DE1228255B - Verfahren zur Herstellung von 16alpha-Hydroxy-9beta, 10alpha- oder 9alpha, 10alpha-stiden der Androstan- oder Pregnanreihe - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 16alpha-Hydroxy-9beta, 10alpha- oder 9alpha, 10alpha-stiden der Androstan- oder PregnanreiheInfo
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Description
- Verfahren zur Herstellung von 16x-Hydroxy-9ß,10a- oder 9ca,10a-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe Es ist bekannt, daß 9ß,10a-Steroide und 9a,10a-Steroide pharmakologische Eigenschaften haben, die von denen der 10ß-Methyl-9a-Reihe (Normalsteroide) abweichen.
- Es ist bereits vorgeschlagen worden, in diese 9ß,10a- oder 9x,10a-Steroide in an sich bei der Normalsteroidreihe bekannter Weise bestimmte Substituenten in das Steroidskelett einzuführen, z. B. eine Hydroxydgruppe in 16-Stellung.
- Es wurde nun gefunden, daß diese 9ß,10oc- und 9a,10a-Steroide, die eine stereochemische Konfiguration aufweisen, die erheblich von der der in der Natur vorkommenden Steroide abweicht, im Gegensatz zu dem, was auf Grund dieser abweichenden Konfiguration zu erwarten war, mikrobiologischer Umwandlungen fähig sein können.
- Die Erfindung ermöglicht, in Verbindungen der 10x-Steroidreihe, insbesondere der 9ß,10a-Steroidreihe, auf mikrobiologischem Wege eine Hydroxylgruppe in 16x-Stellung einzuführen. Wegen der besonderen stereochemischen Konfiguration des Steroidkernes bei Vertretern aus der 10a-Steroidreihe, insbesondere der 9ß,10x-Steroidreihe, welche erheblich von der Konfiguration der natürlichen Steroide abweicht, war nicht zu erwarten, daß Mikroorganismen oder deren Enzymsysteme eine Substitution an einem Steroidkern mit einer solchen nicht natürlichen Konfiguration durchführen konnten.
- Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von 16a-Hydroxy-9ß,10a- oder 9oc,10a-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein entsprechendes 3-Keto-4-dehydro-, 3-Keto-4,6-bisdehydro- oder 3-Hydroxy-5-dehydro-9ß,10a:- oder -9a,10a-steroid, das am Kohlenstoffatom 16 zwei Wasserstoffatome trägt oder deren 3-Äther oder -Ester in an sich bekannter Weise der oxydierenden Wirkung eines Mikroorganismus der Familie der Moniliaceae oder Enzymsystemen oder Sporen derselben unterwirft.
- Die Ausgangsstoffe können verschiedene Substituenten, z. B. eine oder mehrere verätherte oder veresterte oder nicht verätherte oder veresterte Hydroxygruppen, ein oder mehrere Ketosauerstoffatome, eine oder mehrere gegebenenfalls ungesättigte Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein oder mehrere Halogenatome, z. B. Cl, Br oder F, enthalten. Es können z. B. Hydroxygruppen in den Stellungen 1, 2, 3, 6, 11, 17 oder 21 (jedoch nicht in der 17a-Stellung), Ketosauerstoffatome in den Stellungen 3, 11 und/oder 20 und Alkylgruppen, wie Methyl-, Äthyl-oder Allylgruppen, in den Stellungen 1, 2, 4, 6 oder 17 (jedoch im letzteren Fäll nicht in der ß-Stellung bei gleichzeitiger Anwesenheit einer 17cc-Hydroxygruppe) vorhanden sein. Weiter dürfen in den Ausgangsstoffen eine oder mehrere Doppelbindungen vorhanden sein, z. B. ausgehend von den Kohlenstoff atomen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 14 oder 17.
- Die erfindungsgemäß herstellbaren 16a-Hydroxy-9ß,10a- oder -9a,10a-steroide sind wichtige Ausgangsprodukte für die Synthese anderer 9ß,10a- oder 9x,10a-Steroide mit pharmakologischer Wirkung, die in der Stellung 16 eine andere funktionelle Gruppe tragen, die durch Ersatz von bzw. Reaktion mit der 16a-Hydroxygruppe eingeführt werden kann, z. B. eine Alkylgruppe, eine Aminogruppe oder ein Halogenatom.
- Als gut geeignete Ausgangsstoffe seien folgende erwähnt: 9ß,10a-Progesteron, 6-Dehydro-9ß,10x-progesteron und 9a,10a-progesteron. Weiter sind auch Steroide, die in der Stellung 17 eine ß-gebundene Hydroxygruppe tragen, wie z. B. 9ß,10a-Testosteron oder 17ca-Alkyl-9ß,10a-testosteron geeignete Ausgangsprodukte. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen gehören der Familie der Moniliaceae an, die wiederum der Ordnung der Moniliales zugehört, welche in der Klasse der Fungi imperfecti liegt.
- Besonders günstige Resultate wurden bei den Moniliaceae mit Mikroorganismen des Geschlechtes Sepedonium erzielt. Diese Klassifizierung entspricht der des »Dictionary of the Fungi« von G. C. A i n sw o r t h und G. R. B i s b y, veröffentlicht von dem Commonwealth Micrological Institute, Kew Surrey, England, 1961.
- Von den Arten, welche insbesondere beim Zustandekommen der Erfindung gute Resultate lieferten, können folgende erwähnt werden: Sepedonium ampullosporum Damon und Sepedonium chrysosperum (Bull Fr Boudyn). Besonders mit dem Mikroorganismus Sepedonium ampullosporum sind sehr hohe Ausbeuten (80 °/o) bei der 16a-Hydroxylierung von 20-Keto-9ß;10ä-pregnanen, unter anderem von 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron erzielt worden. Im Hinblick darauf sei noch erwähnt, daß der gleiche Mikroorganismus das normale (10ß-Methyl-9a)-5ß-pregnan-3,11,20-trion nur zu etwa 20 °/o in das entsprechende 16-Hydroxy-steroid umwandelt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der bei bekannten mikrobiologischen Umwandlungen bekannten Weise durchgeführt, z. B. indem das Substrat unter geeigneten Bedingungen mit der Kultur einer der vorerwähnten Fungi und/oder mit einem Enzymsystem derselben in Berührung gebracht wird. Zu diesem Zweck wird z. B. zunächst eine Kultur des Fungus unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung entwickelt, worauf ein Gärmedium, das das zu oxydierende Steroid enthält und das in Lösung oder Suspension zugesetzt werden kann, der oxydierenden Dissimilationswirkung des entstandenen Myceliums unterworfen wird. Die Nährlösung besteht im wesentlichen aus einer Kohlenstoff= und einer Stickstoffquelle, z. B. einem Kohlehydrat, wie Glucose, Maltose oder Stärke, und einer organischen Stickstoffquelle, z. B. Maisquellwasser oder Hefeextrakt, Eiweißhydrolysaten, Aminosäuren oder einer anorganischen Stickstoffquelle, wie Ammoniumsalzen oder Alkalimetallnitraten.
- Dem Medium, das das zu oxydierende Steroid und eine oder mehrere der vorerwähnten Nährquellen enthält, kann gewünschtenfalls noch ein Antischaummittel, z. B. Glycerylmonostearat, zugesetzt werden. Der pH-Wert des Mediums kann auf normale Weise eingestellt werden; er beträgt vorzugsweise 6 bis 7.
- Die geeignetste Gärungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 28'C, obgleich höhere oder niedrigere Temperaturen zwischen 15 und 35'C im allgemeinen auch brauchbar sind.
- Die für die Oxydation des Steroids erforderliche zeit kann zwischen weiten Grenzen schwanken, aber gewöhnlich ist eine Oxydationsperiode von 10 bis 48 Stunden die beste für eine vollständige Umwandlung. Die nach Beendigung des Oxydationsvorganges erhaltenen 16a-Hydroxysteroide können auf eine der üblichen Weisen aus dem Medium und/oder dem Mycehum ausgeschieden werden, z. B. durch Extraktion mit nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther, Äthylacetat, Amylacetat, Methylisobutylketon oder mit anderen Estern und Ketonen. Insbesondere eignet sich Methylisobutylketon für die Extraktion. Das oxydierte Steroid kann auch durch chromatographische Verfahren, gegebenenfalls in Kombination mit Ex; traktion, aus dem Gärmedium abgetrennt und gereinigt werden.
- Gemäß der Erfindung können die 16ca-Hydroxysteroide auch dadurch erzeugt werden, daß Sporen der erwähnten Mikroorganismen auf Lösungen oder Dispersionen der erwähnten Ausgangssteroide einwirken.
- Die nachfolgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
- Beispiel Umwandlung von 9ß,10a-Progesteron in 16a-Hydroxy-9ß,10a-progesteron Eine Nährlösung aus 10 g eingedicktem Maisquellwasser und 10 g Glucose in 500 ml destilliertemWasser wurde mit Hilfe einer wässerigen 2n-Natriumhydroxydlösung auf pH = 6,8 eingestellt und nach Sterilisierung bei einer Temperatur von 120°C 20 Minuten mit einer auf Hafermalzagar gewachsenen Kultur von Sepedonium ampullosporum geimpft. Diese Impfkultur wurde in einem Schüttelkolben von 21 Inhalt 24 Stunden bei 26'C durch eine rotierende Schüttelmaschine (250 U./ Min.) geschüttelt, worauf das entstandene Myceliumgemisch in einen rostfreien stählernen Gärbottich von 1001 mit Rührwerk und Belüftungsvorrichtung gebracht wurde, der das nachfolgende, unter. den vorerwähnten Bedingungen sterilisierte Gärmedium enthielt: Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff)........................... 300 g Glucose .............................. 250 g Glycerylmonostearat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30g Leitungswasser ........................ 401 pH = 6;8 (Natriumhydroxydlösung).
- Beispiel II Umwandlung von 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 6-Dehydro-16,x-hydroxy-9ß,10a-progesteron Ein Medium aus 20 g Caseinhydrolysat, 10 g Hefeextrakt, 20 g Glucose, 5 g Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff) und 2 g primärem Ammoniumphosphat wurde mit Wasser bis auf 1000 ml aufgefüllt und dann mit 2 n-Natriumhydroxydlauge auf pH = 6,1 gebracht. 10 l dieses Mediums wurden sterilisiert und dann mit einer Kultur von Sepedonium chrysospermum geimpft und darauf 36 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 28'C inkubiert, während durch das Fermentationsgemisch 121 sterile Luft pro Minute geleitet wurden. Der erwachsenen Kultur wurde dann eine Lösung von 6,0 g 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 250 ml Aceton zugesetzt, worauf dieses Gemisch noch 48 Stunden bei einer Temperatur von 28'C unter Rühren und Hindurchleiten von Luft inkubiert wurde.
- Das Mycelium wurde darauf von der Gärflüssigkeit getrennt, worauf das Filtrat viermal mit 2000 m1 Methylisobutylketon extrahiert wurde. Die gesammelten Extrakte wurden im Vakuum auf 800 ml eingedampft, dann mit einer Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und schließlich mit aktivierter Kohle behandelt. Der filtrierte Extrakt wurde darauf im Vakuum auf 35 ml konzentriert, worauf 4,59 g kristallines Produkt abfiltriert wurden. Die Mutterlauge wurde bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde zweimal aus einem Aceton-Heptan-Gemisch (1: 1) umkristallisiert. Es wurde noch weiter 0,477 g Kristallisat erhalten.
- Diesem Gärmedium wurden unter aseptischen Bedingungen 12,5 g 9ß,10a-Progesteron, in 200 ml sterilem Wasser suspendiert, zugesetzt, worauf 36 Stunden bei 26'C fermentiert wurde (Umdrehungszahl: 140 pro Minute; Luftzufuhr: 0,9 m3 pro Quadratmeter Bodenfläche pro Minute).
- Das Filtrat der Kultur (39,41) wurde darauf dreimal mit 81 Methylisobutylketon extrahiert. Der Gesamtextrakt wurde im Vakuum auf 11 eingedampft, darauf mit Natriumhydroxyd und Wasser gewaschen und dann mit aktivierter Kohle behandelt. Der so behandelte, eingedampfte Extrakt wurde nach Filtrieren im Vakuum auf 100 ml konzentriert. Dabei entstanden 9,7 g kristalliner Niederschlag, der als 16a-Hydroxy-9ß,10ca-progesteron identifiziert wurde. Das Kristallisat wurde aus 50 ml Methanol-Wasser (2: 1) umkristallisiert, wobei 9,54 g weißes, kristallines Endprodukt mit einem Schmelzpunkt von 172,5 bis 174,5°C erhalten wurden. -92,3'(c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: Amax = 244 m#t (e = 16.900).
- Elementaranalyse für C21113003: Gefunden ... C 76,170/0, H 9,210/0; berechnet ... C 76,320/0, H 9,150/0.
- Aus den Mutterlaugen wurde durch Eindampfen bis zur Trockne und durch Umkristallisieren noch 0,7 g reines Produkt erhalten.
- Die vereinigten Kristallisate wurden zweimal aus jeweils 45 ml Methanol-Wasser (2: 1) umkristallisiert, wobei 4,71 g des Produktes erhalten wurden, das als reines 6-Dehydro-16a-hydroxy-9ß,10a-progesteron identifiziert werden konnte. Schmelzpunkt: 204 bis 205'C; = -528' (c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: Am"" = 286 m#t (e = 26.800).
- Elementaranalyse für C21112,03: Gefunden ... C 76,850/0, H 8,490/0; berechnet ... C 76,79 0/0, H 8,59 0/0.
- Beispiel III Umwandlung von 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 6-Dehydro-16a-hydroxy-9ß,10a-progesteron Einer 24stündigen Kultur von Sepedonium ampullosporum in 5001 Nährmedium mit 5 kg Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff') und 0,5 0/0 Glucose wurden 250 g 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 51 Aceton zugesetzt.
- Die Gärflüssigkeit wurde unter den im Beispiel I beschriebenen Bedingungen 60 Stunden bei 24'C inkubiert.
- Nach Unterbrechung der Gärung wurde das Mycelium durch Zentrifugieren von der Kulturflüssigkeit getrennt. Sowohl das Mycelium als auch die Kulturflüssigkeit wurden dreimal mit 601 Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wurde nach Beispiel II aufgearbeitet, bis ein kristallines Produkt erhalten wurde. Insgesamt wurden 195 g kristallines 6-Dehydro-16a-hydroxy-9ß,10a-progesteron erhalten; Schmelzpunkt: 203 bis 204°C; - -520° (c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: .1..x = 286 mp. (e = 26.800).
- Beispiel IV Umwandlung von '9ß,10a-Testosteron in 16a-Hydroxy-9ß,10a-testosteron 20 Schüttelkulturen von Sepedonium chrysospermum von je 1000 ml in 2-1-Erlenmeyerkolben wurden ,48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine (300 U./Min.) bei 26'C geschüttelt. Das verwendete Medium wurde mit 2n-Natriumhydroxydlösung auf p11 6,2 eingestellt und enthielt die nachfolgenden Bestandteile Eingedicktes Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff) . . . . . . . . . . . . . 10/0 Rohrzuckermelasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20/0 Caseinhydrolysat ..................... 0,50/0 Primärammoniumphosphat ............ 0,20/0 Natriumacetat .... .... . ...... ... . .. .. . 0,10/0 Darauf wurde das Gärgemisch in einen rostfreien stählernen Gärbottich von 501 mit einem Rührwerk und einer Belüftungsvorrichtung gebracht, worauf 4 g 9ß,10a-Testosteron in 300 ml Aceton zugegeben wurden. Nach 56stündiger Züchtung bei 26'C (Umdrehungszahl: 140 pro Minute; Luftzufuhr: 151/Min.) wurde die Gärflüssigkeit von dem Mycelium getrennt und das Filtrat dreimal mit 41 Methylisobutylketon extrahiert. Der Gesamtextrakt wurde im Vakuum auf 750 ml eingedampft, mit Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen und schließlich mit aktivierter Kohle behandelt. Die Lösung wurde darauf im Vakuum auf 90 ml konzentriert. Aus diesem Konzentrat wurden nach Abkühlung 2,9 g kristallines Produkt abgetrennt. Die Mutterlauge wurde trockengedampft und der Rückstand wurde unter Erwärmung in einem Gemisch von 4 ml Aceton und 4 ml Heptan gelöst. Durch Abkühlung wurden daraus noch 0,120 g Kristallisat erhalten. Das Gesamtprodukt wurde aus 45 ml Methanol-Wasser (2: 1) umkristallisiert, wobei 2,85 g reines 16a-Hydroxy-9ß,10a-testosteron erhaltenwurde, welches die nachfolgenden Konstanten aufwies: Schmelzpunkt 210 bis 212'C; = -164' (c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: @max = 242 m[.; (s = 16.700).
- Elementaranalyse für C19112,03: Gefunden ... C 74,750/0, H 9,300/0; berechnet ... C 74,960/0, H 9,270/0.
Claims (4)
- Patentansprüche: 1.
- Verfahren zur Herstellung von 16a-Hydroxy-9ß,10a- oder 9a,10a-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe, dadurch gekennzeichn e t, daß man ein entsprechendes 3-Keto-4-dehydro-, 3-Keto-4,6-bisdehydro- oder 3-Hydroxy-5-dehydro-9ß,10a- oder -9a,10a-steroid, das am Kohlenstoffatom 16 zwei Wasserstoffatome trägt oder deren 3-Äther oder -Ester in an sich bekannter Weise der oxydierenden Wirkung eines Mikroorganismus der Familie der Moniliaceae oder Enzymsystemen oder Sporen derselben unterwirft. 2': Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung mit einem Vertreter des Geschlechtes Sepedonium erfolgt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fungus der Art Sepedonium ampullosporum oder Sepedonium chrysospermum verwendet wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Dehydro-9ß,10cx-progesteron als Ausgangsverbindung verwendet. In Betracht gezogene Druckschriften: USA.-Patentschriften Nr. 3 007 950, 3 011951:
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1228255X | 1962-10-16 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1228255B true DE1228255B (de) | 1966-11-10 |
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ID=19872293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DEN23881A Pending DE1228255B (de) | 1962-10-16 | 1963-10-14 | Verfahren zur Herstellung von 16alpha-Hydroxy-9beta, 10alpha- oder 9alpha, 10alpha-stiden der Androstan- oder Pregnanreihe |
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| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE1228255B (de) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3007950A (en) * | 1960-11-23 | 1961-11-07 | Upjohn Co | 16alpha-hydroxy-5beta-pregnane-3, 11, 20 trione with sepedonium ampullosporum and production thereof |
| US3011951A (en) * | 1960-11-23 | 1961-12-05 | Upjohn Co | Preparation of 11alpha, 17alpha-dihydroxyprogesterone |
-
1963
- 1963-10-14 DE DEN23881A patent/DE1228255B/de active Pending
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US3007950A (en) * | 1960-11-23 | 1961-11-07 | Upjohn Co | 16alpha-hydroxy-5beta-pregnane-3, 11, 20 trione with sepedonium ampullosporum and production thereof |
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