DE1442260C - Verfahren zur Herstellung von 5-Phospho-D-ribosyl-1-pyrophosphat - Google Patents

Description

bindungen wurden durch Zentrifugieren entfernt. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde durch eine mit am Anmeldetag der vorliegenden Erfindung unter dem Handelsnamen »Dowex-1« bekannten Ionenaustauscher, in der Ameisensäureform, beschickte Säule gegeben, wobei die Ribosephosphate adsorbiert wurden. Sodann wurde in der angegebenen Reihenfolge mit 0,2molaren, 0,4molaren und schließlich 0,5molaren Natriumformiat-Pufferlösungen (pH = 5,0) eluiert.

Die PRPP war in dem mit 0,5molarer Natriumformiat-Pufferlösung erhaltenen Eluat enthalten. Die einzelnen Fraktionen wurden dann durch eine Säule gegeben, die mit am Anmejdetag der vorliegenden Erfindung unter dem Handelsnamen »Diaion SK Nr. 1« bekannten Ionenaustauscher (Η-Form) beschickt war, auf pH = 7,0 neutralisiert und sodann unter vermindertem Druck eingeengt.

Das Konzentrat wurde mit einer kleinen Menge Aktivkohle behandelt und der pH-Wert mit Hilfe von Natriumhydroxyd auf 8,3 eingestellt. Zu dem auf diese »o Weise behandelten Konzentrat wurden 20%ige Bariumacetatlösung in einer Menge entsprechend dem l,2fachen der berechneten Menge und Alkohol (4fache Menge) zur Abscheidung des Bariumsalzes der PRPP gegeben. Die Abscheidungen wurden unter verminder- as tem Druck getrocknet, wobei PRPP in einer Ausbeute von 41,2 g — berechnet als wasserfreies Bariumsalz — erhalten wurde.

Beispiel 2

30

Von Micrococcus glutamicus ATCC 14305, Escherichia coli ATCC 14621, Aerobacter aerogenes ATCC 14304, Bacillus subtilis ATCC 14618 und Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15137 wurden wie im Beispiel 1 beschriebene Impfkulturen hergestellt.

Jeweils 40 ml eines Fermentationsmediums der unten angegebenen Zusammensetzung wurden sterilisiert und mit 10 Volumprozent einer der Impfkulturen angeimpft. Dann wurde 48 Stunden bei 28° C als Schüttelkultur gezüchtet. PRPP wurde in den in der Tabelle angegebenen Mengen in dem Fermentationsmedium angereichert.

Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

Glucose 10% .

Harnstoff 0,4 °/₀

NH₄Cl 0,2%

K₂HPO₄ 1,0%

KH₂PO₄ 1,0%

MgSO₄-7H₂O 0,6%

Hefeextrakt 0,4%

Pepton 0,2%

FeSO₄-7H₂O 0,002%

pH-Wert vor der Sterilisation 7,8

Impfkultur

Micrococcus glutamicus ATCC14 305

Escherichia coli ATCC 14621

Aerobacter aerogenes ATCC 14304 ..

Bacillus subtilis ATCC 14618 ...

Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 15137

PRPP

(mg/ml)

5,0 4,9 7,0 3,2

8,0

Claims (1)

1 2

Patentanspruch- Caseinaminosäuren, Fischextrakte u. dgl. und anorganische Salze, z. B. Phosphate wie Kaliumphosphat

Verfahren zur Herstellung von 5-Phospho-D- und Ammoniumphosphat, Magnesiumsalze wie Maribosyl-1-pyrophosphat durch Züchten von D-Ribo- gnesiumchlorid und andere Salze, die für das Wachssephosphate bildenden Mikroorganismen in einem 5 turn der Mikroorganismen unentbehrliche Elemente assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, wie z. B. Salze des Kaliums, des Calciums, und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium, des Eisens, des Mangans, des Zinks, des Kupfers, des das Phosphationen in einer Menge von 0,2 bis 2% Bors und des Molybdäns.

und Magnesiumionen in einer Menge von 0,01 bis Die Phosphat- und Magnesiumionen sind in dem

0,2% enthält, dadurch gekennzeich-io Nährmedium in Konzentrationen von 0,2 bis 2,0°/₀

net, daß als D-Ribosephosphate bildende Mikro- bzw. 0,01 bis 0,2°/₀ enthalten. Falls das Wachstum

Organismen Micrococcus glutamicus ATCC 14995, eines Mikroorganismus durch die hohe Konzentration

Micrococcus glutamicus ATCC 14305, Escherichia dieser Salze im Nährmedium gehemmt wird, können

coli ATCC 14621, Aerobacter aerogenes ATCC diese in kleinen Mengen während der Fermentation

14304, Bacillus subtilis ATCC 14618 oder Brevi- 15 zugegeben werden.

bacterium ammoniagenes ATCC 15137 eingesetzt Die Fermentation wird bei Temperaturen von

werden. 20 bis 4O⁰C unter aeroben Bedingungen, z. B. als

Schüttel- oder Submerskultur unter Belüftung und

Rühren, durchgeführt. Nach 2- bis 7tägigem Züchten

20 haben sich überraschend hohe Mengen an 5-Pospho-

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren D-ribosyl-1-pyrophosphat (PRPP) in der Fermentazur Herstellung von 5-Phospho-D-ribosyl-l-pyrophos- tionsflüssigkeit und in den Zellen der Mikroorganisphat, bei dem bestimmte D-Ribosephosphate bildende men gebildet.

Mikroorganismen gezüchtet werden. Nach der Beendigung der Fermentation kann das In dem deutschen Patent 1 295 505 wird ein Verfah- »5 5-Phospho-D-ribosyl-l-pyrophosphat in der in den ren zur biotechnischen Herstellung von D-Ribose-5- Beispielen beschriebenen Weise durch Absorption an phosphat, bei dem Micrococcus glutamicus ATCC einem geeigneten starkbasischen Ionenaustauscher und 15455 oder Brevibacterium Ammoniagenes ATCC fraktionierte Eluierung gewonnen werden.
6872 in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, In den folgenden Beispielen ist die Durchführung des vorgeschlagen und aus J. Gen. Appl. Microbiol. 30 erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.
(Tokio), 9, S. 457—8 (1963), CA. 61 (1964), 12349c, Die angegebenen Prozentzahlen sind Gewichtsist bekannt, daß durch Züchten eines nicht identifizier- Volumprozente,
ten Mikroorganismus in der Fermentationsflüssigkeit B e i s d i e 1 1
Ribose-5-phosphat und geringe Mengen 5-Phospho-

D-ribosyl-1-pyrophosphat angereichert werden können. 35 300 ecm eines sterilisierten wäßrigen Nährraediums, Ein zur industriellen Durchführung geeignetes Ver- das 2°/₀ Glucose, 1% Pepton, l°/₀ Fleischextrakt, fahren zur biotechnischen Herstellung von 5-Phospho- 0,25% NaCl und 0,2% Harnstoff enthielt, wurden D-ribosyl-1-pyrophosphat ist bisher nicht bekannt- in einem 2-1-Erlenmeyerkolben mit einer Kultur von geworden. Micrococcus glutamicus ATCC 14995 beimpft. Dann Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur 40 wurde 24 Stunden bei einem pH-Wert von 7,5 und Herstellung von 5-Phospho-D-ribosyl-l-pyrophosphat einer Temperatur von 28° C gezüchtet,
durch Züchten von D-Ribosephosphate bildenden Die so erhaltene Impfkultur wurde zum Beimpfen Mikroorganismen in einem assimilierbare Kohlen- des Fermentationsmediums verwendet. Das Fermentastoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze tionsmedium wurde mit 10 Volumprozent Impfkultur, enthaltenden Nährmedium, das Phosphationen in 45 bezogen auf die Menge des Fermentationsmediums, einer Menge von 0,2 bis 2,0 % und Magnesiumionen in beimpft. Das verwendete Fermentationsmedium hatte einer Menge von 0,01 bis 0,2 % enthält, dadurch ge- die folgende Zusammensetzung.

kennzeichnet, daß als D-Ribosephosphate bildende ς.,_Λτ,,._η., _1So/

._ ... . ... . . . rr^^-i^^ oaccnarose υ in

Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC /_ΝΗ \ vr\ 0 2°/

14995, MicTococcus glutamicus ATCC 14305, Esche- 50 KH PO " ". 0 8 °/°

richia coli ATCC 14621, Aerobacter aerogenes ATCC _κ ηρο* 08 °/°

14 304, Bacillus subtilis ATCC 14 618 oder Brevibacte- MgSO · 7HO 66 ⁰I

rium ammoniagenes ATCC 15137 eingesetzt werden. Biotin* ² 30v/l

Das erfindungsgemäß erhältliche 5-Phospho-D-ribo- Perjton 0 2 °/

syl-1-pyrophosphat ist als biochemisches Reagens und 55 FeSO · 7H 0 0002°/

als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Nucleo- ^{4 2} '

tiden wertvoll. pH-Wert: Eingestellt auf 7,3 vor der Sterilisation

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Die Fermentation wurde unter Verwendung von 3 I

Nährmedium entspricht dem für die Herstellung von des Fermentationsmediums, die in einem 5-1-Fermen-

D-Ribosephosphaten bekannten Nährmedium. Es ent- 60 tationsbehälter sterilisiert worden waren, als Submers-

hält hierfür geeignete Mengen an Kohlenstoffquellen Züchtung unter Belüften und Rühren durchgeführt,

wie z. B. Glucose, Saccharose, Saccharide, Stärke, Während des Züchtens wurde der pH-Wert bei 7,0

Stärkehydrolysate, Melassen, Gluconate, Acetate usw., gehalten.

Stickstoffquellen, z. B. anorganische Stickstoffquellen Zu 2 1 des Filtrats, das nach dem Abtrennen der

wie Ammoniumsalze und Nitrate oder organische 65 Zellen von dem vergorenen Fermentationsmedium

Stickstoffquellen wie Harnstoff, Aminosäuren, Peptide nach einer Züchtungszeit von 48 Stunden bei 34⁰C er-

und solche Stickstoffquellen enthaltenden Zuberei- halten worden war, wurde Calciumhydroxyd gegeben,

tungen wie z. B. Pepton, Flefeextrakt, Fleischextrakt, und die abgeschiedenen anorganischen Phosphorver-