfektáljuk a 293 sejtekbe, melyek konstitutívan expresszálják az adenovirális E1 gént. A pJM17 plazmid tartalmazza az adenovirus genomot, kivéve az E3 régiót, és ideértve a vírus E1 régiójában egy inzertet (pBRX). A /?-galaktozidázt kódoló pCA3 és a pJM17 közötti homológ rekombináció a transzfekció után a pJM17 E1 régióját a pCA3-ból származó CMV-/?-galaktozidázra cseréli. A plakk képződés a ko-transzfekció után 2-4 héttel következik be, ami után az egyes plakkokat izoláljuk, és a virális extraktumokat amplifikáljuk belőlük a 293 sejtek fertőzésével. Az egyes vírus törzs oldatok titereit plakk vizsgálattal határozzuk meg 293 sejtekben és körülbelül 1O10 pfu/ml vírus titert nyerünk. A transzfektánsok βgalaktozidáz expresszióját X-gal festéssel erősítjük meg.
A VEGF és GFP géneket kódoló rekombináns bicisztonos adenovirális vektorokat az alábbiak szerint hozzuk létre.
A VEGF165-öt és a GFP géneket kódoló rekombináns adenovirális vektorokat hordozó vektorokba való rutin prokarióta klónozással szerkesztjük meg, amit 293 sejtekben való homológ rekombináció követ. A humán VEGF16s cDNS-t (GenBank AB021221 katalógusszám) tartalmazó 600 bázispár hosszúságú BamHI fragmentet, ideértve a szekrécióhoz való jel szekvenciát (ami Dr. J. Abraham kedves ajándéka, Scios Nova, Mountain View, CA) a pQBI-CMV5-GFP (QBI, Canada) hordozó vektor Bglll helyére inzertáljuk, és így létrehozzuk a CMV5VEGF165-IRES-EGFP hordozó vektort (3a. ábra). A pQBI-CMV5-GFP expressziós plazmid magába foglalja az Ad5 genom egy bal karját (16%), az E1 régióban egy delécióval, ami egy hCMV5 inzertet tartalmaz. A CMV5-VEGF165-IRES-EGFP hordozó vektort a pJM17 plazmiddal az E1 gént konstitutívan expresszáló 293 sejtekbe ko-transzfektáljuk. A pJM17 plazmid magába foglal egy adenovirális genomot, nem tartalmaz E3 régiót, és tartalmaz a vírus E1 régiójában egy inzertet (pBRX). A transzfekciót követő CMV5-VEGF165-IRES-EGFP és a pJM17 közötti homológ rekombináció az E1 régiót és a pBRX inzertet a CMV5-VEGF165IRES-EGFP-ből származó expressziós kazettára cseréli. A plakk képződés a kotranszfekció után 2-4 héttel következik be, ami után az egyes plakkokat izoláljuk és a virális kivonatokat a 293 sejtek fertőzésével amplifikáljuk. Az egyes virális törzs oldatok titerét a 293 sejtekben végzett plakk vizsgálattal határozzuk meg, a titer körülbelül 1O10 pfu/ml. A transzgén expressziót a fertőzött sejt-kondicionált tápközeg Western immunolenyomat analízisével erősítjük meg.
A humán VEGF-et és GFP-t kódoló pszeudotipizált retrovirális vektorokat az alábbiak szerint hozzuk létre.
A GFP és a humán VEGF165 gént kódoló rekombináns retrovirális vektorokat a pLXSN plazmidba (#K1060-B, Clontech, USA) való klónozással szerkesztjük meg két lépésben. Az első lépésben egy VEGF165-öt (GenBank AB021221 katalógusszám) kódoló 600 bázispár hosszúságú BamHI fragmentet inzertálunk a plRES2-EGFP plazmid (#6029-1, Clontech) BamHI helyére. Másodszor egy a VEGF165-öt, IRES-t és EGFP-t kódoló szekvenciákat tartalmazó 2,0 kB méretű EcoRI-Munl fragmentet klónozunk a pLXSN plazmid EcoRI restrikciós helyére és így létrehozzuk az LXSN-VEGF165-IRES-EGFP vektort (3b. ábra) A retrovirális vektor létrehozásához 293E3 ekotróp csomagoló sejteket átmenetileg transzfektálunk LXSN-VEGF165-EGFP-vel. 48 óra után a G418-rezisztens termelő sejtek konfluens tenyészetből származó felülúszót összegyűjtjük, szűrjük (0,45 pm), majd PA317 amfotróp csomagoló sejtek transzdukálására használjuk. A transzdukált PA317 sejteket G418 szelekció (300 mg/ml) mellett tenyésztjük és 48 óra múlva a felülúszót összegyűjtjük és a TEFLYGA csomagoló sejtek transzdukálására használjuk, melyek GALV köpeny glikoproteint expresszálnak, hogy pszeudotipizált vírust hozzunk létre, ami nagy hatékonysággal képes az EC-t és az SMC-t transzdukálni. A transzdukált TEFLYGA sejtek G418 szelekciója (400 pg/ml) után az egyedülálló telepeket összegyűjtjük és EGFP és VEGF165 expresszióra szkríneljük. Az egyes telepek vírus titereit TE671 sejt transzdukcióval határozzuk meg, és azt találtuk, hogy 105 - 106 pfu/ml értékek között vannak. A legnagyobb titert eredményező telepeket szelektáljuk és a frissen összegyűjtött felülúszókat transzdukcióhoz használjuk.
Az alábbiakban bemutatjuk az UP50 gént kódoló rekombináns adenovirális vektorok létrehozását.
A humán UP50 gént expresszáló rekombináns adenovirális vektort (amit Y. Shaul-tól kaptunk, Weizmann Institute) a fent leírtak szerint szerkesztjük meg. A humán UP50 cDNS-t (1. számú szekvencia) tartalmazó 1361 bázispár hosszúságú Bglll fragmentet a pCA3 plazmidba inzertáljuk. A transzgént tartalmazó pCA3 plazmidot pJM17 plazmiddal ko-transzfektáljuk 293 sejtekbe. Az expressziós plazmid és a pJM17 plazmid közötti homológ rekombináció, valamint azt ezt követő transzfekció az E1 régiót a pCA3 plazmidból származó expressziós kazettára cseréli, és így létrehozza a CMV5-UP50 hordozó vektort (4a. ábra). A plakk képződés 2-4 héttel a ko-transzfekció után következik be. Az egyedi plakkokat izoláljuk és a virális kivonatokat a 293 sejtek fertőzésével amplifikáljuk. A virális törzs oldatok titerei körülbelül 1011 pfu/ml értéket mutatnak. A transzgén expressziót a fertőzött sejt kondicionált tápközeg Western immunolenyomat analízisével határozzuk meg.
Az alábbiakban bemutatjuk az UP50 és a GFP géneket kódoló rekombináns adenovirális vektorok létrehozását.
A humán UP50 és GFP géneket közösen expresszáló rekombináns adenovirális vektorokat módosított AdEasy eljárással (28) hozzuk létre. Az UP50 cDNS 1361 bázispár hosszúságú Bglll fragmentjét a pAdTrackCMV hordozó vektor Bglll helyére inzertáljuk a CMV promoter szabályozása alatt. A hordozó vektor egy további, a transzgéntől downstream irányban levő CMV promoter szabályozása alatt kódolja a GFP-t. Az inzertet tartalmazó hordozó vektort Pmel emésztéssel linearizáljuk és a Qiaquick gél extrakciós kittel (Qiagen, Germany) tisztítjuk. A kompetens BJ5183 sejteket inzertet tartalmazó hordozó vektorral és pAsEasy-1 plazmiddal ko-transzfektáljuk elektroporációval és az UP50-GFP-t kódoló, rekombináns adenovirális vektort tartalmazó pozitív kiónokat (4b. ábra) PCR-ral szelektáljuk, majd restrikciós térkép analízissel vizsgáljuk. A rekombináns adenovirális plazmidokat Paci emésztéssel linearizáljuk, tisztítjuk és 293 sejtekbe transzfektáljuk Lipofectamine 2000-ret (Gibco BRL, USA) használva. A transzfekció után 7 nappal, citopatikus hatás lép fel és azt találtuk, hogy a sejtek 100 %-a expresszálja a GFP-t. A sejteket összegyűjtjük, és a virális extraktumokat tovább amplifikáljuk 293 sejtekben. Az egyes virális törzs oldatok titerét sorozatos hígítási vizsgálattal meghatározzuk 293 sejtekben és a titereket körülbelül 1011 pfu/ml értékűnek találtuk. A transzgén expresszióját a fertőzött sejt kondicionált tápközeg Western immunolenyomat analízisével megerősítjük.
Az alábbiakban bemutatjuk az UP50 expressziójához vagy az UP50 és az EGFP ko-expressziójához való retrovirális vektorok megszerkesztését.
A humán UP50 gént kódoló LXSN-UP50 rekombináns retrovirális vektort (4c. ábra) úgy szerkesztjük meg, hogy a humán UP50 cDNS 1361 bázispár hosszúságú Bglll fragmentjét a pLXSN plazmid (#K1060-B, Clontech, USA) BamHI helyére inzertáljuk a Mo-MULV 5’ hosszú terminális ismétlődés (LTR) szabályozása alatt.
Az UP50 és EGFP géneket kódoló bicisztronos rekombináns retrovirális vektort két lépésben klónozzuk a pLXSN plazmidba. Az első lépésben egy a pIRES-EGFP plazmidból (Clontech, #6029-1) kimetszett 1400 bázispár hosszúságú IRES-EGFP EcoRI-Hpal fragmentet inzertálunk az EcoRI-Hpal emésztett pLXSN plazmidba a pLXSN-IRESEGFP kontroll plazmid létrehozása céljából. A második lépés a pLXSNUP50-IRES-EGFP (4d. ábra) plazmid megszerkesztéséből áll, melynek során a humán UP50 EcoRI fragmentet (1361 bázispár) a pLXSN-IRESEGFP plazmid EcoRI helyére klónozzuk. A gén expressziót ezekben a szerkezetekben a Mo-MULV 5’ hosszú terminális ismétlődés (LTR) szabályozza.
Az alábbiakban leírjuk az UP50-et kódoló pszeudotipizált rekombináns retrovirális vektorokok léterhozását.
A retrovirális vektor létrehozáshoz a pLXSN-UP50-EGFP vektort vagy a pLXSN-UP50 vektort 293FLYA csomagoló sejtekbe transzferáljuk Lipofectamine-t (Gibco BRL, USA) használva. 48 óra után a virális termelő sejtek konfluens tenyészeteinek felülúszóját összegyűjtjük, szűrjük (0,45 pm) és hozzáadjuk 293FLY10A vagy a 293 FLYGALV csomagoló sejtekhez. A transzdukált sejteket G418 szelekció mellett (400 pg/ml) tenyésztjük és az egyedi telepeket összegyűjtjük és EGFP expresszióra szkríneljük invertált fluoreszcensz mikroszkópot használva, és UP50 expresszióra szkríenljük a transzdukált sejt kondicionált tápközeg Western immunolenyomat analízisével. Az egyes telepek vírus titerét a TE671 sejtek transzdukálásával határozzuk meg, és a titereket körülbelül 106 pfu/ml értékűnek találtuk. A legmagasabb literekkel rendelkező telepekből származó felülúszót frissen összegyűjtjük az EC és SMC transzdukálásához.
Az alábbi eredményeket kaptuk.
A virális vektor létrehozásának eredményei a következők: Az I. táblázatban felsorolt vektorokat az UP50 és a VEGF165 génekkel végzett EC és SMC transzferálásához használjuk. A 3a,. 4a. és 4b. ábrák az adenovirális VEGF165-GFP, az UP50 és az UP50-GFP expressziós vektorokat mutatják be, melyeket meg szerkesztettünk, és a 3b., 4c. és 4d. ábrák a retrovirális VEGF165-GFP, UP50 és UP50-GFP expressziós szerkezeteket mutatják, a jelen találmánynak megfelelően.
I. táblázat
| Virális rendszer | Csomagoló sejtvonal | Kódolt gén(ek) | Jelölés | Titer |
| Adenovirus | GFP | Ad.GFP | 101ü pfu/ml | |
| Adenovirus | VGEFIRES-GFP | Ad.VEGFGFP | 101ü pfu/ml | |
| Adenovirus | UP50-GFP | Ad.UP50GFP | 5x 1O10 pfu/ml | |
| Adenovirus | UP50 | Ad.UPöO | Függő | |
| Pszeudotipizált retrovirus | TEFLYGA | GFP | RetroGFP | 1(rffu |
| Pszeudotipizált retrovirus | TEFLYGA | VGEFIRES-GFP | RetroVEGFGFP | 5x105ffu |
| Pszeudotipizált retrovirus | 293FLYGA | UP50IRES-GFP | RetroUP50GFP | 1Oöffu |
| Pszeudotipizált retrovirus | 293FLYGA10A | UP50IRES-GFP | RetroUPGFP | 1O6ffu |
| Pszeudotipizált retrovirus | 293FLYGA | UP50 | RetroUPöO | 106 ffu |
3. példa
A pro-endotelializáló faktorok expressziója mesterséges ér transzplantátumok beoltására használt vasculáris sejtekben
Egyre fokozódik az igény a biokompatibilis felszínekkel rendelkező és nagy krónikus akadálymentességi arányokkal rendelkező szintetikus ér transzplantátumok iránt. A szintetikus PTFE ér transzplantátumok nagy népszerűségnek örvendenek anyaguk biokompatibilitásának és tartósságának köszönhetően. A szintetikus ér transzplantátumok tartóssága és alkalmassága fokozható, ha luminális felszínüket EC-vel burkoljuk. Az ilyen sejtek optimális biokompatibilis felszínt hoznak létre, hosszútávú védelmet biztosítanak a trombózissal szemben trombolitikus kapacitásuknak köszönhetően (11, 12) és megakadályozzák a neointimális proliferációt és a gyulladásos reakciókat a szintetikus ér transzplantátumokban (13).
A beoltott mesterséges ér transzplantátumok endotelializálása optimalizálásához való hatékony megközelítés során pro-endotelializálási faktorokat túlexpresszáló, genetikailag módosított vasculáris sejteket használunk. Ennélfogva, a vasculáris sejteket úgy módosítjuk genetikailag, hogy túlexpresszálják az ilyen faktorokat, ahogy azt az alábbiakban leírjuk, azért, hogy gyorsítsuk a vasculáris ér transzplantátumok beoltását és maximalizlájuk a ráoltott sejtek, implantáció utáni proliferációját, ami a szintetikus ér transzplantátum luminális felszínének vasculáris sejtekkel való maximális burkolásához vezet.
Az alábbiakban bemutatjuk a primer humán vasculáris sejtek szövettenyésztését.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Humán rózsaér véna EC-t (HSVEC) gyűjtünk humán rózsaér véna 5 cm hosszú vénás szegmenseiből, kollagenázos emésztés segítségével, a korábban leírtaknak megfelelően (29). Izolált HSVEC-et tenyésztünk, 20 % összegyűjtött humán szérummal, 2 mM L-glutaminnal (Biological Industries, Israel), 100 egység/ml penicillinnel (Biological Industries, Israel), 0,1 mg/ml sztreptomicinnel (Biological Industries, Israel), 100 pg/ml heparinnal (Sigma, USA) és 2 ng/ml bFGF-fel (Neufeld professzor kedves ajándéka) kiegészített M199 tápközeget (Gibco BRL, USA) tartalmazó, zselatin borítású edényekben. A 3-9 átoltásból származó sejteket összegyűjtjük, hogy biztosítsuk a fenotípusos stabilitást, melyet a von Willebrand faktor (Zymed, USA) immunohisztokémiai detektálásával követünk nyomon.
A humán rózsaér véna SMC-t (HSVSMC) explantum tenyésztéssel szaporítjuk humán rózsaér vénákból és bal belső emlő artériákból (HLSMC). A sejteket 10% összegyűjtött humán szérummal, 2 mM Lglutaminnal, 100 egység/ ml penicillinnel, 0,1 mg/ml sztreptomicinnel és 2 ng/ml bFGF-fel kiegészített Dulbecco-féle Módosított Eagles Tápközegben (DMEM)(Gibco BRL, USA) szaporítjuk. Az SMC-t immunohisztokémiai analízissel azonosítjuk specifikus anti-simaizom aaktin antitesteket (Zymed, USA) használva.
Az alábbiakban leírjuk a sejtvonalak szövettenyésztését
A 293-FLYA, 293-FLY10A, 293-FLYGALV és TEFLYGA burkoló sejtvonalakat (Dr. F.L. Cosset-Lion-tól kaptuk, Franciaország) 10% FCSsel (Biological Industries, Israel), 2 mM L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel, 0,1 ng/ml streptomicinnel, 6 pg/ml blaszticidinnel (Sigma, USA) és 6 pg/ml phleomicinnel (Sigma, USA) kiegészített DMEM-ben tenyésztjük.
A PA317, 293E3 burkoló sejtvonalakat (Dr. J. Exelrodtól kaptuk, Haddasa, Israel) 10% FCS-sel, 2 mM L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel, 0,1 mg/ml streptomicinnel kiegészített DMEM-ben tenyésztjük.
Az alábbiakban bemutatjuk az EC és a vasculáris SMC rekombináns adenovirális vektorokkal való fertőzését.
Az eljáráshoz a következő anyagokat és módszereket alkalmazzuk.
Az endoteliális sejteket és az SMC-t rekombináns adenovirális vektorokkal fertőzzük az alábbiakban leírtak szerint: a sejteket 70%-os konfluencia szinten oltjuk fibronectinnel (Sigma, USA) előburkolt (4,5 pg/ml) lemezekre 20 órával a fertőzés előtt, és komplett táptalajon (M20) tenyésztjük őket. A fertőzés napján a tenyésztápközeget friss szérummentes M199 tápközeggel helyettesítjük és a rekombináns vírust adunk hozzá 3000 MOI érték mellett (azaz 3000 vírus részecske/sejt mennyiségeben (=MOI)). A sejteket 90 percen keresztül inkubáljuk 20 percenként enyhe döntéssel, ami után a vírust tartalmazó tápközeget M20 komplett tenyésztápközeggel helyettesítjük. A fertőzési arányt a GFP expresszió láthatóvá tételével követjük nyomon fluorszcensz GFP szűrővel (GFP-LP, Nikon) felszerelt fluoreszcensz inverz mikroszkópot használva (TE200 Nikon, Japan).
Az alábbiakban bemutatjuk az EC és SMC rekombináns retrovirális vektorokkal való transzdukcióját.
Az eljárásban a következő anyagokat és módszereket használjuk.
Az EC és SMC retrovirális vektorokkal való transzdukcióját az alábbiak szerint végezzük al. Az EC-t vagy SMC-t (4-9 átoltás) 105 sejt/35-mm-es üreg mennyiségben oltjuk olyan lemezekre, melyet 4,5 pg/ml fibronectinnel burkoltunk, és komplett tenyésztápközegben szaporítjuk őket 24 órán keresztül. A sejteket a transzdukció előtt egy órával oly módon pre-kondicionáljuk, hogy a tenyésztápközeget szérummentes, 0,1 mg/ml DEAE-dextránt (Sigma, USA) tartalmazó, M199 tápközegre cseréljük. A pre-kondicionálás után a sejteket háromszor mossuk foszfát puffereit sóoldatban (PBS). A transzdukciót a sejtek vírust termelő burkoló sejtek frissen összegyűjtött és szűrt felülúszóival (0,45 pl) való 4 órás inkubálásával végezzük el. Az inkubálás végén a vírust tartalmazó tápközeget M20 tenyésztápközeggel helyettesítjük.
4. példa
A PTFE ér transzplantátumok EC-vel való beoltása
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Humán EC-t oltunk 50-60 %-os konfluencia mellett 20 órával a transzdukció előtt. A sejteket a korábbiakban leírtak szerint transzdukáljuk GFP-t vagy UP50-GFP-t kódoló retrovirális vektorokkal, majd az ér transzplantátum beoltására használjuk a G418 szelektálás (300 pg/ml) után, mely homogén sejt populáció létrehozását célozza. A sejteket (2 x 105 sejt/1 cm2 mennyiségben) fibronectinnel (4,5 pg/ml) burkolt ePTFE ér transzplantátumokra oltjuk. Az oltási eljárást horizontálisan rotáló eszköz segítségével végezzük 45 rotáció/óra érték mellett 4 órán keresztül 37°C hőmérsékleten, eztuán a beoltott ér transzplantátumokat 200 egység/ml penicillint és 0,2 mg/ml sztreptomicint tartalmazó M199 tenyésztápközegbe helyezzük. A transzplantátum beoltás hatékonyságát a beoltáshoz használt sejtek GFP termelésének fluoreszcensz mikroszkópos detektálásával értékeljük.
Az eredmények a következők.
A LacZ és VEGF-GFP expressziója virális vektorokkal transzformált humán EC-ben és szintetikus ér transzplantátumokra való oltás során a következő: Azt találtuk, hogy az Ad.LacZ-vel fertőzött humán EC-vel beoltott PTFE ér transzplantátumok ^-galaktozidázt expresszálnak (5a. ábra), ahogy azt egy X-gal kolorimetriás vizsgálattal meghatároztuk. Azt találtuk, hogy az Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött humán EC-vel beoltott ér transzplantátumok transzgént expresszálnak, amint azt a GFPexpresszáló sejtek fluoreszcensz mikroszkópos detektálásával meghatároztuk (5b. ábra). A transzgén expressziót a fertőzés után 24 órával analizáljuk.
A nukleáris-célzott LacZ-t kódoló TGA retrovirális vektorral (F. Cosset kedves ajándéka) fertőzött humán EC-vel oltott PTFE ér transzplantátumok úgy tűnik ^-galaktozidázt expresszálnak (6a. ábra) amint azt X-gal kolorimetriás vizsgálattal meghatároztuk. Azt találtuk, hogy a retroVEGF-GFP-vel fertőzött humán EC-vel oltott ér transzplantátumok transzgént expresszálnak, amint azt a GFP-t expresszáló sejtek fluoreszcensz mikroszkópos detektálásával meghatároztuk (6b. ábra). A transzgén expressziét a fertőzés után 24 órával analizáljuk.
Az eredmények ezért azt mutatják, hogy a jelen találmány adenovirális és retrovirális vektorai képesek mesterséges ér transzplantátumra oltott primer humán EC-ben a transzgének, mint például a VEGF pro-endotelializációs faktor expresszióját irányítani.
5. példa
Csontvelő őssejt VEGF-et kódoló vektorokkal való fertőzése
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
A csontvelő őssejteket a korábban leírtak (17, 30) szerint gyűjtjük össze és fertőzzük VEGF-GFP-t kódoló rekombináns adenovirális vektorral. A differenciálódást a fertőzött sejtek morfológiai elemzésével és a von Willebrand faktor immunohisztokémiai detektálásával követjük nyomon.
6. példa
A gén expresszié szabályozása a beoltás után
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat ésmódszereket használjuk.
Egy effektor-szabályozható expressziós rendszert használunk a transzgén, például a VEGF és az UP50 expressziójának szabályozása céljából, EC-ben. Például, tetraciklint használunk a VEGF expresszió lefelé történő szabályozásához és az UP50 felfelé történő szabályozásához, azáltal, hogy ezeket a proteineket olyan promóterek szabályozó ellenőrzése alatt expresszáljuk, melyeket a tetraciklin sorrendben felfelé és lefelé szabályoz. Egy ilyen rendszerrel a beoltott sejtek egy proteint expresszálnak, például VEGF-et az első héten, amikor szükség van a sejt proliferációra, míg a tetraciklin sebészeti beavatkozás után egy héttel való alkalmazása lefelé szabályozza a VEGF expressziót és felfelé szabályozza az UP50 expressziót, ily módon növeli a sejtek ér transzplantátumhoz való tapadását (31).
A rekombináns protein expresszió elemzését az alábbiakban részletezzük.
A VEGF protein szintjeit a beoltott ér transzplantátum-kondícionált felülúszó ELISA módszerrel való vizsgálatával elemezzük 24 órán keresztül. Hasonló módszereket használunk az UP50 protein szintjeinek méréséhez.
7. példa
Az endoteliális sejtek mennyiségi morfometriája
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat ésmódszereket használjuk.
Az inkubálási időszak végén az ér transzplantátumokat hosszanti irányban felvágjuk, és fluoreszcensz mikroszkóppal megvizsgáljuk, lefényképezzük és a képeket kép-elemző rendszert (Image pro Plus, Media cyberbetics, USA) használva feldolgozzuk.
8. példa t-PA és urokinase mérések
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
A t-PA szintet és aktivitást a beoltott ér transzplantátumok összegyűjtött felülúszóiban határozzuk meg. A t-PA és az urokináz szintjeit ELISA módszerrel teszteljük, míg a t-PA aktivitást a korábban leartak szerint mérjük (32).
9. példa
Az ér transzplantátumokból való sejt kinyerés
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
A PTFE ér transzplantátumokból a sejteket EDTA-tripszinnel végzett emésztéssel nyerjük ki. A sejteket az emésztés után megszámoljuk és fibronectinnel előburkolt szövet-tenyésztő lemezen újra szélesztjük az életképesség értékelése céljából. Feljegyezzük a szélesztéstől a teljes konfluenciáig eltelő időtartamot. A pszeudotipizált retrovirális vektorokkal transzdukált sejtekben ELISA módszert, és a jelen találmányban leart különböző módszereket használva nyomon követjük a VEGF és UP50 expressziót.
10. példa
A transzgén expresszió detektálása genetikailag módosított vasculáris sejtekben
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az alábbiakban leírjuk az UP50 mRNS transzkripció RT-PCR alanízisét. Teljes RNS-t izolálunk az EC-ből és SMC-ből 48 órával az UP50-t kódoló adenovirális és retrovirális vektorokkal való transzformálás után, PURESCRIPT RNS izolációs kitet (Gentra systems, USA) használva és az RNS koncentrációt a 260 nm hullámhosszúságon mért abszorbanciából számítjuk ki.
A cDNS szintézishez 1 pg RNS-t összekeverünk 500 ng random hexamerrel, a keveréket 70°C hőmérsékletre melegítjük 10 percig, majd jégen lehűtjük. A reakcióelegy 0,4 mM dNTP-ket, 5 egység AMV-reverz transzkriptázt (RT)(Promega), 5 mM DTT-t, 32 egység RN-áz-out-ot (Gibco BRL) tartalmaz, és RT puffért (Promega) adunk az előmelegített RNS-hez. A reakcióelegyet 2 órán keresztül inkubáljuk 38°C hőmérsékleten, majd 15 percig 95°C hőmérsékleten. A PCR reakciót 50 pl-es térfogatban hajtjuk végre 7 pl RT reakcióelegy keverékkel, 20 pmol sense-primerrel: 5’.
GAAGATCTTGACATGCCAGGAATAAAAAGGATACTC-3’ (2. számú szekvencia), 20 pmol anti-sense primerrel: 5’GAAGATCTTCAGAATGGGTACTGCGACACATATATCCGCAGTCG-3’ (3. számú szekvencia), 240 mmol dNTP-kel, 1 U Ex-Taq DNS polimerázzal (Takara, Japan) és a gyártók által biztosított reakció pufferrel. A PCR reakciót az alábbiak szerint végezzük el: 2 percig tartó inkubálás 94°C hőmérsékleten, amit a következőkben leírt 10 ciklus követ: 94°C/30 másodperc -> 50°C/30 másodperc -> 72°C/60 másodperc. Ezt 21 ciklus követi: 94°C/30 másodperc -> 60°C/30 másodperc -> 72°C/60 másodperc + 5 másodperc/ciklus -> 72°C/10 perc. Az RT-PCR termékeket elektroforézissel analizáljuk 1%-os agaróz gélben.
Az alábbiakban leírjuk az UP50 és VEGF protein expresszié western immunolenyomat analízisét.
Az adenovirálisan vagy retrovirálisan transzformált EC és SMC UP50 vagy VEGF protein expresszióját a transzformált sejt-kondicionált tápközeg Western immonolenyomat analízisével határozzuk meg. A tenyésztápközeget szérum-mentes tápközeggel helyettesítjük 24 órával a transzformáció után és a sejteket további 24 órán keresztül szaporítjuk. A transzformált sejt-kondicionált tápközeg (CM) mintáit (30 pl) 10 % SDS poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel szeparáljuk redukáló körülmények között. A szeparált proteint elektrolenyomatoljuk nitrocellulóz membránra (Schleicher & Schuell). A lenyomatokat blokkoló oldattal (0,1% szeparált tejet és 0,3% Tween-20-at tartalmazó TBS (TBST)) való inkubálással blokkoljuk 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten, gyenge rázatás mellett. Ezután, a lenyomatokat blokkoló oldattal hígított primer antitesttel inkubáljuk 2 órán keresztül, szobahőmérsékleten. Affinitás tisztított poliklonális nyúl anti-UP50 antitestet (#9855, rendelésre gyártott, Sigma, lsrael)(1:5000) használunk az UP50 detektálásához és poliklonális nyúl anti-VEGF165 antitestet (#SC 152 Santa-Cruz, USA)(1:700) használunk a VEGF detektálásához.
A primer antitesttel való inkubálást követően, a lenyomatokat háromszor mossuk TBST-vel és TBST-vel hígított anti-nyúl peroxidázkonjugált szekunder antitesttel (Sigma, USA) inkubáljuk 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten. TBST-vel végzett háromszori mosás után a specifikus proteint a lenyomatok ECL reagenssel (Sigma, USA) való előhívásával és röntgen filmen való exponálásával vizualizáljuk.
Az UP50 expressziót immunohisztokémiai analízissel elemezzük. Adenovirálisan fertőzött EC-t és SMC-t oltunk fibronectinnel (4,5 pl/mg) előburkolt kamra-tárgylemezre (Lab-Tek, USA) és 24 órán keresztül tenyésztjük. Az adenovirális fertőzés után 48 órával a sejteket oly módon fixáljuk, hogy szobahőmérsékleten inkubáljuk őket 20 percen keresztül
4% paraformaldehidben, majd kétszer mossuk őket PBS-sel. A sejteket ezután a tárgylemezek mikrosütőben 5 percig tartó 1 mM EDTA-ban (pH 8,0) való melegítésével denaturáljuk. A mintákat Histostain-Plus kittel szállított (Zymed, USA) blokkoló oldatot használva blokkoljuk gyártók útmutatásának megfelelően. Blokkolás után a sejteket affinitás tisztított anti-UP50-nel (1:50) inkubáljuk 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten. A mintákat ezután háromszor mossuk PBS-T-vel (0,3% Tween-20-at tartalmazó PBS), majd PBS-T-ben 1:400-ra hígított rhodamin-konjugált kecske anti-nyúl IgG antitesttel (#SC 2091, Santa Cruz, USA) inkubáljuk 1 órán keresztül. A sejteket háromszor mossuk PBS-T-vel és montírozó tápközeggel (H-1000, Vector Laboratories, USA) borítjuk. A mintákat a sejtekben levő GFP és rhodamin fluoreszcensz szkenning konfokális (MRC-1024, BioRad) mikroszkópos detektálásával vizualizáljuk.
Az UP50 ECM-ben való immunohisztokémiai analíziséhez az UP50 gént kódoló, rekombináns adenovirális vektorral fertőzött endoteliális sejteket úgy indukáljuk az ECM létrehozása céljából, hogy dextránt adunk a tenyésztápközeghez. Az EC réteg eltávolítása után (melyhez 20 mM NH4OH oldatot használunk), az ECM-et rhodamin alapú immunofestésnek vetjük alá anti-UP50 antitestet használva.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
Az alábbiakban leírjuk az UP50 EC-ben és SMC-ben való expressziójának analízisét. Az EC és SMC UP50-GFP-t kódoló rekombináns adenovírussal való fertőzése transzgén expressziót eredményez (sorrendben 7b és 7d ábrák), amint azt a GFP vizualizációjával meghatároztuk. Az EC és SMC UP50-GFP-t kódoló retrovirális vektorral való transzdukciója hasonlóan a GFP protein termelését demonstrálja (8b. és 8d. ábrák).
Az UP50 mRNS transzkripcióját RT-PCR analízissel detektáljuk Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC-ben és EMC-ben (sorrendben 9a és 9b.
ábrák), és az UP50-GFP4 kódoló retrovirális vektorral genetikailag módosított EC-ben és SMC-ben (sorrendben 10a. és 10b. ábrák).
Az UP50 protein (60 kD) expressziót Western immunolenyomat analízissel detektáljuk az EC és SMC UP50-GFP-et kódoló adenovirális (11. ábra) és retrovirális (12. ábra) vektorokkal való fertőzése után.
Az UP50 proteint Ad.UP50-fertőzött EC-bensés SMC-ben detektáljuk, amint azt immunohisztokémiaiig meghatároztuk (sorrendben 13b. és 13d. ábrák). A citoplazmás festést Ad.UP50-GFP-vel fertőzött sejtekben detektáljuk, míg nem detektálunk festődést az Ad.UP50 fertőzött sejtekben, így demonstrálva, hogy az UP citoplazmás expressziója magas szintű.
Konfokális mikroszkópiát használunk az UP50 sub-celluláris elhelyezkedésének elemzéséhez fertőzött EC-ben. Az UP50 expresszióját Ad.UP50-GFP fertőzött endoteliális sejtekben detektáljuk a citoplazmában és a sejt membránban (14b. és 14c. ábrák) és szálas szerkezetként detektáljuk a konfluens sejtekben (14b. ábra). Az UP50 citoplazmás szálas expressziója nem-konfluens sejtekben azt jelenti, hogy az UP50 kapcsolatban állhat a citoszkeletonnal (sejtvázzal), és szerepe lehet a sejt-sejt vagy sejt-ECM kölcsönhatásokban.
Az UP50 protein jelenlétét az UP50-GFP-t kódoló adenovirális vektorral fertőzött EC által létrehozott ECM-ben immunohisztokémiai analízissel detektáljuk (15. ábra).
Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a jelen találmány retrovirális és adenovirális expressziós vektorai képesek az UP50 celluláris tapadási faktor expresszióját indukálni vasculáris sejtekben. Ezért, az ilyen szerkezetetek expresszáló EC-t és az SMC-t használjuk a funkcionális elemzésekben, melyek azt a célt szolgálják, hogy kimutassuk, hogy az UP50-et expresszáló vasculáris sejtek képesek jobb szintetikus ér transzplantátumokat létrehozni, ha azokat az ér transzplantátumokra oltjuk.
11. példa
Az adenovitálrisan fertőzött EC és SMC közös tenyészeteinek UP50 és VEGF protein expressziója
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az EC adenovirálisan fertőzött közös tenyészeteit vagy az adenovirálisan fertőzött EC és SMC közös tenyészeteit 24 órán keresztül tenyésztjük a fertőzést követően szérummal kiegészített tenyésztápközegben, majd tovább tenyésztjük szérum mentes tenyésztápközegben további 24 órán keresztül. A felülúszóban levő proteineket elektroforetikusan szeparáljuk 10% SDS poliakrilamid gélen és a szeparált proteineket elektrolenyomatoljuk nitrocellulóz mambránokra. A lenyomatokat anti-VEGF vagy anti-UP50 antitestekkel inkubáljuk. A peroxidáz-konjugált szekunder antitesteknek való exponálás után a lenyomatokat ECL reagensekkel előhívjuk, majd röntgen filmen exponáljuk.
Az alábbi eredményeket kaptuk.
Az Ad.VEGF-GFP-fel fertőzött és az Ad.UP50-GFP-fel fertőzött EC vagy SMC közös tenyészetei a VEGF és UP50 hasonló szintű expresszióit demonstrálja (sorrendben 16a. és 16b. ábrák).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a jelen találmány módszere képes közösen létrehozni EC mitogén VEGF és az UP50 EC adhéziós faktort, valamint képes ezeket a proteineket termelni a genetikailag módosított EC és SMC közös tenyészeteivel. Ennélfogva a jelen találmány javított módszert biztosít a mesterséges ér transzplantátumok endoteliális sejtekkel való beoltására.
Az alábbiakban, a retrovirálisan fertőzött EC és SMC közös tenyészetek által expresszált VEGF és UP50 proteinek Western lenyomat analízisét mutatjuk be.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
A különöző retrovírusokkal fertőzött EC közös tenyészeteit, vagy a fertőzött EC és SMC kevert tenyészeteit szérummal kiegészített tenyésztápközegben tenyésztjük 24 órán keresztül, a fertőzés után, majd a sejteket további 24 órán keresztül tenyésztjük szérum mentes tenyésztápközegben. A szaporító tenyésztápközeg mintáit (30 pl) 10% SDS poliakrilamid gélen szeparáljuk és elektrolenyomatoljuk nitrocellulóz membránon. A lenyomatokat anti-VEGF vagy anti-UP50 antitestekkel inkubáljuk. A peroxidáz konjugált szekunder antitestnek való exponálás után a lenyomatokat ECL reagensekkel előhívjuk, és röntgen filmen exponáljuk.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
Az UP50 és VEGF expressziójára retrovirálisan fertőzött SMC és EC közös tenyészeteinek analízise sorrendben azt demonstrálja, hogy a VEGF és az UP50 protein közösen expresszálódik, amint azt Western immunolenyomat analízissel meghatároztuk (17a. és 17b. ábrák).
Ezek, és a fent leírt adenovirális vektorok alkalmazásával nyert eredmények ezért azt demonstrálják, hogy a jelen találmány virális expressziós vektorai hatékonyan irányíthatják a VEGF és az UP50 proteinek expresszi óját. Ezek az eredmények azt is bemutatják, hogy a retrovirális vagy adenovirális vektorok segítségével genetikailag módosított vasculáris sejtek közös tenyészetei túlexpresszálhatják a VEGF és az UP50 proteineket. így, a jelen találmány adenovirális és retrovirális expressziós vektorainak alkalmazása, valamint a mitogén és adhéziót indukáló molekulákat expresszáló, genetikailag módosított vasculáris sejtek kevert tenyészeteinek alkalmazása nagy mértékben alkalmas a hosszú élettartamú és akadálymentes, szintetikus ér transzplantátumok előállításában.
12. példa
A vasculáris sejtekben túlexpresszált rekombináns VEGF és UP50 funkcionális elemzése
Az alábbiakban bemutatjuk az EC proliferációs vizsgálatát.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az endoteliális sejteket (5-11 átoltás) 30 %-os konfluenciánál (104 sejt/üreg) oltjuk 4,5 pg/ml fibronectinnel előburkolt 24 üregű lemezekre, 24 órával az adenovirálisan fertőzés előtt. A sejteket Ad.UP50-GFP-vel, Ad.GFP-vel vagy Ad.VEGF165-GFP-vel fertőzzük. A 90 percig tartó adenovirális vektoroknak való, 37°C hőmérsékleten végzett exponálás után szérumot tartalmazó tenyésztápközeget adunk hozzá és 16-18 órával később a tenyésztápközeget 2% humán szérumot és 2 ng/ml bFGF-et tartalmazó M199 tenyésztápközeggel helyettesítjük. A vizsgálatot háromszori ismétlésben végezzük, és a proliferációt XTT kolorimetriás vizsgálattal mérjük a fertőzés utáni 7. napon.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
A fertőzés majdnem 100%-os transzgént expresszáló sejteket eredményez, ahogy azt a citoplazmás GFP expresszióval detektáltuk. Az eredményeket a nem fertőzött sejtekhez viszonyított relatív értékként mutatjuk be. Amint az a 18. ábrán látható, az UP50 transzgén túlexpresszió nincs gáltó vagy proliferatív hatással a sejtek szaporodási sebességére. Bár az adenovirálisan fertőzött csoportban (Ad.GFP, AD. UP50-GFP) mért értékek valamivel magasabbak, mint a nem fertőzött, kontroll csoportban mért eredmények, az UP50 expresszió hatása nem szignifikáns. Nincs szignifikáns különbség az Ad.GFP-vel fertőzött és az Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC eredményei között Az Ad.VEGF165-GFPvel való fertőzés szignifikáns proliferációt indukál az egyéb fertőzött EC csoportokhoz képest.
Az alábbiakban bemutatjuk az EC, UP50-et túlexpresszáló EC-vel létehozott, SMC-hez való tapadását.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az alábbiakban bemutatjuk az ECM EC általi indukcióját. Az EC-t fibronectinnel előburkolt 48 üregű lemezekre oltjuk (104 sejt/üreg) 24 órával a fertőzés előtt. A sejteket Ad.UP50-GFP-fel vagy Ad.GFP-vel fertőzzük, a korábban leírtak szerint. Fertőzés után a sejteket 4% dextrán 42000-rel (Sigma, USA) kiegészített M20 tenyésztápközegben szaporítjuk 7 napon keresztül. Ezen fertőzéses időszak után a tenyésztápközeget aspiráltatjuk a fertőzött sejtekről és a mátrixot létrehozó sejteket 20 mM NH4OH-val lecsupaszítjuk, körülbelül 5 perces kezeléssel. A sejt lízis után az ECM-burkolt üregeket háromszor mossuk PBS-sel és PBS-ben tároljuk 4°C hőmérsékleten.
Extracelluláris mátrix adhéziós vizsgálatot végzünk el az alábbiak szerint: az EC-t 10 mM EDTA oldatban való inkubálással leválasztjuk, a mátrixot M199 tenyésztápközeggel mossuk, majd Ad.UP50-GFP-vel, Ad.GFP-vel fertőzött CM-ben, vagy nem fertőzött EC-ben inkubáljuk, sorrendben 15 percig. Ezen inkubálás után az EC-t ECM-mel burkolt üregekbe oltjuk (2 x 104 sejt/üreg mennyiségben). Az Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC-vel létrehozott ECM-re oltott, sejteket Ad.UP50-GFP-vel fertőzött sejtekből létrehozott CM-ben inkubáljuk. Az Ad.GFP-vel fertőzött sejtek által létrehozott ECM-re oltott sejteket Ad.-GFP-vel fertőzött sejtekből gyűjtött CM-mel inkubáljuk, és a nem fertőzött sejtekből létrehozott ECM-re oltott kontroll csoport sejtjeit nem fertőzött sejtkondicionált tenyésztápközeggel inkubáljuk. A sejteket további 30 percig inkubáljuk, hogy lehetővé tegyük a sejtek tapadását, majd PBS-sel mossuk őket. A megmaradt adherens sejtek mennyiségi meghatározását XTT kolorimetriás vizsgálattal határozzuk meg.
Hasonló kísérletet hajtunk végre retroUP50-GFP-vel transzdukált EC-ből létrehozott ECM-et használva.
Az alábbiakban bemutatjuk az UP50 celluláris fiziológiára és közös tenyészetekre kifejtett hatásait.
Az feltételeztük, hogy megvalósítható az UP50 és a VEGF közös expressziója. Ezért a VEGF vagy az UP50 expresszálására fertőzött EC közös tenyészeteit teszteljük az expresszió szintjeire mindkét protein esetében, miután összekevertük az Ad.UP50-GFP-vel fertőzött sejteket az Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC-vel az alábbiakban leírtak szerint.
Az UP50-GFP-Í, GFP-t kódoló retrovirális vektorral transzdukált endoteliális sejteket vagy a kontroll, nem transzdukált sejteket 48 órán keresztül inkubáljuk az adenovirális fertőzés előtt. A fertőzést Ad.VEGFGFP-vel vagy Ad.GFP-vel végezzük el. A sejteket 24 órán keresztül inkubáljuk a vírust tartalmazó tenyésztápközegben, majd a tenyésztápközeget szérum mentes tápközeggel helyettesítjük és a sejteket további 24 órán keresztül inkubáljuk. A szaporító tápközeg mintáit (30 μ|) 10% SDS poliakrilamid gélen szeparáljuk, a szeparált proteineket elektrolenyomatoljuk nitrocellulóz mebránra és a lenyomatokat anti-VEGF-fel vagy anti-UP50-nel inkubáljuk. A peroxidázkonjugált szekunder antitestnek való kitevés után a lenyomatokat ECL reagenseket használva előhívjuk, és röntgen filmen exponáljuk.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
Az alábbiakban bemutatjuk a retrovirális és adenovirális vektorokkal egymás után genetikailag módosított EC általi UP50 és VEGF expresszió analízisét.
Azok az endoteliális sejtek, melyeket retrovirálisan transzdukáltunk, hogy UP50-GFP-t expresszáljanak, majd ezt követően VEGF-GFP-t kódoló adenovirális vektorral fertőztünk, magasabb szinten expresszálják a GFP-t, mint a csupán az UP50-GFP-t kódoló retrovirális vektorral fertőzött sejtek, ahogy azt fluoreszcensz mikroszkópiával meghatároztuk (sorrendben 19b. és 19a. ábrák).
Az UP50 expresszálására retrovirálisan transzdukált, majd ezt követően a VEGF géneket kódoló adenovirális vektorral fertőzött EC Western immonolenyomatolási elemzése azt jelzi, hogy az ilyen sejtek képesek együtt expresszálni a VEGF és az UP50 proteineket (sorrendben a 20a. és 20b. ábrák).
Ezért ezek az eredmények azt mutatják, hogy az EC, VEGF és UP50 mitogén és adhéziót-indukáló proteinek közös expresszálását célzó, sorrendben egymást követő retrovirális transzdukciója és adenovirális fertőzése nagy mértékben alkalmas a hosszú élettartamú és akadálymentes szintetikus ér transzplantátumok előállítására. Az EC ilyen duális virális genetikai módosításának alkalmazását támogatja az ezáltal termelt megnövekedett GFP szint, amint azt korábban tárgyaltuk.
Az alábbiakban leírjuk az UP50 EC szaporodásra kifejtett hatását háromdimenziós kollagén tenyészet in vitro angiogenezisben.
A szintetikus ér transzplantátumok VEGF és UP50 - sorrendben mitogén és pro-adhéziós faktorokat túlexpresszáló EC-vel való beoltása igen kívánatos a hosszú élettartamú és akadálymentes szintetikus ér transzplantátumok létrehozásában. Ennélfogva, ezen faktorok az EC porliferáció indukálására kifejtett kombinált hatásait az alábbiak szerint vizsgáljuk meg.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az in vitro angiogenezist kollagén gélekben adenovírussal fertőzött EC szferoidokat használva mennyiségileg határozzuk meg. Az EC szferoidok létrehozását a korábban leírtak szerint végezzük el (33). Az endoteliális sejteket 0,25% (tömeg/térfogat) kabroximetil-cellulózt tartalmazó tenyésztápközegben szuszpendáljuk és nem-szövettenyésztő kultúra kezelt, kerek aljú 96 üregű lemezeken (Nunc, Denmark) tenyésztjük 24 órán keresztül, 37°C hőmérsékleten, 5% CO2 alatt, mely idő alatt a szuszpendált sejtek üregenként egyetlen, meghatározott méretű és sejtszámú szferoidot hoznak létre (körülbelül 750 sejt/szferoid). Az így léte hozott szeferoidokat kollagén gélekbe ágyazzuk. A kollagén törzsoldatot a felhasználás előtt készítjük el oly módon, hogy összekeverünk 8 térfogat savas patkány farok kollagén kivanatot (2 mg/ml értékre ekvilibráljuk, 4°C), 1 térfogat 10x M199-cel (Gibco BRL, USA). A pH értéket 7,4-re állítjuk 0,34N NaOH hozzáadásával. A szferoidok kollagén gél polimerizációja előtti leülepedésének megakadályozása céljából 1 térfogat kollagén törzsoldatot összekeverünk 1 térfogat szobahőmérsékletű, 40% humán szérumot és 0,5% (tömeg/térfogat) karboximetil-cellulózt tartalmazó M199 tenyésztápközeggel. A szferoidokat tartalmazó géleket (20-30 szferoid/gél) gyorsan, előmelegített 24-üregű lemezekre helyezzük át, és hagyjuk, hogy bekövetkezzen a polimerizáció. A géleket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk 5% CO2-ben és az EC proliferációját a gélekben mikrofotókkal dokumentáljuk digitális video kamerát (DXM1200 Nikon, Japan) használva. Az egyes csoportokból legalább 40 szferoid csírázását analizáljuk.
Az alábbi eredményeket kaptuk.
Az Ad.GFP-vel vagy az Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC szferoidjai esetében (sorrendben 21b. és 21f. ábrák) alacsony alapvonal csírázási aktivitást tapasztaltunk, amit az exogén VEGF hozzáadása erősen stimulál (sorrendben 21 d. és 21 h. ábrák). Az Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC szferoidjai (21f. ábra) esetében azt találtuk, hogy magasabb alapvonal csírázás! aktivitással rendelkeznek, mint az Ad.GFP-vel fertőzött EC (21b. ábra).
Az Ad.GFP-vel és Ad.GFP+Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC szferoidjai (sorrendben 22b. és 22f. ábrák) esetében alacsony alapvonal csírázási aktivitást találtunk, melyet az Ad.GFP-vel és Ad.VEGF-fel fertőzött EC 50%-os közös tenyészeteiben való szaporítás stimulál (sorrendben 22d. és 22h. ábrák). A legmagasabb csírázás! szintet az Ad.UP50-GFP-vel és az Ad.VEGF-GFP-vel fertőzött EC közös tenyészeteiben figyeltünk meg (22h. ábra).
Ezért azt a következtetést lehet levonni, hogy az UP50 VEGF-fel való közös túlexpresszálása szinergista növekedéshez vezet az EC csírázásban, hacsak a VEGF által közvetítetthez hasonlítjuk.
Ezek az eredmények ezért azt mutatják, hogy az UP50 VEGF-fel való egyidejű közös túlexpresszálása az EC-ben nagy mértékben alkalmas a hosszú élettartamú és akadálymentes szintetikus ér transzplantátumok előállítására, mivel a faktorok ilyen kombinációját expresszáló EC erősen fokozott proliferatív kapacitást mutat.
13. példa
Az UP50 túlexpresszálás EC szintetikus ér transzplantátumokoz való tapadására kifejtett hatása, in vitro.
A fokozott adhéziós tulajdonságokkal rendelkező EC-vel beoltott szintetikus ér transzplantátumok igen kívánatosak, mivel az EC-vel oltott transzplantátumok tudomány területének korábbi fő problémája az, hogy ezek nem tartják meg hatékonyan a rájuk oltott sejteket. Ennélfogva, az EC tapadóképességének fokozását célzó EC pro-adhéziós UP50 faktor túlexpresszálás hatékonyságát az alábbiak szerint elemezzük.
Az alábbiakban leírjuk az UP50 túlexpresszió adhézióra kifejtett hatását in vitro tenyésztett EC-ben a tripszinizációt követően.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az UP50 Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC-ben való biológiai aktivitását sejt retenciós sebességgel vizsgáljuk tripszinizáció után. Az endoteliális sejteket 70-80%-os konfluencia mellett (6-7,5x104 sejt/üreg) oltjuk 12-üregű lemezekre, 24 órával az adenovirális fertőzés előtt. A sejteket fertőzzük (3x103 pfu/sejt) a korábban leírtak szerint, Ad.UP50GFP-vel vagy Ad.GFP-vel és kontrollként nem fertőzött sejteket használunk. A fertőzés után a sejteket M20 tenyésztápközegben szaporítjuk 4 napon keresztül. A sejteket PBS-sel mossuk és az adhéziós vizsgálatot a sejtek tripszinizációjával végezzük el 0,001% EDTA-t tartalmazó 0,0025% tripszint használva. Három perces, szobahőmérsékleten való inkubálás után a tripszint semlegesítjük komplett tenyésztápközeg (M20) hozzáadásával. A sejteket háromszor mossuk PBS-sel, majd 300 μ! M20 tápközeget adunk hozzá a sejtekhez. A továbbra is tapadó sejtek mennyiségi meghatározását a kontroll, nem tripszinizált sejtek százalékaként, kolorimetriás XTT vizsgálattal határozzuk meg.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
A rekombináns adenovirális fertőzést követő UP50 expresszió szignifikánsan növeli a sejt megtartást (60%) az Ad.GFP-vel fertőzött sejtekhez képest (40%), vagy a kontroll, nem fertőzött sejtekhez képest (20%)(23. ábra).
Az UP50 túlexpresszálás ECM-hez való sejt adhézióra kifejtett hatását az alábbiakban mutatjuk be.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az EC-t 10mM EDTA oldattal leválasztjuk, 0,1% BSA-t (Sigma, USA), 10mM HEPES-t tartalmazó M199 tenyésztápközeggel mossuk és sorrendben Ad.UP50-GFP-vel vagy Ad.GFP-vel fertőzött EC-ből, vagy nem fertőzött EC-ből származó CM-mel inkubáljuk 15 percig. Inkubálás után a sejteket ECM burkolt üregekbe (2x104 sejt/üreg) oltjuk. Az ECM-re oltott sejteket - melyeket Ad.UP50-GFP-vel fertőzött EC-ből hozunk létre Ad. UP50-GFP-vel fertőzött sejtekből származó CM-ben inkubáljuk. Az Ad.GFP-vel fertőzött sejtekkel létrehozott ECM-re oltott sejteket Ad.GFPvel fertőzött sejtekből gyűjtött CM-mel inkubáljuk, a nem fertőzött sejtekkel létrehozott ECM-re oltott sejtek kontroll csoportját nem fertőzött sejt kondicionált tápközegben inkubáljuk. A sejteket további 30 percig inkubáljuk, hogy lehetővé tegyük a sejt tapadást, majd PBS-sel mossuk. A továbbra is tapadó sejtek mennyiségi meghatározását kolorimetriás XTT vizsgálattal határozzuk meg.
Az alábbiakban bemutatjuk az eredményeket.
A korábban bemutatott, szekretált UP50-nek, és ECM-kötött UP50nek való exponálás (15. ábra) az EC sejtek adhéziójának 30%-nál nagyobb növelését eredményezte a kontroll csoporthoz képest (24. ábra).
Az alábbiakban bemutatjuk az UP50 túlexpresszálás EC retencióra kifejtett hatását folyamatos nyírási stressz mellett.
Az UP50 EC-re kifejtett adhéziót elősegítő aktivitását sejt retencióval vizsgáljuk folyamatos nyírási stressz alatt, amit úgy valósítunk meg, hogy a tenyész lombikokat rázógépen rázatjuk az alábbiakban léírtaknak megfelelően.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Humán rózsaér véna EC-t (8-11átoltás) oltunk (105 sejt/35 mm-es üreg) mennyiségben, majd M20-ban szaporítjuk 60-80%-os konfluencia eléréséig. A sejteket Ad.UP50-GFP-vel vagy Ad.GFP-vel (MCI 3000) :·%. ·. ··:
«· «· ·**· fertőzzük a korábban leírtak szerint, és a nem fertőzött sejtek szolgálnak kontrollként. A sejteket további 30 percig szaporítjuk, hogy biztosítsuk a transzgén expressziét a nyírási stressznek való kitevés előtt. A kísérlet előtt az egyes csoportokból (Ad. UP50-GFP, Ad.GFP, Kontroll) 2 üreget összegyűjtünk tripszin-EDTA használatával, és a sejteket megszámoljuk. Hogy a sejteket teljesen befedjük a rázatás alatt 5 ml M20 tenyésztápközeget adunk az egyes üregekhez. A lemezeket a rázógépre helyezzük a CO2 inkubátor belsejébe, és 20-24 órán keresztül inkubáljuk intenzív rázatás mellett (körülbelül 140 ciklus/perc). Rázatás után, a sejteket ötször mossuk PBS-sel. A sejteket tripszin-EDTA-t használva összegyűjtjük és hemacitométerrel megszámoljuk. A vizsgálatot párhuzamosan retrovirális vektorokkal transzdukált sejtekkel is elvégezzük.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
A 25a-g. ábrákon (morfometria) és a 25h. ábrán (sejt számolás) bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a retrovirális transzdukció általi UP50 túlexpresszió növeli a folyamatos nyírási stressznek kitett EC tapadását. Az UP50-et expresszáló sejtek között a sejtek 98 %-a a lemezhez tapadt állapotban marad a GFP-t expresszáló EC-hez (72% ± 1%) és a nem transzdukált EC-hez (69 ± 2%) képest. Hasonló eredményeket kaptunk az UP50 expressziója céljából adenovirálisan fertőzött EC-vel (az eredményeket nem mutatjuk be).
14. példa
A szintetikus ér transzplantátumra oltott, áramlási körülményeknek kitett, genetikailag módosított vasculáris sejtek adhéziója.
A szintetikus ér transzplantátumok beolthatok az EC mitogén faktorok expresszálását célzó genetikailag módosított vasculáris %:·'.?
sejtekkel, hogy hosszú élettartamú és akadálymentes ér transzplantátumokat hozzunk létre. A jelen találmánynak megfelelően az ér transzplantátum beoltását EC adhéziót elősegítő faktorokkal végezzük, hogy fokozottan hosszú élettartamú és akadálymentes ér transzplantátumokat hozzunk létre. így az ér transzplantátumok ilyen sejtekkel való beoltását és pulzáló áramlási körülmények között való tesztelését az alábbiakban leírtak szerint végezzük θ|.
Az alábbiakban leírjuk a humán EC retencióját ePTFE ér transzplantátumokon pulzáló áramlási körülmények között.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Az ér transzplantátumokat az alábbiak szerint oltjuk be.
Az UP50-GFP expresszálására retrovirálisan transzdukált EC-t (2 x 105 sejt/1 cm2) fibronectinnel (4,5 mg/ml) előburkolt ePTFE ér transzplantátumokra oltjuk. Ezt a beoltási eljárást 37°C hőmérsékleten hajtjuk végre, 4 órán keresztül, horizontálisan rotáló készülékben, mely 45 rotáció/óra értéken rotál. A beoltott ér transzplantátumokat ezután 20 órán keresztül antibiotikumokkal kiegészített M199 tenyésztápközegben tartjuk.
Az alábbiakban bemutatjuk az áramlási készüléket.
A sematikusan a 26. ábrán bemutatott áramlási rendszer egy pulzáló vér pumpából (Harvard készülék #1421, USA), rugalmas „tygon” csövekből, kompenzációs tartályból és szintetikus ér transzplantátumokból áll, amint azt képszerűen a 27. ábrán bemutatjuk. A rendszer nyomását a nyomás monitoron követjük nyomon (#742 Mennen Medical, Germany). Az ér transzplantátumokon keresztüli áramlást Doppler-alapú áramlási rendszerrel követjük nyomon (#T106 Transonic Systems Inc., USA). Az áramlási és nyomás értékeket nyomon követjük és online feljegyezzük. A nyomás és áramlási adatokat adat gyűjtő rendszerrel analizáljuk, mely online mutatja a kiszámított nyírási erőket az ér transzplantátumon belül. Az áramláshoz használt ePTFE ér transzplantátumok 5-12 cm hosszúságúak és 6 mm átmérőjűek (GORE Co., USA).
Az áramlási körülmények a következők.
A beoltott ér transzplantátumokat laminális áramlási körülményeknek vetjük alá. Az áramlást úgy állítjuk be, hogy 45 percre elérje a 120/75 (90 Hgmm középértéke) fiziológiai vérnyomást, 150-200 ml/perc áramlási sebesség és 60 löket/perc értékű pumpálás mellett. Az ér transzplantátumokat mikroszkópos dokumentációt és morfometriás analízist használva értékeljük. A kísérlet második fázisában az ér transzplantátumokat különböző áramlási körülmények között exponáljuk összesen 30 percig. Az áramlási körülményeknek való exponálás után a GFP-t expresszáló sejtek számának retencióját úgy értékeljük, hogy hosszanti irányban felvágjuk az ér transzplantátumokat és fluoreszcensz fotomikrográfiával megvizsgáljuk a luminális felszín random kiválasztott mezőit.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
Az ér transzplantátumok majdnem teljes borítását detektáljuk a retroGFP és retroUP50-GFP transzdukált sejtek fluoreszcensz mikroszkópiájával (sorrendben 28a. és 28b. ábrák) a pulzáló laminális áramlási körülményeknek való exponálás előtt. Ezt a pulzáló laminális áramlási körülményeknek való exponálás követi. Azok az ér transzplantátumok, melyeket az UP50-GFP expresszálására retrovirálisan transzdukált EC-vel burkoltunk magasabb sejt retenciót mutatnak, mint azok az ér transzplantátumok, melyeket a GFP expresszálására retrovirálisan transzdukált EC-vel burkoltunk, és ·*·*» ugyanilyen áramlási körülményeknek vetettünk alá (sorrendben a 28b. és 28d. ábrák).
Az UP50 gén transzfer utáni megnövekedett sejt adhézió ezen eredményei alátámasztják a jelen találmányban leírt módszert, melyben olyan sejtekkel beoltott ér transzplantátumokat használunk, mely sejtek túlexpresszálják az UP50-et, ami a sejt burkolás fokozását szolgálja áramlási körülmények között.
15. példa
A mesterséges ér transzplantátumokra oltott, genetikailag módosított EC retenciója in vivo áramlási körülmények között.
A következőkben bemutatjuk a genetikailag módosított humán ECvel burkolt ePTFE ér transzplantátumok rövid távú implantációját birka artériákban.
A pro-endotelializációs faktorok expresszálására genetikailag módosított, és szintetikus ér transzplantátumokra oltott humán EC adhéziójának tesztelésére való realisztikus modellként az ilyen faktorokat túlexpresszáló humán EC-vel oltott ér transzplantátumokat in vivo birka artériákban teszteljük az alábbiak szerint.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
Kis keliberű ePTFE ér transzplantátumokat (6 mm) oltunk humán EC-vel, melyeket retrovirális transzdukcióval genetikailag úgy módosítottunk, hogy túlexpresszálják a GFP-t, az UP50-GFP-t vagy a VEGF165-GFP-t, 36 órával az implantáció előtt.
Éheztetett (12 órán keresztül) kifejlett birkát gyógyszerrel előkezelünk inramusculárisan adott 10 mg diazepam injekcióval és 500600 mg intravénásán adott nátrium-pentobarbital, majd légcsövébe csövet vezetünk. Az anesztéziát 1-2 % isoflurán belélegeztetéssel tartatjuk fenn. Operáció előtt 600 mg aspirint alkalmazunk. A kísérlet alatti nyomon követő rendszer vérnyomásmérőt, pulzus oximetriát, és ECG-t foglal magába. Heparint (300 U/kg) injektálunk intravénásán a szisztémás antikoagulációhoz, amit az ér transzplantátum implantációhoz az artériák exponálása és preparálása követ. Az eljárás alatt 30 percenként vérmintát veszünk és a heparinizáció hatékonyságát értékeljük a részleges thromboplasztin idő (PTT) mérésével.
A beoltott ér transzplantátumokat vég-oldal proximális és disztális helyzetben ülteti be a birka femorális artériáiba egy szívsebész szakértő, amint azt a 29. ábrán bemutatjuk. Az ér transzplantátumokat két órára vér áramlás hatásának exponáljuk a begyűjtés előtt.
A beoltott ér transzplantátumokat ezután bilaterálisán vég-oldal pozícióban implantáljuk a birka femorális és femorális artériákba. A femorális artéria egyik oldalán a beültetett ér transzplantátumot beoltottuk retroGFP-vel transzdukált EC-vel, a másik oldalon a beültetett ér transzplantátumot retroUP50-GFP-vel transzdukált EC-vel oltottuk be (femorális artériák). A femorális artériákban a beültetett ér transzplantátumot az egyik végén rertoVEGF165-GFP-vel transzdukált EC-vel, a beültetett ér transzplantátum másik végén retroUP50-GFP-vel transzdukált EC-vel oltottuk be. A beültetett ér transzplantátumok akadálymentességét 30 perccel az implantált ér transzplantátumok véráramnak való kitevése után és az ér transzplantátum begyűjtése előtt értékeljük közvetlen kitapintással, az áramlás méréseket Doppler áramlás mérővel (Transonic Animal Research Flowmeter, NY, USA), valamint szelektív angiográfiát használva végezzük (30. ábra).
A femorális ér transzplantátumon belüli áramlási sebességek mindkét oldalukon hasonlóak (körülbelül 50 ml/perc, 38%-a a femorális véráramlásnak). A carotid transzplantátumon keresztüli áramlás, ami magasabb a kísérlet elején, bilaterálisán csökken a két órás kísérlet végére az anasztomózisos helynél fellépő trombózisnak köszönhetően (szekunder sebészeti komplikáció). A femorális és karotid ér transzplantátumokat a beültetés utáni második órában összegyűjtjük. Mindkét ér transzplantátumot összegyűjtjük és az ér transzplantátumok luminális felszínein levő celluláris retenciót fluoreszcensz mikroszkópiával elemezzük.
Az ér transzplantátum eltávolítása után a birkákat intravénás kálium-klorid alkalmazásával elpusztítjuk.
Az összes kísérletet a Technion ITT (Haifa, Israel) állatvédelmi és kísérlet végrehajtási törvényeknek megfelelően végezzük el.
Az alábbi eredményeket kapjuk.
Az UP50-GFP-t vagy VEGF-GFP-t túlexpresszáló sejtekkel beoltott ér transzplantátumok világosan nagyobb ér transzplantátumokhoz tapadó sejtszámot mutatnak az in vivo véráramlásnak való exponálás után, mint amit csak a GFP-t túlexpresszáló sejtek esetében tapasztaltunk, amint azt a GFP expresszió fluoreszcensz mikroszkópos láthatóvá tételével meghatároztuk (31. ábra). Az UP50-et túlexpresszáló sejtekkel beoltott ér transzplantátumok nagyobb megtapadt sejtszámot mutatnak, mint a GFPt vagy a VEGF-et túlexpresszáló sejtekkel beoltott ér transzplantátumok.
Ezek az eredmények a statikus vagy áramlásos körülmények között végzett in vitro adhéziós vizsgálatokból nyert eredményekkel egyetértésben, amint azt fent leírtuk, meggyőzően bizonyítják, hogy az EC, UP50 EC adhéziót elősegítő faktor túlexpresszálására szolgáló genetikai módosítása ezen sejtek erősen fokozott adhéziójához vezet. Ezért, az ilyen genetikailag módosított sejtek szintetikus ér transzplantátumok beoltására való használata igen előnyös hosszú élettartamú és akadálymentes ér transzplantátumok létrehozásához.
Az alábbiakban leírjuk a genetikailag módosított, autológ EC-vel beoltott mesterséges ér transzplantátumok hosszútávú implantációját birkákban.
Az eljáráshoz az alábbi anyagokat és módszereket használjuk.
A donor birkák hátsó lábából származó rövid vénás szegmensekből begyűjtött endoteliális sejteket laboratóriumban expandáljuk és virális vektorokkal genetikailag módosítjuk. A genetikailag módosított sejteket ér transzplantátumokra oltjuk és ezeket vég-vég pozícióban proximálisan és disztálisan autológ donor birkák femorális artériáiba implantáljuk. A genetikailag módosított sejtekkel beoltott ér transzplantátumot egy femorális artéria egyik oldalára implantáljuk, míg a csupán marker gént expresszáló sejtekkel beoltott ér transzplantátumot a femorális artéria másik oldalára implantáljuk. Hosszú távú és rövid távú (3, 7, 30 nap) kísérleteket végzünk el, hogy detektáljuk a sejt tapadást és a lokális trombózist és gyulladást. A hosszú távú ér transzplantátum élettartamot és akadálymentességet a 7., a 30. és a 180. napon (n=5 a VEGF és n=5 az UP50 esetében) értékeljük oly módon, hogy külsőleg mérjük az áramlást Doppler áramlásmérőt (Transonic Animal Research Flowmeter, NY, USA) használva. A megfigyelési periódus végén az ér transzplantátumokat kinyerjük és a neointimális képződést a kereszt szekciók morfometriás mérésével értékeljük, a sejtek tapadását a marker gén expresszió detektálásával teszteljük.
Bár a jelen találmányt specifikus kiviteli alakjaival egyetértésben írtuk le, egyértelmű, hogy számos alternatíva, módosítás és variáció nyilvánvaló a tudomány e területén képzett szakember számára. Ennek megfelelően, szándékunk szerint a jelen találmány magába foglalja az összes alternatívát, módosítást és variációt, mely a jelen találmány körébe és a csatolt igénypontok széles körébe tartozik. Az összes publikáció, szabadalom, szabadalmi alkalmazás, valamint az ezekben leírt szekvencia, és/vagy a jelen találmányban GenBank katalógusszámon említett összes szekvencia a jelen specifikációban való hivatkozás révén teljes egészében a jelen találmány részét képezi, ugyanolyan mértékben, mintha az egyes publikációk, szabadalmi alkalmazások, szabadalmak vagy szekvenciák specifikusan és egyenként jelölve lennének, hogy részét képezik a jelen találmánynak a hivatkozás révén. Ezen kívül, a jelen találmányban megadott bármely hivatkozás idézése vagy meghatározása nem tekinthető annak elismeréseként, hogy az ilyen hivatkozások elsőbbséget élveznek a jelen találmánnyal szemben.
Az alábbiakban megadjuk a jelen találmányban használt irodalmi hivatkozásokat.
A további hivatkozások a találmány leírásában találhatók meg.
1. VA Study Group 141. Comparative evaluation of prosthetic, reversed, and in situ vein bypass grafts in distal popliteal and tibialperoneal revascularization. Arch Surg 1988;123:434-8.
2. Londrey GL, Ramsey DE, Hodgson KJ, Barkmeier LD, Sumer DS. Infrapopliteal bypass for severe ischemia: comparison of autogenous vein composite, and prosthetic grafts. J Vase J 1991 ;13:6316.
3. Darling RC, Linton RR. Durability of femoropopliteal reconstructions. Am J Surgery 1972;123:472-79.
4. Rutherford RB, Nishikimi N. Graft thrombosis and thromboembolic complications. In Rutherford RB ed. Vascular Surgery. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co;1989:501-510.
5. Eickhoff JH, Broome A, Ericsson BF, et al. Four years results of a prospective, randomized clinical trial comparing PTFE and modified human umbilical for below knee femoropopliteal bypass. J Vase Surg 1987;6:506-511.
6. Meinhart J, Deutsch M, Zilla P. Eight years of clinical endothelial cell transplantation. Closing the gap between prosthetic grafts and vein grafts. ASAIO 1999;43:M515-21.
7. Falk J, Townsend LE, Vogel LM, Boyer M, et al. Improved adherence of genetically modified endothelial cells to small diameter expanded PTFE grafts in canine model. J Vase Surg 1998;27:902-8.
8. Magometschnigg H, Kadletz M, Vodrazka M, et al. Prospective clinical study with in vitro endothelial cell lining of expanded polytetraflouruethylene grafts in crural repeat reconstruction. J Vase Surg 1992;15:527-35.
9. Noishiki Y, Tomizawa Y, Yamane Y, Matsumoto A. Autocrine angiogenic vascular prosthesis with bone marrow transplantation. Nature Medicine 1996;2:90-93.
10. Clowes AW. Improving the interface between biomaterials and the blood - the gene therapy approach. Circulation 1996;93:1319-1320.
11. Dichek DA, Anderson J, Kelly AB, Hanson SR, Harker LA. Enhanced in vivo antithrombotic effects of endothelial cells expressing recombinant plasminogen activators transduced with retroviral vectors. Circulation 1996;93:301-309.
12. Gillis-Haegerstrand C, Frebelius S, Haegerstrand A. Swedenberg J. Cultured human endothelial cells seeded on expanded PTFE support thrombin mediated activation of protein C. J Vase Surg 1996;24:226-34.
13. Pasic M, Muller-Glauser W, Odermatt B, Lachat M, Seifert B, Turina M. Seeding with omental cells prevents late neointimal hyperplasia in small-diameter grafts. Circulation 1995;92:2605-2616.
14. Edelman ER. Vascular tissue engineering. Circ Res 1999,85:11157
15. Leung DW, Cachians G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N: Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic factor. Science 1989;246:1306-1309.
16. Hanahan D. Signaling vascular morphogenesis and maintenance. Science 1997;277:48-50.
17. Huang XL. et al., Biochem Biophys Res Commun. 1999, 264:133
18. Sapienza P, di Marzo L, Cucina A, et al. Release of PDGF-BB and bFGF by human endothelial cells seeded on ePTFE vascular grafts. J Surg Res 1998;75:24-9.
19. Van Belle E, Tio FO, Couffinhal T, Maillard L, Passeri J, Isner JM. Stent endothelialization. Circulation 1997;95:438-448.
20. Folkman J: Therapeutic angiogenesis in ischemic limbs [editorial; comment.]. Circulation 1998;97:1108-1110
21. Anderson WF. Human gene therapy. Nature 392;25-30.
22. Mulligan RC: The basic science of gene therapy. Science 260:926-932, 1993.
23. Cosset F-L, Russell SJ. Targeting retrovirus entry. Gene Therapy 1996;3:946-956.
24. Nakamura T, Ruiz-Lozano P, Lindner V, et al. DANCE, a novel secreted RGD protein expressed in developing, atherosclerotic, and balloon injured arteries. JBC 1999; 274,:22476-22483.
25. Huber TS, Welling TH, Sarkar R, Messina LM, Stanley JC. Effects of retroviral-mediated t-PA gene transfer and expression on adherence and proliferation of canine endothelial cells seeded onto ePTFE. J Vase Surg 1995;22:795-803.
26. Dunn PF, Newman KD, Jones M, Jamada I, Shayani V, Virmani R, Dichek DA. Seeding of vascular grafts with genetically modified endothelial cells; secretion of recombinant T-PA results in decreased seeded cell retention in vitro and in vivo. Circulation 1996;93:1439-1446.
27. Zilla P, Greisler HP (Eds). Tissue engineering of vascular prosthetic grafts. RG Landes Company, Austin, Texas, USA 1999.
28. He TC. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:2509.
29. Flugelman MY. et al., Circulation Research 1992, 70:348.
30. Asahara T. et al., EMBO J. 1999, 18:3964.
31. Agha-Mohammadi S. and Lotze MT. J Clinical Investigations 2000, 105: 1177.
32. Dichek DA. etal, Blood 1991,77:533.
33. KorffT. etal. J Cell Biol. 1998, 143:1341.
34. Steele JG, Johnson G, Norris VD, Underwood PA. Adhesion and groth of cultured human endothelial cells perfluorosulphonate: role of vitronectin and fibronectin in cell attachment. Biomaterials 1991 Aug:12(6):531-9.
35. Y. Marois, M.F. Sigot-Luizard and R. Guidoin, Endothelial cell behavior on vascular prosthetic grafts: effect of polymer chemistry, surface structure, and surface treatment. Asaio, J. 45 4 (1999), pp. 272280.
36. G.W. Bos, N.M. Scharenborg, A.A. Poot, G.H. Engbers, J.G. Terlingen, T. Beugeling, W.G. Van Aken and J. Feijen, Adherence and proliferation of endothelial cells on surface-immobilized albumin-heparin conjugate. Tissue Eng. 43 (1998), pp. 267-279.
37. G.W. Bos, N.M. Scharenborg, A.A. Poot, G.H. Engbers, T. Beugeling, W.G. van Aken and J. Feijen, Proliferation of endothelial cells on surface-immobilized albumin-heparin conjugate loaded with basic fibroblast groth factor. J. Biomed. Mater. Res. 44 3 (1999), pp. 330-340.
38. H.M. Carr, R. Vohra, H. Sharma, J.V. Smyth, O.B. Rooney, P.D. Dodd and M.G. Walker, Endothelial cell seeding kinetics under chronic flow in prosthetic grafts. Ann, Vase. Surg. 10 5 (1996), pp. 469475.
39. R. Vohra, G.J. Thomson, H.M. Carr, H. Sharma and M.G. Walker, Comparison of different vascular prostheses and matrices in relation to endothelial seeding. Br. J. Surg. 78 4 (1991), pp. 417-420.
40. G.B. Koveker, L.M. Graham, W.E. Bürkei, R. Sell, T.W. Wakefield, K. Dietrich and J.C. Stanley, Extracellular matrix preparation of expanded polytetrafluoroethylene grafts seeded with endothelial cells: influence on early platelet deposition, cellular growth, and luminal prostacyclin release. Surgery 109 3 Part 1 (1991), pp. 313-319.
41. J.E. Hasson, D.H. Wiebe, J.B. Sharefkin, P.A. D'Amore and W.M. Abbott, Use of tritiated thymidine as a marker to compare the effects of matrix proteins on adult human vascular endothelial cell attachment: implications for seeding of vascular prostheses. Surgery 100 5 (1986), pp. 884-892.
42. R.B. Patterson, J.D. Keller, E.B. Silberstein and R.F. Kempczinski, A comparison between fibronectin and Matrigel pretreated ePTFE vascular grafts. Ann Vase. Surg. 3 2 (1989), pp. 160-166.
43. H.M. Carr, R. Vohra, M. Welch, O.B. Rooney, H. Sharma and M.G. Walker, Fibronectin binding to gelatin-impregnated Dacron (Gelseal) prostheses. Artif. Organs 16 4 (1992), pp. 342-345.
44. A. Sank, K. Rostami F. Weaver, D. Ertl, A. Yellin, M. Nimni and T.L. Tuan, New evidence and new hope concerning endothelial seeding of vascular grafts. .Am. J. Surg. 164 3 (1992), pp. 199-204.
45. G.J. Thomson, R.K. Vohra, M.H. Carr and M.G. Walker, Adult human endothelial cell seeding using expanded polytetrafluoroethylene vascular grafts: a comparison of four substrates. Surgery 109 1 (1991), pp. 20-27.
46. Braddock M, Schwachtgen JL, Houston P, Dickson MC, Lee M.J. Campbell CJ. Fluid Shear Stress Modulation of Gene Expression in endothelial Cells. News Physiol Sci. 1998 Oct;13:241-246.
47. Morimoto M, Kume N, Miyamoto S, Ueno Y, Kataoka H, Minami M, Hayashida K, Hashimoto N, Kita T. Lysophosphatidylcholine induces early growth response factor-1 expression and activates the core promoter of pdgf-a chain in vascular endothelial cells. Arterioscler Thromb Vase. Biol. 2001 May;21 (5):771-6.
48. Ogasawara A, Arakawa T, Kaneda T, Takuma T, Sato T, Kaneko H, Kumegawa M, Hakeda Y. Fluid Shear Stress-induced cyclooxygenase-2 Expression Is Mediated by C/EBP beta, cAMPresponse element-binding Protein, and AP-1 in Osteoblastic MC3T3-E1 Cells. J Biol Chern. 2001 Mar. 9;276(10):7048-54.
49. Lin K, Hsu PP, Chen BP, Yuan S, Usami S, Shyy JY, Li YS, Chien S. Free in PMC. Molecular mechanism of endothelial growth arrest by laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Aug 15;97(17):9385-9.
50. Houston P, White BP, Campbell CJ, Braddock M. Delivery and a expression of fluid shear stress-inducible promoters to the vessel wall: applications for cardiovascular gene therapy. Hum Gene Ther. 1999 Dec 10:10(18):3031-44.
51. Nakamura T. et al., J Biol Chern. 1999, 274:22476.
52. Shattil, SJ., and Ginsberg, MH. J. Clin. Invest. 1997, 100:S91.
53. Hynes, RO., Cell 1992, 69:11.
54. Doolittle RF. et al., Nature 1984, 307:558.
55. Selander-Sunnerhagen, M. et al.,J. Biol. Chern.
1992,267:19642.
56. Apella E. et al. FEBS Lett 1988 231:1.
57. Kowal RC. et al., Circ Res. 1999, 84:1166.
Claims (64)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy egy szintetikus cső alakú elemből áll, melynek luminális felszínét számos endoteliális sejttel és/vagy simaizom sejttel burkoltuk, melyeket genetikailag úgy transzformáltunk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 2. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek sokaságának első részét genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy említett sejt proliferációs növekedési faktort expresszáljon, valamint ahol az említett endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek említett sokaságának második részét úgy transzformáltuk, hogy legalább egy említett celluláris tapadási faktort expresszáljon.
- 3. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett luminális felszín politetrafluoretilén (PTFE), expandált politetrafluoretilén (ePTFE), poliészter rostokból, Dacron™, és feldolgozott állati véredényből készül.
- 4. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett szintetikus tubuláris elem lényegében a véredény belső keresztmetszeti területével megegyező belső keresztmetszeti területet jelent.
- 5. A 4. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett szintetikus tubuláris elem belső keresztmetszeti területe körülbelül 7 — 700 mm2 között van.
- 6. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az endoteliális sejtek említett sokasága véna szegmensből, csontvelő őssejtekből, perifériás vér őssejtekből és keringő endoteliális sejtekből származik.
- 7. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek említett sokasága a mesterséges ér transzplantátumot kapó személyből származik.
- 8. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek említett sokasága humán vagy állati donorból származik.
- 9. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az endoteliális sejtek említett sokasága az említett belső luminális felszínen összefüggő monoréteget képez.
- 10. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy sejt proliferációs növekedési faktor VEGF-et, savas vagy bázisos FGF-et vagy HGF-et jelent.
- 11. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy celluláris tapadási faktor UP50et, DANCE-t, vitronectint, albumint, l-es kollagént, IV-es kollagént, fibronectint vagy Laminint jelent.
- 12. Az 1. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek említett sokaságát úgy transzformáltuk genetikailag, hogy a továbbiakban legalább egy marker polipeptidet is expresszáljanak.
- 13. Transzformált endoteliális sejt vagy simaizom sejt azzal jellemezve, hogy a sejteket úgy transzformáltuk genetikailag, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 14. A 13. igénypont szerinti transzformált endoteliális sejt vagy simaizom sejt azzal jellemezve, hogy ezeket a sejteket genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy marker polipeptidet is expresszáljanak.
- 15. A 13. igénypont szerinti transzformált endoteliális sejt vagy simaizom sejt azzal jellemezve, hogy az említett endoteliális sejt egy véna szegmensből, csontvelő őssejtekből, perifériás vér őssejtekből vagy keringő endoteliális sejtekből származik.
- 16. A 13. igénypont szerinti transzformált endoteliális sejt vagy simaizom sejt azzal jellemezve, hogy az említett endoteliális sejt vagy simaizom sejt humán vagy állati donorból származik.
- 17. A 13. igénypont szerinti transzformált endoteliális sejt vagy simaizom sejt azzal jellemezve, hogy az említett sejt proliferációs növekedési faktor VEGF-et, savas vagy bázisos FGF-et vagy HGF-et jelent.
- 18. A 13. igénypont szerinti transzformált endoteliális sejt vagy simaizom sejt azzal jellemezve, hogy az említett celluláris tapadási faktorUP50-et, DANCE-t, vitronectint, albumint, l-es kollagént, IV-es kollagént, fibronectint vagy Laminint jelent.
- 19. Mesterséges ér transzplantátum előállítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az alábbi lépésekből áll:(a) az endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket genetikailag transzformáljuk oly módon, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktrot expresszáljanak; és (b) az említett endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elemen szaporítjuk, míg az említett luminális felszínen elegendő endoteliális sejt és/vagy simaizom sejt borítást kapunk.
- 20. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az (a) lépést úgy végezzük el, hogy az említett endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek első részét oly módon transzformáljuk genetikailag, hogy legalább egy említett sejt proliferációs növekedési faktort expresszáljanak, és oly módon transzformáljuk genetikailag az említett endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek második részét, hogy legalább egy említett celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 21. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett (a) lépés az említett (b) lépést megelőzi.
- 22. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett (b) lépés az említett (a) lépést megelőzi.
- 23. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett endoteliális sejtek egy véna szegmensből, csontvelő őssejtekből, perifériás vér őssejtekből vagy keringő endoteliális sejtekből származnak.
- 24. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett mesterséges ér transzplantátum luminális felszínét áramlási erők hatásának tesszük ki.
- 25. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett mesterséges ér transzplantátumot bypass sebészeti beavatkozásban használjuk.
- 26. Nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy magába foglal:(a) egy sejt proliferációs növekedési faktort kódoló első polinukleotid szegmenst; és (b) egy celluláris tapadási faktort kódoló második polinukleotid szegmenst.
- 27. A 26. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy tartalmaz még legalább egy promoter szekvenciát is az említett első és az említett második polinukleotid szegmensek legalább egyike expressziójának irányításához.
- 28. A 27. igénypont szerinti nukleinsav szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett első polinukleotid szegmenst transzkripcióval az említett második polinukleotid szegmenshez kapcsoljuk, ahol az említett első és második polinukleotid szegmens az említett legalább egy promoter szekvencia egyetlen promoter szekvenciájának transzkripciós szabályozása alatt áll.81 ” -
- 29. A 28. igénypont szerinti nukleinsav szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett első és az említett második polinukleotid szegmensek közé helyezve még egy kötő szekvenciát is tartalmaz.
- 30. A 29. igénypont szerinti nukleinsav szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett kötő szekvencia IRES-t vagy egy proteáz hasítási felismerő helyet tartalmaz.
- 31. A 26. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy promoter eukarióta sejtekben funkcióképességgel rendelkezik.
- 32. A 26. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy promoter egy konstitutív promótert, egy indukálható promótert vagy egy szövet specifikus promótert jelent.
- 33. A 26. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy az alábbiakat tartalmazza:(a) egy első promoter szekvenciát, mely az említett első polinukleotid szegmens irányítására szolgál; és (b) egy második promoter szekvenciát, mely az említett második polinukleotid szegmens expressziójának irányítására szolgál.
- 34. A 33. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett első promoter és az említett második promoter egy konstitutív promótert, egy indukálható promótert vagy egy szövet specifikus promótert jelent.
- 35. A 34. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett indukálható promótert ugyanaz az effektor molekula szabályozhatja.
- 36. A 26. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy legalább egy további polinukleotid szegmenst tartalmaz, mely egy marker polipeptidet kódol.
- 37. A 36. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett marker polipeptid egy szelekciós polipeptidet, vagy egy riporter polipeptidet jelent.
- 38. A 36. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy további polinukleotid szegmens az említett első és említett második polinukleotid szegmens egyikéhez transzkripciósán kötődik.
- 39. A 36. igénypont szerinti nukleinsav szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy további polinukleotid szegmens az említett első és említett második polinukleotid szegmens egyikéhez a kötő szegmensen keresztül transzkripciósán kötődik.
- 40. A 39. igénypont szerinti nukleinsav szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett kötő szegmens szekvencia IRES-t vagy egy proteáz hasítási felismerő helyet tartalmaz.
- 41. A 36. igénypont szerinti nukleinsav szerkezet azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy további polinukleotid szegmens az említett első és az említett második polinukleotid szegmens legalább egyikéhez transzlációsán fúzionálódik.
- 42. Egy nukleinsav expressziós szerkezet rendszer azzal jellemezve, hogy (a) egy első nukleinsav expressziós szerkezetet tartalmaz, mely magába foglal egy első polinukleotid szegmenst, mely egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol; és (b) egy második nukleinsav expressziós szerkezetet, mely magába foglal egy második polinukleotid szegmenst, mely a celluláris tapadási faktort kódolja.
- 43. A 42. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet rendszer azzal jellemezve, hogy az említett első és említett második nukleinsav expressziós szerkezetek egyike még tartalmaz legalább egy további polinukleotid szegmenst, mely egy marker polipeptidet kódol.
- 44. A 42. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet rendszer azzal jellemezve, hogy tartalmaz még legalább egy promoter szekvenciát, mely az említett első és említett második polinukleotid szegmens legalább egyikének az expresszióját irányítja.
- 45. A 42. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet rendszer azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy promoter szekvencia eukarióta sejtekben funkcióképes.
- 46. A 42. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet rendszer azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy promoter szekvencia egy konstitutív promótert, egy indukálható promótert vagy egy szövet specifikus promótert tartalmaz.
- 47. A 43. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet rendszer azzal jellemezve, hogy az említett marker polipeptid egy szelekciós polipeptidet vagy egy riporter polipeptidet jelent.
- 48. A 43. igénypont szerinti nukleinsav expressziós szerkezet rendszer azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy további polinukleotid szegmens az említett első és említett második polinukleotid szegmens legalább egyikéhez transzkripciósán kötődik.
- 49. Kit azzal jellemezve, hogy legalább egy csövet tartalmazó állványt foglal magába, az említett legalább egy cső egy nukleinsav expressziós szerkezet rendszert foglal magába, az említett nukleinsav expressziós szerkezet rendszer az alábbiakból áll:(a) egy első nukleinsav expressziós szerkezetből, mely egy első polinukleotidot tartalmaz, mely egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol; és (b) egy második nukleinsav expressziós szerkezetből, mely egy második polinukleotidot tartalmaz, mely a celluláris tapadási faktort kódolja.
- 50. Kit azzal jellemezve, hogy legalább egy csövet tartalmazó állványt foglal magába, az említett legalább egy cső egy nukleinsav expressziós szerkezet rendszert foglal magába, az említett nukleinsav expressziós szerkezet az alábbiakból áll:(a) egy első polinukleotidból, mely egy sejt proliferációs növekedési faktort kódol; és (b) egy második polinukleotidból, mely a celluláris tapadási faktort kódolja.
- 51. Genetikailag transzformált endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek létrehozására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy (a) az endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket egy emlős szövet forrásból nyerjük ki; és (b) az említett endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket úgy transzformáljuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 52. Egy személy érrendszere legalább egy részének bypass eljáráshoz vagy helyettesítéséhez való módszer azzal jellemezve, hogy a módszer során az egyén érrendszerébe egy mesterséges ér transzplantátumot ültetünk be oly módon, hogy folyadék kommunikáció jöjjön létre az érrendszer és az említett mesterséges ér transzplantátum között, mely egy olyan szintetikus cső alakú elemet foglal magába, mely endoteliális sejtek és/vagy a simaizom sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel rendelkezik; a sejteket genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 53. Az 52. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek említett sokaságának első részét úgy transzformáljuk genetikailag, hogy legalább egy említett sejt proliferációs növekedési faktort expresszáljanak, valamint az említett endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek említett sokaságának második részét úgy transzformáljuk genetikailag, hogy legalább egy említett celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 54. Az 52. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett szintetikus tubuláris elem egy belső86 ’* *· ·' keresztmetszeti területet tartalmaz, mely lényegében egy véredény belső keresztmetszeti területének felel meg.
- 55. Az 54. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett szintetikus tubuláris elem belső keresztmetszeti területe körülbelül 7 - 700 mm2 között van.
- 56. Egy mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy egy szintetikus tubuláris elemet tartalmaz, mely endoteliális sejtekkel és simaizom sejtekkel burkolt luminális felszínnel rendelkezik, az említett endoteliális sejtek és simaizom sejtek legalább egyikét úgy transzformáltuk genetikailag, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 57. Mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy egy szintetikus tubuláris elemet tartalmaz, mely olyan endoteliális sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel rendelkezik, mely sejteket úgy transzformáltunk genetikailag, hogy UP50-et és VEGF-et expresszáljanak.
- 58. Mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy egy szintetikus tubuláris elemet tartalmaz, mely olyan simaizom sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel rendelkezik, mely sejteket úgy transzformáltunk genetikailag, hogy UP50-et és VEGF-et expresszáljanak.
- 59. Mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy egy szintetikus tubuláris elemet tartalmaz, mely olyan endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel87 - rendelkezik, mely sejteket úgy transzformáltunk genetikailag, hogy UP50et és egy sejt proliferációs növekedési faktort expresszáljanak, mely savas vagy bázikus FGF vagy HGF lehet.
- 60. Mesterséges ér transzplantátum előállítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy a következőkből áll:(a) genetikailag transzformálunk endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket, hogy UP50-et és VEGF-et expresszáljanak; és (b) az említett endoteliális sejteket és/vagy simaizom sejteket egy luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elem belsejében szaporítjuk, míg az említett luminális felszínt az említett endoteliális sejtek és/vagy simaizom sejtek megfelelő mértékben beburkolják.
- 61. Mesterséges ér transzplantátum előállítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy a következőkből áll:(a) endoteliális sejteket és simaizom sejteket biztosítunk, az említett endoteliális sejtek és simaizom sejtek legalább egyikét genetikailag úgy transzformáljuk, hogy UP50-et és VEGF-et expresszáljanak; és (b) ezt követően, vagy ezzel egy időben az említett endoteliális sejteket és simaizom sejteket egy luminális felszínnel rendelkező szintetikus tubuláris elem belsejében szaporítjuk, míg az említett luminális felszínt az említett endoteliális sejtek és simaizom sejtek megfelelő mértékben beburkolják.
- 62. Mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy szintetikus tubuláris elemet, mely endoteliális sejtek sokaságával burkolt luminális felszínnel és simaizom sejtek sokaságával burkolt külső felszínnel rendelkezik.····
- 63. A 62. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett endoteliális sejtek sokaságát genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy sejt proliferációs növekedési faktort és legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.
- 64. A 62. igénypont szerinti mesterséges ér transzplantátum azzal jellemezve, hogy az említett simaizom sejtek sokaságát genetikailag úgy transzformáltuk, hogy legalább egy celluláris tapadási faktort expresszáljanak.A meghatalmazottSzentpéteri ZsoliX. szabadalmi ügyvivő =z S.B.to &K. Szahadal^ Ügyfiv^i Iroda \J 1 J vafcja _ ____________uv/13Melon: 4SM000 Fax: 46ΕΪ099 '
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62022700A | 2000-07-20 | 2000-07-20 | |
| PCT/IL2001/000670 WO2002007646A2 (en) | 2000-07-20 | 2001-07-20 | Artificial vascular grafts, and methods of producing and using same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0300810A2 true HUP0300810A2 (hu) | 2003-08-28 |
Family
ID=24485086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0300810A HUP0300810A2 (hu) | 2000-07-20 | 2000-07-20 | Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7364725B1 (hu) |
| EP (1) | EP1301146B1 (hu) |
| JP (1) | JP5067822B2 (hu) |
| AT (1) | ATE469615T1 (hu) |
| AU (1) | AU2001278664A1 (hu) |
| CA (1) | CA2416548A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ2003253A3 (hu) |
| DE (1) | DE60142290D1 (hu) |
| HU (1) | HUP0300810A2 (hu) |
| IL (1) | IL153946A0 (hu) |
| PL (1) | PL362561A1 (hu) |
| WO (1) | WO2002007646A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA200300635B (hu) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6485723B1 (en) | 1995-02-10 | 2002-11-26 | Purdue Research Foundation | Enhanced submucosal tissue graft constructs |
| JP5859179B2 (ja) * | 2000-03-15 | 2016-02-10 | オーバスネイチ メディカル、インコーポレイテッド | 内皮細胞接着を促進するコーティング |
| US7175658B1 (en) | 2000-07-20 | 2007-02-13 | Multi-Gene Vascular Systems Ltd. | Artificial vascular grafts, their construction and use |
| HUP0300810A2 (hu) | 2000-07-20 | 2003-08-28 | M.G.V.S. Ltd. | Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása |
| CA2476917A1 (en) * | 2002-02-19 | 2003-08-28 | Bioarttis, Inc. | Artificial vessel scaffold and artificial organs therefrom |
| EP2103684A1 (en) | 2002-05-02 | 2009-09-23 | Purdue Research Foundation | Vascularisation enhanced graft constructs |
| CA2483683C (en) | 2002-05-02 | 2013-07-02 | Purdue Research Foundation | Vascularization enhanced graft constructs |
| AU2003231209B2 (en) * | 2002-05-02 | 2009-08-06 | Cook Biotech Incorporated | Cell-seeded extracellular matrix grafts |
| JP2005533535A (ja) * | 2002-05-02 | 2005-11-10 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | 血管新生が促進された移植片構成物 |
| EP2946666B1 (en) | 2004-04-30 | 2017-11-15 | OrbusNeich Medical, Inc. | Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods of using same |
| WO2006017275A1 (en) | 2004-07-13 | 2006-02-16 | The University Of Tennessee Research Foundation | Adhesive composition for carrying therapeutic agents as delivery vehicle on coatings applied to vascular grafts |
| WO2007088418A1 (en) * | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Multi Gene Vascular Systems, Inc. | Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use |
| JP5839814B2 (ja) * | 2010-03-17 | 2016-01-06 | グンゼ株式会社 | Ｄａｎｃｅタンパク質含有徐放基材及び該徐放基材の製造方法 |
| CN105311677B (zh) | 2010-05-25 | 2019-08-20 | 库克生物技术股份有限公司 | 用于医疗移植物的细胞接种的方法、基底和系统 |
| US9663564B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-30 | The Regents Of The University Of California | Vectors and methods to treat ischemia |
| US20140065110A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | The Regents Of The University Of California | Genetically modified msc and therapeutic methods |
| WO2014070792A1 (en) | 2012-10-29 | 2014-05-08 | Ariste Medical, Inc. | Polymer coating compositions and coated products |
| US9878071B2 (en) | 2013-10-16 | 2018-01-30 | Purdue Research Foundation | Collagen compositions and methods of use |
| GB2537770B (en) | 2014-04-22 | 2017-09-13 | Ariste Medical Llc | Methods and processes for application of drug delivery polymeric coatings |
| JP2017529390A (ja) | 2014-08-27 | 2017-10-05 | パデュー リサーチ ファウンデーション オフィス オブ テクノロジー コマーシャリゼーション | コラーゲンに基づく治療送達系 |
| WO2016092542A1 (en) * | 2014-12-07 | 2016-06-16 | M.G.V.S. Ltd. | Use of fibulin-5 for the treatment of keloid scars |
| WO2016140716A1 (en) | 2015-03-02 | 2016-09-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Injectable microtissue systems, devices, and methods |
| US11919941B2 (en) | 2015-04-21 | 2024-03-05 | Purdue Research Foundation | Cell-collagen-silica composites and methods of making and using the same |
| PT3325444T (pt) | 2015-07-20 | 2021-09-22 | Acadia Pharm Inc | Métodos para preparar n-(4-fluorobenzil)-n-(1-metilpiperidina-4-il)-n'-(4-(2-metilpropiloxi)fenilmetil)carbamida e o seu sal de tartarato e forma polimórfica c |
| CN106075585B (zh) * | 2016-07-08 | 2019-06-21 | 福建师范大学 | 一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法 |
| CN110229779A (zh) * | 2016-09-14 | 2019-09-13 | 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 | 人工组织前体及制备其的方法 |
| US11439731B2 (en) | 2016-09-14 | 2022-09-13 | Revotek Co., Ltd. | Artificial tissue progenitor and method for preparing the same |
| JP7242553B2 (ja) | 2017-01-31 | 2023-03-20 | ジェニフィス，インコーポレイテッド | 基質の調製のための方法及び組成物 |
| US11739291B2 (en) | 2017-04-25 | 2023-08-29 | Purdue Research Foundation | 3-dimensional (3D) tissue-engineered muscle for tissue restoration |
| WO2020023957A1 (en) * | 2018-07-27 | 2020-01-30 | Washington University | Cell-embedded vascular graft for transplantation |
| CA3168904A1 (en) | 2020-01-27 | 2021-08-05 | Geniphys, Inc. | Biologic filler for restoring and regenerating tissue |
| CN114457003A (zh) * | 2020-11-10 | 2022-05-10 | 维思尔治疗有限公司 | 预调节血管细胞用于转导的方法、转导方法和保存转导的细胞的方法 |
Family Cites Families (80)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
| US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
| US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
| NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
| US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
| US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
| US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
| US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
| US4879219A (en) | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
| US5011771A (en) | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| US4736866A (en) | 1984-06-22 | 1988-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic non-human mammals |
| US4666828A (en) | 1984-08-15 | 1987-05-19 | The General Hospital Corporation | Test for Huntington's disease |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4801531A (en) | 1985-04-17 | 1989-01-31 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis |
| ES2004281A6 (es) | 1986-04-04 | 1988-12-16 | Univ Jefferson | Una superficie protesica implantable para implantacion en un paciente humano |
| EP0289121B1 (en) | 1987-05-01 | 1995-12-27 | Stratagene | Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences |
| US5175385A (en) | 1987-09-03 | 1992-12-29 | Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center | Virus-resistant transgenic mice |
| US6001350A (en) | 1987-12-11 | 1999-12-14 | Somatix Therapy Corp | Genetic modification of endothelial cells |
| US5674722A (en) * | 1987-12-11 | 1997-10-07 | Somatix Therapy Corporation | Genetic modification of endothelial cells |
| US5221778A (en) | 1988-08-24 | 1993-06-22 | Yale University | Multiplex gene regulation |
| US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
| US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
| US5175383A (en) | 1989-02-17 | 1992-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Animal model for benign prostatic disease |
| US5272263A (en) * | 1989-04-28 | 1993-12-21 | Biogen, Inc. | DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS) |
| US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
| US5192659A (en) | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
| ATE260974T1 (de) | 1990-06-15 | 2004-03-15 | Scios Inc | Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt |
| US5498238A (en) | 1990-06-15 | 1996-03-12 | Cortrak Medical, Inc. | Simultaneous angioplasty and phoretic drug delivery |
| US5288846A (en) | 1990-10-19 | 1994-02-22 | The General Hospital Corporation | Cell specific gene regulators |
| WO1992011895A1 (en) | 1990-12-28 | 1992-07-23 | Boston Scientific Corporation | Balloon drug delivery system |
| US5925564A (en) | 1991-11-06 | 1999-07-20 | Baylor College Of Medicine | Expression vector systems and method of use |
| US5298422A (en) | 1991-11-06 | 1994-03-29 | Baylor College Of Medicine | Myogenic vector systems |
| ES2204899T3 (es) | 1992-01-07 | 2004-05-01 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Modelos de animales transgenicos para la enfermedad de alzheimer. |
| US5360735A (en) | 1992-01-08 | 1994-11-01 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells |
| US5599352A (en) | 1992-03-19 | 1997-02-04 | Medtronic, Inc. | Method of making a drug eluting stent |
| US5281521A (en) | 1992-07-20 | 1994-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified avidin-biotin technique |
| WO1994006908A1 (en) | 1992-09-11 | 1994-03-31 | The Regents Of The University Of California | Transgenic non-human animals having targeted lymphocyte transduction genes |
| US5634901A (en) | 1992-11-02 | 1997-06-03 | Localmed, Inc. | Method of using a catheter sleeve |
| WO1994023049A2 (en) | 1993-04-02 | 1994-10-13 | The Johns Hopkins University | The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals |
| US6664107B1 (en) | 1993-05-26 | 2003-12-16 | Ontario Cancer Institute, University Health Network | CD45 disrupted nucleic acid |
| ES2255477T5 (es) | 1993-07-29 | 2010-04-08 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Uso de paclitaxel y sus derivados en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de reestenosis. |
| WO1995007360A1 (en) * | 1993-09-10 | 1995-03-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Endothelial cell tropic compositions and methods of making and using the same |
| WO1995025547A1 (en) * | 1994-03-24 | 1995-09-28 | University Of Washington | Devices and methods for implanting transduced cells |
| US5700346A (en) * | 1994-07-19 | 1997-12-23 | Edwards; Peter S. | Automated slide staining system |
| US6425881B1 (en) | 1994-10-05 | 2002-07-30 | Nitrosystems, Inc. | Therapeutic mixture useful in inhibiting lesion formation after vascular injury |
| ATE434423T1 (de) | 1994-10-17 | 2009-07-15 | Igaki Iryo Sekkei Kk | Medikamentenfreisetzender stent |
| US20020026037A1 (en) * | 1995-06-06 | 2002-02-28 | Jing-Shan Hu | Vascular endothelial growth factor 3 antibodies |
| JP2000502682A (ja) | 1995-12-22 | 2000-03-07 | ローカルメッド インコーポレイテッド | 血管新生を促進する成長因子の局所的血管内デリバリー |
| US5785965A (en) * | 1996-05-15 | 1998-07-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Univ. | VEGF gene transfer into endothelial cells for vascular prosthesis |
| JP2001501471A (ja) * | 1996-09-24 | 2001-02-06 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 血管新生の阻害のための遺伝子治療 |
| EP2008664B1 (en) * | 1997-04-10 | 2012-08-29 | University Of Southern California | Modified proteins which bind extracellular matrix components |
| WO1998056312A1 (en) | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Scimed Life Systems, Inc. | Stents having multiple layers of biodegradable polymeric composition |
| US5872234A (en) | 1997-06-27 | 1999-02-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human extracellular matrix proteins |
| US5899935A (en) | 1997-08-04 | 1999-05-04 | Schneider (Usa) Inc. | Balloon expandable braided stent with restraint |
| US6077987A (en) | 1997-09-04 | 2000-06-20 | North Shore-Long Island Jewish Research Institute | Genetic engineering of cells to enhance healing and tissue regeneration |
| JP2002502608A (ja) * | 1998-02-06 | 2002-01-29 | コラテラル・セラピューティックス・インコーポレイテッド | 血管新生促進因子である血管内皮細胞成長因子：ｖｅｇｆの変異体 |
| US6364856B1 (en) | 1998-04-14 | 2002-04-02 | Boston Scientific Corporation | Medical device with sponge coating for controlled drug release |
| EP1090992A4 (en) | 1998-04-28 | 2004-05-19 | Ono Pharmaceutical Co | NEW POLYPEPTIDE, DNA CODING IT, AND ITS USE |
| US6010573A (en) * | 1998-07-01 | 2000-01-04 | Virginia Commonwealth University | Apparatus and method for endothelial cell seeding/transfection of intravascular stents |
| EP1568375A1 (en) | 1998-10-26 | 2005-08-31 | Ludwig Institute For Cancer Research | Use of VEGF-C or VEGF-D gene or protein to prevent restenosis |
| US6328762B1 (en) * | 1999-04-27 | 2001-12-11 | Sulzer Biologics, Inc. | Prosthetic grafts |
| US6554857B1 (en) | 1999-07-20 | 2003-04-29 | Medtronic, Inc | Transmural concentric multilayer ingrowth matrix within well-defined porosity |
| US6589534B1 (en) * | 1999-09-30 | 2003-07-08 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Hepatitis B virus binding proteins and uses thereof |
| US6716242B1 (en) | 1999-10-13 | 2004-04-06 | Peter A. Altman | Pulmonary vein stent and method for use |
| US20030229393A1 (en) | 2001-03-15 | 2003-12-11 | Kutryk Michael J. B. | Medical device with coating that promotes cell adherence and differentiation |
| HUP0300810A2 (hu) * | 2000-07-20 | 2003-08-28 | M.G.V.S. Ltd. | Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása |
| US7175658B1 (en) * | 2000-07-20 | 2007-02-13 | Multi-Gene Vascular Systems Ltd. | Artificial vascular grafts, their construction and use |
| US6939376B2 (en) | 2001-11-05 | 2005-09-06 | Sun Biomedical, Ltd. | Drug-delivery endovascular stent and method for treating restenosis |
| US20060079439A1 (en) | 2002-03-27 | 2006-04-13 | University Of Utah Research Foundation | Elastin prevents occlusion of body vessels by vascular smooth muscle cells |
| US20040126788A1 (en) | 2002-08-13 | 2004-07-01 | Schiemann William P. | Fibulin-5 and uses thereof |
| US6918929B2 (en) | 2003-01-24 | 2005-07-19 | Medtronic Vascular, Inc. | Drug-polymer coated stent with pegylated styrenic block copolymers |
| KR100856360B1 (ko) | 2004-03-29 | 2008-09-04 | 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 | 절단형 ｄａｎｃｅ, ｄａｎｃｅ 복합체, 및 이들을사용하는 방법 |
| WO2005099695A1 (en) | 2004-04-19 | 2005-10-27 | Novartis Ag | Drug delivery systems for the prevention and treatment of vascular diseases |
| WO2006082763A1 (ja) | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Kyoto University | Ｄａｎｃｅまたはその発現を増強する因子による弾性線維再生の方法 |
| WO2007088418A1 (en) | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Multi Gene Vascular Systems, Inc. | Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use |
-
2000
- 2000-07-20 HU HU0300810A patent/HUP0300810A2/hu unknown
-
2001
- 2001-07-20 WO PCT/IL2001/000670 patent/WO2002007646A2/en not_active Ceased
- 2001-07-20 CA CA002416548A patent/CA2416548A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-20 DE DE60142290T patent/DE60142290D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-20 CZ CZ2003253A patent/CZ2003253A3/cs unknown
- 2001-07-20 PL PL01362561A patent/PL362561A1/xx unknown
- 2001-07-20 EP EP01956749A patent/EP1301146B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-20 JP JP2002513384A patent/JP5067822B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-20 AU AU2001278664A patent/AU2001278664A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-20 AT AT01956749T patent/ATE469615T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-07-20 IL IL15394601A patent/IL153946A0/xx unknown
-
2002
- 2002-06-04 US US10/163,387 patent/US7364725B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-01-23 ZA ZA200300635A patent/ZA200300635B/en unknown
-
2006
- 2006-01-31 US US11/344,870 patent/US7563278B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-03-13 US US12/075,657 patent/US8022195B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-06-02 US US12/455,521 patent/US8088160B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2416548A1 (en) | 2002-01-31 |
| JP2004506418A (ja) | 2004-03-04 |
| IL153946A0 (en) | 2003-07-31 |
| US20080269472A1 (en) | 2008-10-30 |
| WO2002007646A3 (en) | 2002-06-13 |
| US7364725B1 (en) | 2008-04-29 |
| PL362561A1 (en) | 2004-11-02 |
| US8022195B2 (en) | 2011-09-20 |
| ZA200300635B (en) | 2004-04-22 |
| JP5067822B2 (ja) | 2012-11-07 |
| US20090263452A1 (en) | 2009-10-22 |
| CZ2003253A3 (cs) | 2003-05-14 |
| EP1301146B1 (en) | 2010-06-02 |
| DE60142290D1 (de) | 2010-07-15 |
| EP1301146A2 (en) | 2003-04-16 |
| US7563278B2 (en) | 2009-07-21 |
| WO2002007646A2 (en) | 2002-01-31 |
| US20060275338A1 (en) | 2006-12-07 |
| ATE469615T1 (de) | 2010-06-15 |
| EP1301146A4 (en) | 2008-11-19 |
| AU2001278664A1 (en) | 2002-02-05 |
| US8088160B2 (en) | 2012-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1301146B1 (en) | Artificial vascular grafts and methods of producing and using same | |
| US5785965A (en) | VEGF gene transfer into endothelial cells for vascular prosthesis | |
| US7147846B2 (en) | Prosthetic grafts | |
| US7175658B1 (en) | Artificial vascular grafts, their construction and use | |
| US20050053587A1 (en) | Cultured stromal cells and uses thereof | |
| EP1307582B1 (en) | Nucleic acid constructs, vascular cells transformed therewith, pharmaceutical compositions and methods utilizing same for inducing angiogenesis | |
| WO2007088418A9 (en) | Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use | |
| JP4736088B2 (ja) | Ｃｄ９遺伝子からなる心疾患を予防又は治療する医薬 | |
| WO2000063369A2 (en) | Gene therapy | |
| JP2005052001A (ja) | 遺伝子治療剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FD9A | Lapse of provisional protection due to non-payment of fees |