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TWI582239B - 與ｗｎｔ抑制劑相關之標記 - Google Patents

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TWI582239B
TWI582239B TW103108007A TW103108007A TWI582239B TW I582239 B TWI582239 B TW I582239B TW 103108007 A TW103108007 A TW 103108007A TW 103108007 A TW103108007 A TW 103108007A TW I582239 B TWI582239 B TW I582239B
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車健爲
珍妮佛 哈里斯
謝馨儀
李�杰
劉峻
尼可拉斯 黃
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諾華公司
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Description

與WNT抑制劑相關之標記
本發明係關於藥物基因體學領域，及適用於確定治療前之患者敏感性、治療後之後續患者反應、癌症敏感性，篩選化合物、治療方法及用於該治療中之醫藥組合物的生物標記之用途。
Wnt訊號傳導為多種癌症之一種重要致癌路徑1、2。在結合至其受體(於血漿膜之處之低密度脂蛋白受體相關蛋白質5/6(LRP5/6)及捲曲蛋白(FZD)(二者均為Wnt訊號傳導所需的單通道跨膜受體))後，Wnt配體即可觸發由Axin2、GSK3β、APC及其他蛋白質組成之β-連環蛋白(catenin)降解機制之中斷，此導致β-連環蛋白積聚於細胞質中3。β-連環蛋白之濃度增加最終會導致其易位至細胞核中，以與LEF/TCF形成複合物，及驅動下游基因表現3。
Wnt訊號傳導之失調1可經由諸如APC及β-連環蛋白之下游組分之突變發生，其在結腸癌中有明確記錄1。此外，多種癌症中已報告Wnt配體或諸如RSPO2/3之共刺激劑之過度表現、或Wnt抑制劑基因之沉默1、4。另外，諸如Axin1/2或RSPO共受體RNF43/ZNFR3之泛-Wnt路徑組分之突變在胰臟、結腸、及肝細胞癌上扮演潛在性重要角色4-6。動物模型中Wnt路徑之不偏及靶向突變已證實此路徑之致癌訊號傳導功能7、8。除了典型Wnt路徑之外，存在經由FZD及VANGL之非典型Wnt訊號傳導對於腫瘤發生之各種態樣(包括細胞遷移及腫瘤轉移)具 重要性之將來之證據9。
典型及非典型Wnt訊號傳導活性均取決於Wnt配體。於Wnt配體之生物合成期間，Wnt會經歷由豪豬(Porcupine)(PORCN)(一種膜結合之O-醯基轉移酶)所介導之轉譯後醯化3、10。PORCN具特異性及專用於為隨後之Wnt分泌所需的Wnt轉譯後醯化11。PORCN之損失導致基因敲除小鼠模型中Wnt配體驅動之訊號傳導活性之抑制12、13。於人類中，在異型接合子及其等就PORCN基因而言具有鑲嵌者中，PORCN基因之功能損失(LoF)突變均引起與各種先天性異常相關聯之X染色體性聯顯性遺傳病之局灶性真皮發育不全。此表現型係與胚胎發生及發育期間Wnt訊號傳導路徑之作用一致14、15。
到目前為止治療上靶向Wnt訊號傳導之成功受限制。此很大程度上是因為缺乏針對於Wnt路徑中標靶之有效治療劑及缺乏將對Wnt抑制劑敏感之所確定患者群體。作為細胞週期中一連串複雜調節機制具差異性及差異性基因表現的結果，不同癌症類型可具差異性地回應於相同活性化合物。關於指示細胞對PORCN抑制劑或Wnt抑制劑之療法之敏感性之特異性生物標記的知識亦很少。
本發明係關於Notch1、Notch2、Notch3、AXIN2、LEF1、NKD1、SFRP2、FRZB、SFRP4、DKK2、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A、及/或DTX3L於確定細胞對Wnt抑制劑敏感性中充作特異性生物標記之分析。本發明係關於至少一種選自表1之生物標記提供作為在預測哪些癌細胞或癌症對Wnt抑制劑具敏感性中具有經提高之準確度及特異度之Wnt抑制劑之「基因特徵」之分析。該方法分析取自患者之癌症樣本中至少一種選自表1之生物標記之表現、基因表現、突變狀態、蛋白質含量或功能及與對照組進行比 較以預測癌症樣本對Wnt抑制劑之敏感性。表現水平之圖譜改變可指示有利反應或不利反應。此外，選自表1之基因特徵具有增大之預測值，此乃因其亦指示Wnt路徑具功能性。本發明亦提供「個人化醫療」之一個實例，其中患者係基於對該個體具特異性之功能性基因組特徵基礎進行治療。
亦可在以Wnt抑制劑治療之後使用揭示於本文中之至少一種生物標記之預測值來確定患者是否仍對該治療敏感。一旦已投與Wnt抑制劑，即可利用生物標記以監測該患者對以Wnt抑制劑治療之持續敏感性。本發明亦關於在以Wnt抑制劑治療之前及之後所識別出之基因之表現的上調或下調。此在確定患者接受正確療程中係有用的。本發明包括一種預測及監測患者對以Wnt抑制劑治療之敏感性之方法。該方法包括投與Wnt抑制劑給該患者及測量於取自該患者之生物樣本上之生物標記基因表現之步驟。基於偵測至少一種選自表1之生物標記之基因表現來評估該患者之反應。相較於對照組至少一種生物標記之表現水平之偵測及/或改變指示患者對治療之敏感性。表現水平圖譜之改變可指示有利的患者反應或不利的患者反應。
本發明亦提供用於治療頭部及頸部癌之Wnt抑制劑。預測尤佳的治療反應是在相較於對照組於其癌症樣本中差異性地下調至少一種選自表1之生物標記之表現之患者中。
本發明之態樣、特徵及實施例概述於以下項目中及可分別單獨地或以組合方式使用：
1.一種預測癌症患者對以Wnt抑制劑之治療之敏感性的方法，該方法包括：a)提供來自癌症患者的癌症樣本b)測量從該患者獲得的該癌症樣本中至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現；及 c)將至少一種生物標記之該差異性基因表現與對照組樣本中該生物標記之基因表現進行比較，d)將基因表現比較中之增加或減少與該患者對以Wnt抑制劑治療之敏感性產生關聯。
2.一種以Wnt抑制劑治療癌症患者的方法，該方法包括：a)提供來自癌症患者的癌症樣本b)測量從該患者獲得的該癌症樣本中至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現；c)將該至少一種生物標記之該差異性基因表現與對照組樣本中該生物標記之基因表現進行比較；d)確定該患者對Wnt抑制劑之敏感性；及e)投與有效量之該Wnt抑制劑給已確定對該Wnt抑制劑敏感之患者。
3.一種預測癌細胞對Wnt抑制劑之敏感性的方法，該方法包括：a)測量該細胞中至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現；b)將至少一種選自表1之生物標記之該差異性基因表現與正常或對照組細胞之基因表現進行比較；c)自該差異性基因表現之比較預測該癌細胞對Wnt抑制劑之敏感性。
4.一種確定癌細胞對Wnt抑制劑之敏感性的方法，該方法包括：a)使癌細胞與至少一種Wnt抑制劑接觸；b)測量已與該Wnt抑制劑接觸之該細胞中至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現；c)將该至少一種生物標記之該差異性基因表現與來自未經處理或經安慰劑處理之對照組細胞之該生物標記之基因表現進行比較；d)將該至少一種生物標記之表現相較於來自未經處理或經安慰劑 處理之對照組細胞之該至少一種生物標記之表現之增加或減少與該癌細胞對Wnt抑制劑之敏感性產生關聯。
5.根據項目1至4中任一項之方法，其中多於一種之生物標記係選自表1。
6.根據項目1至5中任一項之方法，其中該生物標記為Notch1。
7.根據項目6之方法，其中該Notch1具有在胞外域中之突變。
8.根據項目1至7中任一項之方法，其中該至少一種生物標記之差異性基因表現與對照組樣本之基因表現之比較指示功能性Wnt路徑。
9.根據項目1至8中任一項之方法，其中該癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌。
10.根據項目2或4之方法，其中該癌症係由Wnt抑制劑治療及顯示相較於對Wnt抑制劑敏感之癌症樣本中之表現的Axin2、LEF1及/或NKD1之差異性表現。
11.根據項目1至10中任一項之方法，其中已與至少一種Wnt抑制劑接觸之癌細胞之IC50小於1μM，較佳小於0.5μM，更佳小於0.2μM。
12.根據項目11之方法，其中該細胞係在至少兩個不同時間點與該Wnt抑制劑接觸。
13.根據項目4、11或12中任一項之方法，其中該細胞係在步驟a)下同時或依序與兩種不同Wnt抑制劑接觸。
14.根據項目4、或11至13中任一項之方法，其中在選自由以下組成之群之時間點重複該等步驟b)及c)：投與各劑量之Wnt抑制劑後4小時時、8小時時、16小時時、24小時時、48小時時、3天時、1週時、1個月時及數個月時。
15.一種用於治療患者中癌症之Wnt抑制劑，其中該患者係基於以下來選擇： a)測量從該患者獲得的癌症樣本中至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現；b)將該至少一種生物標記之該差異性基因表現與對照組樣本中之該生物標記之基因表現進行比較；c)確定該患者對Wnt抑制劑之敏感性；及d)篩選對Wnt抑制劑敏感之患者。
16.一種用於治療相較於對照組基因表現具有至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現之患者之癌症的Wnt抑制劑，其中該差異性基因表現係與對Wnt抑制劑敏感之患者相關聯。
17.根據項目15或16之用於治療癌症之Wnt抑制劑，其中多於一種之生物標記係選自表1。
18.根據項目15至17中任一項之用於治療癌症之Wnt抑制劑，其中該生物標記為Notch1。
19.根據項目15至18中任一項之用於治療癌症之Wnt抑制劑，其中該Notch1具有在胞外域中之突變。
20.根據項目15至19中任一項之用於治療癌症之Wnt抑制劑，其中該癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌，較佳地，該癌症樣本經Wnt抑制劑處理後是顯示對Wnt抑制劑敏感之癌症樣本之Axin2、LEF1及/或NKD1表現。
21.一種用於治療患者之癌症之包含Wnt抑制劑之醫藥組合物，其中該患者係基於顯示相較於正常對照組細胞樣本的從該患者獲得的癌細胞樣本中至少一種選自表1之生物標記之基因表現來選擇，其中該差異性基因表現係與對Wnt抑制劑敏感之患者相關聯。
22.一種用於治療顯示相較於對照組基因表現至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現之患者之癌症的包含Wnt抑制劑之醫藥組合物，其中該差異性基因表現係與對Wnt抑制劑敏感之患者相關聯。
23.根據項目21或22之用於治療癌症之包含Wnt抑制劑之醫藥組合物，其中多於一種之生物標記係選自表1。
24.根據項目21至23中任一項之用於治療癌症之包含Wnt抑制劑之醫藥組合物，其中該生物標記為Notch1。
25.根據項目21至24中任一項之用於治療癌症之包含Wnt抑制劑之醫藥組合物，其中該Notch1具有在胞外域中之突變。
26.根據項目21至25中任一項之用於治療癌症之包含Wnt抑制劑之醫藥組合物，其中該癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌。
27.一種用於預測癌症患者對以Wnt抑制劑治療之敏感性之套組，其包括：i)用於偵測選自表1之生物標記之表現之裝置；及ii)如何使用該套組之使用說明。
28.一種以根據項目27之套組於項目1至14中任一種方法之用途。
29.一種用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之Wnt抑制劑。
30.根據項目29之用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之Wnt抑制劑，其中該Wnt抑制劑係投與給顯示相較於對照組基因表現至少一種選自表1之生物標記之差異性基因表現之癌症患者，其中該差異性基因表現係與對Wnt抑制劑敏感之患者相關聯。
31.根據項目30之用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之Wnt抑制劑，其中該生物標記為Notch1。
32.根據項目1至14中任一項之方法、根據項目15至20中任一項之用於治療癌症之Wnt抑制劑、根據項目21至26中任一項之醫藥組合物、或根據項目29之用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之Wnt抑制劑，其中該Wnt抑制劑係以治療有效量投與。
33.根據項目15至20中任一項之用於治療患者之癌症之Wnt抑制劑，其中投與治療有效量之該Wnt抑制劑給該患者。
34.根據項目33之用於治療患者之癌症之Wnt抑制劑，其中將治療有效量之該Wnt抑制劑選擇性地投與給已確定對Wnt抑制劑敏感之患者，或基於對該Wnt抑制劑不敏感之患者，選擇性地投與治療有效量之除了Wnt抑制劑外之藥物給該患者。
35.根據項目1至14中任一項之方法、根據項目15至20、33或34中任一項之用於治療癌症之Wnt抑制劑、根據項目21至26中任一項之醫藥組合物、根據項目27之套組或根據項目29至32中任一項之用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之Wnt抑制劑，其中該Wnt抑制劑為式(1)之化合物：
或其生理上可接受之鹽，其中：其中之X1、X2、X3及X4係選自N及CR7；X5、X6、X7及X8中之一者為N及其他為CH；X9係選自N及CH；Z係選自苯基、吡嗪基、吡啶基、噠嗪基及哌嗪基；其中Z之各苯基、吡嗪基、吡啶基、噠嗪基或哌嗪基係視情況經R6基取代；R1、R2及R3為氫；m為1；R4係選自氫、鹵素、二氟甲基、三氟甲基及甲基；R6係選自氫、鹵素及-C(O)R10；其中R10為甲基；及R7係選自氫、鹵素、氰基、甲基及三氟甲基。
36.根據項目1至14中任一項之方法、根據項目15至20、33或34中任一項之用於治療癌症之Wnt抑制劑、根據項目21至26中任一項之醫 藥組合物、根據項目27之套組、或根據項目29至32中任一項之用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之Wnt抑制劑，其中該Wnt抑制劑為選自以下之群之化合物：N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(噠嗪-4-基)吡啶-3-基]乙醯胺；2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺；N-(2,3'-聯吡啶-6'-基)-2-(2',3-二甲基-2,4'-聯吡啶-5-基)乙醯胺；N-(5-(4-乙醯基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-甲基-3-(三氟甲基)-2,4'-聯吡啶-5-基)乙醯胺；N-(5-(4-乙醯基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-聯吡啶-5-基)乙醯胺；及2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-聯吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺；或其醫藥上可接受之鹽。
37.根據項目1至14中任一項之方法、根據項目15至20、33或34中任一項之用於治療癌症之Wnt抑制劑、根據項目21至26中任一項之醫藥組合物、根據項目27之套組、或根據項目29至32中任一項之用於治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之Wnt抑制劑，其中該Wnt抑制劑為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺。
38.根據項目1至37中之任一項，其中表現或基因表現為DNA表現、DNA複製次數、mRNA表現、cDNA表現、蛋白質轉錄、蛋白質表現、DNA修飾、cDNA修飾、mRNA修飾、蛋白質修飾、DNA功能、cDNA功能、mRNA功能、蛋白質功能、DNA突變、cDNA突變、mRNA突變、蛋白質突變、或其組合；較佳係DNA突變。
39.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記係選自由 Notch1、Notch2、Notch3、AXIN2、LEF1、NKD1、SFRP2、FRZB、SFRP4、DKK2、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A及DTX3L組成之群。
40.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記係選自Notch1、Notch2、Notch3、AXIN2、LEF1、NKD1、SFRP2、FRZB、SFRP4、DKK2、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A及DTX3L之群。
41.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記係選自Notch1、Notch2、Notch3、SFRP2、FRZB、SFRP4及DKK2之群。
42.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記係選自Notch1、Notch2及Notch3之群。
43.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記為Notch1。
44.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記係選自Notch1、Notch2、Notch3、SFRP2、FRZB、SFRP4、DKK2、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3及WNT7A之群。
45.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記為HRAS或FAT1。
46.根據項目1至38中之任一項，其中該生物標記係選自由FAM58A、FLJ43860、NOTCH1、OR7G3、CCDC168、ZNF527及CDKN2A組成之群。
47.根據項目1至38中任一項之實施例，其中該生物標記係選自Notch1、Notch2、Notch3、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A、及DTX3L之群，較佳係選自Notch1、Notch2、 Notch3、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、及DTX3L之群。
48.一種以選自表1之化合物作為生物標記之用途。
49.一種以選自Notch1、Notch2、Notch3、AXIN2、LEF1、NKD1、SFRP2、FRZB、SFRP4、DKK2、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A、及DTX3L之群之化合物作為生物標記之用途。
50.一種以選自Notch1、Notch2、Notch3、SFRP2、FRZB、SFRP4及DKK2之群之化合物作為生物標記之用途。
51.一種以選自Notch1、Notch2及Notch3之群之化合物作為生物標記之用途。
52.一種以化合物Notch1作為生物標記之用途。
53.一種以選自Notch1、Notch2、Notch3、SFRP2、FRZB、SFRP4、DKK2、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3及WNT7A之群之化合物作為生物標記之用途。
54.一種以選自Notch1、Notch2、Notch3、AXIN2、LEF1、NKD1、SFRP2、FRZB、SFRP4、DKK2、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A及DTX3L之群之化合物作為生物標記之用途。
55.一種以化合物HRAS或FAT1作為生物標記之用途。
56.一種以選自由FAM58A、FLJ43860、NOTCH1、OR7G3、CCDC168、ZNF527及CDKN2A組成之群之化合物作為生物標記之用途。
57.一種以選自Notch1、Notch2、Notch3、FAM58A、FLJ43860、 CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A、及DTX3L之群，較佳選自Notch1、Notch2、Notch3、FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、HRAS、FAT1、OR7G3、及DTX3L之群之化合物作為生物標記之用途。
58.根據項目48至57中任一項之化合物之用途，其中該用途指示癌症患者對以Wnt抑制劑治療之敏感性。
59.根據項目39至42、44至51、或53至58中之任一項，其中至少兩種生物標記、至少三種或至少四種生物標記係用於共同指示癌症患者對以Wnt抑制劑治療之敏感性。
60.根據項目1至59中之任一項，其中：-患者樣本中之WNT11、WNT10A、WNT3或WNT7A表現較對照組更高，該表現指示患者對Wnt抑制劑之治療之敏感性；-患者樣本中之AXIN2、LEF1或NKD1表現相較於處理前對照組在處理之後減少，該表現指示患者對Wnt抑制劑治療之敏感性；-患者樣本中之Notch1、Notch2或Notch3表現相較於對照組減少(特定言之，活性或功能之降低)，該表現(特定言之活性或功能之降低)指示患者對Wnt抑制劑治療之敏感性；-患者樣本中之SFRP2、FRZB、SFRP4或DKK2表現較對照組更低，該表現指示患者對Wnt抑制劑治療之敏感性；-患者樣本中之FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、FAT1、OR7G3或DTX3L表現相較於對照組更低(特定言之，功能之損失更高)，該表現(特定言之功能之損失)指示患者對Wnt抑制劑治療之敏感性；-患者樣本中之HRAS表現相較於對照組更高(特定言之，功能增強)，指示患者對Wnt抑制劑治療之敏感性。
61.根據項目60，其中該Wnt抑制劑係如項目35至37中任一項所定義。
圖1A顯示化合物A之結構。圖1B顯示化合物B之結構。
圖2A顯示3H-放射性標記之化合物B與PORCN之結合。化合物B與PORCN之間之特異性相互作用可藉由未經標記之化合物B競爭消除(圖2A)。圖2B顯示化合物A與PORCN之結合。
圖3A顯示於Wnt共同培養檢測中化合物A對Wnt訊號傳導之有效抑制作用，IC50為0.4nM。圖3B繪示抑制效果係藉由添加經外源Wnt3A調節之介質恢復。
圖4顯示不同劑量之化合物A針對於經HA-Wnt3A轉染之293A細胞之效應。如圖4所顯示，化合物A有效地減低HA-Wnt3A於上清液中之豐度同時保留溶胞產物HA-Wnt3A，表明Wnt3A分泌係以劑量依賴性方式實質上受化合物A抑制。
圖5A展現化合物A實際上強烈阻斷自分泌L-Wnt3A細胞(一種過度表現Wnt3A之小鼠乳腺細胞株)中LRP6之Wnt依賴性磷酸化。圖5B顯示在所有19種Wnt當中保留推定Wnt棕櫚醯基化位點(Ser209)周圍之殘基。圖5C顯示化合物A證實抗所有所測試Wnt(包括Wnt1、2、3、3A、6、7A、及9A)之相當的抑制活性。
圖6為每種癌症類型之不同細胞株對化合物A之處理之回應。回應性細胞株係經定義為在以10至100nM化合物A處理48小時後達成大於50%之AXIN2 mRNA減少。如圖6所顯示，頭部及頸部癌細胞(HNSCC)株屬於回應於化合物A之前幾種癌症類型。
圖7顯示在HNSCC細胞株當中，96個中有31個在化合物A處理後顯示Wnt路徑抑制。
圖8A顯示化合物A有效地抑制HN30中之Wnt依賴性AXIN2產生， IC50為0.3nM。圖8B繪示化合物A強烈地減低HN30菌落形成，但IC50右移。
圖9A顯示化合物A之減少菌落形成之效應可部分地藉由過度表現顯性β-連環蛋白恢復。圖9B證實化合物A之細胞效應與PORCN依賴性Wnt訊號傳導活性之抑制一致；針對於PORCN之shRNA實質上抑制Wnt靶基因AXIN2之表現。圖9C顯示針對於PORCN之shRNA亦抑制活體外HN30細胞之菌落形成。
圖10顯示化合物A之活體內抗腫瘤活性；亦即，於HNSCC HN30之小鼠皮下異種移植模型中。當每天一次給藥時，化合物A誘導劑量依賴性藥效及減少腫瘤重量(圖10A)。在化合物A以3mg/kg之單次給藥之後，腫瘤中AXIN2 mRNA表現之程度在給藥後5至10小時之間減低~60至95%(圖10B)。另外，如圖10C所顯示，HN30腫瘤中之pLRP6水平實質上以時間依賴性方式減低。
圖11為HNSCC細胞株組中最會突變之致癌基因或腫瘤抑制基因。
圖12為其聚集功能損失突變與來自HNSCC細胞株之化合物A PD回應資料最佳相關聯之前幾種候選基因。
圖13A及圖13B顯示化合物A回應性頭部及頸部癌細胞株中之高度富集之Notch1功能損失(LoF)突變。A)頭部及頸部癌細胞株中Notch1之潛在LoF突變之圖。N：N-端；C：C-端；LNR：Lin12-Notch重複；TMD：跨膜域；PEST：脯胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸富集(PEST)域。框移(fs)及無意義突變(X)包括E488fs、A495fs、K538fs、G192X、P460fs、E216X，以紅色突顯。B)頭部及頸部癌細胞株中Notch1框移及無意義突變之列表。C)Notch1 C478F顯示在DLL1刺激或無DLL1刺激下之Notch1報導子基因檢測中相較於野生型其活性完全減低。
圖14顯示化合物A之活體內藥效。於小鼠SNU1076異種移植模型中，於5mg/kg劑量下之化合物A在14天處理之後明顯抑制腫瘤生長(T/C：25%)(圖14A)。化合物A實質上抑制Wnt路徑，此點如AXIN2減少70%所指示(圖14B)。
圖15顯示頭頸癌細胞株中之FAT1突變。FAT1突變集中在化合物A回應性頭頸癌細胞株中。
圖16顯示頭頸癌細胞株中之HRAS突變。HRAS突變集中在化合物A回應性頭頸癌細胞株中。
定義
除非本文清楚地另作指明，否則如本說明書及申請專利範圍所用，單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數形式之參考。例如，術語「一個細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。
例如pH、溫度、時間、濃度、及分子量之所有指定數值(包括範圍)為可改變(+)或(-)0.1增量的近似值，雖然不總是明確規定，然而，應明瞭所有指定數值前面存在術語「約」。雖然不總是明確規定，然而，亦應明瞭述於本文中之試劑僅係示例性及其等效物是為相關技藝所熟知的。
本文中術語「標記」或「生物標記」可互換使用。生物標記為核酸或多肽及該核酸或多肽之存在、不存在或差異性表現、描述基因數量之參數、基因或蛋白質突變、功能、或活性，及用於確定對任何Wnt抑制劑之敏感性。例如，Notch1為生物標記及癌症樣本細胞中Notch1之mRNA表現相較於正常(非癌性)組織或對照組織中之Notch1表現減少。
「PORCN」係指豪豬，一種Wnt轉譯後修飾時所需的膜結合醯基轉移酶。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之PORCN係指人類 PORCN，寄存編號NM_017617.3/NP_060087(4851/P46531.4)。
「Notch1」係指Notch同系物1。其為Notch訊號傳導中之單通道跨膜受體。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之Notch1係指人類Notch1，寄存編號NM_017617.3/NP_060087/GI：148833508(4851/P46531.4)。「Notch2」係指神經性基因座notch同系物蛋白質2，一種Notch訊號傳導中之單通道跨膜受體。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之Notch2係指人類Notch2，寄存編號NM_024408.3/NP_077719/GI：24041035(4853/Q04721.3)。「Notch3」係指神經性基因座notch同系物蛋白質3，一種Notch訊號傳導中之單通道跨膜受體。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之Notch3係指人類Notch3，寄存編號NM_000435.2/NP_000426/GI：134244285(4854/Q9UM47.2)。
「AXIN2」係指軸抑制蛋白質2。其為在調節β-連環蛋白之穩定性中具有重要作用之細胞溶質蛋白質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之AXIN2係指人類AXIN2，寄存編號NM_004655.3/NP_004646/GI：195927059(8313/Q9Y2T1)。
「LEF1」係指淋巴增強子-結合因子1。其為與β-連環蛋白形成複合物及驅動下游靶基因表現之核蛋白。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之LEF1係指人類LEF1，寄存編號NM_016269/NP_001124185/GI：7705917(51176/Q9UJU2.1)。
「NKD1」係指裸角質層1。其為與蓬亂蛋白(Disheveled)相互作用之細胞溶質蛋白質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之NKD1係指人類NKD1，寄存編號NM_033119/NP_149110/GI：14916433(85407/Q969G9.1)。
「SFRP2」係指分泌捲曲相關蛋白2。其為Wnt訊號傳導之可溶性 調節物質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之SFRP2係指人類SFRP2，寄存編號NM_003013.2/NP_003004/GI：48475052(6423/Q96HF1.2)。
「FRZB」係指捲曲相關蛋白，亦為一種Wnt訊號傳導之可溶性調節物質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之FRZB係指人類FRZB，寄存編號NM_001463.3/NP_001454/GI：38455388(2487/Q92765.2)。
「SFRP4」係指分泌捲曲相關蛋白4，亦為一種Wnt訊號傳導之可溶性調節物質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之SFRP4係指人類SFRP4-寄存編號NM_003014.3/NP_003005/GI：170784838(6424/Q6FHJ7.2)。
「DKK2」係指dickkopf-相關蛋白2，亦為一種Wnt訊號傳導之可溶性調節物質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之DKK2係指人類DKK2，寄存編號NM_014421.2/NP_055236/GI：7657023(27123/Q9UBU2.1)。
「WNT11」係指WNT 11。其為分泌Wnt配體蛋白質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之WNT11係指人類WNT11，寄存編號NM_004626.2/NP_004617/GI：17017974(7481/O96014)。
「WNT10A」係指WNT10A，亦為一種分泌Wnt配體蛋白質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之WNT10A係指人類WNT10A，寄存編號NM_025216.2/NP_079492/GI：16936520(80326/Q9GZT5)。
「WNT3」係指WNT3，亦為一種分泌Wnt配體蛋白質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之WNT3係指人類WNT3，寄存編號NM_030753.3/NP_110380/GI：13540477(7473/P56703)。
「WNT7A」係指WNT7A，亦為一種分泌Wnt配體蛋白質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之WNT7A係指人類WNT7A，寄存 編號NM_004625.3/NP_004616/GI：17505191(7476/O00755)。
「FAM58A」係指具序列相似性家族58之成員A。該基因包含細胞週期素箱式折疊域(cyclin-box-fold domain)，可具有控制核細胞分裂週期的作用。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之FAM58A係指人類FAM58A，寄存編號NM_152274.3/NP_689487/GI：196049382(92002/Q8N1B3)。
「FLJ43860」係指FLJ43860蛋白，一種功能未知的未特徵化蛋白質。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之FLJ43860係指人類FLJ43860，寄存編號NM_207414.2/NP_997297/GI：148727311(389690/Q6ZUA9)。
「CDKN2A」係指細胞週期素依賴性激酶抑制劑2A，一種用於細胞週期進展之重要抑制劑。除非另外明確地陳述，否則如本文所用之CDKN2A係指人類CDKN2A，寄存編號NM_000077.4/NP_478104/GI：4502749(1029/P42771)。
「OR7G3」係指嗅覺受體7G3，為嗅覺G-蛋白偶聯受體(GPCR)受體之一。除非另外明確地陳述，否則本文所用之OR7G3係指人類OR7G3，寄存編號NM_001001958.1/NP_001001958/GI：50080201(390883/Q8NG95)。
「DTX3L」係指類似Deltex 3，一種E3泛素連接酶，其果蠅同系物Deltex為果蠅中Notch訊號傳導之正調節物質。除非另外明確地陳述，否則本文所用之DTX3L係指人類DTX3L，寄存編號NM_138287.3/NP_612144.1/GI：19923717(151636/Q8TDB6)。
「CCDC168」係指含有捲曲螺旋域之168，為一種具有捲曲螺旋域之蛋白質。除非另外明確地陳述，否則本文所用之CCDC168係指人類CCDC168，寄存編號NM_001146197.1/NP_001139669.1/GI：226246553(643677/Q8NDH2)。
「ZNF527」係指鋅指蛋白質527，屬於鋅指蛋白質家族。除非另外明確地陳述，否則本文所用之ZNF527係指人類ZNF527，寄存編號NM_032453.1/NP_115829/GI：149192840(84503/Q8NB42)。
「HRAS」係指Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物，為一種小G蛋白質，其活化MAP激酶路徑。除非另外明確地陳述，否則本文所用之HRAS係指人類HRAS，寄存編號NM_005343.2/NM_176795.3NM_001130442.1/NP_001123914.1/GI：47117697/GI：194363760/GI：194363761(3265/P01112)。
「FAT1」係指FAT1，一種原黏附素(protocadherin)蛋白，據報告可結合至β-連環蛋白(catenin)及防止其核易位。除非另外明確地陳述，否則FAT1係指人類FAT1，寄存編號NM_005245.3/NP_005236/GI：75813622(2195/Q14517)。
在本文中，對於任何所給基因僅列出一種基因寄存編號。應明瞭本發明包括與該基因有關之任何剪接形式。剪接形式在本文中意指單一基因之mRNA以選擇方式剪接，導致單一基因之多種蛋白質變異體之表現。例如，Notch2具有兩種剪接變異體，NM_024408及NM_001200001。對於Notch2，僅列出NM_024408。
如本文所用，「敏感性」意指細胞或患者對於Wnt抑制劑反應，其意為因Wnt抑制劑之作用導致延遲、停止、抑制腫瘤生長、侵襲或轉移或達成腫瘤縮小或消退。於本發明之一個實施例中，當用10至100nM化合物A處理細胞或患者樣本48小時，如該細胞或患者樣本對於治療以大於50%Axin2減低反應(Wnt路徑抑制)(例如Axin2 mRNA或蛋白質含量減低)，則該細胞或患者樣本對Wnt抑制劑具有「敏感性」。於一個特定實施例中，當用50nM化合物A處理細胞或患者樣本48小時，如該細胞或患者樣本對於治療以Axin2 mRNA含量減低大於50%反應，則該細胞或患者樣本對Wnt抑制劑具有「敏感性」。
當在至少一種選自表1之生物標記相較於對照組差異性地下調時，該細胞針對於Wnt抑制劑之抑制為「敏感性」或展現「敏感性」。或者，當在多於一種、多於兩種、多於三種、或整組生物標記差異性地表現時，該細胞針對於Wnt抑制劑之抑制為「敏感性」。
「對照組細胞」或「正常細胞」係指非癌性組織或細胞。
「對照組組織」或「正常組織」係指非癌性組織或細胞。
「對照組樣本」或「正常樣本」係指非癌性組織或細胞。
如本文所用，「對照組」為對照組細胞、對照組組織或對照組樣本中之生物標記表現、或描述與正常或健康生物標記表現(即，正常非癌性細胞、樣本或組織中之生物標記表現)充分相關聯之值之參數或數值。
Notch1「胞外域」於本文中表示胺基酸1至1735之Notch1區。
術語「核酸」及「多核苷酸」可互換使用及係指任何長度之核苷酸聚合形式，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其類似物。多核苷酸可具有任何三維結構及可執行任何功能。以下為多核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段(例如，探針、引物、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列之單離DNA、任何序列之單離RNA、核酸探針、及引物。多核苷酸可包括改質之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，則針對於核苷酸結構之改質可在聚合物組裝之前或之後進行。核苷酸之序列可間雜非核苷酸組分。多核苷酸可進一步在聚合之後改質，諸如，藉由與標記組分結合。該術語亦指雙股分子及單股分子二者。除非另外指明或另有需要，否則本發明之任何實施例為：多核苷酸包括雙股形式及包括已知或預測構成雙股形式之兩互補單股形式各者。
「基因」係指包含至少一個可在轉錄及轉譯之後編碼特定多肽 或蛋白質之開放讀碼框(ORF)之多核苷酸。多核苷酸序列可用於識別與其相關聯之基因之較大片段或全長編碼序列。熟習此項技藝者已知單離較大片段序列之方法。
「基因表現」、「基因產物」或「表現」在本文中均可互換使用及係指當基因轉錄及轉譯時所產生之核酸或胺基酸(例如，肽或多肽)、生物標記之DNA複製次數、生物標記之基因組DNA、cDNA或RNA序列；生物標記基因表現、生物標記蛋白質表現、生物標記mRNA表現；生物標記蛋白質之功能性效應；生物標記基因、cDNA或mRNA之功能性效應；蛋白質、cDNA、基因或mRNA活性、或其損失、或諸如(例如)框移突變、缺失、易位、插入、複製、轉化、功能性突變之突變狀態；或其組合。
於一個特定實施例中，「基因表現」、「基因產物」或「表現」表示DNA表現、DNA複製次數、mRNA表現、cDNA表現、蛋白質轉錄、蛋白質表現、DNA修飾、cDNA修飾、mRNA修飾、蛋白質修飾、DNA功能、cDNA功能、mRNA功能、蛋白質功能、DNA突變、cDNA突變、mRNA突變、蛋白質突變、或其組合；較佳為DNA突變。DNA修飾包括DNA烷基化或醯化。例如，甲基化為涉及添加甲基至胞嘧啶或腺嘌呤DNA核苷酸之生物化學製程。mRNA修飾包括RNA譯讀，該RNA譯讀為涉及核苷酸在其由RNA聚合酶產生以形成序列之後之改變的生物化學製程。cDNA修飾包括在mRNA層級進行之將轉譯為cDNA修飾之任何修飾。蛋白質修飾包括涉及胺基酸在其經過轉譯之後之改變的生物化學製程。蛋白質功能應理解為蛋白質進行由基因中編碼之資訊所特定的職責，包括訊號轉導、酵素反應等等之促進。
術語「多肽」可與術語「蛋白質」互換使用及在其最寬廣意義上係指兩個或更多個子單元胺基酸、胺基酸類似物、或肽模擬物之化 合物。該等子單元可由肽鍵鍵聯。於另一個實施例中，子單元可由其他鍵(例如，酯、醚等等)鍵聯。
如本文所用，術語「胺基酸」係指天然及/或非天然或合成胺基酸中之任何一者、及D及L光學異構體二者、胺基酸類似物、及肽模擬物。假如肽鏈短，則三個或更多個胺基酸之肽通常稱為寡肽。假如肽鏈長，則肽通常稱為多肽或蛋白質。
術語「單離」意指自組分、細胞及其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段性質上通常相關聯之其他之分離。例如，單離的多核苷酸係自其通常在其天然或自然環境中，例如，於染色體上相關聯之3'及5'鄰接核苷酸相分離。如熟習此項技藝者所可明瞭，非自然生成之多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體、或其片段不需要「單離」以區分其與其自然生成之對應物。此外，「濃縮」、「分離」或「稀釋」之多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段可與其自然生成之對應物區分開，在於每體積中分子之濃度或數量在「濃縮」類型中比其自然生成之對應物之每體積中分子之濃度或數量大或在「分離」類型中比其自然生成之對應物之每體積中分子之濃度或數量小。其一級序列或例如其糖基化方式不同於自然生成之對應物之多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體、或其片段不需要呈其單離形式存在，此乃因其可藉由其一級序列或者藉由諸如糖基化方式之另一特徵與其自然生成之對應物區分。因此，非自然生成之多核苷酸係提供作為與單離的自然生成之多核苷酸分開之實施例。產生於細菌細胞中之蛋白質係提供作為與自其中本質上產生其之真核細胞單離的自然生成之蛋白質分開之實施例。
「探針」當在多核苷酸操作情況中使用時係指一種提供作為可藉由與靶雜交偵測潛在性地存於受關注樣本中之靶之試劑之寡核苷酸。通常，探針將包括標記或可在雜交反應之前或之後附接標記之裝 置。適宜之標記包括(但不限於)放射性同位素、螢光染料、化學發光化合物、染料、及蛋白質(包括酵素)。
「引物」為短多核苷酸，一般具有藉由與靶雜交及之後促進與靶互補之多核苷酸之聚合，結合至潛在性地存於受關注樣本中之靶或「模板」之游離3'-OH基。「聚合酶鏈反應」(「PCR」)為其中複製複本係由靶多核苷酸使用由「上游」及「下游」引物組成之「引物對」或「引物組」、及聚合觸媒(諸如DNA聚合酶，及通常係熱穩定聚合酶)進行之反應。PCR之方法為相關技藝中所熟知，及教示於例如PCR：A Practical Approach，M.MacPherson等人，於牛津大學出版社下之IRL出版社(1991)中。產生多核苷酸之複製複本之所有方法諸如PCR或基因選殖在本文中統稱為「複製」。引物亦可用作用於雜交反應(諸如南方或北方墨點分析法)中之探針(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989))。
如本文所用，「差異性表現」意指通常相較於對照組情況下之表現之可測量差異。例如，當應用於基因時，其可指相較於正常細胞中之正常、野生型、功能性基因之基因之差異性突變狀態。差異性突變之基因可相較於野生型基因突變，此會導致突變基因之功能損失。其亦可指經由基因或由基因編碼之蛋白質產品轉錄及/或轉譯之mRNA之差異性產生。經差異性表現之基因可相較於正常或對照組細胞之表現程度為過度表現或不足表現。然而，如本文所用，過度表現為基因表現之增加及一般係至少1.25倍、或或者至少1.5倍、或或者至少2倍、或或者至少3倍或或者至少4倍表現超過在正常或對照組對應物細胞或組織中所偵測到之表現。如本文所用，不足表現為基因表現之減低及一般係至少1.25倍、或或者至少1.5倍、或或者至少2倍或或者至少3倍或或者至少4倍表現低於在正常或對照組對應物細胞或組織中所偵測到之表現。術語「差異性表現」亦指癌細胞或癌性組織中之表現與對 照組(例如對照組細胞或正常組織，例如，非癌性細胞或組織)中之表現不同之情況。作為一實例，若癌症樣本中之表現係至少1.25倍、或或者至少1.5倍、或或者至少2倍或或者至少3倍或或者至少4倍低於對照組中之表現，則生物標記係差異性表現或差異性地下調。
基因之高表現水平可發生，此係因為基因之過度表現或基因複製次數之增加。基因亦可因負向調節物之失調或不存在轉為增加之蛋白質含量。
術語「cDNA」係指互補DNA，亦即，存在於細胞或生物體中之mRNA分子與諸如逆轉錄酶之酵素形成為cDNA。「cDNA庫」為存在於細胞或生物體中之所有mRNA分子之集合，其等均由酵素逆轉錄酶轉化為cDNA分子，接著插入至「載體」(可在添加外源性DNA後繼續複製之其他DNA分子)中。庫之示例性載體包括噬菌體(bacteriophage(亦稱為「phage」))、感染細菌之病毒(例如，λ噬菌體)。庫可接著經探針探測受關注特異性cDNA(且因而mRNA)。
作為一實例，可藉由使用諸如Affymetrix® HG-U133-Plus-2基因晶片之基因晶片測量信使RNA含量來評估轉錄活性。大數目之受關注基因之RNA之高通量即時定量因而在可再現系統中變為可能。
術語「嚴苛雜交條件」係指使得核酸探針將特異性地雜交至其靶子序列而不雜交至其他序列之條件。決定雜交嚴苛性之條件包括：溫度、離子強度、及諸如甲醯胺之變性劑之濃度。改變該等因素中之一個因素會影響另一個因素及熟習此項技藝者當明瞭維持所欲嚴苛度之條件之改變。高度嚴苛雜交之一個實例為：0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉，於65至68℃下或0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉、及50%甲醯胺，於42℃下(參見Sambrook，上述)。「中等嚴苛」雜交之一個實例為以下之條件：0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉，於50至65℃下或0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉、及20%甲醯胺，於 37至50℃下。當在需要中等量之核酸失配時使用中等嚴苛條件。熟習此項技藝者當明瞭洗滌為雜交條件之一部分。例如，洗滌條件可包括02.X至0.1X SSC/0.1% SDS及42至68℃之溫度，其中漸增之溫度可增強洗滌條件之嚴苛性。
當雜交以反向平行構形在兩單股多核苷酸之間發生時，反應稱為「退火」及將其等多核苷酸描述作「互補」。若雜交可在第一多核苷酸及第二多核苷酸該等股之一者之間發生，則雙股多核苷酸可與另一多核苷酸「互補」或「同系」。「互補」或「同系」(一種多核苷酸與另一種多核苷酸互補之程度)可依照大致上被接受的鹼基配對原則根據預期彼此形成氫鍵結合之相對股中鹼基之比例量化。
多核苷酸或多核苷酸區域(或多肽或多肽區域)具有特定百分比(例如，80%、85%、90%、95%、98%或99%)之與另一序列之「序列一致性」，意指當在比對時，在比較兩種序列中該百分比之鹼基(或胺基酸)係相同的。該比對及百分比同系或序列一致性可利用相關技藝中已知之軟體程式，例如，述於Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人編輯，(1987)增刊30，第7.7.18部分，表7.7.1中之其等確定。較佳地，預設參數係用於比對。一種較佳之比對程式為使用預設參數之BLAST。特定言之，較佳之程式為BLASTN及BLASTP，使用以下預設參數：遺傳密碼=標準；篩選=無；股=兩股；截止=60；預期=10；矩陣=BLOSUM62；描述=50序列；選擇=高得分值；資料庫=非冗餘。
本文中生物標記包括基因變異體及具有至少95%序列一致性之基因。
術語「細胞增生性疾病」應包括特徵係異常細胞生長及/或分裂或功能損失之正常生理功能之失調。「細胞增生性疾病」之實例包括(但不限於)增生、瘤形成、化生、及各種自體免疫疾病(例如，特徵係 T細胞凋亡之失調之其等)。
如本文所用，術語「腫瘤性細胞」、「腫瘤性疾病」、「瘤形成」、「腫瘤」、「腫瘤細胞」、「癌症」、及「癌細胞」(可互換使用)係指展現相對地自主生長使得其展現特徵係細胞增生之控制顯著損失(亦即，失調之細胞分裂)之異常性生長表現型之細胞。腫瘤性細胞可為惡性或良性。轉移性細胞或組織意指細胞可侵入並破壞鄰近身體結構。
「頭部及頸部癌症」或「頭部及頸部鱗狀細胞癌」可互換使用及係指出現於頭部或頸部區域中之癌症16。其主要為鼻腔、鼻竇、唇、口、唾腺、喉(throat/larynx)之癌症。90%之頭部及頸部癌症被歸類為頭部及頸部鱗狀細胞癌。其以全球發生率計為第六位癌症，全球每年有約600,000例。HNSCC患者之5年存活率為約40至50%。
「抑制腫瘤生長」指示腫瘤細胞生長之減慢，此可藉由相關技藝中已知之任何方式來評估，包括(但不限於)測量腫瘤大小，利用3H-胸苷併入檢測確定腫瘤細胞是否增生，藉由FDG-PET(氟化去氧葡萄糖正子發射斷層攝影術)成像測量葡萄糖吸收，或計數腫瘤細胞。「抑制」腫瘤細胞生長意指任何或所有以下狀態：減慢、延緩及停止腫瘤生長、以及腫瘤縮小。
「醫藥組合物」為活性劑及另一種惰性(例如，可偵測作用劑或標記)或活性載劑(例如，化合物或組合物)(諸如佐劑、稀釋劑、黏結劑、穩定劑、緩衝劑、鹽、親油性溶劑、防腐劑或類似者)之組合。載劑亦包括醫藥賦形劑及添加劑，例如；蛋白質、肽、胺基酸、脂質、及碳水化合物(例如，糖，包括單糖及寡糖；衍生之糖，諸如醛醣醇、醛醣酸、酯化糖及類似者；及多醣或糖聚合物)，其可單獨或以組合方式(單獨地或以組合方式佔1至99.99%(以重量或體積計))存在。碳水化合物賦形劑包括例如：單糖，諸如果糖、麥芽糖、半乳 糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、及類似者；二糖，諸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二醣、及類似者；多醣，諸如棉籽糖(raffinose)、松三糖(melezitose)、麥芽糊精、葡聚糖、澱粉、及類似者；及醛醣醇，諸如甘露糖、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)及肌醇。
示例性蛋白質賦形劑包括血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白(HSA)、重組人類白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白、及類似者。亦可在緩衝能力上發揮作用之代表性胺基酸/抗體組分包括丙胺酸、甘胺酸、精胺酸、甜菜鹼、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、離胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、阿斯巴甜(aspartame)、及類似者。
術語「載劑」進一步包括緩衝劑或pH調節劑；通常，緩衝劑為自有機酸或鹼製得之鹽。代表性緩衝劑包括有機酸鹽，諸如檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、或苯二甲酸之鹽；Tris、胺丁三醇鹽酸鹽、或磷酸鹽緩衝劑。其他載劑包括聚合物賦形劑/添加劑，諸如聚乙烯吡咯啶酮、菲科爾(ficolls)(一種聚合糖)、葡萄糖(例如，環糊精，諸如2-羥丙基-正交-環糊精)、聚乙二醇、矯味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如，聚山梨糖醇酯，諸如TWEEN 20TM及TWEEN 80TM)、脂質(例如，磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如，膽固醇)、及螯合劑(例如，EDTA)。
如本文所用，術語「醫藥上可接受之載劑」包括任何標準醫藥載劑，諸如經磷酸鹽緩衝之鹽水溶液、水、及乳液(諸如油/水或水/油乳液)、及各種類型之潤濕劑。該等組合物亦可包括穩定劑及防腐劑及任何上述載劑，其額外限制條件為其等係活體內使用可接受的。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，請參見Remington’s Pharmaceutical Science，第15版(Mack Publ.Co.,Easton(1975)及Physician’s Desk Reference，第52版，Medical Economics，Montvale,N.J.(1998)。
「有效量」為足可實現敏感性細胞或患者樣本中有益或所欲結果(例如，預防腫瘤生長)之量。其亦可表示抑制Wnt路徑之量。有效量可分一或多次投與、施用或劑量投與。
「受試者」、「個體」或「患者」在本文中可互換使用，其係指脊椎動物，較佳係哺乳動物，更佳係人。哺乳動物包括(但不限於)小鼠、猿、人、農場動物、競技類動物、及寵物。
如本文所用，「Wnt抑制劑」係減低Wnt路徑之活性。Wnt抑制劑為可抑制Wnt訊號傳導路徑之化合物，及包括PORCN抑制劑。該抑制可包括(例如)抑制PORCN、及其之Wnt之棕櫚醯基化、或降低包括捲曲蛋白及蓬亂蛋白之Wnt路徑組分之間之締合。較佳地，Wnt抑制劑為PORCN抑制劑。
於一個特定實施例中，用於如本文所述之處理之Wnt抑制劑為如WO2010/101849 A1(PCT/US10/025813)中所揭示之任何適宜化合物，較佳係式(1)之化合物：
或其生理上可接受之鹽，其中：其中之X1、X2、X3及X4係選自N及CR7；X5、X6、X7及X8中之一者為N及其他為CH；X9係選自N及CH；Z係選自苯基、吡嗪基、吡啶基、噠嗪基及哌嗪基；其中Z之各苯基、吡嗪基、吡啶基、噠嗪基或哌嗪基係視情況經R6基取代； R1、R2及R3為氫；m為1；R4係選自氫、鹵素、二氟甲基、三氟甲基及甲基；R6係選自氫、鹵素及-C(O)R10；其中R10為甲基；及R7係選自氫、鹵素、氰基、甲基及三氟甲基。
特定言之，該Wnt抑制劑可為選自以下之群之化合物：N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(噠嗪-4-基)吡啶-3-基]乙醯胺；2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺；N-(2,3'-聯吡啶-6'-基)-2-(2',3-二甲基-2,4'-聯吡啶-5-基)乙醯胺；N-(5-(4-乙醯基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-甲基-3-(三氟甲基)-2,4'-聯吡啶-5-基)乙醯胺；N-(5-(4-乙醯基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-聯吡啶-5-基)乙醯胺；及2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-聯吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺；或其醫藥上可接受之鹽。
於一不同實施例中，該Wnt抑制劑為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺(化合物A)。
可依照本發明使用如WO2011/123785(PCT/US2011/030950)或WO2011/088123(PCT/US2011/020994)中所揭示之其他Wnt抑制劑。
本發明之詳細陳述
現已識別出多種基因可充作用於Wnt抑制劑之生物標記。其等列於表1中。該等生物標記可用於確定癌症患者對抑制劑之敏感性及有助於監測接受治療之該等患者之反應。另外，明確界定之生物標記可指示哪位患者應接受治療，亦即，可用於患者分級及增加化合物將最 終引起患者反應之機會。其容許較及時且積極之治療，與試驗及誤差方法相反。該等生物標記亦可用於監測治療之有效性。若生物標記指示患者已變為對該治療不敏感，則投與劑量可增加、減少、完全停藥、或改用另一種治療投與。因此，所識別之生物標記(即，選自表1之任何生物標記)為與Wnt抑制劑或PORCN抑制劑相關聯之適宜生物標記。使用該等生物標記之方法確保恰當患者接受適宜之治療及在治療過程中患者可受監測其持續之Wnt(特別是PORCN)抑制劑敏感性。治療方法中之癌症患者可根據其對Wnt抑制劑之敏感性選擇性地獲得治療。該等生物標記係藉由在細胞株及小鼠異種移植中進行實驗來識別，或基於生物資訊分析來確定。
一或多種本文所識別生物標記之基因表現之減少可用於確定患者對任何Wnt抑制劑之敏感性，例如，生物標記之減少或過度表現指示癌症患者對Wnt抑制劑(特別是化合物A)之投與敏感及將有利地回應於Wnt抑制劑(特別是化合物A)之投與。作為另一實例，在利用Wnt抑制劑治療之後，可獲得患者樣本及檢測該樣本之敏感性以發現該患者是否仍舊對以Wnt抑制劑之治療敏感。或者，可檢測多於一種選自表1之生物標記之組合以達成該結果。以Wnt抑制劑(特別是如本文所定義之其等，尤其是化合物A)之治療可係選擇性的。此意指僅被識別為敏感之該等患者或極有可能回應於Wnt抑制劑之治療之該等患者接受Wnt抑制劑。其他可視情況接受其他藥物之替代治療。
已確定該等生物標記在患者樣本中於治療之前或治療之後相較於對照組樣本之基因表現之變化(包括活性或功能之損失或增益)可指示患者回應於Wnt抑制劑之治療。例如，Wnt抑制劑可為化合物A。更特定言之，WNT11、WNT10A、WNT3、WNT7A在患者樣本中較對照組更高之表現指示患者對Wnt抑制劑之治療更可能敏感。另一方面，患者對Wnt抑制劑之治療更可能敏感係由AXIN2、LEF1、NKD1之表 現相較於對照組表現減少所指示。若Notch1、Notch2或Notch3表現減少，或特定言之，若其活性或功能相較於對照組減低，則其指示患者對Wnt抑制劑之治療更可能敏感。該活性或功能可係因突變引起。相較於對照組，於患者樣本中偵測到較低之SFRP2、FRZB、SFRP4或DKK2表現，可指示患者對Wnt抑制劑之治療之敏感性。相較於對照組程度，FAM58A、FLJ43860、CDKN2A、CCDC168、ZNF527、FAT1、OR7G3或DTX3L之較低表現，特別是其功能損失，可指示患者將極有可能回應於Wnt抑制劑之治療。當患者樣本顯示較對照組HRAS之更高表現(特別是功能增益)時，患者對Wnt抑制劑之治療敏感之可能性更大。
已證實頭頸癌細胞高度回應於Wnt抑制劑。患有頭部及頸部癌症之癌症患者可自Wnt抑制劑之治療獲益。一般而言，本發明之化合物將以治療有效量經由相關技藝中已知的任何常用且可接受之模式單獨或以與一或多種治療劑組合方式投與。治療有效量可廣泛地改變，取決於疾病之嚴重度、個體之年齡及相對健康狀態、所使用化合物之效力及其他因素。一般而言，指示以約0.03至2.5mg/kg體重之日劑量可全身性地獲致令人滿意的結果。較大哺乳動物(例如人)中之所指示日劑量在自約0.5mg至約100mg範圍內，可方便地投與，例如，以多達一天四次之分次劑量。用於口服之適宜單位劑型包含約1至50mg活性成分。
患有相較於對照組出現選自表1之生物標記之差異性下調表現之頭部及頸部癌症之患者，尤其可自Wnt抑制劑(較佳係化合物A)之治療獲益。此患者回應之可能性為最高。藉由相同符記，亦可治療罹患其他腫瘤類型之患者，只要相較於對照組在其癌症樣本中選自表1之生物標記之差異性表現下調。一旦開始以Wnt抑制劑治療，則抑制劑之有效性可藉由Axin2、LEF1及/或NKD1之差異性表現與對Wnt抑制劑 敏感之癌症樣本中之表現之比較監測。通常，假如Wnt抑制劑有效，則Axin2、LEF1及/或NKD1之表現達成下調。Axin2、LEF1及/或NKD1之不足之下調表現指示需要調整劑量，或可必需將Wnt抑制劑與另一種抗腫瘤藥劑組合。
基因表現之測量
基因表現之偵測可藉由任何適宜方法進行，包括(例如)偵測由基因轉錄之mRNA的量或由自基因轉錄之mRNA之逆轉錄所產生之cDNA的量或由基因編碼之多肽或蛋白質的量。該等方法可在樣本上藉由樣本基礎地或經改動達成高通量之分析進行。例如，使用AffymetrixTM U133微陣列晶片。
於一個態樣中，基因表現係藉由與會與該生物標記之適宜探針特異性雜交之探針雜交來偵測並定量化。亦可利用相關技藝中已知的方法將該等探針附接至用於高通量篩選試驗中之固體擔體。例如，WO 97/10365及美國專利案第5,405,783號、第5,412,087號及第5,445,934號揭示可包含一或多種本文所揭示序列之高密度寡核苷酸晶片之構造。利用揭示於美國專利案第5,405,783號、第5,412,087號及第5,445,934號中之方法，在衍生之玻璃表面上合成本發明之探針。經光保護之核苷亞磷醯胺係偶聯至玻璃表面，選擇性地藉由光解經由微影光罩去除保護，及與第二經保護之核苷亞磷醯胺反應。重複偶聯/去除保護製程直到完成期望的探針。
於一個態樣中，基因之表現水平係藉由使核酸樣本暴露於探針改質晶片來確定。提取之核酸係例如藉由螢光標籤較佳在擴增步驟中進行標記。經標記樣本之雜交係以適宜嚴苛水平進行。使用偵測裝置定量地測定探針-核酸雜交之程度。參見美國專利案第5,578,832號及第5,631,734號。
或者，可利用已知的技術測定基因複製次數、轉錄、或轉譯中 之任何一者。例如，諸如PCR之擴增方法可係有用的。PCR之一般程序教示於MacPherson等人，PCR：A Practical Approach(於牛津大學出版社下之IRL出版社(1991))中。然而，用於各應用反應之PCR條件係以經驗方式確定。許多參數會影響反應之成功。其中包括退火溫度及時間、延伸時間、Mg2+及/或ATP濃度、pH、及引物、模板、及脫氧核糖核苷酸之相對濃度。於擴增之後，可藉由瓊脂糖凝膠電泳，接著利用溴化乙錠染色劑及紫外光照射進行目測，以偵測所得DNA片段。
於一個實施例中，藉由偵測一或多個附接至樣本核酸之標記，來偵測經雜交之核酸。該等標記可依熟習相關技藝者所熟知的多種方法中之任一者併入。然而，於一個態樣中，標記係在製備樣本核酸之擴增步驟期間同時地併入。因此，例如，利用經標記引物或經標記核苷酸之聚合酶鏈反應(PCR)將提供經標記擴增產物。於另一個實施例中，如上所述使用經標記核苷酸(例如，螢光素標記之UTP及/或CTP)之轉錄擴增可將標記併入至經轉錄之核酸中。
或者，標記可直接地添加至初始核酸樣本(例如，mRNA、polyA、mRNA、cDNA等等)或可在完成擴增之後添加至擴增產物。將標記附接至核酸之方法是為熟習此項技藝者所熟知的及包括(例如)刻痕轉譯或末端標記(例如，利用經標記RNA)，其係藉由激酶化核酸及於隨後進行接合樣本核酸與標記(例如，螢光團)之核酸連接子之附接(連接)。
適用於本發明之可偵測標記包括可藉由光譜方法、光化學方法、生物化學方法、免疫化學方法、電方法、光學方法或化學方法偵測之任何組合物。於本發明中之有用的標記包括用於利用經標記鏈黴親和素共軛物染色之生物素、磁性珠粒(例如，DynabeadsTM)、螢光染料(例如，螢光素、德克薩斯紅(texas red)、玫瑰紅、綠色螢光蛋白質、及類似者)、放射性標記(例如，3H、125I、35S、14C、或32P)、酵 素(例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶及通常用於ELISA中之其他酶)、及熱量標記(諸如膠態金或彩色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等等)珠粒)。教示該等標記之用途之專利案包括美國專利案第3,817,837號；第3,850,752號；第3,939,350號；第3,996,345號；第4,277,437號；第4,275,149號；及第4,366,241號。
熟習相關技藝者熟知標記之偵測。因此，例如，可使用照相軟片或閃爍計數器偵測放射性標記，可使用偵測發射光之光偵測器偵測螢光標記物。通常藉由提供具有底物之酵素及偵測由酵素對底物作用所產生之反應產物偵測酵素標記，及藉由簡單地觀察彩色標記偵測熱量標記。
可偵測之標記可在雜交之前或之後被添加至靶(樣本)核酸，正如WO 97/10365中所述。該等可偵測標記係在雜交之前直接附接或併入至靶(樣本)核酸。相反地，「間接標記」係在雜交之後接合至雜交二螺旋。一般而言，間接標記係附接至已在雜交之前附接至靶核酸之結合部分。例如，靶核酸可在雜交之前生物素化。於雜交之後，與抗生物素蛋白(avidin)共軛之螢光團將會結合帶有提供容易偵測到之標記之雜交二螺旋之生物素。關於標記核酸及偵測經標記雜交核酸之方法的詳細評論，請參見Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第24卷：Hybridization with Nucleic Acid Probes，P.Tijssen編輯Elsevier，紐約(1993)。
多肽之偵測
生物標記之表現水平亦可藉由檢測至少一種選自表1之生物標記之蛋白質表現或蛋白質產物來確定。蛋白含量之確定涉及測量發生在可選擇性地識別及結合獲自患者的樣本中生物標記之多肽之抗體間之任何免疫特異性結合之量及比較該量與對照組樣本中至少一種生物標記之免疫特異性結合之量。該生物標記之蛋白質表現之量相較對照組 表現可能增加或減少。或者，可分析多於一種選自表1之生物標記之組合。
於蛋白質分析技藝中有多種技術可用。其等包括(但不限於)放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、「夾心」免疫測定、免疫放射量測定、原位免疫測定(使用例如膠態金、酵素或放射性同位素標記)、西方墨點分析、免疫沉澱測定、免疫螢光測定、流式細胞計數法、免疫組織化學、共焦顯微鏡法、酵素測定、表面電漿共振及PAGE-SDS。
生物標記之檢測及Wnt抑制劑之治療
一旦已經預測患者對Wnt抑制劑敏感，則可在整個治療過程中以一次給藥、連續或斷續地實施投與患者任何Wnt抑制劑。確定最有效之投藥裝置及劑量之方法為熟習此項技藝者所熟知及將隨用於治療之組合物、治療之目的、進行治療之靶細胞、及進行治療之個體而改變。單一或多次投藥可以由治療醫師所選劑量及方式進行。可憑經驗調整適宜之劑量配方及投與藥劑之方法。
可在投與Wnt抑制劑之後檢測至少一種選自表1之生物標記以確定患者是否仍舊對Wnt抑制劑之治療敏感。此外，可在單次投與抑制劑之後的多個時間點檢測至少一種生物標記。例如，投與初始大量(bolus)Wnt抑制劑，在首次治療後1小時、2小時、3小時、4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、3天、1週或1個月或數個月檢測至少一種生物標記。或者，多於一種(例如2種、3種、4種、5種或所有)選自表1之生物標記可一起檢測。
可在每次投與Wnt抑制劑之後檢測該至少一種選自表1之生物標記，因此，若存在Wnt抑制劑之多次投與，則可在每次投與之後檢測該至少一種生物標記以確定持續之患者敏感性。患者會經歷Wnt抑制劑之多次投藥及接著在不同時間點檢測該等生物標記。例如，治療過 程可能需要投與初始劑量、經過特定時段後之第二劑量、及再於第二給藥數小時後之第三劑量之Wnt抑制劑。可在投與各劑量之Wnt抑制劑後1小時、2小時、3小時、4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、3天、1週或1個月或數個月檢測至少一種生物標記。或者，多於一種(例如2種、3種、4種、5種或所有)選自表1之生物標記可一起進行檢測。
本發明範疇中亦包括在不同時間點檢測不同生物標記。在不受任一理論約束下，歸因於Wnt抑制劑或生物標記之作用機制，對Wnt抑制劑之回應延遲及在投與後的任何時間檢測至少一種生物標記以確定患者是否仍舊對藥物之投與敏感。在每次投與Wnt抑制劑後針對於至少一種選自表1之生物標記之檢測將提供關於方法、劑量及治療過程之指導。
最終，存在投與不同Wnt抑制劑及接著檢測至少一種選自表1之生物標記。於該實施例中，選擇多於一種Wnt抑制劑及投與給該患者。可接著在投與每次不同之Wnt抑制劑之後檢測至少一種選自表1之生物標記。如上述，該試驗亦可在投與不同Wnt抑制劑後的多個時間點進行。例如，可投與第一Wnt抑制劑給患者及在投與後1小時、2小時、3小時、4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、3天、1週或1個月或數個月檢測至少一種生物標記。可接著投與第二抑制劑及再次於投與第二Wnt抑制劑後1小時、2小時、3小時、4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、3天、1週或1個月或數個月檢測至少一種生物標記。或者，多於一種(例如2種、3種、4種、5種或所有)選自表1之生物標記可一起進行檢測。
本發明之另一個態樣提供一種評估Wnt抑制劑之適宜劑量水平之方法，該方法包括在投與Wnt抑制劑之後監測至少一種生物標記之差異性表現。例如，在投與第一大量Wnt抑制劑之後，分析至少一種生 物標記及基於該結果，建議增加或減少Wnt抑制劑劑量。於投與經調整劑量之Wnt抑制劑之後，至少一種生物標記之分析將可確定患者是否仍舊對經調整之劑量敏感及該經調整之劑量是否提供預期之效果，例如，抑制腫瘤生長。或者，多於一種(例如2種、3種、4種、5種或所有)選自表1之生物標記可一起進行檢測，以評估對Wnt抑制劑之劑量之敏感性。
於評估最初具敏感性之腫瘤中Wnt抑制劑之延時效力之所有實施例之替代實施例中，可將NKD1、LEF1及/或Axin2之差異性表現與敏感性腫瘤樣本中之表現進行比較。敏感性腫瘤樣本亦定義為藉由50nM化合物A之治療48小時時顯示Axin2減少(Wnt路徑抑制)大於50%之腫瘤。
可製得用於評估任何Wnt抑制劑之活性之套組。例如，包括用於選自表1之生物標記之PCR或微陣列雜交之核酸引物之套組可用於評估對Wnt抑制劑之敏感性。或者，與用於至少一種生物標記之抗體一起提供之套組可適用於檢測對Wnt抑制劑之敏感性。
相關技藝中熟知癌症可變為抗化療治療，尤其在該治療為長期之情況下。至少一種選自表1之生物標記之差異性表現之檢測可在利用任何化療劑之長期治療之後進行，以確定癌症是否對Wnt抑制劑敏感。若患者先前已經另一種化療劑或另一種Wnt抑制劑治療，則此乃患者檢測至少一種選自表1之生物標記以確定腫瘤是否對Wnt抑制劑敏感之有用資訊。該檢測可尤其有益於假如癌症經歷緩解且接著再生長或已轉移至不同部位的患者。
針對於Wnt抑制劑之篩選
可檢測至少一種選自表1之生物標記以篩選其他Wnt抑制劑。該方法包括檢測具有至少一種生物標記之細胞，此預測若細胞對候選Wnt抑制劑敏感，則接著使該細胞與該候選Wnt抑制劑接觸及比較經 處理之細胞之IC50與接觸敏感性細胞之已知Wnt抑制劑。例如，就預測為如藉由至少一種生物標記之差異性表現所確定之對任何Wnt抑制劑敏感之細胞而言，候選Wnt抑制劑將具有IC50 3μM。至少一種生物標記表現之測量可藉由上述方法(例如PCR或微陣列分析)進行。或者，可基於此目的檢測多於一種之生物標記之組合。
實例 實例1：化合物A及化合物B(分別為圖1A及1B)為生化及細胞檢測中之有效PORCN抑制劑。
放射性配體結合檢測：膜製備：使用Fugene 6(Roche)，利用帶有人類PORCN之pcDNA 3.1結構(Invitrogen)轉染約108個293細胞。於48小時後，藉由於PBS中刮削來收穫細胞，以1,000×g離心10分鐘。對緩衝液吸氣。在乾冰浴中冷凍細胞小球，接著輕柔地再懸浮於10ml含有無EDTA蛋白酶抑制劑混合物之50mM Tris pH 7.5、250mM蔗糖緩衝液(Sigma)中。使用polytron(Brinkman)裂解細胞。於4℃以1,600×g將裂解細胞離心20分鐘，及轉移上清液及於4℃下在SS34轉子中以20,000rpm離心20分鐘。棄置上清液及使用三個利用Polytron之10秒脈衝，將該等小球再懸浮於10%蔗糖、50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2、1mM EDTA溶液中。
化合物B之放射性配體標記：化合物C，其結構列於下方，
經由由AmBioslabs進行之氫化反應放射性標記化合物C，以製得3H-放射性標記之化合物B。
放射性配體結合檢測：利用上述膜製劑，如下進行過濾結合檢測。為減低非特異性結合，如製造商建議利用0.1% BSA預塗覆96孔過濾盤(PerkinElmer)且接著利用0.1% BSA洗滌四次。於室溫下，在聚丙烯96孔盤中於結合緩衝液(50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2、1mM EDTA、0.1%牛血清白蛋白)加上無EDTA蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)中在存在或不存在化合物A下，利用6.6nM 3H-化合物B以150μl之最終體積培養膜製劑(50μg總蛋白質)3小時。接著將結合反應混合物轉 移至經預塗覆之96孔過濾盤(PerkinElmer)，使用96-針FilterMate收穫器(PerkinElmer)過濾及洗滌。使用微盤閃爍計數器TopCount(PerkinElmer)獲得放射性信號。藉由TopCount(PerkinElmer)測定放射性配體PORCN結合活性。利用Prism進行曲線擬合。
如圖2A所顯示，經氚標記之化合物B大量地結合至自經PORCN轉染之293細胞之膜製劑而不結合至自無Wnt或載體對照組轉染細胞之其等，此表明化合物B特異性地與PORCN相互作用。另外，化合物B及PORCN之間之特異性相互作用可被未經標記之化合物B競爭消除(圖2A)。化合物B結合至PORCN及充當活體外生物化學PORCN結合檢測中用於與冷測試化合物競爭之熱放射性配體。於使用3H-化合物B之與PORCN之放射性配體結合檢測中，化合物A顯示1nM之IC50(圖2B)。
實例2：藉由化合物A抑制PORCN阻斷活體外Wnt訊號傳導
報導子基因檢測：於37℃與5% CO2之空氣氛圍中，將小鼠睾丸間質(Leydig)細胞TM3細胞(獲自美國菌種培養物保集中心(American Type Culture Collection)，ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯)培養於補充2.5% FBS(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)及5%馬血清(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)、50單位/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)之漢姆氏(Ham's)F12培養基及杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)之1：1混合物中。於10cm培養皿中之TM3細胞係遵循製造商協定，藉由8μg之包含由Wnt回應性元素所驅動之螢光素酶基因之STF-報導子質體及2μg pcDNA3.1-Neo(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)與30μL FuGENE6(Roche Diagnostics，印弟安納州印弟安納波里斯)共轉染。藉由400μg/mL G418(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)篩選穩定細胞株(TM3 Wnt- Luc)。於37℃與5% CO2之空氣氛圍中，將TM3 Wnt-Luc細胞及L-細胞Wnt3A細胞(獲自美國菌種培養物保集中心，ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯)培養於補充10% FBS(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)及50單位/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)之杜貝卡氏改良依格培養基(Gibco/Invitrogen，加州卡爾斯巴德)中，係經胰蛋白酶化及共培養於含補充2% FBS之DMEM培養基之384孔盤中，及藉由不同濃度之本發明化合物處理。於24小時後，藉由Bright-GloTM螢光素酶檢測系統(Promega，威斯康辛州麥迪遜)檢測螢火蟲螢光素酶活性。當在化合物之效應使得發光信號減少50%時，測得IC50。
化合物A有效地抑制Wnt共培養檢測中之Wnt訊號傳導，IC50為0.4nM(圖3A)。該抑制效應係藉由添加經過外源Wnt3A調節之培養基恢復(圖3B)。為進一步證實其於PORCN依賴性Wnt分泌中之功能，藉由HA標記之Wnt3a(HA-Wnt3A)轉染293A細胞及利用多種劑量之化合物A處理。如圖4所顯示，化合物A有效地減低上清液中HA-Wnt3A之豐度同時保留溶胞產物HA-Wnt3A，此表明Wnt3A分泌實質上係以劑量依賴性方式受化合物A抑制。所分泌之Wnt於隨後作用於Wnt接收細胞，此導致Wnt共報導子LRP6之磷酸化。使用自分泌L-Wnt3A細胞(一種過度表現Wnt3A之小鼠乳腺細胞株)，吾人證實化合物A實際上強烈地阻斷LRP6(低密度脂蛋白受體相關蛋白質6)之Wnt依賴性磷酸化(圖5A)。據報告PORCN會影響泛-Wnt轉譯後棕櫚醯基化17-18。於推定Wnt棕櫚醯基化位點Ser209周圍之殘基保留於所有19種Wnt當中(圖5B)，及於整個蛋白質組之任何其他蛋白質中未識別出CHGxSGSC棕櫚醯基化基元。為測試化合物A是否可從基因方面概括PORCN之損失之結果，吾人在Wnt依賴性STF報導子檢測中專注於一組典型的Wnt，包括Wnt1、2、3、3A、6、7A、及9A。如圖5C所顯示，化合物A證實 對所有測試Wnt之相當的抑制活性，此點與PORCN表現型之損失一致。另外，化合物A直至20μM時未在細胞中顯示明顯細胞毒性。
實例3：人頭頸癌細胞株中Wnt抑制劑之細胞功能性效應
為識別出回應於豪豬抑制之人癌細胞株，吾人使用AXIN2之mRNA表現水平作為讀出，吾人對超過300種細胞株進行特徵分析。於37℃與5% CO2下之增濕培養箱中培養所有細胞株。HN30細胞(韋恩州立大學(Wayne State University))及UMSCC細胞(密歇根大學(University of Michigan))係衍生自人頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)患者腫瘤樣本。分別地，依照製造商指令，使用Qiagen RNeasy及DNeasy血液及組織套組單離總RNA或DNA。簡言之，藉由添加緩衝劑RLT破壞細胞及使用QIAshredder旋轉管柱均質化。在添加一體積70%乙醇至均質化溶胞產物及徹底混合之後，將該等樣本轉移至RNeasy旋轉管柱。於離心之後棄置溢流。在利用緩衝劑RW1及緩衝劑RPE洗滌RNeasy旋轉管柱兩次之後，藉由利用無RNA酶水洗脫RNeasy旋轉管柱以收集RNA樣本。對於TaqMan檢測，每孔2×106個細胞接種於6孔細胞培養盤中及以5μM作為最高最終濃度開始之多點劑量回應中利用或不利用化合物處理。於48小時後，收集RNA樣本。
回應性細胞株係定義為在利用10至100nM化合物A處理48小時後，較佳在利用50nM化合物A處理48小時後達成AXIN2 mRNA減少大於50%。如圖6所顯示，頭部及頸部癌症細胞(HNSCC)株屬於回應於化合物A之前幾種癌症類型。於HNSCC細胞株當中，96種中有31種在化合物A之處理後顯示路徑抑制(圖7)。
為了關聯路徑抑制與細胞功能，將人HNSCC細胞株HN30用於進一步之活體外及活體內特徵分析。對於菌落形成檢測，每孔2×103個細胞地接種於經過或不經過化合物處理之6孔細胞培養盤中。於一週後利用結晶紫染色細胞。
化合物A有效地抑制HN30中之Wnt依賴性AXIN2訊息產生，IC50為0.3nM(圖8A)。其強烈地減低HN30菌落形成，但IC50右移(圖8B)。藉由化合物A減低之菌落形成效應可部分地藉由顯性β-連環蛋白之過度表現恢復(圖9A)。為進一步證實化合物A之細胞效應是否係歸因於PORCN依賴性Wnt訊號傳導活性之抑制，進行shRNA實驗。針對於PORCN之shRNA實質上抑制Wnt靶基因AXIN2之表現(圖9B)及活體外HN30細胞之菌落形成(圖9C)，與化合物A資料一致。
實例4：Wnt抑制劑於Wnt依賴性人HNSCC之小鼠模型中之效力
為測試化合物A之抗腫瘤活性，建立HNSCC HN30之小鼠異種移植模型。依照腫瘤體積隨機分組帶有HN30腫瘤之裸小鼠。化合物A係在10%檸檬酸鹽緩衝液pH 2.8/90%檸檬酸鹽緩衝液pH 3.0、或0.5% MC/0.5%吐溫(Tween)80中調配及藉由經口餵食以10μL/g動物體重之給藥體積投與。每日監測體重及一旦腫瘤為可觸摸，則每週三次地評估腫瘤大小。藉由利用測徑規測量確定腫瘤大小。利用公式(長度×寬度×高度)/2計算得腫瘤體積。在第14天測定帶有腫瘤之裸小鼠(n=2/給藥組)中之血漿濃度及化合物A之暴露量。在給藥後第1、3、7、16及24小時藉由連續眼窩採樣採集血液樣本(50μL)。將該等血液樣本離心及分離血漿並冷凍直到藉由LC/MS/MS分析。
如圖10A所顯示，當每天一次地給藥時，化合物A誘導劑量依賴性效力。測量治療組(T)及對照組(C)各組之腫瘤重量改變及用於計算由T/C比表示之生長延遲。於14天的治療之後，0.1mg/kg之劑量導致中度腫瘤生長延遲(T/C：69%)，及0.3mg/kg之劑量明顯地抑制腫瘤生長(T/C：26%)，及1.0及3.0mg/kg之劑量導致實質的腫瘤消退(T/C：分別為-31%及-50%)(圖10A)。療法具良好耐受性及無明顯的動物體重損失。當每天兩次地給藥時，於此模型中獲致類似的結果，以0.5mg/kg之劑量每天兩次下，獲致-44% T/C。
利用AXIN2 mRNA及pLRP6水平(如實例3所確定)作為關聯HN30小鼠異種移植模型中抗腫瘤活性觀察值之藥效動力學標記。在化合物A以3mg/kg下之單次劑量之後，腫瘤中之AXIN2 mRNA表現水平在給藥後第5至第10小時期間減低~60至95%及在第16小時時效應開始降低同時減低藥物濃度(圖10B)。在峰值藥物濃度(第1小時)及最大AXIN2 mRNA抑制(第10小時)之間觀測到時間延遲。另外，如圖10C所顯示，HN30腫瘤中之pLRP6水平實質上以時間依賴性方式減低。在給藥後第7至10小時達成最大效應及到第24小時pLRP6水平大致恢復為正常值。化合物A之治療亦導致LEF1之84%下調及NKD1之67%下調。該藥物動力學(PK)、PD、及效力關係說明持續路徑抑制對於誘導此HN30異種移植模型中之腫瘤消退並非必需的，此可提供腫瘤與正常組織之間之重要差異因子以達成治療窗。結論是Wnt抑制劑(特別是化合物A)可用於治療頭部及頸部癌症。
實例5：藉由評估Notch1、Notch2、Notch3、LEF1、NKD1、SFRP2、FRZB、SFRP4及DKK2之基因表現預測人原發性腫瘤小鼠異種移植模型及人原發性腫瘤之Wnt抑制劑敏感性：
為了研究藉由化合物A活體內處理所調節之其他Wnt相關基因，TaqMan® GeneCard分析顯示包括LEF1及NKD1之若干種其他已知Wnt靶基因、以及包括Wnt3及Wnt9B之Wnt配體之下調。
為此，於PTC-200帕耳帖熱循環儀(MJ Research)及ABI PRISM 7900HT序列偵測系統(Applied Biosystems)上進行兩步驟TaqMan RT-PCR分析。首先，使用高容量cDNA Archive套組(Applied Biosystems)依照製造商指令合成cDNA。簡言之，藉由使高容量cDNA Archive套組之非酵素催化、酵素催化組分與單離的RNA樣本混合，準備RT反應，接著使用熱循環儀進行25℃下10min及37℃下120min之串接式培養。其次，使用TaqMan通用型主要(Universal Master)混合物 (Applied Biosystems)及AXIN2及GAPDH探針(Applied Biosystems)依照製造商指令進行TaqMan分析。簡言之，藉由使通用型主要混合物、TaqMan探針及合成cDNA樣本混合，準備PCR反應。PCR循環如下：95℃維持10min及40個95℃維持15秒及60℃維持1min的串接式培養循環。將靶基因之mRNA表現水平標準化至GAPDH mRNA水平及利用SDS 2.0軟體(Applied Biosystems)分析資料以計算相對RNA量。使用Prism進行曲線擬合。
就GeneCard分析而言，依照製造商指令使用96孔TaqMan基因卡片陣列。基因卡片檢測係於ABI 7900HT即時PCR系統(Applied Biosystems)上運行及利用△△Ct方法分析。
當比較利用GeneCard分析之HN30腫瘤及正常人口咽組織之間基因表現模式時，包括Wnt3、7A、10A及11之Wnt配體實質上於HN30腫瘤中過度表現而已知的諸如SFRP2、FRZB、SFRP4及DKK2之Wnt抑制基因實質上下調，此與Wnt訊號傳導為致病靶之假設一致。此資料指示假如發現SFRP2、FRZB、SFRP4或DKK2基因表現相較於對照組差異性下調，則細胞株、癌症樣本或患者更有可能會罹患對Wnt抑制劑敏感之癌症類型。具有相較於對照組差異性下調之SFRP2、FRZB、SFRP4或DKK2基因表現之癌症樣本或癌症相比展現可與對照組相當的基因表現之癌症樣本或癌症更有可能會對Wnt抑制劑敏感。此見解可應用於患者分級方法，其中選擇將最有可能回應於Wnt抑制劑之治療之患者及進行治療。
針對40種HNSCC細胞株(25種回應性細胞株及15種非回應性細胞株)進行外顯子定序，以進一步理解回應於化合物A治療之細胞(包括HN30細胞)之作用機制。TP53、CDKN2A、Notch1/2/3、PTEN、HRAS及PIK3CA屬於在該組細胞株中突變之前幾種致癌基因或腫瘤抑制基因(圖11)。
全外顯子組捕獲庫製備及定序：使用Roche NimbleGen V2(44.1Mbp)外顯子組富集套組(Otogenetics)進行外顯子組捕獲庫建構。於具有50×平均覆蓋之Illumina基因組分析儀IIx平臺(Otogenetics)上進行所捕獲外顯子之配對末端定序(2×100bp)。
序列資料處理：藉由布羅德研究所(Broad Institute)基因組圖譜工具套組(Genome Atlas Tool Kit)(GATK)所推薦的標準管線處理定序資料：
使用Burrows-Wheeler比對器0.5.9版(http：//bio-bwa.sourceforge.net)，將具有各樣本之讀取值及品質得分值之原始定序fastq文檔與NCBI人參考基因組GRCh37比對。對於各個樣本，產生具有其與參考基因組之比對的單一分選二進制比對圖譜(Binary Alignment Map)(BAM)文檔。
利用「與已知的插入缺失(indel)之樣本水平再比對及再校準(sample level realignment with known indels and recalibration)」方法，進一步清晰化來自比對之BAM文檔。(http：//www.broadinstitute.org/gatk/guide)
GATK統一基因型用於各次再校準及清晰化BAM文檔以產生SNP、多核苷酸多態性(MNP)、及插入缺失。在各樣本之變異調用之後，將其歸併為多樣本SNP及插入缺失調用。基於SNP及插入缺失調用形成獨立的變異調用格式(Variant Call Format)(VCF)文檔。
接著依SnpEff(v2.1b http：//snpeff.sourceforge.net/)處理所有變異調用以預測其對對應蛋白質產物之功能性影響，及藉由GATK變異標註器達成其他標註。包括dbSNP v.135、COSMIC v.58、及ESP5400之各種公開可取得之資料庫用於圖譜分析針對於已知變異之基因組改變。
變異之分析：為減少定序異常，利用各種過濾，包括變異品質 <30，圖譜分析品質<30，變異置信度<2，及標準化Phred規模的概率>80。相較於參考外顯子組，總計有18349個基因出現基因組改變。所有40種HNSCC細胞株中基因組改變之總數為約169k。然而，其中大多數(89%)為標註於上述公開資料庫中之已知變異。在該等新穎變異當中，約一半(總數的6%)的變異導致蛋白質序列改變，諸如突變、截短、插入、及缺失。請注意所有的定序係基於其中不可取得匹配之正常之細胞株而言的。因此，本文所述之某些新穎變異潛在性地可為SNP。在細胞株繼代期間獲得之突變亦有可能及無法與其等在癌症形成及進展期間獲得者區分開來。UM-SCC株各自具有獨特的基因型及係以通常少於自初代培養之100個繼代之最低可能繼代數使用。
依SnpEff評估基因組改變之功能性影響。高度影響突變包括框移、剪接位點突變、起始密碼子損失、終止密碼子獲得、及終止密碼子損失。中等影響突變包括框內插入或缺失及非同義突變。藉由無論突變係標註於具有SNP對偶基因來源(SAO)<2之dbSNP或於ESP5400進入中而非標註於COSMIC中來確定潛在生殖系突變。
為研究功能突變損失與化合物A藥理學功能之間之關聯性，吾人將所有可能的功能損失(LoF)變異聚集為一個類別，此乃因已知基因之LoF突變可具有跨寬範圍之蛋白質序列分佈之突變。突變包括高度影響突變，諸如終止密碼子增加、框移、起始密碼子損失、及剪接位點突變。吾人亦要求野生型及突變對偶基因之組合序列深度為至少5，以移除極低覆蓋變異。吾人使用來自經定序之40種HNSCC細胞株之變異調用，評估LoF變異對各基因之化合物A PD回應之富集效應。富集因子係經定義為以下(即，優勢率)，E(LoF)=(P(回應性|突變)[1-P(回應性)])/(P(回應性)[1-P(回應性|突變)])
其中P(回應性|突變)表示出現LoF突變之基因回應於化合物A治療 之機率，及P(回應性)表示偶然回應於化合物A治療之機率。
實例6：Notch1為用於Wnt抑制劑之治療之最具預測性之生物標記
基於E>2及LoF出現次數大於3來選擇候選基因。在前幾種候選基因當中，Notch1 LoF具有最高富集因子中之一種，超過隨機選擇3倍富集。藉由定序癌細胞株之cDNA或基因組DNA(GeneWiz)來確認Notch1突變/變異。使用序列器(Sequencher)(GeneCodes)分析序列。
由該資料可得出的結論是與基因突變狀態及回應於化合物A之細胞株路徑抑制關聯之最為顯著的特徵之一為回應性細胞株中之Notch1功能損失(LoF)突變。
如圖13A及13B所顯示，已在回應性細胞株當中識別出五種框移/無意義突變，其中僅一種Notch1無意義突變屬於非回應性細胞株。令人關注的是，具有Notch1突變之所有細胞出現至少一種會影響Notch1之N端之突變對偶基因。此點與Notch1之N端係其功能所需之見解一致，其中N端EGF重複造成配體-受體相互作用17，使得該區域中之突變更有可能成為LoF突變。為進一步表徵於HN30細胞中識別出的誤義突變(諸如Notch1 C478F)之功能性結果，藉由野生型或C478F突變體之過度表現進行Notch報導子基因檢測(圖13C)。C478F突變位於Notch1之胞外域中，據推測此點係Notch受體及配體相互作用的關鍵所在。實際上，在Notch配體DLL1的存在下，突變體C478F Notch1之活性於該Notch報導子基因檢測中消失(圖13C)。
此均可於支持諸如(例如)化合物A之PORCN抑制劑之臨床治療中提供指導給患者選擇。
在HNSCC細胞株SNU1076中識別出DTX3L(Deltex 3樣，亦稱為BBAP，B-淋巴瘤-及BAL-相關蛋白)雜合子無意義突變。DTX3L為E3泛素連接酶。其於哺乳動物Notch路徑中之細胞功能尚不明確，但其 果蠅同系物Deltex為果蠅中之Notch訊號傳導之正調節物。於小鼠SNU1076異種移植模型中，化合物A於5mg/kg之劑量下在治療14天後可明顯地抑制腫瘤生長(T/C：25%)(圖14A)。除此之外，化合物A實質上抑制Wnt路徑，此點由AXIN2減少70%指示(圖14B)。DTX3L之損失可提供一種使Notch訊號傳導路徑失活及隨後活化Wnt訊號傳導的替代機制。
實例7：作為Wnt抑制劑治療之預測性標記之HRAS及FAT1。
由本發明外顯子組定序及細胞株特徵分析努力，吾人可觀察到化合物A回應者之富集於FAT1突變體頭部及頸部癌細胞株中(圖15)。此外，由本發明分析可知，出現HRAS突變之5種細胞株中有4種對化合物A回應(圖16)。
實例8：由基因組資料及臨床涵義預測細胞株對Wnt抑制劑之化學敏感性。
如由外顯子組定序所確定，Notch1基因表現(例如，突變狀態)為Wnt抑制劑敏感性之最有力指示之一，及因此可用作被視為是用於選擇回應於諸如(例如)化合物A之Wnt抑制劑之癌症患者的分級生物標記。癌症相關細胞株之板中Notch1 LoF突變與Wnt抑制劑之化學敏感性之關聯性證實Notch1於預測患者對Wnt抑制劑敏感性上係有價值的。Notch1 LoF突變係用於基於40種頭頸癌細胞株(如上所述)之生物資訊分析來預測路徑抑制回應。除Notch1外及基於腫瘤模型，SFRP2、FRZB、SFRP4及DKK2亦與Wnt抑制劑之效力相關聯。在選自本文所述者之至少兩種生物標記之組用於預測敏感性之情況下，預期甚至更佳的預測能力。借助於生物資訊分析，識別出可用於患者分級之另一組有用的生物標記：FAM58A、FLJ43860、NOTCH1、CDKN2A、OR7G3、CCDC168、ZNF527、HRAS及FAT1。因為HNSCC患者中Notch1 LoF突變之發生率相對較高，故Notch1基因表現 尤其適於選擇HNSCC患者。癌細胞株之板中NOTCH1 LoF突變與Wnt抑制劑之化學敏感性之關聯性證實NOTCH1具有超過隨機選擇3倍富集之預測值。其他上述生物標記亦與對Wnt抑制劑敏感之臨床前模型相關聯。作為臨床場景之推斷，基於上述生物標記之患者選擇將增加Wnt抑制劑治療時臨床回應之可能性。
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Claims (16)

  1. 一種藉由使用名為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺或其醫藥上可接受之鹽的Wnt抑制劑確定癌細胞對Wnt抑制劑之敏感性的活體外方法，該方法包括：a)使癌細胞與該前述Wnt抑制劑接觸；b)測量與Wnt抑制劑接觸之該細胞中至少一種其為Notch 1的生物標記之差異性基因表現；c)將該至少一種生物標記之差異性基因表現與未經處理或經安慰劑處理之對照組細胞之生物標記之基因表現進行比較；d)將Notch 1之表現相較於未經處理或經安慰劑處理之對照組細胞之Notch 1之表現的減少與該癌細胞對Wnt抑制劑之敏感性相互關聯。
  2. 如請求項1之方法，其中該Notch1具有突變在胞外域中。
  3. 如請求項1之方法，其中該至少一種生物標記之差異性基因表現與對照組樣本之基因表現之比較指示一種功能性Wnt路徑。
  4. 如請求項1之方法，其中該癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌。
  5. 如請求項1之方法，其中該癌症係經Wnt抑制劑治療及相較於對Wnt抑制劑敏感之癌症樣本中之表現顯示Axin2、LEF1及/或NKD1之差異性表現。
  6. 如請求項1之方法，其中與至少一種Wnt抑制劑接觸之癌細胞之IC50小於1μM。
  7. 一種名為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺或其醫藥上可接受之鹽的Wnt抑制劑之用途，其用於製備治療患者之癌症的藥物，其中該患者係基於以 下選擇：a)測量從該患者獲得的癌症樣本中至少一種其為Notch 1的生物標記之差異性基因表現；b)將該至少一種生物標記之差異性基因表現與對照組樣本中該生物標記之基因表現進行比較；c)基於當與對照組比較時該至少一種生物標記降低的表現、或降低的活性或功能，確定該患者對Wnt抑制劑之敏感性；及d)選擇對Wnt抑制劑敏感之患者；且該前述Wnt抑制劑係投與至鑑定為敏感或可能會對該Wnt抑制劑之治療有反應的患者。
  8. 一種名為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺或其醫藥上可接受之鹽的Wnt抑制劑之用途，其用於製備治療相較於對照組基因表現具有至少一種其為Notch 1的生物標記之差異性基因表現之患者之癌症的藥物，其中當與對照組比較時該其為Notch 1的至少一種生物標記的表現降低、或其活性或功能降低時，則該差異性基因表現係與對Wnt抑制劑敏感之該患者相關聯。
  9. 如請求項7或8之用途，其中該Notch1在胞外域中具有突變。
  10. 如請求項7或8之用途，其中該癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌。
  11. 一種包含名為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺或其醫藥上可接受之鹽的Wnt抑制劑之醫藥組合物的用途，其用於製備治療患者之癌症的藥物，其中該患者係基於相較於正常對照組細胞樣本從該患者獲得的癌細胞樣本中顯示至少一種其為Notch 1的生物標記之基因表現來選擇，其中當與對照組比較時該其為Notch 1的至少一種生物標記的表現降低、或其活性或功能降低時，則該差異性基因表現係 與對該Wnt抑制劑敏感之患者相關聯。
  12. 一種包含名為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺或其醫藥上可接受之鹽的Wnt抑制劑之醫藥組合物的用途，其用於製備治療相較於對照組基因表現顯示至少一種其為Notch 1的生物標記之差異性基因表現的患者之癌症的藥物，其中當與對照組比較時該其為Notch 1的至少一種生物標記的表現降低、或其活性或功能降低時，則該差異性基因表現係與對該Wnt抑制劑敏感之患者相關聯。
  13. 如請求項11或12之用途，其中該Notch1具有突變在胞外域中。
  14. 如請求項11或12之用途，其中該癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌。
  15. 一種名為2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙醯胺或其醫藥上可接受之鹽的Wnt抑制劑用於製備治療頭部及頸部鱗狀細胞癌之藥物的用途，其中該Wnt抑制劑係投與給相較於對照組基因表現顯示至少一種其為Notch 1的生物標記之差異性基因表現之癌症患者，其中該差異性基因表現係與對Wnt抑制劑敏感之患者相關聯。
  16. 如請求項7或8之用途，其中該藥物選擇性地投與給已確定對該Wnt抑制劑敏感之患者，或基於對該Wnt抑制劑不敏感之患者，除了該Wnt抑制劑以外之藥物係選擇性地投與給該患者。
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