DE1071080B

DE1071080B - Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-zlM-steroiden, 3-Keto--44-steroiden oder deren Gemischen

Info

Publication number: DE1071080B
Application number: DENDAT1071080D
Authority: DE
Inventors: Huntington Station N. Y. Gilbert Malcolm Shulll (V. St. A.)
Original assignee: Charles Pfizer and Co Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Publication date: 1959-12-17

Description

DEUTSCHES

njoO.

P 19645 IVb/12 ο

ANMELDE TA G: 13. NOVEMBER 1957

BEKANNTMACHUNG DER ANMELDUNG UND AUSGABE DER AUSLEGESCHRIFT:

17. DEZEMBER 1959

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Dehydrierung im Kern gesättigter 3-Keto-Steroid-Verbindüngen durch Mikroorganismen der Micromonospora-Gattung, insbesondere der Micromonospora-chalcea-Art, oder durch Oxydationsenzyme, die durch diese Mikroorganismen erzeugt worden sind.

Hierbei können entweder die 4ständige Doppelbindung allein oder, je nach den angewendeten Bedingungen, wie Reaktionszeit usw., eine 1- und 4ständige Doppelbindung in den Kern eingeführt werden. Diese Umsetzung ist deshalb von so großer Bedeutung, weil viele Δ ^-Steroide, wie zJ^l'⁴-Pregnadien-ll/S, 17a,21-triol-3,20-dion (Prednisolon), Zl''⁴-Pregnadien-17a, 21-diol-3,11,20-trion (Prednison), 14-Hydroxy-Prednisolon oder 14-Hydroxy-Prednison, für die Behandlung bestimmter Krankheiten des menschlichen Körpers, insbesondere von rheumatischer Arthritis, sehr wertvoll sind.

Es gibt viele leicht herstellbare, im Kern gesättigte Steroide, die als verhältnismäßig billige Ausgangsstoffe für die Synthese dieser Verbindungen verwendet werden können, jedoch war bisher kein gangbares Verfahren zur Einführung der erforderlichen Doppelbindungen in den Α-Ring bekannt. Ein solches Verfahren zur Einführung von A¹- und Δ ''-Doppelbindungen in den Α-Ring ist daher für die Herstellung bestimmter pharmazeutischer Präparate von großer Bedeutung.

Es wurde bereits beschrieben, daß eine Doppelbindung in der 1-Stellung durch Organismen, die sich von den in dieser Erfindung verwendeten Organismen unterscheiden, in bestimmte 3-Keto-J⁴-Verbindungen eingeführt werden können. Sehr viele Organismen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, diese Umsetzung durchzuführen, getestet, wobei sich jedoch sehr viele als unbrauchbar erwiesen. Es wurde gefunden, daß Organismen der Micromonosporachalcea-Art diese Umsetzung mit hoher Ausbeute durchzuführen vermögen.

Weitere Vorzüge der Organismen dieser Micromonospora-chalcea-Art liegen darin, daß das gewonnene Produkt verhältnismäßig frei von Nebenprodukten und daher leicht zu reinigen ist. Da die Reinigung kostspielig ist, ist dieses Freisein von Nebenprodukten ein sehr großer Vorzug. Ein weiterer Vorteil der Micromonospora chalcea liegt darin, daß der Organismus verhältnismäßig schnell wächst und leicht auf billigen Nährböden gezüchtet werden kann.

Das Verfahren wird so ausgeführt, daß man die gewählte Steroidvcrbindung in wäßriger Lösung oder Suspension entweder mit einer aktiv wachsenden Micromonospora-chalcea-Kultur oder mit von der wachsenden Kultur entfernten und in einem geeigneten Medium suspendierten Zellen von Micromonospora chalcea oder mit Extrakten von Oxydationsenzymen aus der Micromonospora-chalcea-Kultur in Berührung bringt.

Eine Vielzahl von im Kern gesättigten 3-Keto-Steroid-Verfahren zur Herstellung

von 3-Keto-J¹-⁴-steroiden,

3-Keto-zl⁴-steroiden oder deren Gemischen

Anmelder:

Chas. Pfizer & Co., Inc.,
Brooklyn, N. Y. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Beil und A. Hoeppener, Rechtsanwälte,
Frankfurt/M.-Höchst, Antoniterstr. 36

Beanspruchte Priorität:
V, St. v. Amerika vom 12. Februar 1957

Gilbert Malcolm Shull, Huntington Station, N. Y.

(V. St. A.)
ist als Erfinder genannt worden

Verbindungen können als Ausgangsstoffe für die erfindungsgemäße Umsetzung verwendet werden. Dazu gehören:

Androstan-S-on.Androstan-S.lT-dion.Bisnorcholan-S-on, Pregnan-3-on, Pregnan-3,20-dion, 4-Dihydrocorticosteron, 17a-Oxyandrostan-3-on, Östran-3-on, 4-Dihydrodcsoxycorticosteroti, Alloprcgnan-3-on, Allopregnan-3,20-djon, 17a-Oxypregnan-3-on und -3,20-dion, 11/9-Oxypregnan-3-on und -3,20-dion, 20-Oxy-pregnan-3,20, 14a-0xypregnan-3-on und -3,20-dion, Pregnan- und Allopregnan-3,11-dion und -3,11,20-trion, ll/S.lfa^l-Trioxy-prcgnan-3,20-dion, 17a,21-Dioxypregnan-3,ll,20-trion, 11/8,21 -Dioxypregnan-3,20-dion, 11/?, 14a, 17a,21-Tetraoxypregnan-3,20-dion, 21-Oxvpregnan-3,20-dion.

Das crnndungsgemäße Verfahren ist besonders gut bei im Kern gesättigten 3-Keto-Steroid-Reaktionsteilnehmcrn mit 18 bis 21 Atomen im Kohlenstoffgerüst durchführbar. Die Produkte dieser Umsetzung können durch einen genauen Vergleich von Papierchromatogrammen der mit bekannten Steroidverbindungcn hergestellten Produkte ermittelt werden. Dieses Verfahren wurde bei einer Vielzahl von Verbindungen ausprobiert und führt bekanntlich zu zuverlässigen Ergebnissen.

Der Micrornonospora-chalcea-Organismus wird in »Actionomycetes and their Antibiotics« auf S. 127 von Waksman und Lcchevalier, 1953, Williams and WiI-kens, Baltimore, beschrieben. Der in dem Katalog der

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amerikanischen Kulturkollektion als Micromonospora- besondere Magnesium sowie eine kleinere Menge Ade-Art Nr. 10 026 aufgeführte Organismus wurde von dieser nosintriphosphat enthalten.

öffentlichen Kulturkollektion bezogen und als zu der Nach der Umsetzung führt man am zweckmäßigsten Micrornonospora-chalcea-Art gehörig identifiziert. Eine eine Papierchromatographie durch. Die nach dem vorlebende Kultur eines von Nährboden isolierten Orga- 5 liegend beschriebenen Verfahren gewonnenen Produkte nismus, der als Micromonospora-chalcea-Art klassi- können durch Extraktion mit verschiedenen, mit Wasser fiziert wurde, wurde bei der amerikanischen Kultur- mischbaren, organischen Lösungsmitteln aus der wäßrigen kollektion, Washington, D. C, hinterlegt und erhielt die Lösung isoliert werden. Besonders geeignet dafür sind Nummer ATCC 12 452. Sowohl die Micromonospora niedrigere Halogenkohlenwasserstoffe wie Chloroform, chalcea ATCC 12 452 als auch die Micromonospora-Art io Nach der Extraktion können die Lösungsmittel abde-Nr. 10 026 entsprechen der auf S. 127 des vorgenannten stilliert und das feste Produkt somit isoliert werden. Dieser anerkannten Textes von Waksman und Lechevalier Stoff kann durch Wiederauskristallisation aus organischen gegebenen Beschreibung der Micromonospora-chalcea- Lösungsmitteln oder durch Chromatographie, z. B. auf Art. Die erfindungsgemäßen Umsetzungen können sowohl Tonerdekolonnen oder auf anderen geeigneten, in fester mit einem aus dem Erdboden isolierten Organismus als 15 Form vorliegenden Absorptionsstoffen, weiter gereinigt auch mit dem von der amerikanischen Kulturkollektion werden. Als besonders vorteilhaft erwies sich die Verbezogenen Organismus durchgeführt werden. Wendung einer Kieselsäuregel-Äthanol-Kolonne mit Ge-

Das erfindungsgemäße Dehj'drierungsverfahren kann mischen aus Methylenchlorid und 2 bis 5 Volumprozent

auf verschiedene Weise ausgeführt werden. Und zwar Äthanol (95 °/o) als Entwickler. Verfahren zur Herstellung

kann man ein Kohlehydrat, eine organische Stickstoff- ao von Produkten dieser Art sind in der Fachliteratur be-

quelle, Mineralsalze und Spurenelemente enthaltende schrieben. Für manche Verwendungszwecke ist es nicht

Nährböden mit Schrägnährböden von Micromonospora nötig, die Produkte zu trennen; das Rohgemisch kann

chalcea impfen, diese dann 2 bis 3 Tage kultivieren und als solches verwendet werden. In einigen Fällen erwies

anschließend als Impfstoff für größere Tanks verwenden, es sich als angebracht, die Rohprodukte zu acylieren und

die gerührt und belüftet werden. Das zu dehydrierende 25 mit den entstandenen Estern, die etwas beständiger sind,

Steroid wird dann dem Nährboden, der mindestens einen zu arbeiten.

Wasserstoff acceptor, ein zweiwertiges Metall, insbesondere Die verschiedenen Δ ^1>4- und Zl⁴-Produkte eignen sich

Magnesium, und Puffersubstanzen enthalten soll, nach als Zwischenprodukte für die Synthese anderer wert-

dem Einstellen des p_H-Wertes einfach in fester Form zu- voller Verbindungen. Die dehydrierten Produkte, die

gesetzt. 30 in der 1 (2)-Stellung zusammen mit der 3-Keto-Gruppe

Die Dehydrierung der Steroide erfordert im allgemeinen und in der 4(5)-SteUung ungesättigte Bindungen enteinige Stunden bis mehrere Tage. Die günstigsten Zeit- halten, sind beispielsweise für eine I.nhoffen-Aromatisie- und Temperaturbedingungen lassen sich leicht experi- rung besonders geeignet. Durch diese werden östronmentell ermitteln. derivate gebildet.

An Stelle den Mikroorganismus vorher zu kultivieren, 35 Außer der vorstehend erwähnten, vorteilhaften Verkann man die Steroidverbindung auch dem sterilisierten wendbarkeit sind viele der durch diese Umsetzung geNährboden direkt zufügen und diesen dann mit Micro- wonnenen Verbindungen wegen ihrer biologischen Wirkmonospora chalcea impfen, samkeit von sehr großer Bedeutung. Wird z. B. ll/?,17a,

Die Dehydrierung kann ferner mit von einer wachsenden 21 -Trioxypregnen-3,20-dion mit Micromonospora chalcea

Kultur entfernten Zellen durchgeführt werden, die in 40 nach dem neuen Verfahren behandelt, so entsteht Predni-

eincr Lösxing suspendiert werden, die in bezug auf Na- solon, das sehr nützlich ist und bei der Behandlung von

triumfumarat oder einen anderen Wasserstoffacceptor rheumatischer Arthritis dem Hydrocortison überlegen ist.

sowie Magnesiumsulfat 0,01 molar und in bezug auf Wird 17a,21-Dioxypregnan-3,ll,20-trion mit Micromono-

Natriumcitrat 0,03 molar ist. Dabei erweist sich die spora chalcea behandelt, so entsteht die als Prednison

gleichzeitige Gegenwart einer bestimmten Menge Ade- 45 bekannte Verbindung, die sich bei der Behandlung von

nosintriphosphat, z. B. von 0,125%, als seltr vorteilhaft. rheumatischer Arthritis ebenfalls als sehr vorteilhaft

Das genannte Medium wird vor dem Zusatz der abzentri- erweist.

fugierten, gewaschenen Zellen mit z. B. Citronensäure Es wurde weiter gefunden, daß andere 3-Keto-

auf einen p_H-Wert von etwa 6 eingestellt. Δ ^-Steroide eine große Wirksamkeit als Nebennieren-

Die Zellen von etwa 100 ecm der gerührten und be- 50 rindenhormone besitzen und sich für die gleiche Therapie

lüfteten Micromonospora-chalcea-Kulturen ergeben bei wie Hydrocortison eignen. Viele natürlich vorkommende

Suspendierung in etwa 20 ecm der genannten Lösung gute Steroide sowie aus den natürlich vorkommenden leicht

Resultate. Dieses Mengenverhältnis kann jedoch stark herstellbare Steroide weisen zwar eine im Kern gesättigte

variiert werden. Die Steroidverbindung wird in einem Ver- 3-Keto-Struktur auf, aber keine 3-Keto-4 ¹⁺-Verbin-

hältnis von etwa 25 bis etwa 200 mg je 100 mg des Um- 55 düngen sind als Rohstoffe leicht erhältlich. Daher ist

Setzungsgemisches verwendet. das vorliegende Verfahren, das die Dehydrierung einer

Nach einem weiteren Verfahren werden für die Deny- oder beider A-Ring-Bindungen, die mit der 3-Ketodrierung die von Micromonospora chalcea erzeugten, oxy- Gruppe des gesättigten Steroidkerns verbunden ist, in dierend wirkenden Enzyme verwendet. Diese können einer einzigen Stufe in einer technisch in großem Maßnach einer Reihe von Verfahren aus den Zellen des ge- 60 stäbe angelegten Produktion ermöglicht, von sehr großer wählten Organismus isoliert werden, z. B. mechanisch Bedeutung.

durch Autolyse, durch rasch aufeinanderfolgendes Ge- Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungs-

frieren- und Auftauenlassen, durch Ultraschallbehandlung gemäße Verfahren,

oder Stehenlassen in mit Wasser mischbaren Lösungs- Beispiel 1

mitteln, insbesondere Aceton. 65

Zur Dehydrierung werden die Enzyme in die gleichen Eine Reihe von Fernbachkolben, die jeweils 500 ecm

Medien gegeben, wie sie bei der Dehydrierung mit abge- &« folgenden Nährbodens enthielten:

trennten Zellen verwendet wurden, d. h. in Medien, die Enzymetisches Caseinhydrolysat (bekannt

einen Wasserstoffacceptor, wie Furaarat, eine Puffer- unter dem Handelsnamen N-Z-Amin B;

substanz, in einigen Fällen ein zweiwertiges Metall, ins- 70 Sheffield-Farms-Caseinhydrolysat) 10 g

Dextrosehydrat 10 g

Hefeextrakt 5 g

Calciumcarbonat Ig

und Leitungswasser, um auf 11 aufzufüllen, wurden bereitgestellt. Die Kolben wurden mit Baumwolle verschlossen, sterilisiert und dann mit einer Suspension der Sporen und des pflanzlichen Wachstums, das aus einer Schrägbodenkultur von Micromonospora chalcea ATCC 10 026 gewonnen wurde, geimpft. Die Kolben wurden 4 Tage bei 28° C geschüttelt, wobei jedem Kolben 50 mg ll/9,17a,21-Trioxypregnan-3,20-dion in Form einer sterilen Lösung in Aceton zugesetzt wurden. 3 Tage wurde weitergeschüttelt. Dann wurde jeder Kolben dreimal mit jeweils der gleichen Menge Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden auf eine Kieselsäuregel-Chromatographie-Kolonne gebracht, die mit einem Gemisch aus Methylcnchlorid und Äthanol eluiert wurde. Auf diese Weise wurde Prednisolon gewonnen.

Beispiel 2

30

Es wurde wie im Beispiel 1 verfahren, nur war diesmal der verwendete Organismus Micromonospora chalcea (ATCC Nr. 12 452). Es ergab sich wieder Prednisolon.

Beispiel 3

Die Verfahrensweise der Beispiele 1 und 2 wurde wiederholt, wobei als Ausgangsmaterial 17a,21-Dioxypregnan-3,ll,20-trion verwendet wurde. In jedem Falle wurde Prednison gewonnen.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei als Ausgangsmaterial 4-Dihydro-desoxycorticosteron verwendet wurde. Nach Ablauf eines Tages der dreitägigen Umsetzungszeit wurde eine Probe entfernt und getestet. Es wurde Desoxycorticosteron im Gemisch mit einigem /d ^l-Dehydro-desoxycorticosteron gewonnen. Eine nach Ablauf der dreitägigen Umsetzung durchgeführte Untersuchung des Produktes ergab, daß dieses größtenteils aus Δ MDehydro-desoxycorticosteron mit Spuren von Desoxycorticosteron bestand.

In allen Fällen lagen die erhaltenen Ausbeuten zwischen 25 und 35%.

Beispiel S

Eine Reihe von Fernbachkolben, die jeweils 500 ecm des folgenden Nährmediums enthielten:

Enzymatisches Caseinhydrolysat, bekannt
unter der Handelsbezeichnung N-Z-AminB (Sheffield-Farms Caseinhydrolysat) 10 g

Dextrosehydrat 10 g

Hefeextrakt 5 g

Calciumcarbonat Ig

und Leitungswasser, um auf 11 aufzufüllen, wurden bereitgestellt. Die Kolben wurden mit Watte verschlossen, sterilisiert und dann mit einer Suspension der Sporen und des vegetativen Wachstums von einer Schrägkultur

SS von Micromonospora chalcea (ATCC 1.0 026) geimpft. Die Kolben wurden 4 Tage bei 28° C geschüttelt, worauf in jeden Kolben eine sterile Lösung von 50 mg Androstan-3-on in Aceton gegeben wurde. Dann wurde noch 3 Tage geschüttelt. Anschließend wurde jeder Kolben dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden auf eine Kieselsäuregelsäule aufgebracht, die mit Gemischen aus Methylcnchlorid und Äthanol eluiert wurde. Man erhielt J¹'⁴-Androstadien-3-on in einer Ausbeute von 25%.

Beispiel 6

Dextrosehydrat 10 g

Hefeextrakt 5 g

Calciumcarbonat Ig

und Leitungswasser, um auf 1 1 aufzufüllen, wurden bereitgestellt. Die Kolben wurden mit Watte verschlossen, sterilisiert und dann mit einer Suspension der Sporen und des vegetativen Wachstums von einer Schrägkultur von Micromonospora chalcea (ATCC 10 206) geimpft. Die Kolben wurden 4 Tage bei 28° C geschüttelt, worauf in jeden Kolben eine sterile Lösung von 50 mg Androstan-3,17-dion in Aceton gegeben wurde. Dann wurde noch 3 Tage geschüttelt. Anschließend wurde jeder Kolben dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden auf eine Kieselsäuregelsäule aufgebracht, die mit Gemischen aus Methylenchlorid und Äthanol eluiert wurde. Man erhielt Δ ^li4-Androstadien-3,17-dion in einer Ausbeute von 30%.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-Zl ¹^⁴-Steroiden, 3-Keto-z]⁴-Steroiden oder deren Gemischen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein im Kern gesättigtes 3-Keto-Steroid in bekannter Weise mit den oxydierenden Enzymen eines Organismus der Micromonospora-chalcca-Art dehydriert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangs verbindungen im Kern gesättigte 3-Keto-Steroide mit 18 bis 21 Atomen im Kohlenstoffgerüst verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsverbindung 3-Ketoandrostan, ein 3-Ketopregnan oder 3-Ketoallopregnan, ein Bisnorcholan, ll/9,17a,21-Trioxypregnan-3,20-dion, ^a^l-Dioxypregnan-S.ll^O-trion, 11 ß,2i -Dioxypregnan^O-dion, 11 ß, 14ct,l 7ct,21-Tetraoxypregnan-3,20-dion oder 21-Oxypregnan-3,20-dion verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micromonospora chalcea ATCC 10026 oder 12 452 verwendet.

Q 909 689/574 12.59