DE1207325B

DE1207325B - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5-Amino-1-beta-D-ribosyl-4-imidazolcaoxamid

Info

Publication number: DE1207325B
Application number: DEA43599A
Authority: DE
Inventors: Teruo Shiro; Schimpachi Konishi; Akio Yamanoi; Shinju Okumura; Masahiro Takahashi
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1962-07-18
Filing date: 1963-07-17
Publication date: 1965-12-23

Description

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid.
5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-inüdazolcarboxamid ist einer der biologisch wichtigen Precursoren der Purinnucleoside, von dem man annimmt, daß es in der Medizin und der Biochemie zunehmend Verwendung finden wird. Es ist das am besten bekannte Ausgangsmaterial für die Synthese von 5-Amin0-1-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid-5'-phosphat.
Nach dem vorb2kannten Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid wird als Ausgangsmaterial 5-Amino-4-imidazolcarboxamid verwendet, das auf chemischem oder biologischem Wege synthetisiert und der Additionsreaktion von Ribose in einer komplexen und kostspieligen Folge von Verfahrensstufen unterworfen wird. Im Vergleich dazu stellt das mikrobiologische Herstellungsverfahren gemäß Erfindung eine Pioniererfindung dar.
Das Verfahren der Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß bestimmte, künstlich erzeugte biochemische Mutanten von Bacillus subtilis und Baeillus megaterium: die Bacillus-subtilis-Stämme (D-2511) ATCC 15 116 und (D-422) ATCC 15 115 sowie die Bacillus-megaterium-Stämme (MA-336) ATCC 15 117 und (MA-658) ATCC 15 118, die auf einer Nähragarschrägfläche zu wachsen vermögen und für ihr Wachstum mindestens eine Purinbase oder deren Derivate, wie Adenin, Guanin, Inosin, Hypoxanthin und Xanthin, benötigen, bei der aeroben Fermentation außerhalb der Zellen 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid in so großen Mengen (z. B. 1 bis 9 gll) zu bilden und anzureichern vermögen, daß darauf ein Herstellungsverfahren im industriellen Maßstab aufgebaut werden kann.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid, wonach man die Stämme Bacillus subtilis (D-422( ATCC 15 115, Bacillus subtilis (D-2511) ATCC 15 116, Bacillus megaterium (MA-336) ATCC 15 117 oder Bacillus niegaterium (MA-658) ATCC 15 118 unter Anwendung üblicher Temperaturen und Nährmedien, weiche Purinbasen oder deren Derivate, wie Adenin, Guanin, Inosin, Hypoxanthin und Xanthin, enthalten, bei einem pH-Wert zwischen 5,0 bis 8,0 züchtet.
Zur Gewinnung der gemäß Erfindung benutzten Stämme Bacillus subtilis (D-422) ATCC 15 115 und (D-2511) ATCC 15 116 und Bacillus megaterium (MA-336) ATCC 15 117 und (MA-658) ATCC 15 118 wurden gewöhnliche Bacillus-subtilis- und Bacillusmegaterium-Stämme verschiedener Stammkulturen sowie neue Naturisolate, die nicht die Fähigkeit haben, größere Mengen 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid zu bilden, noch in einem Kulturmedium anzureichern, der UV-, Röntgen- oder y-Strahlung ausgesetzt oder in Form von aktiven Zellen oder als Sporen mit Natriumnitritlösung in Berührung gebracht. Die erhaltenen Mutanten mit der Fähigkeit, bei der aeroben Fermentation in Purinbasen oder deren Derivate enthaltenden Kulturmedien sonst üblicher Zusammensetzung außerhalb der Zellen 5-Amino-1-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid zu bilden, wurden dann aus den unveränderten Stämmen mittels der konventionellen Selektion unter Nutzung der Tatsache ausgewählt, daß die Mutanten auxotroph waren (vgl. Werner B r o w n, »Bacterial Genetics«, W. B. Saunders Comp. [1953]. Die Ausgangsstämme können gewöhnlich auf einem üblichen Gray-Tatum-Medium des in Tabelle I angegebenen Typs wachsen, die Mutanten dagegen nicht. Tabelle I Gray-Tatum-Medium Ammoniumchlorid .................... 5,0 g Ammoniumnitrat ..................... 1,0 g Natriumsulfat ........................ 2,0 g Magnesiumsulfat ..................... 0,1 g sec. Kaliumphosphat (K2HPO,) ......... 3,0 g prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 1,0 g Calciumchlorid ....................... 1,0 mg Zinksulfat ........................... 8,8 mg Ferrichlorid .......................... 0,9 mg Kupfersulfat ......................... 0,4 mg Manganchlorid ....................... 0,07 mg Glucose ............................. 0,5 mg Mit Wasser aufgefüllt auf .............. 11 . Die Mutanten wachsen gut auf einem modifizierten Kulturmedium der Art, wie es in Tabelle 11 angegeben ist, das auch das Wachstum der Ausgangsstämme unterstützt. Die Bildungsgeschwindigkeit von 5-Aniino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolearboxamid in dem Kulturmedium und die erreichte maximale Konzentration an dieser Verbindung wurden bestimmt, und die Stämme mit der größten Fähigkeit, diese Verbindungen zu bilden und anzureichern, wurden ausgewählt. Tabelle II Selektionsmedium für die Produktion von 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid Glucose ............................. 5,001, prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 0,20/, Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,040/, Ferrosulfat .......................... 0,000501, Mangansulfat ........................ 0,000501, Hefeextrakt .......................... 0,501, Ammoniumchlorid .................... 0,40/, Harnstoff ............................ 0,60/, Pepton .............................. 0,501, pH ................................. 7,0 Die Konzentrationsbestimmung für 5-Amino-1-ß-D-ribosyl-4-imidazolearboxamid in dem Fermentationsmedium erfolgte in üblicher Weise. Die Papierehromatographie, die Filterpapierelektrophorese, die Orcinolreaktion für Ribose, die Methode von B r a tt o n und M a r s h a 11 zur Bestimmung von 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid waren die besten Methoden zur Trennung der verschiedenen Komponenten in den analysierten Medien. Zur Identifizierung der isolierten Kristalle wurden die üblichen Vergleichsteste, wie UV-Absorptionsspektrum, Infrarotspektrum, Schmelzpunkt, Rf-Wert der Papierehromatographie, Wanderung der Filterpapierelektrophorese, Elementaranalyse, Methode von Bratton und M a r s h a 11, Orcinolreaktion usw., mit bekannten Proben von 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid angewandt.
Es ist eine charakteristische Eigenschaft der erfindungsgemäßen künstlichen Bakterienmutanten, daß sie mindestens eine der Purinbasen oder deren Derivate in ihrem Kulturmedium benötigen und daß sie auf Gray-Tatum-Medien gezüchtet werden können, die in der Weise modifiziert sind, daß sie die notwendigen Purinbasen oder die entsprechenden Derivate, wie Adenosin, Guanosin, Inosin, Xanthosin, Adenylsäure, Guanylsäure, Inosinsäure und Xanthylsäure, enthalten. Von den gemäß Erfindung verwendeten, künstlich erzeugen Mutanten benötigen Bacillus subtilis (13-422) ATCC 15 115 Adenin, Adenosin oder Adenylsäure und Baeillus subtilis (D-2511) ATCC 15 116, Baeillus megaterium (MA-336) ATCC 15 117, Bacillus megaterium (MA-658) ATCC 15 118 Purinbasen, wie die Purinriboside oder Purinribotide, z. B. Adenin, Adenosin, Adenylsäure, Guanin, Guanosin, Guanylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Inosinsäure, Xanthin, Xanthosin und Xanthylsäure, für ihr Wachstum.
Das Medium, Af dem die Mutantenstämme der Erfindung kultiviert werden, muß Kohlenstoff- sowie Stickstofflieferanten und die üblichen, von den Mikroorganismen benötigten Nährstoffe enthalten.

Einige Beispiele für Lieferanten assinlilierbarer Kohlenstoffverbindungen sind Kohlenhydrate, wie Stärke, Stärkehydrolysate, Zucker, stark zuckerhaltige industrielle Produkte und metabolische Kohlenstoffverbindungen, wie Zuckeralkohole und organische Säuren. In Tabelle III sind die Änderungen in der Bildung von 5-Anüno-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid in Abhängigkeit vom Zusatz verschiedener Kohlenstofflieferanten dargestellt. Die in g/1 angegebenen Werte für 5-Amin0-1-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid wurden mit Bacillus subtilis (D-2511) ATCC 15 116 und Bacillus megaterium (MA-336) ATCC 15 117 unter aeroben Bedingungen (20 ccm Medium in einem 500 ccm-Schüttelkolben) bei 31,5'C nach 72 Stunden erhalten.

Tabelle III

Zugesetzter Bacillus Bacillus

Kohlenstofflieferant subtilis megaterium

5010 (D-2511) (MA-336)

ATCC 15116 ATCC 15117

Glucose ................ 3,18 6,51

Fructose ............... 1,25 5,63

Maltose ................ 1,64 6,33

Saccharose ............. 0,97 4,95

Melassen ............... 2,56 5,71

Stärke ................. 2,45 6,12

Stärkehydrolysat ......... 3,43 6,94

Grundmedium (pH 7,0) prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 0,5010 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,041/, Ferrosulfat .......................... 0,0005010 Mangansulfat ........................ 0,000501, Ammoniumchlorid .................... 1,501, Ammoniumnitrat ..................... 0,204 Harnstoff ............................ 0,30/0 Caseinhydrolysat ..................... 0,20/,) Calciumearbonat ..................... 5,001, Ribonucleinsäure ..................... 0,1250/,) Einige Beispiele für Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff, der für die Bildung von 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid benötigt wird, sind Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff sowie Ammoniak in Form einer wäßrigen Lösung oder als Gas, das der für die Belüftung verwendeten Luft in bekannter Weise beigemischt wird. Der Stickstoff der Proteine oder der Aminosäuren wird auch von den Mikroorganismen assimiliert. Für die Fermentation sind auch gewisse anorganische Salze notwendig. Sie sollten Phosphat-, Sulfat-, Kalium-, Natrium-, Magnesium-, Ferro- oder Ferri-, und Manganionen bilden.

Die mehr komplexen organischen Subuanzen, die das Wachstum der Mikroorganismen steigern und die Bildung von 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid beschleunigen, sind für die wirtschaftliche Durchführung des Prozesses wichtig. Durch ihre Anwesenheit werden die Ausbeute, die Bildungsgeschwindigkeit und die maximale Konzentration von 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazol-carboxamid in dem Medium beeinflußt. Einige Beispiele für die Nährstoffe oder Wachstumsbeschleuniger dieser Gruppe sind Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Adenosin, Guanosin, Inosin, Xanthosin, Adenylsäure, Guanylsäure, Inosinsäure, Xanthylsäure,Aminosäuren, verschiedene Vitamine sowie Materialien, die diese

Tabelle IV

(D-2511) ATCC 15116 (D-422) (MA-336)

mg 0/0 ATCC 15115 ATCC 15117

Adenin Guanin Hypoxanthin Xanthin Adenin Adenin

o 0 0 0 o 0 0

5 1,16 0,59 0,90 0 0,31 4,04

10 1,24 0,95 0,93 0,28 0,41 5,08

15 1,55 1,16 1,29 0,39 0,77 4,87

20 1,88 1,34 181 0,98 0,90 4,51

30 1,73 175 0:98 1,19 0,95 2,00

50 1,03 1:55 023 1,52 0,90 0,93

80 0,23 0 , 26 0:18 0,44 0,28 0,45

Grundmedium Baeillus subtilis (D-2511) ATCC 15 116 und (D-422) ATCC 15 115 Glucose ............................. 5,00/0 prim. Kaliumphosphat (KH,PO4) ....... 0,5l)/, Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,041)/, Ferrochlorid ......................... 0,00040h, Manganchlorid .................... 0,00040/0 Ammoniumchlorid .................... 1,5010 Caseinhydrolysat ..................... 0,20/0 Caleiumcarbonat ..................... 5,001,

Tabelle V

g/100 Ccm Baeillus subtilis (D-2511) ATCC 15116

Trockenhefe Hefeextrakt Ribonucleinsäure

0,1 0,15 0,39 2,15

0,3 0,52 0,65 1,52

0,6 0,67 1,08 0,77

1,0 0,77 0:95 0,54

1,5 0,62 031 0,19

Grundmedium Glucose ............................. 5010 prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 0,5% Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,040/, Ferrochlorid ......................... 0,00040/0 Manganchlorid- ....................... 0,00041)/, Ammoniumchlorid ........ . .......... 1,5010 Calciumcarbonat ..................... 5% Subuanzen enthalten oder unter Fermentationsbedingungen in sie übergeführt werden.

Weitere bzkannte Subuanzen, die die erwähnten Substanzen enthalten, werden ebenfalls verwendet. Es sind Ribonucleinsäuren, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen erhalten werden, Proteinhydrolysat, Maisquellwasser, von Mikroorganismen erhaltene Extrakte sowie Trockenzellen von Mikroorganismen. Die mit dem Zusatz von Nährstoffen und Wachstumsbeschleunigern erzielten Wirkungen sind in Taballen.IV und V dargestellt. Die in g/1 angegebenen Werte f ür 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid wurden mit Bacillus subtilis (13-2511) ATCC 15 116 und (D-422) ATCC 15 115 und Bacillus megaterium (MA-336) ATCC 15 117 unter aeroben Bedingungen (20ccm Medium in einem 500-ccm-Schüttelkolben) bei 31'C nach 64 Stunden (Tabelle IV) und nach 60 Stunden (Tabelle V) erhalten. Bacillus megaterium (MA-336) ATCC 15 117 Glucose ............................. 60/0 prim. Kaliumphosphat (KH,PO4) ....... 0,10/() Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,04% Ferrochlorid ......................... 0,0004% Manganchlorid ....................... 0,00040/0 Ammoniumchlorid .................... 1,5010 Ammoniumnitrat ....... . ............. 0,40/0 sec. Ammoniumphosphat [(NH4),HPOJ. . 0,05% Harnstoff ............................ 0,15% Caseinhydrolysat ..................... 0,20/, Calciumcarbonat ..................... 5% Die Wasserstoffionenkonzentration im Fermentationsmedium beeinflußt die Ausbeute an 5-Amino-1-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid. Gute Ergebnisse wurden im pH-Bereich zwischen 5,0 und 8,5 erhalten, wobei engere Optimalbereiche f ür die verschiedenen Mutantenstämme und spezifischen Kulturbedingungen ermittelt werden konnten. Der Einfluß des pH-Wertes auf die Bildung von 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid in Kulturen von Bacillus subtilis (13-2511) ATCC 15116 und Baeillus megaterium (MA-336) ATCC 15117 ist in Tabelle VI veranschaulicht, in der die Ergebnisse, die mit den Kulturen bzi 31,5'C nach 68 Stunden erhalten wurden, zusammengestellt sind. 31 des Mediums wurden in einen »jar«-Fermenter mit einer Geschwindigkeit von 400 Umdr./ Min. gerührt, während Luft mit einer Geschwindigkeit von 750 cem/Min. hindurchgeleitet wurde. Die angegebenen pH-Werte wurden durch Zusatz von Phosphorsäure, Salzsäure, Ammoniak, CaCO" KOH sowie NaOH erhalten. Insb--sondere den Kulturen von Bacillus megaterium (MA-336) ATCC 15117 wurde Ammoniaklösung und Ammoniakgas als Neutralisationsmittel und Stickstofflieferant zugesetzt.

Tabelle VI

pH (D-2511) (MA-336)

4,6 bis 4,8 0,38 0,82

5,0 bis 5,3 1,75 3,63

5,8 bis 6,1 2,14 7,82

6,7 bis 7,0 1,88 7,51

7,5 bis 7,8 1,52 6,74

8,2 bis 8,5 0,97 2,44

8,6 bis 8,9 0,45 0,87

Medium Baeillus subtilis (D-2511) ATCC 15 116 Glucose ... . ......................... 6,00/, prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 0,30/0 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,040/, Ferrosulfat .......................... 0,000501, Mangansulfat .................... . ... 0,000501, Ammoniumehlorid .................... 1,5% Trockenhefe ......................... 1,011/o Caseinhydrolysat ..................... 0,20/0 Baeillus megaterium (MA-336) ATCC 15117 Stärkehydrolysat (als Glucose) ......... 6,00/0 prim. Kaliumphosphat (KH.P0,) ....... 0,1(1/0 Ma,-nesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,040/0 Ferrosulfat .......................... 0,000501, Mangansulfat ........................ 0,000501, Ammoniumchlorid .................... 0,30/0 Harnstoff ............................ 0,15% Ribonueleinsäure ..................... 0,1250/, Sojabohnenmehl ...................... 0,30/, Gute Ergebnisse werden gewöhnlich in einem Temperaturbereich zwischen 25 und 40, vorzugsweise zwischen 30 und 37'C erhalten. Der Einfluß der Temperatur auf die Ausbeute an 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid, die mit zwei repräsentativen Mutantenstämmen gemäß Erfindung erhalten wurde, ist in Tabelle VII gezeigt. Die angegebenen Konzentrationswerte für 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolearboxamid wurden mit 20 cem Medium erhalten, das unter Schütteln in einem 500 cem-Kolben nach 68 Stunden Kultivierung erhalten worden war.

Tabelle VII

Temperatur ('C) (D-2511) (MA-336)

25 1,01 3,36

30 1,98 6,34

34 2,04 7,21

37 1,67 5,84

40 0,64 1,15

Medium Baeillus subtilis (13-2511) ATCC 15 116 Glucose ............................. 6,00/, i prim. Kaliumphosphat (KH2P04) ....... 0,30/, Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,040/0 Ferrosulfat .......................... 0,0005010 Mangansulfat ........................ 0,000501, Ammoniumchlorid .................... 1,501, Trockenhefe ......................... 1,017o Caseinhydrolysat ..................... 0,20/, Calciumcarbonat ..................... 5,0010 Bacillus megaterium (MA-336) ATCC 15117 Stärkehydrolysat (als Glucose) ......... 6,00/, prim. Kaliumphosphat (KH,PO4) ....... 0,10/0 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,040/, Ferrosulfat .......................... 0,000501o Mangansulfat ........................ 0,000501,) Ammoniumchlorid .................... 1,501, Ammoniumnitrat ..................... 0,40/0 Harnstoff ............................ 0,1501, Ribonucleinsäure ..................... 0,1250/() Pepton .............................. 0,20/0 Die Mutantenstämme der Erfindung werden unter aeroben Bedingungen kultiviert, wobei die Luft dem Medium entweder mit dem Schütteln oder durch Belüftung und Rühren zugeführt wird. Die günstigste Fermentationsperiode liegt gewöhnlich zwischen 2 und 4 Tagen. Impfkulturen werden auf Bouillon-Agar-Medien, auf flüssiger Bouillon oder auf einem der Fermentationsmedien hergestellt.

Unter optimalen Bedingungen kann die äußerste Konzentration an 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid in dem Medium von 9 gll erreicht werden. Das 5-Amin0-1-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid wird zur Isolierung aus dem Medium selektiv adsorbiert an Aktivkohle und Ionenaustauscherharz. Es läßt sich in gereinigter Form leicht eluieren.
Das Verfahren der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das folgende Zusammensetzung in g/100ccm hatte: Glucose ............................. 6,0 prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 0,8 Mac,nesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,04 Ferrochlorid ......................... 0,0004 Manganchlorid ....................... 0,0004 Caseinhydrolysat ..................... 0,6 Trockenhefe ........... « ............. 1,0 Ammoniumehlorid .................... 0,4 Harnstoff ............................ 0,6 Maisquellwasser ...................... 0,1 (ccm) Calciumcarbonat ..................... 2,0 Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.
Je 20 ccm Ansätze der erhaltenen wäßrigen Lösung wurden in 500-ccm-Kolben 10 Minuten bei 115'C entkeimt und die Medien in den Kolben mit 0,1 ccm einer Suspension von Baeillus-subtilis-Mutante-Stamm (D-2511) ATCC 15116, der in einem Testrohr in 3 ccm des gleichen wäßrigen Kulturmediums, das in der weiter oben beschriebenen Weise hergestellt worden war, 20 Stunden bei 30'C in einer Schüttelkultur kultiviert worden war, beimpft.
Bacillus subtilis (13-2511) ATCC 15116 wurde aus Bacillus subtilis K, Stamm IAM 1523 (IAM; Institute of Applied Mierobiology of Tokyo University), durch Einwirkung von Röntgenstrahlen (1000,ylMin.) für 144 Minuten erzeugt.
Die Fermentation wurde 64 Stunden bei 30'C unter Schütteln durchgeführt. Danach enthielt das Fermentationsmedium 2,7 g/1 5-Aniino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid. 21 der vereinigten Medien wurden mit 10 g Hydrosupercel versetzt, 5 Minuten gerührt und dann filtriert. Das erhaltene Filtrat stellte man auf einen leicht sauren pH-Wert ein, führte es durch eine Kolonne mit 60 g granulierter Tierkohle, wusch die Verunreinigungen in der Kolonne mit Wasser aus und eluierte das 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolearboxamid mit einer Mischung von Äthanol zu Ammoniumhydroxyd zu Wasser (Volumenverhältnis 1 : 1 : 2). Das Eluat wurde im Vakuum zu einem Oel konzentriert, dann in 500 ccm Wasser gelöst, der pH-Wert dieser Lösung mit wäßriger Ammoniaklösung auf 10 bis 11 eingestellt und die Lösung durch eine mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1 - 8 vom Formiat-Typ gepackte Kolonne geleitet. Das 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid wurde aus der Kolonne mit Wasser ausgewaschen, die erhaltene Lösung im Vakuum zu einem Öl konzentriert, das dann in 110,01 n-Salzsäure gelöst wurde. Die angesäuerte Lösung wurde in einer Dowex-50-Kolonne in der Ammoniumform adsorbiert, sodann die Kolonne mit 110,01 n-Salzsäure gewaschen und das 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid mit 0,1 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Ammoniak wurde aus dem Eluat durch Eindampfen zur Trockene entfernt. der erhaltene Trockenrückstand durch vorsichtiges Erhitzen in einem Wasserbad in einer minimalen Wassermenge gelöst und auf 4 bis 6'C gekühlt, wobei man Rohkristalle von 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolearboxamid erhielt. Durch Umkristallisation aus Wasser erhielt man 0,44 g Reinkristalle. Beispiel 2 Es wurde ein wäßriges Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung (g/100 ccm) hergestellt: Stärkehydrolysat (als Glucose) ......... 7,0 prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 0,2 sec. Ammoniumphosphat [(NH02HPOJ. . 0,4 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,04 Ferrosulfat .......................... 0,0005 Mangansulfat ........................ 0,0005 Caseinhydrolysat ..................... 0,4 Ribonucleinsäure (Reinheitsgrad 70 0/,) .. 0,3 Ammoniumchlorid .................... 0,2 Calciumcarbonat ..................... 2,0 Bacillus-subtilis-Mutante-Stamm. (13-422) ATCC 15 115 wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise kultiviert. Die Konzentration an 5-Amin0-1-ß-D-ribosyl-4-Imidazolcarboxamid in dem Medium betrug zum Schluß 2,2 g/l. Aus 51 des Mediums wurden 0,87 g nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode isoliert.
Beispiel 3 Bacillus-megaterium-Mutante-Stamm (MA-336) ATCC15117 wurde auf einem Medium kultiviert, das in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise entkeimt worden war und folgende Bestandteile (g/100 ccm) enthielt: Stärkehydrolysat ..................... 8,0 prim. Kaliumphosphat (KH,P0,) ....... 0,3 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,04 Ferrosulfat 0,0005 Mangansulfat .......... 0,0005 Caseinhydrolysat ..................... 0,2 Ribonueleinsäure (Reinheitsgrad 800/,) .. 0,1 Ammoniumchlorid .................... 1,0 Ammoniunmitrat ..................... 0,2 Calciumcarbonat ..................... 5,0 Nach einer Fermentation von 72 Stunden unter Schütteln bei 31,5'C enthielt das Medium 8,8 gll 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid. Nach der im Beispiell beschriebenen Weise wurden aus 2 1 Medium 11,4 g dieser Verbindung isoliert.
Beispiel 4 Bacillus-megaterium-Mutante-Stamin (MA-336) ATCC 15 117 wurde auf einem Medium, das in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise entkeimt worden war und fblgende Bestandteile (g/100 ccm) enthielt, kultiviert: Glucose ............................. 6,0 prim. Kaliumphosphat (KH,PO4) ....... 0,2 prim. Natriumphosphat (NaH2P04) ..... 011 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,04 Ferrosulfat .......................... 0,0005 Mangansulfat ........................ 0,0005 Pepton .............................. 0,2 Adenin .............................. 0,025 Ammoniumchlorid .................... 0,8 Ammoniumnitrat ..................... 0,3 Harnstoff ............................ 0,3 Calciumcarbonat ..................... 2,5 Die Impfkultur wurde bei 34'C 16 Stunden und die Hauptfermentation bei 34'C 68 Stunden unter Schütteln durchgeführt. Das fermentierte Medium enthielt dann 6,45 g/1 5-Amino-l-ß-D-ribosyl-4-imidazolearboxamid. Bei der Aufarbeitung verschiedener Ansätze des Mediums in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise wurden pro Liter Medium 4,6 g 5-Amino-l-p-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid isoliert.
Beispiel 5 Es wurde ein wäßriges Kulturmedium. der folgenden Zusammensetzung (g/l) hergestellt: Glucose ............................. 5,0 prim. Kaliumphosphat (KHP0,) ....... 0,25 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,04 Ferrosulfat .......................... 0,0005 Mangansulfat ........................ 0,0005 Trockenhefe ......................... 1,0 Pepton .............................. 0,5 Ammoniumsulfat ..................... 0,1 Ammoniumnitrat ..................... 0,5 Harnstoff ............................ 0,5 Calciumcarbonat ..................... 2,5 Das Medium wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise entkeimt.
Bacillus-megaterium-Mutante-Stamm (MA-658) ATCC 15118, der bei 31,5'C 18 Stunden kultiviert worden war, wurde zum Beimpfen benutzte Die Fermentation wurde bei 31,5'C 80Stunden durchgeführt, und das Medium enthielt schließlich 9,12 g/1 S-Amin0-1-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid. 5,8 g dieser Substanz wurden aus 11 Medium nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise isoliert.
Beispiel 6 Bacillus-megaterium-Mutante-Stamm -(MA-658) ATCC15118 wurde, wie im Beispiell angegeben, kultiviert, jedoch die Impfkultur wurde bei 25'C 20 Stunden, die Hauptfermentation bei 31,5'C 72Stunden durchgeführt. Das verwendete Medium hatte folgende Zusammensetzung (g/100 ccm): Glucose ............................. 6,0 prim. Kaliumphosphat (KH2P0,) ....... 0,3 Magnesiumsulfat-Heptahydrat .......... 0,04 Ferrosulfat .......................... 0,0005 Mangansulfat ........................ 0,0005 Inosin ............................... 0,05 Caseinhydrolysat ..................... 0,2 Ammoniumchlorid .................... 1,0 Ammoniumnitrat ..................... 0,3 Harnstoff ............................ 0,3 Calciumcarbonat ..................... 2,0 Das fermentierte Medium enthielt 6,3 g/1 5-Amino-1-ß-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid, und 5,4 g dieser Substanz wurden aus 11 Medium nach der im Beispiel 1 angegebenen Weise isoliert.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5-Amino-l-fl-D-ribosyl-4-imidazolcarboxamid, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus subtilis ATCC15115, Bacillus subtilis ATCC 15 116, Bacillus megaterium ATCC 15 117 und Bacillus megaterium ATCC15118 unter Anwendung üblicher Temperaturen und Nährmedien, welche Purinbasen und deren Derivate, wie Adenin, Guanin, Inosin, Hypoxanthin und Xanthin, enthalten, bei einem pH-Wert zwischen 5,0 und 8,0 züchtet.