DE1022586B - Verfahren zur Einfuehrung von Sauerstoff in Steroide - Google Patents

Description

• Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide Es ist bereits bekannt, mittels Enzymen aus Nebennieren, insbesondere mit deren Homogenaten oder auch bei ihrer Durchströmung, Hydroxylgruppen u. a. in 21-Stellung von Steroiden einzuführen. So interessant diese Funktion tierischer Enzyme vom theoretischen Standpunkt aus ist, so vermag sie zur präparativen und speziell industriellen Gewinnung von 21-Oxysteroiden nicht zu befriedigen. Mit mikrobiologischen Methoden, die sich auch im größten Stile anwenden lassen, ist die genannte Reaktion bisher nicht durchführbar gewesen.
• Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zurEinführung von Sauerstoff in Steroide durch Bebrütung mit Kulturen oxydierend wirkender Pilze oder den durch diese erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen unter aeroben, vorzugsweise submersen Bedingungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Verbindungen der Pregnanreihe, die in 21-Stellung unsubstituiert sind, der biologischen Oxydation mit Pilzen der Arten Ophiobolus herpotrichus oder Sclerotinia fructicola in bekannter Weise unterwirft und die erhaltenen 21-Oxysteroide in bekannter Weise isoliert.
• Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind allgemein Verbindungen der Pregnanreihe, die in 21 -Stellung urisubstituiert sind, worunter gesättigte und ungesättigte, beliebig konfigurierte und substituierte Derivate des 10,13-Dimethy l -17-äthyl-cyclopentanopolyhydrophenanthrens sowie seiner höheren und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Nor-, D-Homo- und 19-N or-verbindungen, verstanden sind. Doppelbindungen befinden sich z. B. in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15-und/'oder 16-Stellung. Die Konfiguration der Ausgangsstoffe ist v orzugsweise diej enige des Pregnans, 5 a-Pregnans, 17a-Prägnans oder entsprechender Racemate, wie sie bei der Totalsynthese erhalten werden. A1sSubstituenten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-; Semicarbazon-und Enolgruppen, z. B. in 2-, 3-, 6-, 7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19- und 20-Stellung, ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor, z. B. in 9- und 17-Stellung. Spezifische Ausgangsstoffe sind u. a. Progesteron, 17a-Progesteron, 16a-Oxyprogesteron, 17a-Oxyprogesteron, 11-Ketoprogesteron, 11a- sowie 11ß-Oxyprogesteron, 9,11- oder 11,12-Dehydroprogesteron, 19-Oxoprogesteron, 11-Keto-17a-oxyprogesteron, 11a- sowie 11 ß-Oxyprogesteron, 9-Chlor- oder 9-Fluor-11ß,17a-dioxyprogesteron, 11ß,18-Dioxyprogesteron, 11ß,17,18-Trioxyprogesteron, 11 ß-Oxy-18-oxoprogesteron, 9-Chlor- oder 9-Fluor-11ß-oxy -18 - oxoprogesteron, 11,18 - Dioxoprogesteron, 19-Nor-progesteron, 19-Nor-11 ß-oxy-18-oxoprogesteron, Pregnenolon bzw. ihre funktionellen Derivate.
• Die verwendeten Enzyme sind mikrobiologischer Herkunft und durch aerobe Kulturen von Pilzen der Arten Ophiobolus herpotrichus oder Sclerotinia fructicola produziert. Zur Einführung von Sauerstoff inkubiert man meist direkt die Ausgangsstoffe mit den unter an sich bekannten aeroben Bedingungen submers wachsenden Kulturen der genannten Pilze. Diese werden zweckmäßig bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne daß dieErfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll. Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sog. Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol, zu und inkubiert weiter. Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die Reaktionsprodukte in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen u. dgl. Dieselben Umsetzungen lassen sich aber auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen von Pilzen der genannten Arten zuerst abtrennt und unter Ausschluß der wachsenden Kulturen verwendet.
• Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Von größtem praktischem Interesse sind z. B. Cortison, Hydrocortison, 1-Dehydrocortison, 1-Dehydrohydrocortison, Reichsteins Substanz S, Aldosteron sowie die z. B. aus Progesteron, Pregnenolon und 1:1-Ketoprogesteron entstehenden mehrfach durch Sauerstoff substituierten Derivate.
• Daß man durch Pilze oder durch aus Pilzen abgesonderte Enzyme Sauerstoffunktionen in ein Steroid einführen kann, wurde bereits in der USA.-Patentschrift 2602769 offenbart, welche ein Verfahren zur 11-Hydroxylierung von Steroiden mittels Pilzen der Ordnung Mucorales beschreibt. Durch die vorliegende Anmeldung wird nun der Stand der Kenntnisse durch die Lehre bereichert, daß zweckmäßig ausgewählte Pilzarten, wie die hierin genannten, selektive Oxydation eines Steroides im Sinne der 21-Hydroxylierung bewirken können.
• Die Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 4 1 70prozentige Bierwürze werden in einem Schüttelgefäß sterilisiert (px 5;6) und mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Nach 3tägigem Schütteln bei 26° gibt man zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1,0 g Progesteron in 25 cm3 Aceton und schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt. Man schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 1 1 Essigester aus und wäscht die Extrakte mit ln-Salzsäure, 1n-Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigesterlösung wird im Vakuum bei 40° eingedampft. Der Rückstand (1,2 g) wird an 15 g Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen z>Silicagel«) chromatographiert, wobei zuerst mit Methylenchlorid, dann mit Chloroform und schließlich mit Chloroform-Aceton-Gemischen mit steigendem Acetongehalt eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm3) werden eingedampft und papierchromatographisch untersucht. Die Methylenchlorid-Fraktionenunddie ersten mitChloroform eluiertenFraktionen enthalten neben Verunreinigungen nur Ausgangsmaterial, während in den letzten Chloroform-Fraktionensowie finden Chloroform-Aceton-Eluaten (95: 5 und 90: 10) Cortexon (11-Desoxycorticosteron, 4-Pregnen-21-ol-3,20-dion) anwesend ist: Diese Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Der zur Hauptsache aus Cortexon bestehende Rückstand (0,81 g) wird aus Äther umkristallisiert, wobei farblose Platten vom F. = 140 bis 142° erhalten werden. Diese Kristalle besitzen eine optische Drehung von -f- 175° und zeigen imGemisch mit authentischemMaterial keine Schmelzpunktserniedrigung. Ebenso sind ihre Infrarot- und Ultraviolett-Spektren identisch mit denjenigen von Cortexon. Beispiel 2 150 cm3 einer Nährlösung, enthaltend im Liter 50 g Rohglukose, 20 cm3Maisquellwasser und 10 gAmmoniumtartrat und im übrigen Leitungswasser, werden in einem Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fassungsvermögen sterilisiert und mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Nach 2tägigem Schütteln bei 26° hat sich die Kultur gut entwickelt, und man gibt unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg 11-Ketoprogesteron in 1,5 cm3 Aceton zu, worauf weitere 3 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt wird. Dann wird das Mycel abgetrennt. Man schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 50 cm3 Essigester aus und arbeitet die Extrakte, wie im Beispiel 1 beschrieben, auf. Der Rückstand (40 mg) wird papierchromatographisch untersucht und besteht zur Hauptsache aus 11-Dehydrocorticosteron (Kendalls Compound A; 4-Pregnen-21-ol-3,11,20-trion). Dieses kann nach chromatographischer Reinigung in kristalliner Form erhalten werden.
• Beispiel 3 Gibt man zu einer analogen Schüttel-Kultur von Ophiobolus herpotrichus, wie sie im Beispiel 2 beschrieben wurde, an Stelle des 11-Ketoprogesterons eine Lösung von 30 mg 17a-Oxyprogesteron in 1,5 cm3 Aceton, so erhält man nach analoger Inkubation und Extraktion ein rohes Reaktionsprodukt, das zur Hauptsache aus 17a-Oxycortexon (Reichsteins Substanz S; 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion) besteht. Dieses kann nach chromatographischer Reinigung in kristalliner Form erhalten werden. Beispiel 4 Zu 41 einer Schüttelkultur vonOphiobolus herpotrichus, die, wie im Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wurde, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 1-Dehydroprogesteron in 25 cm3 Aceton. Man schüttelt 3 Tage bei 27° und trennt dann das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird mehrere Male mit insgesamt 31 Essigsäure ausgeschüttelt. Die Extrakte wäscht man mit 1/"n-Salzsäure, In-Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigesterlösung wird im Vakuum eingedampft und der so erhaltene Rückstand (1,1 g) an 30 g »Silicagel« chromatographiert, wobei mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Gemischen steigenden Acetongehaltes eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm") werden eingedampft und Papierchromatographisch untersucht. In den Chloroform-Fraktionen befindet sich neben Verunreinigungen etwas Ausgangsmaterial, während die mit Chloroform-Aceton-(95: 5)-Gemischen eluierten Anteile (710 mg) zur Hauptsache aus 1-Dehydrocortexon (1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion) bestehen. Dieses wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch kristallisiert. F. = 185 bis 192°; [a] ö = -a- 120° (CHC13). Beispiel 5 Wird im obigen Beispiel an Stelle der Lösung von 1-Dehydroprogesteron eine solche von 1 g 1-Dehydro-11-keto-17a-oxyprogesteron in 25 cm3 Aceton zur Kultur zugegeben und wird in der beschriebenen Weise aufgearbeitet und chromatographiert, so bestehen die Chloroform-Aceton-(1 : 1)-Fraktionen zur Hauptsache aus 1-Dehydrocortison (1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion), das aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert wird; F. = 231 bis 233". Beispiel 6 Wird im Beispiel 4 an Stelle der Lösung von 1-Dehydroprogesteron eine solche von 1 g 1-Dehydro-11 ß,17a-dioxyprogesteron in 25 cm3 Methanol zugegeben und wird in der beschriebenen Weise aufgearbeitet und chromatographiert, so bestehen die Chloroform-Aceton-(1 : 1)-Fraktionen zur Hauptsache aus 1-Dehydrohydrocortison (1,4-Pregnadien-11,B,17a,21-triol-3,20-dion). Es wird aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert; F. = 239 bis 242°. Beispiel 7 In einem Erlenmeyerkolben werden 50 cm3 70prozentige Bierwürze sterilisiert und mit einer Kultur von Sclerotinia fructicola beimpft. Nach 4tägigem Schütteln bei 27° gibt man zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 10 mg Progesteron' in 0,5 cm3 Aceton. Man läßt weitere 4 Tage bei der gleichen Temperatur schütteln und trennt dann das Mycelab. Das Kulturfiltratwird mit Essigester erschöpfend ausgeschüttelt. Man wäscht den Extrakt mit Wasser, trocknet ihn und dampft ihn im Vakuum ein. Die papierchromatographische Untersuchung des so erhaltenen Rohextraktes zeigt, daß er zur Hauptsache aus Cortexon (11-Desoxycorticosteron; 4-Pregnen-21-ol-3,20-dion) besteht.
• Beispiel 8 Wird im obigen Beispiel an Stelle der Lösung von Progesteron eine solche von 10 mg 1-Dehydro-11-keto-17a-oxyprogesteron in 0,5 cm' Aceton zur Schüttelkultur von Sclerotinia fructicola zugegeben und wird in gleicher Weise inkubiert und aufgearbeitet, so besteht der Rohextrakt zur Hauptsache aus 1-Dehydrocortison (1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion).
• Beispiel 9 In einem Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fassungsvermögen werden 120 cm3 Bierwürze sterilisiert und mit Ophiobolus herpotrichus beimpft. Nach 4tägigem Schütteln bei 26° gibt man zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,1-4-Pregnen-llß-ol-3,20-dion-18-säure-lakton-(18 -.- 11ß) in 1,5 cm3 Aceton zu und läßt weitere 3 Tage bei 26° schütteln. Dann wird, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, mit Essigester extrahiert. Der Rohextrakt wird an Papier präparativ chromatographiert (System Propylenglykol-Toluol), wobei eine Substanz abgetrennt wird, die im Vergleich zum Ausgangsmaterial höher polar ist und alkalische Silberdiamminlösung rasch und stark reduziert. Sie wird aus Aceton-Äther kristallisiert und stellt das d,l-4-Pregnen-11ß,21-diol-3,20-dion-18-säure-lakton-(18 @ 11ß) dar.
• Das als Ausgangsstoff verwendete d,1-4-Pregnen-1lß-ol-3,20-dion-18-säure-lakton-(18 -+. 11ß) läßt sich z. B. gemäß dem Verfahren der Patentanmeldung R 15734 IVb/12o herstellen.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide durch Bebrütung mit Kulturen oxydierend wirkender Pilze oder den durch diese erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen unter aeroben, vorzugsweise submersen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Pregnanreihe, die in 21-Stellung unsubstituiert sind, der biologischen Oxydation mit Pilzen der Arten Ophiobolus herpotrichus oder Sclerotinia fructicola in bekannter Weise unterwirft und die erhaltenen Oxysteroide in bekannter Weise isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Progesteron, 11-Keto-progesteron, 17a-Oxy-progesteron, ferner in 1,4-Stellung ungesättigte Pregnadiene, insbesondere 1-Dehydroprogesteron, 1-Dehydro-11-keto-17a-oxyprogesteron oder 1-Dehydro-11ß,17a-dioxy-progesteron, als Ausgangsstoffe verwendet.