MXPA06000176A

MXPA06000176A - Anticuerpos anti-ccr2 humanizados y sus metodos de uso.

Info

Publication number: MXPA06000176A
Application number: MXPA06000176A
Authority: MX
Inventors: Paul Ponath
Original assignee: Millennium Pharm Inc
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2003-12-10
Publication date: 2006-06-27
Also published as: AU2003300896A1; IL172533A0; EP2135619A1; EP1631311A4; IL172533A; CA2529694A1; WO2005060368A3; JP2007521248A; WO2005060368A2; EP1631311A2

Abstract

La presente invencion se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento funcional del mismo que se enlaza a un receptor 2 (CCR2) de CC-quimiocina de mamifero (por ejemplo, humano) o una porcion del receptor . La invencion ademas se refiere a un metodo para inhibir la interaccion de una celula portadora de CCR2 de mamifero con un ligando del mismo, y al uso de anticuerpos y fragmentos en metodos terapeuticos, profilacticos y de diagnostico.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CCR2 HUMANIZADOS Y SUS MÉTODOS DE USO Antecedentes de la invención En los últimos varios años se ha descrito una familia creciente de factores quimioatractantes/activadores de leucocitos, denominados quimioquinas (Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol . , 9:617-648 (1991); Schall y Bacon, Curr. Opin. Immunol., 6:865-873 (1994); Baggiolini, M. , et al., Adv. Imunol, 55:97-179 (1994)). Los miembros de esta familia son producidos y secretados por muchos tipos celulares en respuesta de mediadores inflamatorios tempranos tales como IL-1? o TNFQÍ. La superfamilia de quimioquinas comprende dos ramas principales : las cx-quimioquinas (o CXC quimioquinas) y las 3-quimioquinas (CC quimioquinas) . La rama de o;-quimioquinas incluye proteínas tales como IL-8, péptido activador de neutrófilos-2 (???-2) , actividad estimuladora de crecimiento de melanoma (MGSA/gro o GROa) , y ENA-78, cada una de los cuales tiene efectos de atracción y activación, predominantemente sobre neutrófilos . Los miembros de la rama de jS-quimioquina afectan otros tipos celulares tales como monolitos, linfocitos, basófilos y eosinófilos (Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M. , et al. Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller y Krangel . Crit. Rev. Immunol, 12:17-46 (1992); José, P. J. , et al, J.

Exp. Med. , 179:881-118 (1994); Ponath, P.D., et al . , J. Clin. Invest . , 97:604-612 (1996), e incluye proteínas tales como proteínas quimiotácticas de monolitos 1-4 (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP4 y MCP-S) , RANTES y proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-la, MJP-1/3) . Recientemente se ha identificado una nueva clase de quimioquinas ligadas a membrana denominadas quimioquinas CX3C (Bazan, J. F., et al., Nature 385:640-644 (1997)). Las quimioquinas pueden mediar un rango de efectos proinflamatorios en los leucocitos, tales como desencadenar quimiotaxis, desgranulación, síntesis de mediadores lipidíeos y activación de integrinas (Oppenheim, J. J. et al, Annu. Rev. Immunol . , 9:617-648 (1991); Baggiolini, M. et al, Adv. Imunol . , 55:97-179 (1994); Miller, M. D. y Krangel, M. S., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992)). Últimamente se ha demostrado que ciertas ß-quimioquinas suprimen la infección por HIV-1 de líneas celulares T humanas in vitro (Cocchi, F., et al., Science (Wash. DC) , 270:1811-1815 (1995)). Las quimioquinas se unen a 7 receptores acoplados a proteínas G transmembrana (7TMS) (Murphy, P.M., Annu. Rev. Immunol., 12:593-633 (1994)). Algunos receptores conocidos para CC o jS-quimioquinas incluyen CCR1, que se fija a MIP-la y RANTES (Neote, K. , et al., Cell, 72:415-425 (1993); Gao, J.

L., J. Exp. Med., 177:1421-1427 (1993)); CCR2 , que se une a quimioquinas tales como MCP-1, MCP-2, MCP-3 y MCP-4 (Charo, I.F., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:2752-2756 (1994); Myers, SJ., et al, J. Biol . Chem. , 270:57865792 (1995); Gong et al., J. Biol Chem 272:11682-11685 (1997); García-Zepeda et al., J. Immunol . 157:5613-5626 (1996)) ; CCR3, que se une a quimioquinas tales como eotaxina, RANTES y MCP-3 (Ponta, P. D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)); CCR4, que según se demostró, genera una señal en respuesta a MCP-1, ???-?a, y RANTES (Power, C. A, et al., J. Biol. Chem., 270:19495-19500 (1995)); y CCR5, que según se demostró, genera una señal en respuesta a MIP-la, MIP-13 y RANTES (Boring, L . , et al., J. Biol. Chem., 271 (13) : 7551-7558 (1996); Raport, C. J., J. Biol. Chem., 271:17161-17166 (1996); y Samson, M. et al., Biochemistry, 35:3362-3367 (1996) ) . CCR2 se expresa en la superficie de varios subconjuntos de leucocitos y aparece expresada en dos formas ligeramente diferentes (CCR2a y CCR2b) debido al ensamblado alternativo del mARN que codifica la región carboxi-terminal (Charo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2752-2756 (1994)) . MCP-1 actúa sobre monocitos, Iinfocitos y basófilos, induce quimiotaxis, liberación de gránulos, explosión respiratoria y liberación de histamina y citocina. Los estudios sugieren, que MCP-1 interviene en la patología de enfermedades tales como artritis reumatoidea, ateroesclerosis, enfermedades granulomatosas y esclerosis múltiple (Koch, J. Clin. Invest . 90:772-79 (1992); Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol . 97:451-457 (1994); Schwartz et al., Am. J. Cardiol 71(6):9B-14B (1993); Schimmer et al, J. Immunol. 160:1466-1471 (1998); Flory et al., Lab. Invest. 69:396-404 (1993); Gong et al., J. Exp. Med. 186:131-137 (1997)). Además, CCR2 puede actuar como correceptor en HIV (Connor et al., J. Exp. Med. 185:621-628 (1997) ) . En consecuencia, el antagonista de receptor de CCR2 puede representar una nueva clase de importantes agentes terapéuticos . Síntesis de la invención La presente invención se refiere a un anticuerpo o su fragmento funcional (p. ej . un fragmento fijador de antígeno) que se fija a un receptor de quimioquina CC de mamífero 2 (también denominado CCR2 , CKR-2, MCP-1RA o MCP-1RB) o porción del receptor (anti-CCR2) . En una forma de realización, el anticuerpo de la presente invención o su fragmento tiene especificidad por CCR2 humano o rhesus, o una de sus porciones. En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento de la invención bloquea la unión de un ligando (p. ej . , MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina) al receptor e inhibe la función asociada con la fijación del ligando al receptor (p. ej . , tránsito de leucocitos) . Por ejemplo, tal como se describe en la presente, los anticuerpos y sus fragmentos de la presente invención que se unen a CCR2 humano o rhesus, o una de sus porciones, pueden bloquear la unión de una quimioquina (p. ej . , MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-S, eotaxina) al receptor e inhibir la función asociada con la unión de la quimioquina al receptor. En una forma de realización, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal ( Ab) LS132.1D9 (1D9) de un anticuerpo que puede competir con 1D9 para unirse a CCR2 humano de una porción de CCR2 humano. También se contemplan los fragmentos funcionales de los anticuerpos anteriores . En otra forma de realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención se une a CCR2 humano o una de sus porciones e inhibe la unión del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) al receptor, por lo que inhibe la función asociada con la unión de HIV al receptor (p. ej . , liberación de antígeno HIV e infectividad) . En una forma de realización, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal 1D9 o un anticuerpo capaz de competir con 1D9 para la unión a CCR2 humano o una porción de CCR2 humano .

La presente invención también se refiere a un anticuerpo o su fragmento funcional ( . ej . , un fragmento fij ador de antígeno) que se uno al CCR2 mamífero o porción del receptor y provee mayor intensidad de tinción fluorescente de las CCR2 o las composiciones que comprenden CCR2 , respecto de otros anticuerpos anti-CCR2. En una forma de realización, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal 1D9 o LS132.802 (8G2) o un anticuerpo capaz de competir con 1D9 o 8G2 para la unión de CCR2 humano o una porción de CCR2 humano. La presente invención también se refiere a inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno, con especificidad de unión por CCR2 , en donde dicha inmunoglobulina comprende una región fijadora de antígeno de origen no humano (p . ej . , roedor) y al menos una porción de una inmunoglobulina de origen humano (p. ej . , una región de marco de origen humano, una región constante humana de tipo gamma) . En una forma de realización, la inmunoglobulina humanizada o su fragmento descrita en la presente puede competir con 1D9 por la unión de CCR2. En una forma de realización de preferencia, la región fijadora de antígeno de la inmunoglobulina humanizada deriva de anticuerpo monoclonal 1D9 (p. ej . , una inmunoglobulina que comprende las regiones variables de las cadenas liviana y pesada, como se muestra en la Figura 7 (SEC ID NO: 9) y la Figura 8 (SEC ID NO: 10), respectivamente) . En algunas formas de realización, la inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno también pueden incluir la totalidad o una porción de una región constante de origen humano, p. ej . , la totalidad o una porción de la región constante de la cadena pesada humana y/o la región constante de la cadena liviana humana. En algunas formas de realización, la inmunoglobulina humanizada o su porción fijadora de antígeno puede incluir la totalidad o una porción de la región constante humana con una o más mutaciones, p. e . , una o más mutaciones que reducen la unión a receptores Fe y/o la capacidad para fijar complemento. Por ejemplo, la región constante humana o porción de ella puede ser una región constante de cadena pesada, p. ej . , una región constante de cadena pesada gamma, o porción de ella que incluye una mutación en los residuos 235 y 237 de la región constante gamma humana. La mutación en el residuo 235 puede ser de leucina a alanina. La mutación en el residuo 237 puede ser de glicina a alanina. En una forma de realización, la inmunoglobulina humanizada incluye la totalidad o una porción de la región constante de la cadena pesada de SEC ID NO: 110 y/o una región constante de cadena liviana de SEC ID NO: 112.

La ínmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno pueden comprender una región fijadora de antigeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de origen no humano, y una región marco (FR) derivada de una región marco humana. En un aspecto, la Ínmunoglobulina humanizada con especificidad de unión por CCR2 comprende una cadena liviana que comprende al menos un CDR derivado de un anticuerpo de origen no humano que fija CCR2 y una FR derivada de una cadena liviana de origen humano (p . ej . , de HF-21128) , y una cadena pesada que comprende un CDR derivado de un anticuerpo de origen no humano que fija CCR2 y una FR derivada de una cadena pesada de origen humano (p. ej . , de 4B ' CL) . En otro aspecto, la cadena liviana comprende tres CDR derivados de la cadena del anticuerpo 1D9, y la cadena pesada comprende tres CDR derivados de la cadena pesada del anticuerpo 1D9. En algunas formas de realización, la Ínmunoglobulina humanizada también incluye la totalidad o una porción de la región constante de la cadena pesada de SEC ID NO: 110 y/o una región constante de cadena liviana de SEC ID NO: 112. La presente invención también se refiere a cadenas livianas de Ínmunoglobulina humanizada y su fragmento fijador de antígeno (p. ej . , que comprenden CDRl, CDR2 y CDR3 de las cadenas livianas del anticuerpo 1D9 y un FR de cadena liviana humana) , y a cadenas pesadas de inmunoglobulina humanizada y sus fragmentos fijadores de antxgeno (p. ej . , que comprenden CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo 1D9, y una FR de cadena pesada humana) . En una forma de realización de preferencia, la invención se refiere a cadenas pesadas y livianas humanizadas descritas en la presente (p. ej . , una cadena liviana humanizada que comprende la región variable de la cadena liviana mostrada en la Figura 7 (SEC ID NO: 9), una cadena pesada humana que comprende la región variable de la cadena pesada que se muestra en la Figura 8 (SEC ID NO: 10) . También se abarcan las inmunoglobulinas humanizadas que comprenden una o más cadenas livianas y/o pesadas humanizadas . La presente invención también se refiere a una de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno, con especificidad de unión por CCR2, que comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde dicha cadena liviana comprende al menos una región determinante de complementariedad derivada de anticuerpo 1D9 monoclonal murino y una región marco derivada de la cadena liviana de anticuerpo humano HF-21/28, y en donde dicha cadena pesada comprende al menos una región determinante de complementariedad derivada de anticuerpo monoclonal 1D9 murino y una región marco derivada de la cadena pesada de anticuerpo humano 4B4'CL. En una forma de realización, la cadena liviana comprende tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena liviana del anticuerpo 1D9, y la cadena pesada comprende tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena pesada del anticuerpo 1D9. En otra forma de realización, las regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena liviana de 1D9 son los aminoácidos 24-39 de SEC ID NO: 9, los aminoácidos 55-61 de SEC ID NO: 9 y los aminoácidos 94-102 de SEC ID NO: 9, y las regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena pesada de 1D9 son los aminoácidos 31-35 de SEC ID NO: 10, los aminoácidos 50-68 de SEC ID NO: 10 y los aminoácidos 101-106 de SEC ID NO: 10, En algunas formas de realización, la inmunoglobulina humanizada también incluye la totalidad o una porción de la región constante de la cadena pesada de SEC ID NO: 110 y/o una región constante de la cadena liviana de SEC ID NO: 112. La invención también se refiere a una inmunoglobulina o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena liviana y una cadena pesada complementaria, en donde dicha cadena liviana comprende una región variable que comprende SEC ID NO: 12. En algunas formas de realización, la cadena liviana también puede incluir la totalidad o una porción de la región constante de una cadena liviana de origen humano, p. ej . , la región constante de la cadena liviana kappa de origen humano. De preferencia, la región constante de la cadena liviana incluye la totalidad o una porción de la región constante de la cadena liviana SEC ID NO: 112. La invención también se refiere a una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena pesada y una cadena liviana complementaria, en donde dicha cadena pesada comprende una región variable que comprende SEC ID NO: 17. En algunas formas de realización, la cadena pesada también puede incluir la totalidad o una porción de una región constante de una cadena pesada de origen humano, p. ej . , la región constante de una cadena pesada gamma de origen humano. De preferencia, la región constante de la cadena pesada incluye la totalidad o una porción de la región constante de la cadena pesada de SEC ID NO: 110, En una forma de realización de preferencia, la invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena pesada y una cadena liviana, en donde dicha cadena liviana comprende una región variable que comprende SEC ID NO: 12 y en donde dicha cadena pesada comprende una región variable que comprende SEC ID NO: 17. En otras formas de realización de preferencia, la invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno con una cadena liviana y una cadena pesada, en donde la cadena liviana incluye una región variable que comprende SEC ID NO: 12 y una región constante que comprenden la totalidad o una porción de SEC ID NO: 112 y en donde la cadena pesada incluye una región variable que comprende SEC ID NO: 17 y una región constante que comprende la totalidad o una porción de SEC ID NO: 110, En una forma de realización, la inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno puede competir con el anticuerpo 1D9 murino por la unión a CCR2. En otra forma de realización, inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno inhibe la unión de un ligando a CCR2. En algunas formas de realización, la inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno incluye al menos dos cadenas livianas y al menos dos cadenas pesadas . La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una inmunoglobulina humanizada de la presente invención (p. ej . , un anticuerpo de cadena única), además de moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada (p. ej., una secuencia que codifica una región variable de cadena liviana que comprende SEC ID NO: 109 o SEC ID NO: 98 y/o una secuencia que codifica una región constante de cadena liviana que comprende SEC ID NO: 113. SEC ID NO: 117, o sus porciones) o de cadena pesada (p. ej . , una secuencia que codifica una región variable de una cadena liviana que comprende SEC ID NO: 108 o SEC ID NO: 97 y/o una secuencia que codifica una región constante de cadena pesada de SEC ID NO: 111, SEC ID NO: 115, o sus porciones) de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención provee un ácido nucleico (p. ej . , un ácido nucleico fusionado) que codifica una cadena liviana o una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región fijadora de antígeno derivada de anticuerpo monoclonal 1D9 murino y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina de origen humano. En una forma de realización, la invención provee un ácido nucleico (p. ej . , un ácido nucleico fusionado) que codifica una cadena liviana humanizada que incluye un primer ácido nucleico que comprende SEC ID NO: 109 y un segundo ácido nucleico que comprende SEC ID NO : 113 o una de sus porciones . En otra forma de realización, la invención provee un ácido nucleico (p. ej . , un ácido nucleico fusionado) que codifica una cadena pesada humanizada que incluye un primer ácido nucleico que comprende SEC ID NO: 108 y un segundo ácido nucleico que comprende SEC ID NO: 111 o su porción. La invención también se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una inmunoglobulina humanizada de la presente invención (p. ej . , un anticuerpo de cadena única), además de moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden a secuencia que codifica una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada (p. ej . , una secuencia que codifica una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, 13, 14, o 15 y/o una secuencia que codifica un aminoácido de SEC ID NO: 111, 116 o sus porciones) o una cadena pesada (p. ej . , una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 17, 18, 19 y/o 20, y/o una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 110, 114 o sus porciones .

La presente invención también se refiere a una construcción que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina inmunizada con especificidad de unión para CCR2 o una cadena de dicha inmunoglobulina. Por ejemplo, se provee un vector de expresión que comprende un gen (p. ej . , un gen fusionado) que codifica una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de una cadena liviana de un anticuerpo no humano con especificidad de unión para CCR2 , y una región de marco derivado de una cadena liviana de origen humano. Un vector de expresión que comprende un gene que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de una cadena pesada de un anticuerpo no humano con especificidad de unión para CCR2, y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano es otro ejemplo de dicha construcción. En una forma de realización, el vector de expresión puede incluir un ácido nucleico que codifica una cadena liviana que incluye una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región variable de cadena liviana, p. ej . , SEC ID NO: 109, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena liviana, p. ej . , SEC ID NO: 113 o una de sus porciones. En otra forma de realización, el vector de expresión puede incluir un ácido nucleico que codifica una cadena pesada que incluye una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región variable de cadena pesada, p. ej . , SEC ID NO: 108, y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región constante de cadena pesada, p. ej . , SEC ID NO: 111 o una de sus porciones. En algunas formas de realización, el vector de expresión puede incluir un ácido nucleico que codifica una cadena liviana como la descrita en la presente, y un ácido nucleico que codifica una cadena pesada como la descrita en la presente. En algunas formas de realización, el vector de expresión expresa una cadena liviana (p. ej . , una región variable de cadena liviana de SEC ID NO: 12 y/o una región constante de cadena pesada de SEC ID NO: 112 o una de sus porciones) y/o una cadena pesada (p. ej . , una región variable de pesada de SEC ID NO: 17 y/o una región constante de cadena pesada de SEC ID NO: 110 o una de sus porciones) . El ácido nucleico que codifica una o más de la región variable de la cadena liviana, la región constante de la cadena liviana, la región variable de la cadena pesada y la región constante de la cadena pesada también pueden incluir otras secuencias de uno o más de los extremos 5' o 3' (p. ej . , un sitio de enzima de restricción y/o una secuencia flanqueadora) que, insertada adecuadamente en el vector, no codifica aminoácidos expresados como parte del polipéptido. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nos : 98, 117, 97 y 115 incluyen secuencias adicionales no expresadas como parte del polipéptido. La presente invención también se refiere a una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención, incluso una o más construcciones que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención. En una forma de realización, la invención se refiere a una célula huésped que comprende un primer ácido nucleico recombinante que codifica una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, y un segundo ácido nucleico recombinante que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, en donde dicho primer ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de la cadena liviana de anticuerpo 1D9 murino y una región marco derivada de una cadena liviana de origen humano; y en donde dicho segundo ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de la cadena pesada de anticuerpo 1D9 murino y una región marco derivada de una cadena pesada de origen humano . En una forma de realización, la célula huésped incluye un ácido nucleico que codifica una cadena liviana que incluye una primera secuencia que codifica una región variable de cadena liviana, p. ej . , SEC ID NO: 109, y una segunda secuencia que codifica a una región constante de cadena liviana, p. ej . , SEC ID NO: 113 o una de sus porciones. En otra forma de realización, la célula huésped incluye una ácido nucleico que codifica una cadena pesada que incluye una primera secuencia que codifica una región variable de cadena pesada, p. ej . , SEC ID NO: 108, y una segunda secuencia que codifica una región constante de cadena pesada, p. ej . , SEC ID NO: 111 o una de sus porciones. En formas de realización de preferencia, La célula huésped incluye un ácido nucleico que codifica una cadena liviana descrita en la presente y un ácido nucleico que codifica una cadena pesada descrita en la presente. La presente invención también provee un método para preparar una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento fijador de antígeno, que comprende mantener una célula huésped de la presente invención en condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina humanizada, por lo cual se expresa (n) la(s) cadena (s) de una inmunoglobulina humanizada y se produce una inmunoglobulina humanizada o el fragmento fijador de antigeno. El método también puede comprender el paso de aislar la inmunoglobulina humanizada.

Las inmunoglobulinas humanizadas, y los fragmentos fijadores de antigeno de la presente invención pueden ser menos inmunogénicos que sus contrapartidas murinas u otras no humanas. En consecuencia, las inmunoglobulinas humanizadas y sus fragmentos fijadores de antígeno, descritos en la presente se pueden usar como agentes terapéuticos en humanos, por ejemplo para controlar la localización de linfocitos en los tejidos linfoides de la mucosa, y así reducir las respuestas inflamatorias . La invención también se refiere a una inmunoglobulina humanizada de la presente invención para su uso diagnóstico o terapéutico (incluso preventivo) . En una forma de realización, la invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada, o su fragmento fijador de antígeno, de la presente invención, para el uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con infiltración leucocitaria de tejidos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, rechazo de injertos, infección por HIV y trastornos mediados por monocitos tales como ateroesclerosis . En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una inmunoglobulina humanizada, o su fragmento fijador de antígeno, de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la infiltración leucocitaria de tejidos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, trastornos mediados por monocitos tales como ateroesclerosis, rechazo de injertos, o infección por HIV. La presente invención también se refiere a un método para inhibir la interacción de una célula portadora de CCR2 de mamífero (p. ej . , humano, primate no humano o murino) con uno de sus ligandos, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional, que se uno a un CCR2 de mamífero o porción de CCR2 , p. ej . , un anticuerpo o su fragmento fijador de antígeno descrito en la presente. Las células adecuadas incluyen granulocitos , leucocitos tales como monocitos, macrófagos, basófilos y eosinófilos, mastocitos, y linfocitos incluso células T (p. ej . , células CD8+ , células CD4+ , células CD25+, células CD45RO+) , y otras células que expresan CCR2, tales como células recombinantes que expresan CCR2 (p. ej . , células transfectadas) . En una forma de realización particular, el anticuerpo es 1D9 o un anticuerpo capaz de competir con 1D9 por la unión a CCR2 humano o una porción de CCR2 humano.

Otra forma de realización de la invención se refiere a un método para inhibir la interacción de una célula portadora de CCR2 de mamífero con una quimioquina, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, que se fija a CCR2 o a una de las porciones de dicho receptor, p. ej . , un anticuerpo o fragmento funcional descrito en la presente. En una forma de realización del método, el anticuerpo o su fragmento funcional es cualquiera de 1D9, un fragmento fijador de antígeno de 1D9 o un anticuerpo o su fragmento con especificidad de epitopo igual o similar al de 1D9. Además, la invención se refiere a un método para inhibir una función asociada con la unión de una quimioquina a CCR2, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional, que se fija a una proteína CCR2 de mamífero o una porción de dicho receptor, p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente. En un aspecto del método, el anticuerpo o su fragmento funcional es cualquiera o varios de 1D9, un fragmento fijador de antígeno de 1D9 o un anticuerpo o su fragmento con especificidad de epitopo igual o similar a 1D9. Otro aspecto de la invención es un método para la identificación de la expresión de un CCR2 de mamífero o porción del receptor por una célula. De acuerdo con el método, una composición que comprende una célula o una de sus fracciones (p. ej . , una fracción de membrana) se pone en contacto con un anticuerpo o su fragmento funcional (p . ej . , 1D9 o 8G2) que se fija a una proteína CCR2 de mamífero o una porción del receptor, p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente, en condiciones apropiadas para fijar el anticuerpo, y se detecta la formación de un complejo entre dicho anticuerpo o fragmento y dicha proteína o su porción. La detección del complejo indica, en forma directa o indirecta, la presencia del receptor en la célula. La presente invención también se refiere a un equipo que se usa para detectar la presencia de CCR2 o una de sus porciones en una muestra biológica, que comprende un anticuerpo o su fragmento funcional, que se fija a un receptor CC-quimioquina 2 de mamífero o una porción de dicho receptor, p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente, y uno o más reactivos auxiliares adecuado para detectar la presencia de un complejo entre dicho anticuerpo o fragmento y dicha proteína o porción de ella. También se abarcan en la presente invención métodos para identificar ligandos adicionales u otras sustancias que se unen a una proteína CCR2 de mamífero, incluso inhibidores y/o promotores de la función de CCR2 en mamíferos. Por ejemplo, los agentes con especificidad de unión igual o similar a la del anticuerpo de la presente invención o su fragmento funcional que se puede identificar mediante un ensayo de competencia con dicho anticuerpo o fragmento. En consecuencia, la presente invención también abarca métodos para identificar ligandos u otras sustancias que fijan el receptor CCR2 , incluso inhibidores (p. ej . , antagonistas) o promotores (p. ej . , agonistas) de la función del receptor. En una forma de realización, se usan células que expresan naturalmente la proteína de receptor CCR2 o las células huésped adecuadas que fueron sometidas a ingeniería para expresar un receptor CCR2 o variante codificado por un ácido nucleico introducido en dichas células en un ensayo para identificar y evaluar la eficacia de los ligandos, inhibidores o promotores de la función de receptor. Dichas células también son útiles para evaluar la función de la proteína o polipéptido expresados del receptor. En consecuencia, la invención también se refiere a un método para detectar o identificar un agente que se fija a un CCR2 de mamífero o variante fijadora de ligando que comprende combinar un agente que se desea analizar, un anticuerpo o fragmento fijador de antígeno de la presente invención (p. ej . , anticuerpo monoclonal 1D9, un anticuerpo con especificidad de epitopo igual o similar al de 1D9, fragmentos fijadores de antígeno 1D9, anticuerpo monoclonal 8G2, un anticuerpo con especificidad de epitopo igual o similar al de 8G2, y fragmento fijador de antígenos de 8G2) y una composición que comprende una proteína CCR2 de mamífero o una de sus variantes fijadoras de ligando. Los anteriores componentes se pueden combinar en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo o fragmento fijador de antígeno a una proteína CCR2 de mamífero o una de sus variantes fijadoras de ligando y se detecta o mide la unión del anticuerpo o fragmento de la proteína de mamífero CCR2 o variante fijadora de ligando, en forma directa o indirecta, de acuerdo con los métodos descritos en la presente u otros métodos adecuados. Una disminución de la cantidad de complejo formada respecto de un control adecuado (p. ej . , en ausencia del agente estudiado) indica que el agente fija dicho receptor o variante. La composición que comprende una proteína CCR2 de mamífero o su variante fijadora de ligando puede ser una fracción de membrana de una célula portadora de proteína CCR2 recombinante o su variante fijadora de ligando. El anticuerpo o su fragmento se pueden rotular con un rótulo tal como un radioisótopo, un rótulo spin, un rótulo de antígeno, un rótulo de enzima, un grupo fluorescente y un grupo quimioluminiscente . Se pueden usar este y ensayos similares para detectar agentes, incluso ligandos (p. ej . , quimioquinas que interactúan con CCR2) u otras sustancias, incluso inhibidores o promotores de la función de receptor, que se puede fijar a CC 2 y competir con los anticuerpos descritos en la presente para la unión al receptor. De acuerdo con la presente invención, se pueden identificar ligandos, inhibidores o promotores de la función en un ensayo adecuado, y también evaluar su efecto terapéutico. Los inhibidores de la función de receptor se pueden usar para inhibir (reducir o prevenir) la actividad del receptor, y se pueden usar los ligandos y/o promotores para inducir (desencadenar o aumentar) la función normal del receptor, cuando corresponde. La presente invención también provee un método para tratar enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, ateroesclerosis, y rechazo de injertos, o infección por HIV, que comprende administrar un inhibidor de la función de receptor (p. ej . , unión de quimioquina o fijador de HIV) a un individuo (p. ej . , un mamífero, tal como un humano) . La presente invención también provee un método para estimular la función del receptor al administrar un nuevo novel ligando o promotor a un individuo, y proporcionar un nuevo enfoque a la estimulación selectiva de la función leucocitaria, de utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para inhibir una infección por HIV en una célula que expresa un CCR2 de mamífero o su porción, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional que se une a un CCR2 de mamífero o la porción del receptor (p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente) e inhibe la unión de HIV y la infección. En una forma de realización particular de la invención, el anticuerpo o su fragmento funcional es cualquiera de 1D9, un anticuerpo con especificidad de epitopo igual o similar a 1D9, un anticuerpo capaz de competir con 1D9 por la unión de CCR2 humano, y sus fragmentos fijadores de antígeno. También se abarca en la presente invención un método para inhibir (p. ej . , tratar) HIV en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional, que se une a un CCR2 de mamífero o una porción de dicho receptor (p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente) e inhibe la unión de HIV al receptor CCR2. El anticuerpo anti-CCR2 o fragmento se. puede administrar solo o en combinación con uno a más agentes terapéuticos adicionales, p. ej . , uno o más anticuerpos que se unen a un correceptor para la infección por HIV e inhibe la unión a dicho correceptor, tal como un anticuerpo anti-CCR3, anti-CCR5 y/o anti-CXCR4. Otro aspecto de la invención también se refiere a un método para prevenir o inhibir la infección por HIV en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional, que se une a CCR2 (p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente) e inhibir la unión de HIV a CCR2. De acuerdo con el método, prevenir la infección por HIV incluye un tratamiento para prevenir (reducir o eliminar) la infección de nuevas células en un individuo infectado, a fin de prevenir la infección en un individuo que puede estar, pueda haber estado o ha estado expuesto a HIV. Por ejemplo, se pueden tratar los individuos tales como un individuo infectado por HIV, un feto de una mujer infectada por HIV, o un profesional de la salud de acuerdo con el método de la presente invención. La presente invención también abarca un método para inhibir el tránsito de leucocitos en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional, que se une a un CCR2 de mamífero o una porción de dicho receptor (p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente) e inhibe la función asociada con la unión de un ligando al receptor. La presente invención también se refiere a un método para inhibir o tratar trastornos mediados por CCR2 , tales como trastornos inflamatorios, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional, que se une a un CCR2 de mamífero o una porción de dicho receptor (p. ej . , un anticuerpo o su fragmento funcional descrito en la presente) e inhibe la función mediada por CCR2. Por ejemplo, la invención se refiere a un método para inhibir o tratar la estenosis o restenosis de la vasculatura, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento funcional, que se une a un CCR2 de mamífero o una porción de dicho receptor e inhibe la función mediada por CCR2. La presente invención también se refiere a un anticuerpo o su fragmento, como se describe en la presente (p. ej . , un anticuerpo 1D9 monoclonal humanizado o su fragmento fijador de antígeno) para el uso terapéutico (incluso preventivo) o diagnóstico, y el uso de dicho anticuerpo o fragmento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno mediado por CCR2 u otra enfermedad o condición inflamatoria como se describe en la presente. También se incluye en la invención las cadenas pesadas o livianas de inmunoglobulinas o sus fragmentos, de cualquier anticuerpo o inmunoglobulina descritos en la presente. También se pueden incluir los ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos o inmunoglobulinas, o sus fragmentos, vectores, y las células transformadas por los vectores. .Breve descripción de las figuras Las Figuras 1A-10 son perfiles de histogramas de escaneo de células activadas por fluorescencia (FACS) para ilustrar que mAbs 1D9 y 802 tiñen los transfectantes CCR2, pero no los transfectantes CCR5 o CCR1. Las células huésped de linforna pre B murino Ll/2 (también denominado L1.2 en la presente) se transfectan con CCR2, CCR5 y CCR1 tal como se indica, y se tiñen con anticuerpos de distintas especificidades de receptor. Las tinciones se analizaron por citometría de fluj o . Las figuras 2A-2L son gráficos de puntos FACS que muestran la expresión de CCR2 en la mayoría de los monocitos, una subpoblación de linfocitos y un pequeño subconjunto de granulocitos . Las células de sangre entera se tiñeron con uno de tres mAba anti-CCR2 (5A11, generado mediante un péptido que consiste en los primeros 32 aminoácidos del amino-terminal de CCR2 como inmunógeno, y 1D9 y 8G2 generados como se describe en la presente con transíectantes de células Ll/2 de CCR2b como el inmunógeno) . La tinción se analizó por citometría de flujo, y la población de linfocitos, granulocitos y monolitos se estudiaron mediante el dispersor de luz frontal y lateral. El eje X representa la dispersión de luz hacia adelante (una medida del tamaño de la célula) , y el eje Y mide la intensidad de la fluorescencia de la tinción para CCR2. El nivel de tinción de control negativo se indica con una línea. Las figuras 3A-3I son gráficos de puntos FACS que muestra las tinciones mAb 1D9 de una población positiva para IgG en sangre periférica (basófilos) mediante tinción de dos colores para IgG y CCR2. Las células de sangre entera se colorearon primero con un control negativo de anticuerpo (anti-Flag) , un anticuerpo 1D9 anti-CCR2, o un anticuerpo anti-CXCRl, como se indica, y se detecta mediante un conjugado FITC antirratón. Se realizó una segunda tinción con PBS o un anticuerpo biotinilado específico para IgG o CD16, según se indica, y se detecta con estreptavidina-ficoeritrina . La tinción se analizó por citometría de flujo.

La Figura 4 ilustra que mAb 1D9 inhibe la unión de

[1251] MCP-1 a las membranas de células THP-l. Se incubaron 3,0 /¿g de proteína de membrana THP-l con 0,1 nM de

[1251] MCP-1 en presencia de diversas concentraciones de 1D9 o del anticuerpo 1C6 anti-CXCR3 que coincide por isotipo. La cantidad de trazador ligado se determinó por separación de la parte libre de la ligada por filtración y recuento por centelleo. Los datos se analizaron para determinar el valor ICS0 por regresión no lineal con ecuación logística de 4 parámetros con software KaleidaGraph. La Figura 5 ilustra que mAb 1D9 inhibe la unión de

[1251] MCP-1 a PBMC humano fresco. Se incubaron células mononucleares de sangre periférica recién aisladas (500.000) con 0,1 nM de

[1251] MCP-1 en la presencia de diversas concentraciones de 1D9 o del anticuerpo 1C6 anti-CXCR3 que coincide por isotipo. La cantidad de trazador ligado se determinó por separación de la parte ligada de la libre por filtración y recuento por centelleo. Los datos se analizaron para determinar el valor de IC50 como en la Figura 4. Las figuras 6A y 6B son gráficos que demuestran que mAb 1D9 inhibe la quimiotaxis inducida por MCP-1, pero no la quiomiotaxis inducida por RANTES, o PBMC fresco. La Figura 6A muestra los resultados de los ensayos de quimiotaxis de PBMC a 10 nM de MCP-1 sin anticuerpo, o 0,1 de 10 µg/ml de 1D9 o IgG2a no específico murino. También se indica la migración no específica espontánea. La Figura 6B muestra los resultados de los ensayos de quimiotaxis de PBMC a 10 nM de RANTES sin anticuerpo, 10 µg/ml de 1D9 o 10 /xg/ml de IgG2a no específico murino. También se indica la migración espontánea no específica en ausencia de RANTES . La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 9) de la región variable de la cadena liviana kappa del anticuerpo 1D9 murino. Los CDR se destacan con negrita. La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 10) de la región variable de la cadena pesada de los anticuerpo 1D9 murinos . Los CDR se destacan con negrita. La Figura 9 ilustra las clases canónicas de CDR en la región 1D9 VK murina. "Clases canónicas de Chothia" indica cuando se definen las clases canónicas definidas por Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . 197:901 (1987); Chothia et al., Nature 34:877 (1989); Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990); y Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992)), cuando se usan, mientras que "Clases canónicas de Martin" significa cuando se definen las clases canónicas definidas por Martin y Thornton (Martin y Thornton, J. Mol. Biol. 263:800 (1996), cuando se usan. Los residuos FR se destacan con negrita. La Figura 10 ilustra clases canónicas de CDR en la región 1D9 VH murina. "Clases canónicas de Chothia" indica cuando se definen las clases canónicas como lo definen Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 197:901 (1987); y Chothia et al., Nature 34:877 (1989); Tramontano et at . , J. Mol. Biol. 215:175 (1990); y Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992)), cuando se usan, mientras que "Clases canónicas de Martin" significa cuando se definen las clases canónicas definidas por Martin y Thornton (Martin y Thornton, J. Mol. Biol. 263:800 (1996), cuando se usan. Los residuos FR se destacan con negrita. La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de diversas versiones de la región 1D9 VK humanizada (SEC ID NOS: 12-15 y 107, respectivamente) . Cuando coinciden los residuos de la región 1D9 VK (SEC ID NO: 9) y las secuencias de la región HF-21/28 VK humana (SEC ID NO: 11) , se muestra un punto [ . ] . Cuando no hay aminoácidos presentes en una posición especifica del residuo, se muestra una raya [-] . Cuando se modifica un aminoácido en las FR de HF-21/28 de la región 1D9 VK humanizada, se destaca en negrita. Los CDR se describen mediante el uso de la nomenclatura [=L1=] . La numeración utilizada es de acuerdo con Kabat et al, Seguences of proteins of immunological interest, 5.° edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Imprenta del Gobierno de los Estados Unidos (1991) . La Figura 12 muestra las secuencias de aminoácidos de diversas versiones de la región 1D9 VH humanizada (SEC ID NOS: 17-20, respectivamente) . Cuando coinciden los residuos de la región 1D9 VH (SEC ID NO: 10) y las secuencias de la región 4B4 ' CL VH humana (SEC ID NO : 16) se muestra un punto [ . ] . Cuando no hay aminoácidos presentes en una posición especifica del residuo, se muestra una raya [-] . Cuando se modifica un aminoácido en las 4B41 CL de la región 1D9 VH humanizada, se destaca en negrita. Los CDR se describen mediante el uso de la nomenclatura [=L1=] . La numeración utilizada es de acuerdo con Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest, 5.° edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Imprenta del Gobierno de los Estados Unidos (1991) . La Figura 13 muestra una comparación de una porción de la región 1D9 VK murina (SEC ID NO: 21) con secuencias de genes VK de línea germinal de ratones (SEC ID NOS: 22-33, respectivamente) . "Residuos idénticos 1 ' representan la cantidad de residuos idénticos en una región VK de línea germinal murina con la región 1D9 VK. Cuando coinciden la secuencia de la región 1D9 VK y la secuencia de la región VK de la línea germinal de ratón se muestra un punto [.] . Cuando no hay aminoácidos presentes en una posición específica del residuo, se muestra una raya [-] . La Figura 14 muestra una comparación de una porción de la región 1D9 VH murina (SEC ID NO: 34) con secuencias de genes VH de línea germinal de ratones (SEC ID NOS: 35-53, respectivamente) . "Residuos idénticos'1 representan la cantidad de residuos idénticos en una región de línea germinal VH murina con la región 1D9 VH murina. Cuando coinciden la secuencia de la región 1D9 VH y las secuencias de la región VH de la línea germinal de ratón se muestra un punto [.] . Cuando no hay aminoácidos presentes en una posición específica del residuo, se muestra una raya [-] . La Figura 15 muestra una comparación de una porción de la región 1D9 VK murina (SEC ID NO: 9) con las diecisiete secuencias de aminoácidos VK humanas más homologas (SEC ID NOS: 5470, respectivamente) . "ID" representa el porcentaje de identidad de las secuencias VK humanas con la región 1D9 VK murina. Cuando coinciden los residuos de la región 1D9 VK y las secuencias de la región VK humanas se muestra un punto [ . ] . Cuando no hay aminoácidos presentes en una posición especifica del residuo, se muestra una raya [-] . US" indica la posición de los aminoácidos en la superficie del dominio FV. 1 1 C ' indica los residuos ubicados dentro del núcleo del dominio FV. Los residuos dentro de 5 Á de un CDR se definen mediante letras mayúsculas, mientras que los ubicados a mayor distancia se describen con letras minúsculas . Los CDR se describen mediante el uso de la nomenclatura ==L1==. "v" denota los residuos Vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol . 224:487 (1992)) ubicados en las FR. Los residuos de las secuencias de la región VK humana subrayados difieren de los genes de línea germinal VK humana más cercana. La numeración utilizada concuerda con Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest, 5.° edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Imprenta del Gobierno de los Estados Unidos (1991) . La Figura 16 muestra una comparación de la región 1D9 VK murina con las diecisiete secuencias de aminoácidos VK humanas más homologas. "ID" indica el porcentaje de identidad de las secuencias VK humanas con la región 1D9 VK murina. "Superficie" indica la cantidad de residuos idénticos en la superficie. "Núcleo" indica la cantidad de residuos idénticos dentro del núcleo del dominio FV. "CDR" indica la cantidad de residuos idénticos dentro de los CDR. "FR" indica la cantidad de residuos idénticos dentro de los FR. 1 "Superficie FR" indica la cantidad de residuos idénticos expuestos en la superficie. "Núcleo FR" indica la cantidad de residuos idénticos ubicados dentro del núcleo del dominio FV. "FR cercano a CDR" representa la cantidad de residuos idénticos entre los aminoácidos FR dentro de 5Á de un CDR. "Vernier" indica la cantidad de residuos idénticos entre los 14 aminoácidos de Vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol . 224:487 (1992)) . "VK" indica la cantidad de residuos idénticos en el gen VK. ' "Cadena J" indica la cantidad de residuos idénticos dentro del gen de cadena J. "Ll Len" a "L3 Len" define la cantidad de residuos de cada CDR, mientras que "Clase Ll" a "Clase L3" describe la clase canónica de CDR de acuerdo con Martin y Thornton (Martin y Thornton, J. Mol. Biol. 263:800 (1996) ) . Las figuras 17A-17B muestran una comparación de la región 1D9 VH murina (SEC ID NO: 10) con las 24 secuencias de aminoácidos VH humanas más homologas (SEC ID NOS: 7194, respectivamente) . "ID" indica el porcentaje de identidad de las secuencias VH humanas con la región 1D9 VH murina. Cuando coinciden los residuos de la región 1D9 VH y las secuencias de la región VH humana se muestra un punto [.] .Cuando no hay aminoácidos presentes en una posición específica del residuo, se muestra una raya [-] . "S" indica la posición de los aminoácidos en la superficie del dominio FV. "C" indica los residuos ubicados dentro del núcleo del dominio FV. Los residuos dentro de 5 Á de un CDR se definen mediante letras mayúsculas, mientras que los ubicados a mayor distancia se describen con letras minúsculas . Los CDR se describen mediante el uso de la nomenclatura ==H1==. "v" denota los residuos Vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol . 224:487 (1992)) ubicados en las FR. Los residuos de las secuencias de la región VK humana subrayados difieren de los genes de linea germinal VK humana más cercana. La numeración utilizada concuerda con Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest, 5.° edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Imprenta del Gobierno de los Estados Unidos (1991) . Las figuras 18A-18B muestran una comparación de la región 1D9 VH murina con las 24 secuencias de aminoácidos VH humanas más homologas. "ID" indica el porcentaje de identidad de las secuencias VH humanas con la región 1D9 VH murina. "Todos" indica la cantidad de residuos idénticos del total de la región VH humana, comparada con la totalidad de la región 1D9 murina. "Superficie" indica la cantidad de residuos idénticos en la superficie. "Núcleo" indica la cantidad de residuos idénticos dentro del núcleo del dominio FV. "CDR" indica la cantidad de residuos idénticos dentro de los CDR. "FR" indica la cantidad de residuos idénticos dentro de los FR. 1 "Superficie FR" indica la cantidad de residuos idénticos expuestos en la superficie. "Núcleo FR" indica la cantidad de residuos idénticos ubicados dentro del núcleo del dominio FV. "FR cercano a CDR" representa la cantidad de residuos idénticos entre los aminoácidos FR dentro de 5Á de un CDR. "Vernier" indica la cantidad de residuos idénticos entre los 14 aminoácidos de Vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol . 224:487 (1992)) . "VH" indica la cantidad de residuos idénticos en el gen VH. '"Cadena J" indica la cantidad de residuos idénticos dentro del gen de cadena J. "Tamaño de Hl" respecto de "Tamaño H3" define la cantidad de residuos de cada CDR, mientas que "Clase Hl" y "Clase H2" describen la clase canónica de CDR de acuerdo con Martin y Thornton, (J. Mol. Biol. 263:800 (1996)) . Las figuras 19A-19C muestran la alineación de las secuencias de aminoácidos conducentes al diseño de la primera (1D9RKA.) y la segunda (1D9RKB) versión humanizada de la región variable de la cadena liviana kappa del anticuerpo 1D9. No se muestran los aminoácidos idénticos a los de 1D9 murino en una posición particular de residuo en la columna 7; M-w indica que no se ubican aminoácidos en esta posición de residuos . Las letras en negrita indican posiciones en FR y CDR en las cuales el residuo de aminoácido humano fue reemplazado por el correspondiente residuo murino. "?" indica la numeración de los cambios en las FR humanas de 1D9RKA.. "1D9VK murino" indica la secuencia de aminoácidos de la región de VK de la región variable de la cadena liviana kappa de 1D9 murino. "6-II murino" indica la secuencia de consenso de las regiones VK murinas del subgrupo 6-II de Rabat . "6-11 humano" indica la secuencia de consenso de las regiones VK humanas del subgrupo 611 de Kabat. ' 'HF-21/281 ' indica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo HF-21/28 humano (Chastagner et al. Gene 101(2) :305-6 (1991)) . El número entre paréntesis (005056) es el número de ID de la base de datos de Kabat. "Superficie o Núcleo" indican la posición de los aminoácidos en relación con el resto de los residuos de ambas cadenas de las regiones variables del anticuerpo. Los residuos dentro de 5Á de un CDR se definen con letras mayúsculas. "1D9RKA" indica la secuencia de aminoácidos de la primera versión de la región 1D9 VK humanizada. "1D9RKB" indica la secuencia de aminoácidos de la segunda versión de la región 1D9 VK humanizada . Las figuras 20A-20C muestran la alineación de las secuencias de aminoácidos conducentes al diseño de la primera (1D9RHA) y la segunda (1D9RKB) versión humanizada de la región variable de la cadena liviana kappa del anticuerpo 1D9. No se muestran los aminoácidos idénticos a los de 1D9 murino en una posición particular de residuo en la columna 7; indica que no se ubican aminoácidos en esta posición de residuos. Las letras en negrita indican posiciones en FR y CDR en las cuales el residuo de aminoácido humano fue reemplazado por el correspondiente residuo murino. "?" indica la numeración de los cambios en las FR humanas de 1D9RHA. "1D9 "VH murino" indica la secuencia de aminoácidos de la región VH de la región variable de la cadena pesada 1D9 murina. "ÍIIc murino " indica la secuencia de consenso de las regiones VH murinas del subgrupo IIIc de Kabat . "III humano" indica la secuencia de consenso de las regiones VH humanas del subgrupo IIIc de Kabat. "4B4'CL" indica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 4B4'CL humano (Sanz et al., Journal of Immunology 142:883 (1989)) . El número entre paréntesis (000490) es el número de ID de la base de datos de Kabat . "Superficie o Núcleo" indican la posición de los aminoácidos en relación con el resto de los residuos de ambas cadenas de las regiones variables del anticuerpo. Los residuos dentro de 5Á de un CDR se definen con letras mayúsculas. "1D9RHA" indica la secuencia de aminoácidos de la primera versión de la región 1D9 VK humanizada. "1D9RHB" indica la secuencia de aminoácidos de la segunda versión de la región 1D9 VK humanizada. La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos, el complemento y la secuencia de aminoácidos codificada de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 1D9 murino. También se muestran la secuencia guía y una porción de la región constante. La secuencia de nucleótidos ilustrada es SEC ID NO: 96, la secuencia complementaria es SEC ID NO: 99, y la secuencia de aminoácidos es SEC ID NO: 100. La Figura 22 muestra la secuencia de nucleótidos, el complemento y la secuencia de aminoácidos codificada de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo 1D9 murino. También se muestran la secuencia guía y una porción de la región constante. La secuencia de nucleótidos ilustrada es SEC ID NO: 95, la secuencia complementaria es SEC ID NO: 101, y la secuencia de aminoácidos es SEC ID NO: 102.

La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada 1D9RHA humanizada. Los sitios de enzima indicados se agregaron para la clonación al vector pLKTOK41. El vector también tiene regiones guia y constante humanas. La secuencia de nucleótidos ilustrada es SEC ID NO: 97, la secuencia complementaria es SEC ID NO: 103, y la secuencia de aminoácidos es SEC ID NO: 104. La Figura 24 muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena liviana 1D9RKA humanizada. Los sitios de enzima indicados se agregaron para la clonación al vector pLKTOK41. El vector también tiene regiones guía y constante humanas. La Y entre corchetes indica un residuo que cambia a aspartato cuando se clona en el sitio de clonación Eco RV de pLKT0K41. La secuencia de nucleótidos ilustrada es SEC ID NO: 98, la secuencia complementaria es SEC ID NO: 105, y la secuencia de aminoácidos es SEC ID NO: 106. La Figura 25 ilustra un comparación de las capacidades de mAb 1D9 murina y una versión humanizada de mAb 1D9 (cadena pesada de 1D9RHA VH, cadena liviana de 1D9RKA VK) para inhibir la unión de

[1251] -MCP-1 a células THP-1 enteras. Los puntos de datos de 1D9 murino (mus-lD9) se muestran como triángulos negros. Los puntos de datos para la versión humanizada de 1D9 (hum-lD9) se muestran en cuadrados negros.

La Figura 26 muestra el proceso de construcción para la transferencia de los casetes de cadena pesada y los casetes de cadena liviana en un vector de cásete de ADN de inmunoglobulina de combinación única. Para la creación de vectores combinados se puede clonar el cásete de cadena pesada, incluido el promotor, nVHL, la región constante de IgG y la región de poliadenilación, como un fragmento Bgl Il/Bam HI en el sitio Bam HI del vector con el cásete de cadena liviana. Bgl II y Bam HI tienen extremos cohesivos y ambos sitios se pierden con la ligadura. La Figura 27 muestra la estructura del vector de expresión de anticuerpo de cásete de ADN de inmunoglobulina de cadena pesada y liviana de combinación completa. La Figura 28 describe el proceso de clonación para la incorporación de las secuencias variables deseadas (VH y VK) en el vector de expresión de anticuerpo de cásete de ADN de inmunoglobulina de cadena pesada y liviana de combinación completa . Descripción detallada de la invención Las formas de realización de la presente invención se refieren a un anticuerpo (anti-CCR2) o su fragmento funcional, que se fija a un receptor CC-quimioquina 2 de mamífero (CCR2, CKR-2, MCP-1RA o MCP-1RB) o una porción de CCR2. En una forma de realización, el anticuerpo tiene especificidad para CCR2 humano o rhesus, o una de sus porciones. En una forma de realización, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se generan contra un CCR2 de mamífero aislado y/o recombinante o su porción (p. ej . , péptido) o contra una célula huésped que expresa CCR2 humano. En una forma de realización de preferencia, los anticuerpos se unen específicamente a receptor (es) CCR2 humano (s) (p. ej . , CCR2a y/o CCR2b) o una de sus porciones (y en una forma de realización de particular preferencia, los anticuerpos tienen especificidad por un CCR2 humano natural o endógeno. Tal como se usa en la presente, "receptor de CC-guimioquina 2" ("CCR2") se refieren a un receptor de CC-quimioquina 2a y/o un receptor de CC-quimioquina 2b. Los anticuerpos o sus fragmentos funcionales que pueden inhibir una o más funciones características de un CCR2 de mamífero, tal como la actividad de unión (p. ej . , unión de ligando, inhibidor y/o promotor), la actividad de generación de señales (p. ej . , la activación de una proteína G de mamífero, la inducción de un aumento rápido y transitorio de la concentración de calcio libre en el citosol [Ca2+] , y/o la estimulación de una respuesta celular (p. ej . , estimulación de quimiotaxis, exocitosis o la liberación de mediadores inflamatorios por leucocitos. activación de integrinas) también se incluyen en la presente invención, tales como un anticuerpo capaz de inhibir la unión de un ligando (es decir, uno o más ligandos) a CCR2 y/o una o más funciones mediadas por CCR2 en respuesta a un ligando. Por ejemplo, en un aspecto, los anticuerpos o sus fragmentos funcionales pueden inhibir (reducir o prevenir) la interacción del receptor con un ligando natural, tal como MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 y/o eotaxina. En otro aspecto, un anticuerpo o su fragmento funcional que se fija a CCR2 puede inhibir la unión de MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-S y/o eotaxina y/o HIV a CCR2 de mamífero (p . ej . , CCR2 humano, CCR2 primate no humano, CCR2 murino) . Los anticuerpos o fragmentos funcionales de la presente invención pueden inhibir las funciones mediadas por CCR2 humano, incluso el tránsito de leucocitos, la entrada de HIV a la célula, la activación de células T, la liberación de mediadores inflamatorios y/o la desgranulación de leucocitos. De preferencia, los anticuerpos o fragmentos pueden fijar CCR2 con una afinidad de al menos aproximadamente 0,1 x 10'~3M, de preferencia al menos aproximadamente 1 x 10~9 M, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 3 x 10"9 M. En una forma de realización particular, los anticuerpos o sus fragmentos funcionales muestra inhibición de quimiotaxis inducida por guimioquina (p. ej . , inducida por MCP-1) de las células (p. ej . , PBMC) con menos de aproximadamente 150 µ/ml, de preferencia menos de aproximadamente 100 µg/ml, con mayor preferencia menos de aproximadamente 50 /¿g/ml, y con aún mayor preferencia menos de aproximadamente 20 µ^/p??. En otra forma de realización de la invención, los anticuerpos o sus fragmentos funcionales de la invención pueden inhibir la unión de un ligando CCR2 (p. ej . , una quimioquina) a CCR2 con una IC50 de menos de aproximadamente 1,0 µg/ml, de preferencia menos de aproximadamente 0,05 fíg/ml, y con mayor preferencia menos de aproximadamente 0,005 /¿g/ml. Los anticuerpos monoclonales murinos específicos para CCR2 , designados 1D9 y 8G2, se producen como se describe en la presente. En una forma de realización de preferencia, los anticuerpos de la presente invención se unen a CCR2 humano, y tienen una especificidad de epitopo igual o similar a la del anticuerpo 1D9 o 8G2 murino descrito en la presente. Los anticuerpos con una especificidad igual o similar a la del anticuerpo monoclonal 1D9 murino se puede identificar por su capacidad para competir con el anticuerpo monoclonal 1D9 murino por la unión con CCR2 humano (p . ej . , a células portadoras de CCR2 humano, tales como las células transfectantes portadoras de CCR2 , células CD8+, células CD4+, células CDR4SR0+, células CD2S+, monocitos, células dendríticas, macrófagos y basófilos) . De modo similar, los anticuerpos con especificidad de epitopo igual o similar a la del anticuerpo monoclonal 1D9 murino se puede identificar por su capacidad para competir con el anticuerpo monoclonal 8G2 murino se puede identificar por su capacidad para competir con el anticuerpo monoclonal 8G2 murino por la unión con CCR2 humano. Mediante quimeras de receptor (Rucker et al., Cell 87:437-446 (1996), se ha elaborado el mapa del sitio de unión de mAba 1D9 y 8G2 en el dominio amino-terminal del receptor 2 de quimioquina CC, específicamente en un epitopo que comprende desde aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína. Mediante esta u otras técnicas adecuadas se pueden identificar anticuerpos con especificidad de epitopo igual o similar a la del anticuerpo de la presente invención. mAbs 1D9 y 8G2 tienen especificidad de epitopo para el dominio amino-terminal del receptor CCR2 , p. ej . , desde aproximadamente el aminoácido número 1 hasta aproximadamente el aminoácido número 30, de la proteína del receptor. En consecuencia, la invención se refiere a un anticuerpo o su porción funcional que se fija al dominio amino-terminal o porción de él del receptor 2 de quimioquina CC de mamífero, y particularmente a un epitopo que comprende desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 30 del receptor 2 de quimioquina CC de mamífero. La invención también se refiere a un anticuerpo biespecifico, o su fragmento funcional (p. ej . , F(ab')2), con especificidad de epitopo igual o similar con al menos dos de los anticuerpos descritos en la presente (ver, p. ej . , patente de los Estados Unidos N.° 5.141.736 (Iwasa et al.), patente de los Estados Unidos N. ° 4.444.878, 5.292.668, 5,523.210 (todos de Paulus et al.) y patente de los Estados Unidos N.° 5.496.549 (Yamazaki et al.) . Por ejemplo, un anticuerpo biespecifico de la presente invención puede tener especificidad de epitopo igual o similar a m7Ab 1D9 y 8G2, p. ej . , y fija el dominio amino-terminal, o una de sus porciones, de la proteina CCR2 de mamífero. Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos de acuerdo con la presente invención se depositaron el 17 de julio de 1998, en beneficio de LeukoSite, Inc., 215 First Street, Cambridge, MA 02142, EE. UU. (ahora Millennium Pharmaceuticals . Inc., 75 Sidney Street, Cambridge, MA 02139, EE. UU.), en el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, EE. UU. , con números de acceso HB-12549 (1D9) y HB-12550 (8G2) . La presente invención también se refiere a líneas celulares de hibridoma depositadas con el número de acceso ATCC HB-12549 y número de acceso ATCC HB-12550, además de los anticuerpos monoclonales producidos por las lineas celulares de hibridoma depositados con el número de acceso ATCC HB-12549 y HB-12550. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales, y el término "anticuerpo" pretende abarcar los anticuerpos policlonales y monoclonales. Además, se entiende que los métodos descritos en la presente que utilizan 8G2 también pueden utilizar los fragmentos funcionales (p. ej . , fragmentos fijadores de antígeno) de 8G2, anticuerpos con especificidad de epitopo igual o similar a 8G2 , y sus combinaciones, opcionalmente en combinación con anticuerpos o fragmentos con especificidad de epitopo no igual ni similar a 8G2; de modo similar, los métodos descritos que utilizan 1D9 también pueden utilizar fragmentos funcionales de 1D9, anticuerpos con especificidad de epitopo igual o similar a 1D9, y sus combinaciones, opcionalmente en combinación con anticuerpos o fragmentos especificidad de epitopo no igual ni similar a 1D9. Los anticuerpos de la presente invención se puede generar contra un inmunógeno adecuado, tal como la protelna CCR2 de mamífero aislada y/o recombinante o porción de ella, o moléculas sintéticas tales como péptidos sintéticos. En una forma de realización de preferencia, se pueden usar células que expresan el receptor, tales como células transfectadas, como inmunógenos o en una pantalla para el anticuerpo que se une al receptor. Los anticuerpos de la presente invención, o sus fragmentos, son útiles para las aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación descritas en la presente. La presente invención abarca un anticuerpo o su porción funcional de la presente invención (p. ej . , mAb 1D90 o 8G2, o sus fragmentos fijadores de antígeno u otros anticuerpos o sus fragmentos fijadores de CCR-2, como se describe en la presente) para uso terapéutico (incluso prevención) o diagnóstico (p. ej . , de enfermedades o condiciones patológicas particulares, como se describe en la presente) , y el uso de dichos anticuerpos o sus porciones funcionales para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades o condiciones patológicas como se describe en la presente . La preparación de antígeno inmunizante, y la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden llevar a cabo como se describe en la presente, o mediante otras técnicas adecuadas. Se han descrito diversos métodos (ver p. ej . , Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) y Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al, patente de los Estados Unidos N.° 4.172.124; Harlow, B. y D. Lañe, 1988, Anticuerpos: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY) ; Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, verano de 1994), Ausubel, F. M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: Nueva York, NY) , Capitulo 11, (1991)) . Por lo general, se puede producir un hibridoma por fusión de una línea celular inmortal adecuada (p. ej . , una línea celular de mieloma como SP2/0) con células productoras de anticuerpo. Las células productoras de anticuerpo, de preferencia las del bazo o los ganglios linfáticos, se obtienen de animales inmunizados con el antígeno de interés.

Las células fusionadas (hibridomas) se pueden aislar mediante condiciones de cultivo selectivas, y clonadas por dilución limitante. Las células productoras de anticuerpos con las propiedades de unión deseadas se pueden seleccionar mediante un ensayo adecuado ( . ej . , ELISA) . Se pueden usar otros métodos adecuados para producir o aislar anticuerpos capaces de fijar CCR2, incluso anticuerpos humanos o artificiales, tales como, por ejemplo, métodos que seleccionan el anticuerpo recombinante (p. ej . , Fv o Fab de cadena única) de una biblioteca, o que se basan en la inmunización de animales transgénicos (p. ej . , ratones) capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos (ver p. ej., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Lonberg et al, patente de los Estados Unidos N. ° 5.545.806; Surani et al, patente de los Estados Unidos N. ° 5.545.807) . Los anticuerpos de cadena única y quiméricos, los anticuerpos humanizados o privatizados (por injerto de CDR) , y los anticuerpos quiméricos o de cadena única con injerto de CDR, y similares, que comprenden una porción derivada de diferentes especies, también están abarcados por la presente invención y el término "anticuerpo" . Las diversas porciones de estos anticuerpos se pueden unir químicamente mediante técnicas convencionales, o se pueden preparar como proteína contigua mediante técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, se pueden expresar ácidos nucleicos que codifican una cadena quimérica o humanizada par producir una proteína contigua. Ver, p. ej . , Cabilly et al., patente de los Estados Unidos N. ° 4.816.567; Cabilly et al., patente europea N. ° 0.125.023 Bl; Boss et al., patente de los Estados Unidos N.° 4.816.397; Boss et al., patente europea N.° 0.120.694 Bl; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al, patente europea N.° 0.194.276 Bl; Winter, patente de los Estados Unidos N.° 5.225.539; Winter, patente europea N. ° 0.239.400 Bl; y Queen et al., patentes de los Estados Unidos N.os 5.585.089, 5.698.761 y 5.698.762. Ver también Newman, . et al, BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), respecto de anticuerpo primatizado, y Ladner et al., patente de los Estados Unidos N.° 4.946.778 y Bird, R. E . , et al., Science, 242: 423-426 (1988)), respecto de anticuerpos de cadena única. Además, también se pueden producir fragmentos funcionales de anticuerpos, incluso fragmentos de anticuerpos quiméricos, humanizados, privatizados o de cadena única. Los fragmentos funcionales de los anteriores anticuerpos retienen al menos una función de unión y/o una función de modulación del anticuerpo de longitud total del cual derivan. Los fragmentos funcionales de preferencia retienen una función fijadora de antígeno del correspondiente anticuerpo de longitud total (p. ej . , la capacidad de un CCR2 de mamífero) . Los fragmentos funcionales de particular preferencia retienen la capacidad para inhibir una o más funciones características de un CCR2 de mamífero, por ejemplo actividad de unión, actividad de señales, y/o estimulación de una respuesta celular. Por ejemplo, en una forma de realización, un fragmento funcional puede inhibir la interacción de CCR2 con uno o más de sus ligandos (p. ej . , MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 y/o eotaxina) y/o puede inhibir uno o más funciones mediadas por receptor, tales como tránsito de leucocitos, entrada de HIV a las células, activación de células T, liberación de mediadores inflamatorios y/o desgranulación de leucocitos . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de fijar un receptor CCR2 de mamífero o una de sus porciones incluso, sin limitaciones, los fragmentos Fv, Fab, Fab ' y F(ab')2están abarcados por la invención. Dichos fragmentos se pueden producir por escisión enzimática o por técnicas recombinantes , por ejemplo. Por ejemplo, la escisión con papaina o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')2, respectivamente. Los anticuerpos también se pueden producir por una variedad de formas truncadas mediante genes de anticuerpo en los cuales se han introducido uno o más codones de detención corriente arriba del sitio de detención natural. Por ejemplo, se puede diseñar un gen quimérico que codifica una porción de cadena pesada F(ab' )2 y que incluye secuencias de ADN que codifican el dominio CHl y la región bisagra de la cadena pesada. La presente invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada o su fragmento -fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2, que comprende una región fijadora de antígeno de origen no humano (p. ej . , roedor) y al menos una porción de una inmunoglobulina de origen humano (p. ej . , una región marco humana, una región constante humana o una de sus porciones) . En una forma de realización, la inmunoglobulina humanizada incluye una región fijadora de antígeno de origen no humano que se une a CCR2 y una región constante derivada de una región constante humana. En otra forma de realización, la inmunoglobulina humanizada que se une a CCR2 comprende una región determinante de complementariedad de origen no humano y una región marco variable de origen humano, y opcionalmente una región constante de origen humano. De preferencia, la inmunoglobulina humanizada que fija CCR2 incluye una región determinante de complementariedad de origen no humano, una región marco variable de origen humano y al menos una porción de una región constante de origen humano, p. ej . , al menos una porción de una región constante gamma de origen humano y/o al menos una porción de una región constante kappa de origen humano . La región constante puede incluir una o más mutaciones descritas en la presente. En algunas formas de realización, la inmunoglobulina inmunizada puede comprender una cadena pesada y una cadena liviana, en donde la cadena liviana comprende una región determinante de complementariedad derivada de un anticuerpo de origen no humano que se une a CCR2 y una región marco derivada de una cadena liviana de origen humano, y la cadena pesada comprende una región determinante de complementariedad derivada de un anticuerpo de origen no humano que fija CCR2 y una región marco derivada de una cadena pesada de origen humano. En una forma de realización, la inmunoglobulina humanizada puede competir con el anticuerpo monoclonal 1D9 o 8G2 murino por la unión a CCR2 humano. En una forma de realización de preferencia, la región fijadora de antigeno de la inmunoglobulina humanizada (a) deriva del anticuerpo monoclonal 1D9 (p. ej . , como en la inmunoglobulina humanizada que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena liviana de 1D9 y/o CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de 1D9) o (b) deriva del anticuerpo monoclonal 8G2 ( . ej . , como en la inmunoglobulina humanizada que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena liviana de 8G2 y/o CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de 8G2) . Los anticuerpos quiméricos o de cadena simple injertada de CDR también se incluyen en el término inmunoglobulina humanizada. La presente invención también se refiere a una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antigeno o una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fi ador de antígeno . En una forma de realización, la invención se refiere a una cadena liviana humanizada que comprende una cadena liviana de CDR (es decir, uno o más CDR) de origen no humano y una región marco de cadena liviana humana. En algunas formas de realización, la cadena liviana de inmunoglobulina humanizada también puede incluir al menos una porción de una región constante de origen humano, p. ej . , una región constante de cadena liviana kappa de origen humano. En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un CDR de cadena pesada (es decir, uno más CDR) de origen no humano y una región marco de cadena pesada. En otras formas de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada también puede incluir al menos una porción de una región constante de origen humano, p. ej . , una región constante de cadena pesada gamma de origen humano. La región constante puede incluir una o más mutaciones descritas en la presente. Los CDR se pueden derivar de una inmunoglobulina no humana. Las inmunoglobulinas naturales tienen una estructura nuclear común en la cual dos cadenas livianas idénticas (aproximadamente 24 kD) y dos cadenas pesadas idénticas (aproximadamente 55 o 70 kD) forman un tetrámero. La porción amino-terminal de cada cadena se denomina región variable (V) y se distingue de las regiones constantes más conservadas (C) del resto de cada cadena. En la región variable de la cadena liviana hay una porción C-terminal denominada región J. En la región variable de la cadena pesada hay una región D además de la región J. La mayor parte de la variación de la secuencia de aminoácidos de las inmunoglobulinas está confinada a tres ubicaciones distintas de las regiones V denominadas regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR) , que intervienen directamente en la unión del antígeno. A partir del amino-terminal, estas regiones se denominan CDR1, CDR2 y CDR3 , respectivamente. Los CDR se mantienen en su lugar mediante regiones marco más conservadas (FR) . A partir del amino-terminal , estas regiones se denominan FR1 , FR2 , FR3 , y FR4 , respectivamente . Las ubicaciones de las regiones CDR y FR y un sistema de numeraciones fueron definidas por Kabat et al . (Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.° Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. Imprenta del Gobierno de los Estados Unidos (1991)) .

Las inmunoglobulinas humanas se pueden dividir en clases y subclases, según el isotipo de la cadena pesada. Las clases incluyen igG, IgM, IgA, IgD e IgE, en donde las cadenas pesadas son de tipo gamma (7) , mu (µ) , alfa (OÍ) , delta (d) o epsilon (e), respectivamente. Las subclases incluyen IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4, IgAl y IgA2, en las cuales las cadenas pesadas son de tipo ??, y2 , y3 y ?4 , al y OÍ2 , respectivamente. Las moléculas de inmunoglobulina humana de una clase o subclase seleccionada pueden contener una cadena liviana kappa (?) o lambda (?.) . Ver p. ej . , Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., Ed., Capítulo 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co, Filadelfia, PA (1991) ; Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology. 2o Ed., Capítulo 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984) . El término "inmunoglobulina", tal como se usa en la presente incluye anticuerpos enteros y sus fragmentos biológicamente funcionales . Dichos fragmentos biológicamente funcionales retienen al menos una función fijadora de antígeno del correspondiente anticuerpo de longitud total (p. ej . , la especificidad para CC 2 del anticuerpo 1D9) , y de preferencia, retiene la capacidad para inhibir la interacción de CCR2 con uno o más de sus ligandos (p. ej . , HIV, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, CP-5, eotaxina) . Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo biológicamente funcionales que se pueden usar incluyen fragmentos capaces de unirse a CCR2 , tales como anticuerpos de cadena única, y los fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2- Dichos fragmentos se pueden producir por escisión enzimática o por técnicas recombinantes . Por ejemplo, se puede usar escisión por papaína o pepsina para generar fragmentos Fab o F(ab')2, respectivamente. Los anticuerpos también se pueden producir de diversas formas truncadas con genes de anticuerpo en los cuales se han introducido uno o más codones de detención corriente arriba del sitio de detención natural. Por ejemplo, se puede diseñar un gen quimérico que codifica la cadena pesada de un fragmento F(ab')2 ara incluir secuencias de MM que codifican el dominio CHl y la región bisagra de la cadena pesada. Tal como se usa en la presente, un fragmento fijador de antígeno de una cadena pesada o liviana de inmunoglobulina humanizada pretende significar un fragmento que se une a un antígeno cuando se aparea con una cadena complementaria. Es decir, un fragmento fijador de antigeno de una cadena liviana humanizada se une a un antígeno cuando se aparea con una cadena pesada (p. ej . , murino, quimérico, humanizado) que comprende una región variable, y un fragmento fijador de antígeno de una cadena pesada humanizada se une a un antígeno cuando se aparea con una cadena liviana (p. ej . , murino, quimérico, humanizado) que comprende una región variable. El término " inmunoglobulina humanizada" tal como se usa en la presente se refiere a una inmunoglobulina que comprende porciones de inmunoglobulinas de diferente origen, en donde al menos una porción es de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender porciones derivadas de una inmunoglobulina de origen no humano con la especificidad requerida, por ejemplo murina, y secuencias de inmunoglobulina de origen humano (p. ej . , inmunoglobulina quimérica) , unidas químicamente mediante técnicas convencionales (p. ej . , sintéticos) o preparadas como un polipéptido contiguo mediante técnicas de ingeniería genética (p. ej . , ADN que codifica las porciones proteicas del anticuerpo quimérico se puede expresar de manera tal que produce una cadena polipeptídica contigua) . Otro ejemplo de inmunoglobulina humanizada de la presente invención es la inmunoglobulina que contiene una o más cadenas de inmunoglobulina que comprenden un CDR derivado de un anticuerpo de origen no humano y una región marco derivada de una cadena liviana y/o pesada de origen humano (p. ej . , anticuerpos con injerto de CDR con o sin cambios de marco) . Los anticuerpos quiméricos o de cadena única con injerto de CDR también se incluyen en el término inmunoglobulina humanizada. Ver, p. ej . , Cabilly et al., patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567; Cabilly et al, patente europea N.° 0.125.023 Bl; Boss et al, patente de los Estados Unidos N.° 4.816.397; Boss et al, patente europea N. ° 0.120.694 Bl; Neuberger, M. S. et al., WO 86101533; Neuberger, M. S. et al, patente europea N.° 0.194.276 Bl; Winter, patente de los Estados Unidos N.° 5.225.539; Winter, patente europea N. ° 0.239.400 Bl; Padlan, E. A. et al, solicitud de patente europea N. ° 0.519.596 Al. Ver también, Ladner et al., patente de los Estados Unidos N.° 4.946.778; Huston, patente de los Estados Unidos N.° 5.476.786; y Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)), respecto de los anticuerpos de cadena única . Por ejemplo, se pueden producir inmunoglobulinas humanizadas mediante ácidos nucleicos sintéticos y/o recombinantes para preparar genes (p. ej . , cADN) que codifica la cadena humanizada deseada. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos (p. ej . , ADN) que codifican las regiones variables humanizadas se pueden construir mediante métodos de mutagénesis por PCR para alterar secuencias de ADN que codifican una cadena humana o humanizada, por ejemplo una plantilla de ADN de una región variable previamente humanizada (ver p. ej . , amman, M., et al . , Nucí. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K. , et al., Cáncer Research. 53: 851-856 (1993); Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acid Res., 19(9): 2471-2476 (1991); y Lewis, A. P. y J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991) ) . Mediante estos u otros métodos adecuados también se pueden producir variantes con facilidad. En una forma de realización se pueden mutagenizar las regiones variables clonadas, y se pueden seleccionar las secuencias que codifican variantes con la especificidad deseada (p. ej . , de una biblioteca de fago; ver p. ej . , Krebber et al., U. S. 5.514.548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, publicado el 1.° de abril de 1993) ) . La región fijadora de antígeno de la inmunoglobulina humanizada (la porción no humana) se puede derivar de la inmunoglobulina de origen no humano (denominada inmunoglobulina donante) con especificidad de unión con CCR2. Por ejemplo, se puede derivar una región fijadora de antígeno adecuada del anticuerpo monoclonal 1D9 murino. Otras fuentes incluyen anticuerpos específicos de CCR2 obtenidos de fuentes no humanas, tales como roedores (p. ej . , ratón, rata), conejo, cerdo, cabra o primate no humano (p. ej . , mono) . Además, se pueden preparar otros anticuerpos policlonales o monoclonales , tales como anticuerpos que se unen a un epitopo igual o similar que el anticuerpo 1D9 (p. ej . , Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975); Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, Y) ; y Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 2 (Suplemento 27, verano 1994), Ausubel et al., Eds. (John Wiley & Sons: Nueva York, NY) , Capítulo 11 (1991)) . Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos contra un inmunógeno adecuado en un mamífero apropiado (p. ej . , ratón, rata, conejo u oveja) . Las células portadoras de CCR2 , fracciones de membrana que contienen CCR2 , y f agmentos inmunogénicos de CCR2 son ejemplos de inmunógenos adecuados. Las células productoras de anticuerpo (p. e . , un linfocito) se pueden aislar, por ejemplo, de ganglios linfáticos o bazos de un animal inmunizado. Las células luego se pueden fusionar a una célula inmortalizada adecuada (p. ej . , una línea celular de mieloma) , por lo que se forma un hibridoma. Las células fusionadas se pueden aislar mediante técnicas de cultivo selectivas. Las células productoras de anticuerpos con la especificidad deseada se pueden seleccionar mediante un ensayo adecuado (p. ej . , ELISA) . Las inmunoglobulinas de origen no humano con especificidad de unión para CCR2 también se pueden obtener de bibliotecas de anticuerpos (p. ej . , una biblioteca de fago que comprende moléculas Fab no humanas) . En una forma de realización, la región fijadora de antígeno de la inmunoglobulina humanizada comprende un CDR de origen no humano. En esta forma de realización, la inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2 comprende al menos un CDR de origen no humano. Por ejemplo, los CDR se pueden derivar de las regiones variables de cadena liviana y cadena de las inmunoglobulinas de origen no humano, de manera tal que la inmunoglobulina humanizada incluye sustancialmente cadena pesada CDR1, CDR2 y/o CDR3, y/o CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena liviana, con una o más inmunoglobulinas de origen no humano, y la inmunoglobulina humanizada obtenida tiene especificidad de unión para CCR2. De preferencia, los tres CDR de una cadena seleccionada son sustancialmente iguales a los CDR de la cadena correspondiente de un donante, y con mayor preferencia, los tres CDR de las cadenas livianas y pesadas son sustancialmente iguales a los CDR de la correspondiente cadena donante. En una forma de realización, la invención se refiere a una inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena liviana humanizada o su fragmento fijador de antigeno que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena liviana del anticuerpo 1D9 y una cadena pesada, p. ej . , una cadena pesada humana. La invención también una inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena pesada humanizada o su fragmento fijador de antígeno que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo 1D9 y una cadena liviana, p. ej . , una cadena liviana humana. La invención también se refiere a una inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena liviana y una cadena pesada, en donde la cadena liviana comprende al menos un CDR de un anticuerpo de origen no humano (p. e . , 1D9) y regiones marco (p. e . , SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO:15 y SEC ID NO: 107), y regiones constantes (p. ej . , SEC ID NO:112) de origen humano y en donde la cadena pesada comprende una región variable de origen no humano (p. ej . , de 1D9) y una región constante de origen humano. La invención también provee fragmentos fijadores de antígeno de estas inmunoglobulinas . La invención también se refiere a una inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena liviana y una cadena pesada, en donde la cadena liviana comprende una cadena variable de origen no humano ( . ej . , de 1D9) y una región constante de origen humano, y en donde la cadena pesada comprende al menos 1 CDR de un anticuerpo de origen no humano (p. ej . , 1D9) y marco (p. ej . , SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20) y regiones constantes de origen humano (p. ej . , SEC ID NO: 110) . La invención también provee fragmentos fijadores de antígeno de estas inmunoglobulinas . La porción de la inmunoglobulina humanizada o cadena de inmunoglobulina de origen humano (porción humana) se puede derivar de cualquier inmunoglobulina humana o cadena de inmunoglobulina adecuada. Por ejemplo, se puede derivar una región constante humana o su porción, si estuviera presente, de las cadenas livianas ? o ?, y/o las cadenas pesadas y (p. ej . , yl, y2 , y3 y y4) µ, a ( p. ej . , al, a2) d o e de anticuerpos humanos, incluso variantes alélicos. Se puede seleccionar una región constante particular (p. ej . , IgGl) , variante o su porción a fin de personalizar la función efectora. Por ejemplo, se puede incorporar una región constante mutada (variante) a una proteína de fusión para minimizar la unión a receptores Fe y/o la capacidad para fijar complemento (ver p. ej . , Ejemplo 3; ver también, Winter et al, GB 2.209.757 B; Morrison et al, WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, 22 de diciembre de 1994). Las mutaciones L235A y G237 A inhiben la unión de la región constante a los receptores Fe humanos e inhiben la iniciación de las reacciones ADCC, y se describieron previamente en la patente de los Estados Unidos N. ° 5.985.279 y la publicación internacional N° . W098/06248, que se incorporan a la presente como referencia. La numeración de los residuos de la cadena de inmunoglobulinas es la del Indice EU. Ver abat et al, (1991) J Immunol. 147:1709-19. Una inmunoglobulina humanizada de la invención puede incluir una o más de las regiones constantes de la cadena liviana de origen humano (p. ej . , SEC ID NO: 112) ; y la región constante de cadena pesada de origen humano. Una región constante de cadena pesada del anticuerpo humanizado también puede incluir una región constante de cadena mutada, p. ej . , una región constante de cadena pesada con una o más mutaciones L235A y G237A, p. ej . , una región constante de cadena pesada de SEC ID NO: 110. Si existen, de preferencia los marcos de región humanos (p. ej . , de la región variable de cadena liviana) derivan de una región variable de anticuerpo humano con similitud de secuencia con la región análoga o equivalente (p. ej . , región variable de cadena liviana) del donante de región fijadora de antigeno. Otras fuentes de regiones marco para las porciones de origen humano de la inmunoglobulina humanizada incluyen secuencias de consenso variables humanas (ver, p. ej . , ettleborough, C.A. et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Cárter et al., WO 94104679, publicado el 3 de marzo de 1994)). Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo o región variable usada para obtener la porción no humana se puede comparar con secuencias humanas como describió abat et al . , Seguences of Proteins of Immunological Interest, 5.° Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos, Imprenta del Gobierno de los Estados Unidos (1991) . En una forma de realización de preferencia, las regiones marco de una cadena de inmunoglobulina humanizada derivan de una región variable humana con al menos aproximadamente 60% de identidad global de secuencia, de preferencia al menos aproximadamente 70% de identidad global de secuencia y con mayor preferencia al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia global, con la región variable del donante no humano (p . ej . , anticuerpo 1D9 murino) . Una porción humana también se puede derivar de un anticuerpo humano con al menos aproximadamente 65% de identidad de de secuencia, y de preferencia al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia, dentro de la porción particular (p. ej . , FR) usado, cuando se compara con la porción equivalente (p. ej . , FR) del donante no humano.

En una forma de realización, la inmunoglobulina humanizada comprende al menos una de las regiones marco (FR) derivadas de una o más cadenas de un anticuerpo de origen humano. En consecuencia, FR puede incluir una FRl y/o FR2 y/o FR3 y/o FR4 derivado de uno o más anticuerpos de origen humano. De preferencia, la porción humana de una cadena humanizada seleccionada incluye FRl, FR2, FR3 y FR4 derivados de una región variable de origen humano (p. ej . , a partir de una cadena de inmunoglobulina humana, de una secuencia de consenso humana) . Las porciones de inmunoglobulina de origen human o no humano para uso en la presente invención tienen secuencias idénticas a las inmunoglobulinas o porciones de inmunoglobulina de las que derivan o sus variantes . Dichas variantes incluyen mutantes que difieren por la adición, deleción, o sustitución de uno o más residuos. Tal como se indicó con anterioridad, los CDR que son de origen no humano son sustancialmente iguales a los del donante humano, y de preferencia son idénticos a los CDR del donante no humano. Tal como se describe en el Ejemplo 2, se pueden realizar los cambios de la región marco, tales como aquellos que sustituyen un residuo de la región marco de origen humano con un residuo de la correspondiente posición del donante. Se pueden realizar una o más mutaciones en la región marco, incluso deleciones, inserciones y sustituciones de uno o más aminoácidos . Varias de dichas sustituciones se describen en el diseño de anticuerpos 1D9 humanizados en Ejemplo 2. Para un anticuerpo o cadena humanizada seleccionada se pueden diseñar mutaciones marco como se describe en la presente. De preferencia, las inmunoglobulinas humanizadas pueden fijar CCR2 con una afinidad similar o mayor que la del donante no humano. Las variantes se pueden producir por diversos métodos adecuados, incluido la mutagénesis de donante no humano o cadenas humanas aceptoras. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención tienen especificidad de unión para CCR2 humano. En una forma de realización de preferencia, la inmunoglobulina humanizada de la presente invención tiene al menos una característica funcional de anticuerpo 1D9 murino, tal como la función de unión (p. ej . , con especificidad para CCR2, con igual o similar especificidad de epitopo) , y/o función inhibitoria ( . ej . , la capacidad para inhibir la función dependiente de CCR2 in vitro y/o in vivo, por ejemplo la capacidad para inhibir la unión de una célula portadora de CCR2 a uno de sus ligandos (p. ej . , una quimioquina) ) . En consecuencia, las inmunoglobulinas humanizadas de preferencia pueden tener la especificidad del anticuerpo 1D9 murino, la especificidad de epitopo de un anticuerpo 1D9 murino (p. ej . , puede competir con 1D9 murino, un anticuerpo 1D9 quimérico, o 1D9 humanizado para la unión de CCR2 (p. ej . , en una célula portadora de CCR2)) y/o la función inhibitoria de anticuerpo ID9 murino . La función fijadora de una inmunoglobuli a humanizada con especificidad de unión para CCR2 se puede detectar mediante métodos inmunológicos estándar, por ejemplo mediante ensayos que monitorean la formación de un complejo entre inmunoglobulina humanizada y CCR2 (p. ej . , una fracción de membrana que comprende CCR2, en una célula portadora de CCR2, una línea celular humana o célula huésped recombinante que comprende el ácido nucleico que codifica CCR2, que expresa CCR2) . También se pueden usar ensayos de unión y/o adhesión u otros métodos adecuados en procedimientos para la identificación y/o el aislamiento de inmunoglobulina humanizada (p. ej . , de una biblioteca) con especificidad de requisito (p. ej . , un ensayo que monitorea la adhesión entre una célula portadora de CCR2 y su ligando (p. ej . , HIV, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, CP-5, eotaxina) , u otros métodos adecuados .

Las porciones de inmunoglobulina de origen no humano y humano para el uso de la presente invención incluye cadenas livianas, cadenas pesadas y porciones de cadenas livianas y pesadas. Estas porciones de inmunoglobulina se pueden obtener o derivar de inmunoglobulinas (p. ej . , por síntesis de novo de una porción) , o se pueden producir y expresar moléculas de ácido nucleico que codifican una inmunoglobulina o una de sus cadenas con la propiedad deseada (p. ej . , unión a CCR2, similitud de secuencia) . Las inmunoglobulinas humanizadas que comprenden las porciones deseadas (p. ej . , región fijadora de antígeno, CDR, FR, región C) de origen humano y no humano se pueden producir mediante ácidos nucleicos sintetizados y/o recombinantes para preparar genes (p . ej . , cADN) que codifica la cadena humanizada deseada. Para preparar una porción de una cadena, se pueden introducir uno o más codones de detención en la posición deseada. Por e emplo, se pueden construir secuencias de ácidos nucleicos (p. ej . , ADN) codificadoras de regiones variables humanizadas recién diseñadas mediante métodos de mutagénesis por PCR, a fin de alterar las secuencias de ADN existentes (ver p. ej . , Kamman, M., et al., Nucleic Acids Res. 17:5404 (1989)). Los cebadores de PCR codificadores de nuevos CDR se pueden hibridar a un molde de ADN de una región variable previamente humanizada que se basa en la misma región variable humana, o una muy similar (Sato, K. , et al., Cáncer Research 53:851-856 (1993)). Si no se dispone de una secuencia de ADN similar para usar como molde, se puede construir un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable a partir de oligonucleótidos sintetizados (ver p. ej . , Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993) ) . También se puede incorporar una secuencia que codifica un péptido señal en el ácido nucleico (p.ej, por síntesis, por inserción en un vector) . Si no se dispone de una secuencia peptídica señal natural, se puede usar una secuencia peptídica señal de otro anticuerpo (ver, p. ej . , ettleborougb, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Mediante estos métodos, los métodos descritos en la presente u otros métodos adecuados, se pueden obtener variantes con facilidad. En una forma de realización, se pueden mutagenizar regiones variables clonadas y se pueden seleccionar secuencias que codifican variantes con la especificidad deseada (p. ej . , de una biblioteca de fago; ver p. ej . , Krebber et al., U.S. 5.514.548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, publicado el 1.° de abril de 1993)). La invención se refiere a una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno, en donde dicha cadena liviana o su fragmento fijador de antígeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una porción funcional de la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena liviana de SEC ID NO: 9. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos comprende al menos uno, o de preferencia dos, y con mayor preferencia tres de los CDR de SEC ID NO: 9. La invención también se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno, en donde dicha cadena pesada o su fragmento fijador de antígeno tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una porción funcional de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que se muestra en SEC ID NO: 10. En una forma de realización de preferencia, la secuencia de aminoácidos comprende al menos uno, de preferencia dos, y con mayor preferencia tres de los CDR de SEC ID NO: 10. Cabe destacar que todas las secuencias murinas descritas en la presente derivan de Mus musculus. De acuerdo con una forma de realización de la invención, una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2 puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 107. De acuerdo con otra forma de realización de la invención, una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2 puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, y SEC ID NO : 20. En una forma de realización particular, una inmunoglobulina humanizada de la invención puede comprender una cadena liviana o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2, que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 107, y un cadena pesada o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, y SEC ID NO: 20. Dichas inmunoglobulinas humanizadas también pueden incluir una región constante de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 112, o una de sus porciones, y/o una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 110, o una de sus porciones.

En una forma de realización, la invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12 y una cadena pesada complementaria, o un fragmento fijador de antlgeno de dicha inmunoglobulina inmunizada con especificidad de unión para CCR2. En otra forma de realización, la invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 17 y una cadena liviana complementaria o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2. Una cadena liviana o pesada complementaria es la capaz de asociarse con un cadena pesada o liviana seleccionada, respectivamente, para dar por resultado la capacidad de una inmunoglobulina que comprende dichas cadenas pesadas y livianas complementarias para la especificidad de unión para CCR2. En una forma de realización de preferencia, la invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2 que comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 17, o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2. En otra forma de realización de preferencia, la inmunoglobulina humanizada también puede incluir una región constante de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 112, o una de sus porciones, y/o una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 110, o una de sus porciones. En una forma de realización alternativa, una inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20, o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2. En otra forma de realización, la inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19 y SEC ID NO : 20, o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR.2. En una forma de realización adicional, la inmunoglobuli a humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 14 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20, o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2. En otra forma de realización, una inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 15 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20, o un fragmento fijador de antigeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2. En una forma de realización alternativa, una inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 107 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20, o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2.

En otra forma de realización, la inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 107 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 17, o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2. En una forma de realización alternativa, una inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 107 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 18, o un fragmento fijador de antígeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2. En otra forma de realización, una inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 107 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 19, o un fragmento fijador de antigeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2. En otra forma de realización, la inmunoglobulina humanizada de la invención comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 107 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 20, o un fragmento fijador de antigeno de dicha inmunoglobulina con especificidad de unión para CCR2. En una forma de realización, la cadena liviana de inmunoglobulina humanizada o el fragmento fijador de antigeno con especificidad de unión para CCR2 se puede codificar con una molécula de ácido nucleico que comprende SEC ID NO: 109. La cadena liviana de la inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno también puede incluir una región constante codificado por un ácido nucleico de SEC ID NO: 113. De preferencia, la cadena liviana de inmunoglobulina humanizada es codificada por un ácido nucleico de SEC ID NO: 109 y se liga a un ácido nucleico de SEC ID NO: 113. En otra forma de realización, la cadena pesada de la inmunoglobulina humanizada o el fragmento fijador de antígeno para CCR2 se puede codificar mediante una molécula de ácido nucleico que comprende SEC ID NO: 108. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno también puede incluir una región constante codificada por un ácido nucleico de SEC ID NO: 111. De preferencia, la cadena liviana de inmunoglobulina humanizada es codificada por un ácido nucleico de SEC ID NO: 108 y ligada a un ácido nucleico de SEC ID NO: 111. La invenci'ón también se refiere a una inmunoglobulina quimérica o su fragmento fij ador de antígeno con especificidad de unión para CCR2 que comprende una región variable de cadena liviana de origen no humano y una región constante humana (p. ej . , una región constante de cadena liviana) . La invención también se refiere a una inmunoglobulina quimérica o su fragmento fijador de antigeno con especificidad de unión para CCR2 que comprende una región variable de cadena pesada de origen no humano y una región constante humana (p. ej . , una región constante de cadena pesada) . En otra forma de realización, la inmunoglobulina quimérica o su fragmento fijador de antígeno con especificidad de unión para CCR2 comprende una región variable de cadena liviana de origen no humana y una región variable de cadena pesada de origen no humano y también comprende una región constante humana (p. ej . , una región constante de cadena liviana humana y/o una región constante de cadena pesada humana) . Ácidos nucleicos y construcciones La presente invención también se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes (incluso, p. ej . , esencialmente puros) que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican una inmunoglobulina humanizada o la cadena liviana o pesada de una inmunoglobulina humanizada de la presenta invención. Las moléculas de ácidos nucleicos referidas en la presente como "aisladas" son moléculas de ácidos nucleicos que se han separado de los ácidos nucleicos del ADN genómico o ARN celular de su fuente de origen (p . ej . , como existe en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos tales como una biblioteca) , e incluye moléculas de ácidos nucleicos obtenidas por métodos descritos en la presente u otros métodos adecuados, tales como moléculas de ácidos nucleicos esencialmente puros, moléculas de ácidos nucleicos producidos por síntesis química, por combinaciones de métodos biológicos y químicos, y moléculas de ácidos nucleicos recombinantes aisladas (ver p. ej . , Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acid Res. 19 (9): 2471-2476 (1991); Lewis, A. P. y J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Las moléculas de ácidos nucleicos referidas en la presente como "recombinantes" son moléculas de ácidos nucleicos producidas por metodología de ADN recombinante, incluso las moléculas de ácido nucleico generadas por procedimientos que se basan en un método de recombinación artificial, tal como reacción en cadena de polimerasa (PCR) y/o clonación en un vector que utiliza enzimas de restricción. Las moléculas de ácido nucleico "recombinante" son también las que son el resultado de eventos recombinantes que tienen lugar por los mecanismos naturales de las células, pero se seleccionan tras la introducción a las células de ácido nucleicos diseñados para permitir y posibilitar un evento de recombinación deseado . La presente invención también se refiere más específicamente a moléculas de ácido nucleico aisladas y/o recombinantes que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una inmunoglobulina 1D9 humanizada (es decir, una inmunoglobulina humanizada de la presente invención en la cual la porción no humana deriva del anticuerpo monoclonal murino 1D9) o su cadena. En una forma de realización, la cadena liviana comprende tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena liviana del anticuerpo 1D9, y la cadena pesada comprende tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena pesada del anticuerpo 1D9. Dichas moléculas de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, (a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina humanizada 1D9 (p. ej . , región variable de cadena pesada de las figuras 8 y 21) (p. ej . , nucleótidos 58-411 de SEC ID NO: 96); (b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana de la inmunoglobulina humanizada 1D9 (p. ej . , la región variable de cadena liviana de las figuras 7 y 22) (p. ej . , nucleótidos 52-390 de SEC ID NO: 95); (c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica al menos una porción funcional de la región variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina humanizada 1D9 (p. ej . , una porción suficiente para la unión de antigeno de una inmunoglobulina humanizada que comprende dicha cadena) . En una forma de realización, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la región variable establecida o sustancialmente como se establece en la Figura 21 o como se establece o sustancialmente como se establece en la Figura 22, incluso polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios . (Aunque varias de las figuras pueden ilustrar polipéptidos de mayor tamaño que la región variable (es decir, incluyen una secuencia codificadora de un péptido señal o una porción de una secuencia codificadora de una región constante) , la referencia a la región variable de una figura particular pretende incluir la porción de la región variable de la secuencia mostrada) . En otra forma de realización de preferencia, la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena liviana o su porción fijadora de antígeno incluye la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 109 y/o una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 113. En otra forma de realización de preferencia, el ácido nucleico que codifica la cadena pesada o su porción fijadora de antígeno incluye la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 108 y/o la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 111. Debido a la degeneración del código genético, se puede preparar una variedad de ácido nucleicos que codifican un polipéptido seleccionado. En consecuencia, la invención también presenta un ácido nucleico que codifica una cadena liviana que incluye un ácido nucleico que codifica la cadena liviana variable de SEC ID NO: 12 y/o el ácido nucleico que codifica la cadena liviana constante de SEC ID NO: 112. La invención también presenta un ácido nucleico que codifica una cadena pesada que incluye un ácido nucleico que codifica la cadena pesada variable de SEC ID NO: 17 y/o un ácido nucleico que codifica la cadena pesada constante de SEC ID NO: 110. Las moléculas de ácido nucleico aisladas y/o recombxnantes que cumplen estos criterios pueden comprender moléculas de ácidos nucleicos que codifican secuencias idénticas a las secuencias de anticuerpo humanizado 1D9 o sus variantes, según se analizó con anterioridad. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden usar en la producción de inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2. Por ejemplo, se puede incorporar una molécula de ácido nucleico (p. ej . , ADN) que codifica una inmunoglobulina humanizada de la presente invención, en una construcción adecuada (p. ej . , un vector), para la posterior manipulación de secuencias, o para la producción del polipéptido codificado en células huésped adecuadas. Los vectores que contienen dichos ácidos nucleicos de preferencia expresan las inmunoglobulinas humanizadas descritas en la presente, p. ejemplo., expresan uno o más de las cadenas livianas variables de SEC ID NO: 12, la cadena liviana conístante de SEC ID NO: 112, la cadena pesada variable de SEC ID NO: 17 y la región constante de la cadena pesada de SEC ID NO: 110. Las secuencias de ácidos nucleicos para la inserción en el vector pueden incluir, p. ej . , secuencias adicionales en uno o más extremos (tales como los sitios de endonucleasa de restricción, endonucleasas de restricción complementarias a los sitios disponibles en el vector o secuencias flanqueadoras) tales como, cuando se insertan en forma adecuada en los vectores, el vector no expresa los aminoácidos codificados por esas secuencias adicionales. Los ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos que incluyen dichas secuencias adicionales se establecen en SEC ID NO: 98, SEC ID NO: 117, SEC ID NO: 97 y SEC ID NO: 115. El vector puede incluir un enlace operativo entre una secuencia guía y un dominio de inmunoglobulina estable (p. ej . , una región constante) que incluye secuencias pasibles de digestión con endonucleasas de restricción. Los sitios de endonucleasas de restricción de preferencia incluidos por ingeniería en el enlace operativo incluyen EcoRV, PpuMI o Mfel y BlpI o BsiWI, sin embargo, se pueden incorporar por ingeniería sitios adicionales o alternativos, a fin de acomodar las secuencias adicionales de particular interés, junto con el cásete de ADN. Los métodos para incorporar por ingeniería los sitios de restricción (p. ej . , mutagénesis dirigida al sitio) y la determinación de los sitios de preferencia mediante análisis de secuencia son bien conocidos en la técnica. Los sitios de restricción incorporados por ingeniería en el enlace permiten la posterior incorporación de secuencias de inmunoglobulina adicionales (p. ej . , región variable) de manera tal que las secuencias adicionales se incorporan por enlace operativo al dominio guía y estable (p. ej . , región constante) para permitir la producción de un ácido nucleico que codifica una molécula completa de inmunoglobulina operable (p. ej . , la clonación de la secuencia variable adicional se mantiene en el marco de la región guía y constante, a fin de producir ácidos nucleicos que codifican una protelna de inmunoglobulina que incluye los dominios guía, variable y constante) . Se puede aislar una secuencia de ácido nucleico de dominio variable de inmunoglobulina, en donde los extremos 5' y 31 de las secuencias insertadas comprenden secuencias disponibles para las endonucleasas de restricción complementarias a los sitios disponibles en el cásete de ADN. En una forma de realización, se aislan las secuencias variables de inmunoglobulina mediante técnicas de PCR conocidos, en donde las secuencias cebadoras se someten a ingeniería para incorporar secuencias de endonucleasas de restricción de ADN en la ubicación adecuada para permitir en enlace operativo tras la incorporación en el cásete de i¾DN de la inmunoglobulina. Moléculas dirigidas La invención también se refiere a moléculas dirigidas capaces de lograr la interacción de una célula que expresa CCR2 con una célula blanco. La molécula dirigida incluye un primer residuo fijador capaz de fijar CCR2 de mamífero, y un segundo residuo fijador capaz de fijar una molécula expresada en la superficie de una célula blanco. Las células blanco de preferencia incluyen células tumorales y células infectadas por virus . En la técnica se conocen diversas moléculas expresadas en niveles más elevados o exclusivamente en las células tumorales (p. ej . , antígenos tumorales, tales como Lewis Y, HER-2/neu, disialogangliósido G3, antlgeno carcinoembrionario. CD30) y/o células infectadas por virus (p. ej . , antigenos vitales, tales como hemaglutinina de virus de gripe, LMP-1 de virus Epstein-Barr, glicoproteína E2 de virus de hepatitis, gp!60 de HIV, gp!20 de HIV) . La molécula dirigida puede contener cualquier segundo residuo fijador adecuado, que se une a una molécula expresada en la célula blanco de interés (ver, por ejemplo Ring, patente de los Estados Unidos N.° 5.948.647, cuyo total de enseñanzas de incorpora en la presente como referencia) . Los residuos fijadores adecuados incluyen, por ejemplo, proteínas y péptidos (incluso formas modificadas postraduccionales p. ej . , glicosiladas, fosforiladas, lipidadas) , azúcares, lípidos, peptidomiméticos, pequeñas moléculas orgánicas, ácido nucleicos y otros agentes que se unen a CCR2 de mamífero o una molécula expresada en la superficie de una célula blanco. Los residuos fijadores adecuados se pueden identificar mediante cualquier método adecuado, por ejemplo los ensayos de unión descritos en la presente. En una forma de realización de preferencia, el primer residuo fijador puede ser, por ejemplo, una inmunoglobulina humanizada de la invención que fija CCR2 de mamífero o su fragmento fijador de antígeno (p. ej . , Fab, Fv, Fab', F(ab')2). El segundo residuo fijador puede ser, por ejemplo, un anticuerpo (p. ej . , una segunda inmunoglobulina humanizada) o su fragmento fijador de antígeno, que se une a una molécula expresada en la célula blanco o su fragmento fijador de antígeno. Cuando la molécula blanco comprende un primer residuo fijador que es una inmunoglobulina anti-CCR2 humanizada o su fragmento fijador de antígeno, se prefiere que inmunoglobulina anti-CCR2 humanizada no inhiba la unión del ligando a CCR2.

El primer residuo fijador se puede unir en forma directa o indirecta al segundo residuo fijador a través de diversos enlaces adecuados. Por ejemplo, cuando el primer residuo fijador y el segundo residuo fijador son proteínas o péptidos, los residuos pueden ser parte de un polipéptido contiguo (por ejemplo, una proteína de fusión) . Cuando la molécula dirigida es una proteína de fusión, el primero y el segundo residuo fijador se pueden organizar en el polipéptido en cualquier configuración adecuada. El primer y el segundo residuo fijador se pueden unir indirectamente a través de uno o más enlaces peptídicos, o unir directamente entre sí mediante un enlace peptídico. Cuando los residuos fijadores no son parte de un polipéptido contiguo, se pueden unir directamente mediante un enlace químico formado por reacción de un grupo funcional (o su derivado activado) en el primer residuo con un segundo grupo funcional (o su derivado activado) en el segundo residuo. Por ejemplo, dos tioles pueden reaccionar para formar un enlace disulfuro, y una amina puede reaccionar con un ácido carboxílico o haluro de acilo para formar una amida. En la técnica se conocen diversas otras reacciones que se pueden usar (ver, por ejemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Los residuos fijadores se pueden unir indirectamente mediante un ligador adecuado (p. ej . , un enlace peptídico) . Generalmente, un ligador contiene dos grupos reactivos capaces de reaccionar para formar un enlace con el primer residuo fijador y/o el segundo residuo fijador. Los ligadores que contienen dos grupos reactivos diferentes (p. ej . , un ligador heterobifuncional) se pueden usar para conjugar selectivamente el primer residuo fijador al segundo residuo fijador. Se conocen muchos ligadores adecuados para formar conjugados entre proteínas, ácido nucleicos, péptidos, vitaminas, azúcares, lípidos, pequeñas moléculas orgánicas y otros agentes adecuados (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos N.° 5.856.571, 5.880.270; Hermanson, G. T . , Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996) . De preferencia, las actividades independientes de los residuos fijadores (p. ej . , actividades fijadoras, actividad de quimioatracción) de la molécula dirigida no son significativamente diferentes de las actividades de los residuos fijadores como entidades moleculares diferenciadas. Por ejemplo, cuando el primer residuo fijador en una inmunoglobulina humanizada o fragmento fijador de antígeno que fija CCR2, la molécula dirigida se puede unir a CCR2 con una afinidad dentro de un factor de aproximadamente 1000, de preferencia dentro de un factor de 100, con mayor preferencia dentro de un factor de 10 o sustancialmente igual a la afinidad del anticuerpo libre o fragmento fijador de antígeno. Las moléculas blanco con estas características de preferencia se pueden preparar por cualquier método adecuado. La molécula dirigida obtenida luego se puede analizar para la unión (p. ej . , por ELISA) y para la actividad de quimioatracción. En una forma de realización, la molécula blanco es un anticuerpo humanizado biespecífico o su fragmento fijador de antigeno biespecífico (p. ej . , F(ab')2) -ie tiene especificidad por CCR2 de mamífero y una molécula expresada en la célula blanco (p. ej . , antígeno tumoral, antígeno viral) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden secretar mediante triomas e hibridomas híbridos . Los sobrenadantes de triomas e hibridomas híbridos se pueden ensayar para el anticuerpo biespecífico mediante un ensayo adecuado (p. ej . , ELISA) , y los anticuerpos biespecíficos se pueden purificar mediante métodos convencionales. Estos anticuerpos luego se pueden humanizar de acuerdo con los métodos descritos en la presente. En consecuencia, la invención provee una molécula blanco que es un anticuerpo humanizado biespecífico con especificidad de unión para CCR2 y un antígeno expresado en la célula blanco, o un fragmento fijador de antígeno bivalente del anticuerpo biespeclfico . La invención también se refiere a un método para efectuar la interacción de una célula portadora de CCR2 con una célula blanco en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una molécula blanco que es un anticuerpo humanizado biespecífico con especificidad de unión para CCR2 y un antígeno expresado en una célula blanco, o un fragmento fijador de antígeno bivalente del anticuerpo biespecífico.

Método para producir inmunoglobulinas humanizadas con especificidad para CCR2 Otro aspecto de la invención se refiere a un método para preparar una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2. La inmunoglobulina humanizada se puede obtener, por ejemplo, mediante la expresión de uno o más ácido nucleicos recombinantes que codifican una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2 en un huésped adecuado, por ejemplo. También se proveen construcciones del vector de expresión adecuadas para la expresión de una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2. Las construcciones se pueden introducir en una célula huésped adecuada, y se pueden producir y mantener en cultivo las células que expresan una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. Las células huésped adecuadas pueden ser procariontes, incluso células bacterianas tales como E. coli, B. subtilis y otras bacterias adecuadas, o eucariontes, tales como células fúngicas o levaduras (p. ej . , Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharo yces pombe, Neurospora crassa) , u otras células eucariontes inferiores, y células de eucariontes superiores tales como las de insectos (p. e . , células de insectos Sf9 (WO 94/26087, O'Connor, publicado el 24 de noviembre de 1994)) o de mamíferos (p. ej . , células COS, tales como COS-1 (número de acceso ATCC CRL-1650) y COS-7 (número de acceso ATCC CRL-1651) , CHO (p. ej . , número de acceso ATCC CRL-9096) , 293 (número de acceso ATCC CRL-1573) , HeLa (número de acceso ATCC CCL-2) , CVl (número de acceso ATCC CCL-70) , WOP (Dailey et al., J. Virol . 54:739-749 (1985)), 3T3, 293T (Pear et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. ., 90:8392-8396 (1993)), células NSO, SP2/0, células HuT 78, y similares (ver, p. ej . , Ausubel, F. M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons Inc., (1993)). Las células huésped de mamífero de preferencia para la expresión de anticuerpos de la invención incluyen Ovario de hámster chino (células CHO) (incluso células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA.77 : 4216-4220 , usado con un marcador selectivo DHFR, p. ej . , como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.159: 601-621) . Las células huésped que producen una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2 se pueden producir como sigue. Por ejemplo, se puede insertar el ácido nucleico que codifica la totalidad o parte de la secuencia codificadora de la inmunoglobulina humanizada deseada en un vector de ácido nucleico, p. ej . , un vector ADN, tal como un plásmido, virus u otro replicón adecuado para la expresión. Se dispone de diversos vectores, incluso vectores que se mantienen en copia simple o múltiple, o que se integra en el cromosoma de la célula huésped. Los vectores de expresión adecuados pueden contener numerosos componentes, tales como, sin limitaciones, una o más de los siguientes : un origen de replicación; un gen de marcador selectivo; uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control de transcripción (p . ej . , un promotor, un incentivador, un terminador) , y/o una o más señales de traducción; una secuencia señal o secuencia guía dirigida a membrana o secreción. En una construcción se puede proveer una secuencia señal mediante un vector u otra fuente. Por ejemplo, las señales- de transcripción y/o traducción de una inmunoglobulina se pueden usar para la expresión directa. Se puede proveer un promotor para la expresión en células huésped adecuadas . Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles . Por ejemplo, un promotor puede estar ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina humanizada o cadena de inmunoglobulina, de manera tal que dirige la expresión del polipéptido codificado. Se dispone de diversos promotores adecuados para huéspedes procariontes (p. ej . , promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli) y eucariontes (p. ej . , alcohol deshidrogenasa de levaduras (ADH1) , SV40, CMV, EF-la) . Además, en general los vectores de expresión comprenden un marcador seleccionable para la selección de células huésped portadoras del vector, y en el caso de un vector de expresión replicable, un origen o replicación. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o fármacos son marcadores seleccionables comunes y se pueden usar en células procariontes (p. ej . , gen de /3-lactamasa (resistencia a ampicilina) , gen Tet para resistencia a tetraciclinas) y células eucariontes (p. ej . , genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina) , gptt (ácido micofenólico) ampicilina, o higromicina) . Los genes marcadores de dihidrofolatorreductasa permiten la selección con metotrexato en diversos huéspedes . A menudo se usan los genes que codifican el producto génico de marcadores autotrófico del huésped (p. ej . , LEU2, URA3 , HIS3) como marcadores seleccionables en levaduras . También se contempla el uso de vectores virales (p. ej . , baculovirus) o fagos, y vectores capaces de integrarse en el genoma de la célula huésped, por ejemplo vectores retrovirales . En una forma de realización, el vector es pLKTOK38. La presente invención también se refiere a células portadoras de estos vectores de expresión. Un vector de expresión que comprende un gen fusionado que codifica una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, en donde dicho gen comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de una cadena liviana de un anticuerpo no humano con especificidad de unión para CCR2 y una región marco derivada de una cadena liviana de origen humano, y opcionalmente una región constante, p. ej . , una región constante descrita en la presente.

En consecuencia, la invención incluye un vector de expresión que comprende un gene que codifica una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, dicho gen comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de una cadena liviana de un anticuerpo no humano con especificidad de unión para CCR2 y una región marco derivada de una cadena liviana de origen humano, y, opcionalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica la totalidad o una porción de una región constante de una cadena liviana, p. ej . , una región constante de cadena liviana descrita en la presente. La invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un gen que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, en donde dicho gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de una cadena pesada de un anticuerpo no humano con especificidad de unión para CCR2 y una región marco derivada de una cadena pesada de origen humano, y, opcionalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica la totalidad o una porción de una región constante de una cadena pesada, p. ej . , una región constante de cadena pesada descrita en la presente. En una forma de realización, el anticuerpo no humano es anticuerpo 1D9 murino. La invención también incluye células huésped que comprende los vectores de expresión de la invención. La invención también se refiere a un gen aislado o recombinante que codifica una cadena liviana o pesada de una inmunoglobulina humanizada que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región fijadora de antígeno derivada de anticuerpo monoclonal 1D9 murino; y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina de origen humano, o una región constante mutada de una inmunoglobulina de origen humano, como se describe en la presente. La invención también se refiere a una célula huésped (p. ej . , que expresa una inmunoglobulina humanizada o uno de sus antígenos fijadores de antígeno con especificidad para CCR2) que comprende una primera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada o su fragmento, y una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o su fragmento, en donde dicha primera molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CDR derivado de la cadena liviana de anticuerpo 1D9 murino y una región marco derivada de una cadena liviana de origen humano, y en donde dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucíeótidos que codifica un COR derivado de la cadena pesada de anticuerpo 1D9 murino y una región marco derivada de una cadena pesada de origen humano. La primera molécula de ácido nucleico también puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción de la región constante de una cadena liviana descrita en la presente y/o la segunda molécula de ácido nucleico también puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción de una región constante de cadena pesada descrito en la presente. La invención también incluye un método para preparar una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno que comprende mantener una célula huésped de la invención en condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina humanizada, por lo que se expresan las cadenas de inmunoglobulina humanizada y se producen una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno con especificidad para CCR2. El método también puede comprender el paso de aislar la inmunoglobulina humanizada o su f agmento . Por ejemplo, se puede introducir una molécula de ácido nucleico (es decir, una o más moléculas de ácido nucleico) que codifica las cadenas pesadas y livianas de una inmunoglobulina humanizada con especificidad de unión para CCR2 , o una construcción (es decir, una o más construcciones) que comprende dicha (s) molécula (s) de ácido nucleico, en una célula huésped adecuada por un método adecuado para la célula huésped seleccionado (p. ej . , transformación, transfección, electroporación, infección), en donde la(s) molécula (s) de ácido nucleico se ligan operativamente a uno o más elementos de control de expresión (p. ej . , en un vector, en una construcción creada mediante procesos celulares, integrado en el genoma de las células huésped) . Las células huésped se pueden mantener en condiciones adecuadas para la expresión (p. ej . , en la presencia de un inductor, un medio adecuado suplementado con las sales adecuadas, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricionales, etc.), por los cuales se produce (n) polipéptido (s) codificados. Si se desea, la proteína codificada (p. ej . , anticuerpo humanizado 1D9) se puede aislar, p. ej . , de células huésped, medio, leche. Este proceso abarca la expresión en una célula huésped de un animal transgénico (ver p. ej . , O 92/03918, GenPharm International, publicado el 19 de marzo de 1992) . Se pueden producir proteínas fusionadas en las cuales la inmunoglobulina humanizada o la cadena de inmunoglobulina está ligada a un residuo no de inmunoglobulina (es decir, un residuo que no se encuentra en las inmunoglobulinas como en la naturaleza) en una ubicación N-terminal, una ubicación C-terminal o interna de la proteína fusionada. Por ejemplo, se pueden producir algunas formas de realización mediante la inserción de un ácido nucleico que codifica secuencias de inmunoglobulina en un vector de expresión adecuado, por ejemplo un vector pET vector (p. ej . , pET-15b, Novagen) , un vector fago (p. ej . , pCANTAB 5 E, Pharmacia) , u otro vector (p. ej . , vector de fusión de proteína A pRIT2T, Pharmacia) . La construcción obtenida se puede introducir en una célula huésped adecuada para su expresión. Tras la expresión, se pueden aislar o purificar algunas proteínas de fusión a partir de un lisado celular mediante una matriz de afinidad adecuada (ver p. ej . , Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., eds., Vol. 2, Suppl . 26, pp. 16.4.1- 16.7.8 (1991) ) . Métodos y composiciones terapéuticas La presente invención provee inmunoglobulinas humanizadas que (1) se puede fijar a CCR2 in vitro y/o in vivo; y/o (2) pueden modular una actividad o función de CCR2 , tal como (a) la función de unión (p. ej . , la capacidad de CCR2 para unirse a un ligando) y/o (b) tránsito de leucocitos, incluso el reclutamiento y/o la acumulación de leucocitos en tejidos. De preferencia, las inmunoglobulinas humanizadas son capaces de fijarse selectivamente a CCR2 in vi tro y/o in vivo, y de inhibir las interacciones mediadas por CCR2. En una forma de realización, una inmunoglobulina humanizada puede fijar CCR2, y puede inhibir la unión de CCR2 a uno o más de sus ligandos (p . ej . , HIV, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina) . Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención son útiles para diversos procesos con aplicaciones en investigación, diagnóstico y terapéutica. Por ejemplo, se pueden usar para detectar, aislar y/o purificar CCR2 o sus variantes (p. ej . , por purificación por afinidad u otros métodos adecuados) , y para estudiar la estructura de CCR2 (p. ej . , la conformación) y la función. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención también se pueden usar para aplicaciones diagnósticas (p. ej . , in vitro, ex vivo) o para modular la función de CCR2 en aplicaciones terapéuticas (incluso preventivas) . Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención se pueden usar para detectar y/o medir el nivel de CCR2 en una muestra (p . ej . , tej idos o fluidos corporales, tales como exudado inflamatorio, sangre, suero, líquido ascítico, en células portadoras de CCR2) . Por ejemplo, se puede obtener una muestra (p. ej . , tejido y/o fluido corporal) de un individuo y se puede usar un método inmunológico adecuado para detectar y/o medir la expresión de CCR2, incluso métodos tales como ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) , tales como ensayos de quimioluminiscencia, radioinmunoensayo e inmunohistologia . En una forma de realización, se provee un método para detectar un CCR2 seleccionado en una muestra, que comprende poner en contacto una muestra con una inmunoglobulina humanizada de la presente invención en condiciones adecuadas para la unión específica de la inmunoglobulina humanizada a CCR2 y detectar complejos an icuerpo-CCR2 formados. En una aplicación del método, se pueden usar inmunoglobulinas humanizadas para analizar tejidos normales versus inflamados (p. ej . , de un humano) para determinar la reactividad para CCR2 y/o la expresión (p. e . , inmunohistológicamente) , a fin de detectar las asociaciones entre condiciones particulares y el aumento de la expresión de CCR2 (p. ej . , en tejidos afectados) . Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención permiten aplicar métodos de evaluación de la presencia de CCR2 en tejidos normales versus inflamados, a través de los cuales se puede evaluar la presencia de enfermedad, el progreso de la enfermedad y/o la eficacia de la terapéutica anti-CC 2 con integrinas en la enfermedad inflamatoria. Además, las inmunoglobulinas humanizadas de la invención proveen métodos para evaluar la presencia de CCR2 a través del progreso de proliferación celular no deseada asociada con la expresión de CCR2 , p. ej . , un cáncer que expresa CCR2. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención también se pueden usar para modular (p. ej . , inhibir (reducir o prevenir) la función fijadora y/o de tránsito de leucocitos (p. ej . , linfocitos, monocitos) modulada por CCR2. Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas que inhiben la unión de CCR2 a un ligando (es decir, uno o más ligandos) se pueden administrar de acuerdo con el método en el tratamiento de enfermedades asociadas con tejidos infiltrados por leucocitos (p. ej . , linfocitos, monocitos) . Además, se pueden administrar inmunoglobulinas humanizadas que inhiben la unión de CCR2 a un ligando (es decir, uno o más ligandos) de acuerdo con el método en el tratamiento de HIV. Una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención (es decir, una o más) se administra a un individuo (p. ej . , un mamífero, tal como un humano u otro primate) para tratar dicha enfermedad.

Las inmunoglobulinas humanizadas se administran en una cantidad efectiva que inhibe la unión de CCR2 a uno de sus ligandos. Para el tratamiento, una cantidad efectiva será suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado (incluso preventivo) (tal como una cantidad suficiente para reducir o prevenir la unión y/o las señales mediadas por CCR2) . La inmunoglobulina humanizada se puede administrar en una dosis única o en dosis múltiples. La dosificación se puede determinar por los métodos conocidos en técnica anterior y pueden depender, por ejemplo, de la edad, sensibilidad, tolerancia y estado general del individuo. Las dosis adecuadas para anticuerpos pueden ser de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal por tratamiento. Por ejemplo, la dosis puede ser de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal . De acuerdo con el método, se puede administrar la inmunoglobulina humanizada a un individuo (p. ej . , un humano) sola o junto con otro agente. Una inmunoglobulina humanizada se puede administrar antes, junto o después de la administración del agente adicional. En consecuencia, la invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención y un portador adecuado. En una forma de realización, se administra más de una inmunoglobulina humanizada que inhibe la unión de CCR2 a sus ligandos. En otra forma de realización se administra otro anticuerpo monoclonal además de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. En aún otra forma de realización, se puede administrar otro ingrediente farmacológicamente activo (p. ej . , un compuesto antiinflamatorio, tal como sulfasalazina, otro compuesto antiinflam torio no esteroide, o un compuesto antiinflamatorio esteroide) junto con una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. Son posibles diversas vía de administración, incluso, sin ser necesariamente limitantes, parenteral (p. ej . , inyección intravenosa, intraarterial , intramuscular, subcutánea), oral (p. ej . , dietaria) , tópica, por inhalación (p. ej . , inhalación intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales) , o rectal, según la enfermedad o condición patológica tratada. La administración parenteral es el modo de administración de preferencia. La formulación varía de acuerdo con la vía de administración seleccionada (p. ej . , solución, emulsión). Una composición apropiada que comprende el anticuerpo humanizado para la administración se puede preparar en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. Para las soluciones o emulsiones, los portadores adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, tales como medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservadores, o repositores de fluidos, nutrientes o electrólitos (Ver, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17.° Edición, Mack Publishing Co., PA, 1985) . Para inhalación, se puede solubilizar y cargar el compuesto en un dispensador adecuado para la administración (p. ej . , un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol bajo presión) . En consecuencia, la invención incluye un método para inhibir la infección por HIV de una célula, que comprende poner en contacto una célula con una cantidad efectiva de una composición que comprende una inmunoglobuüna humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención. La invención también se refiere a un método para tratar HIV o inhibir la infección por HIV en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención. La invención también se refiere a un método para inhibir una función asociada con la unión de una quimioquina a CCR2 de mamífero o una porción funcional de CCR2 , que comprende poner en contacto una composición que comprende CCR2 o su porción con una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención, en donde dicha inmunoglobulina humanizada inhibe la unión de la quimioquina a CCR2 de mamífero e inhibe una o más funciones asociadas con la unión de la quimioquina a CCR2. Por ejemplo, se puede seleccionar la quimioquina del grupo que consiste en MCP-1, MCP-2, CP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina y sus combinaciones. La invención también se refiere a un método para inhibir el tránsito de leucocitos en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención, que se une a CCR2 de mamífero e inhibe la unión de un ligando al receptor. Por ejemplo, el ligando puede ser una quimioquina (p. ej . , MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina) o HIV.

La invención también se refiere a un método para inhibir la interacción de una primera célula que expresa CCR2 con un ligando (p. ej . , en una segunda célula que expresa un ligando de CCR2) , que comprende poner en contacto la primera célula con una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención, en particular en donde dicha inmunoglobulina o su fragmento inhibe la unión del ligando a CCR2. Por ejemplo, se puede seleccionar la célula del grupo que consiste .en linfocitos, monolitos, granulocitos , células T, basófilos, y células que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica CCR2 o una de sus porciones . En una forma de realización, el ligando es una quimioquina (p. ej . , MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina) . En otra forma de realización, el ligando es HIV. La invención también incluye un método para tratar un trastorno mediado por CCR2 en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención, que se une a CGR2 de mamífero. El trastorno puede incluir, sin limitaciones, alergia, aterogénesis, anafilaxia, enfermedad maligna, trastornos inflamatorios crónicos y agudos, reacciones alérgicas mediadas por histamina e IgE, shock, y artritis reumatoidea, ateroesclerosis, esclerosis múltiple, estenosis, restenosis, rechazo de aloinjerto, enfermedad fibrótica, asma, esclerodermia, glomerulopatías inflamatorias, enfermedades relacionadas con la inmunidad. En una forma de realización particular, la invención se refiere a un método para inhibir la restenosis en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención, que se une a CCR2 de mamífero. La invención también incluye una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención para el uso en la terapéutica o el diagnóstico de enfermedades o trastornos mediados por CCR2. La invención también incluye el uso de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento fijador de antígeno de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por CCR2. También se proveen anticuerpos antiidiotipo. Los anticuerpos antiidiotipo reconocen determinantes antigénicos asociados con el sitio de unión del antígeno de otro anticuerpo. Los anticuerpos antiidiotipo se pueden preparar contra el segundo anticuerpo al inmunizar a un animal de la misma especie, y de preferencia de la misma cepa, que el animal usado para producir el segundo anticuerpo. Ver p. ej . , patente de los Estados Unidos N.° 4.699.880. La presente invención también se refiere a líneas celulares de hibridoma depositadas con los números de acceso ATCC HB-12549 y HB-12550, además de los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma depositadas con los números de acceso de ATCC HB-12549 y HB-12550. Las líneas celulares de la presente invención tienen otros usos, además de la producción de anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, las líneas celulares de la presente invención se pueden fusionar con otras células (tales como células de mieloma humano con marca farmacológica, de mieloma murino, de heteromieloma humano-murino o de células linfoblastoides humanas adecuadas) a fin de producir hibridomas adicionales, y así proveer la transferencia de los genes que codifican los anticuerpos monoclonales. Además, se pueden usar las líneas celulares como fuente de ácidos nucleicos que codifican las cadenas de inmunoglobulina anti-CCR2, que se pueden aislar y expresar (p. ej . , por transferencia a otras células por cualquier técnica adecuada (ver p. ej . , Cabilly et al., patente de los Estados Unidos N. ° 4.816.567; Winter, V. S. patente de los Estados Unidos N. ° 5.225.539)) . Por ejemplo, se pueden aislar clones que comprenden una cadena pesada o liviana reorganizada anti-CCR2 (p. ej . , por PCR) o se pueden preparar bibliotecas de cADN a partir de aislamientos de mARN de las lineas celulares, y se pueden aislar clones de cADN que codifican una cadena de inmunoglobulina anti-CCR2. En consecuencia, se pueden obtener y usar ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y/o livianas de los anticuerpos o sus porciones de acuerdo con las técnicas de ADN recombinante para la producción de la inmunoglobulina específica, las cadenas de inmunoglobulina o sus variantes (p. ej . , inmunoglobulinas humanizadas) en diversas células huésped o en un sistema de traducción in vitro. Por ejemplo, se pueden ubicar los ácidos nucleicos, incluso cADN, o sus derivados que codifican variantes tales como una inmunoglobulina humanizada o cadena de inmunoglobulina, en vectores procariontes o eucariontes adecuados (p. ej . , vectores de expresión) e introducirlos en células huésped adecuadas mediante un método apropiado (p . ej . , transformación, transfección, electroporación, infección) , de manera tal que el ácido nucleico se une operativamente a uno o más elementos de control de la expresión (p. ej . , en el vector o integrados al genoma de la célula huésped) . Para la producción se pueden mantener las células huésped en condiciones adecuadas para la expresión (p. ej . , en presencia de un inductor, medios adecuados suplementados con sales apropiadas, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricios, etc.), por la cual se produce el polipéptido codificado. Si se desea, se puede recuperar y/o aislar la proteína codificada (p. ej . , de células huésped, medio, leche) . Se apreciará que el método de producción abarca la expresión en una célula huésped de un animal transgénico (ver p. ej . , WO 92/03918, GenPharm International, publicado el 19 de marzo de 1992) . Tal como se describe en la presente, los anticuerpos y sus fragmentos funcionales de la presente invención pueden bloquear (inhibir) la unión de un ligando a CCR2 y/o inhibir la función asociada con la unión del ligando de CCR2. Tal como se analiza más adelante, se pueden usar diversos métodos para evaluar la inhibición de la unión de un ligando a CCR2 y/o la función asociada con la unión del ligando al receptor. Ensayos de unión Tal como se usa en la presente "proteína CCR2 de mamífero" se refiere a proteínas CCR2 de mamífero endógenas o naturales y a proteínas con una secuencia de aminoácidos igual a la correspondiente proteína natural o endógena CCR2 de mamífero (p. ej . , proteínas recombinantes) . En consecuencia, tal como se define en la presente, el término incluye proteína receptora madura, variantes polimórficas o alélicas, y otras isoformas de un CCR2 de mamífero (p. ej . , producida por ensamblado alternativo u otros procesos celulares) , y las formas modificadas o no modificadas de los anteriores (p. ej . , glicosilados , no glicosilados) . Las proteínas CCR2 de mamífero se pueden aislar y/o formar proteínas recombinantes (incluso proteínas producidas por síntesis) . Las proteínas naturales o endógenas CCR2 de mamífero incluyen proteínas de tipo salvaje tales como CCR2 maduras, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas que ocurren naturalmente en mamíferos (p. ej . , humanos, primates no humanos) , tales como las formas CCR2a y CCR2b de la proteína de receptor que se producen por ensamblado alternativo de los carboxi-terminales de la proteína. Dichas proteínas se pueden recuperar o aislar de una fuente que naturalmente produce CCR2 de mamífero, por ejemplo. Estas proteínas y proteínas CCR2 de mamífero con la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente CCR2 natural o endógeno de mamífero, se denominan con el nombre del correspondiente mamífero. Por ejemplo, cuando el correspondiente mamífero es un humano, la proteína se designa como proteína CCR2 humana (p. ej . , una CCR2 recombinante humana producida en una célula huésped adecuada) . Las "variantes funcionales" de las proteínas CCR2 de mamífero incluyen fragmentos funcionales, proteínas mutantes funcionales y/o proteínas de fusión funcionales (p. ej . , producidas por técnicas de mutagénesis y/o recombinantes) . Generalmente, los fragmentos o porciones de proteínas CCR2 de mamífero incluyen las que tienen una deleción (es decir, una o más deleciones) de un aminoácido (es decir, uno o más aminoácidos) respecto de la proteína CCR2 madura de mamífero (por ejemplo deleciones N-terminales, C-terminales o internas) . También se contemplan los fragmentos o porciones en los cuales sólo se han eliminado aminoácidos contiguos o en los cuales se han eliminado aminoácidos no contiguos respecto de la proteína CCR2 madura de mamífero. Por lo general, los mutantes de proteínas CCR2 de mamífero incluyen variantes naturales o artificiales de una proteína CCR2 de mamífero que difiere por la adición, deleción y/o sustitución de uno o más residuos contiguos o no contiguos de aminoácido (p. ej . , quimeras de receptor). Dichas mutaciones pueden ser una región conservada o no conservada (comparado con otros receptores CXC y/o CC de quimioquina) , o regiones extracelulares , citoplasmáticas o transmembrana, por ejemplo. Generalmente, las proteínas de fusión abarcan polipéptidos que comprenden una CCR2 de mamífero (p. ej . , CCR2 humano) como primer residuo, ligado mediante un enlace peptídico a un segundo residuo que no aparece en el CCR2 de mamífero como se encuentra en la naturaleza. En consecuencia, el segundo residuo puede ser un aminoácido, oligopéptido o polipéptido. El primer residuo puede estar en una ubicación N-terminal, C-terminal o interna de la proteína de fusión. En una forma de realización, la proteína de fusión comprende un ligando por afinidad (p. ej . , una enzima, un antígeno, un rótulo de epitopo) como primer residuo, y un segundo residuo que comprende una secuencia ligadora y CCR2 humano o una de sus porciones. Un "fragmento funcional o porción", "mutante funcional" y/o "proteína de fusión funcional" de una proteína CCR2 de mamífero se refiere a una protelna o polipéptido aislado y/o recombinante con al menos una función característica de una proteína CCR2 de mamífero, como se describe en la presente, tal como actividad de unión, actividad de señal y/o capacidad para estimular una respuesta celular. Las variantes funcionales de preferencia son capaces de fijar un ligando (es decir, uno o más ligandos tales como MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 y/o eotaxina) , y se denominan en la presente "variantes de fijadores de ligando". En una forma de realización, una variante funcional de CCR2 de mamífero comparte al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia con la CCR2 de dicho mamífero, de preferencia al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con dicha CCR2 de mamífero. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de CCR2a y CCR2b humanos se describen en la patente de los Estados Unidos N. ° 5.707.815. La identidad de secuencia se puede determinar mediante un programa adecuado, por ejemplo el programa Blastx (versión 1.4), mediante parámetros adecuados, tales como parámetros predeterminados. En una forma de realización, los parámetros de búsqueda de Blastx son la matriz de calificación BLOSUM62, W=3. En otra forma de realización, una variante funcional comprende una secuencia de ácido nucleico diferente de la molécula de ácido nucleico natural, pero debido a la degeneración del código genético, codifica CCR2 de mamífero o una de sus porciones. Una composición que comprende una CCR2 de mamífero aislada y/o recombinante o su variante funcional se puede mantener en condiciones adecuadas para formar la unión, se pone en contacto CCR2 de mamífero o su variante con un anticuerpo o fragmento que se desea estudiar, y se detecta la unión o se mide en forma directa o indirecta. En uria forma de realización, se usan células que expresan CCR2 naturalmente o células que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos recombinantes que codifica un CCR2 de mamífero o su variante. Las células se mantienen en condiciones adecuadas para la expresión del receptor. Las células se ponen en contacto con un anticuerpo o su fragmento en condiciones adecuadas para la unión (p. ej . , en un buffer de unión adecuado), y se detecta la unión mediante técnicas estándar. Para determinar la unión, se puede determinar la extensión de unión respecto de un control adecuado (p. ej . , comparado con una base determinada sin anticuerpo, comparado con la unión de un segundo anticuerpo (es decir, un estándar) , comparado con la unión de anticuerpo a células no transíectadas) . Se puede usar una fracción celular, por ejemplo una fracción de membrana, que contiene el receptor o Ixposomas que comprenden el receptor, en lugar de células enteras. En una forma de realización, el anticuerpo se rotula con un rótulo adecuado (p. ej . , un rótulo fluorescente, un rótulo isotópico, un rótulo de antígeno o de epitopo, un rótulo enzimático) , y se determina la unión al detectar el rótulo. En otra forma de realización, se puede detectar el anticuerpo fijado mediante un segundo anticuerpo rotulado. La especificidad de la unión se puede evaluar por competencia o desplazamiento, por ejemplo, mediante anticuerpos o ligandos no rotulados como competidor. También se pueden utilizar ensayos de inhibición de unión para identificar anticuerpos sus o fragmentos que se unen a CCR2 e inhiben la unión de otro compuesto tal como un ligando (p. ej . , MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 y/o eotaxina) a CCR2 o una variante funcional. Por ejemplo, se puede conducir un ensayo de unión en el cual se detecta o mide la reducción de la unión de un ligando a CCR2 (en presencia de un anticuerpo) , comparado con la unión del ligando en ausencia del anticuerpo. Una composición que comprende un CCR2 aislado y/o recombinante de mamífero o su variante funcional se puede poner en contacto con el ligando y anticuerpo simultáneamente, o uno tras del otro, en cualquier orden. La reducción del grado de unión del ligando en presencia del anticuerpo indica inhibición de la unión del anticuerpo. Por ejemplo, la unión con el ligando puede estar disminuida o abolida.

En una forma de realización se monitorea la inhibición directa de la unión de un ligando (p. ej . , una quimioguina tal como MCP-1) a un CCR2 de mamífero o su variante por un anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, se puede monitorear la capacidad de un anticuerpo de inhibir la unión de MCP-1 con marca de 1251, MCP-2 con marca de 1251, MCP-3 con marca de 1251, MCP-4 con marca de 1251, MCP-5 con marca de 1251, o eotaxina con marca de 1251 a CCR2 de mamífero. Dicho ensayo se puede conducir mediante células adecuadas portadoras de CCR2 o una de sus variantes funcionales, por ejemplo células sanguíneas aisladas (p. ej . , células T, PBMC) o una línea celular adecuada que expresa CCR2 naturalmente, o una línea-celular que contiene ácido nucleico que codifica un CCR2 de mamífero, o una fracción de membrana proveniente de dichas células, por ejemplo. Existen otros métodos para identificar la presencia de un anticuerpo que fija CCR2 , así como otros ensayos de unión adecuados, o métodos para monitorear eventos que son desencadenados por la unión del receptor, incluso la función de señal y/o de estimulación de una respuesta celular (p. ej . , el tránsito de leucocitos) . Se debe entender que el efecto inhibidor de los anticuerpos de la presente invención se puede evaluar en un ensayo de inhibición de la unión. En el método también se puede evaluar la competencia entre anticuerpos por la unión del receptor. Los anticuerpos identificados de esta manera también se pueden evaluar para determinar si después de la unión actúan como inhibidores de otras funciones de CCR2 y/o para evaluar su utilidad terapéutica. Ensayos de señal La unión de un ligando o promotor, por ejemplo un agonista, a CCR2 puede dar por resultado una señal emitida por este receptor acoplado a proteina G, y se estimula la actividad de proteínas G, además de otras moléculas señal intracelulares . La inducción de la función de señal por un compuesto (p. ej . , un anticuerpo o su fragmento) se puede monitorear por cualquier método adecuado. Dicho ensayo se puede usar para identificar los anticuerpos agonistas de CCR2. La actividad inhibitoria de un anticuerpo o su fragmento funcional se puede determinar mediante un ligando o promotor en el ensayo, y al evaluar la capacidad del anticuerpo para inhibir la actividad inducida por el ligando o promotor. La actividad de la proteina G, por ejemplo la hidrólisis de GTP a GDP, o eventos señal posteriores desencadenados por la unión del receptor, tales como la inducción del aumento rápido y transitorio de la concentración de calcio libre intracelular (citosólico) [Ca2+]i, se puede evaluar mediante métodos conocidos en la técnica previa u otros métodos adecuados (ver p. ej . , Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425 (1993); Van Riper et al., J. Exp. Med. , 177: 851-856 (1993) ; Dahinden, C.A. et al., J. Exp. Med., 179: 751-756(1994)) .

Por ejemplo, el ensayo funcional de Sledziewski et al. con receptores acoplados a proteína G híbrida se pueden usar para monitorear la capaidad de un ligando o promotor para unirse al receptor y activar una proteína G (Sledziewski et al., patente de los Estados Unidos N. ° 5.284.746, cuyas enseñanzas se incorporan a la presente como referencia) . Dichos ensayos se pueden realizar en presencia del anticuerpo o su fragmento a evaluar, y se determina la capacidad del anticuerpo o fragmento para inhibir la actividad inducida por el ligando o promotor, mediante métodos conocidos y/o métodos descritos en la presente. Quimiotaxis y ensayos de estimulación celular Los ensayos de quimiotaxis también se pueden usar para evaluar la capacidad de un anticuerpo o su fragmento funcional para bloquear la unión de un ligando a CCR2 de mamífero o su variante funcional y/o inhibir la función asociada con la unión del ligando al receptor. Estos ensayos se basan en la migración funcional de células in vitro o in vivo inducida por el compuesto. La quimiotaxis se puede evaluar como se describe en los Ejemplos, p. ej . , en un ensayo que utiliza una placa de quimiotaxis de 96 cavidades, o mediante otros métodos reconocidos en las técnicas para evaluar quimiotaxis. Por ejemplo, se describe el uso de un ensayo de quimiotaxis in vitro transendotelial en Springer et al. (Springer et al, WO 94/20142, publicado el 15 de setiembre de 1994, cuyas técnicas se incorporan en la presente como referencia; ver también Berman et al., Immunol . Invest. 17: 625-677 (1988)). También se describió la migración a través del endotelio, hacia geles de colágeno (Kavanaugh et al., J. Immunol., 146: 4149-4156 (1991)). Se pueden usar transfectantes estables de células Ll-2 preB murinas u otras células huésped adecuadas con capacidad de quimiotaxis en los ensayos de quimiotaxis, por ejemplo. Generalmente, los ensayos de quimiotaxis monitorean el movimiento direccional o de migración de una célula adecuada (por ejemplo, un leucocito (p. ej . , linfocito, eosinófilo, basófilo) ) hacia el interior o a través de una barrera (p. ej . , endotelio, un filtro) , hacia niveles aumentados de un compuesto, desde una primera superficie de la barrera hacia una segunda superficie opuesta. Las membranas o filtros proporcionan barreras convenientes, por lo que se monitorea el movimiento direccional o la migración de una célula adecuada hacia el interior o a través de un filtro, hacia niveles aumentados de un compuesto, desde una primera superficie del filtro barrera hacia una segunda superficie opuesta del filtro. En algunos ensayos, la membrana está recubierta por una sustancia a fin de facilitar la adhesión, por ejemplo ICAM-1, fibronectina o colágeno. Dichos ensayos proveen una aproximación in vitro de la localización ("homing") del leucocito. Por ejemplo, se puede detectar o medir la inhibición de la migración de células en un recipiente adecuado (un medio de contención) , desde una primera cámara hacia el interior o a través de una membrana microporosa, hacia una segunda cámara, que contiene un anticuerpo a estudiar, y que se divide desde la primera cámara mediante la membrana. Se selecciona una membrana adecuada, con tamaño de poro adecuado para el monitoreo de la migración específica en respuesta al compuesto que incluye, por ejemplo, nitrocelulosa o policarbonato . Por ejemplo, se pueden usar tamaños de poro de aproximadamente 3-8 micrones, y de preferencia aproximadamente 5-8 micrones. El tamaño del poro puede ser uniforme en un filtro o dentro de un rango de tamaños de poro adecuados . A fin de evaluar la migración y la inhibición de la migración, se pueden determinar la distancia de la migración hacia el interior del filtro, la cantidad de células que atraviesan el filtro y permanecen adheridas a la segunda superficie del filtro, y/o la cantidad de células que se acumulan en la segunda cámara, mediante técnicas estándar (p. ej . , microscopía) . En una forma de realización, las células se rotulan con un rótulo detectable (p. ej . , radioisótopo, rótulo fluorescente, rótulo de antigeno o epitopo) , y la migración se puede evaluar en presencia y ausencia del anticuerpo o fragmento, al determinar la presencia del rótulo adherido a la membrana y/o presente en la segunda cámara, mediante un método adecuado (p. ej . , al detectar radiactividad, fluorescencia, por inmunoensayo) . El grado de migración inducida por un agonista de anticuerpo se puede determinar respecto de un control adecuado ( . ej . , comparado con la migración de base determinada en ausencia de anticuerpo, comparado con el grado de migración inducido por un segundo compuesto (es decir un estándar) , comparado con la migración de células no transfectadas inducidas por el anticuerpo) .

En una forma de realización, particularmente para células T, monolitos o células que expresan CCR2 de mamífero, se puede monitorear la migración transendotelial . En esta forma de realización se evalúa la transmigración a través de una capa de células endoteliales. Para preparar la capa celular, se pueden cultivar células endoteliales en un filtro o membrana microporosa, opcionalmente recubierta con una sustancia tal como colágeno, fibronectina, u otras proteínas de matriz extracelular, a fin de facilitar la adhesión de células endoteliales. De preferencia, se cultivan las células endoteliales hasta formar una monocapa confluente. Diversas células endoteliales de mamífero están disponibles para la formación de monocapa, tales como por ejemplo, venas, arterias o endotelio microvascular, tales como las células endoteliales de la vena umbilical humana (Clonetics Colp, San Diego, CA) . Para ensayar la quimiotaxis en respuesta a un receptor de mamífero particular, se prefieren células endoteliales del mismo mamífero; sin embargo, también se pueden usar células endoteliales provenientes de especies o géneros de mamíferos heterólogos. Generalmente, se realiza el ensayo por detección de la migración direccional de células hacia el interior o a través de una membrana o filtro, en una dirección hacia el aumento de niveles de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro, en donde el filtro contiene una capa de células endoteliales en la primera superficie. La migración direccional ocurre desde la zona adyacente a la primera superficie, hacia el interior o a través de la membrana, hacia un compuesto situado en la cara opuesta del filtro. La concentración de compuesto presente en la zona adyacente a la segunda superficie es superior a la de la zona adyacente a la primera superficie . En una forma de realización usada para estudiar un inhibidor de anticuerpo, se puede colocar una composición que comprende células capaces de migrar y expresar un receptor CCR2 de mamífero en la primera cámara. Se coloca una composición que comprende uno o más ligandos o promotores capaces de inducir quimiotaxis en las células de la primera cámara (con función de quimioatraccion) . De preferencia, poco antes de colocar las células en la primera cámara, o simultáneamente con las células, se coloca una composición que comprende el anticuerpo a estudiar, de preferencia, en la primera cámara . Los anticuerpos o sus fragmentos funcionales que se pueden unir al receptor e inhibir la inducción de quimiotaxis por un ligando o promotor, de las células que expresan CCR2 de mamífero en este ensayo son inhibidores de la función del receptor (p. ej . , inhibidores de la función estimuladora) . La reducción del grado de migración inducida por el ligando o promotor en presencia del anticuerpo o fragmento indica la actividad inhibitoria. Se podrían realizar otros estudios de unión (ver antes) a fin de determinar si la inhibición es consecuencia de la unión del anticuerpo al receptor o si tiene lugar por otro mecanismo diferente . Los ensayos in vivo que monitorean la infiltración de leucocitos en un tejido en respuesta a la inyección de un compuesto (p. ej . , quimioquina o anticuerpo) en el tejido, se describen más adelante (ver Modelo de inflamación) . Estos modelos de homing in vivo miden la capacidad de las células para responder a un ligando o promotor por emigración y quimiotaxis hacia un sitio de inflamación y para evaluar la capacidad de un anticuerpo o su fragmento para bloquear esta emigración. Además de los métodos descritos , se pueden evaluar los efectos de un anticuerpo o fragmento sobre la función estimuladora de CC , al monitorear las respuestas celulares inducidas por un receptor activo, mediante células huésped adecuadas que contienen el receptor.

Identificación de Ligandos, Inhibidores y/o Promotores Adicionales de Función de CCR2 en Mamíferos Los ensayos descritos anteriormente, los cuales se pueden utilizar para evaluar la unión y función de los anticuerpos y fragmentos de la presente invención, pueden adaptarse para identificar ligandos adicionales u otras sustancias las cuales unen un CCR2 de mamífero o su variante funcional, así como también inhibidores y/o promotores de la función de CCR2 de mamífero. Por ejemplo, pueden identificarse agentes que tienen la misma especificidad de unión o similar a aquella de un anticuerpo de la presente invención o su porción funcional mediante un ensayo de competición con dicho anticuerpo o su porción. Por consiguiente, la presente invención también abarca métodos para identificar ligandos del receptor u otras sustancias las cuales unen una proteína CCR2 de mamífero, así como también inhibidores (por ejemplo, antagonistas) o promotores (por ejemplo, agonistas) de la función del receptor. En una realización, células que portan una proteína CCR2 de mamífero o su variante funcional (por ejemplo, leucocitos, líneas celulares o células huéspedes adecuadas las cuales se han construido genéticamente para expresar una proteína CCR2 de mamífero o variante funcional codificada por un ácido nucleico introducido en dichas células) se utilizan en un ensayo para identificar y evaluar la eficacia de ligandos u otras sustancias las cuales se unen al receptor, incluyendo inhibidores o promotores de la función del receptor. Ese tipo de células son también útiles para evaluar la función de la proteína del receptor expresada o polipéptido. De acuerdo con la presente invención, los ligandos y otras sustancias las cuales se unen al receptor, inhibidores y promotores de la función del receptor pueden identificarse en un ensayo adecuado, y se evalúan adicionalmente para efecto terapéutico . Los inhibidores de la función del receptor pueden utilizarse para inhibir (reducir o prevenir) la actividad del receptor, y ligandos y/o promotores pueden utilizarse para inducir (disparar o aumentar) la función del receptor normal donde fuese indicado. Por lo tanto, la presente invención provee un método para tratar enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedad autoinmune y rechazo de injerto, que comprende administrar un inhibidor de la función del receptor a un individuo (por ejemplo, un mamífero) . La presente invención proporciona además un método para estimular la función del receptor administrando un ligando novedoso o promotor de la función del receptor a un individuo, proporcionando un número enfogue para la estimulación selectiva de la función leucocitaria, lo cual es útil, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades infecciosas y en el cáncer. Como se utiliza en la presente invención, un "ligando" de una proteina CCR2 de mamífero se refiere a una clase particular de sustancias las cuales se unen a una proteina CCR2 de mamífero, incluyendo ligandos naturales y formas sintéticas y/o recombinantes de ligandos naturales. Los agentes infecciosos que tienen un tropismo para células CCR2-positivas de mamífero (por ejemplo, virus tales como HIV) también se pueden unir a una proteína CCR2 de mamífero. Un ligando natural de un receptor de mamífero seleccionado es de origen mamífero el cual es el mismo al de la proteína CCR2 de mamífero (por ejemplo, una quimioquina tal como MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 y/o eotaxina. En una realización preferida, la unión al ligando de una proteína CCR2 de mamífero se produce con alta afinidad. Como se utiliza en la presente invención, un "inhibidor" es una sustancia la cual inhibe (disminuye o previene) al menos una función característica de una proteína CCR2 de mamífero (por ejemplo, un CCR2 humano) , tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión al ligando, unión al promotor, unión al anticuerpo) , una actividad de señalamiento (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción del aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca2+]i) y/o función de la respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediador inflamatorio por leucocitos) . Un inhibidor es también una sustancia la cual inhibe la entrada del HIV en una célula. El término inhibidor se refiere a sustancias que incluyen antagonistas los cuales se unen al receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un imitante de un ligando natural, moléculas orgánicas de pequeño peso molecular, otros inhibidores competitivos de la unión al ligando) , y sustancias las cuales inhiben la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotípico) . Como se utiliza en la presente invención, un "promotor" es una sustancia la cual promueve (induce, causa, aumenta o incrementa) al menos una función característica de una proteína CCR2 de mamífero (por ejemplo, un CCR2 humano) , tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión al ligando, inhibidor y/o promotor) , una actividad de señalamiento (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca2+]i) y/o función de la respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediador inflamatorio por leucocitos) . El término promotor se refiere a sustancias que incluyen agonistas los cuales se unen al receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un homólogo de un ligando natural de otra especie) , y sustancias las cuales promueven la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, activando una proteina asociada) . En una realización preferida, el agonista no es un homólogo de un ligando natural . Por consiguiente, la invención también se refiere a un método para detectar o identificar un agente el cual se une a un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando, que incluyen ligandos, inhibidores, promotores y otras sustancias las cuales se unen a un receptor CCR2 de mamífero o variante funcional. De acuerdo con el método, un agente a ser ensayado, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la presente invención (por ejemplo, 8G2, 1D9, un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica la cual es la misma o es similar a la de 8G2 o 1D9, y sus fragmentos de unión al antígeno) y una composición que comprende un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando pueden combinarse. Los componentes antes mencionados se combinan bajo condiciones adecuadas para unir al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno a un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando, y unión del anticuerpo o fragmentos al receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando se detecta o se mide, ya sea directa o indirectamente, de acuerdo con métodos descritos en la presente invención u otros métodos adecuados . Una disminución en la cantidad de complejo formado con relación a un control adecuado (por ejemplo, en ausencia del agente que se va a ensayar) indica que el agente se une a dicho receptor o variante. La composición que comprende un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando puede ser una fracción de membrana de una célula que porta la proteína del receptor 2 de quimioquina recombinante o su variante de unión al ligando. El anticuerpo o su fragmento puede ser rotulado con un rótulo tal como un radioisótopo, rótulo de espín, antígeno o rótulo de epítopo, rótulo enzimático, grupo fluorescente y grupo quimioluminiscente. En una realización, la invención se refiere a un método para detectar o identificar un agente el cual se une a un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando, que comprende combinar un agente que se va a ensayar, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la presente invención (por ejemplo, 1D9, 8G2, un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica la cual es la misma o similar a la de 1D9 u 8G2, o sus fragmentos de unión al antigeno) y una célula que porta un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando. Los componentes mencionados anteriormente se combinan bajo condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno a la proteína CCR2 o una variante de unión al ligando de la misma, y unión del anticuerpo o fragmento del receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o variante se detecta o se mide, ya sea directa o indirectamente, de acuerdo con métodos descritos en la presente invención u otros métodos adecuados. Una disminución en la cantidad de complejo formado con relación a un control adecuado indica que el agente se une al receptor o variante. El anticuerpo o su fragmento puede ser rotulado con un rótulo seleccionado del grupo formado por un radioisótopo, rótulo' de espín, antígeno o rótulo de epitopo, rótulo enzimático, grupo fluorescente y grupo quimioluminiscente . Pueden utilizarse estos ensayos y ensayos similares para detectar agentes, que incluyen ligandos (por ejemplo, quimioquinas o cepas de HIV que interactúan con CCR2) u otras sustancias, que incluyen inhibidores o promotores de la función del receptor, que se pueden unir a CCR2 y competir con los anticuerpos descritos en la presente invención para unión al receptor. Los ensayos descritos anteriormente pueden utilizarse, solos o en combinación entre sí u otros métodos adecuados, para identificar ligandos u otras sustancias las cuales se unen a una proteína CCR2 de mamífero, e inhibidores o promotores de una proteína CCR2 de mamífero o variante. Los métodos in vitro de la presente invención pueden adaptarse para screening de alto rendimiento en el cual se procesan grandes cantidades de muestras (por ejemplo, formato de 96 pocilios) . Las células que expresan CCR2 de mamífero (por ejemplo, CCR2 humano) en niveles adecuados para screening de alto rendimiento pueden utilizarse, y así, son particularmente valiosas en la identificación y/o aislación de ligandos u otras sustancias las cuales se unen al receptor, e inhibidores o promotores de las proteínas CCR2 de mamífero. La expresión del receptor puede controlarse de diversas maneras. Por ejemplo, la expresión puede controlarse utilizando anticuerpos de la presente invención que se unen al receptor o una porción del mismo. También, pueden utilizarse anticuerpos comercialmente disponibles para detectar la expresión de una proteína de fusión etiquetada con antígeno o epítopo que comprende una proteína receptora o polipéptido (por ejemplo, receptores marcados con PLAG) y pueden seleccionarse células que expresan el nivel deseado. El ácido nucleico que codifica una proteína CCR2 de mamífero o su variante funcional puede incorporarse en un sistema de expresión para producir una proteína receptora o polipéptido. Una protelna CCR2 de mamífero recombinante y/o aislada o variante, tal como un receptor expresado en células transíectadas estable o transitoriamente con una construcción que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína CCR2 de mamífero o variante, o en una fracción celular que contiene receptor (por ejemplo, una fracción de membrana de células transíectadas, liposomas que incorporan receptor) , puede utilizarse en ensayos para determinar la función del receptor. El receptor puede ser adicionalmente purificado si se desea. El ensayo de la función del receptor puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Una proteína CCR2 de mamífero aislada y/o recombinante o su variante funcional, tal como un CCR2 humano, puede utilizarse en el presente método, donde el efecto de un compuesto se evalúa monitoreando la función del receptor según lo descrito en la presente invención o utilizando otras técnicas adecuadas. Por ejemplo, los transíectantes estables o transitorios (por ejemplo, células Sf9 infectadas con baculovirus, transíectantes estables de células pre-B Ll/2 de ratón) , pueden utilizarse en ensayos de unión. Pueden utilizarse transfectantes estables de células Jurkat o de otras células adecuadas capaces de quimiotaxis (por ejemplo, células Ll/2 pre-B de ratón) en ensayos de quimiotaxis, por ej emplo. De acuerdo con el método de la presente invención, los compuestos pueden ser individualmente seleccionados o se pueden ensayar uno o más compuestos simultáneamente de acuerdo con los métodos de la presente invención. Cuando se ensaya una mezcla de compuestos, los compuestos seleccionados por los procesos descritos pueden separarse (según lo apropiado) y pueden identificarse mediante métodos adecuados (por ejemplo, PCR, secuenciado, cromatografía, espectroscopia de masas) . También puede determinarse la presencia de uno o más compuestos (por ejemplo, un ligando, inhibidor, promotor) en una muestra de ensayo de acuerdo con estos métodos . Pueden ensayarse grandes genotecas combinatorias de compuestos (por ejemplo, compuestos orgánicos, péptidos recombinantes o sintéticos, "peptoides" , ácidos nucleicos) producidas mediante síntesis química combinatoria u otros métodos (ver por ejemplo Zuckerman, R.N. y otros, J. Med. Chem., 37: 2678- 2685 (1994) y referencias citadas en dicho documento; ver además, Ohlmeyer, M. H. J. y otros, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926 (1993) y De itt, S. H. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993), con relación a los compuestos etiquetados; Rutter, W. J. y otros, Patente estadounidense no. 5.010.175; Huebner, V.D. y otros, Patente estadounidense no. 5.182.366; y Geysen, H. M. , Patente estadounidense no. 4.833.092) . Donde los compuestos seleccionados de una genoteca combinatoria mediante el presente método portan etiquetas únicas, la identificación de compuestos individuales por métodos cromatográficos es posible . En una realización, se utiliza la metodología de exhibición de fagos. Por ejemplo, una protelna CCR2 de mamífero o variante funcional, un anticuerpo o su porción funcional de la presente invención, y un fago (por ejemplo, un fago o recolección de fago tal como una genoteca) que exhibe un polipéptido, puede combinarse bajo condiciones apropiadas para unión del anticuerpo o su porción a la proteína CCR2 de mamífero o variante (por ejemplo, en un buffer de unión adecuado) . El fago que puede competir con el anticuerpo o su porción y unirse a la proteína CCR2 de mamífero o variante puede detectarse o seleccionarse utilizando técnicas convencionales u otros métodos adecuados.

El fago unido puede separarse del receptor utilizando un buffer de elución adecuado. Por ejemplo, un cambio en la concentración iónica o pH puede conducir a una liberación de fago. Alternativamente, el buffer de elución puede comprender un componente o componentes de liberación diseñados para interrumpir la unión de compuestos (por ejemplo, uno o m s compuestos los cuales pueden interrumpir la unión del peptido exhibido al receptor, tal como un ligando, inhibidor y/o promotor el cual inhibe de manera competitiva la unión) . Opcionalmente, el proceso de selección puede repetirse o se puede utilizar otro paso de selección para enriquecer adicionalmente para fago que se une al receptor. El polipéptido exhibido puede caracterizarse (por ejemplo, mediante secuenciado ADN de fago) . Los polipéptidos identificados pueden producirse y adicionalmente ensayarse para unión, y para función del inhibidor o promotor. Pueden producirse análogos de ese tipo de péptidos los cuales han aumentado la estabilidad u otras propiedades deseables . En una realización, puede producirse fago que expresa o exhibe proteínas de fusión que comprenden una proteína de cubierta con un peptido N-terminal codificado por ácidos nucleicos de secuencia al azar. Las células huéspedes adecuadas que expresan una proteína CCR2 de mamífero o variante y un anticuerpo anti-CCR2 o su porción funcional, se combinan con el fago, el fago unido se selecciona, se recupera y se caracteriza. (Ver, por ejemplo, Doorbar, J. y G. Winter, J. Mol. Biol . 244: 361 (1994) que describe un procedimiento de exhibición de fago utilizado con un receptor acoplado a proteína G) . Otras fuentes de ligandos potenciales u otras sustancias las cuales se unen a, o inhibidores y/o promotores de, proteínas CCR2 de mamífero incluyen, aunque no se limitan a, -variantes de ligandos de CCR2 , incluyendo variantes de presentación natural, sintéticas o recombinantes de MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 y/o eotaxina, sustancias tales como otros quimioatrayentes o quimioquinas , sus variantes, moléculas orgánicas de bajo peso molecular, otros inhibidores y/o promotores (por ejemplo, anticuerpos anti-CCR2, antagonistas, agonistas) , otros ligandos de receptores acoplados a proteína G, inhibidores y/o promotores (por ejemplo, antagonistas o agonistas), y porciones solubles de un receptor CCR2 de mamífero, tal como un péptido receptor adecuado o análogo el cual puede inhibir la función del receptor (ver, por ejemplo, Murphy, R. B., WO 94/05695). Modelos de Inflamación Se encuentras disponibles modelos in vivo de inflamación los cuales se pueden utilizar para evaluar los efectos de los anticuerpos y fragmentos de la invención in vivo como agentes terapéuticos. Por ejemplo, la infiltración leucocitaria luego de inyección intradérmica de una quimioquina y un anticuerpo o su fragmento reactivo con CCR2 de mamífero en un animal adecuado, tal como un conejo, ratón, rata, conejillo de Indias o macaco rhesus puede controlarse (ver, por ejemplo, Van Damme, J. y otros, J. Exp. Med., 176: 59-65 (1992); Zachariae, C. O. C. y otros, J. Exp. Med. 171: 2177- 2182 (1990); José, P. J. y otros, J. Exp. Med. 179: 881- 887 (1994) ) . En una realización, se evalúan biopsias de piel histológicamente para infiltración de leucocitos (por ejemplo, esinófilos, granulocitos) . En otra realización, células rotuladas (por ejemplo, células establemente transíectadas que expresan un CCR2 de mamífero, rotuladas con ulIn por ejemplo) capaces de quimiotaxis y extravasación se administran al animal. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento a ser evaluado puede ser administrado, antes, simultáneamente con o después del ligando o agonista se administra al animal de ensayo. Una disminución del grado de infiltración en presencia de anticuerpo en comparación con el grado de infiltración en ausencia de inhibidor indica inhibición.

Aplicaciones de Diagnóstico y Terapéuticas Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo investigación, diagnóstico y aplicaciones terapéuticas. En una realización, los anticuerpos son rotulados con una etiqueta adecuada (por ejemplo, rótulo fluorescente, rótulo quimioluminiscente, rótulo de isótopo, rótulo de antigeno o epxtopo o rótulo enzimático) . Por ejemplo, pueden utilizarse para aislar y/o purificar al receptor o porciones del mismo, y para estudiar la estructura (por ejemplo conformación) y función del receptor. Adicionalmente, pueden utilizarse los diversos anticuerpos de la presente invención para detectar CCR2 o para medir la expresión de receptor, por ejemplo, en células T (por ejemplo, células CD8+, células CD45R0+) , monocitos y/o en células transfectadas con un gen receptor. Por lo tanto, también tienen utilidad en aplicaciones tales como clasificación celular (por ejemplo, citometria de flujo, clasificación celular activada por fluorescencia) , para propósitos de diagnóstico o investigación. Los anticuerpos anti-CCR2 de la presente invención tienen valor en aplicaciones de diagnóstico. Puede utilizarse un anticuerpo anti-CCR2 o su fragmento para controlar la expresión de este receptor en individuos infectados con HIV, similar a la manera en que anti-CD4 se ha utilizado como un indicador de diagnóstico del estadio de enfermedad. Típicamente, los ensayos de diagnóstico implican detectar la formación de un complejo que es el resultado de la unión de un anticuerpo o su fragmento a CCR2. Para propósitos de diagnóstico, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden rotularse o no rotularse. Los anticuerpos o fragmentos pueden ser directamente rotulados. Puede emplearse una variedad de rótulos, incluyendo, aunque sin limitarse a, radionúclidos , fluorescedores , enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos y ligandos (por ejemplo, biotina, haptenos) . El experto conoce numerosos inmunoensayos apropiados (ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654 y 4.098.876). Cuando están sin rotular, los anticuerpos o fragmentos pueden detectarse utilizando medios adecuados, como en ensayos de aglutinación, por ejemplo. Los anticuerpos no rotulados o fragmentos también pueden utilizarse en combinación con otro (es decir, uno o más) reactivo adecuado el cual se puede utilizar para detectar anticuerpo, tal como un anticuerpo rotulado (por ejemplo, un segundo anticuerpo) reactivo con el primer anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos anti-idiotípicos u otros anticuerpos que son específicos para la inmunoglobulina no rotulada) u otro reactivo adecuado (por ejemplo, proteína A rotulada) . En una realización, los anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden utilizarse en inmunoensayos enzimáticos, donde el anticuerpo o fragmento en cuestión, o segundos anticuerpos, se conjugan a una enzima. Cuando una muestra biológica que comprende una proteína CCR.2 de mamífero se combina con los anticuerpos en cuestión, se produce la unión entre los anticuerpos y la proteína CCR2. En una realización, una muestra que contiene células que expresan una proteína CCR2 de mamífero, tal como sangre humana, se combina con los anticuerpos en . cuestión, y se produce la unión entre los anticuerpos y células que portan una proteína CCR2 humana que comprende un epítopo reconocido por el anticuerpo. Estas células unidas pueden separarse de los reactivos no unidos y puede determinarse la presencia del conjugado anticuerpo- enzima unido específicamente a las células, por ejemplo, poniendo en contacto la muestra con un sustrato de la enzima que produce un color u otro cambio detectable cuando es influenciada por la enzima. En otra realización, los anticuerpos en cuestión puede estar no rotulados, y un segundo anticuerpo rotulado puede ser agregado el cual reconoce al anticuerpo en cuestión. También pueden prepararse kits para utilizar en la detección de la presencia de una proteína CCR2 de mamífero en una muestra biológica. Ese tipo de kits incluyen un anticuerpo o su fragmento funcional el cual se une a un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o porción de dicho receptor, así como también uno o más reactivos auxiliares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre el anticuerpo o fragmento y CCR2 o su porción. Pueden proporcionarse composiciones de anticuerpos de la presente invención en forma liofilizada, solas o en combinación con anticuerpos adicionales específicos para otros epxtopos. Los anticuerpos, los cuales pueden estar rotulados o no rotulados, pueden ser incluidos en los kits con ingredientes adyuvantes (por ejemplo, buffers, tales como Tris, fosfato y carbonato, estabilizantes, excipientes, biocidas y/o proteínas inertes, por ejemplo, seroalbúmina bovina) . Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser proporcionados como una mezcla liofilizada con los ingredientes adyuvantes, o los ingredientes adyuvantes pueden ser proporcionados separadamente para combinación por el usuario. Generalmente, estos materiales adyuvantes estarán presentes en menos de aproximadamente 5% en peso en base a la cantidad de anticuerpo activo, y generalmente estarán presentes en una cantidad total de por lo menos aproximadamente 0,001% en peso en base a la concentración de anticuerpos . Donde se emplea un segundo anticuerpo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal, tal anticuerpo puede ser provisto en el kit, por ejemplo, en un frasco o recipiente por separado. El segundo anticuerpo, si está presente, es típicamente rotulado, y puede ser formulado en forma análoga a las formulaciones de anticuerpos descritas anteriormente. Similarmente, la presente invención también se refiere a un método para detectar y/o cuantificar la expresión de un CCR2 de mamífero o una porción del receptor mediante una célula, en donde una composición que comprende una célula o fracción de la misma (por ejemplo, fracción de membrana) se pone en contacto con un anticuerpo o su fragmento funcional (por ejemplo, 1D9 y/o 8G2) el cual se une a un CCR2 de mamífero o porción del receptor bajo condiciones apropiadas para la unión del anticuerpo o fragmento del mismo, y se controla la unión. La detección del anticuerpo, que indica la formación de un complejo entre anticuerpo y CCR2 o una porción del mismo, indica la presencia del receptor. La unión de anticuerpo a la célula puede determinarse según lo descrito anteriormente bajo el encabezado "Ensayos de Unión", por ejemplo. El método puede utilizarse para detectar la expresión de CCR2 en células de un individuo (por ejemplo, en una muestra, tal como un fluido corporal, tal como sangre, saliva u otra muestra adecuada) . El nivel de expresión de CCR2 en la superficie de células T o monocitos también puede determinarse, por ejemplo, mediante citometría de flujo y el nivel de expresión (por ejemplo, intensidad de tinción) puede correlacionarse con la susceptibilidad, progresión o riesgo de la enfermedad. Los receptores de quimioquina funcionan en la migración de leucocitos a través del cuerpo, particularmente a sitios de inflamación. La emigración de células inflamatorias de la vasculatura se regula mediante un proceso de tres etapas que involucra interacciones de leucocito y proteínas de adhesión a células endotélicas y quimioatrayentes específicos de la célula y factores de activación (Springer, T. A., Cell, 76: 301- 314 (1994); Butcher, E. C, Cell, 67: 1033- 1036 (1991); Butcher, E.C. y Picker, L.J., Science (Wash. DC) , 272: 60-66 (19996)) . Estos son: (a) una interacción de baja afinidad entre selectinas leucocitarias y carbohidratos de células endotélicas; (b) una interacción de alta afinidad entre receptores guimioatrayentes leucocitarios y factores quimioatrayentes/ activadores; y (c) una estrecha unión entre integrinas leucocitarias y proteínas de adhesión a células endotélicas de la superfamilia de inmunoglobulinas . Diferentes subconjuntos de leucocitos expresan diferentes repertorios de selectinas, receptores quimioatrayentes e integrinas. Adicionalmente, la inflamación altera la expresión de proteínas de adhesión endotélicas y la expresión de factores quimioatrayentes y activadores de leucocitos. Como consecuencia, existe una gran diversidad para regular la selectividad del reclutamiento de leucocitos a sitios extravasculares . El segundo paso es crucial en el sentido de que se piensa que la activación de los receptores quimioatrayentes de leucocitos causa la transición del rodamiento celular mediado por selectina a la unión estrecha mediada por integrinas . Esto dio como resultado que el leucocito esta listo para transmigrar a sitios perivasculares . La interacción de receptores quimioatrayentes/ quimioatrayente es también crucial para la migración transendotelica y localización dentro de un tejido (Campbell, J.J., y otros, J. Cell Biol . , 134: 255- 266 (1996); Carr, M. W. y otros, Immunity, 4: 179-187 (1996)).

Esta migración es dirigida por un gradiente de concentración de quimioatrayente que conduce hacia el foco inflamatorio. CCR2 tiene un rol importante en el tráfico de leucocitos . Es probable que CCR2 es un receptor de quimioquina clave para la migración de células T o subconj untos de células T o monocitos a ciertos sitios inflamatorios, y así mAbs anti-CCR2 pueden utilizarse para inhibir (reducir o prevenir) la migración de células T o monocitos, particularmente aquella asociada con la disfunción de células T, tal como enfermedad autoinmune, o reacciones alérgicas o con trastornos mediados por monocitos tales como aterosclerosis . Por consiguiente, los anticuerpos y sus fragmentos de la presente invención también pueden utilizarse para modular la función del receptor en aplicaciones de investigación y terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos funcionales descritos en la presente invención pueden actuar como inhibidores para inhibir (reducir o prevenir) (a) la unión (por ejemplo, de un ligando, un inhibidor o un promotor) al receptor, (b) una función de señalamiento del receptor y/o (c) una función estimuladora. Los anticuerpos que actúan como inhibidores de la función del receptor pueden bloquear la unión al ligando o promotor directa o indirectamente (por ejemplo, causando un cambio conformacional) . Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir la función del receptor inhibiendo la unión de un ligando, o por des-sensibilización (con o sin inhibición de la unión de un ligando) . Los anticuerpos los cuales se unen al receptor también pueden actuar como agonistas de la función del receptor, activar o estimular una función del receptor, tal como una función de señalamiento y/o una función estimuladora de un receptor (por ejemplo, tráfico leucocitario) luego de la unión al receptor. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para inhibir el tráfico leucocitario en un mamífero (por ejemplo, un paciente humano), que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención. La administración de un anticuerpo o fragmento de la presente invención puede dar como resultado un mejoramiento o eliminación del estado patológico . El anticuerpo de la presente invención, o su fragmento funcional, también puede utilizarse para tratar trastornos en los cuales está implicada la activación del receptor CCR2 por la unión de quimioquinas . Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos (por ejemplo, fragmentos funcionales 1D9 y/o 8G2 de los mismos) pueden utilizarse para tratar la alergia, aterogénesis , anafilaxis, malignidad, inflamación crónica y aguda, reacciones alérgicas mediadas por histamina e IgE, choque, y artritis reumatoidea, aterosclerosis, esclerosis múltiple, estenosis, restenosis, rechazo de aloinjerto, enfermedad fibrótica, asma y glomerulopatías inflamatorias. Las enfermedades o afecciones de humanos u otras especies las cuales se pueden tratar con inhibidores de la función del receptor CCR2 (incluyendo anticuerpos o sus fragmentos adecuados) , incluyen, aunque no se limitan a: - enfermedades y afecciones inflamatorias o alérgicas, incluyendo enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades pulmonares de hipersensibilidad, neumonitis de hipersensibilidad, enfermedades pulmonares intersticiales (ILD) (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática, o ILD asociada con artritis reumatoidea, lupus sistémico eritematoso, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis) ; enfermedad pulmonar obstructiva crónica, por ejemplo, enfisema y bronquitis crónica; anafilaxis o respuestas a hipersensibilidad, alergias a fármacos (por ejemplo, a penicilina, cefalosporinas) , alergias a picaduras de insectos; enfermedades intestinales inflamatorias, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa; espondiloartropatías; escleroderma (por ejemplo, escleroderma sistémica) y trastornos de tejido conectivo mixto; soriasis y dermatosis inflamatorias tales como dermatitis, eczema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, urticaria; vasculitis (por ejemplo, vasculitis necrotizante, cutánea y de hipersensibilidad) ; enfermedades autoinmunes, tales como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoides juvenil, artritis soriática, artritis asociada con enfermedad gastrointestinal y artritis reactiva) , esclerosis múltiple y otras enfermedades desmielinizantes , lupus sistémico eritematoso (SLE) , miastenia grave, diabetes desencadenante en la juventud, espondilitis anquilosante, espondiloartropatías no diferenciadas y espondiloartropatías de inicio en la juventud (incluyendo artritis reumatoide juvenil), nefritis tales como glomerulonef itis , tiroiditis autoinmune, enfermedad de Behcet; - rechazo de injerto (por ejemplo, en transplante), incluyendo rechazo de aloinjerto, rechazo de xenoinjerto o enfermedad de injerto contra huésped y arteriesclerosis asociada con transplante de órganos; - aterosclerosis; - cánceres con infiltración de leucocitos de la piel u órganos, cánceres que expresan CCR2 , por ejemplo, tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de mama) o tumores líquidos, cánceres que expresan ligando de CCR2 , por ejemplo, tumores sólidos o líquidos, y cánceres que tienen expresión aberrante o anormal de CCR2. estenosis o restenosis de la vasculatura, particularmente de las arterias, por ejemplo, la arteria coronaria, tal como estenosis o restenosis que es el resultado de intervención vascular (por ejemplo, intervención quirúrgica, terapéutica o mecánica) , así como también hiperplasia neointimal . Por ejemplo, la restenosis, la cual produce típicamente un angostamiento de la abertura lumenal del vaso, puede ser el resultado de lesión vascular incluyendo, aunque sin limitarse a, aquella producida por procedimientos de injerto vascular, angioplastia, incluyendo angioplastia realizada mediante balón, aterectomía, láser u otro método adecuado (por ejemplo, angioplastia coronaria translumenal percutánea (PTCA) ) , colocación de stent (por ejemplo, colocación de stent endovascular mecánica o biológica) , procedimientos de bypass vascular o combinaciones de los mismos, así como también otros procedimientos utilizados para tratar vasos sanguíneos estenóticos o obstruidos; - trastornos fibróticos tales como fibrosis hepática (por ejemplo, fibrosis hepática asociada con enfermedades hepáticas inducidas por alcohol, otras toxinas y fármacos, hepatitis crónica, hepatitis aguda, ataque del medio ambiente y hepatitis autoinmune) , trastornos fibróticos del pulmón, riñon o corazón y espondiloartropatías inflamatorias, por ejemplo, espondilitis anquilosante; - trastornos isquémicos, por ejemplo, enfermedad cardiaca isquémica (por ejemplo, infarto de miocardio, angina inestable, angina, cardiomiopatías isquémicas, angina (silenciosa) asintomática) ; - enfermedad cerebrovascular incluyendo enfermedades del SNC isquémicas, ataque isquémico, ataques isquémicos transitorios (TAI) ; lesión de reperfusión isquémica, por ejemplo, de sistemas orgánicos, afecciones quirúrgicas tales como injerto de bypass vascular (por ejemplo, CABG, injerto de bypass periférico) , enfermedad renal isquémica, estenosis arterial renal con o sin posterior isquemia y enfermedad ateroembólica de la o las arterias renales y colitis isquémica. otras enfermedades o afecciones (que incluyen enfermedades o afecciones mediadas por CCR2) , en las cuales las respuestas inflamatorias no deseables que se deben inhibir pueden tratarse, incluyendo, aunque sin limitarse a, lesión por reperfusión tal como reperfusión isquémica, ciertas enfermedades hematológicas , toxicidad inducida por citoquina (por ejemplo, choque séptico, choque endotóxico) , polimiositis, dermatomiositis, y enfermedades granulomatosas incluyendo sarcoidosis. Las enfermedades o afecciones de seres humanos o de otras especies que se pueden tratar con los promotores de la función del receptor CCR2 (incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos) , incluyen, aunque no se limitan a: - inmunosupresión, tal como aquella en individuos con síndromes de inmunodeficiencias tales como SIDA, individuos que sufren terapia de radiación, quimioterapia, terapia para enfermedad autoinmune u otra terapia farmacológica (por e emplo, terapia con corticosteroides) , lo cual causa inmunosupresión; e inmunosupresión debida a deficiencia congénita en la función del receptor u otras causas . Los anticuerpos anti-CCR2 de la presente invención pueden bloquear la unión de una o más quimioquinas, bloqueando de ese modo la cascada corriente abajo de uno o más eventos que conducen a los trastornos mencionados anteriormente . Los anticuerpos y sus fragmentos funcionales los cuales son antagonistas de CCR2 pueden utilizarse como agentes terapéuticos para el SIDA, así como también ciertas enfermedades inflamatorias. HIV-1 y HIV-2 son los agentes etiológicos del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en los seres humanos. El SIDA es el resultado, en parte, del agotamiento de linfocitos CD4+ T en individuos infectados con HIV. El HIV-1 infecta principalmente a los linfocitos T, monocitos/ macrófagos, células dendrlticas y, en el sistema nervioso central, microglias . Todas estas células expresan la glicoproteína CD4, la cual sirve como un receptor para el HIV-1 y el HIV-2. El ingreso eficaz del HIV en células objetivo depende de la unión de la glicoproteína de envoltura exterior viral, gpl20, al dominio CD4 amino-terminal . Después de la unión del virus, las glicoproteínas de envoltura del HIV-1 intervienen en la fusión de las membranas de células huéspedes y virales para completar el proceso de ingreso. La fusión de membranas dirigida por las glicoproteínas de envoltura del HIV-1 expresadas en la superficie de células infectadas conduce a la fusión de célula- célula, dando como resultado sincicios.

Recientemente, los factores de células huéspedes además de CD4 han sido sugeridos para determinar la eficacia de la fusión de membranas mediada por glicoproteínas de envoltura del HIV-1. Se ha demostrado que el receptor de transmembrana 7 (7TMR) denominado HUMSTSR, LESTR, o "fusina" permite que un rango de células que expresan CD4 soporten la infección y la fusión celular mediada por glicoproteínas de envoltura del HIV-1 adaptadas a laboratorio (Feng, Y. y otros, Science (Wash. DC) , 272: 872:877 (1996)). Los anticuerpos contra HUMSTSR bloquearon la fusión celular y la infección mediante aislados del HIV-1 adaptados al laboratorio aunque no por virus primarios macrófago-trópicos in vitro (Feng, Y. y otros, Science (Wash. DC) , 272: 872:877 (1996)). La capacidad de los receptores de quimioquina y las moléculas relacionadas para facilitar la infección de aislados del HIV-1 clínicos primarios ha sido reportada recientemente por diversos grupos (ver por ejemplo, Bates, P., Cell, 86: 1-3 (1996); Choe, H., y otros, Cell, 85: 1135-1148 (1996); Doranz y otros, Cell 85: 1149- 1158 (1996)). Estos estudios indicaron que el involucramiento de diversos miembros de la familia de receptores de quimioquina en los estadios tempranos de la infección del HIV-1 ayuda a explicar el tropismo viral y la inhibición de ß-guimioguina de aislados del HIV-1 primarios. La presente invención también proporciona un método para inhibir la infección del HIV de una célula (por ejemplo, nueva infección y/o formación de sincicios) la cual expresa un CCR2 de mamífero o una porción del mismo, que comprende poner en contacto la célula con una composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o su fragmento funcional el cual se une a un CCR2 de mamífero o una porción de dicho receptor. La composición también puede comprender uno o más agentes adicionales eficaces contra el HIV, incluyendo, aunque sin limitarse a, anticuerpos anti-CCR3, anticuerpos anti-CCR5 y anticuerpos anti-fusina. Pueden utilizarse diversos métodos para evaluar la unión del HIV a una célula y/o infección de una célula por HIV en presencia de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos que evalúan la unión de gp!20 o una porción de la misma al receptor, infección del HIV y formación de sincicios (ver, por ejemplo, Choe, H. , y otros, Cell, 85: 1135-1148 (1996)). La capacidad del anticuerpo de la presente invención para inhibir estos procesos puede evaluarse utilizando estos u otros métodos adecuados .

Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para tratar el HIV en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o su fragmento funcional que se une a un CCR2 de mamífero o porción de dicho receptor. Nuevamente, la composición también puede comprender uno o más agentes adicionales eficaces contra el HIV, incluyendo, aunque sin limitarse a, anticuerpos anti-CCR3, anticuerpos anti-CCR5 y anticuerpos anti-fusina. El uso terapéutico de anticuerpo para tratar el HIV incluye el uso profiláctico (por ejemplo, para el tratamiento de un paciente quien puede estar o quien pudo haber estado expuesto al HIV) . Por ejemplo, los proveedores del cuidado de la salud quienes pueden estar expuestos o quienes han estado expuestos al HIV (por ejemplo, por clavarse una aguja) pueden ser tratados de acuerdo con el método . Otro ej emplo es el tratamiento de un paciente expuesto al virus después del contacto sexual sin protección o la falla de protección. En el SIDA, el tratamiento con múltiples fármacos parece ser el más prometedor. Un antagonista del receptor anti-quimioquina que inhibe la infección por HIV puede ser agregado al régimen de tratamiento farmacológico, en particular bloqueando la infección viral de células nuevas.

Por lo tanto, se prevé la administración de un anticuerpo o fragmento de la presente invención en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos tales como análogos nucleósidos (por ejemplo, AZT, 3TC, ddl) y/o inhibidores de proteasa, y proporciona una adición importante a un régimen de tratamiento del HIV. En una realización, se utiliza un mAb anti-CCR2 humanizado en combinación con un agente terapéutico (es decir, uno o más) para reducir la carga viral de los pacientes, previniendo la fusión y/o infección de células nuevas. Ese tipo de anticuerpo también puede ser útil en la prevención de la infección perinatal . Otro aspecto de la invención se refiere a un método para prevenir la infección por HIV en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo o su fragmento funcional el cual se une a CCR2. De acuerdo con el método, prevenir la infección por HIV incluye el tratamiento a fin de prevenir (reducir o eliminar) la infección de células nuevas en un individuo infectado o a fin de prevenir la infección en un individuo guien puede estar expuesto, o pudo haber estado expuesto, al HIV. Por ejemplo, individuos tales como un individuo infectado con HIV, un feto de una mujer infectada con el HIV, o un trabajador de la salud puede ser tratado de acuerdo con el método de la presente invención. Modos de Administración Pueden administrarse uno o más anticuerpos o fragmentos de la presente invención a un individuo mediante una ruta apropiada, ya sea solos o en combinación con (antes, en forma simultánea con, o después) de otro fármaco o agente, o antes, en forma simultánea con o después de la intervención quirúrgica, mecánica o terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden ser utilizados en combinación con otros anticuerpos monoclonales o policlonales (por ejemplo, en combinación con anticuerpos los cuales se unen a otros receptores de quimioquina, incluyendo, aunque sin limitarse a, CCR3 y CCR5) o con productos de plasma sanguíneo existentes, tales como productos de gammaglobulina e inmunoglobulina disponibles en el comercio utilizados en tratamientos profilácticos o terapéuticos . Los anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas por separado proporcionadas en conjunto con antibióticos y/o agentes antimicrobianos . Se administra una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento (es decir, uno o más anticuerpos o fragmentos) . Una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado (incluyendo profiláctico) , bajo las condiciones de administración, tal como una cantidad suficiente para la inhibición de una función de CCR2 , y de ese modo, la inhibición de una respuesta inflamatoria o infección por HIV, o una cantidad suficiente para la promoción de una función de CCR2 , según lo indicado. El anticuerpo o fragmento puede ser administrado en una dosis única o en dosis múltiples. La dosificación puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y depende, por ejemplo, del anticuerpo o fragmento seleccionado, la edad del sujeto, la sensibilidad o tolerancia a los fármacos, y el estado general. Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, tales como los anticuerpos humanos, humanizados y quiméricos y fragmentos de unión al antigeno a menos se pueden administrar con menos frecuencia que otros tipos de agentes terapéuticos. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un anticuerpo puede oscilar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 5 o 10 mg/kg administrados en forma diaria, semanal, cada quince días o mensualmente. Son posibles una variedad de rutas de administración incluyendo, aunque sin limitarse a, oral, dietaria, tópica, parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial , intramuscular, subcutánea o infusión), inhalación (por ejemplo, inhalación intrabronquial , intraocular, intranasal u oral, gotas intranasales) , dependiendo de la enfermedad o afección a ser tratada. Otros métodos adecuados de administración también pueden incluir dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse como parte de una terapia de combinación con otros agentes. La formulación de un anticuerpo o fragmento a ser administrado varía de acuerdo con la ruta de administración y formulación (por ejemplo, solución, emulsión, cápsula) seleccionada. Una composición farmacéutica apropiada que comprende un anticuerpo o su fragmento funcional a ser administrado se puede preparar en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. También se puede utilizar una mezcla de anticuerpos y/o fragmentos. Para soluciones o emulsiones, los portadores adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas o alcohólicas/ acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponeados. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer's lactado o aceites fijos. El experto en la técnica conocen una variedad de portadores acuosos apropiados, incluyendo agua, agua tamponeada, solución salina tamponeada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , polietilenglicol liquido) , solución de dextrosa y glicina. Los vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes, o agentes de relleno de fluidos, nutrientes o electrolitos (Ver, generalmente, Remington' s Pharmaceutical Science, Edición No. 16, ack, Ed. 1980) . Las composiciones pueden opcionalmente contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según lo requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH y agentes de tamponación y agentes de ajuste de toxicidad, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro de calcio y lactato sódico. Los anticuerpos y fragmentos de esta invención pueden ser liofilizados para almacenamiento y reconstituidos en un portador adecuado con anterioridad al uso de acuerdo con técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. La concentración óptima del o de los ingredientes activos en el medio seleccionado puede determinarse empíricamente, de acuerdo con procedimientos bien conocidos por el experto, y dependerá de la formulación farmacéutica final deseada. Para inhalación, el anticuerpo o fragmento puede solubilizarse y cargarse en un dispensador adecuado para administración (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador en aerosol presurizado) . La presente invención será ahora ilustrada mediante los siguientes Ejemplos, los cuales no tienen el propósito de ser limitativos de modo alguno. Las descripciones de todas las referencias citadas en la presente invención se incorporan aquí como referencia. EJEMPLOS Ejemplo 1 Materiales : Se obtuvieron los siguientes materiales de las fuentes indicadas : anti-CD16 PE-conjugado, estreptav dina PE-conjugada y anti-IgE humana biotinilada eran de Pharmingen (San Diego, CA) . IgG anti-ratón de cabra conjugada con FITC era de Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA) . El Buffer de Lisado FACS era de Becton Dickenson (Mountain Vie , CA) y [125IJ-MCP-1 era de NEN (Boston, ??) . Células, Líneas Celulares y Cultivo Celular Se mantuvo la línea celular de linfoma pre-B murina Ll/2 en RPMI-1640 suplementada con 10% de Fetal Clone I (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 50 Unidades/mL de penicilina (Gibco, BRL) , 50 ug/mL de estreptomicina (Gibco BRL) , L-Glutamina 2 mM (Gibco BRL) y 55 uM de ß-mercaptoetanol (Gibco BRL) . Otras líneas celulares incluyeron transfectantes de células Ll/2 que expresan CCR1 (Campbell, J. y otros (1996) J. Cell Biol . 134:255-266), CCR5 ( u y otros, Nature 384: 179-183 (1996)) cultivado en el medio de cultivo antes mencionado suplementado con 800 g/ml de G418 activo. Se cultivaron células THP-1 (ATCC No. TIB202) de conformidad con las instrucciones de ATCC. Se purificaron PBMC de sangre heparinizada según lo descrito en Ponath y otros, J. Clin. Invest. 97:604-612 (1996). Preparación de Construcciones de Expresión de CCR2b y Transfectantes Estables La región codificadora para el CCR2b humano (Charo y otros (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos- de América, 91:2752) se obtuvo mediante amplificación por RT-PCR según lo descrito (Qin, S. y otros (1996) Eur. J. Immunol . , 26:640-647). Se preparó ADNc utilizando oligo (dT) -cebado, y se logró la amplificación de la región codificadora de CCR2b mediante PCR anidado con los siguientes conjuntos de cebadores los cuales corresponden a las posiciones de la secuencia de CCR2b (GenBank Acceso No. U03905; Charo y otros, Proc. Acad. Sci . Estados Unidos de América 91: 2752- 2756 (1994)) según lo indicado: 1) cebador 5': 5 ' -TGAGACAAGCCACAAGCTGAAC-3 ' (nucleótidos 11 a 32; SEC ID NO: 1) ; cebador 3': 5 ' -TCTGTATTAGTACACACAGCCC-3 ' (nucleótidos 1301 a 1280; SEC ID NO: 2); 2 ) Cebador 5 ' : 5 ' -5 ' -ATGCTGTCCACATCTCGTTCTCGG-3 ' (nucleótidos 81 a 104; SEC ID NO: 3) ; Cebador 3 ' - 5 ' - TATAAACCAGCCGAGACTTCCTGCTC-3 ' (nucleótidos 1164 a 1137; SEC ID NO: 4) . Se modificó la región codificadora de ADNc de CCR2B para contener la secuencia guía de péptido de señal de CD5 (Aruffo y otros, Cell 61:1303-1313 (1990)) . La secuencia de aminoácidos esperada de este péptido es : NH2-Met-Pro-Met-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Thr-Leu-Tyr-Leu-Leu-Gly-Met -Leu-Val -Ala-Ser-Val -Leu-Ala... (SEC ID NO: 5) Utilizando PCR con el ADNc de CCR2b como patrón y dos cebadores 5' superpuestos que contienen un sitio de restricción BamHI, se codifica la secuencia de péptidos de señal CD5 y la secuencia amino terminal de CCR2b, y un cebador 3' ubicado internamente en la región codificadora de CCR2b . cebador 5' CD5 Secl 5' - GGGGATCCAGAAACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTG-3' (SEC ID NO: 6) cebador 5' CD5 Sec2 5' - GCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCGTGCTAGCGATGCTGTCCACATCTC GTTC-3' (SEG ID NO: 7) 3' cebador CCR2AB2 - 5'- GACGACCAGCATGTTGCC-3 ' (SEC ID NO: 8; U03905 nucleótidos 272 a 255) Se digirió el fragmento amplificado de 278 pares de bases con BamHI y Apal y se insertó el fragmento de 209 pares de bases resultante en el sitio Apal en posición 206 del ADNc de CCR2b (GenBank Acceso No. U03905) para reemplazar el fragmento de 5 ' pares de bases endógeno de CCR2. La secuencia resultante que codifica un CCR2b con la secuencia líder de péptidos de señal de CD5 que precede inmediatamente al iniciador receptor metionina se insertó en los sitios BamHI y Xhol de pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) para crear el plásmido de expresión de mamífero pCD5MCPRB. El fragmento CD5-CCR2b se subclonó en el sitio BamH I-Not de pCDEF3 (Goldman y otros, (1996) Biotechniques 21:1013-1015), y esta construcción se designó CCR2bDEF3. En este vector de expresión, la expresión del gen insertado es impulsado por el promotor EF-loc. Se sembraron cincuenta mililitros de células Ll/2 a 4 x 105 células/mL el día antes de la electroporación. En el día de la electroporación, las células, las cuales habían crecido hasta una densidad de 1 x 106/mL, se centrifugaron separándolas del medio y se resuspendieron en 800 µ? de buffer de electroporación a temperatura ambiente (Zajac y otros, DNA 7:509-513). Acido L-Glutámico 120 mM (Sigma) , Acetato Mg 7 mM (EM Science), Glucosa 4,3 mM (Sigma), K Pipes 17 mM, pH 6,9 (Sigma), EGTA 1 mM (Sigma), ATP 5 mM, pH 7,0 (Sigma) . Se colocó ADN de plásmido CCR2bDEF3 linearizado con veinticinco microgramos de Sea I, extraído con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitado con isopropanol en un recipiente de electroporación con espacio de 0,4 cm. Las células resuspendidas se agregaron al recipiente, y se aplicó un solo pulso a 450 voltios, 960 µ ?. Luego, las células se transfirieron del recipiente a un frasco T-75 que contenía 15 mL de medio de cultivo Ll/2 (descrito anteriormente, y cultivado durante tres días, tiempo en el cual las células se separaron por centrifugación de su medio y se resuspendieron en medio de crecimiento Ll/2 suplementado adicionalmente con piruvato sódico 1 mM (Gibco BRL) y 0,8 mg/mL de G418 activo (Gibco BRL) . Selección de Células que Expresan CCR2b por Quimiotaxis Las células transfectadas se dejaron crecer durante once días, entonces se separaron 1:20 en medio de crecimiento fresco. Al decimosexto día, se seleccionaron las células mediante quimiotaxis. Se colocaron 600 µL de MCP-1 1 nM en RPMI 1640 suplementado con 0,5% de BSA (RPMl/BSA) en la cámara inferior y se colocaron 1 x 106 células CCR2bDEF3 en 100 µ? de RPMI/BSA en la cámara superior de una placa de quimiotaxis de 24 pocilios de poro de 3,0 micrones (Becton Dickinson) . Las células se dejaron sufrir quimiotaxis durante cuatro horas y veinte minutos en un aparato incubador humidificado, de C02 al 5%, a 37 °C, tiempo en el cual se retiró la cámara superior. Este tiempo de incubación se seleccionó en el momento del experimento puesto que era suficientemente largo como para que las células que responden al MCP-1 sufran quimiotaxis, aunque suficientemente corto como para mantener el fondo ( "background" ) bajo. Selección Secundaria de Células Que Expresan CCR2b mediante Clasificación FACS Las células que habían sufrido quimiotaxis a través de la membrana y en la cámara inferior se cultivaron, y se purificaron adicionalmente mediante clasificación FACS estéril . Se separaron por centrifugación diez millones de células CCR2bDEF3 de su medio, resuspendidas en 2,5 mi de PBS (+Ca, Mg) suplementado con Suero de Ternero Fetal inactivado con calor 1% (??? FCS") (Gibco BRL) y 2,5 mi de sobrenadante 5A11 de anticuerpo de péptido amino terminal anti-CCR2b filtrado estéril. Las células y el anticuerpo se mezclaron y se dejaron incubar en hielo durante treinta minutos. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS (+) (Gibco BRL) y se resuspendieron en 5 mL de una dilución 1:250, filtrada estéril de IgG anti-ratón de cabra F(abl)2 purificada por afinidad, conjugada con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) en PBS (+) suplementado con 1% HI FCS. Las células se incubaron durante treinta minutos en hielo en la oscuridad, y luego se lavaron dos veces con PBS (+) (GIBCO BRL) . Las células se clasificaron en el FACSCalibur® y se recogieron 4% más brillante de las células. (FL1 > 3 x 102) . Las células clasificadas se dejaron crecer, y se reclasi icaron utilizando el mismo protocolo que anteriormente . Se recogieron el 1% más brillante de las células (FL1 > 3 x 103) . Producción de Anticuerpos Monoclonales Para producir raAbs a CCR2b, los transfectantes se controlaron continuamente para asegurar que los niveles de expresión no se desviaron hacia abajo. Se llevó a cabo coloración de FACS periódicamente para determinar la expresión del receptor en los transfectantes utilizando el sobrenadante de anticuerpo anti CCR2b 5A11 con FITC de IgG anti-ratón de cabra como el anticuerpo secundario. Se lavaron veinte millones de células CCR2bDEF3.Ll/2 en RPMI 1640 (Gibco BRL) y se incubaron en RPMI 1640 más 0,2 mg/ml de Mitomicina C durante 30 minutos a 37°C. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS (+) y se inyectaron 2 x 107 células en 0,5 mL de PBS (+) intraperitonealmente en un ratón hembra C57 BL/6. Esto se repitió dos veces más en intervalos de dos semanas. La cuarta vez, se resuspendieron 2 x 107 células en 0,25 mL y se inyectaron intravenosamente. Tres días después de la inyección intravenosa, el ratón se sacrificó y se retiró el bazo y las células se fusionaron con la línea celular SP2/0 según lo descrito (Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Nueva York, 1992) . Este conjunto de ratones habla sido previamente inmunizado muchas veces con 2 líneas celulares diferentes así como también un péptido sintético, aunque no se generaron anticuerpos que mancharon células CCR2 positivas de las diversas fusiones. Las cuatro inmunizaciones anteriores con la línea celular CCR2bDEF3. Ll/2 que expresa altos niveles de CCR2b fueron críticas para obtener el anticuerpo descrito. Selección de Clon de Célula Única de Transfectantes de CCR2 mediante Limitación de Dilución Después de que el ratón recibió la última inyección, se dejaron crecer nuevamente las células dos veces clasificadas, y luego se purificaron adicionalmente limitando la dilución. Las células se colocaron en placas a 1 y 0,5 célula por pocilio en placas de 96 pocilios. Las células subclonadas de la dilución de 0,5 células por pocilio se cultivaron y se ensayaron para determinar la expresión de CCR2b mediante análisis FACS inmunofluorescente indirecto utilizando el sobrenadante 5A11 de anticuerpo anti-CCR2b con FITC de IgG anti-ratón de cabra como el anticuerpo secundario. El procedimiento era el mismo al descrito anteriormente, excepto que el volumen de tinción fue de 100 µ? . Se seleccionaron cuatro positivos y se congelaron. Identificación de Anticuerpos Monoclonales Positivos El análisis de tinción inmunofluorescente utilizando un FACScan® (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) se utilizó para identificar los anticuerpos monoclonales los cuales fueron reactivos con el receptor CCR2b. Se ensayaron ¦ los sobrenadantes de cultivo de hibridoma en un formato de 96 pocilios utilizando FITC de IgG anti-ratón de cabra como el anticuerpo secundario. Se utilizaron células CCR2bDEF3.Ll/2 para identificar anticuerpos monoclonales reactivos con CCR2b, y se utilizaron células Ll/2 no transíectadas para eliminar anticuerpos monoclonales reactivos con otras proteínas de superficie celular. Tinción FACS - Células Cultivadas Para la tinción de lineas celulares transfectantes cultivadas se resuspendieron 0,5 x 106 células en 50 µ? en PBS + 1% FCS en una placa de fondo en V de poliestireno de 96 pocilios. Se agregaron 50 µ? de sobrenadantes de anticuerpos primarios o medio HT (control negativo) , y las muestras se incubaron a 4°C durante 30 min. Se agregaron 100 µ? de PBS y las células se peletizaron mediante centrifugación y se lavaron una vez con PBS. El pellet se resuspendió en 100 µ? de PBS + 1% de FCS que contenía anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC (una dilución 1:250) y se incubó durante treinta minutos a 4°C en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en PBS, y se analizaron mediante citometría de flujo con' un citómetro FacScan utilizando el software CellQuest (Becton-Dickenson) .

Las células se fijaron con PBS/formaldehído al 1% si no debían ser analizadas el mismo día. Los anticuerpos monoclonales 1D9 y 8G2 mancharon a los transfectantes de CCR2 pero no a los transfectantes de CCR1 o CCR5 (Figura 1) . Tinción FACS - Sangre Entera Se mezclaron 100 µ? de sangre entera con 100 µL de sobrenadantes de hibridoma de anticuerpo 1D9 o medio HT (control negativo) y se incubaron a 4°C durante 30 min. Después de un lavado con PBS, se agregaron 100 µL de anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC (una dilución de 1:250) a cada muestra y se incubaron durante 30 min. a 4°C en la oscuridad. Luego, las muestras se lavaron una vez con PBS si se realiza una segunda tinción con color, de otro modo se lavaron dos veces más en PBS . Para la tinción con dos colores, se agregan 5 µ? de suero de ratón a los pellets celulares después del único lavado, se mezclaron y se incubaron durante cinco minutos a 4°C en la oscuridad. Se agregaron segundos anticuerpos primarios (o PBS como control negativo) (10 µ? anti-CD16, 100 µ? dilución 1:200 de anti-IgE) y se incubaron durante treinta minutos a 4°C en la oscuridad. Luego, las muestras se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en 100 µL de estreptavidina PE (1:200 PBS + 1% BSA) y se incubaron durante quince minutos a 4°C en la oscuridad. Se lisaron eritrocitos agregando 2 mi de Buffer de Lisado FACS a cada muestra y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante quince minutos o hasta que las muestras eran transparentes. Las células se peletizaron mediante centrifugación y se aspiró todo menos 200 µ? del sobrenadante. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo en un citómetro FacScan utilizando el software CellQuest (Becton-Dickenson) . CCR2b se expresa en la mayoría de los monoci os, una subpoblación de linfocitos y un subconjunto de granulocitos (Figura 2) . CCR2b se expresa en una población IgE-positiva en sangre periférica (basófilos) (Figura 3) . Ensayos de Unión de MCP-1 Se llevó a cabo la unión de MCP-1 en un volumen final de 0,1 mi de Hepes 50 mM pH 7,4, CaC12 1 mM, MgCl2 5 mM, azida de sodio 0,02%, BSA (HBB) 0,5%, que contenía 2,5 µg de proteína de membrana de THP-1 o 500.000 PBMC y 0,1 nM de [125I]-MCP-1. Se llevaron a cabo experimentos de unión por competición incluyendo concentraciones variables de MCP-1 sin rotular, anticuerpo 1D9, o un control negativo IgG2a. Se determinó la unión no específica siguiendo la adición de un exceso de 2500 veces de MCP-1 sin rotular. Las muestras se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente, y se separaron trazador unido y libre mediante filtración a través de placas de filtro GF/B de 96 pocilios pre-empapadas en polietilenimina al 0,3%. Los filtros se lavaron en HBB suplementado adicionalmente con NaCl 0,5 M, se secaron y la cantidad de radioactividad unida se determinó mediante conteo por centelleo líquido. mAb 1D9 inhibe la unión de [125I]MCP-1 a membranas celulares THP-1 con una IC50 de aproximadamente 0, 004 µ /tol (aproximadamente 0,02 nM; Figura 4) y a PBMC fresco con una IC50 de 0,04 µ9/t?1 (aproximadamente 0,2 nM; Figura 5) . Quimiotaxis de PBMC Se ensayó quimiotaxis utilizando una placa de quimiotaxis de 96 pocilios de 3 µt? de tamaño de poro (Neuroprobe, Cabin John, MD) . PBMC aislado mediante métodos convencionales utilizando centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque se lavaron con PBS/0,5% BSA y luego se resuspendió en medio de ensayo de quimiotaxis (HBSS/HEPES 10 mM/ BSA libre de ácido graso al 0,5%) hasta una concentración final de 10 x 106 células/ml. Las células se preincubaron en medio de ensayo de quimiotaxis a temperatura ambiente durante 20 min. con diversas concentraciones del anticuerpo anti-CCR2, 1D9, o IgGa murina no especifica. Las mismas diluciones de anticuerpo se mezclaron con quimioquina y se agregaron 30 µ? de la mezcla a cada uno de los pocilios inferiores de la placa de quimiotaxis . Los pocilios inferiores se cubrieron con la membrana, y se agregan 25 µ? de la mezcla de célula y anticuerpo a la parte superior del filtro. Las placas se incuban a 37 °C en incubador de C02 al 5% durante aproximadamente 80 min. Al concluirse la migración, la membrana se retira y la placa con los pocilios inferiores se incuba a -80 °C durante 30 minutos para congelar el contenido. Las placas se descongelan a 37°C durante 10 minutos. Se agregan 6 µ? de una dilución 1:400 de reactivo CyQuant (Molecular Probes, Eugene, OR) en un buffer de lisis proporcionado por el proveedor a cada pocilio, y se cuantifica la migración celular según lo indicado por intensidad de fluorescencia determinado utilizando un lector de placas de fluorescencia CytoFlour a 485ex/535em. mAb 1D9 inhibe la quimiotaxis inducida por MCP-1, aunque no la quimiotaxis inducida por RANTES, de PBMC fresco (Figuras 6A y 6B) . La inhibición de la quimiotaxis inducida por MCP-1 de PBMC fresco ha sido demostrada con 10 µ9/p?1 (40 nM) . Ej emplo 2 Humanización de anticuerpo monoclonal 1D9 El anticuerpo monoclonal 1D9 es probablemente inmunogeno en seres humanos, activando potencialmente una respuesta del anticuerpo anti-ratón humano (????) . Esta respuesta de ????. generalmente da como resultado una evacuación ("clearance") rápida del anticuerpo monoclonal de ratón del cuerpo, limitando de ese modo cualquier efecto terapéutico que pueda tener el anticuerpo monoclonal 1D9. Por lo tanto, en un esfuerzo por reducir la inmunogenicidad de este anticuerpo en seres humanos y para aumentar al máximo su potencial terapéutico, se llevó a cabo la humanización del anticuerpo monoclonal de ratón 1D9. Los siguientes ejemplos proporcionan un análisis detallado de los datos de la secuencia de aminoácidos de 1D9, la construcción de un modelo molecular del dominio FV de 1D9 murino, y la estrategia de diseño para la humanización exitosa del anticuerpo de ratón. Esta estrategia de diseño dio como resultado el diseño de una cantidad de versiones humanizadas tanto de la región variable de cadena liviana kappa (VK) como de la región variable de cadena pesada (VH) . En total, la región VH humanizada incluyó hasta 16 cambios de aminoácidos en las FR de la región VH humana seleccionada. Estos cambios se subdividieron entre cuatro versiones de la región VH humanizada. Adicionalmente, se incluyeron doce cambios de aminoácidos en las FR de la región VK humana seleccionada en las cuatro versiones de la región VK humanizada las cuales también se diseñaron. Análisis de secuencia de la región variable de cadena liviana kappa de 1D9 de ratón La secuencia de aminoácidos de la región VK de 1D9 (Figura 7) se comparó con otras regiones variables de cadena liviana kappa de ratón y también las secuencias de consenso de los subgrupos que las regiones variables se subdividieron en la base de datos Kabat (Kabat y otros, Sequences of proteins of immunological interest, quinta edición, Departamento de Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, Oficina de Impresión del Gobierno de Estados Unidos (1991) ) . A partir de este análisis, se encontró que la región VK de 1D9 coincide mayormente en forma cercana con la secuencia de consenso de ratón de subgrupo II kappa de ratón (Identidad = 79,46%, Similitud = 82,14%) . Cuando solo las FR de la región variable de cadena liviana kappa de 1D9 se compararon en el subgrupo II de ratón, el porcentaje de identidad aumentó hasta 87,5%, mientras que el porcentaje de similitud aumentó hasta 88,75%. Adicionalmente, la región VK de 1D9 de ratón mostró buena homología con una traducción del gen de linea germinal VK murino 70/3 (Figura 13) . En conjunto, la evidencia mencionada probó claramente que la secuencia de 1D9 era típica de una región VK de ratón. Análisis de secuencia de la región variable de cadena pesada de ID9 Un análisis similar de la región VH de 1D9 (Figura 8) encontró que coincidía con máxima cercanía con la secuencia de consenso del subgrupo lile de cadena pesada de ratón en la base de datos Kabat (Kabat y otros, Sequences of proteins of immunological interest, quinta edición, Departamento de Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, Oficina de Impresión del Gobierno de Estados Unidos (1991) ) . La identidad entre la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de ratón de 1D9 y la secuencia de consenso del subgrupo Ule de ratón se midió a 70,94%, mientras que la similitud se calculó como de 76,07%. Cuando solo las FR de la región VH de 1D9 se comparó con el subgrupo lile de ratón, el porcentaje de identidad aumentó hasta 75,86%, mientras que la similitud aumentó hasta 80,46%. La región VH de 1D9 de ratón también mostró buena homología con una traducción del gen de línea germinal VH murino MLR-RF24BG, entre otros (Figura 14) . Por lo tanto, la evidencia mencionada confirmó que la secuencia de 1D9 era típica de una región VH de ratón.

Modelado molecular del dominio de 1D9 Para ayudar en el diseño de las regiones variables humanizadas del anticuerpo 1D9, se construyeron una serie de modelos moleculares de la región FV de 1D9 de murino y las ocho variantes CDR injertadas. Esto se llevó a cabo utilizando el paquete de modelado molecular de AbM suministrado y utilizado por Oxford Molecular Limited (OML) . Las estructuras cristalográficas de rayos x del anticuerpo disponibles de la base de datos Brookhaven se formatearon para poder utilizarlas para modelado con AbM. Las FR de las regiones variables de 1D9 se modelaron en FR de regiones variables de inmunoglobulina estructuralmente resueltas similares . Si bien se mantuvieron cadenas laterales de aminoácidos idénticas en su orientación original, se sustituyeron cadenas laterales de apareamiento erróneo como en FV de 1D9 original . Los átomos estructurales de las FR de la región VK Fab Bv04-01 se utilizaron para el modelo de la región de estructura Fv de 1D9 tanto para las cadenas Vk como VH (Brookhaven PDB código lnbv, resuelto a 2 , OD) . La secuencia de Fab Bv04-01 era un buen apareamiento para las secuencias de región variable de 1D9 murino y sus variantes humanizadas. Las identidades entre Fab Bv04-01 y las secuencias de 1D9 murxnas y humanizadas oscilaron entre 76% y 78% para las secuencias de VK y de 74% a 84% para las secuencias de VH. El ensayo de AbM con estructuras conocidas ha mostrado que la homología de estructura de FR es un factor importante en la calidad de cualquier modelo, puesto que el uso de estructuras de FR que coinciden pobremente con una secuencia que se está modelando puede afectar significativa y adversamente la posición y orientación de los lazos de CDR. Para las estructuras de armazón de CDRs Ll, L2, L3 , Hl y H2, se tomaron las conformaciones para todos los modelos de clases canónicas utilizadas por AbM sin modificación, utilizando las clases mostradas en las figuras 9 y 10. Para la estructura de armazón del lazo Ll, las conformaciones de lazos de la región VK de 1D9 murina se tomaron de la Clase 4 canónica de AbM. Esta clase canónica se basa en aquellas descritas por Chothia y sus colegas (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . 197:901 (1987) ; Chothia y otros, Nature 34:877 (1989); Tramontano y otros, J. Mol. Biol. 215: 175 (1990); y Chothia y otros, J. Mol. Biol. 227:799 (1992)), aunque se han modificado para tomar en cuenta estructuras que se han vuelto disponibles desde que se publicaron los artículos originales . El ensayo del rendimiento de las predicciones de AbM para estructuras de lazo conocidas ha mostrado que los lazos de CDR los cuales se crean de este modo son generalmente modelados muy precisamente, es decir hasta dentro de desviaciones 1-1, 5? RMS. El lazo H3 en la región VH de 1D9 es comparativamente corta en seis residuos de largo. Se modeló utilizando una búsqueda de conformaciones de armazón de estructuras de rayos X en el banco de datos Brookhaven. Para lazos cortos como este, existen suficientes conformaciones de lazos de estructuras de rayos X conocidas para saturar el espacio conformacional disponible para el lazo. El ensayo de las predicciones hechas por AbM con las estructuras de nuevos anticuerpos, donde la estructura no está incluida en las bases de datos utilizadas por el programa, muestra que para los lazos CDR H3 de este tamaño, la precisión es probablemente al menos 2,0Á. Después de ajustar todo el modelo para choques estéricos obvios, se sometió a minimización de energía, según lo implementado en MA.CROMODEL, tanto para aliviar contactos atómicos desfavorables como para optimizar interacciones de van der Waals y electrostáticas. Diseño de las variantes de anticuerpo VK de 1D9 humanizadas El primer paso en el diseño de las regiones variables humanizadas del anticuerpo 1D9 fue la selección de la región variable de cadena liviana kappa humana que servirla como la base para la región VK de 1D9 humanizada. Como una ayuda para este proceso la región VK de 1D9 se comparó inicialmente con la secuencia de consenso de los cuatro subgrupos de región variable de cadena liviana kappa humana según lo definido por Kabat (Kabat y otros, Sequences of proteins of immunological interest, quinta edición, Departamento de Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, Oficina de Impresión del Gobierno de Estados Unidos (1991) ) . La región variable de cadena liviana de 1D9 de ratón era más similar a la secuencia de consenso del subgrupo II de cadena liviana kappa humano, con el cual exhibió una identidad de 76,2% con respecto a la región variable entera y una identidad del 82,5% dentro de la FRs sola. Cuando se mide con respecto a la similitud, estos valores aumentaron hasta 79,7% en total y 85,0% dentro de las FRs solas. Por consiguiente, parecía generalmente coincidir bien con las secuencias de región variable de cadena liviana kappa humanas del subgrupo II kappa. Luego, se comparó la VK de 1D9 de ratón con todos los ejemplos registrados de secuencias individuales de regiones variables humanas públicamente disponibles. La Figura 15 muestra los mejores diecisiete apareamientos con la región VK de 1D9 de ratón los cuales se identificaron a través de este análisis. En general, el algoritmo de búsqueda seleccionó el anticuerpo 036521 de región VK humano (Rheinnecher y otros, Journal of Immunology. 157 (7) : 2989-97 (1996)) como el mejor apareamiento con la región VK de 1D9 de ratón (figura 16) . Sin embargo, una revisión del papel fuente para este anticuerpo reveló que los cebadores de oligonucleótidos murinos se habían utilizado para rescatar los genes del hibridoma. Esto quería decir que este anticuerpo era de hecho un anticuerpo murino y no humano, según lo sugerido por la base de datos Kabat . Por lo tanto, el siguiente mejor apareamiento con la región VK de 1D9 murina que fue seleccionado por la búsqueda en la base de datos fue la región VK humana del anticuerpo HF-21/28 (Número de ID en la base de datos Kabat 005056; Chastagner y otros, Gene 101(2) :305-6 (1991)) . La secuencia humana tenía una identidad general con la región VK de 1D9 de 79,3% y 85,0% dentro de las FRs solas. Cuando se miden con respecto a la similitud, estos valores aumentan a 83,99% total y 87,5% dentro de las FRs solas. Adicionalmente, los aminoácidos de FR claves fueron más conservativamente preservados en la región VK HF-21/28 que en las otras regiones variables de cadena liviana kappa humanas candidatas. Por consiguiente, la región FR de cadena liviana kappa HF-21/28 fue seleccionada como la secuencia aceptora humana para la humanización de la región variable de cadena liviana kappa del anticuerpo 1D9. Desafortunadamente, el último residuo en FR4 (en posición 107, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) de la región VK HF-21/28 humana no fue definido por la base de datos Kabat o los autores quienes originalmente aislaron esta secuencia de región variable. Por lo tanto, se decidió insertar el aminoácido más comunmente encontrado en esta posición en las secuencias de regiones variables descritas por el subgrupo 6-II de cadena liviana kappa humana de Kabat (Kabat y otros, Sequences of proteins of immunological interest, quinta edición, Departamento de Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, Oficina de Impresión del Gobierno de Estados Unidos (1991) ) . Por consiguiente, se agregó lisina en posición 107 en FR4 en base a un análisis de la base de datos Kabat el cual descubrió que el 85,7% de las secuencias en el subgrupo K-II de cadena liviana kappa humano de Kabat tenia una lisina en esta posición. Luego, esto se convirtió en la base de la primera versión humanizada de la cadena liviana kappa de 1D9 (1D9RKA) , la cual comprendía esencialmente las CDR' s de la región VK de 1D9 y las FRs de la región VK de HF-21/28. Las Figuras 19A-19C definen la secuencia de aminoácidos de esta primera versión CDR-inj ertada de la región VK de 1D9 humanizada . El siguiente paso en el proceso de diseño fue estudiar las secuencias de aminoácidos de las FRs de la región VK de HF-21/28 para determinar si cualquiera de estos residuos aminoácidos podría influir de manera adversa en la unión al antígeno. Esto podría ser causado directamente a través de interacciones con antígeno, o indirectamente alterando la confirmación u orientación de los lazos de CDR. Este fue un proceso difícil el cual son se hizo posible a través de la disponibilidad de un modelo de las regiones variables de 1D9, es decir, tanto las regiones VK como VH. No obstante, cualquier aminoácido en las FRs de 1D9 de ratón que parecía afectar la unión al antígeno se consideró luego para la conversión en el anticuerpo 1D9 humanizado. Al decidir que residuos murinos se conservan, se consideraron los siguientes puntos : Fue de gran importancia que las estructuras canónicas de los lazos hipervariables (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . 197:901 (1987); Chothia y otros, Nature 34:877 (1989); Tramontano y otros, J. Mol. Biol. 215:175 (1990); y Chothia y otros, J. Mol. Biol. 227:799 (1992)) se conservaron. Por consiguiente, fue crucial conservar en las regiones variables de 1D9 humanizadas todos los residuos de FR de ratón que eran parte de estas estructuras canónicas (Figuras 9 y 10) . Las secuencias de las regiones variables del anticuerpo 1D9 se compararon con secuencias similares de otros anticuerpos de ratón para identificar residuos no usuales o raros los cuales pueden haber indicado un rol importante en la unión al antígeno. Luego, esto se investigó utilizando el modelo de ratón de los genes de regiones variables de 1D9. También se realizó un análisis directo del modelo para tratar de predecir si cualquiera de los otros residuos de FR de ratón no presente en las FRs humanizadas podría influir en la unión al antígeno de algún modo. También se realizaron comparaciones de las secuencias aceptoras humanas individuales para las regiones variables de cadena liviana y de cadena pesada kappa con la secuencia de consenso de subgrupos de regiones variables humanas a los cuales pertenecen las secuencias aceptoras. La identificación de cualquier aminoácido idiosincrático en las secuencias donantes humanas fue importante, ya que estas podrían haber afectado adversamente la unión al antígeno. Puesto que las regiones variables de cadena liviana y pesada humanas seleccionadas derivarían de dos anticuerpos humanos diferentes, debería realizarse un análisis cuidadoso de los residuos de empaquetadura de interdominio de tanto las regiones variables de cadena liviana kappa donantes como aceptoras (Chothia y otros, J. Mol. Biol . 186:651 (1985)) . Esto fue debido a que cualquier empaquetadura errónea en esta región podría haber tenido un efecto drástico luego de la unión al antígeno, sin importar la conformación de las estructuras de lazo de CDR del anticuerpo 1D9 humanizado. Si bien había 12 diferencias de aminoácidos entre las FRs de la región VK de 1D9 de ratón donadora y la región VK de HF-21/28 humana aceptora, solo dos residuos de ratón fueron considerados suficientemente importantes para afinidad de unión para preservarlos en las FRs humanizadas . Los primeros de los cambios de FR que se introdujeron en 1D9R B se ubicó en posición 36. Este residuo es un residuo Vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol. 224:487 (1992)) y se predice que es un residuo determinante de estructura clave para la estructura de lazo Ll según lo definido por Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 197:901 (1987); Chothia y otros, Nature 34:877 (1989); Tramontano y otros J. Mol. Biol. 215: 175 (1990); y Chothia y otros, J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)) . Si bien ambos residuos son hidrófobos, el Phe humano es más voluminoso en esta posición, y las estructuras de rayos X con Leu y Phe en esta posición muestran que si Phe está presente el impedimento estérico hace que la cadena lateral en 34Asn apunte en dirección opuesta. Por lo tanto, se consideró crítico para la humanización exitosa de la cadena liviana kappa de 1D9. El segundo cambio incorporado en la versión humanizada de 1D9RKB fue en el residuo 37, es decir, Gln37Leu. si bien este fue un cambio conservador, se produjo en una región altamente conservada en la base de CDR1. Se pensó que preservando este residuo Leu murino en esta versión, al lado del residuo Leu murino en posición 36, se podría preservar la afinidad del anticuerpo humanizado. Dos otras versiones de la región V humanizada también fueron consideradas para construcción para explorar las consecuencias de afinidad de unión y estructurales de la manipulación de las FRs del anticuerpo 1D9 humanizado. 1D9RKC era esencialmente idéntico a 1D9RKB, excepto por la mutación GlnlOOGly. Existe una diferencia drástica en el volumen molecular entre estos dos residuos, y por ende esta versión se realizó para explorar las consecuencias de este cambio para las Frs de la cadena liviana kappa humana reconformada en la estructura del anticuerpo y la afinidad con el anticuerpo en general . 1D9R D contenia las modificaciones descritas en 1D9RKC y, adicionalmente, contenía el cambio de FR Glnl7His. Si bien Gln y His son similares en cuanto al tamaño y ambos son débilmente polares, el resido de ratón (His) en esta posición es extremadamente raro entre todas las secuencias de VK de ratón (0,07% total, aunque no se ha observado en secuencias del subgrupo II de abat de ratón) y nunca se ha visto en cualquiera de las secuencias de VK humanas. A la inversa, el residuo Gln es más comúnmente visto en esta posición en las secuencias de ratón (16,16% total y 6,12% en secuencias del subgrupo II Kabat de ratón) y humanas (5,00% total y 39,7% en secuencias del subgrupo II de Kabat humanas) . Por lo tanto, la simple rareza del His en esta posición sugiere que puede ser importante para la unión, si bien no hay clara evidencia que sustente esto a partir de los datos de modelado molecular. Una descripción de las secuencias de aminoácidos de todas las variantes de región VK del anticuerpo 1D9 humanizado propuestas anteriormente se proporcionan en la Figura 11. Diseño de variantes del anticuerpo 1D9 VH Una vez más, el primer paso en el diseño de la región VH humanizada del anticuerpo 1D9 de ratón fue la selección de la región variable de cadena pesada humana aceptora que serviría como la base de la región VH de 1D9 humanizada. Cuando la región VH de 1D9 se comparó inicialmente con las secuencias de consenso de los tres subgrupos de región variable de cadena pesada humana, se encontró que era la mas similar a la secuencia de consenso para el subgrupo III de cadena pesada humana, con una identidad total del 69,231% y una identidad del 78,161% entre las FRs solas. Cuando se miden con respecto a la similitud, estos valores aumentaron a 74,359% total y a 82,759% dentro de las FRs solas. Luego, la región VH de 1D9 de ratón se comparó con todos los ejemplos registrados de secuencias individuales de regiones variables humanas públicamente disponibles. Las Figuras 17A-B muestran los mejores 24 apareamientos a la región VH de 1D9 de ratón los cuales fueron identificados a través de este análisis. En general, el algoritmo de búsqueda seleccionó la región VH humana del anticuerpo 4B4'CL (número de ID de la base de datos abat 000490; Sanz y otros, Journal of Immunology. 142:883 (1989)) como el mejor apareamiento a la región VH de 1D9 de ratón. La región VH de este clon tenía una identidad total con la región. VH de 1D9 de 67,2%, un valor que aumentó hasta 80,95% cuando se compararon las FRs solas (figuras 18A-B) . Cuando se miden con respecto a la similitud, estos valorés aumentaron a 69,66% total y a 84,52% dentro de las FRs solas. Por ende, si bien una vez más no la más homologa de las secuencias VH aceptoras humanas potenciales, esta FR humana se convirtió en la base de la versión humanizada de la cadena pesada de 1D9. El siguiente paso en el proceso de diseño consistió en estudiar las secuencias de aminoácidos de las FRs de región VH de 4B4 ' CL aceptora humana para determinar si cualquiera de estos residuos aminoácidos podría afectar adversamente la unión al antígeno. Una vez más, los modelos moleculares construidos por OML eran importantes en este proceso de diseño, de los cuales una cantidad de aminoácidos en las FRs de región VH de 1D9 murino se identificaron para conversión en las primera (1D9RHA) y subsiguientes versiones del anticuerpo 1D9 humanizado (Figura 12 y Figuras 20A-C) . Habían 16 diferencias de aminoácidos entre las FRs de las regiones de 1D9 de ratón donadoras y VH de 4B4'CL humanas aceptoras, y hasta 5 residuos murinos fueron considerados para conservación en FRs humanizadas (Figura 12) . 1D9RHA consistió en las CDRs de la región VH del anticuerpo 1D9 murino insertadas genéticamente en las FRs de la región VH del anticuerpo 4B4 ' CL humano. 1D9RHB era idéntico a la versión 1D9RHA además de las dos mutaciones FR1, Thr28Ser y Ser30Asn. Estos cambios se realizaron porque representaban aminoácidos Vernier según lo definido por Foote y Winter (J. Mol. Biol . 224:487 (1992)), que se creía que eran críticos para la conformación del lazo Hl . Los residuos 27-30 son considerados parte del lazo Hl mismo y por ende son aun más importantes para la correcta conformación y orientación de este lazo, justificando su conservación aun más fuertemente. Por ende, estos dos residuos representaban la suma de los cambios realizados a las FRs de la secuencia de VH de 4B4'CL humana en 1D9RHB. 1D9RHC era idéntico a la versión 1D9RHB excepto que contenía dos cambios adicionales en posiciones Gly49Ala y Phe67Tyr. El Gly49Ala era un cambio conservador. Sin embargo, la posición de residuo 49 se ha identificado como un residuo Vernier (Foote y Winter (J. Mol. Biol. 224:487 (1992)), importante para la estructura de lazo hipervariable H2 , entonces se decidió conservar el residuo Ala murino en esta versión. La posición de residuo 67 también era una posición de residuo Vernier, identificándolo como importante para mantener la conformación de lazo de CDR. Tyr es muy raramente visto en secuencias VH humanas (0,08% total) y no se ha encontrado previamente en regiones VH murinas en esta posición. Por consiguiente, debe haber surgido a través de mutación somática. Por lo tanto, dada su ubicación cercana a CDR2 de acuerdo con el modelo molecular y su status de residuo Vernier, se decidió conservar el residuo Tyr murino en esta posición. 1D9RHD era idéntico a 1D9RHC excepto por una mutación Thr93Val . Este residuo había sido identificado como importante tanto como un residuo de empaquetadura VH/VK (Chothia y otros, J. Mol. Biol. 186:651 (1985)). Asimismo, su posición enterrada entre los lazos de CDR Hl y H3 , de acuerdo con el modelo molecular, sustentó la decisión de conservar el residuo Val murino en esta posición. Una descripción de las secuencias de aminoácidos de todas las variantes de región VH humanizadas descritas anteriormente se proporciona en la Figura 12. Inhibición de la Unión de MCP-1 por la Versión Humanizada de 1D9 La Figura 25 ilustra la capacidad de mAb murino 1D9 y una versión humanizada de mAb ID9 que comprende la cadena pesada 1D9RHAVH (Figura 12) y la cadena liviana 1D9RKAVK (Figura 11) para inhibir la unión de [125I]-MCP-1 a células THP-1 enteras. Se incubaron 0,5 X 106 células THP-1 en HEPES 50 mM, CaCl2 1 mM, MgCL2 5 mM, BSA 0,1%, azida de sodio 0,05% (buffer de unión) con diferentes diluciones de muestras de anticuerpo durante 10 minutos a 37 °C. Se agregó un volumen igual de [125I]-MCP-1 en buffer de unión hasta una concentración final de 0 , 1 n y se incubó durante 30 minutos más a 37°C. Se diluyeron las células y se sometieron a vórtice con un volumen igual de buffer de unión con NaCl 0,5 M (buffer de lavado) y se peletizaron mediante centrifugación (centrífuga de estantería, 7000 rpm, 2 minutos) . Después de la remoción del sobrenadante, el pellet se sometió a vórtice en 200 µ!> de buffer de lavado, se hizo girar como antes, y se eliminó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 100 µ?? de buffer de lavado y se contaron en un contador gamma (Cobra, Packard Instruments) . Se llevó a cabo el análisis de los datos utilizando software Graphpad. Ejemplo 3 Creación de Vectores de Cásete de ADN de Inmunoglobulina Combinados Se utilizó un pcDNA3 como un vector de armazón el cual contiene el gen para resistencia a G418 (NEO) para permitir la fácil selección en condiciones de investigación. Se eliminó el sitio de restricción Spel de pcDNA3 mediante mutagénesis dirigida al sitio. El promotor EF-la del plásmido pcDEF3 (originalmente pBOS) se insertó en pcDNA3, eliminando de ese modo el promotor CMV. Un sitio BamHI en el ligante de clonación pcDNA3 y un sitio de clonación Mfe I dentro del promotor EF-la se eliminaron utilizando mutagénesis dirigida al sitio, y un sitio BamHI se agregó 3' en la región poliA. Esto dio lugar a la combinación de las regiones activas de cadena pesada y liviana en un vector único y daría lugar a la adición de cualquier otro marcador seleccionable incluyendo el cásete génico DHFR que confiere resistencia a trexato de metilo. Los casetes de cadena pesada (incluyendo su promotor y región de poliadenilación) se subclonaron de los diversos vectores de cásete único e sus correspondientes vectores de cásete de cadena liviana para crear los dos vectores de cásete combinados (Figura 26) . Las combinaciones se sintetizan en la Tabla 1. Todos los vectores de combinación tenían una estructura general similar que se muestra en la Figura 27. El vector pLKT0 58, creado combinando pLKTOK55 y pLKTOK57, puede utilizarse para producir un anticuerpo que contiene una región constante kappa humana y región constante de IgGl humana en su forma natural. El vector pLKT0K59, creada combinando pLKTOK56 y pLKTOK57, pueden utilizarse para producir un anticuerpo que contiene una región constante kappa humana y una región constante IgGl-FcRmut humana que contiene las mutaciones en posiciones L235A y G237A. Estas mutaciones inhiben la unión de la región constante a receptores Fe humanos e inhiben la iniciación de reacciones ADCC . Ese tipo de mutación se ha descrito previamente en la Patente de Estados Unidos No. 5.985.279 y en la Publicación Internacional No.: O 98/06248, las cuales se incorporan aguí como referencia. Los vectores pLKT0K92 y pLKT0 73, creados combinando pLKTOK55 o pLKTOK56 y pLKTOK72, pueden utilizarse para producir anticuerpos que contienen regiones constantes lambda humanas y IgGl-WT humana (pLKTOK92) o IgGl-FcRmut humana (pLKTOK73 ) . Los vectores pLKTOK68 y pLKTOK69, creados combinando pLKTOK65 o pLKTO 66 y pLKTOK67, pueden utilizarse para producir anticuerpos que contienen una región constante kappa de macaco y una región constante de IgGl de macaco. La región constante de pLKTOK68 es IgGl-WT tanto para macacos cinomolgus como rhesus . La región constante de pLKTOK69 es IgGl-FcRmut que contiene las mutaciones L235A y G237A y teóricamente deberían inhibir la unión de la región constante a receptores FC de macaco. La región constante kappa es una de las dos regiones constantes kappa expresadas por ambos macacos rhesus y cinomolgus pues deberla reconocerse como natural por ambas especies de monos . Los vectores pLKTOK63 y pLKTOK64, creados combinando pLKTOK60 o pL T0K61 y pLKTOK62, pueden utilizarse para producir anticuerpos que contienen una región constante kappa de ratón y una región constante de IgG2a de C57BL/6 de ratón.

La región constante de pLKTOK63 es la conformación natural de IgG2a en ratón y es el alotipo más cercanamente apareado en estructura y función con IgGl humana. La región constante de pLKT0K64 contiene la IgGl murina con las mutaciones en posiciones L235A y G237A (para la región I de Fe) y E318A (para la región II de Fe) para inhibir la unión de la región constante a los receptores FC de ratón e inhibir la iniciación de reacciones ADCC (Ver, Isaacs JD, y otros. Therapy with monoclonal antibodies II. The contribution of Fe gamma receptor binding and the influence of C (H) 1 and C (H) 3 domains on in vivo effector function. 1998. J Immunol . 161 (8) : 3862-9) Tabla 1. Composición de vectores de expresión combinados VECTOR VECTOR DE COMPOSICION VECTOR DE COMPOSICION COMBINADO CADENA DE CADENA CADENA DE CADENA PESADA PESADA LIVIANA LIVIANA pLKTOK58 pLKTOK55 nVHL- IgGl- PLKTOK57 riVKL - WT humana Kappa C humana pLKTOK59 pLKTO 56 nVHL- IgGl- PLKTOK57 nVKL - FcRmut Kappa C humana humana pLKTOK92 pLKTO 55 nVHL- IgGl- pLKTOK72 nVLL - WT humana Lambda C Humana pLKTOK73 pLKTO 56 nVHL- IgGl- pLKTOK72 nVLL - FcRmut Lambda C humana Humana pLKTOK68 pLKT0K65 nVHL- IgGl- pLKTOK67 nVKL - WT de Kapp C de macaco macaco pLKTOK69 pL TOK66 nVHL- IgGl- pL TOK67 nVKL - FcRmut de Kappa C de macaco macaco pLKTOK63 pLKTOK60 nVHL - pLKTOK62 nVKL - IgG2a-WT de Kappa C de ratón ratón pL TOK64 pLKTOK61 nVHL - pLKTO 62 nVKL - IgG2a- Kappa C de FcRmut de ratón ratón Ejemplo 4 Creación de Secuencias de Inserción de Cásete de ADN: Adaptando regiones variables de anticuerpo Para ensayar estos vectores creando anticuerpos intactos, las regiones variables del anticuerpo 1D9 monoclonal se adaptaron por PCR para agregar los sitios de enzimas de restricción deseados (Mfel y BIpI para el VH, PpuMI y BsiWI para el VK de macaco y humano y PpuMI y Clal para el VK de ratón. Los anticuerpos ID9 han sido descritos previamente en las Publicaciones Internacionales Nos : WO 00/05265 y WO 01/57226, las cuales se incorporan aguí como referencia. Una vez adaptados, estos y cualquier otro conjunto de regiones variables se pudieron clonar en los diversos vectores de expresión. Los cebadores para la región VH son diseñados de modo que el cebador 5' incluya los 7 codones al final del guía VH (incluyendo la enzima de restricción Mfe I) y los primeros 7-9 codones del hibridoma VH. El cebador 3' incluyó 7-9 codones del hibridoma VH seguido por 3 codones de la región constante de IgGl (incluyendo la enzima de restricción BlpI) . Los cebadores utilizados para adaptar regiones variables son demostrados en la Tabla 2, (las letras en mayúscula ilustran secuencias idénticas para todos los anticuerpos codificados en vectores; las letras en minúscula se determinan mediante la secuencia del anticuerpo individual) .

Los cebadores para la región VK son diseñados de modo que el cebador 5' incluye los 6 codones al final del guía VK (incluyendo la enzima de restricción PpuM I) y los primeros 7-9 codones del hibridoma VK (Tabla 2) . El cebador 3' humano incluyó 7-9 codones del hibridoma VH seguido por 4 codones de la región constante kappa humana (incluyendo la enzima de restricción BsiWI) . El cebador 3' de ratón incluyó 7-9 codones del hibridoma VH seguido por 12 codones de la región constante kappa de ratón (incluyendo la enzima de restricción Clal) (Tabla 2) . Los cebadores utilizados para adaptar el gen VH 1D9 del hibridoma fueron nlD9VH5 y nlD9VH3. Los cebadores utilizados para adaptar el gen VK de 1D9 del hibridoma fueron nlD9VK5 y nlD9VK3. Los genes VH y VK de 1D9 adaptados se clonaron en los vectores en clonación de dos pasos convencional para crear los plásmidos completos (Figura 28) . Tabla 2. Cebadores para adaptar VH y VK de 1D9 para clonación en todos los vectores de expresión. (Las letras en mayúscula son idénticas para todos los anticuerpos . Las letras en minúscula se determinan por la secuencia del anticuerpo individual) . CEBADOR SECUENCIA nlD9VH5 5' TTACCCAATTGTGTCCTGTCCgaggtgcagcttgttgagtctg 3' SEC ID NO: 118 nlD9VH3 5' GTTTTAGGCTGAGCTgacggtgaccgtggtccctgtg 3' SEC ID NO : 119 nlD9VK5 5' TTCCCAGGGTCCCGTTCCgatgttgtgatgacccagact 3' SEC ID NO: 120 nlD9V hum3 5' AGCCACCGTACGCtttatttccagcttggtcc 3' SEC ID NO: 121 nlD9VKmur3 5' TGGGAATATCGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCACGC11tatttccagcttggtcc 3' SEC ID NO 122 Ejemplo 5 Ensayos del Sistema: Determinación de índices Relativos de Producción de Anticuerpos El nivel de producción de proteína, el índice de pliegue correcto y el índice de transporte de células determinan la elevada producción de proteínas secretadas . Un componente principal de producción proteica es la función de su promotor. Para el pliegue exitoso y transporte de anticuerpos de célula, deben producirse dos proteínas y asociarse apropiadamente . Se cree que teniendo concentraciones similares de las cadenas pesada y liviana puede ayudar en la asociación, pliegue y transporte de los anticuerpos . Un exceso de una cadena de anticuerpo dentro de una célula puede conducir a la muerte celular. Creemos que creando casetes en los cuales cada cadena de anticuerpo tenía su propio promotor a través de sitio de poliadenilación aumentaría la probabilidad de producción proteica equivalente de las dos cadenas. Este sistema también utiliza insertos de ADNc que eliminan la necesidad de modificación pos-translacional . La variabilidad disminuida puede reducir los niveles de otras especies de ARN y aumentar los niveles de las especies de ARN deseadas. Para analizar este sistema y determinar las combinaciones de promotores óptimas, se crearon vectores con los promotores CMV o EF-la (Ver las Patentes de Estados Unidos Nos.: 5.225.348 y 5.266.491; Mizus ima S, Nagata S. pEF-BOS, a po erful mammalian expression vector. 1990 Nucleic Acids Res 18(17) :5322. En ambos casos, los sitios de restricción que interferirían con la clonación dentro de estos casetes se eliminaron mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se eliminó el sitio de clonación Spel de CMV y el sitio de clonación Mfel se eliminó de EF-la. El ensayo con un cásete EGFP demostró que estos cambios no hicieron ningún cambio notable en la función general de los promotores. También se creó un vector con una combinación del promotor CMV mutado con la beta-quinesina IRES para ver si esto aumentaba la producción de anticuerpos. Se utilizó el vector pcDNA3 como un vector de armazón puesto que contiene el gen para resistencia a G418 (NEO) para permitir la fácil selección en condiciones de investigación. En este vector se clonó el promotor CMV mutado, el promotor CMV mutado con la beta-quinesina IRES o el promotor EF-la mutado . Los cambios para ayudar en la clonación se realizaron al armazón del vector incluyendo la remoción de un sitio de clonación Mfel 5' del promotor. Un sitio BamHI en el ligante de clonación pcDNA3 se eliminó y se agregó un sitio BamHI 3' de la región de poliadenilación. Este sitio BamHI de flanqueo permite la transferencia de los casetes de cadena pesada (como un fragmento BglIl/BamHI) incluyendo sus promotores y regiones de poliadenilación en vectores que contienen los casetes de cadena liviana. Como queda un sitio BamHI único después de la clonación, da lugar a la última adición mencionada de cualquier otro marcador seleccionadle incluyendo el cásete génico para DHFR, el cual confiere resistencia a metotrexato. Se construyeron tres vectores apareados para analizar el sistema. Cada uno era un único vector con un cásete de cadena liviana (con su promotor y región de poliadenilación) seguido por un cásete de cadena pesada (con su promotor y región de poliadenilación) . Los tres vectores contienen el VK de 1D9 unido f ncionalmente al gen C Kappa humano y el VH de ID9 unido funcionalmente al gen IgGl-FcRmut humano mediante el método descrito en la construcción de los insertos . Los vectores diferían solamente en su combinación de promotores. El vector pLKTO 34 tenía casetes de cadena liviana y pesada impulsados por el promotor CMV mutado. El vector pLKTOK36 tenía casetes de cadena liviana y pesada impulsados por el promotor CMV mutado combinado con la beta-quinesina IRES . El vector pLKTOK38 tenía casetes de cadena liviana y pesada impulsados por el promotor EF-la. Se transfectaron vectores completados en células CHO y se seleccionaron en medio G418. Este medio dio como resultado la muerte de todas las células que no contienen el gen para resistencia a Neomicina. Después de 5 días de selección en G418, las células se tripsinizaron para preparar una única suspensión celular y se colocaron en placas en placas de 96 pocilios en la proporción de 1, 5 o 10 células / pocilio. A 5 días de selección, la mayoría de las células no resistentes G418 será programadas para morir. Estos clones se expandieron y se analizaron repetidamente para determinar su capacidad de retener altos niveles de producción. Después de 10 días en las placas de 96 pocilios, las placas se calificaron visualmente para seleccionar los pocilios que contienen un clon CHO único. A las dos semanas, se ensayan para determinar su capacidad de producir y secretar anticuerpo intacto según lo medido por un ELISA que cubre los pocilios con un Fab' contra pesado y ligero humano y desarrolla con Proteína A unida al HRP enzimático. En diversas transfecciones , 50-70% de los pocilios de clon único ensayados estaban produciendo anticuerpo en cantidades significativas y generalmente 70% + retendría la producción después de la transferencia. Se ensayaron los mejores clones en cuanto a su capacidad de producir anticuerpo durante un período de 5 días tanto con como sin ácido butírico (necesario para amplificar la producción de CMV) . Se determinó que las células CMVmut produjeron un promedio de 0,5 ug/ml sin tratamiento con ácido butírico y 1,8 ug/ml con tratamiento con ácido butírico. Las células CMVmut/IRES produjeron un promedio de 0,7 ug/ml sin tratamiento con ácido butírico y 0,2 ug/ml con tratamiento con ácido butírico. Las células EF-la produjeron un promedio de 122,6 ug/ml sin tratamiento con ácido butírico y 50,2 ug/ml con tratamiento con ácido butírico. Los resultados demostraron que el promotor EF-la produjo lOOx la cantidad de anticuerpo. Es bastante posible que las dos cadenas del anticuerpo impulsado por sus propios promotores y teniendo sus propias regiones de poliadenilación permite que las dos proteínas sean producidas en proporciones similares. Teniendo cantidades similares de las dos cadenas probablemente ayuda a la asociación correcta y rápida, pliegue y transporte hacia afuera de las células CHO. El ensayo funcional de los anticuerpos generados demostró que los anticuerpos producidos utilizando la función del presente sistema en forma similar a aquellos producidos por el hibridoma 1D9 original. Si bien la invención ha sido particularmente mostrada y descrita con referencias a sus realizaciones preferidas, los expertos en la técnica entenderán que pueden efectuarse diversos cambios en forma y detalles sin apartarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno que tiene especificidad e unión para CCR2 y que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende por lo menos una región determinante de la complementariedad de la región variable de cadena pesada de anticuerpo monoclonal 1D9 y una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 110 o una porción de la misma. 2. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región determinante de la complementariedad se selecciona entre el grupo formado por: a) los aminoácidos 31-35 de SEC ID NO: 10; b) los aminoácidos 50-68 de SEC ID NO: 10; y c) los aminoácidos 101-106 de SEC ID NO: 10. 2. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, donde la cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada del anticuerpo 1D9. 4. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 3, donde las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada son los aminoácidos 31-35 de SEC ID NO: 10, los aminoácidos 50-68 de SEC ID NO: 10, y los aminoácidos 101-106 de SEC ID NO: 10. 5. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la región variable de cadena pesada comprende una región de estructura derivada de la cadena pesada variable del anticuerpo 4B4'CL. 6. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20. 7. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de cadena pesada comprende el aminoácido de SEC ID NO 17. 8. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 108. 9. La cadena pesada de ínmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región constante está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 111 o una porción de la misma. 10. La cadena pesada de Ínmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 108 y la región constante está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 111 o una porción de la misma. 11. Una cadena liviana de Ínmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, que tiene especificidad de unión para CCR2 y que comprende una región variable de cadena liviana humanizada que comprende al menos una región determinante de la complementariedad de la región variable de cadena liviana del anticuerpo monoclonal 1D9 y una región constante de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 112. 12. La cadena liviana de ínmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región determinante de la complementariedad se selecciona del grupo formado por: a) los aminoácidos 24-39 de SEC ID NO: 9; b) los aminoácidos 55-61 de SEC ID NO: 9; y c) los aminoácidos 94-102 de SEC ID NO: 9. 13. La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, donde la cadena liviana comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena liviana del anticuerpo 1D9. 1 . La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 13, donde las regiones determinantes de la complementariedad de cadena liviana son los aminoácidos 24-39 de SEC ID NO: 9, los aminoácidos 55-61 de SEC ID NO: 9, y los aminoácidos 94-102 de SEC ID NO: 9. 15. La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, donde la región variable de cadena liviana comprende una región de estructura de la cadena liviana variable del anticuerpo HF21/28. 16. La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región variable de cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 107. 17. La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región variable de cadena liviana comprende un aminoácido de SEC ID NO: 12. 18. La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región variable está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 109. 19. La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región constante está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 113 o una porción de la misma. 20. La cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región variable está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 109 y la región constante está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 113 o una porción de la misma. 21. Una inmunoglobulina humanizada, o una porción de unión al antigeno de la misma, que tiene especificidad de unión para CCR2 y que tiene una cadena pesada y una cadena liviana, donde la cadena pesada es una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10. 22. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 21, donde la cadena liviana es una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-20. 23. Una inmunoglobulina humanizada, o una porción de unión al antigeno de la misma, que tiene especificidad de unión para CCR2 y que tiene una cadena pesada y una cadena liviana, donde la cadena liviana es una cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-20. 24. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 23, donde la cadena pesada es una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10. 25. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con las reivindicaciones 21-24, donde la inmunoglobulina humanizada comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. 26. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-25, donde la inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno compite para la unión al receptor de CC—quimioquina 2 de mamífero con el anticuerpo monoclonal 1D9. 27. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, donde el receptor de CC-quimioquina 2 de mamífero es el receptor de CC-quimioquina 2 humano. 28. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con la reivindicación 27, donde la inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno inhibe la unión del receptor 2 de CC-quimioquina a un ligando. 29. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con la reivindicación 28, donde el ligando es una quimioquina. 30. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 29, donde la quimioquina se selecciona del grupo formado por MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina y combinaciones de los mismos. 31. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 29, donde el ligando es HIV o una porción del mismo. 32. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31, donde la inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno está rotulado. 33. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 32, donde el rótulo se selecciona del grupo formado por un radioisótopo, un rótulo de espin, un rótulo de antigeno, un rótulo enzimático, un rótulo fluorescente, un rótulo quimioluminiscente y un rótulo de epitopo. 34. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31, donde la inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno inhibe uno o más funciones asociadas con la unión del receptor de CC-quimioquina de mamífero a un ligando de CC-quimioquina 2. 35. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con la reivindicación 34, donde la inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno inhibe uno o más de: tráfico de leucocitos, ingreso de HIV en una célula, activación de células T, liberación del mediador inflamatorio y desgranulación de leucocitos. 36. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con la reivindicación 34, donde la función asociada con la unión del ligando a dicho receptor es el tráfico de leucocitos . 37. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con la reivindicación 34, donde la función asociada con la unión del ligando a dicho receptor es quimiotaxis. 38. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con la reivindicación 34, donde la función asociada con la unión del ligando a dicho receptor es la infectividad del HIV. 39. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-38, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno une al receptor 2 de CC-quimioquina con una afinidad de por lo menos aproximadamente 0,1 x 1CT9 M. 40. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-38, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno une al receptor 2 de CC-quimioquina con una afinidad de por lo menos aproximadamente 1 x 10"9 M. 41. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-38, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno une al receptor 2 de CC-quimioquina con una afinidad de por lo menos aproximadamente 3 x 10~9 M. 42. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 37, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno inhibe la quimiotaxis inducida por quimioquina de células en menos de 150 Tg/ml. 43. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 37, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno inhibe la quimiotaxis inducida por quimioquina de células en menos de 100 Tg/ml . 44. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 37, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno inhibe la quimiotaxis inducida por quimioquina de células en menos de 50 Tg/ml . '45. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 37, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno inhibe la quimiotaxis inducida por quimioquina de células en menos de 20 Tg/ml. 46. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 42-45, donde las células son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . 47. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno inhibe la unión del ligando a dicho receptor con una IC50 inferior a aproximadamente 1,0 Tg/ml. 48. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno inhibe la unión del ligando a dicho receptor con una IC50 inferior a aproximadamente 0,05 Tg/ml. 49. La inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de 5 unión al antigeno, de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno inhibe la unión del ligando a dicho receptor con una IC50 inferior a aproximadamente 0,005 Tg/ml. 50. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica _0 a la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10. 51. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 50, donde la secuencia de ácidos 5 nucleicos codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 114. 52. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 50, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 108 y una secuencia de ácidos 0 nucleicos de SEC ID NO: 111. 53. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 52, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 108 y una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 115. 54. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena liviana de inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-20. 55. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 54, donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 116. 56. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 54, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 109 y una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 113. 57. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 56, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 109 y una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 117. 58. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 50-53. 59. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 54-57. 60. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 50-53 y una molécula de ácidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 54-57. 61. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 y 60, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de cadena pesada y el ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada humanizada están operativamente ligados a un promotor seleccionado del grupo formado por un promotor EF-la, un promotor CMV, un promotor SV40 y un promotor tardío mayor de adenovirus . 62. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 61, donde el promotor es un promotor EF-la. 63. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 62, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de cadena pesada y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de cadena pesada humanizada están bajo el control del mismo promotor. 64. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 62 o con la reivindicación 63, donde el vector comprende además una secuencia BGH poli A. 65. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 64, donde la secuencia BGH poliA está corriente abajo de la secuencia que codifica la región constante de cadena pesada. 66. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 y 60, que comprende además un gen marcador seleccionable . 67. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 66, donde el gen marcador seleccionable se selecciona del grupo formado por el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) y un gen neo. 68. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 y 60-65, donde el vector de expresión comprende por lo menos dos genes marcadores y los genes marcadores son un gen DHFR y un gen neo. 69. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 y 60-65, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de cadena pesada comprende además un secuencia guia de inmunoglobulina . 70. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 y 60-65, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de cadena pesada humanizada comprende además un secuencia guia de inmunoglobulina . 71. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 59 y 60, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de cadena liviana y el ácido nucleico que codifica la región variable de cadena liviana humanizada están ligados operativamente a un promotor seleccionado del grupo formado por un promotor EF-la, un promotor CMV, un promotor SV40 y un promotor tardío mayor de adenovirus . 72. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 71, donde el promotor es un promotor EF-la. 73. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 72, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de cadena liviana y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de cadena liviana humanizada están bajo el control del mismo promotor. 74. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 72 o con la reivindicación 73, donde el vector comprende además una secuencia BGH poli A. 75. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 74, donde la secuencia BGH poliA está corriente abajo de la secuencia que codifica la región constante de cadena liviana . 76. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 59 y 71-75, que comprende además un gen marcador seleccionable . 77. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 76, donde el gen marcador seleccionable se selecciona del grupo formado por el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) y un gen neo. 78. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 59 y 71-75, donde el vector de expresión comprende por lo menos dos genes marcadores y los genes marcadores son un gen DHFR y un gen neo. 79. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 59, 60 y 71-75, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de cadena liviana comprende además una secuencia guia de inmunoglobulina . 80. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 59, 60 y 71-75, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de cadena liviana humanizada comprende además una secuencia guia de inmunoglobulina . 81. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 58-80. 82. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 81, donde la célula se selecciona del grupo formado por una célula bacteriana, una célula de levadura y una célula de mamífero . 83. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 81, donde la célula es una célula de mamífero. 84. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 83, donde la célula de mamífero se selecciona del grupo formado por una línea celular linfocítica, células CHO y COS. 85. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 83, donde la célula de mamífero es una célula CHO. 86. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 85, donde la célula CHO es una célula CHO DHFR deficiente. 87. Un método para preparar una inmunoglobulina humanizada que comprende mantener una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 81-86 bajo condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina humanizada, por lo cual las cadenas de inmunoglobulina humanizada son expresadas y se produce una inmunoglobulina humanizada. 88. El método de acuerdo con la reivindicación 87, que comprende además el paso de aislar la inmunoglobulina humanizada. 89. Un método para inhibir la interacción de una célula que expresa al receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero con un ligando del receptor, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de una inmunoglobulina humanizada o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-49. 90. El método de acuerdo con la reivindicación 89, donde la célula se selecciona del grupo formado por linfocitos, monocitos, granulocitos, células T, basófilos, células dendríticas, células cebadas, esinófilos, y células que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero. 91. El método de acuerdo con la reivindicación 90, donde dichas células T se seleccionan del grupo formado por células CD8+, células CD25+, células CD4+ y células CD45RO+. 92. El método de acuerdo con la reivindicación 89, donde dicho receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero es un receptor 2 de CC-quimioquina humano. 93. El método de acuerdo con la reivindicación 92 , donde el ligando es una quimioquina. 94. El método de acuerdo con la reivindicación 93, donde la quimioquina se selecciona del grupo formado por MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina y combinaciones de las mismas . 95. El método de acuerdo con la reivindicación 89, donde el ligando es HIV o una porción del mismo. 96. Un método para inhibir la infección por HIV de una célula, que comprende poner en contacto una célula con un cantidad eficaz de una inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-49. 97. El uso de una inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antigeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del HIV en un sujeto. 98. El uso de una inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49 en la preparación de un medicamento para inhibir la infección por HIV en un sujeto. 99. ün método para inhibir una función asociada con la unión de una quimioquina al receptor 2 de CC—quimioquina de mamífero o porción funcional del receptor, que comprende poner en contacto al receptor o una porción del mismo con una cantidad eficaz de una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-49. 100. El método de acuerdo con la reivindicación 99, donde la quimioquina se selecciona del grupo formado por MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, eotaxina y combinaciones de las mismas. 101. El método de acuerdo con la reivindicación 99, donde dicha función se selecciona del grupo formado por: (a) actividad de señalamiento; (b) estimulación de una respuesta celular; y (c) las combinaciones de (a) y (b) . 102. El método de acuerdo con la reivindicación 101, donde dicha función es la actividad de señalamiento y se selecciona del grupo formado por: (a) activación de una proteína G de mamífero; (b) inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca2+]I; y (c) las combinaciones de (a) y (b) . 103. El método de acuerdo con la reivindicación 101, donde dicha función es la estimulación de una respuesta celular y se selecciona del grupo formado por: (a) estimulación de quirniotaxis ; (b) exocitosis; (c) liberación del mediador inflamatorio por leucocitos; (d) activación de integrina; (e) activación de células T; (f) desgranulación de leucocitos; y (g) las combinaciones de (a), (b) , (c) , (d) , (e) y (f). 104. El método de acuerdo con la reivindicación 99, donde el receptor está en una célula que tiene al receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero. 105. El método de acuerdo con la reivindicación 104, donde dicha célula se selecciona del grupo formado por linfocitos, monocitos, granulocitos, células T, células dendriticas, esinófilos, células cebadas, y células que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica CCR2 de mamífero o una porción del mismo. 106. El método de acuerdo con la reivindicación 105, donde dichas células T se seleccionan del grupo formado por células CD8+, células CD25+, células CD4+ y células CD45RO+. 107. El método de acuerdo con la reivindicación 99, donde dicho receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero es un receptor 2 de CC-quimioquina humano. 108. El uso de una inmunoglobulina humanizada, o su fragmento de unión al antígeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49 en la preparación de un medicamento para inhibir el tráfico de leucocitos en un suj eto . 109. El uso de acuerdo con la reivindicación 108, donde el medicamento inhibe la migración de células T. 110. El uso de una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-39 en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno mediado por CCR2 en un sujeto. 111. El uso de acuerdo con la reivindicación 110, donde el trastorno es un trastorno inflamatorio. 112. El uso de acuerdo con la reivindicación 110, donde el trastorno es escleroderma . 113. El uso de acuerdo con la reivindicación 112, donde el trastorno es escleroderma sistémica. 114. El uso de acuerdo con la reivindicación 110, donde dicho trastorno mediado por CCR2 es un trastorno autoinmune. 115. El uso de acuerdo con la reivindicación 114, donde el trastorno autoinmune es esclerosis múltiple. 116. El uso de acuerdo con la reivindicación 114, donde el trastorno autoinmune es artritis reumatoidea. 117. El uso de acuerdo con la reivindicación 110, donde el trastorno mediado por CCR2 es aterogénesis . 118. El uso de acuerdo con la reivindicación 110, donde el trastorno mediado por CCR2 es aterosclerosis . 119. El uso de acuerdo con la reivindicación 110, donde el trastorno mediado por el receptor 2 de CC-quimioquina es asma . 120. El uso de acuerdo con la reivindicación 110, donde dicho trastorno mediado por el receptor 2 de CC-quimioquina se selecciona entre artritis asociada con enfermedad gastrointestinal, artritis reactiva, espondiloartropatias no diferenciadas e inicio juvenil, enfermedad cerebrovascular, lesión por reperfusión isquémica, enfermedad renal isquémica, estenosis arterial renal y colitis isquémica. 121. El uso de una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-39 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la estenosis o restenosis en un sujeto. 122. El uso de acuerdo con la reivindicación 121, donde la restenosis está asociada con la intervención vascular en el sujeto. 123. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde la intervención vascular se selecciona entre angioplastia, colocación de stent o ambos . 124. El uso de una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-39 en la preparación de un medicamento para inhibir el angostamiento de un lumen de un vaso en un sujeto. 125. El uso de acuerdo con la reivindicación 124, donde el angostamiento del lumen de un vaso está asociado con la intervención vascular en el sujeto. 126. El uso de acuerdo con la reivindicación 125, donde la intervención vascular se selecciona entre angioplastia, colocación de stent o ambos . 127. El uso de una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-39 en la preparación de un medicamento para inhibir la hiperplasia neointimal de un vaso en un sujeto. 128. El uso de acuerdo con la reivindicación 127, donde la hiperplasia neointimal del vaso está asociada con la intervención vascular en el sujeto. 129. El uso de acuerdo con la reivindicación 128, donde la intervención vascular se selecciona entre angioplastia, colocación de stent o ambos . 130. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 108-129, donde el sujeto es un humano. 131. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 108-129, donde el medicamento es formulado para la administración parenteral . 132. El uso de acuerdo con la reivindicación 131, donde el medicamento es formulado para la administración intravenosa . 133. El uso de acuerdo con la reivindicación 131, donde el medicamento es formulado para la inyección subcutánea o infusión . 134. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 108-129, donde el medicamento es preparado para la administración con otro fármaco o agente. 135. El uso de acuerdo con la reivindicación 134, donde el otro fármaco o agente es un anticuerpo o su fragmento de unión al antigeno el cual se une a un receptor de quimioquina que no es el recep.or 2 de CC-quimioquina . 136. El uso de acuerdo con la reivindicación 135, donde el otro fármaco o agente es uno o más de un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo el cual se une al receptor 3 de CC-quimioquina y un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo el cual se une al receptor 5 de CC-quimioquina . 137. El uso de acuerdo con la reivindicación 134, donde el otro fármaco o agente es K-globulina, inmunoglobulina o ambos . 138. Un método para detectar o identificar un agente el cual se une a un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando, que comprende combinar: a) un agente a ser ensayado; b) una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antxgeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-49; y c) una composición que comprende un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o una variante de unión al ligando del mismo, bajo condiciones adecuadas para la unión de dicha inmunoglobulina, o su fragmento de unión al antxgeno, a dicho receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando, y detectar o medir la unión de dicha inmunoglobulina, o su fragmento de unión al antígeno, a dicho receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando, donde una disminución en la cantidad de complejo formado con relación a un control adecuado indica que el agente se une a dicho receptor o a su variante de unión al ligando. 139. El método de acuerdo con la reivindicación 138, donde dicha composición que comprende un receptor 2 de CC- quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando es una célula que porta al receptor 2 de CC-quimioquina recombinante o su variante de unión al ligando. 140. El método de acuerdo con la reivindicación 138, donde dicha composición que comprende un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando es una célula que expresa naturalmente al receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando. 141. El método de acuerdo con la reivindicación 138, donde dicha composición que comprende un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o su variante de unión al ligando es una fracción de membrana de dicha célula que porta al receptor 2 de CC-quiinioquina recombinante o su variante de unión al ligando. 142. El método de acuerdo con la reivindicación 138, donde el agente es un anticuerpo, o un fragmento de unión al antigeno del mismo, que tiene especificidad para un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero. 143. El método de acuerdo con la reivindicación 138, donde dicho receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero o una variante de unión al ligando del mismo es un receptor 2 de CC-quimioquina humano o una variante de unión al ligando del mismo . 144. El método de acuerdo con las reivindicaciones 138-143, que comprende además evaluar al agente para determinar su efecto terapéutico. 145. Un método para detectar la expresión de un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-49 bajo condiciones apropiadas para la unión de la inmunoglobulina, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, al receptor, determinar si la unión se produjo entre la inmunoglobulina, o su fragmento de unión al antigeno,, y el receptor para formar un complejo, donde un complejo indica la presencia de receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero en la muestra. 146. El método de acuerdo con la reivindicación 145, donde la muestra es un fluido corporal. 147. El método de acuerdo con la reivindicación 146, donde el fluido corporal es exudados inflamatorios, saliva, sangre, suero o fluido intestinal. 148. El método de acuerdo con las reivindicaciones 145-147, donde el receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero es un receptor 2 de CC-quimioquina humano. 149. Un método para detectar la expresión de un receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero por una célula, que comprende poner en contacto una célula con una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-49 bajo condiciones apropiadas para la unión de la inmunoglobulina, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, al receptor, determinar si la unión se produjo entre la inmunoglobulina, o su fragmento de unión al antigeno, y el receptor para formar un complejo, donde un complejo indica la expresión del receptor 2 de CC-quimioquina de mamífero por la célula. 150. El método de acuerdo con la reivindicación 149, donde la célula se selecciona entre el grupo que consiste en linfocitos , monocitos, granulocitos , células T, basófilos, células dendríticas, eosinófilos y células cebadas. 151. El método de acuerdo con la reivindicación 150, donde dichas células T se seleccionan del grupo formado por células CD8+, células CD25+, células CD4+ y células CD45RO+. 152. Una composición que comprende una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-49, y un vehículo fisiológicamente aceptable opcional. 153. La composición de acuerdo con la reivindicación 152, donde la composición está en forma liofilizada. 154. La composición de acuerdo con las reivindicaciones 152 y 153, donde la composición comprende además uno o más de un tampón, un estabilizante, un excipiente, un biocida y una proteína inerte. 155. Una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49, y un vehículo fisiológicamente aceptable. 156. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 155, donde la inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno, es una inmunoglobulina liofilizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, reconstituida en un portador farmacéuticamente aceptable . 157. Un kit que comprende: una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49 en forma liofilizada; y un vehículo fisiológicamente aceptable. 158. Un kit para detectar la presencia de receptor 2 de CC-quirnioquina, que comprende: una primera inmunoglobulina humanizada o su fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49; y uno o más reactivos auxiliares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre la inmunoglobulina o su fragmento de unión al antígeno y el receptor. 159. Un kit de acuerdo con la reivindicación 158, que comprende además una segunda inmunoglobulina, o un fragmento de unión al antígeno de la misma especifica para un epitopo diferente del receptor que la primera inmunoglobulina, o su fragmento de unión al antigeno, o la cual se une a la primera inmunoglobulina o su fragmento de unión al antigeno. 160. Un kit de acuerdo con la reivindicación 159, donde la segunda inmunoglobulina, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, está rotulada. 161. Una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49 para utilizar en terapia o diagnóstico . 162. Una inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de unión al antigeno de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 y 34-49 para utilizar en el tratamiento de una enfermedad mediada por CCR2.