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Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden, Nucleosiden und deren
Gemischen durch Hydrolyse von Ribonucleinsäuren, Oligoribonucleotiden oder deren
Gemischen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden
und Nucleosiden oder deren Gemischen auf biologischem Wege.
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Nucleinsäuren, die im lebenden Körper als nichtproteinische Komponenten
in Nucleoproteinen weit verbreitet sind und in enger Beziehung zu den Erscheinungen
des Lebens stehen, sind wichtige Bestandteile des lebenden Körpers und aus verschiedenen
Nucleotiden aufgebaut.
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Von diesen Nucleotiden sind die 5'-Nucleotide wichtig als wertvolle
Reagenzien für biologische Forschungen. Ferner werden sie als Würze für Nahrungsmittel,
als Heilmittel oder deren Zwischenprodukte verwendet.
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Trotz der weiten Verbreitung von 5'-Nucleotiden in natürlichen Quellen
als Komponenten von Ribonucleinsäuren wurden 5'-Nucleotide als schwer in reiner
Form darzustellende Verbindungen angesehen, da bisher kein geeignetes Verfahren
zur Hydrolyse von Ribonucleinsäuren zu 5'-Nucleotiden gefunden wurde. Ihre Verwendung
war daher bis heute sehr beschränkt.
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Es sind sowohl chemische als auch biochemische Verfahren zur Hydrolyse
von Ribonueleinsäuren bekannt. Beim chemischen Verfahren werden jedoch keine 5'-Nucleotide,
sondern 2'- und/oder 3'-Nucleotide gebildet. In einem der bekannten biochemischen
Verfahren werden Ribonucleinsäuren oder Produkte, die durch Hydrolyse der Substanz
mit Ribonuclease der Bauchspeicheldrüse erhalten wurden, mit Phosphodiesterase aus
Schlangengiften oder aus einer Schleimhaut des Rinderdünndarms weiter hydrolysiert.
Dieses Verfahren hat jedoch die Nachteile einer niedrigen Ausbeute an 5'-Nucleotiden
und der Schwierigkeit, die benötigten Enzyme zu beschaffen. Daher eignet sich dieses
Verfahren kaum für eine industrielle Herstellung von 5'-Nucleotiden.
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Auf der Suche nach einer Ribonuclease, die in der Lage ist, Ribonucleinsäuren
oder Oligoribonucleotide zwecks Herstellung von 5'-Nucleotiden oder von Nucleosiden
im industriellen Maßstab zu hydrolysieren, wurde folgendes festgestellt: Erstens
Verschiedene Mikroorganismen erzeugen ein Enzym, das für den vorgesehenen Zweck
geeignet ist; zweitens: 5'-Nucleotide oder Nucleoside können durch Hydrolyse von
Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotiden unter Verwendung dieser Mikroorganismen
selbst oder der durch sie gebildeten Enzyme hergestellt werden. Auf der Grundlage
dieser Erkenntnisse wurde das im industriellen Maßstab durchführbare Verfahren gemäß
der Erfindung entwickelt. In der Beschreibung soll der Ausdruck »Ribonuclease« eine
Enzymmischung bezeichnen, durch die Ribonucleinsäure in ihre Komponenten hydrolysiert
wird. Es handelt sich dabei um Ribonuclease, 5'-Phosphodiesterase, Adenylsäure,
Deaminase, Phosphomonoesterase usw.
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Als Ausgangsmaterial für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignete
Ribonucleinsäuren können aus natürlichen Quellen, wie Hefe und tierischen Geweben,
gewonnen werden. Ebenso können durch Teilhydrolyse von Ribonucleinsäuren erhaltene
Oligoribonucleotide als Ausgangsstoffe eingesetzt werden. Geeignet sind ferner Substanzen,
wie wäßrige Hefeextrakte, die unraffinierte Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotide
enthalten. Da sie bekanntlich Adenylsäure, Cytidylsäure, Uridylsäure, Guanylsäure
usw. enthalten, stellt das Produkt gemäß der Erfindung ein Gemisch von 5'-Mononucleotiden
oder ein durch Abtrennung von Phosphorsäure daraus gebildetes Gemisch von Nucleosiden
dar.
Diese Gemische können natürlich als solche für die eingangs
genannten Zwecke verwendet werden, jedoch kann gegebenenfalls jede Komponente nach
an sich bekannten Verfahren abgetrennt werden.
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Für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen sich die verschiedensten
Arten von Mikroorganismen oder die von ihnen erzeugten Enzyme. Diese Mikroorganismen
gehören zu Klassen, wie Schizomyceten, Fungi imperfecti usw. Hiervon sind die zu
genas Fusarium, genas Verticillium, genas Gliomastix, genas Helminthosporium, genas
Bacillus, genas Streptomyces usw. gehörenden Mikroorganismen besonders geeignet.
Als Beispiele für die im Verfahren gemäß der Erfindung verwendbaren Mikroorganismen
seien folgende genannt: Fusarium roseum Link.
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Fusarium solani (Mart.) Appel et Wollenweber. Verticillium niveostratosum
Lindau. Gliomastix convoluta (Harz.) Mason var. felina (Marchal) Mason.
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Helminthosporium sigmoideum var. irregulare Cralley et Tullis.
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Bacillus subtilis Cohn einend. Prazmowski. Bacillus brevis Migula
einend. Ford. Streptomyces griseus (Krainsky einend. Waksman et a1) Waksman et a1.
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Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici.
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Streptomyces fiavus (Krainsky) Waksman et Henrici.
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Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.
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Streptomyces ruber (Krainsky) Waksman et Henrici.
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Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici.
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Streptomyces pupurescens Lindenbeim. Streptomyces albogriseolus Benedict
et a1. Streptomyces olivochromogenus (Bergey et a1.) Waksman et Henrici.
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Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.
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Strept,imyces gougeroti (Dache) Waksman et T gznr s;'; S«eptomyces
griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici. C:::-=:i-ne von -ihen :cie@:eli `Jikroorganismen
befir lex_ sich. irc ins«tute für Fermentation, Osaka, ui-.d sind dort erhältlich.
Ferner sind sie leicht von den T-,akt-vi ieral~altur-Sammeistellen in verschiedenen
Ländern beziehbar, z. B. vom American Type Culture Collection, Washington, D. C.,
USA., Northern Utilization Research Branch of United States Department of Agriculture,
Peoria, I11., USA., und vom Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland.
Außer den vorstehend als Beispiel aufgeführten Mikroorganismen kann jeder Mikroorganismus,
der Ribonuclease erzeugt, für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden.
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Im Verfahren gemäß der Erfindung werden die oben als Beispiel genannten
Mikroorganismen oder die von ihnen erzeugte Ribonuclease einer Reaktion mit Ribonucleinsäuren
oder mit Oligoribonucleotiden unterworfen. Bei Verwendung der Mikroorganismen wird
die Hydrolyse der Ribonucleinsäuren oder der Oligoribonucleotide durch die von den
Mikroorganismen erzeugte Ribonuclease bewirkt. Daher kann die Erfindung als Verfahren
zur Hydrolyse von Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotiden zu 5'-Nucleotiden
oder Nucleosiden durch Ribonucleasen der Mikroorganismen angesehen werden.
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Wie bereits erwähnt, können diese Ribonueleasen in Form einer Komponente
im lebenden Mycel oder von Kulturfiltraten der Mikroorganismen, einer Suspension
ihrer Mikrobialzellen, von extrahierten Enzymen usw. verwendet werden. Die extrahierten
Enzyme können in roher oder reiner Form gebraucht werden. Um die Ribonucleasen in
den lebenden Zellen der Mikroorganismen mit den Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotiden
in Berührung zu bringen, ist es zweckmäßig, die Mikroorganismen auf einem Nährmedium,
das das Ausgangsmaterial enthält, zu inkubieren oder das Ausgangsmaterial nachher
in die Kultur der Mikroorganismen zu geben. Die Inkubation in den obigen Fällen
kann in einem flüssigen oder festen Medium durchgeführt werden, wobei das Medium
unter Belüftung gerührt oder auch nicht gerührt wird. Das einfachste und vorteilhafteste
Verfahren ist jedoch die sogenannte submerse Kultur mit Belüftung und Rührung.
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Wird das Verfahren gemäß der Erfindung nach einer der obigen Kulturmethoden
durchgeführt, wird das für die verwendeten Mikroorganismen geeignetste Medium ausgewählt,
jedoch kann jedes für die Inkubation gewöhnlicher Mikroorganismen gebrauchte Kulturmedium
verwendet werden. So können Stärke, Dextrin, Saccharose, Lactose, Maltose, Glycerin
usw. als Kohlenstoffquelle und Pepton, Fleischextrakt, Hefe oder Hefeextrakt, Sojabohnenpulver,
Maiskeimextrakt, Gluten, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate usw. als Stickstoffquellen
gebraucht werden. Gegebenenfalls können auch anorganische Salze von Metallen, wie
Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, und Spuren von Kupfer-, Eisen-, Mangan-, Kobalt-
usw. Salzen zugesetzt werden. Die Inkubation kann auch in einem Medium durchgeführt
werden, das ein Spurenelement usw. enthält. In einigen Fällen können Ribonucleinsäure
oder Oligoribonucleotide selbst als Nährstoff verwendet werden.
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Die Reaktion geht durch Berührung zwischen der Ribonucleinsäure oder
dem Oligoribonucleotid und den Mikroorganismen oder ihrem Enzymsystem vonstatten.
Werden lebende Zellen der Mikroorganismen verwendet, kann Ribonucleinsäure oder
Oligoribonucleotid dem Medium in einer Phase der Inkubation zugesetzt werden, oder
die Mikroorganismen können in einem Medium, das das Ausgangsmaterial enthält, inkubiert
werden. Bei Verwendung des Enzymsystems des Mikroorganismus kann das Kulturfiltrat
oder die Zellensuspension des Mikroorganismus oder das extrahierte Enzym mit oder
ohne Verwendung eines geeigneten Mediums in Berührung mit dem Ausgangsmaterial gebracht
werden. Wenn das Kulturfiltrat oder die Zellensuspension verwendet wird, ist in
den meisten Fällen ein Medium nicht unbedingt erforderlich.
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Als Medium - wenn ein solches gebraucht wird - eignet sich Wasser
oder eine wäßrige Lösung, beispielsweise eine wäßrige Lösung eines Salzes, z. B.
eine. Pufferlösung. Die Konzentration des Ausgangsmaterials im Medium einschließlich
des Kulturfiltrats oder der Zellensuspension beträgt zweckmäßig mehr als einige
Prozent.
Die Reaktion wird bei einem pH-Wert durchgeführt, der für
die Entwicklung der enzymatischen Aktivität am geeignetsten ist, selbst wenn das
extrahierte Enzym verwendet wird und selbstverständlich auch für den Fall der Verwendung
lebender Zellen. Dieser pH-Wert liegt etwa im neutralen Bereich, z. B. über 4 und
unter 10. Die Reaktionstemperatur darf die enzymatische Aktivität nicht zu stark
schädigen und das Enzymsystem nicht zerstören. Die Temperatur ist je nach der Art
der verwendeten Mikroorganismen oder den anderen Bedingungen mehr oder weniger veränderlich
und liegt gewöhnlich im Bereich zwischen 30 und 45° C. Die Reaktionszeit ist ebenfalls
verschieden und hängt von Bedingungen, wie Art der Mikroorganismen, Enzymsysteme
oder Medien, der Konzentration des Materials im Medium, der Reaktionstemperatur
usw., ab, jedoch muß die Reaktion so lange durchgeführt werden, bis die gewünschte
Verbindung in höchster Ausbeute gebildet ist. Die Reaktionsbedingungen werden vorzugsweise
so eingestellt, daß 15 bis 40 Stunden erforderlich sind, um das gewünschte Produkt
in höchster Ausbeute zu erzeugen.
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Dem Reaktionssystem kann ein Beschleuniger zugesetzt werden, um die
Aktivität der Enzyme zu steigern. Hierzu eignen sich beispielsweise Salze von divalenten
Metallen, wie Magnesium.
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In den meisten Fällen liegt jedoch Phosphomonoesterase im Enzymsystem
der Mikroorganismen vor. Daher hört die Reaktion nicht beim 5'-Nucleotid auf, sondern
geht weiter bis zu Nucleosiden. In einem solchen Fall kann als Produkt ein Gemisch
aus Nucleosiden, wie Adenosin, Guanosin, Citydin, Uridin, Inosin, Xanthosin usw.,
oder von daraus abgeleiteten Desoxynucleosiden gebildet werden.
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Werden die 5'-Nucleotide allein gewünscht, muß die Phosphomonoesterase
durch Reinigung aus dem Enzymsystem entfernt oder die Wirkung der Phosphomonoesterase
auf andere Weise gehemmt werden. Um die Phosphomonoesterase unwirksam zu machen,
kann ein Phosphomonoesterase-Inhibitor dem Enzymsystem zugesetzt werden. Hierzu
eignen sich beispielsweise Phosphate, Arsenate, Cyanate, Aminosäuren, wie Cystein-
und Glutaminsäure, Äthylendiamintetraessigsäure, Metallionen, wie Zink- und Cupriionen.
In einem gewissen Enzymsystem liegt Deaminase gleichzeitig mit der Ribonuclease
vor. In einem solchen Fall können deaminierte Verbindungen das Produkt verunreinigen.
Eine solche Reaktion kann jedoch mit Vorteil für die Gewinnung von Deaminierungsprodukten,
wie Inosinsäure, ausgenutzt werden.
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Ist die Phosphomonoesterase-Aktivität des Enzymsystems sehr hoch,
wird im Verfahren gemäß der Erfindung bei Verwendung eines Phosphomonoesterase-Inhibitors
ein hauptsächlich aus 5'-Nucleotiden bestehendes Gemisch gebildet, während ohne
Zusatz dieses Inhibitors ein hauptsächlich aus Nucleosiden bestehendes Gemisch entsteht.
In beiden Fällen ist gewöhnlich eine gewisse Menge von Oligonucleotiden mit dem
gewünschten Produkt vermischt. Selbst bei Verwendung eines Phosphomonoesterase-Inhibitors
läßt es sich kaum vermeiden, daß Nucleoside mit dem Produkt gemischt sind. Wie bereits
erwähnt, besteht somit stark die Gefahr der Vermischung von Deaminoverbindungen
mit dem Produkt. Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich. daß das Produkt
in Form eines sehr komplizierten Gemisches von verschiedenen Arten von Verbindungen
anfallen kann. Es ist daher zweckmäßig, die Reaktion zu dem Zeitpunkt zu beenden,
zu dem die Konzentration der gewünschten Verbindung im Reaktionsgemisch am höchsten
ist. Zu diesem Zweck wird der Fortgang der Hydrolyse durch Messung der Konzentration
verfolgt. Die Messung der Konzentration kann nach bekannten Methoden, z. B. durch
einen enzymatischen Prozeß, Papierelektrophorese und Papierchromatographie erfolgen.
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Aus dem so gebildeten Gemisch, das hauptsächlich 5'-Nucleotide und/oder
Nucleoside enthält, können die gewünschten Substanzen durch Ausnutzung der Unterschiede
in den physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen den Verunreinigungen und den
gewünschten Substanzen isoliert bzw. als Gemisch erhalten werden. Zu den für diesen
Zweck ausnutzbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften gehören Unterschiede in
der Löslichkeit, dem Verteilungsfaktor zwischen zwei Lösungsmitteln, der Absorbierbarkeit,
Dialysierbarkeit, Fällbarkeit usw. Zu dem gleichen Zweck kann auch ein Fällungszusatz
zugegeben werden. Die 5'-Nucleotide werden zweckmäßig in Form ihrer organischen
oder anorganischen Salze, z. B. als Salze von Barium, Calcium, Kalium, Ammonium,
Aminosäuren, Cyclohexylamin und Brucin, gesammelt.
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Die Abtrennung und Reinigung jeder Komponente des Gemisches kann nach
an sich bekannten Verfahren, z. B. durch Chromatographie, vorgenommen werden. Ein
Beispiel hierfür ist nachstehend beschrieben.
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Zunächst werden die unlöslichen Verunreinigungen aus dem Gemisch abfiltriert
und dann die aktiven Substanzen an Aktivkohle adsorbiert. Die adsobierten Substanzen
werden mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. verdünnter Salzsäure, verdünntem
Ammoniak öder Alkohol, eluiert. Dann wird die Ultraviolettabsorption jeder Fraktion
gemessen und jede Fraktion, die eine Komponente enthält, aufgefangen und eingeengt.
Wird das Produkt als Bariumsalz gewonnen, läßt sich die anschließende Reinigung
einfacher durchführen.
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Das vorstehend beschriebene Verfahren ist ein Beispiel für die Chromatographie
in einer Aktivkohlesäule. Auch andere Verfahren, z. B. Ionenaustausch-Chromatographie
an Ionenaustauschern oder Gegenstromverteilung, können für diesen Zweck angewendet
werden.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele
erläutert. Die angegebenen Temperaturen sind sämtlich unkorrigiert, und die Prozentsätze
sind auf das Gewicht bezogen. Die benutzten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
AMP = Adenosinmonophosphat; GMP = Guanosinmonophosphat; UMP = Uridinmonophosphat;
CMP = Cytidinmonophosphat und IMP = Inosinmonophosphat. Die als Ausgangsmaterial
in den Beispielen verwendete Nucleinsäure wurde, falls nicht anders angegeben, nach
einem bekannten Verfahren aus Hefe hergestellt. Die Namen der Bakterienkultur-Sammelstellen
wurden wie folgt abgekürzt IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan.
| NRRL = Northern Utilization Research Branch |
| of US. Department of Agriculture, |
| Peoria, 111., USA. |
| ATCC = American Type Culture Collection, |
| Washington, D. C., USA. |
| CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, |
| Baarn, Holland. |
| Beispiel 1 |
Ein Stamm Streptomyces albogriseolus Benedict, Shotwell et Pridham, wird 24 Stunden
bei 28-C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung
inkubiert: 5,0o/0 lösliche Stärke,
3,0% Maiskeimextrakt, 0,10/0 Ammoniumsulfat,
0,05o/0 wäßriges Magnesiumsulfat, 0,50% Pepton und 0,2% Calciumcarbonat. Auf 1001
des gleichen Mediums in einem Behälter werden 500 cm3 der' vorstehend genannten
Kultur eingesät. Anschließend wird die Inkubation 30Stunden bei 28° C durchgeführt.
Eine Suspension von 1 kg Ribonucleinsäure in 2001 Wasser wird mit einer Natriumhydroxydlösung
auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt. Der Lösung werden 1001 des Kulturfiltrats
der obigen Kultur zugegeben. Ferner wird Natriumarsenat in solcher. Menge zugesetzt,
daß seine Konzentration in der Lösung 10 Millimol je Liter beträgt. Anschließend
wird der pH-Wert auf 8,0 eingestellt. Nach Zugabe von 500 g Toluol für antiseptische
Zwecke wird die Hydrolyse 16 Stunden bei 37° C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei
7,5 bis 8 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird mit einem Filtermittel filtriert
und der pH-Wert des Filtrats auf 2,5 gesenkt. Nach Adsorption des im Filtrat enthaltenen
Produkts an Aktivkohle wild mit 1,5%igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Nucleotide
im Eluat werden mit Hilfe eines Ionenaustauschharzes abgetrennt und die Fraktion,
die 5'-AMP enthält, aufgefangen. Die 5'-AMP enthaltende Fraktion wird mit Natriumnitrit
deaminiert, wobei
100 g 5'-IMP erhalten werden. Von den anderen Fraktionen
wurde 5'-GMP, 5'-UMP und 5'-CMP in Ausbeuten von 55, 70 bzw. 78 g gewonnen.
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Der Stamm Streptomyces albogriseolus ist vom NRRL unter der Nummer
B-1305 erhältlich. Beispiel 2 Ein Stamm Streptomyces aureus (Waksman et Curtis)
Waksman et Henrici wird 24 Stunden unter Schütteln bei einer Temperatur von 28°
C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung
inkubiert: 5,0010 lösliche Stärke, 1,00% Fleischextrakt, 0,05010 wäßriges
Magnesiumsulfat und 0,5010 Natriumchlorid. Auf 1001 eines Mediums mit der
gleichen Zusammensetzung werden 500 cm3 der vorstehend genannten Kultur eingesät.
Die Inkubation wird 45 Stunden bei 28° C in einem Behälter durchgeführt.
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Einer Suspension von 1 kg Ribonucleinsäure in 2001 Wasser werden 1001
des Kulturfiltrats der vorstehend genannten Kultur zugesetzt. Anschließend wird
der.pH-Wert des Gemisches mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf 7,8 eingestellt
und Natriumarsenat in einer Menge zugegeben, daß seine Konzentration im Gemisch
10 Mzllimol je Liter beträgt. Nach Einstellung des pH-Wertes des Gemisches auf 8,0
werden 500 g Toluol für antiseptische Zwecke zugesetzt. Dann wird die Hydrolyse
20 Stunden bei 37° C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird.
Das Reaktionsgemisch wird mit einem Filtermittel filtriert und der pH-Wert des Filtrats
auf 3,0 gesenkt. Nach Adsorption des Produkts im Filtrat an Aktivkohle wird es mit
1,5o/0igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Aus dem Eluat werden mit Hilfe eines Ionenaustauschharzes
5'-IMP, 5'-UMP, 5'-GMP und 5'-CMP in einer Ausbeute von 120, 75, 90 bzw. 95 g abgetrennt.
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Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces aureus wird als
Ogata-Stamm Nr.1031 bezeichnet und ist vom IFO unter der Nummer IFO-3303 und vom
ATCC unter der Eintragungs-Nummer ATCC-13357 erhältlich. Beispiel 3 Ein Stamm Streptomyces
viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici wird 24 Stunden bei 28°C in einem
wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert:
3,0o% lösliche Stärke, 1,0% Pepton, 0,50,1o Fleischextrakt, 0,05% wäßriges Magnesiumsulfat,
0,1 % Kaliumphosphit. Auf 1001 eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung werden
500 cm3 der vorstehend genannten Kultur eingesät. Die Inkubation wird 60 Stunden
bei 28°C in einem Behälter durchgeführt.
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Einer Suspension von 1 kg Ribonucleinsäure in 2001 Wasser wird zur
Einstellung des pH-Wertes des Gemisches auf 7,8 eine wäßrigeNatriumhydroxydlösung
zugegeben. Dann werden 1001 des Kulturfiltrats der vorstehend genannten Kultur zugesetzt.
Anschließend wird die Hydrolyse 30 Stunden bei einer Temperatur von 37° C durchgeführt,
wobei der pH-Wert bei 8,0 gehalten wird. Da das Kulturfiltrat Phosphomonoesterase
von hoher Aktivität enthält, wird die Ribonucleinsäure fast quantitativ zu Nucleosiden
hydrolysiert. Aus dem Hydrolysat werden 150 g Adenosin, 110 g Guanosin, 130 g Cytidin
und 140 g Uridin gewonnen.
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Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces viridochromogenes
ist von CBS erhältlich. Der Stamm wurde dieser Bakterienkultur-Sammelstelle ursprünglich
von Dr. S. A. Wa k s m a n , Rutgers University, New Brunswick, New Jersey, zugesandt.
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Beispiel 4 Ein Stamm Streptomyces Purpurescens Lindenbein wird 15
Stunden bei einer Temperatur von 28° C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert
von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert 3,00% lösliche Stärke, 1,001o Pepton,
0,5% Hefeextrakt, 0,05010 wäßriges Magnesiumsulfat, 0,05010
Calciumcarbonat
und 0,10% Natriumchlorid. 1001 des Kulturfiltrats der vorstehenden Kultur wird
I kg Ribonucleinsäure und anschließend Natriumarsenat in einer Menge zugegeben,
daß dessen Konzentration im Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann wird die
Hydrolyse 20 Stunden bei 37°C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten
wird. Aus dem Hydrolysat werden 85 g 5'-AMP, 70 g 5'-GMP, 80 g CMP und 75 g 5'-UMP
gewonnen. Aus dem Rückstand werden sowohl Nucleoside als auch Oligonucleotide gewonnen.
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Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces purpurescens
befindet sich beim IFO unter
der Eintragungsnummer IFO-3389 und
wurde ursprünglich vom NRRL unter der Nummer B-1454 über das National Institute
of Health, Bethesda, Maryland, USA., verteilt.
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Beispiel 5 Ein Stamm Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici
wird 15 Stunden bei 28'C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und
folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0% lösliche Stärke, 3,0% Maiskeimextrakt,
1,00/0 Pepton, 0,050% Ammoniumsulfat, 0,20% Calciumcarbonat und 0,20/0 Natriumchlorid.
1001 des Kulturfiltrats der vorstehenden Kultur wird 1 kg Ribonucleinsäure zugesetzt
und das Gemisch 16 Stunden bei einer Temperatur von 37° C stehengelassen. Aus dem
Hydrolysat werden 55 g 5'-AMP, 30 g 5'-GMP, 45 g 5'-CMP und 48 g 5'-UMP gewonnen.
Durch Entphosphosieren wird ein Teil des Hydrolysats als Adenosin, Guanosin, Cytidin
und Uridin erhalten.
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Der Stamm Streptomyces Coelicolor befindet sich im IFO unter der Nummer
IFO-3807 und wurde beim ATCC unter der Nummer ATCC-13358 eingetragen.
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Beispiel 6 Ein Stamm Helminthosporium sigmoideum var. irregulare Cralley
et Tullis wird 45 Stunden bei einer Temperatur von 28°C in einem wäßrigen Medium
mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0% Glucose,
1,00/0 Pepton, 1,00/0 Sojabohnenpulver, 0,0-0/0 wäßriges Magnesiumsulfat, 0,10%
Kaliumphosphit und 0,2% Natriumchlorid. Einer Suspension "on 1 kg Ribonucleinsäure
in 2001 Wasser werden 1001 des Kulturfiltrats der vorstehend genannten Kultur und
anschließend Natriumarsenat in einer Menge zugegeben, daß dessen Konzentration im
Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann wird die Hydrolyse 16 Stunden bei einer
Temperatur von 37°C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird.
Aus dem Hydrolysat wurden 70g 5'-AMP, 50g 5'-GMP, 65g 5'-UMP und 65g 5'-CMP gewonnen.
Ferner wurden aus einem Teil der Rückstände infolge Entphosphorung Adenosin, Guanosin,
Cytidin und Uridin erhalten.
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Der'in diesem Beispiel verwendete Stamm Helminthosporium sigmoidium
var. irregulare ist beim IFO unter der Nummer IFO-5273 hinterlegt urid wurde beim
ATCC unter der Eingangsnummer ATCC-13359 eingetragen. Beispiel 7 Ein Stamm Bacillus
brevis Migula emend. Ford wird in einem Behälter 60 Stunden bei einer Temperatur
von 28° C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung
inkubiert: 5,0% lösliche Stärke, 1,00% Pepton, 1,00/0 Fleischextrakt, 0,10% Kaliumphosphit
und 0,50% Natriumchlorid. Einer Lösung von 1 kg Ribonucleiiisäure in 2001 Wasser
werden 100 cm3 des Kulturfiltrats der obengenannten Kultur zugegeben. Anschließend
wird Natriumarsenat in einer solchen Menge zugesetzt, daß seine Konzentration im
Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann erfolgt Hydrolyse für 20 Stunden bei
einer Temperatur von 37° C, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird. Aus
dem Hydrolysat werden 90g 5'-AMP, 70g 5'-GMP, 80g 5'-UMP und 85 g 5'-CMP gewonnen.
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Der in diesem Beispiel verwendete Stamm des Bacillus brevis ist vom
ATCC unter der Nummer ATCC-8185 erhältlich.
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Beispiel 8 Ein Stamm des Bacillus subtilis Cohn emend. Prazmowski
wird in einem Tank 45 Stunden bei einer Temperatur von 28'C in einem wäßrigen Medium
mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0% Glukose,
l,00/0 Pepton, 1,00% Fleischextrakt, 0,10/0 Kaliumphosphit, 0,050% wäßriges Magnesiumsulfat
und 0,20/0 Natriumchlorid. In 1001 des Kulturfiltrats der vorgenannten Kultur
wird 1 kg Ribonucleinsäure gelöst und dann die Hydrolyse 16 Stunden bei einer Temperatur
von 37°C durchgeführt, wobei der pH-Wert des Gemisches bei 7,5 bis 8,0 gehalten
wird. Aus dem Hydrolysat werden 60 g 5'-AMP, 45 g 5'-GMP, 50 g 5'-UMP und 55 g 5'-CMP
gewonnen. Ferner können Adenosin, Guanosin, Uridin und Cytidin aus den Rückständen
gewonnen werden, da das Kulturfiltrat Phosphomonoesterase enthält und daher die
Hydrolyse über die 5'-Nucleotide erfolgt.
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Der in diesem Beispiel verwendete Stamm des Bacillus subtilis wurde
von Dr. C. Matsumura von IFO isoliert und bereits im Institute for Fermentation,
Osaka, und beim American Type Culture Collection, Washington, D. C., unter der Eingangsnummer
IFO-3032 bzw. ATCC-13360 hinterlegt.
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Beispiel 9 Ein Stamm Streptomyces coelicolor wird in einem Tank 15
Stunden bei einer Temperatur von 28° C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert
von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert 5,00% lösliche Stärke, 3,0% Maiskeimextrakt,
1,00% Pepton, 0,05% wäßriges Magnesiumsulfat, 0,10/0 Ammoniumsulfat, 0,20/0 Calciumcarbonat
und 0,2% Natriumchlorid.
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Einem wäßrigen Extrakt, hergestellt aus 10 kg Hefe und 1501 Wasser
bei einem pH-Wert von 7 bis 9 unter Erhitzen, werden 351 Kulturfiltrats der vorgenannten
Kultur und anschließend Natriumarsenat in solcher Menge zugegeben, daß dessen Konzentration
im Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann wird die Hydrolyse 20 Stunden bei
einer Temperatur von 37° C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten
wird. Aus dem Hydrolysat werden 110 g 5'-AMP, 70 g 5'-GMP, 90 g 5'-CMP und 80 g
5'-UMP gewonnen. Aus den Rückständen werden außerdem Nucleoside und Oligonucleotide
erhalten.
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Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces coelicolor ist
der gleiche, wie er im Beispiel 5 gebraucht wurde.