CN103037891A - 治疗糖尿病的方法和能够治疗糖尿病的组合物 - Google Patents

Abstract

公开了一种物质组合物，其包含分离的人胰岛淀粉样多肽（IAPP）的寡聚体。也公开了识别其的抗体。还公开了所述物质组合物及所述抗体的用途。

Description

治疗糖尿病的方法和能够治疗糖尿病的组合物

技术领域

在一些实施方式中，本发明涉及用于诊断和治疗糖尿病的组合物和方法。

背景技术

可溶性肽和蛋白质转化为高度有序的淀粉样蛋白结构与包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病、朊病毒和II型糖尿病（T2D）的主要人类疾病有关。以前淀粉样原纤维被认为是促进在淀粉样蛋白相关的疾病中观察到的组织退化的主要病理基础，存在增加的证据实体表明早期可溶性寡聚体聚集在细胞毒性和细胞死亡过程中的关键作用。AD伴随的β淀粉样多肽（Aβ）聚集的全面尸体解剖研究表明在老年人口中淀粉样蛋白斑负荷和认知功能之间的相关性不足。这导致再检查关于原纤维在淀粉样蛋白相关的疾病中作为主要毒性种类的淀粉样蛋白假说。由于这个早期工作，许多研究提供了Aβ寡聚体事实上比成熟的原纤维显著地更具有细胞毒性的证据。而且纯化的可溶性寡聚体向正常啮齿类的大脑中的颅内再引入导致严重的记忆缺陷。革命性的工作已经表明可以在体外产生可溶性毒性寡聚体形式的Aβ 1-42[Lambert,M.P.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.95,6448-6453,(1998);Barghorn,S.等人J.Neurochem.95,834-847,(2005)。Braghorn等人也说明了尽管这些聚集体在体外在相对严格的条件下形成，在体内、在AD患者的大脑内和在淀粉样蛋白前体蛋白转基因小鼠内也观察到了类似的表位[J.Neurochem.95,834-847,(2005)]。这些表位当前被用于AD免疫性治疗的开发。

另外，与任何已知疾病不相关的一些蛋白能在体外形成类寡聚体结构[Caughey,B.&Lansbury,P.T.Annu.Rev.Neurosci.26,267-298,(2003)]。这些新形成的结构表现出与淀粉样蛋白寡聚体类似毒性的观察表明与淀粉样蛋白形成不相关的毒性的更广阔的机制。无论序列如何，淀粉样蛋白寡聚体特定地增加脂双层的电导率，而原纤维和可溶性低分子量种类对膜具有不可见的效果[Bucciantini,M.等人J. Biol.Chem.279,31374-31382,(2004)]。

胰岛淀粉样多肽（IAPP）是在分泌颗粒中通过胰腺的β细胞与胰岛素一起包装并分泌的37个氨基酸的肽激素。在正常情况下IAPP被释放到血液循环并通过肾脏系统排泄。IAPP是内分泌系统的一部分并促进血糖控制。这种肽在物种之间是高度保守的，这意味着功能性意义。2型糖尿病（T2D）的特征在于来自胰岛郎格尔汉斯细胞的胰岛素分泌破坏和周围组织的胰岛素敏感度降低。100多年前就已经对糖尿病受试者的胰岛内的淀粉样蛋白沉积物做出了最先描述。在糖尿病个体中胰岛淀粉样变性可影响少于1%或达到80%的胰岛。在非糖尿病受试者中出现的胰岛淀粉样蛋白是低的，在老年人中，明显地非糖尿病个体小于15%，但是在超过90%糖尿病受试者尸检中是高的。在1987年，两个小组鉴定了胰岛淀粉样蛋白内结构蛋白，将其命名为胰淀素或IAPP。对于其他淀粉样蛋白相关疾病，多年来胰岛中的淀粉样蛋白沉积物被认为是主要毒剂和胰岛退化的主要原因。

在过去十年中这种教条受到了一些研究的挑战，这些研究表明：由于在非糖尿病个体，特别是老年群体中也可发现胰岛淀粉样蛋白，以及不是存在于T2D患者的所有胰岛中，可溶性寡聚体可以是主要毒性种类。由于在10周龄已经有高比例β细胞凋亡，人IAPP（hIAPP）的纯合转基因小鼠产生严重的糖尿病。但是，在5-10周龄β细胞的快速损失期间，在这些小鼠中尚未出现细胞外胰岛淀粉样蛋白。在肥胖的半合子的hIAPP小鼠中，其在约20周龄产生糖尿病，产生大量的胰岛淀粉样蛋白，但是胰岛淀粉样蛋白的程度和β细胞凋亡的频率之间的相关性较少。

Porat,Y.,等人，Biochemistry42,10971-10977,(2003)显示hIAPP的可溶性结构与生物膜相互作用并使生物膜不稳定。通过利福平抑制IAPP原纤维化未抑制对胰脏细胞的毒性的显示，Meier等人[Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.291,E1317-1324,(2006)]证明寡聚体可能是T2D中的主要毒性表位。

尽管在T2D中淀粉样蛋白寡聚体形成的广泛的临床重要性，导致自组装和分子识别过程的分子机制仍未完全理解并且从未作为独特的实体稳定可溶性寡聚体。

美国专利申请号20090246191教导IAPP的交联的前原纤维状聚集体和β淀粉样蛋白寡聚体的交联形式。

Porat等人，[Biochem,2003,42,10971-10977]教导IAPP的前原纤维结构具有β折叠（sheet）二级结构。

发明内容

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供包含分离的人胰岛淀粉样多肽（IAPP）的寡聚体的物质组合物（composition of matter）。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供产生本发明的物质组合物的方法，该方法包括：

（a）将人IAPP溶解在消除IAPP结构化形式（structured form）的试剂中；

（b）去除该试剂；

（c）在溶剂和阴离子表面活性剂中再溶解该非结构化形式（non-structured form）的IAPP，由此产生本发明的物质组合物。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种包含人IAPP的寡聚体和免疫学可接受的载体的疫苗。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种治疗需要其的受试者的糖尿病的方法，该方法包括：给予所述受试者治疗有效量的本发明的疫苗，由此治疗所述受试者的糖尿病。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种分离的抗体，其相比于人IAPP的原纤维，以更高亲和力结合到人胰岛淀粉样多肽（IAPP）的寡聚体。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的分离的抗体。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种在生物样品中检测IAPP寡聚体的方法，所述方法包括：在允许形成免疫复合体的条件下用本发明的抗体接触生物样品，其中免疫复合体的存在高于预定阈值是生物样品中的IAPP寡聚体的指示。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种诊断需要其的受试者的糖尿病的方法，所述方法包括：在所述受试者的生物样品中检测IAPP寡聚体，其中在所述生物样品中所述IAPP寡聚体的存在或水平高于预定阈值，是所述受试者中糖尿病的指示。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种诊断需要其的受试者的糖尿病的方法，该方法包括：在所述受试者的生物样品中检测识别IAPP寡聚体的抗体，其中在该生物样品中所述抗体的存在或水平高于预定阈值，是所述受试者中糖尿病的指示。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种治疗需要其的受试者的糖尿病的方法，该方法包括：给予所述受试者治疗有效量的试剂，所述试剂降低IAPP的活性或量，由此治疗所述受试者的糖尿病。

根据本发明一些实施方式的一个方面，在此提供一种鉴别对治疗糖尿病有用的试剂的方法，所述方法包括：用权利要求1的物质组合物接触所述试剂，其中所述寡聚体的量或活性的下调是对糖尿病治疗有用的试剂的指示。

根据本发明的一些实施方式，寡聚体包含二聚体和/或三聚体。

根据本发明的一些实施方式，寡聚体具有4kDa到90kDa的分子量。

根据本发明的一些实施方式，组合物缺乏（devoid）IAPP原纤维（fibril）。

根据本发明的一些实施方式，物质组合物进一步包含十二烷基硫酸钠（SDS）。

根据本发明的一些实施方式，寡聚体具有α-螺旋构象。

根据本发明的一些实施方式，寡聚体是交联的。

根据本发明的一些实施方式，寡聚体是未交联的。

根据本发明的一些实施方式，根据本发明的一些实施方式，寡聚体由二聚体和/或三聚体组成。

根据本发明的一些实施方式，物质组合物稳定多至7天。

根据本发明的一些实施方式，试剂选自由1,1,1,3,3,3六氟-2-丙醇（HFIP）、三氟乙醇（TFE）、三氟乙酸（TFA）组成的组。

根据本发明的一些实施方式，溶剂选自由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵和二甲亚砜组成的组。

根据本发明的一些实施方式，阴离子表面活性剂选自由十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂基硫酸铵、多库酯钠盐（Docusate sodium salt）、N-月桂酰肌氨酸钠盐（N-lauroylsarcosine sodium salt）、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、己烷磺酸钠、鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholicacid）、脱氢胆酸、甘胆酸、脱氧胆酸钠组成的组。

根据本发明的一些实施方式，分离的抗体被连接到可识别部分。

根据本发明的一些实施方式，分离的抗体是多克隆抗体。

根据本发明的一些实施方式，分离的抗体是单克隆抗体。

根据本发明的一些实施方式，检测使用本发明的抗体实现。

根据本发明的一些实施方式，试剂是本发明的抗体。

根据本发明的一些实施方式，试剂是小分子或抗体。

根据本发明的一些实施方式，接触在细胞存在下实现。

除非另外定义，本文所用所有技术和/或科学术语与本发明技术领域内普通技术人员的通常理解具有相同的含义。尽管与本文描述类似或等效的方法和材料可以用于本发明实施方式的实施或测试，以下描述示例性方法和/或材料。在存在抵触的情况下，以包括定义的专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的并不旨在必须限制。

附图说明

参考附图和照片，在此说明本发明的一些实施方式，仅作为实例。现在具体参考详细附图，需强调显示的细节是作为实例并为了解释性讨论本发明实施方式的目的。关于这一点，连同附图的描述使如何实施本发明的实施方式对本领域技术人员是显而易见的。

在图中：

图1A-1E是说明人IAPP特征的图表和照片。（图1A）在非还原条件下人IAPP寡聚体和非淀粉样变性大鼠IAPP的阴性对照（I-单体、II-二聚体、III-三聚体）的PAGE分析。（图1B）寡聚体稳定性检测，用PBS缓冲液透析hIAPP寡聚体并在37°C孵育。通过在非还原条件下PAGE分析监测寡聚体的结合/离解。（图1C）hIAPP寡聚体；I-单体、II-二聚体、III-三聚体和IV-90kDa寡聚体的尺寸排阻色谱（Superdex7510/300、PBS缓冲液pH7.4）。（图1D）~90kDa寡聚体的透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）图像，TEM比例尺100nm，原子力显微镜（AFM）比例尺600nm。（图1E）hIAPP和rIAPP的CD光谱，5μM的蛋白浓度。每个光谱表示三次测量的平均值。

图2A-2D是说明人IAPP寡聚体的毒性的图表。（图2A）用不同浓度的hIAPP寡聚体（灰色）或用rIAPP（黑色）处理的Rin-m细胞。通过MTT还原法判断细胞活力（^*P<0.05，^**P<0.005）。（图2B）来自含钙黄绿素脂质体的染料泄露。将1μM hIAPP低聚物（黑色方块）或rIAPP（灰色菱形）与脂质体孵育，并通过增加的荧光（激发：495，发射：520）判断膜损伤以及与对照组（白色方块）比较。（图2C）Rin-m细胞与hIAPP寡聚体在不同浓度孵育的FACS结果。将Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒用于凋亡细胞的检测。FL1-H是V-FITC的荧光以及FL2-H是Annexin V-PE的荧光。I-细胞处于坏死态、II-凋亡态晚期、III-凋亡态早期及IV-活细胞。（图2D）三次FACS分析检测的细胞状态分布（分散，dispersion）的图表表示，深灰柱代表活细胞、浅灰柱代表早期和晚期凋亡细胞以及黑柱代表坏死的细胞。

图3是说明说明hIAPP寡聚体可渗透细胞膜的共聚焦显微镜图像。将Rin-m细胞与5μM的hIAPP-Hiytelfluor488寡聚体孵育，并用鬼笔环肽-四甲基罗丹明染色。孵育进行一小时（I）、四小时（IV）、和八小时（VIII）。一小时后，在插入细胞质后观察到hIAPP寡聚体定位到细胞膜。在更长孵育时间后可检测细胞形态改变。

图4A-4E是说明来自II型糖尿病患者的抗体识别并中和hIAPP寡聚体的图表和照片。（图4A）通过分析它们识别hIAPP寡聚体（5μg）的能力比较来自II型糖尿病患者和健康人（N=3）的血清的纯化的抗体。在纯化的抗体的连续稀释上进行斑点印迹分析。（图4B）通过纯化的抗体对hIAPP寡聚体的识别特性的Scion图像（Scion image）进行密度计量分析（密度分析，densitometer analysis），浅灰柱代表非II型糖尿病的抗体以及深灰色柱代表II型糖尿病的纯化的抗体。（图4C）通过MTT还原法检测单独用hIAPP寡聚体处理的Rin-m细胞（浅灰色，5μM）、用hIAPP寡聚体和不同浓度的II型糖尿病（橙色）或非II型糖尿病（深灰色）纯化的抗体处理的Rin-m细胞的活性并与未处理的细胞（黑色）对比，（^*P<0.05,^**P<0.005）。（图4D）进行hIAPP寡聚体的PAGE分析和Western-blot（蛋白印迹）分析以研究II型糖尿病抗体识别哪种多聚体，用兔抗IAPP（SantaCruz Biotechnology，美国）进行阳性对照以及用非II型糖尿病纯化的抗体进行阴性对照。（图4E）说明与非II型糖尿病患者相比，在II型糖尿病患者中抗体识别的量的条状图。

具体实施方式

在本发明的一些实施方式中，本发明涉及用于诊断和治疗糖尿病的组合物和方法。

在详细解释至少一个本发明的实施方式前，需理解本发明不必限制在以下说明书中说明的或通过实例例证的其详细应用。本发明能够具有其他实施方式，或以多种方式实施或进行。

淀粉样蛋白质的可溶性寡聚组装体（assembly）在退化错折叠疾病中作为主要病因出现。与经表征的阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白寡聚体不同，寡聚状态的胰岛淀粉样多肽（IAPP），从未被稳定、探测或操作。本发明涉及稳定的IAPP细胞毒性寡聚体的分离。这些寡聚体在培养的胰细胞内导致凋亡（图2C-2D）、渗透模型脂质囊泡（图3）以及在完全内化后与细胞膜相互作用（图3）。此外，只在糖尿病患者内鉴定出特异地识别这些组装体的抗体并且这些抗体能够中和这些寡聚体的细胞凋亡细胞毒性作用（图4A-4E）。现有的发现表明人IAPP寡聚体不仅稳定而且对培养的细胞毒性高，在II型糖尿病患者内也发现了它们并因此在疾病发展中起主要作用。

本发明人认为包含人IAPP寡聚体的疫苗对于糖尿病的治疗以及作为能够特异地识别人IAPP寡聚体的抗体是有用的。

因而，根据本发明的一个方面，在此提供包含分离的人IAPP的寡聚体的物质组合物。

胰岛淀粉样多肽（IAPP）是基本上由37个氨基酸组成的肽激素，其在胰脏的β细胞内合成并且与胰岛素和胰高血糖素（glucagon）一起参与糖代谢的调控。IAPP是胰岛素的拮抗剂。

IAPP的多核苷酸序列和多肽序列在登录号NM_000415(SEQ ID NO:1)、NP_000406(SEQ ID NO:2)、NM_010491(SEQ ID NO:3)和NP_034621(SEQ ID NO:4)中列出。

如本文所用，术语“寡聚体”是指IAPP的共价和非共价的二聚体和/或三聚体或更高的聚集体，其不形成纤维状结构，即常规β-折叠阵列（β-sheet array）（例如，缺乏IAPP的原纤维）。

短语“分离的寡聚体”是指基本上不含存在于其体内环境中的其他物质（例如，其他胰腺细胞、血液成分、激素、蛋白质或核酸等）的寡聚体。

本发明的分离的寡聚体典型地合成地制备并且不是从胰脏或血液分离的提取物的部分。

根据一种实施方式，本发明的分离的寡聚体包含球状形态的a-螺旋二级结构。

根据另一种实施方式，本发明的分离的寡聚体的分子量是在约4-90kDa之间。

如本文所用，术语“原纤维”是指由通常电子显微镜下可见的高度有序的聚集体组成的线状纤维样结构。

本发明此方面的寡聚体的生产可通过以下步骤进行：

（a）将人IAPP溶解在消除IAPP结构化形式的试剂中；

（b）去除试剂；以及

（c）在溶剂和阴离子表面活性剂中再溶解非结构化形式的IAPP。

可通过固相肽合成或重组方法产生肽人IAPP。Andersson Biopolymers2000;55(3):227-50描述了大规模肽合成。人IAPP也可以商业购买获得-例如从Bachem，Bubendorf，Switzerland（H-7905）。

能够减少人IAPP结构的量的试剂的实例包括，但不限于1,1,1,3,3,3六氟-2-丙醇（HFIP）、三氟乙醇（TFE）、三氟乙酸（TFA）。

在IAPP溶解后，去除溶解试剂（例如通过干燥，包括空气干燥和真空下干燥）。

然后，在溶剂和离子表面活性剂中再溶解所述非结构化形式的IAPP。

可根据本发明的此方面使用的示例性溶剂包括：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵和二甲亚砜。

根据本发明的此方面使用的示例性阴离子表面活性剂包括：十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂基硫酸铵、多库酯钠盐、N-月桂酰肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、己烷磺酸钠、鹅去氧胆酸、脱氢胆酸、甘胆酸、脱氧胆酸钠。

根据具体实施方式，用于溶解IAPP的试剂为1,1,1,3,3,3六氟-2-丙醇（HFIP），用于再溶解非结构化形式的IAPP的溶剂是NaOH以及所用的阴离子表面活性剂是SDS。

本发明人表明根据以上描述的方案生成的IAPP寡聚体能够稳定多至（长达）7天。为了提高稳定性，寡聚体可以是交联的。在美国专利号20090246191中公开了交联IAPP寡聚体的方法，其内容并入本文作为参考。需理解在不存在交联的情况下，IAPP寡聚体典型地不大于三聚体，这样包含本发明此方面的未交联的寡聚体的组合物缺乏五聚体和/或六聚体。

本发明此方面的IAPP寡聚体可用于多种应用，例如从生物液中分离和/或纯化寡聚体反应性抗体或其片段。在另一种实施方式中，纯化的IAPP寡聚体可用于在生物样品中筛查和检测IAPP寡聚体反应性抗体或其片段。在这些方法中纯化的寡聚体可用作配体。寡聚体还可用作诱导特异性识别寡聚态的IAPP的抗体产生的免疫原。

因此，根据本发明的另一方面，在此提供能够特异性结合IAPP寡聚体的分离的抗体。相比于人IAPP的原纤维，这样的抗体以更高的亲和力结合到人胰岛淀粉样多肽（IAPP）的寡聚体。根据本发明此方面的一种实施方式，抗体与IAPP的寡聚体结合的亲和力比原纤维形式的IAPP高至少两倍、优选地至少5倍、更优选地至少10倍及再优选地至少20倍。

根据本发明此方面的另一种实施方式，抗体以相同亲和力与寡聚IAPP和与原纤维形式的IAPP结合。

根据本发明此方面的另一种实施方式，抗体与IAPP的寡聚体结合的亲和力比与其他淀粉变性寡聚体（amyloidogenic oligomer）（例如血清淀粉样A蛋白、β2-微球蛋白、甲状腺素、血清胱抑素C变体、凝溶胶蛋白、降钙素原、PrP蛋白、淀粉样β-蛋白、载脂蛋白A1和溶菌酶）结合的亲和力高至少两倍、优选地至少5倍、更优选地至少10倍及再优选地至少20倍。

如本文所用，术语“抗体”是指基本上完整的抗体分子或抗体片段。

短语“分离的抗体”是指从其自然环境移出的抗体。例如，本发明人使用斑点-印记检测将抗IAPP寡聚体抗体分离到过滤器（见图4A）。

如本文所用的，短语“抗体片段”是指能够结合到抗原的抗体的功能性片段。

用于实施本发明的合适的抗体片段除其他外包括：免疫球蛋白轻链（本文中称为“轻链”）的互补决定区（CDR）、免疫球蛋白重链（本文中称为“重链”）的CDR、轻链的可变区、重链的可变区、轻链、重链、Fd片段、以及包括轻链和重链的基本上全部可变区的抗体片段，如Fv、单链Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2。

包括轻链和重链的全部或基本全部可变区的功能性抗体片段定义如下：

（i）Fv，定义为由轻链的可变区和重链的可变区组成的表示为双链的基因工程片段；

（ii）单链Fv（“scFv”），一种包括轻链的可变区和重链的可变区的通过合适的多肽接头（连接子，linker）连接的基因工程单链分子。

（iii）Fab，一种包含抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，其通过用木瓜蛋白酶处理全抗体以产生完整的轻链和重链Fd片段（其由重链的可变区和CH1区组成）获得；

（iv）Fab’，一种包含抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，其通过在还原后，用胃蛋白酶处理全抗体获得（每抗体分子获得两个Fab’片段）；

（v）F(ab’)2，一种包含抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，其通过用胃蛋白酶处理全抗体获得（即，通过两个二硫键结合到一起的Fab’片段的二聚体）。

在现有技术中产生单克隆抗体和多克隆抗体的方法是公知的。抗体可以通过可以利用在体内诱导抗体分子生产的几种已知方法的任何一种产生，筛选免疫球蛋白库（Orlandi,R.等人(1989).Cloning immunoglobulinvariable domains for expression by the polymerase chain reaction.Proc NatlAcad Sci USA86,3833-3837；和Winter,G.及Milstein,C.(1991).Man-madeantibodies.Nature349,293-299)，或通过培养的连续细胞系生产单克隆抗体分子。这些包括，但不限于：杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术和Epstein-Barr病毒（EBV）-杂交瘤技术（Kohler,G.和Milstein,C.(1975).Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature256,495-497；Kozbor,D.等人(1985).Specific immunoglobulinproduction and enhanced tumorigenicity following ascites growth of humanhybridomas.J Immunol Methods81,31-42;Cote RJ.等人(1983).Generationof human monoclonal antibodies reactive with cellular antigens.Proc NatlAcad Sci USA80,2026-2030；和Cole,S.P.等人(1984).Human monoclonalantibodies.Mol Cell Biol62,109-120）。

使用杂交瘤技术用于制备和筛选特异性抗体的方法在本领域是常规且公知的。在一个非限制的实例中，可以用本发明的分离的寡聚体免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到对抗原特异性的抗体，采集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过已知技术将脾细胞融合到任何合适的骨髓瘤细胞，例如来自可从ATCC^TM获得的细胞系SP20的细胞。通过有限的稀释选择并克隆杂交瘤。对于分泌能够结合本发明原纤维的抗体的细胞，通过本领域已知的方法检测杂交瘤克隆。通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠，可产生通常含高水平抗体的腹水液（ascites fluid）。

因此，本发明提供产生单克隆抗体的方法，以及通过以下方法生产的抗体，该方法包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，通过融合分离自用本发明的原纤维免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞产生杂交瘤细胞，然后对于分泌能够结合原纤维的抗体的杂交瘤克隆，筛选由融合引起的杂交瘤细胞。

除了使用动物的体内传统方法，抗体也可在体外产生，例如，使用重组抗体结合位点表达噬菌体展示文库。例如，参见Huse Science246:1275(1989);Ward Nature341:544(1989);Hoogenboom Trends Biotechnol.15:62-70(1997);Katz Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45(1997)。

当在体内产生抗体时，在目标抗原太小以至于不能激发足够的免疫原性应答的情况下，可将这样的抗原（指的是“半抗原”）偶联到抗原中性载体，如匙孔血蓝蛋白（KLH）或血清白蛋白（例如，牛血清白蛋白（BSA））载体（例如，见美国专利号5,189,178和5,239,078）。使用本领域内熟知的方法实现将半抗原偶联到载体。例如，实现直接偶联到氨基基团以及然后可选地还原形成的亚氨基连接。可替换地，载体可使用浓缩剂（condensingagent）偶联，如二环己基碳二亚胺或其它碳二亚胺脱水剂。也可以使用接头化合物实现偶联；同（型）双功能交联剂和异（型）双功能接头都可从Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois,USA获得。然后，可将获得的免疫原性复合物注射到合适的哺乳动物受试者，如小鼠、兔子等。适合的方案包括根据设计以提高血清中抗体产生的时间表（schedule）在佐剂存在的条件下重复注射免疫原。使用本领域中公知的免疫测定程序可以很容易地测定免疫血清的效价（titer）。

如上文描述，可直接使用获得的抗血清或可获得单克隆抗体。

可以使用本领域中公知的方法获得抗体片段。（例如，见Harlow，E.and Lane,D.(1988).Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York.）例如，通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌细胞或哺乳动物细胞（例如，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养物或其他蛋白表达系统）内表达编码片段的DNA，制备根据本发明的抗体片段。

可替换地，可用常规方法通过用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体获得抗体片段。如上文所述，通过用胃蛋白酶酶法裂解抗体以提供5S片段来制备(Fab’)2抗体片段。使用硫醇还原剂，以及可选地产生自二硫键断裂的巯基基团的保护基（blocking group）可进一步裂解此片段以产生3.5SFab’单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶酶裂解直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段。本领域的文献中提供了大量用于实现这样的方法的指导（例如，参考：美国专利号4,036,945和4,331,647；以及Porter，R.R.(1959).Thehydrolysis of rabbitγ-globulin and antibodies with crystalline papain.BiochemJ73,119-126）。只要片段保持结合被完整抗体识别的抗原的能力，还可使用裂解抗体的其他方法，如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步裂解片段，或其他酶技术、化学技术或基因技术。

如上所述，Fv由成对的重链可变区和轻链可变区组成。这种结合可为非共价的（例如，见Inbar,D.等人(1972).Localization ofantibody-combining sites within the variable portions of heavy and light chains.Proc Natl Acad Sci USA69,2659-2662）。可替代地，如上所述，该可变区可通过分子间二硫键连接以生产单链Fv，或可替代地这样的链是通过如戊二醛的化学物质交联的。

优选地，该Fv是单链Fv。可通过构建由编码肽接头的寡核苷酸连接的包含编码重链可变区和轻链可变区的DNA序列的结构基因制备单链Fv。将结构基因插入表达载体，然后将其引入宿主细胞，如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有由接头肽桥连的两个可变区的多肽单链。本领域文献中提供了用于制备单链Fv的充分指导（例如，见Whitlow，M.and Filpula,D.(1991).Single-chain Fv proteins and their fusion proteins.METHODS:ACompanion to Methods in Enzymology2(2),97-105;Bird,R.E等人(1988).Single-chain antigen-binding proteins.Science242,423-426;Pack,P.等人(1993).Improved bivalent miniantibodies,with identical avidity as wholeantibodies,produced by high cell density fermentation of Escherichia coli.Biotechnology(N.Y.)11(11),1271-1277；和美国专利号4,946,778）。

通过构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因可获得分离的互补决定区肽类。例如，通过抗体产生细胞的mRNA的RT-PCR制备这样的基因。本领域文献中提供了用于实施这样的方法的充分指导（例如Larrick,J.W.和Fry,K.E.(1991).PCR Amplification of Antibody Genes.METHODS:ACompanion to Methods in Enzymology2(2),106-110）。

需理解，对于人的治疗或诊断，优选使用人源化抗体。非人类（例如，鼠类）抗体的人源化形式是具有（优选最小）来自非人类抗体部分的遗传工程的嵌合抗体或抗体片段。人源化抗体包括抗体，抗体中人抗体（受体抗体）的CDR被来自非人类物种（供体抗体），如小鼠、大鼠或兔的具有所需功能性的残基替代。在一些情况下，人抗体的Fv框架残基被相应非人残基替代。人源化抗体也可包括既未在受体抗体也未在输入（imported）CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体包括基本上全部的至少一个，及典型地两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人抗体的CDR，以及全部或基本上全部的框架区对应于相关的人共有序列的框架区。人源化抗体最佳也包括至少一部分抗体恒定区，如典型地来自人抗体的Fc区（例如，见Jones,P.T.等人(1986).Replacing thecomplementarity-determining regions in a human antibody with those from amouse.Nature321,522-525;Riechmann,L.等人(1988).Reshaping humanantibodies for therapy.Nature332,323-327;Presta,L.G.(1992b).Curr OpinStruct Biol2,593-596；和Presta,L.G.(1992a).Antibody engineering.CurrOpin Biotechnol3(4),394-398）。

用于人源化非人抗体的方法在本领域是公知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常指典型地从输入可变区获得的输入残基。基本上如所描述，通过以相应的啮齿类动物的CDR替换人类CDR进行人源化（例如，见Jones等人(1986);Riechmann等人(1988);Verhoeyen,M.等人(1988).Reshaping humanantibodies:grafting an antilysozyme activity.Science239,1534-1536；以及美国专利号4,816,567）。因此，人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整的人类可变区被来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体可以典型地是人类抗体，其中一些CDR残基和可能地一些框架残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基替换。

也可以使用本领域中已知的其他各种技术制备人类抗体，包括噬菌体展示文库（Hoogenboom,H.R.和Winter,G.(1991).By-passing immunisation.Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segmentsrearranged in vitro.J Mol Biol227,381-388;Marks,J.D.等人(1991).By-passing immunization.Human antibodies from V-gene libraries displayedon phage.J Mol Biol222,581-597；Cole等人(1985),Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96;and Boerner,P.等人(1991).Production of antigen-specific human monoclonal antibodies from invitro-primed human splenocytes.J Immunol147,86-95）。还可以通过将编码人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物内，例如引入到内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠内产生人源化抗体。基于抗原刺激（挑战，challenge），在这样的动物中可观察到人类抗体产生，该抗体在所有方面与在人类中观察到的非常相似，包括基因重排、链装配和抗体谱（antibodyrepertoire）。在本领域的文献中提供了用于实施这样的方法的充足的指导（例如，参考：美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016；Marks,J.D.等人(1992).By-passing immunization:building high affinity human antibodies by chain shuffling.Biotechnology(N.Y.)10(7),779-783;Lonberg等人，1994.Nature368:856-859;Morrison,S.L.(1994).News and View:Success in Specification.Nature368,812-813;Fishwild,D.M.等人(1996).High-avidity human IgG kappa monoclonalantibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice.Nat Biotechnol14,845-851;Neuberger,M.(1996).Generating high-avidity human Mabs in mice.Nat Biotechnol14,826；和Lonberg,N.and Huszar,D.(1995).Humanantibodies from transgenic mice.Int Rev Immunol 13,65-93）。

获得抗体后，例如通过酶联免疫吸附检测（ELISA），可测试它们的活性。

本发明此方面的抗体可以连接到功能性部分，如可检测的部分。这样的抗体对于识别IAPP寡聚体是有用的。

可将各种类型的可检测部分或报告（reporter）部分结合到本发明的抗体。这些部分包括，但不限于，放射性同位素（如^[125]碘）、磷光性化学品、化学发光性化学品、荧光性化学品（荧光团）、酶、荧光多肽、亲和标记物、和可通过正电子发射断层摄影（PET）和磁共振成像（MRI）检测的分子（造影剂（contrast agent））。

合适的荧光团的实例包括，但不限于，藻红蛋白（PE）、异硫氰酸荧光素（FITC）、细胞色素、罗丹明、绿色荧光蛋白（GFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、得克萨斯红、PE-Cy5等。关于荧光团的选择、连接荧光团到多种类型的分子的方法的其他指导见Richard P.Haugland,“Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals1992-1994”,5th ed.,Molecular Probes,Inc.(1994)；Oncoimmunin Inc.的美国专利号6,037,137；Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Academic Press New York,N.Y.(1995);Kay M.等人，1995.Biochemistry34:293;Stubbs等人，1996.Biochemistry35:937;Gakamsky D.等人，“Evaluating Receptor Stoichiometryby Fluorescence Resonance Energy Transfer,”in“Receptors:A PracticalApproach,”2nd ed.,Stanford C.和Horton R.(eds.),Oxford University Press,UK.(2001)；Targesome,Inc.的美国专利号6,350,466]。可在抗体结合到可荧光检测部分时用于检测抗体的荧光团检测方法包括，例如荧光激活流式细胞仪（FACS）、免疫荧光共聚焦显微镜、荧光原位杂交（FISH）和荧光共振能量转移（FRET）。

多种类型的酶可连接到本发明的抗体[例如，辣根过氧化物酶（HPR）、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶（AP）]，以及可使用ELISA（例如，在溶液中）、酶联免疫组织化学测试（例如，在固定的组织中）、酶联化学发光测试（例如，在电泳分离的蛋白混合物中）或本领域中已知的其他方法（例如，见Khatkhatay MI.和Desai M.,1999.J Immunoassay20:151-83;WisdomGB.,1994.Methods Mol Biol.32:433-40;Ishikawa E.等人，1983.JImmunoassay4:209-327;Oellerich M.，1980.J Clin Chem Clin Biochem.18:197-208;Schuurs AH.and van Weemen BK.,1980.J Immunoassay1:229-49）进行酶结合的抗体的检测。

亲和标记物（标签，tag）（或结合对的一个成员）可以是可通过相应抗体识别的抗原[例如，通过抗-DIG抗体识别的地高辛配基（digoxigenin，DIG）]或对标记物有高亲和性的分子[例如，链霉亲和素和生物素]。如以上描述，可将结合亲和标记物的抗体或分子荧光标记或将其连接到酶。

可采用本领域广泛使用的各种方法将链霉亲和素或生物素分子连接到本发明的抗体上。例如，生物素分子可以通过如在随后的实施例部分以及在Denkberg,G.等人，2000.Eur.J.Immunol.30:3522-3532中描述的生物素蛋白连接酶（例如，BirA）的识别序列连接到本发明的抗体。可替代地，基本上如在Cloutier SM.等人，2000.Molecular Immunology37:1067-1077;Dubel S.等人，1995.J Immunol Methods178:201;Huston JS.等人，1991.Methods in Enzymology203:46;Kipriyanov SM.等人，1995.Hum AntibodiesHybridomas6:93;Kipriyanov SM.等人，1996.Protein Engineering9:203;Pearce LA.等人1997.Biochem Molec Biol Intl42:1179-1188）中描述的，可将链霉亲和素连接到抗体片段，如单链Fv。

连接到链霉亲和素的功能性部分，如荧光团可以从基本上所有免疫荧光流式细胞术试剂的主要供应商处商业购买获得（例如，Pharmingen或Becton-Dickinson）。

根据本发明的一些实施方式，将生物素连接的抗体结合到链霉亲和素分子以形成多价组合物（例如，二聚体或四聚体形式的抗体）。

表1提供能够结合到本发明抗体的可识别部分的非限制性实例。

表1

表1

如所述，本发明的抗体可以用于检测生物样品中的寡聚IAPP。

因此，根据本发明的另一方面，在此提供一种在生物样品中检测IAPP寡聚体的方法，该方法包括：在允许形成免疫复合体的条件下用本发明的抗体接触生物样品，其中高于预定阈值的免疫复合体的存在是生物样品中的IAPP寡聚体的指示。

生物样品可以包括组织（如胰岛）、细胞、细胞外基质和生物液（生物流体）。生物液包括但不限于血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、腹膜液和唾液。

根据此方面，可以在体外、离体（离体回输，ex vivo）或在体内实现该接触。

本发明的免疫复合体可以在多种温度、盐浓度和pH值下形成，并且本领域技术人员能够调整适合每种免疫复合体形成的条件。

基本上如上所述，测定本发明免疫复合体的存在或水平依赖于抗体所连接的可检测部分。

由于本发明人已经表明低聚IAPP与糖尿病相关联，由此得出结论，所以该抗体可以用于糖尿病的诊断。

因此，根据本发明的另一方面，在此提供一种诊断需要诊断的受试者的糖尿病的方法，所述方法包括：在受试者的生物样品中检测IAPP寡聚体，其中在生物样品中高于预定阈值的IAPP寡聚体的存在或水平是受试者中糖尿病的指示。

如上文提到的，本发明人已经表明糖尿病患者产生识别寡聚IAPP的抗体，而非糖尿病患者内不存在这样的抗体。因此，本发明人提出这样的抗体可用作糖尿病的标记。

因此，根据本发明的又一个方面，在此提供一种诊断需要诊断的受试者的糖尿病的方法，所述方法包括：在所述受试者的生物样品中检测识别IAPP寡聚体的抗体，其中在所述生物样品中高于预定阈值的抗体的存在或水平，是所述受试者中糖尿病的指示。

如本文所用的术语“诊断”是指确认糖尿病的存在、糖尿病分类、确定糖尿病的严重性（等级或阶段）、监测糖尿病进展、预测糖尿病的结果和/或恢复的前景。

受试者可以是进行常规健康检查的健康受试者（例如，人）。可替代地，受试者可能处于患有糖尿病的风险中（例如，有遗传素质的受试者、具有糖尿病医学和/或家族史的受试者）和/或表现出疑似糖尿病临床体征的受试者[例如，在尿中存在糖）。

根据一种实施方式，将免疫复合体（IAPP寡聚体-抗体）的水平与来自非患病受试者的对照样品对比，其中免疫复合体形成的上调是糖尿病的指示。优选地，受试者是相同物种，例如人，优选地以相同年龄、体重、性别等匹配的。应理解来自健康组织，疾病进展前或疾病缓解后的对照样品也可以是相同受试者的。

接触可以是离体（自受试者移出的样品）或在体内。

由于本发明人现在已经查明寡聚体形式的IAPP对胰岛是有毒的，本发明人提出能够减少IAPP的活性或量的试剂可用于糖尿病的治疗。

因此，根据本发明的再一个方面，在此提供一种治疗需要治疗的受试者的糖尿病的方法，所述方法包括：给予所述受试者治疗有效量的试剂，该试剂降低IAPP的活性或量，由此治疗所述受试者的糖尿病。

如本文所用的“糖尿病”是指由于胰岛素的生物合成或生产中的缺陷引起的胰岛素绝对缺乏（1型糖尿病），或在有机体内存在胰岛素抵抗的胰岛素相对缺乏（2型糖尿病），即受损的胰岛素功能导致的疾病。因此，糖尿病患者具有绝对或相对胰岛素不足，以及在其他的症状和体征间显示：升高的血糖浓度、尿中存在葡萄糖以及尿的过量排出。

根据一种具体实施方式，该方法用于治疗II型糖尿病。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的发展、基本上改善病症的临床或美学症状或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。

根据本发明的一种实施方式，试剂将IAPP的量或活性减少至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍以及甚至更优选至少5倍。

降低IAPP寡聚体的量或活性的试剂（试剂，agent）包括但不限于针对寡聚体的抗体、多核苷酸试剂、肽试剂和小分子试剂。

下调IAPP寡聚体的量的试剂的选择可通过将候选试剂与本发明的分离的IAPP寡聚体接触来进行，其中寡聚体的量的下调是对糖尿病治疗有用的试剂的指示。

可以使用本领域已知的任何蛋白质定量方法估计IAPP寡聚体的量。通过Page分析、通过尺寸排阻色谱、圆二色光谱、透射电子显微镜和原子力显微镜实现寡聚体的可视化。

此外，如以下描述的通过分析IAPP寡聚体的活性来估计它们的量。

下调IAPP寡聚体的活性的试剂的选择可通过将候选试剂与本发明的分离的IAPP寡聚体和细胞（或如以下描述的人工细胞）接触来进行，其中寡聚体的活性的下调是对糖尿病治疗有用的试剂的指示。

短语“降低IAPP寡聚体的活性”是指降低寡聚体的细胞毒素活性。

可通过任何在体外条件下例如，包括将候选试剂和寡聚体加入来自受试者的细胞（例如，原代细胞培养物、细胞系）或加入包括其的生物样品（例如包含细胞的流体、液体），这样候选试剂和寡聚体都与细胞直接接触，来进行细胞与候选试剂和寡聚体的接触。根据本发明的一些实施方式，将受试者的细胞与试剂和寡聚体孵育。根据时间周期/细胞的浓度/药物的浓度/细胞和候选试剂间的比例/寡聚体等能够使候选试剂引起寡聚体变化的因素选择用于孵育细胞的条件。

监测由药物诱导的细胞的变化的方法在本领域中是已知的，并且包括例如，MTT检测，其基于活细胞还原黄色盐MTT（溴化3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓）（Sigma,Aldrich St Louis,MO,USA）为纯蓝色不溶的甲臜沉淀物的选择能力；BrDu检测[Cell Proliferation ELISA BrdUcolorimetric kit(Roche,Mannheim,Germany]；TUNEL检测[Roche,Mannheim,Germany]；Annexin V检测[Annexin V Apoptosis Kit(Clontech Laboratories,Inc.,CA,USA)]；衰老相关的-β-半乳糖苷酶检测（Dimri GP，Lee X,等人1995.A biomarker that identifies senescent humancells in culture and in aging skin in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A92:9363-9367）；以及以上文进一步描述的各种RNA和蛋白质的检测方法（其检测表达和/或活性水平）。

如在本文以下实施例部分描述的，因为穿透细胞膜的能力被认为与IAPP的细胞毒素活性直接相关，IAPP寡聚体的细胞毒素活性也可使用合成膜-例如脂质体分析。

能够下调IAPP寡聚体量或活性的试剂可自身或作为与药用载体混合的药物组合物的一部分提供给受试者。

如本文所用的“药物组合物”是指本文描述的一种或多种活性成分与其他化学成分，如生理上合适的载体和赋形剂的制备品。药物组合物的目的是便于将化合物给予治疗的受试者。

本文术语“活性成分”指的是起生物作用的化合物。

在下文中，可以互换使用的短语“生理上可接受的载体”和“药用载体（药学上可接受的载体）”是指不引起受试者显著刺激并且不减少给药的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。本发明药用组合物的优选的载体包括，但不限于，聚乙二醇（PEG）、在有机介质和水介质中都具有宽范围溶解性的生物相容的聚合物（Mutter等人(1979)）。

本文中的术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇类。

用于药物配制和给予的技术可在最新版本的'Remington’sPharmaceutical Sciences'，Mack Publishing Co.,Easton,PA中找到，其通过引用并入本文。

例如，合适的给药途径可包括，例如，口服递送、直肠递送、经粘膜递送、特别是经鼻递送、肠内或肠外递送，包括肌内注射、皮下注射和髓内注射以及鞘内注射、直接心室内注射、静脉内注射、腹腔（腹膜内）注射、鼻内注射或眼内注射。

可替换地，人们可以以局部方式而不是全身方式给予制剂，例如，通过制剂直接注射进入患者身体的特定区域（例如，胰腺或肝脏）。

本发明的药物组合物可通过本领域中公知的工艺制造，例如通过常规的混合工艺、溶解工艺、造粒工艺、糖衣制造工艺、研磨工艺、乳化工艺、封装（囊化）工艺、截留（entrapping）工艺或冻干工艺。

根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理可接受的载体（包括赋形剂和助剂（辅剂），其促进将活性成分加工到可以药用的制剂中）以常规方式配制。合适的剂型取决于所选的给药途径。

对于注射，本发明的活性成分可以在水溶液中，优选地在生理上相容的缓冲液，如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液中配制。对于粘膜给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂（penetrant）。这样的渗透剂通常是本领域中已知的。

对于口服给药，通过混合活性化合物和本领域中公知的药用载体可容易地配制化合物。这样的载体使本发明的化合物能够配制为用于患者口服摄入的片剂、丸剂、糖锭、胶囊、液剂、凝胶剂、糖浆剂、糊剂（slurries）、悬浮液等。可以使用固态赋形剂，如果需要在加入合适的助剂后，可选地研磨获得的混合物，以及加工粒料的混合物，获得片剂或糖锭核（drageecore）来制造用于口服使用的药物制剂。合适的赋形剂尤其是，填料如：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如：玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。如果需要，可添加崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或它的盐，如海藻酸钠。

糖锭核具有合适的涂层。为了此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波凝胶（carbopol gel）、聚乙二醇、二氧化钛、亮漆溶液（lacquer solution）和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了识别或表征活性化合物剂量的不同组合，可将染料或色素加到片剂或糖锭涂层中。

可口服使用的药物组合物包括由明胶制成的硬胶囊（推入适配胶囊，push-fit capsule）以及由明胶和增塑剂，如甘油或山梨糖醇制成的密封的软胶囊。硬胶囊可包含与如乳糖的填充剂、如淀粉的粘合剂、如滑石或硬脂酸镁的润滑剂、以及可选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分溶解或悬浮在合适的液体，如脂肪油、液体石蜡或液态聚乙二醇中。此外，可以添加稳定剂。用于口服给药的所有制剂应该以适合于选择的给药途径的药量。

对于颊部给药，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于经鼻吸入给药，用于根据本发明使用的活性成分可以以气雾喷雾制剂的形式方便地递送，其从加压包装或雾化器使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳产生。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供一个阀来确定剂量单位以递送计量的量。配制用于在分配器中使用的例如明胶的胶囊和药筒，其包含化合物和合适的粉末基质，如乳糖或淀粉的粉末混合物。

配制本发明描述的制剂用于肠胃外给药，例如快速推注（bolusinjection）或持续输注。用于注射的制剂可以以单位剂量形式提供，例如以安瓿瓶或以具有可选地附加的防腐剂的多剂量容器。组合物可以是在油性或水性赋形剂中的悬浮液、溶液或乳液，并可以包含如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。

用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外活性成分的悬浮液可以制备成合适的油基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油，如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯类或脂质体。含水的注射悬浮液包含增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，悬浮液还可包括合适的稳定剂或增加活性成分溶解度以允许制备高浓缩的溶液的试剂。

可替换地，活性成分可以为用于在使用前与合适的赋形剂（载体，vehicle），例如，无菌、无热原水基溶液混合（constitution）的粉末形式。

本发明的制剂还可以使用例如，常规栓剂基质，如可可脂或其他甘油酯类配制为直肠组合物，如栓剂或保留灌肠剂（retention enemas）。

适合用于本发明范围的药物组合物包括其中含有有效获得期望目标的量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量指有效预防、缓解或改善疾病的症状或延长被治疗受试者的生存的活性成分的量。

治疗有效量的确定是在本领域技术人员的能力范围内。

对于在本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以根据体外检测进行初始估计。例如，在动物模型中配制剂量，并且这样的信息可以用于更准确地确定人的有用剂量。

本文所述的活性成分的毒性效果和治疗效果可以通过标准制药规程在体外、在细胞培养或试验动物中确定。从这些在体外和细胞培养检测以及动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。该剂量根据采用的剂量形式和使用的给药途径而变化。确切的剂型、给药途径和剂量可由医师个人根据患者的条件选择。[例如，见Fingl，等人，(1975)"ThePharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.1]。

根据被治疗病症的严重性和响应性，随着疗程持续几天至几周或直到达到治愈或实现疾病状态减轻，给药可以是单次给药或多次给药。

当然，组合物的给药量将取决于被治疗的受试者、痛苦的严重性、给药的方式、处方医师的判断等。

包含本发明的制剂的配制在相容的药物载体内的组合物也可以制备、放入合适的容器中，并标记用于治疗指明的病症。

根据本发明的另一方面，在此提供一种制造的制品，其包括包装材料和鉴定用于治疗淀粉样蛋白相关的疾病（例如，糖尿病）的包含在包装材料内的药物组合物，药物组合物包括作为活性成分的以上描述的化合物和药用载体。

如果需要，本发明的组合物可存在于包装或分配装置内，例如FDA批准的试剂盒，其可以包括包含活性成分的一种或多种单位剂量形式。例如，包装可包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可伴有给药说明。包装或分配器也可伴有与容器相关的以管理药物生产、使用或销售的政府机构批准的形式的通知，该通知是表明政府机构对组合物形式或者人或兽医给药的批准。例如，这样的通知可以是由美国食品和药物管理局（FDA）批准的用于处方药的标贴或经批准的产品说明书。

需理解，其他试剂（例如，胰岛素）和饮食（低糖）可以与本发明的试剂结合使用以提高其治疗效果。

由于本发明人在糖尿病患者的血清中发现了IAPP寡聚体的抗体，本发明人认为IAPP寡聚体可用作治疗糖尿病的疫苗，从而在体内诱导抗体的产生。

因此，根据本发明的另一个方面，在此提供一种包含人类IAPP的寡聚体和免疫学上可接受的载体的疫苗。

在Remington's Pharmaceutical Science;Mack Publishing CompanyEaston,Pa.（最新版）中描述了制备免疫原性组合物或疫苗组合物的一般方法。为了提高免疫原性，可以将本发明的多肽吸附或连接到颗粒（珠粒，bead）上，如胶乳、黄金颗粒、ISCOM等。免疫原性组合物可包含佐剂，它是能够加入免疫原或加入疫苗制剂以增强免疫原部分的免疫刺激性的物质。脂质体也被认为是佐剂（Gregoriades,G.等人，ImmunologicalAdjuvants and Vaccines,Plenum Press,New York,1989）。可增加蛋白质免疫原的效力的佐剂或试剂的实例包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾（明矾）、硫酸铍、二氧化硅、高岭土、碳（carbon）、油包水型乳剂和水包油型乳剂。一种类型的佐剂是胞壁酰二肽（MDP）和各种MDP衍生物和制剂，例如N-乙酰基-D-葡糖胺基-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺（GMDP）（Hornung,R L等人Ther Immunol19952:7-14）或ISAF-1（5％角鲨烯、2.5％普鲁兰尼克L121（pluronic L121）、在具有0.4mg苏氨酰-胞壁酰二肽的磷酸盐缓冲液中的0.2％吐温；见Kwak,L W等人(1992)N.Engl.J.Med.,327:1209-1238）。其他有用的佐剂是，或基于，霍乱毒素、细菌内毒素、脂质X、痤疮丙酸杆菌或百日咳杆菌的整个有机体或亚细胞组分、多核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂苷及皂苷衍生物如QS21（White,A.C.等人(1991)Adv.Exp.Med.Biol.,303:207-210），其现在已用于临床（Helling,F et al.(1995)Cancer Res.,55:2783-2788;Davis,T A et al.(1997)Blood,90:509）、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其他合成佐剂。许多佐剂可从多种来源商业购买获得，例如，Merck佐剂65（Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.）或Freund's不完全佐剂和完全佐剂（Difco Laboratories,Detroit,Mich）、Amphigen（水包油）、铝胶（氢氧化铝）或Amphigen与铝胶的混合物。铝被批准供人类使用。

本发明也考虑了治疗性组合物和方法，包括在一个受试者中使用本发明的肽诱导所述含抗体或抗血清，从该受试者将其移出以及通过被动免疫或抗体转移将其用于治疗另一受试者。

IAPP寡聚体的量可根据受体的健康和体重、给药途径、其他同时治疗的存在（如果存在）、治疗频率、所需效果的性质和熟练医师的判断进行给予。

用于治疗受试者的示例性剂量是每千克体重可达约100毫克寡聚体的量。寡聚体的典型的单剂量在约1ng到约100mg/kg体重间，并优选地从约10μg至约50mg/kg体重。在约0.1毫克至约7克范围内的总日剂量优选用于静脉内给药。用于被动免疫的抗体的有用剂量是在10-100mg/kg之间。已经表明，抗体/抗血清的有效体内剂量是超过有效中和浓度或体外剂量约10到100倍间。联系本公开和技术水平可经验性地确定这些剂量。本发明的寡聚体可单独给药或结合针对疾病或病症治疗的其他疗法给药。

本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，其包括，但不限于，对于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者是已知的或可从已知的方式、手段、技术和过程容易地开发的这些方式、手段、技术和程序。

需理解，为了清楚在分开的实施方式的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中结合提供。相反，为了简洁在单个实施方式中描述的本发明的各种特征也可以单独地提供或在任何合适的子组中提供或如果合适在本发明的任何其他描述的实施方式中提供。在各种实施方式的范围内描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的必要特征，除非该实施方式没有这些元素是不能实施的。

以上描述的以及以下权利要求部分要求的本发明的各种实施方式和方面可在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在对以下实施例作出参考，其结合以上描述以非限制方式说明本发明的一些实施方式。

一般来说，本文所用的名词和本发明中使用的实验方法包括分子技术、生化技术、微生物学技术和重组DNA技术。这样的技术在文献中有详细解释。例如，参见："Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrooket al.,(1989);"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"A Practical Guideto Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988);Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York;Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998);如在美国专利号4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中阐述的方法;"Cell Biology:ALaboratory Handboo k",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994);"Culture ofAnimal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition;"Current Protocols in Immunology"Volumes I-IIIColigan J.E.,ed.(1994);Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980);在专利和科技文献中广泛描述了可用的免疫测定，例如，参见美国专利号3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5,281,521;"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,和HigginsS.J.,eds.(1985);"Transcription and Translation"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,eds.(1984);"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986);"A Practical Guide toMolecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press;"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak et al.,"Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual"C SHL Press(1996)；所有这些都作为参考并入，就好象本文中完全阐述一样。其他一般参考贯穿本文提供。此处的方法在本领域中被认为是公知的，并为了方便读者而提供。其中包含的所有信息并入本文作为参考。

实施例1

材料和方法

寡聚体制备：将IAPP合成肽（Human;H-7905,Bachem,Bubendorf，Switzerland.Rat;74-5-10A,American peptide,California,U.S.A）悬浮于1,1,1,3,3,3六氟-2-丙醇（HFIP）达1毫克/毫升，并且在37℃下在摇动下（100rpm）孵育2小时以完全溶解。通过真空离心蒸发浓缩器（Speedvac）装置移除HFIP并且将肽再悬浮于0.2μM的NaOH中，得到5mM的最终浓度，在预冷的超声浴中超声处理2分钟以确保完全溶解。将肽稀释在具有1%十二烷基硫酸钠（SDS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中以得到600μM的最终浓度，并在37℃下孵育4-7小时。将肽进一步以超纯水稀释得到200μM的最终浓度并在37℃下孵育12小时。通过15%Tris-tricine PAGE分析IAPP自装配产物并用Imperial蛋白染色剂染色。对细胞和脂质体实验，通过过量（v/v）九倍的冰冷甲醇/乙酸溶液（33%甲醇，4%乙酸）在4℃将寡聚体沉淀1小时。然后，将寡聚体沉淀（10分钟，在16,200g），再悬浮于PBS缓冲液，pH7.4。为了确保SDS被完全移除，用PBS缓冲液透析样品过夜。在通过PAGE分析和尺寸排阻色谱处理后，检查IAPP寡聚体。它们显示尺寸分布没有变化。

尺寸排阻色谱：将IAPP寡聚体（0.1mg）负载到Superdex75柱10/300（Amersham Biosciences，瑞典）、0.5ml/min、磷酸盐缓冲盐水（PBS）。使用用5蛋白标准（Bio-Rad.美国）计算的校正曲线确定尺寸。通过PeakFit软件（SYSTAT software Inc.）计算峰去卷积。

透射电子显微镜：使用在120kV运行的JEOL JEM1200EX显微镜进行TEM实验。将寡聚体溶液（8μl）置于300目formvar涂层的网格上，并在2分钟后用滤纸去除过量的液体。用8μl1%的乙酸双氧铀将样品负染色2分钟。

原子力显微镜：通过放置等分的40μl于新剥离的云母表面进行AFM检测。用轻敲模式（tapping mode）的Mikromasch NSC15/Si3N4悬臂（共振频率f＝325kHz，弹簧常数k=40N/m)通过Digital Instrument(DI)MultiModeTM NanoScope IV AFM探测样品。

圆二色(CD）光谱：使用安装温控试样架和10mm光程长的比色皿的AVIV202分光偏振计获得CD光谱。

所有试验在PBS、pH7.4、5μM的肽浓度下进行。对于波长扫描实验，每一光谱代表三次扫描的平均值。从远紫外CD光谱获得的二级结构组成的评估通过使用K2D和CDNN软件协助。

脂质体膜损伤测定：将磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱（Avanti，美国）以5:3:2的摩尔比分别溶解在氯仿中达20mg/ml的浓度。在氮气流下在旋转蒸发仪器中通过蒸发氯仿从样品中去除溶剂，以在玻璃试管壁上沉积一层薄脂膜。然后将干燥的脂膜用包含40mM钙黄绿素钠的50mM磷酸钠缓冲液（pH7.4）再水化以产生40mg/ml浓度的多层囊泡（MLV）。然后使MLV经受几个超声处理循环以用缓冲液平衡囊泡。通过尺寸排阻色谱使用HiPrep16/60sephacryl S-100柱（Amersham PharmaciaBiotech,Uppsala，瑞典）从囊泡中移除非囊封的钙黄绿素。在加入1%的triton x-100前后通过荧光测量证实钙黄绿素填满囊泡。在37℃下孵育样品并且膜损伤率跟随荧光检测（在495nm激发，2.5nm狭缝，和在520nm发射，5nm狭缝）。使用Jobin Yvon Horiba Fluoromax-3荧光计进行测量。每个点代表三次独立测量的平均值。

MTT还原检测：将Rin-m细胞（2×10⁵细胞/ml）培养在96孔微板（100μl/孔），并在37℃下孵育过夜。每孔加入不同浓度的人寡聚体和大鼠IAPP。每次测量重复四次。在37℃下孵育6小时后，使用溴化3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓（MTT）检测估计细胞活性。简要地说，每孔加入溶解在PBS中的5mg/ml MTT20μL。在37℃下孵育4小时后，每孔加入100μl提取缓冲液[溶解在50％二甲基甲酰胺和50％DDW的溶液中的20%SDS（pH值4.7）]，并将板子在37℃下再次孵育过夜。最后，使用ELISA板读数器在570nm测定颜色强度。

流式细胞仪细胞分选(FACS)检测：将与人IAPP寡聚体孵育的Rin-m细胞（5×10⁵细胞/ml）在37℃培养4小时（0.5μM、1μM和5μM的最终浓度）。用PBS缓冲液洗涤样品，然后用500μl的结合缓冲液再悬浮。将5μl的膜联蛋白（Annexin）V-FITC和10μl的碘化丙啶（膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒；MBL）加入样品。在室温下黑暗中孵育10分钟后，使用FACS Sort（Beckton Dickinson）分析样品，并使用CellQuest程序（Beckton Dickinson）分析结果。每次测量重复三次。FL1-H表示V-FITC的荧光和FL2-H表示膜联蛋白V-PE的荧光。

共聚焦显微镜：如在细胞的细胞毒性实验部分描述的，将Rin-m细胞培养在位于24孔微板的玻璃盖玻片上，然后在37℃下与hIAPP-Hiytelfluor488（Anaspec，美国）寡聚体（5μM）孵育不同周期。孵育后，用PBS缓冲液洗涤细胞并用在PBS中的4%低聚甲醛固定5分钟，然后用PBS缓冲液洗涤。在用PBS缓冲液充分洗涤后，用在PBS中的1%Triton x-100处理细胞，并用在PBS中的50μg/ml的鬼笔环肽四甲基-罗丹明B异硫氰酸酯（Sigma-Aldrich）在室温下染色40分钟。使用LSM510共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss Jena，德国）对细胞成像。

抗体纯化：通过蛋白A柱（GE healthcare）纯化来自三位健康人和三位II型糖尿病患者的血清（Bioreclamation，美国）的抗体。1ml的人血清用加样缓冲液（20mM Na₂HPO₄，2mM NaH₂PO₄pH=7）稀释为1:20，然后装填到5-ml蛋白A柱，收集流出并重装3次。结合的抗体用0.1M的柠檬酸（pH3.0）洗脱，然后用1M Tris盐酸（pH9.0）中和，向1ml洗脱液加入200μl Tris缓冲液。合并含蛋白质的流分，用2升PBS缓冲液透析（16h，4℃），使用Bradford试剂测定抗体浓度（Sigma-Aldrich）。

抗体识别检测：为了检查抗体识别，用多真空岐管将hIAPP寡聚体（5μg）涂覆到硝酸纤维素膜上。在室温下用在TBS-T（50mM tris，150mMNaCl pH=7.5与0.3%吐温80）中的5%牛奶封闭膜1小时后，用TBS简单洗涤膜，并室温下与几个浓度的纯化的抗体孵育2小时。然后，用TBS-T简单洗涤膜并与HRP-结合的驴抗人HRP抗体（Jackson immunoResearchlaboratories，美国）孵育。根据供应商的说明使用ECL试剂（NEN，美国）或3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）对膜显影。阳性对照用兔抗IAPP抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）进行。结合的抗体通过Scion图像密度测定软件（Scion Corporation，美国）定量。为了检查II型糖尿病抗体识别哪种聚集体，通过15%Tris-tricine PAGE分离hIAPP寡聚体并通过反式印迹半干转移细胞（Bio-Rad，美国）印迹在硝酸纤维素膜上。结合检测进行方法与5μg/ml抗体浓度的斑点印记检测相同。

抗体中和效果：在96孔微板（100μl/孔）中培养Rin-m细胞（2×10⁵细胞/ml）并在37℃下孵育过夜。将具有或不具有抗体的人寡聚体（5μM）加入到不同浓度的各个孔。每次测量重复4次；同时，在最高浓度进行只具有抗体的对照测量以反驳（refute）抗体对细胞生存能力的任何影响。在37℃下孵育6小时后，使用以上描述的溴化3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓（MTT）检测估计细胞生存能力。

结果

将冻干的hIAPP溶于1,1,1,3,3,3六氟-2-丙醇（HFIP）中以消除任何预先存在的结构，蒸发后将其再悬浮于0.2mM的NaOH中，并进一步在1％十二烷基硫酸钠（SDS）的磷酸盐缓冲液中稀释。SDS常用作离液序列高的（chaotrophic）试剂；但是，由于产生类膜环境可将SDS用于稳定淀粉样蛋白寡聚体。

为了确定形成的组装体的确切性质，本发明人使用多个互补（补充）方法分析了获得的蛋白质。首先，在非还原条件下使用PAGE分析，本发明人观察到三个主要组装种类：～3.9kDa的单体、～8kDa的二聚体和～12kDa的三聚体（图1）。作为阴性对照，分析了三个残基不同并且不自组装形成淀粉样蛋白结构³⁰的大鼠IAPP肽（rIAPP）。事实上，如所预料，只有rIAPP的单体构象被观察到（图1A）。一旦组装，寡聚体结构稳定7天，而不会明显去组装或进一步聚合为原纤维（图1B）。

此外，使用在生理条件下（PBS pH7.4）运行的快速液相色谱（FPLC）在更“自然”的条件下分析尺寸分布（图1C）。将样品装载到Superdex75HR10/300柱并使用校准曲线确定它们的分子量。使用此检测，与另外～90kDa的种类一起观察在先前的凝胶分析中观察到的三个种类。此构象在SDS-PAGE中可能是不稳定的并去组装为较小的多聚体。尺寸排阻色谱未显示较大的组装体的证据，这说明没有形成淀粉样蛋白原纤维。

通过透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）检查了寡聚体的形态（图1D）。使用这些方法仅可以检测到~90kDa的寡聚体。这些实验表明，存在非原纤维状聚集体，并且寡聚体具有在TEM中观察到的5-30nm直径的球形形态，以及由AFM测量的范围在8-35nm间的类似高度（Z轴）尺寸。通过在远紫外区（200-240nm）的圆二色分析（CD）进行二级结构测定（图1E）。CD光谱表明占优势的α-螺旋结构在222nm和208nm具有两个负峰。以相同的方式处理的rIAPP表现出较低的α-螺旋含量和较高的β-折叠和无规卷曲结构。重要的是，分析CD光谱显示没有指示淀粉样蛋白原纤维形成的β-折叠结构的证据。一些研究已经显示由于与生物膜相互作用hIAPP采取α-螺旋结构^27-28表明此构象在与β-细胞相互作用中的重要作用。所有这些数据表明，本发明人在他们尝试稳定可溶性IAPP构象中是成功的。这些寡聚体是稳定的并且具有使它们与成熟的淀粉样蛋白结构相区别的独特的物理性质。

淀粉样蛋白寡聚体被认为对胰腺细胞是有毒的并导致膜解体。为了检查新形成的构象是否确实是有毒的，使用一些补充的（complimentary）方法。如上面所提到的，一些研究已经表明淀粉样蛋白寡聚体通过在生物膜上形成分离的孔表现出毒性。为了检查hIAPP寡聚体是否以相同的方式作用，使用脂质体系统模拟细胞膜。用荧光盐（钙黄绿素钠）填充脂质体，并与hIAPP寡聚体（10μM，37℃）或作为阴性对照的rIAPP一起孵育（图2B）。的确，hIAPP寡聚体渗透脂质体的膜迅速导致荧光染料释放到介质，而rIAPP没有表现出任何膜破坏能力。这些结果表明，淀粉样蛋白纤维的形成对于通过hIAPP的膜破坏不是必须的，并由此暗示寡聚体作为毒性种类的关键作用。通过溴化3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓-甲臜检测（MTT检测）在不同浓度使用胰腺RIN-m细胞评估hIAPP寡聚体对细胞的毒性（图2A）。基于hIAPP寡聚体（100nM-10μM）的加入，MTT还原降低，表明细胞生存能力的剂量依赖性降低。用rIAPP处理的相同细胞没有表现出这样的效果，这再次指出hIAPP寡聚体作为主要的有毒种类。

为了进一步研究此细胞毒性，对胰腺Rin-M细胞系进行荧光活化细胞分选（FACS）分析（图2C）。主要在凋亡阶段的早期和晚期内发现用hIAPP寡聚体处理的细胞。可以观察到寡聚体浓度和凋亡的培养细胞的百分比间明确而强烈的相关性（图2D）。为了建立低聚物和β-细胞之间的物理相互作用；将hIAPP-Hiytelfluor488寡聚体孵育不同的时间段，并通过共聚焦显微镜分析（图3）。一小时后，在寡聚体插入细胞质后观察到寡聚体集中定位到细胞膜，其与细胞数量大规模下降有关。1小时后迅速观察此结果。8小时后观察动态细胞形态变化。这些结果再次强调寡聚体的细胞毒作用。由此，在体外和离体观察hIAPP寡聚体的作用。本发明人想要获得关于这些结构在更相关的生理环境中的相关性的进一步证据。为了实现这一目标，他们检查了他们是否能够鉴别识别来自T2D患者的hIAPP组装体的特异性抗体。为此目的，纯化来自三位T2D患者和3位健康个体的总抗体，并且比较了它们检测hIAPP寡聚体的能力。斑点印迹分析用于定量评估纯化的血清抗体对寡聚体的亲和性（图4A）。与从健康人血清中纯化的抗体相比，来自T2D患者的抗体对寡聚体表现出强烈的识别。在20μg/ml从T2D患者纯化的抗体表现出比那些从健康个体纯化的抗体更高的结合活性，较低的抗体浓度表明仅通过分离自T2D患者的抗体结合（图4A-4B）。

为了验证这些结果，以更大的样品数重复实验。本发明人纯化了来自20位个体的抗体，10位T2D患者和10位健康个体（每组由5位男性和5位女性组成）-患者详情请参见以下的表2。在5μg/ml检查每个样品的hIAPP寡聚体识别。通过3,3',5,5'四甲基联苯胺（TMB）试剂定量地评估抗体识别。如图4E中所示，与来自健康人血清的纯化的抗体相比T2D抗体表现出显著更高的识别性质，这表明T2D患者具有针对hIAPP组装体的特异性抗体。

表2

为了表明T2D患者抗体识别的构象确实是寡聚体一，使用PAGE分析和蛋白质印迹（Western-blot）分析研究hIAPP寡聚体。商用抗-IAPP抗体的阳性对照显示单体、二聚体、三聚体组装体：阴性对照的来自健康人T2D抗体的纯化抗体没有表现出任何结合活性。T2D患者的抗体特异性地识别寡聚体构象，但不识别单体形式（图4D）。

本发明人进一步测试了T2D相关的抗体是否可以减少hIAPP寡聚体的细胞毒素作用。用胰腺细胞在体外进行细胞活力实验（图4C）。如上所示，如通过MTT检测，在5μM寡聚体存在的条件下细胞活性显著降低。在T2D抗体存在下，hIAPP的寡聚体的毒性以剂量依赖的方式减少。用非T2D抗体进行了同样的分析，如预期的，这些抗体未表现出降低hIAPP寡聚体的细胞毒性的任何能力。

在导致细胞死亡和胰岛β-细胞大量损失的病理级联（pathologicalcascade）中，目前的结果为IAPP的寡聚体种类而不是IAPP的单体形式的作用提供了明确的证据。很显然，寡聚体组装体可能通过它们与细胞膜的相互作用诱导凋亡细胞死亡。来自人类患者的抗体与IAPP寡聚体强烈且特异地相互作用的能力清楚地表明，如所描述的形成的组装体表示存在于糖尿病患者内的有效表位。此外，这些抗体消除寡聚体种类的毒性活性的能力为用于治疗晚期T2D中β细胞大量损失（β-cell mass loss）的新的治疗方法铺平了道路。新鉴定和表征的种类可用作用于在主动免疫或被动免疫中产生免疫应答的表位。此外，这些种类可用作用于能够干扰寡聚体种类的毒性作用的小分子的筛选和优化的平台。

尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，显而易见的是，许多替换、修改和变化对本领域的技术人员将是显而易见的。因此，本发明旨在包含落入所附权利要求的精神和广阔范围的所有这样的替换、修改和变化。

以就像每一单独的出版物、专利或专利申请被专门地和单独地通过引用并入本文相同的程度，在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请以其全部内容通过引用并入本说明书。此外，在本申请中的任何参考的引用或识别不应被解释为承认这样的引用是可作为本发明的现有技术。就使用的小节标题来讲，它们不应该被解释必须的限制。

参考文献

1.Glabe,C.G.Common mechanisms of amyloid oligomer pathogenesis indegenerative disease.Neurobiol.Aging.27,570-575,(2006).

2.Selkoe,D.J.Folding proteins infatal ways.Nature426,900-904,(2003).

3.Hardy,J.&Selkoe,D.J.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease:progress and problems on the road to therapeutics.Science297,353-356,(2002).

4.Snowdon,D.A.Aging and Alzheimer's disease:lessonsfrom the NunStudy.Gerontologist37,150-156,(1997).

5.Lue,L.F.etal.Soluble amyloid beta peptide concentration as apredictor of synaptic change in Alzheimer's disease.Am.J.Pathol.155,853-862,(1999).

6.Walsh,D.M.etal.Naturally secreted oligomers of amyloid beta proteinpotently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.Nature416,535-539,(2002).

7.Cleary,J.P.etal.Natural oligomers of the amyloid-beta proteinspecifically disrupt cognitive function.Nat.Neurosci.8,79-84,(2005).

8.Lesne,S.etal.A specific amyloid-beta protein assembly in the brainimpairs memory.Nature440,352-357,(2006).

9.Lambert,M.P.etal.Diffusible,nonfibrillar ligands derivedfromAbeta1-42are potent central nervous system neurotoxins.Proc.Natl.Acad. Sci.USA.95,6448-6453,(1998).

10.Barghorn,S.etal.Globular amyloid beta-peptide oligomer-ahomogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease.J.Neurochem.95,834-847,(2005).

11.Caughey,B.&Lansbury,P.T.Protofibrils,pores,fibrils,andneurodegeneration:separating the responsible protein aggregates fromthe innocent bystanders.Annu.Rev.Neurosci.26,267-298,(2003).

12.Bucciantini,M.etal.Prefibrillar amyloid protein aggregates sharecommonfeatures of cytotoxicity.J. Biol.Chem.279,31374-31382,(2004).

13.Kautzky-Willer,A.etal.Role of islet amyloid polypeptide secretion ininsulin-resistant humans.Diabetologia37,188-194,(1994).

14.Matveyenko,A.V.&Butler,P.C.Relationship between beta-cell massand diabetes onset.Diabetes.Obes.Metab.1023-31,(2008).

15.Opie,E.L.The relation of diabetes mellitus to lesions of thepancreas,hyaline degeneration of the island of langerhans.J.Exp.Med.5,527–540.,(1901).

16.Clark,A.et al.Islet amyloid,increased A-cells,reducedβ-cells andexocrine fibrosis:quantitative changes in the pancreas in type2diabetes.Diabetes.Res.9,151-159,(1988).

17.Westermark,P.& Grimelius,L.The pancreatic islet cells in insularamyloidosis in human diabetic and non-diabetic adults.Acta.Pathol.Microbiol.Scand.81,291-300,(1973).

18.Cooper,G.J.et al.Purification and characterization of a peptidefromamyloid-rich pancreases of type2diabetic patients.Proc.Natl.Acad.Sci USA.84,8628-8632,(1987).

19.Westermark,P.,Wernstedt,C.,O'Brien,T.D.,Hayden,D.W.&Johnson,K.H.Islet amyloid in type2human diabetes mellitus and adultdiabetic cats contains a novel putative polypeptide hormone.Am.J.Pathol.127,414-417,(1987).

20.Westermark,P.,Wilander,E.,Westermark,G.T.&Johnson,K.H.Isletamyloid polypeptide-like immunoreactivity in the islet B cells of type2(non-insulin-dependent)diabetic and non-diabetic individuals.Diabetologia30,887-892,(1987).

21.Westermark,P.Fine structure of islets of Langerhans in insularamyloidosis.Virchows.Arch.A.Pathol.Pathol.Anat.359,1-18,(1973).

22.Janson,J.et al.Spontaneous diabetes mellitus in transgenic miceexpressing human islet amyloid polypeptide.Proc.Natl.Acad. Sci.U SA93,7283-7288,(1996).

23.Butler,A.E.,Janson,J.,Soeller,W.C.&Butler,P.C.Increasedβ-cellapoptosis prevents adaptive increase in beta-cell mass in mouse modelof type2diabetes:evidencefor role of islet amyloidformation ratherthan direct action of amyloid.Diabetes52,2304-2314,(2003).

24.Porat,Y.,Kolusheva,S.,Jelinek,R.&Gazit,E.The Human IsletAmyloid Polypeptide Forms Transient Membrane-Active PrefibrillarAssemblies.Biochemistry42,10971-10977,(2003).

25.Meier,J.J.etal.Inhibition of human IAPP fibrilformation does notprevent beta-cell death:evidencefor distinct actions of oligomers andfibrils of human IAPP.Am.J. Physiol.Endocrinol.Metab.291,E1317-1324,(2006).

26.Patil,S.M.,Xu,S.,Sheftic,S.R.&Alexandrescu,A.T.Dynamicalpha-helix structure of micelle-bound human amylin.J.Biol.Chem.284,11982-11991,(2009).

27.Apostolidou,M.,Jayasinghe,S.A.&Langen,R.Structure ofalpha-helical membrane-bound human islet amyloid polypeptide and itsimplicationsfor membrane-mediated misfolding.J.Biol.Chem.283,17205-17210,(2008).

28.Brender,J.R.et al.Amyloid fiberformation and membrane disruptionare separate processes localized in two distinct regions of IAPP,thetype-2-diabetes-related peptide.J. Am.Chem.Soc.130,6424-6429,(2008).

29.Wiltzius,J.J.,Sievers,S.A.,Sawaya,M.R.&Eisenberg,D.Atomicstructures of IAPP(amylin)fusions suggest a mechanismfor fibrillationand the role of insulin in the process.Protein.Sci.18,1521-1530,(2009).

30.Westermark,P.,Engstrom,U.,Johnson,K.H.,Westermark,G.T.&Betsholtz,C.Islet amyloid polypeptide:pinpointing amino acid residueslinked to amyloid fibrilformation.Proc.Natl.Acad. Sci.U SA87,5036-5040,(1990).。

Claims (30)

1.一种包含分离的人胰岛淀粉样多肽（IAPP）的寡聚体的物质组合物。

2.如权利要求1所述的物质组合物，其中所述寡聚体包含二聚体和/或三聚体。

3.如权利要求1所述的物质组合物，其中所述寡聚体具有4kDa到90kDa的分子量。

4.如权利要求1所述的物质组合物，其中所述组合物缺乏IAPP原纤维。

5.如权利要求1所述的物质组合物，进一步包含十二烷基硫酸钠（SDS）。

6.如权利要求1所述的物质组合物，其中所述寡聚体具有α-螺旋构象。

7.如权利要求1所述的物质组合物，其中所述寡聚体是交联的。

8.如权利要求1所述的物质组合物，其中所述寡聚体是未交联的。

9.如权利要求8所述的物质组合物，其中所述寡聚体由二聚体和/或三聚体组成。

10.如权利要求1所述的物质组合物，在多至7天是稳定的。

11.一种生成权利要求1所述的物质组合物的方法，所述方法包括：

（a）将人IAPP溶解在消除IAPP结构化形式的试剂中；

（b）去除所述试剂；

（c）将所述非结构化形式的IAPP再溶解在溶剂和阴离子表面活性剂中，由此产生权利要求1所述的物质组合物。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述试剂选自由1,1,1,3,3,3六氟-2-丙醇（HFIP）、三氟乙醇（TFE）、和三氟乙酸（TFA）组成的组。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述溶剂选自由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵和二甲亚砜组成的组。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述阴离子表面活性剂选自由十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂基硫酸铵、多库酯钠盐、N-月桂酰肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、己烷磺酸钠、鹅去氧胆酸、去氢胆酸、甘胆酸、脱氧胆酸钠组成的组。

15.一种分离的抗体，相比于人IAPP的原纤维，其以更高的亲和力结合于人胰岛淀粉样多肽（IAPP）的寡聚体。

16.如权利要求15所述的分离的抗体，连接到可识别部分。

17.如权利要求15所述的分离的抗体，是多克隆抗体。

18.如权利要求15所述的分离的抗体，是单克隆抗体。

19.一种药物组合物，包含作为活性成分的权利要求15所述的分离的抗体。

20.一种在生物样品中检测IAPP寡聚体的方法，所述方法包括：在允许形成免疫复合体的条件下用权利要求15或16所述的抗体接触所述生物样品，其中免疫复合体的存在高于预定阈值是所述生物样品中IAPP寡聚体的指示。

21.一种在需要其的受试者中诊断糖尿病的方法，所述方法包括：在所述受试者的生物样品中检测IAPP寡聚体，其中在所述生物样品中所述IAPP寡聚体的存在或水平高于预定阈值，是所述受试者中糖尿病的指示。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述检测使用权利要求15-18所述的抗体实现。

23.一种在需要其的受试者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括：给予所述受试者治疗有效量的试剂，所述试剂降低IAPP寡聚体的活性或量，由此治疗所述受试者的糖尿病。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述试剂是权利要求15、17或18所述的抗体。

25.一种鉴别对治疗糖尿病有用的试剂的方法，所述方法包括：用权利要求1所述的物质组合物接触所述试剂，其中所述寡聚体的量或活性的下调是对治疗糖尿病有用的试剂的指示。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述试剂是小分子或抗体。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述接触在细胞存在下进行。

28.一种疫苗，包含人IAPP的寡聚体和免疫学可接受的载体。

29.一种在需要其的受试者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括：给予所述受试者有效量的权利要求28所述的疫苗，由此治疗所述受试者的糖尿病。

30.一种在需要其的受试者中诊断糖尿病的方法，所述方法包括：在所述受试者的生物样品中检测识别IAPP寡聚体的抗体，其中在所述生物样品中所述抗体的存在或水平高于预定阈值，是所述受试者中糖尿病的指示。

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