DE1093792B

DE1093792B - Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-í¸-steroiden

Info

Publication number: DE1093792B
Application number: DEP21748A
Authority: DE
Inventors: Dan Joseph Badia; Joseph Louis Sardinas
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1957-11-27
Filing date: 1958-11-19
Publication date: 1960-12-01

Description

Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-41,4-steroiden In der Patentanmeldung P 17035 IVb/12 o ist ein Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-d1#4-steroiden durch Fermentierung von 3-Keto-44-Steroiden mit einem Mikroorganismus der Art Nocardia beschrieben. Es ist ferner bekannt, daß eine Spezies von Corynebacterium, nämlich Corynebacterium simpler, 3-Keto-41,4-Steroide durch Dehydrierung von 3-Keto-44-steroiden bildet (Journal of American Chemical Society, Bd. 77, S. 4184 [19551).
Es wurde nun gefunden, daß sich dieses Verfahren mit hohen Ausbeuten an 3-Keto-d1#4-Steroiden unter leichter kontrollierbaren Bedingungen noch besser durchführen läßt, wenn man dem Reaktionsmedium kleinere Mengen an antibakteriellen Antibiotika zusetzt. Diese Maßnahme ist besonders wirksam, wenn eine größere Impfmenge von Nocardia oder einer Spezies des Corynebacteriums dem Steroidreaktionsgemisch zugesetzt wird. Häufig stellt man bei Verwendung einer großen Impfmenge ohne ein Antibiotikum eine Zerstörung des Steroidgehaltes im Reaktionsgemisch fest. Die Verwendung einer größeren Impfmenge der ausgewählten Spezies ergibt bei der Herstellung der 3-Keto-d1#4-steroide eine größere Wirtschaftlichkeit und eine wirksamere Ausnutzung der wertvollen Vorrichtung, weil dadurch höhere Enzymwirksamkeit in dem Reaktionsgemisch geschaffen wird, die die Umwandlung von größeren 3-Keto-44-steroidmengen zuläßt. Diese höhere Enzymwirksamkeit bei der durch Fermentierung bewirkten Herstellung von 3-Keto-41,4-Steroiden wird möglich gemacht, wenn man kleinere Mengen eines antibakteriellen Antibiotikums zusammen mit der Impfmenge in das Reaktionsgemisch gibt. Die vorliegende Erfindung schafft also für die Industrie ein wirtschaftlicheres und praktischeres Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-41,4-steroiden, von denen einige als Verbindungen bei der Behandlung von verschiedenen Entzündungskrankheiten, wie z. B. rheumatoider Arthritis, Asthma und Dermatose, wertvoll sind.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine 3-Keto-d4-steroidverbindung mit 18 bis 21 C-Atomen mit den oxydierenden Enzymen eines Mikroorganismus der Art Nocardia oder der Art Corynebacterium in Gegenwart einer die gewünschte Steroidausbeute vergrößernden Menge wenigstens eines Antibiotikums zusammengebracht.
Die Umwandlung von 3-Keto-d 4-steroiden in 3-Keto-41,4-steroide mittels oxydierender Enzyme der Spezies der Genera Nocardia und Corynebacterium erfolgt innerhalb von bis zu etwa 2 Tagen. Bei der Verwendung einer großen Impfmenge aus den Spezies Nocardia oder Corynebacterium, beispielsweise etwa 5 °/o und mehr, bis zu etwa 20 °/a des gesamten Reaktionsvolumens, werden merklich geringere Ausbeuten an den gewünschten Steroiden erzielt. Völlig unerwartet wurde nun gefunden, daß bei der Verwendung von Impfmengen der obigen Größenordnung 3-Keto-d1#4-steroide in ausgezeichneter Ausbeute sogar nach nur 12 Stunden erhalten werden, wenn eine kleine Menge eines antibakteriellen Antibiotikums, wie z. B. eines Tetracyclins, Neomycin, Streptomycin oder Dihydrostreptomycin zu dem Reaktionsgemisch gegeben wird. Unter einem Antibiotikum von der Art des Tetracyclins wird Tetracyclin, Oxytetr acyclin und Chlortetracyclin, Bromtetracyclin, Desmethyltetracyclin und Desmethylchlortetracyclin und deren verschiedene aktive Salze und Derivate, wie beispielsweise die sauren Salze, z. B. die Halogenwasserstoffsalze und Metallsalze, wie z. B. die Alkalimetallsalze, verstanden. Amphotere Substanzen entweder in wasserfreier oder hydratisierter Form können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Verbindungen von Neomycin, Streptomycin und Dihydrostreptomycin sind z. B. das Sulfat oder das Phosphat. Auch die freien Basen können verwendet werden. Die Menge des zu dem Reaktionsgemisch zuzugebenden Antibiotikums soll so groß sein, daß eine Gesamtblockierung des Enzymsystems der Mikroorganismen nicht stattfindet. Eine Steroidumwandlung findet also dann nicht statt, wenn eine zu große Menge des Antibiotikums zu dem Reaktionsgemisch gegeben wird, obgleich keine merkliche Steroidzersetzung festgestellt wird. Bei einer zu kleinen Menge des Antibiotikums ist die Steroidzersetzung ziemlich ausgeprägt, wenn auch eine Umwandlung zu 3-Keto-d1>4-steroiden dabei stattfindet. Bei jedem dieser Antibiotika soll zur Erzielung der gewünschten 3-Keto-41,4-steroidausbeute eine bestimmte Konzentration verwendet werden. Es scheint keine für alle Antibiotika geeignete allgemeine Konzentration anwendbar zu sein.
Es wurde weiter gefunden, daß man, abgesehen von den ausgezeichneten Ausbeuten, die Konzentration des in dem Reaktionsgemisch anwesenden Antibiotikums zur Regulierung der zur Erzielung maximaler Steroidausbeuten erforderlichen Zeit verwenden kann. Wird beispielsweise eine Impfmenge der Spezies Nocardia oder Corynebacterium von 50/, und eine Tetracyclinmenge von 5 ;,/ccm in einem die Verbindung F (44-Pregnenl lß,17a,21-triol-3,20-dion) enthaltenden Reaktionsmedium verwendet, so werden maximale Ausbeuten von 84 °/o Prednisolon in 40 Stunden erzielt. Wird eine Menge von 100y Streptomycin pro ccm verwendet, so wird nach 40 Stunden eine Ausbeute von 79 % Prednisolon erzielt.
Es können auch Gemische der Antibiotika verwendet werden. Wird beispielsweise ein Gemisch von 1 y Oxytetracyclin und 0,25 y Neomycin pro ccm des Reaktionsgemisches verwendet, so wird in etwas weniger als 30 Stunden eine maximale Ausbeute von 68 °/o erzielt. Gemische dieser Antibiotika sind besonders wirksam, wobei im Verhältnis zur Wirksamkeit von Oxytetracyclin oder Neomycin allein eine synergistische Wirkung festgestellt wird. Ferner wird bei einer Menge von 0,5,y Oxytetracyclin und 0,125 y Neomycin bei Verwendung einer Impfmenge von 5 °/o eine 641)/oige Ausbeute an Prednisolon erhalten.
Die zur Erzielung der maximalen Ausbeuten allgemein erforderliche Reaktionszeit hängt von der Menge des verwendeten Antibiotikums ab. Zur Erzielung bester Ergebnisse werden die Antibiotika von der Art des Tetracyclins in einer Menge von etwa 2 bis 15 y/ccm des Reaktionsgemisches bei Verwendung einer 501,-Impfmenge der Spezies Nocardia oder Corynebacterium verwendet. Streptomycin und Dihydrostreptomycin werden in einer Konzentration von 50 bis 200 y/ccm Reaktionsmedium und Neomycin in einer Menge von 1 bis 4 y/ccm verwendet. Werden die Antibiotika in größeren Konzentrationen, als der vorstehend angegebenen oberen Grenze entspricht, verwendet, so werden die Steroidausbeuten geringer und längere Reaktionszeiten erforderlich. Bei größeren Impfmengen bis zu 18 °/o können zur Erzielung bester Ergebnisse größere Antibiotikamengen verwendet werden. Ein Gemisch von 1,0 y/ccm Oxytetracyclin und 0,25 y/ccm Neomycin ergibt beispielsweise eine 77°/oige Umwandlung der Verbindung F zu Prednisolon innerhalb von nur 16 Stunden. Bei einer Konzentration von 4 y/cem Oxytetracyclin und 1 y/ccm Neomycin wird bei der gleichen Impfmenge eine 69°/oige Ausbeute an Prednisolon innerhalb von 60 Stunden erhalten.
Andere Antibiotika werden auf ihre Wirksamkeit in dem erfindungsgemäßen Verfahren durch ein einfaches Testverfahren untersucht. Dieses beruht auf der Feststellung von Steroiden, die in einem Gärungsreaktionsmedium für kleine Versuche enthalten sind. Beispielsweise können eine Anzahl von Proben der Reaktionsmedia in kleinen Fermentationsbehältern hergestellt werden, zu denen jeweils das gleiche Volumen der Impfmenge eines Mikroorganismus der Spezies Nocardia oder Corynebacterium zusammen mit verschiedenen Mengen der Antibiotika zugegeben werden. Die Wirksamkeit der zu untersuchenden Antibiotika wird durch periodische Untersuchung der Proben der Reaktionsmedia mittels Papierchromatographie festgestellt, wobei die Gesamtmenge des in dem Reaktionsgemisch anwesenden Steroids durch Bestimmung der Prozentsätze der noch in dem Reaktionsgemisch anwesenden 3-Keto-44-steroide und 3-Keto-41#4-steroide festgestellt wird. In der Literatur sind viele Standard-Papierchromatographieverfahren, die mit Vorteil verwendet werden können, beschrieben. Durch diese einfachen Testverfahren kann die optimale Antibiotikakonzentration sowie die Zeit zur optimalen Umwandlung von 3-Keto-44-steroiden in 3-Keto-41#4-steroide bestimmt werden. So haben sich z. B. Penicillin, Tyrothycin, Polymixin, Chloramphenicol, Erythromycin, Carbomycin, Bacitracin, Viomycin, Gramicidin, Novobiocin, Dextromycin, Oleandomycin, Magnamycin und Chlormycetin als wirksam erwiesen. Antifungale Antibiotika, wie z. B. Nystatin, Thiolutin, Cycloheximid und Rimocidin, bewirken nicht die enzymatische Umwandlung von 3-Keto-d 4-steroiden zu 3-Keto-41#4-steroiden.

Als Ausgangsstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren dienen z. B.

Verbindung F (Hydro-

cortison) 9a-Fluoroverbindung F

Verbindung E (Cortison) 14a-Oxy-Verbindung F

Corticosteron 11-Epihydrocortison

Verbindung S d4,e-Androstadiendion

14a-Oxyverbindung S 1Iß,17a-Dioxyprogesteron

Desoxycorticosteron 414-Dehydroverbindung S

Androstendion Testosteron

19-Nortestosteron Progesteron

17a-Oxyprogesteron 16-Dehydroprogesteron

11-Ketoprogesteron d 9 (11)-Dehydroverbin-

dung S

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind verschiedene Spezies der Genera Nocardia und Corynebacterium brauchbar. Die Mikroorganismen können leicht aus öffentlichen Kultursammlungen erhalten werden. Beispielsweise umfaßt die Spezies des Genus Nocardia der American Type Culture Collection in Washington D. C., die für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbar ist, Nocardia convuluta, ATCC 4275, Nocardia corallina, ATCC 4275, Nocardia erythropdis, ATCC 4277, Nocardia gardneri, ATCC 12635, Nocardia minima, ATCC 8074, Nocardia polychromogenes, ATCC 3409, wobei die Organismen der Spezies Nocardia opaca und Nocardia globeruls besonders wertvoll sind. Spezies des Genus Corynebacterium, wie z. B. die Spezies C. simplex, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar ist, sind gleichfalls in der American Type Culture Collection erhältlich. Die verschiedenen Spezies der Nocardia und Corynebacterium unterscheiden sich beachtlich bezüglich der Leichtigkeit und Schnelligkeit, mit der die Dehydrierung bewirkt wird. Auch innerhalb der Stämme der gleichen Spezies gibt es Unterschiede. In ähnlicher Weise gibt es Unterschiede bei den verschiedenen Steroidsubstraten hinsichtlich der Leichtigkeit und Schnelligkeit, mit der die Dehydrierung des A-Ringes stattfindet. Es ist jedoch durch einfachste Routineversuche möglich, die optimalen Bedingungen für die Dehydrierung jedes besonderen Steroids für jede besondere Spezies des Mikroorganismus und eines jeden besonderen Antibiotikums festzustellen.

Vorzugsweise wird folgendes Verfahren für die Umwandlung von 3-Keto-44-steroiden angewendet: Die Nährmedien werden mit Kulturen der gewählten Nocardia- oder Corynebacterium-Spezies geimpft. Ein derartiges Medium besteht beispielsweise aus einem Gemisch einer bakteriologischen Standardnährbrühe und zugesetzten Kohlehydraten. Die Kultivierung von Nocardia und Corynebacterium ist sehr ausführlich in vielen Veröffentlichungen beschrieben. Die geimpfte sterile Nährlösung läßt man 2 bis 3 Tage in Schüttelflaschen wachsen, um eine Impfmenge für größere Gefäße zu erhalten. Die größeren, gerührten und belüfteten Gefäße werden wiederum zur Impfung von Gefäßen, die in industriellen Verfahren für submerse Gärung verwendet werden, benutzt. Ein Medium des oben beschriebenen Typs wird für die erfindungsgemäße industrielle Oxydation der Steroide verwendet. Es können natürlich beträchtliche Veränderungen des Mediums vorgenommen werden. Im allgemeinen sind ein Kohlehydrat, eine Quelle für organischen Stickstoff, Mineralsalze und verschiedene Spurenmetalle erforderlich.
Die Steroidverbindung kann dem Nährmedium und dem mit den ausgewählten Spezies geimpften Medium unmittelbar zugeführt werden. Proben des geschüttelten und belüfteten Gemisches werden von Zeit zu Zeit entnommen, um die Umwandlung der Steroidverbindung zu dem oxydierten Produkt festzustellen. Das Gemisch wird während des Wachstums der Zellen und der Umwandlung des Steroids zwischen 20 und 37°C gehalten. Im allgemeinen sind zur maximalen Produktion der Oxydationsprodukte etwa 12 bis 40 Stunden erforderlich. Das Wachstum der Zellen kann auch schon vor Zugabe des Steroids beendet sein. Bei der Herstellung von Prednisolon (41,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion) verwendet man die reine Verbindung F als Ausgangsmaterial. Auch kann die Verbindung F, die durch die Gärung von Verbindung S mit einem Mikroorganismus des Genus Curvularia, wie in der USA.-Patentschrift 2658023 beschrieben, hergestellt wird, direkt in situ durch Zugabe einer Nocardia- oder Corynebacterium-Spezies zu der ursprünglichen Fermentierungsflüssigkeit in Prednisolon umgewandelt werden. Dieses letztere Verfahren ist zweckmäßig, da es eine Verbesserung der Gesamtausbeute an Prednisolon aus der Verbindung S ergibt. Es ist ferner deshalb zweckmäßig, weil es die Notwendigkeit zur Isolierung und Reinigung der Verbindung F vermeidet.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten antibakteriellen Antibiotika sollten vor oder während der Zugabe der Impfmenge hinzugegeben werden. Sie können in irgendeiner geeigneten Form verwendet werden. Da sie in so geringen Konzentrationen verwendet werden, werden gewöhnlich die Halogenwasserstoffsalze, wie beispielsweise das Hydrochlorid oder andere Salze, wie z. B. die Sulfate, verwendet. Verschiedene Aktivitätskonzentrationen pro Gewichtseinheit einiger löslicher Salze der oben beschriebenen Antibiotika werden nachstehend angegeben:

7I mg

Oxytetracyclinhydrochlorid ............... 885

Tetracyclinhydrochlorid .................. 970

Chlortetracyclinhydrochlorid .............. 965

Streptomycinsulfat ...................... 765

Neomycinsulfat ...... .................. 650

Aktivitätskonzentrationen anderer löslicher Formen der Antibiotika sowie der Antibiotika selbst sind in der Literatur angegeben.

Die Produkte, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, werden aus wäßrigen Lösungen mittels mit Wasser nicht mischbarer organischer Lösungsmittel nach bekannten Methoden extrahiert. Niedere halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Chloroform, sind besonders brauchbar. Nach der Extraktion werden die Lösungsmittel abdestilliert, und das feste Produkt wird isoliert. Dieses Produkt wird weiter durch Umkristallisation aus organischen Lösungsmitteln oder durch Chromatographie, z. B. über Tonerdekolonnen oder andere geeignete absorbierende Stoffe, gereinigt. Die Verwendung einer Kieselsäuregel-Äthanol-Kolonne mit Gemischen aus Methylenchlorid und 2 bis 5 Volumprozent Äthanol (950/,) als Entwickler ist besonders vorteilhaft.
Für manche Zwecke ist es nicht erforderlich, die Produkte zu trennen, sondern es kann das rohe Gemisch als solches verwendet werden. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, das Rohprodukt zu acylieren und mit den erhaltenen Estern weiterzuarbeiten, die etwas beständiger sind. Die verfahrensgemäß hergestellten Produkte werden als Zwischenprodukte für die Synthese anderer Verbindungen verwendet. Beispielsweise können sie besonders leicht einer Aromatisierung nach I n h o f f e n unter Bildung von Derivaten des Östrons unterworfen werden. Ferner kann z. B. die 1-Dehydroverbindung S nach Standardverfahren, z. B. durch Oxydation mit Chromsäure, in das entsprechende 17-Ketosteroid übergeführt werden.
Außer den obenerwähnten Verwendungen sind viele der nach der hier beschriebenen Umsetzung hergestellten Verbindungen biologisch äußerst wertvoll. Wenn beispielsweise Hydrocortison mit Nocardia oder Corynebacterium gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird, erhält man Prednisolon, das bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis wertvoll ist und gegenüber Hydrocortison Vorteile hat. Wenn man Cortison behandelt, so erhält man die als Prednison bekannte Verbindung, die gleichfalls bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis wertvoll ist. Es wurde gefunden, daß andere 3-Keto-d 1.4-steroide eine große Wirksamkeit als Nebennierenrindenhormone besitzen und für die gleichen Zwecke wie Hydrocortison wertvoll sind.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse sind nicht vollständig aufgeklärt. Man nimmt jedoch an, daß bei der Verwendung großer Impfmengen der Spezies Nocardia oder Corynebacterium bei der technischen Herstellung die Steroide des Reaktionsgemisches durch das Wachstum von Bakterien zerstört werden. Das Antibiotikum dürfte bei gewissen Konzentrationen in irgendeiner Art die an der Zerstörung der Steroide beteiligten Enzyme blockieren, ohne die Dehydrierung der 1(2)-Stellung zu beeinträchtigen.
Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1 Man ließ Curvularia lunata, NRRL-2380, 24 Stunden bei 28°C auf einem Nährboden aus Sojabohnenmehl und KZ H P 04 wachsen. Während des Wachstums wurde mit einer Geschwindigkeit von 300 U/min gerührt und 1i2 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute durchgeleitet.

191 dieser Kultur wurden unter sterilen Bedingungen zu 3801 eines sterilen Gärmediums folgender Zusammensetzung gegeben:

Na N 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20/,

M9S04. 7 H20 . ..... .. .. .. ... ... . 0,050/0

K Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,050/,

Fe S 04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0010/0

Rohrzucker ....................... 1,00/0

CaCl2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,050/,

Na4P207 ......................... 0,40/0

Polyoxyäthylenderivate von Teilestern

gewöhnlicher Fettsäuren (Laurin-,

Palmitin-, Stearin- und Ölsäure) und

vom Sorbit abgeleiteter Hexit-

anhydride (bekannt unter dem

Handelsnamen Tween 80) . . . . . . . . 0,25 Volum-

prozent

Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/,

Der PH-Wert wurde nach dem Sterilisieren mit K O H auf 7,0 eingestellt. Das Gärmedium wurde mit 1150 U/min gerührt und 1/2 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute 24 Stunden bei 28°C durchgeleitet. Das Gärmedium wurde dann mit 2 Volumen sterilem Wasser verdünnt. 150 g Verbindung S-Monoacetat, das unter Erhitzen auf 80°C in 3,31 Monomethyläther des Äthylenglycols (bekannt unter dem Handelsnamen Methylcellosolve) gelöst worden war, wurde dann zu 3801 des verdünnten Mediums zugegeben. Die Umwandlung zu Verbindung F wird zweckmäßig durch Papierchromatographie überprüft. Nach 12 bis 24 Stunden war die Verbindung S in 90 g der Verbindung F umgewandelt worden. Nach Zugabe von 1331 sterilem Wasser wurde der PH-Wert mit K 0 H auf 7,5 eingestellt. Das verdünnte Gemisch wurde bei 80°C entwa 5 Minuten erhitzt, und es wurden 571 eines Zusatzes der folgenden Zusammensetzung zugegeben:

N H4 N 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,00/,

K2 H P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8,70/,

Mg S 04 - 7 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,250/0

NaCl ............................. 0,00501 ,

FeS04 - 7 11,0 . . . .. ... . .. . . . .. . . . . . 0,00010/0

Fumarsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/,

Der pH-Wert wurde mit K 0 H auf 7,0 eingestellt. Nocardia opaca, ATCC 4276, ließ man unter Rühren mit 300 U/min und einer Belüftung von 1 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute 40 Stunden bei 28°C in einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung wachsen:

Maiswasser ......................... 10/0

Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/

0

Glycerin ............................ 2%

Traubenmelasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,21)4

CaC 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0

Der pll-«"ert wurde vor der Zugabe von Ca C03 auf 7,0 eingestellt. 28,451 hiervon wurden zu dem die Verbindung F enthaltenden Reaktionsgemisch gegeben, durch das dann '/,Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute geblasen wurde. Vor der Zugabe des Impfproduktes wird eine solche Menge Oxytetracyclinhydrochlorid zu dem die Verbindung F enthaltenden Reaktionsgemisch zugegeben, daß 5 y des Antibiotikums pro ccm des endgültigen Reaktionsvolumens zugegen sind. Das Gärmedium wird während der mit 1/2 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute vorgenommenen Belüftung bei 28` C gehalten. Nach 40 Stunden erhält man Prednisolon durch Extrahieren des Reaktionsgemisches mit Chloroform, Aufbringen des Extrakts auf eine Kieselsäuregelkolonne und Auswaschen mit Gemischen von Methylenchlorid und Äthanol in ausgezeichneter Ausbeute, die 68 0!0, bezogen auf die Verbindung F, beträgt. Beispiel 2 Eine Kultur von N. opaca, ATCC 4276, wurde wie im Beispiel 1 hergestellt. Ein Gärmedium wurde darauf hergestellt, indem man 381 des im Beispiel 1 beschriebenen Zusatzes zu 3801 Wasser gab, das mit K O H auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt worden war und vorher etwa 5 Minuten auf 80°C erhitzt worden war.

211 des N. opaca-Gärmediums wurden dann zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Es wurde eine solche Menge Tetracyclinhydrochlorid zugegeben und außerdem 60 g der Verbindung F in kristalliner Form. Innerhalb von 40 Stunden wurde wie im Beispiel 1 eine 86%ige Prednisolonausbeute erhalten. Beispiel 3 C. lunata, NRLL-2380, ließ man wie im Beispiel 1 unter Verwendung des folgenden sterilen Gärmediums wachsen:

Glucosemonohydrat (bekannt unter dem

Handelsnamen Cerelose) . . . . . . . . . . . 1,00/,

Lactose ........................... 2,00/0

Maiswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,00/0

Nag S 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0

Maismehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,20/0

Sojabohnenöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 ccm/3,71

Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,550/0

Der PH-Wert wurde mittels KOH vor Zugabe von CaCO3 auf 6,25 eingestellt. Nach dem Verfahren des Beispiels l wurden so 133g Verbindung S in 75g Verbindung F umgewandelt.

N. opaca, ATCC 4276, ließ man wie im Beispiel 1 wachsen und wandelte Verbindung F in Prednisolon um: Hierbei wurde das gleiche Verfahren angewandt, jedoch wurde an Stelle von Oxy tetracyclin ein Gemisch von Oxytetracyclin und Neomycinsulfat verwendet, das ausreichte, um 13 y/ccm Oxytetracyclin und 3,3 y/ccm Neomycin zu erhalten. Innerhalb von 40 Stunden wurde eine 70%ige Ausbeute an Prednisolon erhalten. Beispiel 4 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt. An Stelle von Oxytetracyclin wurde eine solche Menge an Streptomycinsulfat verwendet, die ausreichte, um eine Konzentration von 100 y Streptomycin pro ccm des Reaktionsmediums zu erhalten. Es wurde eine 790/0ige Ausbeute an Prednisolon erhalten. Beispiel 5 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei an Stelle von Oxytetracyclin eine Konzentration von 1 y Oxytetracyclin und 0,25y Neomycin pro ccm des Reaktionsmediums verwendet wurden. Innerhalb von 28 Stunden wurde eine 680/0ige Ausbeute an Prednisolon erhalten. Beispiel 6 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von 0,5 y Oxytetracyclin und 0,125 y Neomycin an Stelle von Oxytetracyclin wiederholt. Nach 26 Stunden wurde eine 640/0ige Ausbeute an Prednisolon erhalten. Beispiel 7 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde unter Verwendung von 75,801 N. opaca Wachstumsmedium in Gegenwart von 1 y/ccm Oxytetracyclin und 0,25 y/ccm Neomycin wiederholt. Innerhalb von 16 Stunden hatte eine 77%ige Umwandlung der Verbindung F in Prednisolon stattgefunden. Beispiel 8 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von 102,331 N. opaca Wachstumsmedium in Gegenwart von 4 y/ccm Oxytetracyclin und 1 y/ccm Neomycin wiederholt. Innerhalb von 60 Stunden wurde eine 69%ige Ausbeute an Prednisolon erhalten.
Beispiel 9 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei an Stelle von Tetracyclin eine Konzentration von 15 y Tetracyclin pro ccm Reaktionsmedium verwendet wurde. Innerhalb von 40 Stunden wurde eine 800/0ige Ausbeute an Prednisolon erhalten. Beispiel 10 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei an Stelle von Tetracyclin eine Menge an Neomycinsulfat verwendet wurde, die ausreichte, um eine Konzentration von 4,y Neomycin pro ccm des Reaktionsmediums zu erhalten. Innerhalb von 40 Stunden wurde eine 68o/oige Ausbeute an Prednisolon erhalten.
In jedem dieser Fälle wurden die Produkte aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion gewonnen und mittels Papierchromatographie ausgewertet. Es wurde gefunden, daß stets eine Doppelbindung in der 1-Stellung eingeführt worden war.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-dl>4-steroiden durch Bebrütung von 3-Keto-d 4-steroiden, die 18 bis 21 C-Atome enthalten, mit den oxydierenden Enzymen eines Mikroorganismus der Art Nocardia oder der Art Corynebacterium, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bebrütung in Gegenwart einer die Steroidbildung fördernden Menge mindestens eines Antibiotikums durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotikum Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin oder Neomycin verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotika Neomycin und Oxytetracyclin verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Tetracyclin, Oxytetracyclin oder Chlortetracyclin etwa 2 bis etwa 15 y/ccm des Reaktionsgemisches beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Neomycin etwa 1 bis etwa 4 y/ccm des Reaktionsgemisches beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Oxytetracyclin etwa 0,5 bis etwa 4 y/ccm des Reaktionsgemisches und die Menge an Neomycin von 0,125 bis etwa 1 y/ccm des Reaktionsgemisches beträgt.