DE1030341B - Verfahren zur Kernoxydation von ?-3-Ketosteroiden - Google Patents

Description

• Verfahren zur Kernoxydation von 44-3-Ketosteroiden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Oxydation von Steroidverbindungen, die in 3-Stellung eine Ketogruppe und in 4-Stellung eine Doppelbindung besitzen, mit Hilfe bestimmter Mikroorganismen oder den von diesen erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen.
• Es wurde überraschenderweise gefunden, daß 3-Ketod 1.4-Steroidverbindungen aus den entsprechenden 3-Keto-44-Steroidverbindungen hergestellt werden können, wenn man diese der von Mikroorganismen der Gattung Nocardia entwickelten oxydierenden Wirkung aussetzt. Diese Reaktion ist von außerordentlichem Wert, da das 11ß;17a,21-Trioxy-3,20-diketo-d1,4-pregnadien (Prednisolon) und das 17a,21-Dioxy-3,11,20-triketo-41.4-pregnadien (Prednison) große Bedeutung bei der Behandlung bestimmter Erkrankungen des menschlichen Körpers, insbesondere der rheumatischen Arthritis haben. Es gibt viele leicht zugängliche Ausgangsstoffe für die Synthese dieser Verbindungen, jedoch besitzen diese nur eine Doppelbindung im Ring A, d. h. es sind 3-Ketod4-Steroide. Ein Verfahren, mit dem eine zweite Doppelbindung in den Ring A eingeführt werden kann, ist daher für die pharmazeutische Industrie und die Öffentlichkeit sehr wertvoll.
• Es ist bereits bekannt, daß in bestimmte 3-Keto-44-Verbindungen mit Hilfe von Organismen der Gattungen Fusarium, Calonectria, Ophiobolus, Alternaria, Didymella und Corynebakterium in 1(2)-Stellung eine Doppelbindung eingeführt werden kann. Während bei diesen Verfahren nichts über die erzielten Ausbeuten an 1(2)-Dehydroverbindung angegeben ist, wurde nun gefunden, daß die Dehydrierung der 1(2)-Stellung von 3-Keto-44-Steroiden mit Organismen der Gattung Nocardia in hoher Ausbeute erreicht werden kann. Die erhaltenen Ausbeuten liegen zwischen 50 und 800/" was für ein biochemisches Verfahren außerordentlich gut ist. Weitere Vorteile der Organismen der Gattung Nocardia beruhen auf der Tatsache, daß das erhaltene Produkt verhältnismäßig frei von Nebenprodukten ist und folglich leicht gereinigt werden kann. Da die Reinigung des Produktes kostspielig ist, ist die Abwesenheit von Nebenprodukten ein bedeutender Vorteil des Verfahrens. Außerdem wächst der genannte Organismus verhältnismäßig schnell und kann leicht in billigen Nährmedien gezüchtet werden.
• Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bebrütet man die entsprechende Steroidverbindung in wäßriger Lösung` oder Suspension entweder mit einer wachsenden Kultur von Nocardia oder mit Zellen von Nocardia, die der wachsenden Kultur entnommen und in einem geeigneten Medium suspendiert worden sind, oder aber mit Extrakten der oxydieren wirkenden Enzyme, die aus der Kultur einer Art der Gattung Nocardia erhalten worden sind.
• Eine Anzahl von Steroidverbindungen, die in 3-Stellung eine Ketogruppe und in 4-Stellung eine Doppelbindung besitzen, kann als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Reaktion verwendet werden. Sie umfassen Stoffe wie Verbindung F (Hydrocortison) Verbindung E (Cortison) Corticosteron Verbindung S 14a-Oxy-Verbindung S Desoxycorticosteron Androstendion Nortestosteron 17 a-Oxyprogesteron 11-Ketoprogesteron 9a-Fluor-Verbindung F 14a-Oxy-Verbindung F 11-Epi-Hydrocortison 4 4. 8-Androstadiendion 11 ß,17 a-Dioxyprogesteron 414-Dehydro-Verbindung S Testosteron Progesteron 16-Dehydroprogesteron A'(")_Dehydro-Verbindung S Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf 3-Keto-d4-Steroide anwendbar, die 18 bis 21 Kohlenstoffatome besitzen. Die Reaktionsprodukte können durch sorgfältiges Vergleichen von Papierchromatogramme der erfindungsgemäß hergestellten Produkte mit bekannten Steroiden nachgewiesen werden.
• Die Arten der Gattung Nocardia für die Dehydrierung sind aus öffentlichen Kulturen, Sammlungen, z. B. der American Type Culture Collection of Washington, D. C., leicht zugänglich. Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Arten sind Nocardia coeliaca, Nocardia convoluta, Nocardia corallina, Nocardia crythropolis, Nocardia garneri, Nocardia minima and. Nocardia polychro:noöens.3; von b°sonderem Wert sind die Organismen der Arten N. opaca und N. globerula. Eine lebende Kultur von N. opaca ist bei der American Type Culture Collection of Washington, D. C. mit der Nr. ATCC 4276 hinterlegt worden. Eine lebende Kultur der Art N. globerula wurde ebenfalls dort hinterlegt und ihr die Nr. ATCC 9356 gegeben. Die verschiedenen Arten von Nocardia unterscheiden sich erheblich bezüglich ihrer Reaktionsfreudigkeit und -geschwindigkeit. Es bestehen auch Abweichungen zwischen den Stämmen derselben Art. In ähnlicher Weise unterscheiden sich die verschiedenen Steroidsubstrate bezüglich ihrer Reaktionsfreudigkeit und -geschwindigkeit. Es ist jedoch leicht möglich, die optimalen Bedingungen für die Dehydrierung jedes einzelnen Steroids mit jeder speziellen Art des Organismus experimentell zu bestimmen.
• Es gibt mehrere Verfahren, die zur erfindungsgemäßen Dehydrierung von Steroidverbindungen angewendet werden können. In einem von ihnen werden Nährmedien mit Schrägkulturen des ausgewählten Nocardia Organismus beimpft. Solch ein Medium kann z. B. aus einem Gemisch einer bakteriologischen Standard Nährlösung und zugesetztem Kohlenhydrat bestehen. Die Züchtung von Nocardia ist in vielen Veröffentlichungen genau beschrieben. Die beimpften, sterilen Nährlösungen kann man in Schüttelkolben 2 oder 3 Tage wachsen lassen, um Impfmaterial für Ansätze in größeren Gefäßen zu erzeugen, und die Produkte der größeren, mit Rührwerke und Möglichkeiten für Luftzutritt versehenen Gefäße können ihrerseits zur Impfung von Ansätzen im großen Stil für die submerse Fermentation verwendet werden. Dasselbe Medium, wie oben beschrieben, kann zur erfindungsgemäßen Oxydation der Steroide im großen verwendet werden. Für die Kulturflüssigkeit, die verändert werden kann, sind im allgemeinen ein Kohlenhydrat, eine Quelle für organischen Stickstoff, Mineralsalze und verschiedene Spurenmetalle erforderlich.
• Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man auch Zellen aus den wachsenden Kulturen entnehmen und sie dann in einem Medium suspendieren, welches zur Erzeugung des Enzym-Reaktionsgemisches bestim°nt war. Solch ein Reaktionsgemisch kann z. B. aus einer Lösung bestehen, die in bezug auf fumarsaures Natrium oder einen anderen Wasserstoffakzeptor und in bezug auf Magnesiumsulfat 0,01 molar und in bezug auf Natriumcitrat 0,03 molar ist. Die Gegenwart einer bestimmten Menge Adenosyltriphosphat, z. B. von 0,125°/0, hat sich als nützlich erwiesen. Zentrifugierte, gewaschene Zellen des ausgewählten Nocardiastammes können in dieser Art Reaktionsgemisch, das z. B. mit Citronensäure auf einen pH-Wert von etwa 6 eingestellt wird, suspendiert werden. Nach Zusatz der zu oxydierenden Steroidverbindung kann das Gemisch bei etwa 37° C bebrütet und von Zeit zu Zeit können Proben entnommen werden, um zu ermitteln, wann eine maximale Umwandlung des Steroids stattgefunden hat. Im allgemeinen erfolgt diese Entnahme nach einem bis mehreren Tagen. Es wurde gefunden, daß zur Erzielung geeigneter Ergebnisse die Zellen von etwa 100 cm3 unter Luftzutritt gerührter Nocardiakulturen in etwa 20 cm3 eines Enzym-Reaktionsgemisches suspendiert werden können. Diese Mengen können jedoch wesentlich geändert und etwa 25 bis etwa 200 mg der Steroidverbindung pro 100 cm" des Enzym-Reaktionsgemisches verwendet werden. Die Verbindung wird dem Medium in fester Form nach Einstellung des p1,1-Wertes zugegeben. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen, so daß sie während der Bebrütung der Luft ausgesetzt sind. Man zieht es vor, kleine Volumina im Vergleich zum Volumen des Kolbens, z. B. 20 cm3 in einem 125-cm3-Erlenmeyerkolben, zu verwenden. Das Gemisch kann auch unter Luftzutritt gerührt werden. Im allgemeinen sind mindestens ein Wasserstoffakzeptor, ein zweiwertiges Metall, insbesondere Magnesium, und eine Puffersubstanz für die Zusammensetzung des Mediums erforderlich.
• Man kann ferner die Steroidverbindung direkt zu einem sterilisierten Anteil des Nährmediums, wie oben beschrieben ist, zugeben und das Medium dann mit einem ausgewählten Nocardiastamm beimpfen. In diesem Fall kann ebenfalls annähernd dieselbe Menge der ausgewählten Steroidverbindung verwendet werden. Proben des unter Luftzutritt gerührten Gemisches können von Zeit zu Zeit zur Bestimmung des Umwandlungsgrades der Steroidverbindung in die oxydierten Produkte entnommen werden. Das Gemisch wird während des Wachstums der Zellen und der Umwandlung des Steroids bei Temperaturen zwischen 20 und 37° C oder darüber gehalten. Im allgemeinen sind etwa i/2 bis 7 Tage für eine maximale Produktion oxydierter Verbindungen erforderlich. Das Wachstum der Zellen kann aber auch vor dem Zusatz des Steroids vor sich gehen.
• Eine dritte Methode, die zur Oxydation von ausgewählten Steroidverbindungen ebenfalls gut anwendbar ist, besteht in der Verwendung von aus Nocardia erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen. Diese können nach bekannten Verfahren aus den Zellen der ausgewählten Organismen gewonnen werden.
• Die zellfreien Enzyme können in den obengenannten Medien oberhalb Temperaturen von etwa 20 bis etwa 40'C verwendet werden. Im allgemeinen wird die Oxydation der gewünschten Steroidverbindungen etwa in wenigen Stunden bis mehreren Tagen durchgeführt. Die optimale Zeitdauer und Temperatur sowie andere Bedingungen können leicht durch Versuche bestimmt werden. Eingehende Beschreibungen geeigneter Medien sowohl für die Verwendung von isolierten und wieder suspendierten Zellen als auch für die Verwendung von zellfreien Elaboraten sind in den Handbüchern »Manometric Technique in Tissue Metabolism« von W. W. Umbreit und Mitarbeitern, Brugess Publishing, Company, Minneapolis (1949), und »Respiratory Enzymes« von H. Lardy, Burgess Publishing Company, Minneapolis (1949), angeführt.
• Der Reaktionsverlauf wird gewöhnlich papierchromatographisch verfolgt. Die Produkte des neuen Verfahrens können aus der wäßrigen Lösung durch Extraktion mit verschiedenen, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln in bekannter Weise isoliert werden: Niedere halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, sind besonders brauchbar. Nach der Extraktion können: die Lösungsmittel abdestilliert werden; dann wird das feste Produkt isoliert. Dieses Material kann durch Umkristallisation oder chromatographisch, z. B. mittels Tonerdesäulen oder anderen geeigneten festen Adsorptionsmitteln, von den organischen Lösungsmitteln befreit werden. Die Verwendung einer Kieselsäuregel-Äthanol-Säule und Gemischen aus Methylenchlorid mit 2 bis 5 Volumprozent Äthanol (95 °/oig) als Entwickler hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Für manche Verwendungsaxten kann das Rohgemisch als solche weiterverarbeitet werden. Es wurde in manchen Fällen als vorteilhaft empfunden, die Rohprodukte zu acylieren und mit den entstehenden Estern zu arbeiten, die etwas stabiler sind.
• Als Ausgangssteroide können wohlbekannte Verbindungen, wie Testosteron, Progesteron und Reichsteins Verbindung S verwendet werden. Diese Produkte sind als Zwischenprodukte für die Synthese anderer nützlicher Verbindungen wertvoll. So sind z. B. die dehydrierten d1,4-3-Ketone besonders geeignet für die Inhoffen-Aromatisierung. Dabei entsteht eine Gruppe von Derivaten des Oestrons. Falls sich das Dehydrierungsprodukt von Reichsteins Verbindung S ableitet, kann die Seitenkette unter Bildung einer 17ständigen Ketogruppe leicht durch übliche Methoden, z. B. durch Oxydation mit Chromsäure, abgespalten und sodann nach Inhoffen aromatisiert werden.
• Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 In ein 4-1-Gefäß aus Pyrexglas, das für die Durchführung einer submersen Fermentation unter Luftzutritt eingerichtet war, wurden 21 folgender Lösung gegeben:

  Caseinhydrolysat, bekannt unter dem

  Handelsnamen N-Z Amin B ....... log

  Dextrosehydrat ......................... 10 g

  Hefeextrakt ............................ 5 g

  Calciumcarbonat ........................ 1 g

  Mit Wasser auf 1 Liter auffüllen.

  Das wäBrige Medium wurde sterilisiert und mit 0,25 g Hydrocortison versetzt. Das Gemisch wurde dann mit 100 cm3 einer Kultur von N. opaca (ATCC Nr. 4276), die in einem Schüttelkolben auf einer Nährlösung gezüchtet wurde, beimpft. Darauf wurde geschüttelt und sterile Luft zugeführt. Das gesamte Gemisch wurde dann mehrere Male mit 21 Chloroform ausgeschüttelt. Der Extrakt wurde auf eine mit Kieselsäuregel beschickte chromatographische Säule gebracht, die mit Gemischen aus Methylenchlorid und Äthanol eluiert wurde. Auf diese Art wurde Prednisolon gewonnen. Beispiel 2 Ein Versuch wurde, wie oben beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daB diesmal der verwendete Microorganismus N. globerula (ATCC Nr.9356) war. Prednisolon wurde auf dieselbe Art gewonnen. Beispiel 3 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei Cortison als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Es wurde das Produkt Prednison gewonnen.
• Beispiel 4 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei Cortison als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Prednison wurde auf dieselbe Art gewonnen. Beispiel 5 Eine Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, wobei man das in den obigen Beispielen beschriebene Verfahren anwandte und die folgenden Steroide benutzte: Verbindung S 9a-Fluor-Verbindung F d 4#8-Androstadiendion 11 ß,17a-Oxyprogesteron d 1#4-Dehydro-Verbindung S Androstendion 19-Nortestosteron 17 a-Oxyprogesteron 16-Dehydroprogesteron 11-Ketoprogesteron A'(")-Dehydro-Verbindung S 14a,15a-Epoxy-Verbindung S 14a,15a-Epoxy-Verbindung F 14a-Oxy-hydrocortison 14a-Oxy-cortison Die Produkte wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion gewonnen und papierchromatographisch bestimmt. In j edem Falle wurde festgestellt, daB in 1-Stellung eine Doppelbindung eingeführt worden war.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Kernoxydation von d 4-3-Ketosteroiden, die 18 bis 21 Kohlenstoffatome enthalten durch Bebrütung mit Kulturen oxydierend wirkender Mikroorganismen oder den aus diesen hergestellten oxydierend wirkenden Enzymen unter submersen und aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daB man als oxydierend wirkenden Organismus einen solchen aus der Gattung Nocardia verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daB man einen Organismus der Art Nocardia opaca oder Nocardia globerula verwendet.