DE1254630B

DE1254630B - Verfahren zur Hydrolyse von Nucleinsaeuren, Oligonucleotiden oder deren Mischungen

Info

Publication number: DE1254630B
Application number: DET23883A
Authority: DE
Inventors: Yasunari Ishida; Kazuwo Motizuki; Minoru Uchida; Koichiro Wakita
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1963-04-25
Filing date: 1963-04-25
Publication date: 1967-11-23

Description

Verfahren zur Hydrolyse von Nucleinsäuren, Oligonucleotiden oder deren Mischungen In der folgenden Beschreibung ist unter dem Ausdruck »Ribonuclease« eine Gruppe von hydrolytischen Enzymen zu verstehen, die an der Hydrolyse von Nucleinsäuren oder ihren Derivaten zu 5'-Nucleotiden beteiligt sind. Die Ribonuclease enthält also zumindest Phosphodiesterase. Der Ausdruck »Phosphomonoesterase« ist als gleichbedeutend mit »5'-Nucleotidase« aufzufassen, falls nicht anders angegeben. Er bezeichnet also ein Enzym oder Enzyme, die die Hydrolyse von 5'-Mononucleotiden zu den entsprechenden Nucleosiden zu katalysieren vermögen.
Es ist bekannt, daß Natrium-5'-inosinat als Mittel zur Steigerung oder Hervorhebung des Geschmacks oder Aromas von Nahtangs- und Genußmitteln oder Getränken verwendet werden kann. Kürzlich wurde gefunden, daß einige andere 5'-Nucleotide als solche wohlschmeckend sind oder den mit Hilfe von Dinatrium-5'-inosinat gesteigerten Wohlgeschmack noch weiter zu verbessern vermögen. Sie eignen sich also ebenfalls als Mittel zur Verbesserung des Geschmacks oder Aromas von Nahtangs- und Genußmitteln. Auf Grund dieser Erkenntnisse hat die Herstellung von 5'-Nucleotiden große Bedeutung erlangt.
Großtechnisch werden 5'-Nucleotide auf enzymatischem Wege hergestellt. Hierbei hydrolysiert man Nucleinsäuren, ihre am Grundgerüst modifizierten Derivate, partiellen Derivate oder Oligonucleotide unter Ausnutzung des von Mikroorganismen gebildeten Ribonuclease-Systems und trennt die gebildeten 5'-Nucleotide vom Reaktionsgemisch ab. Da verschiedene hydrolysierende Fermente im Ribonuclease-System enthalten sind, spalten diese Fermente gleichzeitig oder nacheinander die Nucleinsäuren oder ihre Derivate unter Bildung von 5'-Nucleotiden.
Das Enzymsystem enthält jedoch im allgemeinen auch Phosphomonoesterasen, d. h. Nucleotidasen, die eine schnelle Spaltung der durch die Hydrolyse gebildeten 5'-Nucleotide zu Nucleosiden bewirken. Bei der großtechnischen Herstellung von 5'-Nucleotiden auf enzymatischem Wege werden daher gewöhnlich auf die Phosphomonoesterase einwirkende Inhibitoren, wie Phosphate, Arsenite, Cyanate oder Fluoride, zugesetzt, um die Spaltung der gebildeten 5'-Nucleotide zu Nucleosiden zu verhindern.
Der Zusatz dieser Inhibitoren ist jedoch bei den Hydrolysereaktionen mit einigen unerwünschten Begleiterscheinungen verbunden 1. Der Inhibitor unterdrückt nicht nur die Wirksamkeit der Phosphomonoesterasen, sondern beeinträchtigt auch das ganze Ribonuclease-System und verringert die Aktivität jedes zum System gehörenden Enzyms, so daß der Zusatz eine Senkung der Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolyse oder einen Abbruch der Hydrolyse zu einem unpassenden Zeitpunkt zur Folge hat.
z. Bei der Abtrennung der gebildeten 5'-Nucleotide vom Reaktionsgemisch ist es schwierig, den Inhibitor vom Produktgemisch zu entfernen.
Zur Modifizierung von Enzymsystemen ist es weiterhin vorgeschlagen worden, bei aus Mikroorganismen gewonnenen Enzymlösungen, die zum Abbau von Nucleinsäuren oder ähnlichen Verbindungen benutzt werden, die Aktivität oder die Entstehung der Phosphomonoesterase durch Zusatz von Phenol und/oder entsprechende Regelung des pH-Wertes und/oder der Temperatur zu unterdrücken. Auch ein Zusatz von Metallionen, beispielsweise der Zusatz von Nickelsulfat zur Vorbehan.dlung der Enzymsuspension ist vorgeschlagen worden.
Die Erfindung bringt demgegenüber einen neuen Beitrag zur Deaktivierung der Phosphomonoesterasen in Ribonucleasen enthaltenden Systemen, der wirkungsvoller als die bisherigen Vorschläge ist, wodurch die Herstellung von 5'-Nucleotiden auf enzymatischem Weg wesentlich verbessert wird.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Hydrolyse von Nucleinsäuren, Oligonucleotiden oder deren Mischungen unter Verwendung von durch Behandlung mit Phosphomonoesterasehemmstoffen modifizierten Ribonucleasen aus Ribonuclease bildenden Mikroorganismen zu einem Gemisch von 5'-Nucleotiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Hydrolyse mit einer Ribonuclease durchführt, die durch Zusatz von 1 bis 30 Gewichtsprozent eines niederen aliphatischen Alkohols, bezogen auf die Ribonuclease enthaltende Mischung, vor der Zugabe der zu hydrolysierenden Ausgangsstoffe modifiziert worden ist.
Zur Bildung des Ribonuclease-Systems können beispielsweise Mikroorganismen verwendet werden, die zu folgenden Gattungen gehören: Actinomycetales, z. B.
Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici, Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces sp. Nr.5741. Streptomyces flavus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici, Streptomyces ruber (Krainsky) Waksman et Henrici.
Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces purpurascens Lindenbeim, Streptomyces albogriseolus Benedict, Shotwell et Pridham, Streptomyces olivochromogenes (Bergey et a() Waksman et Henrici, Streptomyces gougerotii (buche) Waksman et Henrici, Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.
Fungi Imperfecti, z. B. Fusarium Roseum Link, Fusarium solani (Mart.) Appel et Wollenweber, Verticillium niveostratosum Lindau, Gliomastix convoluta (Harz) Mason, Helminthosporium sigmoideum var. irregulare Cralley et Tullis.
Plectasscales, z. B.
Aspergillus elegans Gasperini, Aspergillus flavipes (Bainier et Sartory) Thom et Church, Aspergillus fischeri Wehmer, Aspergillus melleus Yukawa, Aspergillus nidulans (Eidam) Winter.
Eubacteriales, z. B.
Bacillus brevis Migula, emend. Ford, Bacillus subtillis Cohn, emend. Prazmowski. Ascomycetes, z. B.
Anixiella reticulispora Saito et Minoura, Botryoskphaeria ribis chromogena Grossenb. et buggar, Chaetomidium japonicum Saito et Okazaki, Glomerella cingulata (Stonem.) Spauleding et Schrenk, Neurospora crassa Shear et Dodge, Neurospora sitiohila Shear et Dodge, Opiobolus miyabanus Ito et Kuribayashi, Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf., Sordaria fimicola (Rab.) Cesari et de Notaris, Tilachlidium humicola Oudemans.
Im einzelnen seien unter Bezugnahme auf ihre Hinterlegungsnummern die folgenden Stämme als Beispiele genannt: Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404), Streptomyces albogriseolus Benedict, Shotwell et Pridham (NRRL B-1305), Streptomyces purpurascens Lindenbeim (NRRL B-1454), Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici (ATCC-13405), Helminthosporium sigmoideum var. irregulare Cralley et Tullis (ATCC-13406), Bacillus brevis Migula emend. Ford (ATCC-8185), Aspergillus elegans Gasperini (ATCC-13829), Botryosphaeria ribis chromogena G. et C. (ATCC-13834), Chaetomidium japonicum Saito et Okazaki (ATCC-13835), Glomerella cingulata (Stomem.) Spauld. et v. Sehr. (ATCC-13836), Neurospora crassa Shear et Dodge (ATCC-13837), Ophiobolus miyabeanus Ito et Kuribayashi (ATCC-13839), Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf. (ATCC-13840), Sordaria fimicola (Rab.) Cesari et de Notaris (ATCC-13841) und Tilachlidium humicola Oudemans (ATCC-13842). Die Nucleinsäuren oder ihre Derivate werden durch Einwirkung einer Zuchtbrühe der vorstehend genannten Mikroorganismen oder eines Ribonuclease enthaltenden Materials, z. B. des Kulturfiltrats, der Zell- oder Mycelsuspension, des extrahierten Enzymsystems, das roh oder teilweise gereinigt sein kann, hydrolysiert. Natürlich können auch die vollständig gereinigten extrahierten Enzymsysteme verwendet werden, wenn der mit der Reinigung verbundene Aufwand in Kanf genommen wird. Für die technische Produktion ist jedoch die Reinigung zu schwierig durchzuführen.
Die vorstehend genannten Mikroorganismen werden auf einem Nährboden gezüchtet. Der Nährboden kann fest oder flüssig sein, jedoch wird die flüssige Form zur technischen Durchführung des Verfahrens bevorzugt. Der Nährboden muß gewöhnlich die Nährstoffe für die Mikroorganismen enthalten, z. B. assimilierbaren Kohlenstoff enthaltende Stoffe, digerierbaren Stickstoff enthaltende Stoffe und vorzugsweise anorganische Substanzen, Vitamine, Spuren-. elemente, wachstumsfördernde Faktoren usw. Diese Nährstoffe können aus natürlichen Quellen stammen oder synthetisch hergestellt sein. Als Kohlenstofflieferanten eignen sich beispielsweise Glucose, Lactose, Stärke, Dextrin, Maltose. Geeignete Stickstofflieferanten sind beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Casein, Gluten, Reiskleie, Aminosäuren, Harnstoff, Ammoniumsalze. Als anorganische Nährstoffe eignen sich beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumnitrat, Calciumcarbonat, Magnesiumsulf at. Durch die Behandlung der Ribonuclease mit den niederen aliphatischen Alkoholen wird diePhosphomonoesterase praktisch deaktiviert. Als Alkohole eignen sich beispielsweise Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, Amylalkohol, Isoamylalkohol. Im allgemeinen genügt die Zugabe nur eines Alkohols, jedoch können gegebenenfalls auch zwei oder mehr gleichzeitig verwendet werden. Sie werden in einer Menge von 1 bis 30 Gewichtsprozent dem Nährboden zugesetzt, jedoch genügen im allgemeinen 2 bis 5 Gewichtsprozent, um den Zweck zu erreichen.
Eine besondere Möglichkeit der Erfindung besteht darin, daß man die Hydrolyse mit einer die Ribonuclease und den aliphatischen Alkohol enthaltenden Mischung durchführt, die auf Temperaturen von 35 bis 60°C bei pH-Werten von 3,5 bis 5,0 erhitzt worden ist. Die Dauer dieser Erhitzung beträgt dabei mehrere Sekunden bis zu einigen Stunden je nach dem pH-Wert, der Temperatur, der Art des Mikroorganismus, dem Medium, in dem die Enzyme gebildet werden, usw., jedoch liegt sie gewöhnlich unter 10 Minuten. Auch bei Temperaturen unter 35°C, jedoch oberhalb von etwa 15°C, ist eine ziemlich gute Wirkung festzustellen, wenn das Medium, in dem die Enzyme gebildet werden, eine oder mehrere Stunden bei dem genannten pH-Wert gehalten wird.
Man kann das neue Verfahren weiterhin auch dadurch abwandeln bzw. wirksamer gestalten, daß man zusätzlich die Bebrütung in Gegenwart von Metallionen, wie Chrom-, Mangan-, Eisen-, Kobalt- und Nickelionen, durchführt, wie es für die Mitverwendung dieser Phosphomonoesterasehemmstoffe allein an sich schon beschrieben worden ist.
Die Hydrolyse wird durchgeführt, indem man das auf die beschriebene Weise erhaltene enzymhaltige Gemisch mit dem Ausgangsmaterial, wie Nucleinsäure, Deoxyribonucleinsäure oder Deaminonucleinsäure, umsetzt. Weitere geeignete Ausgangsmaterialien sind in ihrem Grundgerüst modifizierte Derivate dieser Säuren, durch partielle Hydrolyse von Nucleinsäuren oder deren Derivaten erhaltene Hydrolysate, die durch Einwirkung von Alkalien oder Enzymen, die Nucleinsäuren partiell zu hydrolysieren vermögen, hergestellt sind, Gewebe von Organismen, Oligonucleotide oder daraus erhaltene Stoffe, die die vorstehend genannten Nucleinsäuren oder ihre Derivate enthalten. Zweckmäßig werden gewöhnlich Muskeln und Eingeweide von Tieren, wie Fisch, Tintenfisch, Zuchtbrühen von Mikroorganismen, wie Hefe, verwendet. Diese Ausgangsstoffe können roh oder getrocknet, pulverförmig oder zu Pasten oder Stücken verarbeitet sein. Im allgemeinen ist es zweckmäßig, diese Pulver, Pasten oder Stücke in einem Reaktionsmedium zu suspendieren oder mit einem Lösungsmittel zu extrahieren, die Suspension bzw. Lösung mit dem die Ribonuclease enthaltenden Gemisch zu mischen und dann das Gemisch beim gewünschten pH-Wert und bei geeigneter Temperatur zu halten. Als Lösungsmittel für die Hydrolyse verwendet man im allgemeinen Wasser, dem Säuren, Basen und Salze sowie die obengenannten niederen aliphatischen Alkohole zugesetzt sind. Vorzugsweise wird die Hydrolyse bei Temperaturen von 30 bis 50°C in einem schwach sauren bis schwach alkalischen Medium durchgeführt. Die Reaktionszeit ist verschieden je nach der Art des Ausgangsmaterials, des die Ribonuclease enthaltenden Gemisches, des Reaktionsmediums und der Reaktionstemperatur. In jedem Fall wird die Reaktion so lange durchgeführt, bis sich die gewünschten 5'-Nucleotide bis zu einer maximalen Konzentration angereichert haben.
In den folgenden Vergleichsversuchsberichten und Beispielen beziehen sich alle Prozentsätze auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben. Die Temperaturen sind sämtlich unkorrigiert. Die Zahlen und Abkürzungen hinter den Bezeichnungen der Mikroorganismen sind die jeweiligen Hinterlegungsnummern der Stämme beim Northern Utilization Research Branch of US. Department of Agriculture, Peoria, 1l1., USA. (NRRL), oder bei der American Type Culture Collection, Washington, USA. (ATCC).
Die Wirkung der erfindungsgemäß als Phosphomonoesterasehemmstoffe zugesetzten niederen aliphatischen Alkohole wird aus dem folgenden Vergleichsversuch 1 ersichtlich Vergleichsversuch 1 Mikroorganismen der Art Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404) werden in ein wäßriges Medium inkubiert, das 2 °/o Glykose, 2 °/o lösliche Stärke, 2 °/o Maisquellwasser, 3 °/o Sojabohnenmehl, 0,10/, Ammoniumsulfat, 0,05 °/o Magnesiumsulfat (MgS04 - 7 H20), 0,3 °/o Calciumcarbonat und 0,130/, Nickelsulfat enthält. Die Inkubationszeit beträgt 24 Stunden. Nach der Inkubation werden 30/0 n-Butanol - bezogen auf die Kulturlösung - dieser Lösung zugesetzt, und das Ganze wird sorgfältig verrührt. Die Lösung wird dann mit verdünnter Schwefelsäure auf den pH-Wert von 4,1 eingestellt und bei 52°C 1 Minute gehalten. Danach wird so schnell wie möglich der pH-Wert wieder in den Bereich von 7 gebracht und die Lösung gekühlt.
10 Volumteile einer Desoxyribonucleinsäurelösung - hergestellt durch Auflösen von Desoxyribonucleinsäure aus Lachsrogen in Wasser in einer Konzentration von 0,8 °/o unter Einstellen eines pH-Wertes von 9,0 und unter Zusatz von 1,8 °/o Ammoniumchlorid, bezogen auf die Lösung - werden mit 5 Volumteilen der vorher beschriebenen Mikroorganismenlösung versetzt. Das Gemisch wird zunächst auf den pH-Wert 9,0 eingestellt und bei 42°C 6 Stunden stehengelassen. Der pH-Wert des Gemisches beträgt dann etwa 9. Im so erhaltenen Reaktionsgemisch werden die folgenden Ausbeuten (bezogen auf die theoretische Ausbeute) an 5'-Nucleotiden erhalten: Desoxy-5'-adenylsäure 80 °/o, Dexoxy-5'-cytidylsäure 81 °/o, Dexoxy-5'-guanylsäure 840/, und Desoxy-5'-thymidylsäure 940/0.
Wird das Verfahren wiederholt, jedoch auf den Zusatz von n-Butanol zur Kulturlösung verzichtet, dann betragen die entsprechenden Ausbeuten der genannten Verbindungen nur 48, 53, 58 bzw. 600/".
Die überlegene Wirkung der erfindungsgemäß mitverwendeten niederen aliphatischen Alkohole als Phosphomonoesterasehemmstoffe im Vergleich zu den im Stand der Technik schon beschriebenen phenolischen Verbindungen wird aus dem folgenden Vergleichsversuch 1I ersichtlich: Vergleichsversuch 1I Mikroorganismen der Art Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404) werden in ein wäßriges Medium inkubiert, das 20/, Glykose, 20/0 lösliche Stärke, 20/, Maisquellwasser, 3 °/o Sojabohnenmehl, 0,10/, Ammoniumsulfat, 0,05 °/o Magnesiumsulfat, 0,3 °/o Calciumcarbonat und 0,13 °/o Nickelsulfat enthält. Die Inkubationszeit beträgt 24 Stunden. Nach der Inkubation wird 1 % n-Butanol - bezogen auf die Menge an Kulturlösung - dieser Lösung zugesetzt und das Ganze sorgfältig verrührt. Die Lösung wird dann mit verdünnter Schwefelsäure auf den pH-Wert von 4,1 eingestellt und bei 52°C für 1 Minute gehalten. Danach wird so schnell wie möglich der pH-Wert wieder in den Bereich von 7 gebracht und die Lösung gekühlt.
10 Volumteile einer Desoxyribonucleinsäurelösung - hergestellt durch Auflösen von Desoxyribonucleinsäure aus Lachsrogen in Wasser in einer Konzentration von 0,8 °/o unter Einstellen eines pH-Wertes von 9,0 und unter Zusatz von 1,8 °/o Ammoniumchlorid, bezogen auf die Lösung - werden mit 5 Volumteilen der vorher beschriebenen Mikroorganismenlösung versetzt. Das Gemisch wird zunächst auf den pH-Wert 9,0 eingestellt und bei 42'C 6 Stunden stehengelassen. Der pH-Wert des Gemisches beträgt dann etwa 9. Im so erhaltenen Reaktionsgemisch werden die folgenden Ausbeuten (bezogen auf die theoretische Ausbeute) an 5'-Nucleotiden erhalten: Desoxy-5'-adenylsäure 78 °/a, Desoxy-5'-cytidylsäure 82 °/o, Desoxy-5'-guanylsäure 86 °/o und Desoxy-5'-thymidylsäure 950/,.
Wird das Verfahren wiederholt, jedoch so, daß man für n-Butanol Phenol einsetzt, dann betragen die entsprechenden Ausbeuten der genannten Verbindungen nur 61, 64, 71 bzw. 73 0/0. Beispiel 1 In einem wäßrigen Medium, das aus 1 °/o Glucose, 10/0 löslicher Stärke, 111/(, Maisquellwasser, 0,501, Sojabohnenmehl, 0,10/, Ammoniumsulfat, 0,05 °/o Magnesiumsulfat (Heptahydrat), 0,3 °/o Calciumcarbonat, 0,028 °/o Nickelsulfat und Wasser besteht und auf pH 7,0 eingestellt ist, wird Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404) 24 Stunden bebrütet. Nach der Bebrütung werden 3 °/o n-Butanol, bezogen auf das Kulturmedium, zugegeben, und das Kulturmedium wird gut gerührt. Die Nährflüssigkeit wird dann auf pH 4,1 eingestellt und 1 Minute bei 50°C stehengelassen. Danach wird der pH-Wert des Mediums erneut möglichst schnell auf 7 eingestellt, während das Medium gekühlt wird.
Zu 10 Volumteilen einer Hefesuspension, die 10°/0 Trockenhefe enthält, werden 1,5 Volumteile des auf die beschriebene Weise erhaltenen Kulturmediums gegeben. Das Gemisch wird zunächst auf pH 9,0 eingestellt und 12 Stunden bei 42°C stehengelassen, worauf der pH-Wert des Gemisches etwa 7 beträgt. Im Reaktionsgemisch sind 5'-Inosinsäure in einer Menge von 940f, und 5'-Guanylsäure in einer Menge von 92 °/o der Theorie enthalten.
Wird kein n-Butanol zum Nährmedium gegeben, betragen die Ausbeuten an 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure nur 67 und 66 °/o.
Beispiel 2 In einem wäßrigen Medium, das aus 20/, Glucose, 2°/0 löslicher Stärke, 2°/o Maisquellwasser, 3°/o Sojabohnenmehl, 0,1 °/o Ammoniumsulfat, 0,05 % Magnesiumsulfat (Heptahydrat), 0,311/0 Calciumcarbonat, 0,130/() Nickelsulfat und Wasser besteht und auf pH 7,0 eingestellt ist, wird Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404) 24 Stunden bebrütet. Nach der Bebrütung werden 311/, n-Butanol, bezogen auf die Menge des Mediums, zugegeben, worauf das Medium gut gerührt wird. Es wird dann auf pH 4,1 eingestellt und 1 Minute bei 50°C stehengelassen. Anschließend wird der pH-Wert möglichst schnell wieder auf etwa 7 gebracht, während das Medium gekühlt wird.
Zu 10 Teilen einer Hefesuspension, die 100/, Trockenhefe enthält, wird 1 Volumteil des auf die beschriebene Weise erhaltenen Kulturmediums gegeben. Das Gemisch wird zunächst auf pH 9,0 eingestellt und 12 Stunden bei 42°C stehengelassen, worauf der pH-Wert des Gemisches etwa 7 beträgt. Das Reaktionsgemisch enthält 5'-Inosinsäure in einer Ausbeute von 97 °/o und 5'-Guanylsäure in einer Ausbeute von 940/, der Theorie. Beispiel 3 Zu einem Kulturmedium, das auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise erhalten wurde, werden 3 °/o n-Butanol (bezogen auf die Menge des Mediums) gegeben, worauf gut gerührt wird. Das Medium wird mit Schwefelsäure auf pH 3,9 eingestellt und 1 Minute bei 50°C stehengelassen. Anschließend wird der pH-Wert möglichst schnell wieder auf etwa 7 gebracht, während das Medium gekühlt wird.
Zu 10 Volumteilen einer Hefesuspension, die 10 °/o Trockenhefe enthält, wird 1 Volumteil des vorstehenden Kulturmediums gegeben. Das Gemisch wird zunächst auf pH 9,0 eingestellt und 9 Stunden bei 42°C stehengelassen, worauf der pH-Wert etwa 7 beträgt. In dem so erhaltenen Reaktionsgemisch sind 5'-Guanylsäure und 5'-Inosinsäure in Ausbeuten von 90 und 92 °/o der Theorie enthalten. Beispiel 4 Zu dem gemäß Beispiel 2 hergestellten Kulturmedium von Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404) werden 3 °/o Isoamylalkohol (bezogen auf die Menge des Kulturmediums) gegeben, worauf gut gerührt wird. Das Medium wird dann auf pH 4,1 eingestellt und 1 Minute bei 50°C stehengelassen. Anschließend wird der pH-Wert des Mediums möglichst schnell wieder auf etwa 7 gebracht, während das Medium gekühlt wird.
Zu 10 Volumteilen einer Hefesuspension, die 10 °/o Trockenhefe enthält, wird 1 Volumteil des obengenannten Kulturmediums gegeben. Das Gemisch wird zunächst auf pH 9,0 eingestellt und 12 Stunden bei 42°C stehengelassen, worauf der pH-Wert des Gemisches etwa 7 beträgt. In dem so erhaltenen Reaktionsgemisch sind 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure in Ausbeuten von 92 bzw. 910/, der Theorie enthalten.

Beispiel s Das auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellte Kulturmedium von Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404) wird in drei Teile geteilt. Ein Teil dieses Mediums wird als solches als Enzymlösung A verwendet. Der zweite Teil wird auf pH 4,1 eingestellt, 1 Minute bei 50°C stehengelassen und dann wieder auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt, während das Medium gekühlt wird. Dieser Teil des Mediums wird als Enzymlösung B bezeichnet. Der dritte Teil des Mediums wird wie im Beispiel 1 behandelt, d. h. mit n-Butanol versetzt und der Wärmebehandlung bei pH 4,1 unterworfen. Dieser Teil wird als Enzymlösung C bezeichnet. Jeweils 1 Volumteil der Enzymlösungen A, Bund C wird zu 10 bzw. 5 Volumteilen einer Hefesuspension gegeben, die 10 °/o Trockenhefe enthält. Die Gemische werden wie im Beispiel 1 4 Stunden stehengelassen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Enzym- Verhältnis von Ausbeuten in °/o der Theorie

lösung Hefesuspension 5'-Inosin- j 5'-Guanyl-

zu Enzymlösung säure 1 säure

A 10: 1 16 1 15

5 : 1 17 17

B 10: 1 35 33

5 : 1 38 34

C 10: 1 65 66

5 : 1 73 71

Beispiel 6 Zu dem wie im Beispiel 1 erhaltenen Kulturmedium von Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici (ATCC-13404) werden die in der nachstehenden Tabelle genannten niederen aliphatischen Alkohole gegeben. Das Kulturmedium wird dann entweder sofort oder nach 1 Stunde bzw. nach 2 Stunden der Wärmebehandlung bei pH 4,1 unterworfen. Die behandelten Kulturmedien werden zu einer wäBrigen Suspension von Trockenhefe gegeben. Die Gemische werden auf pH 9,2 eingestellt und 7 Stunden bei 42°C stehengelassen. Folgende Ausbeuten an 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure werden in den einzelnen Gemischen erhalten:

Dem Kulturmedium zugesetzte Alkoholmenge

3 Volumprozent 1 5 Volumprozent 1 7 Volumprozent

Zeit zwischen Alkoholzugabe und Wärmebehandlung, Stunden

0 1 2 I 0 I 1 2 I 0 1 2

n-Propanol ....................... 73

Isopropanol....................... 71

Isobutanol ........................ 50 62 65 57 60 76 80 70 83

n-Butanol ........................ 80 83 90 77 83 78 70 72 71

Isoamylalkohol.................... 64 85 72 69 87 77 70 69 59

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Hydrolyse von Nucleinsäuren, Oligonucleotiden oder deren Mischungen unter Verwendung von durch Behandlung mit Phosphomonoesterasehemmstoffen modifizierten Ribonucleasen aus Ribonuclease bildenden Mikroorganismen zu einem Gemisch von 5'-Nucleotiden, d a d u r c h gekennzeichnet, daB man die Hydrolyse mit einer Ribonuclease durchführt, die durch Zusatz von 1 bis 30 Gewichtsprozent eines niederen aliphatischen Alkohols, bezogen auf die Ribonuclease enthaltende Mischung, vor der Zugabe der zu hydrolysierenden Ausgangsstoffe modifiziert worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse mit einer die Ribonuclease und den aliphatischen Alkohol enthaltenden Mischung durchführt, die auf Temperaturen von 35 bis 60°C bei pH-Werten von 3,5 bis 5,0 erhitzt worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da.ß man als niederen aliphatischen Alkohol Butanol verwendet. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Auslegeschrift Nr. 1130 785; französische Patentschriften Nr.1 255 334, 1295 681, 1314200.