DE1420112C3

DE1420112C3 - Verfahren zur Herstellung von ^-Nucleotiden

Info

Publication number: DE1420112C3
Application number: DE1420112A
Authority: DE
Inventors: Chiba Choshi; Masajiro Kibi; Akira Kuninaka; Kinichiro Tokio Sakaguchi
Original assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba (japan)
Current assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba (japan)
Priority date: 1958-04-28
Filing date: 1959-04-25
Publication date: 1974-05-02
Also published as: DE1420112A1; DE1517137C3; DE1420112B2; DE1517137B2; DE1517137A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden (Adenosin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-monophosphat, Inosin-5'-monophosphat) aus Ribonucleinsäure (RNS) durch mikrobielle Wirkung einer 5'-Phosphodiesterase. 5'-Nucleotide waren bisher nur schwer z. B. durch organische Synthese oder durch Extraktion von Geweben verschiedener Organismen wie Säugetiermuskeln zu erhalten. Aufgabe der Erfindung ist ihre wirtschaftliche Gewinnung in guter Ausbeute aus Ribonucleinsäure unter Verwendung der Enzyme von Mikroorganismen.

Ein chemischer Abbau von RNS führt zur Bildung von 3'- und 2'-Nucleotiden und nicht zu 5'-Nucleotiden. Darüber hinaus bauen gewöhnliche Ribonucleodepolymerasen ohne Berücksichtigung der Ursprungsart die RNS zu 3'- (oder 2'-)Nucleotiden, jedoch nicht zu 5'-Nucleotiden ab. Nur die Phosphodiesterasen, die z. B. aus einer Giftschlange oder der Darmschleimhaut isoliert werden können, bauen RNS zu 5'-Nucleotiden ab. Jedoch ist es sehr schwierig, große Mengen dieser Enzyme zu erhalten.

Es konnte nun festgestellt werden, daß die Stämme von Penicillium citrinum 5'-Phosphodiesterasen enthalten, die in spezieller Weise die Phosphodiesterbindungen (C₃ — O — P — O — C₅) in Ribonucleinsäure hydrolysieren und die 5'-Nucleotide Adenosin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-monophosphat und Uridin-5'-monophosphat erzeugen.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden durch enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäure mit Hilfe von in Kulturmedien von Mikroorganismen enthaltenen Enzymen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Kulturmedien von Stämmen der Art Penicillium citrinum einsetzt und die enzymatische Reaktion unter Bedingungen durchführt, unter denen die Aktivität der darin enthaltenen Phosphatase gehemmt wird. So kann beispielsweise bei einer Temperatur von 60 bis 65⁰C und einem pH-Wert von 5 bis 5,3 gearbeitet werden. Unter den Bedingungen dieser Verfahrensvariante wird die in dem Kulturmedium enthaltene Adenylsäuredeaminase inaktiviert und keine 5'-Inosinsäure gebildet. Es kann aber auch in an sich bekannter Weise bei 30⁰C in Gegenwart von 0,01 n-Natriumfluorid gearbeitet werden, wobei 5'-AdenyIsäure teilweise in 5'-Inosinsäure umgewandelt wird.

Ribonucleinsäure wird zu 5'-Nucleotiden durch 5'-Phosphodiesterase abgebaut, die in lebenden Zellen, trockenen Zellen, Kulturfiltraten oder Zellextrakten der oben beschriebenen Mikroorganismen enthalten ist. Die 5'-Phosphodiesterase enthaltenden Mikroorganismen sind in der Lage, auf festen oder flüssigen Medien zu wachsen. Für die wirtschaftliche Massenerzeugung sind die flüssigen Medien geeigneter. Als Nährstoffe der kulturmedien können in wirksamer

ίο Weise die üblichen Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und verschiedene anorganische Salze verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt ein ein- und zweistufiges Verfahren. Bei dem einstufigen Verfahren wird das Züchten der Mikroorganismen und der enzymatische Abbau der RNS gleichzeitig ausgeführt, wobei ein Nährmedium angewendet wird, das RNS enthält. Beim zweistufigen Verfahren wird das Züchten der Mikroorganismen und der enzymatische Abbau der RNS getrennt durchgeführt.

Erfindungsgemäß ist es nicht notwendig, die Ribonucleinsäure vor ihrem enzymatischen Abbau zu reinigen. Als geeignetes Ausgangsmaterial können rohe Lösungen, die RNS enthalten, z. B. Hefeextrakte, verwendet werden. Darüber hinaus können in wirk-

»5 samer Weise mikrobielle Zellen, die zur Erzeugung von 5'-Phosphodiesterase gezüchtet werden, zusätzlich als Quelle für die Ribonucleinsäure verwendet werden. Freie 5'-Nucleotide oder ihre Alkalisalze, insbesondere lnosin-5'-monophosphat und Guanosin-5'-monophosphat, verstärken oder erhöhen in hier nicht beanspruchter Weise den Wohlgeschmack von Nahrungsmitteln, Getränken und Würzen, wenn sie ihnen zugemischt werden.

Beispiel 1

50 ml einer wäßrigen Kultur, die 5% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,05 °/o einbasisches Kaliumphosphat, 0,05% zweibasisches Kaliumphosphat, 0,04% Magnesiumsulfat und 0,04% Calciumchlorid enthielt, wurde sterilisiert und mit einer reinen Kultur von Penicillium citrinum beimpft. Nach einer 5 Tage dauernden Oberflächenbebrütung bei 3O⁰C wurde das Mycel von der Kulturbrühe getrennt und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Mycel wurde mit 50 ml einer 0,5%igen Hefe-Ribonucleinsäure-Lösung, die 0,01 n-Natriumfluorid enthielt, bei 30⁰C bebrütet. Nach 22,5 Stunden wurde das Mycel entfernt. In der erhaltenen Reaktionsmischung wurden 70 bis 80 mg Mononucleotide, 80 bis 90 mg Nucleoside und 70 bis 80 mg Polynucleotide gefunden. Die in der obigen Mischung enthaltenen Mononucleotide wurden als Cytidin-5'-monophosphat, Adenosin-5'-monophosphat, lnosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat und Guanosin-5'-monophosphat identifiziert. Die Identifizierung wurde wie folgt ausgeführt:

23 ml der Reaktionsmischung wurden mittels einer starken Natriumhydroxydlösung auf pH 8,5 eingestellt. 2,5 ml einer 20%igen Bariumacetatlösung wurden hinzugegeben. Der sich bildende Niederschlag von Bariumphosphat wurde entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mittels einer kleinen Menge Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. 1 ml Quecksilberacetatlösung (20% in 2%iger Essigsäure) wurde hinzugefügt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, gewaschen und in Wasser suspendiert. Um die Nucleotide abzutrennen, wurde in die Suspension Schwefelwasserstoff gas eingeleitet. Die Mischung wurde

filtriert und der Niederschlag mit heißem Wasser gewaschen. Die beim Waschen erhaltene Lösung wurde mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt und ein Teil der vereinigten Lösung wurde auf pH 8,5 eingestellt und in eine Säule mit einem Durchmesser von 1,0 und 23 cm Höhe, beschickt mit einem Anionenaustauschharz, gebracht und mit 0,003 n- und 0,01On-Salzsäure eluiert. Je 80 Tropfen des Eluates wurden in ein Versuchsröhrchen gesammelt, bei einer optischen Dichte von 260 ιτιμ wurde jedes Eluat gemessen. Es wurden fünf ultraviolett absorbierende Fraktionen A, B, D, C und E erhalten. Die Eigenschaften dieser Fraktionen werden in den folgenden Tabellen aufgezeigt.

Tabelle I Erhaltene Nucleotid-Fraktionen

	A	B	Fraktionen C I D	262	E
max. (ιτιμ)*)	275	258 78,7	249 82,2		252 81,6
°/₀ Farbentwicklung (Pentose-Orcinol-Reaktion)**) 7 Minuten		94,2	98,9		97,2
15 Minuten		100,0	100,0		100,0
25 Minuten . . ..		96,0	96,8		96,3
35 Minuten		93,9	92,6		92,8
45 Minuten		blau	blau	14,7	blau
Carbazolreaktion ....	4,9	4,9	12,5	7,7 -4-
Wanderungsabstand von Anfang zur Anodenseite durch Elek trophorese (cm)***) .... . .
NaIO₄-Rosanilin-Reaktion

Tabelle II Standard-Substanzen

Cytidin- 3'-mono- phosphat	Adenosin- 3'-mono- phosphat	Adenosin- 5'-mono- phosphat	Inosin- 5'-mono- phosphat	Uridin- 3'-mono- phosphat	Guanosin- 3'-mono- phosphat
278	257	257	250	262	257
			80,4 95,7 100,0 95,4 92,1		42,5 80,2 98,3 100,0 99,1
	purpur	blau	blau		purpur
4,9	5,0	4,5 +	12,5 +	15,0	8,8

Mischung

von 3'-nucleo-

tide

max. (ηιμ)*)

% Farbentwicklung (Pentose-Orcinol-Reaktion)

7 Minuten

15 Minuten

25 Minuten

35 Minuten

45 Minuten

Carbazolreaktion

Wanderungsabstand von Anfang zur Anodenseite durch Elektrophorese (cm)***).....

258

39,6 72,8 94,7 99,0 100,0

purpur

14,8 8,7 4,7

NaIO₄-Rosanilin-Reaktion

*) Die Ultraviolettadsorptionsspektren der Standardsubstanzen wurden in 0,1 n-HCl gemessen.

**) Die angewandte Technik entsprach im wesentlichen der von A 1 b a u m und U m b r e i t (J. Biol. Chem., 167, S. 369 [1947]). ***) Die Ausgangslinie lag 5 cm vom Ende der Kathodenseite und 26 cm vom Ende der Anodenseite.

Aus den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ist zu entnehmen, daß die ultraviolett absorbierenden Substanzen, die in den Fraktionen A, B, C, D und E enthalten sind, Cytidin-S'-monophosphat, Adenosin-5'-monophosphat, Inosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat und Guanosin-5'-monophosphat sind. Wahrscheinlich wurde das in diesem Beispiel festgestellte Inosin-5'-monophosphat sekundär aus dem Adenosin-5'-monophosphat durch die Wirkung einer in Penicillium citrinum enthaltenen Deaminase gebildet. Die Bildung von Xanthosin-5'-monophosphat wurde nicht beobachtet.

Beispiel 2

Für die Bildung von 5'-Phosphodiesterase ist eine Schüttelkultur wirksamer als eine Oberflächenkultur. Das im Beispiel 1 verwendete Kulturmedium wurde mit Penicillium citrinum beimpft. Das beimpfte Wachstumsmedium wurde auf einer Umkehr-Schüttelmaschine bei 30⁰C geschüttelt. Nach 7 Tagen wurden die Kulturfiltrate im Vakuum konzentriert und dann gegen fließendes Wasser über'Nacht dialysiert. Zu der dialysierten Lösung wurden 4 Volumteile Äthanol gegeben. Der entstandene Niederschlag, welcher eine

hohe S'-Phosphodiesterase-Wirksamkeit aufwies, wurde in einem Trockengefäß getrocknet und als Enzympräparat verwendet. Aus 1 Liter Kulturfiltrat wurde etwa 1 g des Präparates erhalten. 1 mg dieses Präparates wurde mit 200 ml einer 5°/_oigen RNS-Lösung bei 65°C und einem pH von 5,0 angesetzt. Unter diesen Bedingungen sind Phosphomonoesterase und Adenyldeaminase inaktiv, während 5'-Phosphodiesterase ihre starke Wirksamkeit behält. Die Reaktion nahm folgenden Verlauf:

5'-Nucleotidbildung
aus Ribonucleinsäure, %

Anorganische Phosphatbildung aus
5'-Nucleotiden, %

Inkubationszeit (Minuten)
0 I 10 I 30 I 60 I 90

3,0

68

3,5

96

4,5

Es konnte festgestellt werden, daß sich in der Reaktionsmischung Adenosin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-monophosphat und Uridin-5'-monophosphat ansammelten. Die angesammelten 5'-Nucleotide wurden durch übliche Mittel gereinigt. Die Ausbeute jeder der 5'-Nucleotide beträgt 1,3 bis 2,0 g in freier Form.

Beispiel 3

10 Liter eines wäßrigen Kulturmediums, das 55Og süßer Kartoffelstärke, 160 ml Fischextrakt (Gesamtstickstoff 4,4%), 5 g einbasisches Kaliumphosphat, 5 g zweibasisches Kaliumphosphat und 4 g Magnesiumsulfat enthielt, wurden auf pH 5,6 eingestellt und mit Penicillium citrinum Thorn 1131 beimpft. Das beimpfte Medium wurde in einer Flaschenfermentations-Vorrichtung bei 30⁰C belüftet. Nach 72 Stunden wurden die Zellen von der Kulturflüssigkeit getrennt. Die Kulturflüssigkeit wurde mit 3 Volumteilen Futterhefeextrakt, der 0,5% Ribonucleinsäure enthielt, bei 60 bis 65°C und pH 5,3 für 3 Stunden angesetzt. Während der Umsetzung wurde die in dem Hefeextrakt vorhandene Ribonucleinsäure vollständig zu Adenosin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat und Cytidin-5'-monophosphat abgebaut.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden durch enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäure mit Hilfe von in Kulturmedien von Mikroorganismen enthaltenen Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturmedien von Stämmen der Art Penicillium citrinum einsetzt und die enzymatische Reaktion unter Bedingungen durchführt, unter denen die Aktivität der darin enthaltenen Phosphatase gehemmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur von 60 bis 65°C und einem pH-Wert von 5 bis 5,3 oder bei 30' C in Gegenwart von 0,01 n-Natriumfluorid gearbeitet wird.