Verfahren zur mikrobiologischen 41-Dehydrierung von Steroiden Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues mikrobiologisches Verfahren zur Einführung einer Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen C-1 und C-2 des Steroidkerns vermittels Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden 44-3-Keto- steroide, wie 44-Pregnen-3,11,20-trion,17a,21-diol oder J4-Pregnen-3,20-dion-llss,17a,21-triol, in die entsprechenden d1.4-3-Keto-steroide, wie 41,4-Pregna- dien-3,11,20-trion-17a,
21-diol bzw. d1.4-Pregnadien- 3,20-dion-llss,17a,21-triol umgewandelt. Die letzt genannten Verbindungen besitzen Cortisonwirkung, unterscheiden sich aber darin von Cortison, dass sie frei sind von unerwünschten Nebenwirkungen, wie Oedembildung, da sie keine merkliche Natrium- oder Wasserretention bewirken.
Die Herstellung von 41.4-3-Keto-steroiden auf chemischem Wege zeitigte unbefriedigende Ergeb nisse, weil die benutzten chemischen Reaktionen zu Gemischen verschiedener Verbindungen führen. Eine Abtrennung der gewünschten Zwischen- und End produkte aus diesen Gemischen ist kostspielig und führt zu nur geringen Ausbeuten an den gewünschten J1.4-3-Keto-steroiden.
Zweck der vorliegenden Erfindung war die Schaf fung eines einstufigen Verfahrens zur Einführung einer J1-Doppelbindung in Steroide, welches Verfah ren selektiv sein und das gewünschte dl-Steroid frei von unerwünschten Nebenprodukten liefern sollte.
Weiter war Zweck der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens, nach welchem 44-3-Keto-pregnene direkt und in hoher Ausbeute in die entsprechenden J1,4-3- Keto-pregnadiene übergeführt werden können, oder mit andern Worten, eines Verfahrens zur Herstellung von J1.4-3-Keto-steroiden der Pregnanreihe auf direk tem Wege und in hoher Ausbeute aus den entspre chenden 3-Keto-pregnenen. Es wurde nun gefunden, dass die selektive di-De- hydrierung von Steroiden bewirkt werden kann durch ein neues biochemisches Dehydrierungsverfahren,
wel ches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Steroide, insbesondere ein in C-5 ungesättigtes und in C-3 oxy diertes Steroid, der Dehyd'rierungswirkung von Enzy men aus Mikroorganismen der Gattung Mycobacte- rium aussetzt, vorzugsweise derjenigen von Mikro organismen, welche zu den Arten Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium phlei, Mycobacterium lac- ticola und Mycobacterium tuberculosis gehören.
Diese Mycobacterien können von den bekannten Quellen bezogen werden, beispielsweise von der American Type Culture Collection, Washington, D. C., oder sie können nach bekannten Verfahren aus natürlichen Quellen isoliert werden, z. B. aus Erde oder aus einem Krankheitsherd.
Die Dehydrierung kann bewirkt werden durch Zusammenbringen des Steroid's mit einem Mycobacte- rium selbst oder, wenn erwünscht, mit den Enzymen eines Mycobacteriums, wobei der an den Kohlenstoff atomen C-1 und C-2 sitzende Wasserstoff selektiv entfernt wird unter Bildung des gewünschten dl-Ste- roids, welches von unerwünschten Nebenprodukten frei ist. Wenn ein 44-3-Keto-pregnen erfindungsge mäss dehydriert wird, erhält man direkt das entspre chende 41.4-Pregnadien in hoher Ausbeute.
Das erfindungsgemässe biochemische Dehydrie- rungsverfahren ist zum Beispiel anwendbar auf die dl-Dehydrierung von 3-Keto-steroiden, im allgemei nen unabhängig von den daran befindlichen Substi- tuenten oder vom Grad der Unges:ättigtheit in den Ringen B, C und D; gewöhnlich verwendet man je doch vorzugsweise als Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren in C-5 ungesättigte und in C-3 oxydierte Steroide der Pregnanreihe, wie z.
B.: '4-3-Keto-pregnene, wie 44-Pregnen-3-20-dion, J4-Pregnen-3,20-dion-17a-ol, 44-Pregnen-3,20-dion-21-ol, J4-Pregnen-3,20-dion-2 1-ol-21-acylat, J4-Pregnen-3,20-dion-21-ol-21-acetat, J4-Pregnen-3,20-dion-17a,21-diol, J4-Pregnen-3,20-dion-17,21-diol-21-acylat, J4-Pregnen-3,20-dion-17a,21-diol-21-acetat, J4-Pregnen-3,20-dion-17a-ol-21-al, J4-Pregnen-3,11,20-trion, 44-Pregnen-3,11,20-trion-17a-ol,
J4-Pregnen-3,11,20-trion-21-ol, J4-Pregnen-3,11,20-trion-21-ol-21-acylat, 44-Pregnen-3,11,20-trion-21-ol-21-acetat, J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol, J4-Pregnen-3,11,20-trion-17,21-diol-21-acylat, J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol-21-acetat, %I4-Pregnen-3,11,20-trion-17a-ol-21-al, d4-Pregnen-3,20-dion-11 ss-ol, J4-Pregnen-3,20-dion-11 ss,21-diol, J4-Pregnen-3,20-dion-11,21-diol-21-acylat, J4-Pregnen-3,
20-dion-11ss,21-diol-21-acetat, J4-Pregnen-3,20-dion-11 ss-ol-21-al, J4-Pregnen-3,20-dion-11 ss,17a-diol, '4-Pregnen-3,20-dion-11 ss,17 a,21-triol, J4-Pregnen-3,20-dion-11,17,21-triol-21-acylat, J4-Pregnen-3,20-dion-1 lss,17a-diol-2-al, J4-Pregnen-3,20-dion-11 ss,17a,21-triol-21-acetat;
9 Halogen-Derivate dieser 44-3-Keto-pregnene, wie 9-Halogen-J4-pregnen-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-J4-pregnen-3,20-dion-17a,21-diol, 9-Halogen-d4-pregnen-3,20-dion-17,21-diol-21- acylat, 9-Fluor-J4-pregnen-3,20-dion-17a,21-diol-21-acetat, 9-Halogen-44-pregnen-3,11,20-trion-17,21-diol, 9-Fluor-J4-pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol, 9-Halogen-J4-pregnen-3,11,20-trion-17,21-diol-21- acylat, 9-Fluor-J4-pregnen-3,11,20-trion-17a,
21-diol-21- acetat, 9-Halogen-J4-pregnen-3,20-dion-11,17,21-triol, 9-Fluor-d4-pregnen-3,20-dion-11 ss,17a,21-triol, 9-Halogen-44-pregnen-3,20-dion-11,17,21-triol-21- acylat, 9-Fluor-J4-pregnen-3,20-dion-11 ss,17a,21-triol-21- acetat usw.
Anstatt 44-3-Ketopregnene kann man als Aus gangsstoffe auch andere in C-5 ungesättigte und in C-3 oxydierte Steroide benützen, wie z. B.: 45-Pregnen-20-on-3-ol, J5-Pregnen-20-on-3,17 a-diol, J5-pregnen-20-on-3,21-diol, 15-Pregnen-20-on-3,2 1-diol-21-acylat, JS-Pregnen-20-on-3,21-diol-21-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,17a,21-triol, J5-Pregnen-20-on-3,17,21-triol-21-acylat, JS-Pregnen-20-on-3,17a,21 -triol-21-acetat,
J5-Pregnen-11,20-dion-3-ol, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17a-diol, J5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol, dz;-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-21-acylat, d5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-21-acetat, A,5-Pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol, d5-Pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-21-acylat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol-21-acetat, d5-Pregnen-20-on-3,11 ss-diol, d5-Pregnen-20-on-3,11 ss,21-triol, A5-Pregnen-20-on-3,11,
21-triol-21-acylat, d5-Pregnen-20-on-3,11 ss,21-triol-21-acetat, d5-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a-triol, J5-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol, d5-Pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol-21-acylat, d5-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol-21-acetat;
9-Halogenderivate dieser J5-3-Oxy-pregnene, wie 9-Halogen-J5-pregnen-20-on-3,17,21-triol, 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3,17a,21-triol, 9-Halogen-A5 -pregnen-20-on-3,17,21-triol - 21- acylat, 9-Fluor-45-pregnen-20-on-3,17a,21-triol-21-acetat, 9-Halogen-J5-pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol, 9-Fluor-d5-pregnen-11 ss,20-dion-3,17a,21-triol, 9-Halogen-J5-pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-21- acylat,
9-Fluor-d5-pregnen-11 ss,20-dion-3,17a,21-triol-21- acetat, 9-Halogen-i-' -pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol, 9-Fluor-d5-pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol, 9-Halogen-d5-pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol-21- acylat, 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3,11 i3,17a,21-tetrol-21- acetat, sowie d5-3-(niedrige Alkanoyloxy-Pre- gnene,
wie _95-Pregnen-20-on-3-ol-3-(niedriges Alkanoat), As-Pregnen-20-on-3-ol-3-acetat, d5-Pregnen-20-on-3,17-diol-3-(niedriges Alkanoat), d5-Pregnen-20-on-3,17 a-diol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3,21-bis-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3,21-diacetat, '5-Pregnen-20-on-3,17,
21-triol-3-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,17a,21-triol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,17,21-triol-3,21-bis-(niedriges Alkanoat), d5-Pregnen-20-on-3,17a,21-triol-3,21-diacetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3-ol-3-(niedriges Alkanoat), d5-Pregnen-11,20-dion-3-ol-3-acetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17-diol-3-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-11,20-dion-3,17 a-diol-3-acetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,
21-diol-3-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-3-acetat, d5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-3,21-bis-(niedriges Alkanoat), JS-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-3,21-diacetat, d5-Pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-3-(niedriges Alkanoat), d5-Pregnen-11,20-dion-3,17 a,21-triol-3-acetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-3,21-bis-(nied- riges Alkanoat), J--,-Pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol-3,21-diacetat,
J--,-Pregnen-20-on-3,11-diol-3-(niedriges Alkanoat), J -Pregnen-20-on-3, l lss-diol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,11,17-triol-3-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a-triol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,11,21-triol-3-(niedriges Alkanoat), _15-Pregnen-20-on-3,11 ss,21-triol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,11,21-triol-3,
21-bis-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,11 ss,21-triol-3,21-diacetat, Ji',-Pregnen-20-on-3,11 a,17,21-tetrol-3-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,1 lss,17a,21-tetrol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol-3,21-bis-(nied- riges Alkanoat), ._15-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol-3,21-diacetat;
9-Halogenderivate dieser J5-3-(niedrigen Alka- noyloxy)-Pregnene, wie 9-Halogen-45-pregnen-20-on-3,17,21-triol-3-(nied- riges Alkanoat), 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3,17a,21-triol-3-acetat, 9-Halogen-J5-pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-3- (niedriges Alkanoat), 9-Fluor-JS-pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol-3- acetat, 9-Halogen-J5-pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-3,
21- bis-(niedriges Alkanoat), 9-Fluor-JS-pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol-3,21- diacetat, 9-Halogen-.15-pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol-3- (niedriges Alkanoat), 9-Fluor-45-pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol-3- acetat, 9-Halogen-45-pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol-3,21- bis-(niedriges Alkanoat), 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3, l lss,17a,21-tetrol-3,
21- diacetat usw.
Diese als Ausgangsmaterialien verwendeten, in 3-Stellung oxydierten 45-Pregnene werden durch die Dehydrierungswirkung der Mycobacterium- Mikroorganismen direkt in die entsprechenden J1,4 - 3 - Keto - pregnadiene umgewandelt, bei wel cher Umwandlung vermutlich intermediär die 44 3 - Ketoverbindung gebildet wird.
Bei den oben genannten Ausgangsstoffen ist der Ester -Substi- tuent in 3- und/oder 21 -Stellung gewöhnlich der Acetatrest, doch können anstelle der Acetate, wenn erwünscht, auch die Ester von andern niedrigen Kohlenwasserstoff-Carbonsäuren verwendet werden, wie z. B. Propionate, Butyrate, tertiäre Butylacetate, Benzoate -usw.
Anstelle dieser in C-5 ungesättigten, in 3-Stellung oxydierten Pregnenen kann man als Aus gangsmaterialien auch 3-Keto-pregnane oder 3-Oxy- pregnane verwenden, welche durch Mycobacterium- Mikroorganismen ebenfalls selektiv dehydriert wer den, zur Erzielung von Doppelbindungen in dl und d4 (und, im Falle von 3-Oxy-pregnane, unter Oxyda tion der 3-Oxygruppe zur 3-Ketogruppe), wobei die entsprechende 41.4-3-Keto-pregnadiene gebildet wer den.
Die 3-Keto-pregnane und 3-Oxy-pregnane, welche als Ausgangsstoffe für die erfindungsgemässe Dehydrie- rung üblicherweise verwendet werden, umfassen: Pregnan-3,20-d'ion, Pregnan-3,20-dion-17a-01, Pregnan-3,20-dion-21-ol, Pregnan-3,20-dion-17a,21-diol, Pregnan-3,11,20-trion, Pregnan-3,11,20-trion-17a-01, Pregnan-3,11,20-trion-21-ol, Pregnan-3,11,20-trion-17a,21-diol, Pregnan-3,
20-dion-11 ss-ol, Pregnan-3,20-dion-1 lss,17a-diol, Pregnan-3;20-dion-11,B,21-diol, Pregnan-3,20-dion-11 ss,17a,21-triol, Pregnan-20-on-3-ol, Pregnan-20-on-3,17a-diol, Pregnan-20-on-3,21-diol, Pregnan-20-on-3,17a,21-triol, Pregnan-11,20-dion-3-ol, Pregnan-11,20-dion-3,17a-diol, Pregnan-11,20-dion-3,21-diol, Pregnan-11,20-dion-3,17a,21-triol,
Pregnan-20-on-3,11 ss-diol, Pregnan-20-on-3,11 ss,17a-triol, Pregnan-20-on-3,11 ss,21-triol, Pregnan-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol sowie die 3- und/oder 21-Ester jener der genannten Ausgangsmaterialien, welche in 3- und/oder 21-Stel- lung Oxygruppen enthalten, mit niedrigen Kohlenwas- serstoff-Carbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure,
tertiärer Butylessigsäure, Benzoesäure usw.
Die Durchführung des erfindungsgemässen Ver fahrens kann so geschehen, dass man die Steroide als Feststoff oder in Form einer Lösung beispielsweise in einem Dialkylketon, wie Aceton, einem Dialkyl- formamid, wie Dimethyl-formamid usw., unter ste rilen Bedingungen zu einer Kultur der Mikroorganis men in einem Nährmedium gibt und das entstehende Gemisch rührt, wobei einerseits das Wachstum der Mikroorganismen und anderseits die Dehydrierung der Steroide bewirkt wird.
Das Steroid kann im Mo ment zugegeben werden, wo das Nährmedium mit dem Mycobacterium geimpft wird, oder es kann zu einer bereits entwickelten Kultur zugegeben werden. Anstatt die Steroide der gebildeten Kultur im Nähr medium zuzusetzen, kann man das Zellmaterial einer solchen Kultur von der Brühe abfiltrieren, mit destil liertem Wasser waschen und dann in einer gepuffer- ten wässerigen Lösung suspendieren, welche ein zum Beispiel in 3-Stellung oxydiertes Steroid enthält,
wo bei unter Rühren des entstehenden Gemisches die Dehydrierung des Steroids unter Bildung des entspre chenden, in 3-Stellung oxydierten dl-Steroids vor sich geht. Das letztere kann aus diesem Medium leich ter isoliert werden als aus dem Gemisch, welches er- halten wird, wenn das Steroid zusammen mit den Mikro organismen im ursprünglichen Nährmedium gezüchtet wird.
Anderseits kann ein zum Beispiel in 3-Stellung oxydiertes Steroid mit Dehydrierungs-Enzympräpara- ten aus der Zucht eines Mycobacteriums zusammen gebracht werden, wobei das entsprechende, in 3-Stel- lung oxydierte dl-Steroid gebildet wird.
Die für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendeten Nährmedien sind die glei chen, wie sie üblicherweise verwendet werden für die Züchtung von Mycobacterium-Mikroorganismen. Die üblichen Nährmedien umfassen eine Stickstoff- und Kohlenstoffquelle, anorganische Salze und erforder lichenfalls wachstumsfördernde Mittel. Der Kohlen stoff kann vorliegen in Form von Verbindungen, wie Acetaten, Lactaten usw.
Der Stickstoff kann vorlie gen in Form von Ammoniumsalzen, Aminosäuren oder Proteinen, wie Sojabohnen, Haferflocken, Hefe, Hefeextrakten, tryptisch digeriertem Casein, Fleisch extrakt, Blutmehl, Protein-, Fleisch- und Knochen grieben, Lachsmehl, Fischmehl, Fischabsüden usw.
Wenn nötig, können die Mycobacterium-Mikroorga- nismen gezüchtet werden unter Verwendung von Pro teinen (oder Aminosäuren) ohne Anwesenheit irgend eines Kohlehydrates im Medium, in welchem Falle die Proteine oder Aminosäuren von den Mikroorga nismen als Quelle sowohl für den Kohlenstoff wie auch für den Stickstoff benützt werden.
Während, wie oben erwähnt, die Dehydrierung der Steroide durchgeführt werden kann unter Ver wendung von Dehydrierungs-Enzympräparaten aus der Zucht von Mycobacterium-Mikroorganismen oder durch Zusammenbringen der Steroide mit einer Suspension einer angelegten Kultur in destilliertem Wasser, verfährt man vorzugsweise so, dass man die zum Beispiel in 3-Stellung oxydierten Steroide zu einem Nährmedium zugibt, welches eine 24 Stunden alte Zucht von einem Mycobacterium enthält.
Die Menge an Steroid, welche dem Medium zugesetzt werden kann, ist variabel und hängt ab von dem be sonderen zu dehydrierenden Substrat, wobei man aber vorzugsweise Konzentrationen der in 3-Stellung oxy dierten Steroide von etwa 0,005 bis 0,2 a/o anwendet; es können indessen, wenn erwünscht, auch höhere oder niedrigere Konzentrationen verwendet werden.
Die das zugesetzte, in 3-Stellung oxydierte Steroid enthaltende Kultur wird dann, vorzugsweise unter Rühren und unter Luftzutritt, während einer Zeit dauer von gewöhnlich etwa zwischen 10 und 50 Stun den weiter bebrütet, wobei aber auch für die Dehy- drierung von speziellen 3-Keto-steroid-Substraten kürzere oder längere Fermentationszeiten vorteilhaft sein können.
Angesichts der Tatsache, dass lange Fer- mentationszeiten eine Zerstörung eines Teiles des pro duzierten dl-3-Keto-steroids herbeiführen können, wendet man gewöhnlich vorzugsweise eine Fermen tationszeit von etwa l0-24 Stunden an, welche, wie sich gezeigt hat, je nach dem Steroid-Substrat zu maximalen Ausbeuten am dl-dehydrierten Steroid- produkt führt.
Nach Beendigung des Dehydrierungsprozesses kann das Produkt aus der Fermentierungsbrühe leicht gewonnen werden durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, beispiels weise einem chlorierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, einem Keton, wie Methylisobutylketon, einem Alkylalkanoat, wie Äthylacetat usw.
Der Aus zug des gebildeten i1-dehydrierten Steroids, welcher auch noch etwas unverändertes Ausgangsmaterial enthalten kann, wird in geeigneter Weise gereinigt durch Chromatographieren auf Silicagel, aktivierter Tonerde usw., oder, wenn erwünscht, mittels abstei gender Papierchromatographie. Nach der Trennung des dehydrierten Produktes von nicht zur Reaktion gelangtem Ausgangsmaterial kann das Produkt wenn nötig weitergereinigt werden durch Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Athyl- acetat-Petroläther usw.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können unter Verwendung der früher erwähnten C-5-unge- sättigten, in 3-Stellung oxydierten Steroiden, 3-Keto- pregnanen und 3-Oxy-pregnan-Verbindungen bei spielsweise die folgenden Stoffe erhalten werden:
41,4-3-Keto-pregnadiene, wie 41,4-Pregnadien-3,20-dion, A1,4-Pregnadien-3,20-dion-17a-ol, 41 .4-Pregnadien-3,20-dion-21-ol, 41.4-Pregnadien-3,20-dion-17 a,21-diol, A1,4-pregnadien-3,20-dion-17a-ol-21-al, A1,4_pregnadien-3,11,20-trion, A1,4-pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol, J1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21-ol, A1,4_pregnadien-3,11,20-trion-17a,21-diol, -11,4-Pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol-21-al, 41.4-Pregnadien-3,
20-dion-11 ss-ol, 41.4-Pregnadien-3,20-dion-11 i3-ol-21-al, 41.4-Pregnadien-3,20-dion-11f,21-diol, A1,4-pregnadien-3,20-dion-1 1ss,17a-diol, 41.4-Pregnadien-3,20-dion-I 1 /3,17a,21-triol;
9-Halogen-41,4-3-keto-pregnadiene, wie 9-Halogen-A1.4-pregnadien-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-41,4-pregnadien-3,20-dion-17a,21-diol, 9-Halogen-J1,4-pregnadien-3,20-dion-17,11,21- triol, 9-Halogen-41.4-pregnadien-3,11,20-trion-17,21- diol, 9-Fluor-d1.4-pregnadien-3,11,20-trion-17a,21- diol, 9-Fluor-d1.4-pregnadien-3,20-dion-11ss,17a,21- triol usw.
<I>Beispiel I</I> Es werden 50 cm-, eines Nährmediums mit fol gender Zusammensetzung hergestellt: Cerelose (handelsübliche Dextrose) 1 g Edamin (handelsüblicher Laktal- bumin-Auszug) 1 g Getreideweiche 0,25 cm3 Destilliertes Wasser auf 50 m3 Dieses Medium wird mit KOH auf PH 6,5 ge stellt, sterilisiert und geimpft mit etwa 2,5-5 cm3 einer Kultur von Mycobacterium segmatis (MB 81)- Mikroorganismen,
worauf man die geimpfte Kultur unter Rühren während 24 Stunden bei einer Tem peratur von 28 C bebrütet. Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lösung von 10 mg Hydrocortison (44- Pregnen-llss,17a,21-triol-3,20-dion) in 0,1 cm3 Di- methylformamid. Die die Steroidverbindung enthal tende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Hierauf wird die Fermentationsbrühe dreimal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert, und die Athylacetat- Auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingedampft. Die konzen trierte Lösung wird dann verwendet zur Herstellung von Papierstreifenchromatogrammen, welche entwik- kelt werden unter Verwendung von Formamid als stationäre flüssige Phase und von Chloroform als bewegliche flüssige Phase.
Es werden zwei Bänder festgestellt, von denen das eine (welches der leichter beweglichen Komponente entspricht) das für Hydro- cortison charakteristische Ultraviolett-Absorptions- maximum zeigt, während das andere (welches der weniger beweglichen Komponente entspricht) ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei etwa 245 m,u besitzt.
Das Papierchromatogramm wird getrocknet und das der Absorption mit 245 m,u entsprechende Band abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Die mit Methanol extrahierte Substanz wird nochmals der Papierstreifenchromatographie unterworfen, unter Verwendung von Papier, welches während 48 Stun den mit Methanol extrahiert wurde, wobei wiederum das vorher verwendete Chloroform-Formamid-System zur Anwendung gelangt.
Das entstehende Chromato- gramm zeigt nur die Spur eines dem Ausgangsmate rial Hydrocortison entsprechenden Bandes, während das grössere Band ein Ultraviolett-Absorptionsmaxi- mum von 245 my aufweist. Das Papierchromato- gramm wird gut getrocknet und das dem Absorptions maximum von 245 m,u entsprechende Band abge schnitten und mit Methanol extrahiert.
Der methano- lische Auszug wird im Vakuum zur Trockne einge dampft, wobei man 41,4-Pregnadien-llss,17a,21-triol- 3,20-dion erhält.
<I>Beispiel 2</I> Es werden 50 cm3 eines Nährmediums mit folgen der Zusammensetzung hergestellt: Cerelose 1 g Edamin 1 g Getreideweiche 0,25 em3 Destilliertes Wasser auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf pH 6,5 gestellt, sterilisiert und mit 2,5-5 cm3 einer Kultur von Mycobacteriumphlei (MB 481)-Mikroorganismen ge impft. Die geimpfte Kultur wird während 24 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C bebrü tet.
Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lösung von 10 mg Hydrocortison (44-Pregnen-11ss,17a,21- triol-3,20-dion) in 0,1 cm3 Dimethylformamid. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C be brütet.
Die Fermentationsbrühe wird dreimal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert, und die Athylacetat- auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cmi, eingedampft. Die konzen trierte Lösung wird verwendet für ein Papierstreifen- chromatogramm, welches entwickelt wird unter Ver= wendung von Formamid als stationär flüssige Phase, und von Chloroform als bewegliche flüssige Phase.
Es werden zwei Bänder festgestellt, von denen das eine (entsprechend der leichter beweglichen Kompo nente) das für Hydrocortison charakteristische Ultra violett-Absorptionsmaximum zeigt, während das an dere (entsprechend der weniger beweglichen Kompo nente) ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum von etwa 245 m,u besitzt. Das Papierchromatogramm wird getrocknet und das der Absorption von 245 my ent sprechende Band abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Die mit Methanol extrahierte Substanz wird nochmals der Papierstreifenchromatographie un terworfen, unter Verwendung von Papier, welches während 48 Stunden mit Methanol extrahiert wurde, wobei wiederum das schon erstmals verwendete Chloroform-Formamid-System zur Anwendung ge langt. Das entstehende Chromatogramm zeigt nur eine Spur eines dem Ausgangsmaterial Hydrocortison entsprechenden Bandes, während das Hauptband ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum von 245 my be sitzt.
Das Papierchromatogramm wird gut getrocknet, worauf man das dem Absorptionsmaximum von 245 mY entsprechende Band abschneidet und mit Methanol extrahiert. Der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 41.4-Pregnadien-11ss,17a,21-triol-3,20-dion erhält.
<I>Beispiel 3</I> Es werden 50 cm3 eines Nährmediums mit folgen der Zusammensetzung hergestellt: Cerelose 1 g Edamin 1 g Getreideweiche 0,25 cm3 Destilliertes Wasser auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf EH 6,5 gestellt, sterilisiert und mit 2,5-5 em3 einer Kultur von Mycobacterium lacticola (MB 466)-Mikroorganismen geimpft. Die geimpfte Kultur wird während 24 Stun den unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C bebrütet.
Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lö sung von 10 mg Hydrocortison (44-Pregnen-11ss,17a, 21-triol-3,20-dion) in 0,1 cm,' Dimethylformamid. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Fermentationsbrühe wird dreimal mit je 50 em3 Äthylacetat extrahiert, und die Athylacetat- Auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingedampft. Die konzen trierte Lösung wird verwendet für ein Papierstreifen- chromatogramm, welches entwickelt wird unter Ver wendung von Formamid als stationäre flüssige Phase und von Chloroform als bewegliche flüssige Phase.
Es werden zwei Bänder festgestellt, von denen das eine (entsprechend der leichter beweglichen Kompo nente) das für Hydrocortison charakteristische Ultra violett-Absorptionsmaximum zeigt, während das an dere (entsprechend der weniger beweglichen Kom ponente) ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum von etwa 245 mc, besitzt. Das Papierchromatogramm wird getrocknet und das der Absorption von 245 m,u. entsprechende Band abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Die mit Methanol extrahierte Substanz wird nochmals der Papierstreifenchromatographie un terworfen, unter Verwendung von Papier, welches während 48 Stunden mit Methanol extrahiert wurde, wobei wiederum das schon erstmals verwendete Chloroform-Formamid-System zur Anwendung ge langt. Das entstehende Chromatogramm zeigt nur eine Spur eines dem Ausgangsmaterial Hydrocortison ent sprechenden Bandes, während das Hauptband ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum von 245 m,u be sitzt.
Das Papierchromatogramm wird gut getrocknet, worauf man das dem Absorptionsmaximum von 245 mit, entsprechende Band abschneidet und mit Methanol extrahiert. Der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 41.4-Pregnadien-11ss,17a,21-triol-3,20-dion erhält.
<I>Beispiel 4</I> Es werden 50 cm3 eines Nährmediums mit fol gender Zusammensetzung hergestellt: Cerelose 1 g Edamin 1 g Getreideweiche 0,25 cm3 Destilliertes Wasser auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf PH 6,5 gestellt, sterilisiert und mit 2,5-5 cm3 einer Kultur von Mycobacterium tubereulosis (MB 83)-Mikroorganis- men geimpft.
Die geimpfte Kultur wird während 24 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C bebrütet. Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lösung von 10 mg Hydrocortison (44-Pregnen- 11ss,17a,21-triol-3,20-dion) in 0,1 cm3 Dimethylform- amid. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Fermentationsbrühe wird dreimal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert, und die Athylacetat- Auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingedampft. Die konzen trierte Lösung wird verwendet für ein Papierstreifen- chromatogramm, welches entwickelt wird unter Ver wendung von Formamid als stationäre flüssige Phase und von Chloroform als bewegliche flüssige Phase.
Es werden zwei Bänder festgestellt, von denen das eine (entsprechend der leichter beweglichen Komponente) das für Hydrocortison charakteristische Ultraviolett- Absorptionsmaximum zeigt, während das andere (ent sprechend der weniger beweglichen Komponente) ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum von etwa 245 m,u besitzt. Das Papierchromatogramm wird getrocknet und das der Absorption von 245 mlt entsprechende Band abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Die mit Methanol extrahierte Substanz wird nochmals der Papierstreifenchromatographie unterworfen, unter Verwendung von Papier, welches während 48 Stun den mit Methanol extrahiert wurde, wobei wiederum das schon erstmals verwendete Chloroform-Form- amid-System zur Anwendung gelangt. Das entstehende Chromatogramm zeigt nur eine Spur eines dem Aus gangsmaterial Hydrocortison entsprechenden Bandes, während das Hauptband ein Ultraviolett-Absorptions- maximum von 245 m,u besitzt.
Das Papierchromato- gramm wird gut getrocknet, worauf man das dem Absorptionsmaximum von 245 my entsprechende Band abschneidet und mit Methanol extrahiert. Der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man d1.4-Pregnadien-11/3,17a,21- triol-3,20-dion erhält.
<I>Beispiel S</I> Es werden 50 cm- eines Nährmediums mit folgen der Zusammensetzung hergestellt: Cerelose 1 g Edamin 1 g Getreideweiche 0,25 cm!, Destilliertes Wasser auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf p,1 6,5 gestellt, sterilisiert und mit 2,5-5 cm3 einer Kultur von Mycobacterium smegmatis (MB 81)-Mikroorganis- men geimpft. Die geimpfte Kultur wird während 24 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C bebrütet.
Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lösung von 10 mg Pregnan-11ss,17a,21-triol- 3,20-dion in 0,1 cm3 Dimethylformamid. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C be brütet.
Die Fermentationsbrühe wird dreimal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert, und die Athylacetat- Auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 em3 eingedampft. Die konzen trierte Lösung wird verwendet für ein Papierstreifen- chromatogramm, welches entwickelt wird unter Ver wendung von Formamid als stationäre flüssige Phase und von Chloroform als bewegliche flüssige Phase.
Das Papierchromatogramm wird getrocknet, und das Band, welches der Komponente entspricht, die ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum von etwa 245 my aufweist, wird abgeschnitten und mit Methanol extra hiert. Die mit Methanol extrahierte Substanz wird nochmals der Papierstreifenchromatographie unter worfen, unter Verwendung von Papier, welches wäh rend 48 Stunden mit Methanol extrahiert wurde, wo bei wiederum das schon erstmals verwendete Chloro- form-Formamid-System zur Anwendung gelangt.
Das Papierchromatogramm wird gut getrocknet, worauf man das dem Absorptionsmaximum von 245 my ent sprechende Band abschneidet und mit Methanol ex trahiert. Der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man d1#4-Pregna- dien-11ss,17a,21-triol-3,20-dion erhält.
<I>Beispiel 6</I> Es werden 50 em3 eines Nährmediums mit fol gender Zusammensetzung hergestellt: Cerelose 1 g Edamin 1 g Getreideweiche 0,25 cm3 Destilliertes Wasser auf 50 em3 Dieses Medium wird mit KOH auf pH 6,5 gestellt, sterilisiert und mit 2,5-5 cm3 einer Kultur von Mycobacterium phlei (MB 481)-Mikroorganismen ge impft. Die geimpfte Kultur wird während 24 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C be brütet.
Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lösung von 10 mg Pregnan-llss,17a,21-triol-3,20-dion in. 0,1 cm3 Dimethylformamid. Die die Steroidverbin- dung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Fermentationsbrühe wird dreimal mit je 50 cm3 Athylacetat extrahiert, und die Athylacetat- Auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingedampft. Die konzen trierte Lösung wird verwendet für ein Papierstreifen chromatogramm, welches entwickelt wird unter Ver wendung von Formamid als stationäre flüssige Phase und von Chloroform als bewegliche flüssige Phase. Das Papierchromatogramm wird getrocknet und das dem Absorptionsmaximum von 245 my entspre chende Band abgeschnitten und mit Methanol extra hiert.
Die mit Methanol extrahierte Substanz wird nochmals der Papierstreifenchromatographie unter worfen, unter Verwendung von Papier, welches wäh rend 48 Stunden mit Methanol extrahiert wurde, wo bei wiederum das schon erstmals verwendete Chloro- form-Formamid-System zur Anwendung gelangt. Das Papierchromatogramm wird gut getrocknet, worauf man das dem Absorptionsmaximum von 245 my ent sprechende Band abschneidet und mit Methanol ex trahiert. Der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man d1,4-Pregna- dien-11i3,17a,21-triol-3,20-dion erhält.
<I>Beispiel 7</I> Es werden 50 cm3 eines Nährmediums mit folgen der Zusammensetzung hergestellt: Cerelose 1 g Edamin 1 g Getreideweiche 0,25 cm3 Destilliertes Wasser auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf pH 6,5 gestellt, sterilisiert und mit 2,5-5 em3 einer Kultur von Mycobacterium lacticola (MB 466)-Mikroorganismen geimpft. Die geimpfte Kultur wird während 24 Stun den unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C bebrütet.
Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lö sung von 10 mg Pregnan-llss,17a,21-triol-3,20-dion in 0,1 em3 Dimethylformamid. Die die Steroidverbin- dung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stundenbei 28 C bebrütet. Die Fermen tationsbrühe wird dreimal mit je 50 cm3 Athylacetat extrahiert, und die Äthylacetat-Auszüge werden ver einigt und in Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingedampft.
Die konzentrierte Lösung wird verwendet für ein Papierstreifenchromatogramm, wel ches entwickelt wird unter Verwendung von Form- amid als stationäre flüssige Phase und von Chloro form als bewegliche flüssige Phase. Das Papierchro- matogramm wird getrocknet und das der Absorption von 245 mu entsprechende Band abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Die mit Methanol extrahierte Substanz wird nochmals der Papierstreifenchromato- graphie unterworfen, unter Verwendung von Papier, welches während 48 Stunden mit Methanol extrahiert wurde, wobei wiederum das schon erstmals verwen dete Chloroform-Formamid-System zur Anwendung gelangt. Das Papierchromatogramm wird gut getrock net, worauf man das dem Absorptionsmaximum von 245 m,u entsprechende Band abschneidet und mit Methanol extrahiert. Der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man d1.4-Pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion erhält.