DE2054785C3 - Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5 '-diphospho-cholin - Google Patents

Description

bei Temperaturen von 20 bis 45 ⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 9, und Isolierung des Cjtidin-5'-diphospho-cholins aus der Gärmaische, d adurch gekennzeichnet, daß maa ede Enzyme von

Brettanomyces petrophilum n. sp ATCC 20 224,

Saccharomyces rouxii AMS 1024,

Saccharomyces carlsbergensis IAM 4206, Candida utilis IAM 4220,

Candida petrophiium n. sp ATCC 20 226,

Torulopsis petrophilum n. sp ATCC 20 225,

Torulopsis Candida IFO 0768,

Zygosaccharomyces soja IFO 0495,

Debaryomyces handenii IFO 0023, Endomycopsis chodati (N) WICKERMAN und BURTON OUT 6270
Lipomyces lipoferus IFO 0673, Eridomyceshordei IFO 0104 Sporobolomyces roseus IFO 1037, Pichia miso IFO 0193,
Hansenula jadini JF° 0?87,
Trigoaopsis variabilis IFO 0671, Cryptococcus albidus IAM 4830 Shizosaccharomyces pombe AMS 1022, Rhodotorula glutinis IFO 0389. Microbacterium ammomaphilum Al CC

Corynebacterium petrophilum ATCC 19 080. Brevibacterium ammomagenes ATCC 6871, Aspergillus fumigatus IAM 4040, Penicillium chrysogenum IFO 4626, Rhizopus nigricans IFO 478 oder Mucor javanicus IAM 6087

einsetzt. , , ,

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vergärung in einem Reaktionsmedium durchführt, das in 1 Lner 5 bis mMol der Cytosinverbindung, 20 bis 200 mMol der Cholinverbindung, 0,1 bis 0,5 Mol Phosphationen 2 bis 15 Prozent (Gew./Vol.) Kohlenhydrate und 0 01 bis 0,05 Mol Magnesiumsalz enthält.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man ein Reaktionsmedium verwendet, das Toluol, Äthanol, Acetaldehyd, Natnumbicarbonat, Natriumfluorid, Äther, Borate und/oder grenzflächenaktive Verbindungen enthalt.

Bekanntlich ist Cytidin-S'-diphospho-cholin (CDP-Cholin) ein Coenzym des FettstolTwechsels. Es wird nicht nur für die Biosynthese des Lecithins benötigt, sondern es spielt auch beim Aufbau von Plasmalogen in Leber und Gehirn eine Rolle. Der bei Kopfverletzun-

NH_a

gen beobachtete erniedrigte Phosphohpidgehalt und erniedrigte Ascorbinsäuregehalt wird durch intracarotiale Injektion von CDP-Cholin normalisiert. Diese Verbindung weist die folgende Strukturformel auf:

/S-H

C-H

O'

~/n h\'

V\ ι ι /V ο ο

CH₈ — O — P — O — P — O — CH₂ — CH₂ — N®(CH₃)₃ OH Ο^Θ

OH OH

Cytidin-S'-diphospho-cholin kann z. B. aus Hefe (Science, Band 124 [1956], S. 81) oder synthetisch (Journal of Biological Chemistry, Band 222 [1956], S. 185 bis 191; Chem. pharmac. Bull. [Tokyo], [1962], S. 231; JA-PS 6540/64; zitiert nach Chem. Abstr., 61 [1964], Spalte 13 406) gewonnen werden. Die Herstellung von CDP-Cholin im Großmaßstab bereitet jedoch Schwierigkeiten, da die bekannten Verfahren zu seiner Herstellung nur geringe Ausbeuten ergeben und deshalb zu unerwünscht hohen Herstellungskosten führen. Aus diesem Grunde hat CDP-Cholin trotz seines unbestrittenen Wertes in der Praxis bisher nur geringe Bedeutung.

Nach einem älteren, nicht vorveröffentiichten Vorschlag wird Cytidin-5'-diphospho-cholin dadurch hergestellt, daß man bei Temperaturen von etwa

20

bis 55⁰C ein wäßriges Reaktionsmedium vergärt, das

a) Cholin und/oder Phosphcrylcholin oder ein funktionelles Derivat dieser Verbindungen,

b) Cytidin, Cytidin-S'-monophosphat, Cytidin 5'-diphosphat und/oder Cytidin-S'-triphosphat,

. c) Enzyme von

Brevibacterium ammoniagenes A.T.C.C. 6872 Escherichia coli A.T.C.C. 21 148, Serratia marcescens A.T.C.C. 2123, Aerobacter aerogenes A.T.C.C. 21 217, Coryr.ebacterium glutamincum A.T.C.C. 13 287, Arthrobacter simplex A.T.C.C. 1577, Micrococcus sodonensis A.T.C.C. 11 880, Pseadomonas fluorescens A.T.C.C. 21 256 Bacillus subtilis A.T.C.C. 15 512, Nocardia globeruia A.T.C.C. 21 022, Streptomyces ambofaciens A.T.C.C.15 154, Penicillium chrysogenum A.T.C.C. 15 241,' Aspergillus terreus A.T.C.C. 1012, '

Aspergillus flavus A.T.C.C. 13 698, Gibberella fujikuroi A. T.C.C. 20136, Rhizopus delemar A.T.C.C. 20 134. Mucor javanicus A.T.C.C. 15 242, Saccaromyces cerevisiae A.T.C.C. 15 248, Saccharomyces lactis A.T.C.C. 12 425, Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549, Zygosaccharomyccs major (Synonym Saccaromyces rouxii) A.T.C.C. 15 249, Kloeckera africana A.T.C.C. 16 512 oder Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058,

d) Phosphationen,

e) Magnesium- und/oder Manganionen und

f) mindestens einen vergärbaren Zucker enthält und das Cytidin-S'-diphospho-cholin aus der Gärmaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überführt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von reinem CDP-Cholin zu schaffen, das gute Ausbeuten ergibt, billig ist und in industriellem Maßstab durchführbar ist. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somi den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Vergärung kann in üblichen Vorrichtungen bei Atmosphärendruck und Normaltemperatur durchgeführt werden.

Die Ausgangsmaterialien 5'-Cytidylsäure, Cytidin, Cytosin sind handelsübliche Verbindungen und könmen synthetisch hergestellt werden. Außerdem kann Cytidin durch enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäuren hergestellt werden.

Cholin wird industriell hergestellt und ist im Handel leicht erhältlich. Es kann in Form seiner Salze, z. B. als Chlorid, als Cholinphosphat (Phosphorylcholin) oder Lecithin verwendet werden. Phosphorylcholin kann durch Phosphorylierung von Cholinchlorid hergestellt werden.

Im eirfindungsgemäßen Verfahren werden Zellen der vorgenannten kultivierten Mikroorganismen, mit oder ohne physikalische oder chemische Behandlung, dem wäßrigen Reaktionsmedium zugesetzt, Die erlindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit zur Bildung von Fructosc-1,6-diphosphat aus Kohlenhydraten. Ein geeignetes Maß für die Bildung von Fructose-1,6-diphosphat ist der Verbrauch an anorganischem Phosphat in einem Standard-Nährme-

785

dium. Der Verbrauch aD anorganischem Phosphat kann nach einer Abänderung der Methode von NeubergiJ. Am. Chem. Soc, Bd. 64 [1942], S. 2722 bis 2723), die nachstehend beschrieben ist, bestimmt werden:

1 g getrocknete Zellen, 1,5 ml Wasser und 0,7 ml Toluol werden gründlich miteinander vermischt. Das Gemisch wird unter gelegentlichen Rühren etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird das Gemisch mit 5 ml einer 0,54molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 (hergestellt durch Auflösen von 120 mg KH₂PO₁ und 650 mg Na₂HPO₄ · 12H₂O in Wasser, so daß sich 5 ml Lösung ergeben) und 1 g Glucose (oder Sucrose) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird bei 30 bis 37° C stehengelassen. Proben des Reaktionsgemisches werden in Zeitabständen entnommen, und der Gehalt an anorganischem Phosphat wird quantitativ bestimmt. 1 bis 2 ml des Reaktionsgemisches werden in ein kleines Reagensglas pipettien und mit einem Tropfen Dodecylalkohol versetzt. Das Gemisch wird 3 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt. Sodann werden die ausgefällten Zellen abzentrifugiert. 0,5 ml des Überstandes werden entnommen und mit 2,0 ml einer 6prozentigen Perchlorsäure versetzt. Die ausgefällten Proteine werden abfiltriert, und im Filtrat wird der Gehalt an anorganischem Phosphat bestimmt. Das Mengenverhältnis von anorganischem Phosphat, das nach 5 bis 8 Stunden verblieben ist, zum anfänglich vorhandenen anorganischen Phosphat, multipliziert mit 100, ist das Maß für die Fähigkeit des Mikroorganismus zur Bildung von Fructose-1,6-diphosphat.

Die Mikroorganismen des erfindungsgemäßen Verfahrens verbrauchen mindestens etwa 20 Prozent, die in den Beispielen genannten Hefen-Stämme verbrauchen 40 bis 80 Prozent anorganisches Phosphat.

Die Mikroorganismen werden zuerst in üblicher Weise in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und gegebenenfalls Spuren organischer Nährstoffe enthält.

Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Sucrose, Maltose, Glycerin, Melasse, Kuhlenwasserstoffe, Carbonsäuren, wie Essigsäure, Citronensäure und Fumarsäure, und Alkohole. Als Alkohole kommen gesättigte primäre Alkohole mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen in Frage. Beispiele für geeignete Stickstoff quellen sind Ammoniak, Nitrate, wie Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Magnesiumnitrat und Ammoniumnitrat, Harnstoff und Ammoniumsalze. Als anorganische Verbindungen können Salze, wie Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und andere Metallsalze, verwendet werden. Beispiele für geeignete Nährstoffe sind Maisquellwasser, Fischmehl, Pepton, Fleischextrakt und Hefeextrakt Ein typisches Beispiel für ein flüssiges Nährmedium hat folgende Zusammensetzung (pro Liter):

(Ge-.v./Vol.)

Glucose 6%

Harnstoff 0,4%

Ammoniumsulfat 0,2%

Primäres Kaliumphosphat 0,2%

Magnesiumsulfat 0,1 %

Calciumchlorid 0,01 %

Maisquellwasser 0,2%

Hefeextrakt 0,05%

Wasser Rest

20

Die optimalen Züchtungsbedingungen hängen vom verwendeten Mikroorganismus ab. Der pH-Wert des Nährmediums wird auf den optimalen Wert für den jeweils verwendeten Mikroorganismus eingesicüi. Im allgemeinen beträgt der optimale pH-Wert für Hefen und Pilze 3 bis 7 und für Bakterien 6 bis 8. Zum Einhalten des pH-Wertes werden Basen oder Säuien, wie Ammoniak, Natriumhydroxid, Salzsäure oder Schwefelsäure, verwendet. Die Züchtungstemperatur beträgt 25 bis 35°C und die Züchtungsdauer 1 bis 3 Tage unter aeroben Bedingungen. In das Kulturmedium kann Luft eingeleitet werden.

Die erhaltenen Zellen der Mikroorganismen werden als Enzymquelle verwendet. Das erhaltene Kulturmedium kann unmittelbar verwendet werden. Vorzugsveise werden die Zellen jedoch aus dem Kulturmedium abgetrennt und gegebenenfalls gewaschen. Das Waschen kann beispielsweise mit Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung durchgeführt werden. Die gewaschenen Zellen können in Form einer Suspension verwendet werden. Ferner können die Zellen bei niedriger Temperatur mil Aceton, Diäthyläther, Toluol, Äthanol oder einem oberflächenaktiven Mittel behandelt werden. Die Zellen können auch gemahlen werden. Es können auch getrocknete Zellen verwendet werden.

Die 5'-Cytidylsäure kann in freier Form oder in Form ihrer wasserlöslichen Salze wie der Alkalimetallsalze, beispielsweise der Natriumslaze, vorliegen.

An Stelle der 5'-Cytidylsäure, können Cytosin oder Cytidin verwendet werden. Die optimale Konzentration der Cytosinverbindung beträgt 5 bis 50 mMol/Liter.

Das Cholin kann beispielsweise durch seine Salze wie Cholinchlorid, Cholinphosphat (Phosphorylcholin) oder Lecithin (Phosphatidylcholin) ersetzt werden. Die bevorzugte Konzentration der Cholinverbindung beträgt 20 bis 200 mMol/Liter.

Beispiele für assimilierbare Kohlenhydrate sind Glucose, Sucrose, Fructose und Maltose, Sie werden im Reaktionsmedium in einer Menge von 2 bis 15 Prozent (Gewichts/Volum) verwendet.

Beispiele für Phosphationen liefernde Verbindungen sind anorganische Phosphate, wie NaHumphosphat, primäres KaHumphosphat und sekundäres Kaliumphosphat. Sie werden in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 Mol/Liter verwendet.

Beispiele für Magnesiumionen liefernde Verbindungen sind Magensiumsulfat und -nitrat und -chlorid. Magnesiumionen spielen eine wichtige Roilebeibiologischen Reaktionen und nehmen an der Bildung des CDP-Cholins teil. Die Konzentration an Magnesiumionen beträgt 0,01 bis 0,05 Mol/Liter.

Ferner können im Reaktionsmedium noch andere Verbindungen enthalten sein, wie grenzflächenaktive Verbindungen, Natriumfluorid, Borate, Kupfersalze, Natriumbicarbonat ,Äthanol, Acetaldehyd, Toluol und Äther, welche die enzymatischc Reaktion fördern. Diese Verbindungen unterdrücken die Entaminierung der Cytosinverbindungen. Vorzugsweise werden nichtionische grenzflächenaktive Verbindungen verwendet, wie Polyoxyäthylen-sorbitan-monoalkylester, Sorbilan-monoalkylestcr und Polyoxyäthylensorbit-alkylester. Beispiele für Borate sind Natriumborat, Kaliumborat und Magnesiuniborat. Man kann auch andere Metallsalze verwenden, solange sie nicht im Reaktionsmedium unlösliche Phosphate bilden.

Ein typisches Beispiel für ein Reaktionsmedium hat folgende Zusammensetzung (pro Liter):

785 7

5'-CytidyIsäure (oder eine
andere der angegebenen
Cytosinverbindungen) 10 bis 2OmMoI
Cholin (oder eine andere
der aneegebenen Cholin-

verbindungen) 50 bis 100 mMol

Phosphatpuffer (pH 7,5) 150 bis 250 mMol

Glucose ^4b's 8%

(Gew./Vol.)

Magnesiumsulfat 5 bis 15 mMol

Zellen 3 bis 10%

(Gew./Vol.)

Toluol ^{lbis 5}%

(Vol./Vol.)

Der pH-Wert der Lösung wird im Bereich von 6 bis 9 vorzugsweise von 7 bis 8, gehalten. Die Reaktionstemperatur beträgt 20 bis 45°C. Das Reaktionsgemisch wird schwach geschüttelt oder gerührt. Die Reaktion wird so lange fortgesetzt, bis sich die gewünschte Maximalmenge an CDP-Cholin gebildet hat. Die Umsetzung ist gewöhnlich innerhalb von etwa 15 bis 20 Stunden vollendet.

Nach beendeter Umsetzung wird das CDP-Cholin aus dem Reaktionsgemisch in an sich bekannter Weise. beispielsweise durch Ausfällen oder Adsorption an lonenaustauschharzcn, oder Aktivkohle und Eluieren oder durch Extraktion mit Lösungsmitteln isoliert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Prozenlangaben beziehen sich auf das Gewicht pro Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Ein Stamm von Brettanomyces petrophilum n. sp ATCC 20 224 wird 40 Stunden bei einem pH-Wert von 5 bis 6 und bei 30°C in einem Nährmedium aerob gezüchtet, das 6 Prozent Sucrose, 0,4 Prozent Harnstoff. 0,2 Prozent Ammoniumsulfat, 0,2 Prozent primäres Kaliumphosphat, 0,05 Prozent Magnesiumsulfat, 0,01 Prozent Calciumchlorid und 0,2% Maisquellwasser enthält. Danach wird die Kulturflüssigkeit zentrifugiert. Ausbeute 144 2 Zellen. Die erhaltenen Zellen werden mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die Zellen (120 g) werden hierauf in 2 Liter eines wäßrigen Nährmediums eingetragen, das 15 g Natrium-5'-cylidylat, 145 g Glucose ,6 g Magnesiumsulfat, 20 g primäres Kaliumphosphat, 30 g sekundäres Natriumphosphat und 5,9 g Cholinchlorid enthält. Dieses Gemisch wird 12 Stunden bei 32°C geschüttelt. Dann haben sich 7,25 g/Liter CDP-Cholin gebildet.

Das Reaktionsgernisch wird 3 Minuten auf 90'C erhitzt, die Feststoffe werden abfiltriert, entfernt und mit Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird mit dem Filtrat vereinigt und auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt. Die Lösung wird auf eine mit Aktivkohle gefüllte Kolonne gegeben. Danach wird die Kolonne mit Wasser gewaschen und mit 50%!gcm wäßrigen Äthanol, das Ammoniak enthält, eluiert. Das Eluat wird so stark eingedampft, bis es einen pH-Wert von 8 aufweist. Hierauf wird die konzentrierte Lösung auf eine mit einem stark basischen Anionenaustausch«^ des quariären Ammoniumlyps in der Chlorid-Form gefüllte Kolonne gegeben. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen und mit einem Gemisch von Salzsäure und Natriumchlorid mit ziiiidimendcm Gehalt an Natriumchlorid cluiert. Die erste Fraktion bis 10Liter, die durch Fluieren mit 0,01 η-Salzsäure erhalten wurde, enthält CDP-Cholin. Durch anschließendes

Eluieren mit 0,01 n-Salzsäure, die 0,01 n-NaC! enthält, wurden 10 Liter einer Fraktion erhalten, die 0,7 g Cytidin-5'-diphosphat (CDP) enthält. Schließlich wurde durch Eluieren mit 0,01 η-Salzsäure — 0,2 n-NaCl 10 Liter einer Fraktion erhalten, die 1,8 g Cytidin-5'-triphosphat (CTP) enthält.

Die CDP-Cholinchlorid-Fraktion wird entsalzt, indem man sie durch eine mit Aktivkohle gefüllte Kolonne hindurchgehen läßt . Die entsalzte Lösung wird mit Bariumchlorid versetzt und das CDP-Cholin in Form des Bariumsalzes ausgefällt. Hierauf wird eine wäßrige Lösung von Natriumsulfat zugegeben und das ausgefällte Bariumsulfat abfiltriert. Aus dem Filtrat wird das CDP-Cholin als Natriumsalz isoliert. Die Ausbeute beträgt 10,2 g, berechnet als freies DCP-Cholin. Aus den beiden anderen Fraktionen werden das Cytidin-5'-triphosphat (CTP) und das Cytidin-5'-diphosphat (CDP) in ähnlicher Weise isoliert.

B e i s ρ i e 1 2 ^ao

Ein Stamm von Torulopsis petrophilum n. sp ATCC 20225 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet. Danach wird die erhaltene Kulturflüssigkeit zentrifugiert. Die abzentrifugierten Zellen werden gefriergetrocknet. 80 g der gefriergetrockneten Zellen werden in 1 Liter eines wäßrigen Nährmedium eingetragen, das 7,35 g 5'-Cytidylsäure, 5,01 g Cholinphosphat, 72 g Glucose, 4 g Magnesiumsulfat, 9,8 g primäres Kaliumphosphat, 15,2 g sekundäres Natriumphosphat, 18 ml Toluol und 22 g Natriumbicarbonat enthält. Dieses Gemisch wird 8 Stunden bei 37⁰C umgesetzt, Dann haben sich 7,44 g/Liter CDP Choiin gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 5,21 g freies CDP-Cholin.

Beispiel 3

Ein Stamm von Candida petrophilum n. sp ATCC 20 226 wird 24 Stunden in 2 Liter des in Beispiel 1 verwendeten Nährmediums gezüchtet. Danach wird die erhaltene Kulturflüssigkeit in 500 ml einer 0,18 m Phosphatpufferlösung (pH 8) eingetragen, die 2,2 g Cytidin, 32 g Sucrose, 1,5 g Magnesiumsulfat, 25 ml Toluol und 2,1 g Cholinphosphai enthält. Dieses Gemisch wird 18 Stunden bei 30° C umgesetzt. Dann haben sich 0,928 g CDP-Cholin gebildet. Das Reaktionsgemisch w.rd gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 650 mg reines CDP-Cholin.

50

Beispiel 4

Ein Stamm von Saccharomyces rouxii AMS 1024 wird unter Rühren 22 Stunden bei 30^c C aerob in einem Nährmedium (pH 6 bis 7) gezüchtet, das 3 % Melasse (als Zuckerkonzentrat), 0,2% Harnstoff, 0,1 % Ammoniumsulfat, 0,1 % primäres Kaliumphosphat und0,05 % Magnesiumsulfat enthält. Danach werden aus der erhaltenen KuUurflüssigkeit die Zellen abzentrifugiert und einmal mit Wasser gewaschen. 500 ml der Zellensuspension in Leitungswasser werden mit 3,7 g Natrium-5'-cytidylat, 2,1 g Cholinchlorid, 72 g Glucose, 1,8 g Magnesiumsulfat, 4,9 g primäres Kaliumphosphat, 7,6 g sekundäres Natriumphosphat und 25 ml Äthanol versetzt und 16 Stunden bei 37⁰C umgesetzt. Dann haben sich 3,84 g CDP-Cholin gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 2,69 g CDP-Cholin.

Beispiel 5

Ein Stamm von Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15 354 wird gemäß Beispiel 3 gezüchtet. Danach werden aus der erhaltenen KuHurfliissigkeit die Zellen abzentrifugiert, in das in Beispiel 21 verwendete Nährmedium eingetragen und gemäß Beispiel 3 umgesetzt. Im Reaktionsmedium werden 1,08 g CDP-Cholin gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 760 mg CDP-Cholin.

Beispiel 6

Ein Stamm von Corynebacterium petrophilum ATCC 19 080 wird in Melasse gemäß Beispiel 4 gezüchtet. Danach werden aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit die Zellen gemäß Beispiel 4 isoliert und getrocknet. 10 g getrocknete Zellen werden in eine Lösung von 360 mg Cytosin, 15 g Glucose, 3(X) mg Magnesiumsulfat, 501 mg Cholinphosphat und 20 mg Natriumfluorid in 100 ml 0,2 molare Phoi.nhatpufferlösüng (pH 7,5) eingetragen und 24 Stunden bei 30" C umgesetzt. Dann haben sich 270 mg CDP-Cholin, 240 mg CTP und 140 mg CDP gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 190 mg freies CDP Choiin.

Beispiel 7

Ein Stamm von Zygosaccharomyces soja IFO 0495 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Danach wird die Kulturflüssigkeit mit Aceton versetzt. Die Zellen .verden isoliert und getrocknet. 50 g der erhaltenen getrockneten Zellen werden in eine Lösung von 4 g 5'-Cytidylsäure, 4,2 g Cholinphosphat. 40 g Glucose. 2.0 g Magnesiumsulfat, 10 ml Toluol und 5 ml Acetaldehyd in 600 ml 0,2molare Phosphatpufferlösung (pH 7,5) eingetragen und 16 Stunden bei 32° C unter Schütteln umgesetzt. Dann haben sich 3,68 g CDP-Cholin gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 2,58 g freies CDP-Cholin.

Beispiel 8

Ein Stamm von Mucor javanicus IAM 6087 wird 72 Stunden bei 30⁰C in einem Nährmedium (pH 6,2) unter Schütteh gezüchtet, das 5% Glucose. 0,5% Pepton, 0,5% Fleischextrakt. 0,5% Sojabohnenrulver. 0,05% Magnesiumsulfat, 0,01 % Calciumchlorid und 0,2% Kaliumnitrat enthält. Danach werden aus der Kulturflüssigkeit die Zellen abzentrifugiert und gefriergetrocknet. Die Zellen werden anschließend mit Aceton gewaschen. Ausbeute 5 g getrocknete Zellen. 5 g der Zellen werden in eine Lösung von 380 mg Natrium-S'-cytidylat, 147 mg Choiin, 4,2 g Glucose, 160 mg Magnesiumsulfat und 20 mg Natriumbicarbonat in 50 ml 0,2molare Phosphatpufferlösung (pH 7,0) eingetragen und 8 Stunden bei 37^c C umgesetzt. Dann haben sich 118 mg CDP-Cholin gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 83 mg freies CDP-Cholin.

Beispiel 9

Ein Stamm von Pichia miso IFO 0193 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Danach wird die KuUurflüssigkeit mit Aceton behandelt. Die Zellen werden isoliert und getrocknet. 25 mg der erhaltenen getrockneten Zellen werden in eine Lösung von 2,0 g 5'-Cytidylsäure, 1,4 § Cholinphosphat, 20 g Glucose, 0,9 g Magnesiumsulfat, 6 ml Toluol und 2 ml Acetaldehyd, in 300 ml 0,2mo

609 611Π78

lare Phosphatpufferlösung (pH 7,0) eingetragen und 6 Stunden bei 35°C unter Schütteln umgesetzt. Dann haben sich 1,43 g CDP-Cholin, 0,43 g CTP und 0,11 g CDP gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 1,0 g freies CDP-Cholin.

Beispiel 10

Ein Stamm von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 wird in dem in Beispiel 4 angegebenen Melasse-Nährmedium gezüchtet. Danach werden aus der Kulturflüssigkeit die Zellen abzentrifugiert und gefriergetrocknet, Ausbeute 10 g. Die getrockneten Zellen (10 g) werden in eine Lösung von 720 mg 5'-Cytidylsäure, 9,0 g Glucose, 250 mg Magnesiumsulfat un·¹ 501 mg Cholinphosphat in 100 ml 0,2molare Phosphatpufferlösung (pH 7,0) eingetragen und 8 Stunden bei 28° C umgesetzt. Dann haben sich 680 mg CDP-Cholin, 120 mg CTP und 150 mg CDP gebildet. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 480 mg freies CDP-Cholin.

Beispiel 11

Ein Stamm von Aspergillus fumigatus IAM 4040 wird gemäß Beispiel 8 gezüchtet. Danach werden die Zellen isoliert und mit Aceton gewaschen. Die erhaltenen getrockneten Zellen werden als Enzymquelle in einem Nährmedium eingesetzt, das Cytosin als Siubstrat an Stelle von 5'-Cytidylsäure enthält. Die Umsetzung wird gemäß Beispiel 8 durchgeführt. Im Reaktionsgemisch haben sich /8 mg CDP-Cholin gebildet. Nach dem Aufarbeiten gemäß Beispiel 1 werden 55 mg CDP-Cholin erhalten.

B e i s ρ i e i 12

Das Verfahren von Beispiel 1 wird unter Verwendung von 12 g Lecithin (Phosphatidyl-cholin) an Stelle von Cholinchiorid wiederholt. Ausbeute 4,18 g/Liter CDP-Cholin. Nach dem Aufarbeiten gemäß Beispiel 1 werden 5,8 g CDP-Cholin aus 2 Liter Reaklionsgemisch erhalten.

Beispiel 13

Das Verfahren von Beispiel 4 wird unter Verwendung von Debaryomyces handenii IFO 0023 an Stelle von Saccharomyces rouxii und 500 mg eines Polyoxyäthylen-sorbitan-monoalkylesters an Stelle von Äthanol wiederholt. Im Reaktionsgemisch haben sich 3,64 g CDP-Cholin gebildet. Nach dem Aufarbeiten gemäß Beispiel 1 werden 2,55 g CDP-Cholin erhalten.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diphospho-cholin durch Vergärung eines wäßrigen Reaktionsmediums, das

a) Cholin oder seine Salze, Phosphorylcholin oder Phosphatidylcholin, *°

b) 5'-Cytidylsäure oder ihre Salze, Cytidin oder Cytosin,

c) Enzyme von Mikroorganismen,

d) Phosphationen,

e) Magnesiumionen und

f) ein assimilierbares Kohlenhydrat enthält,