[go: up one dir, main page]

CZ301712B6 - Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický prípravek obsahující tuto protilátku - Google Patents

Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický prípravek obsahující tuto protilátku Download PDF

Info

Publication number
CZ301712B6
CZ301712B6 CZ20032131A CZ20032131A CZ301712B6 CZ 301712 B6 CZ301712 B6 CZ 301712B6 CZ 20032131 A CZ20032131 A CZ 20032131A CZ 20032131 A CZ20032131 A CZ 20032131A CZ 301712 B6 CZ301712 B6 CZ 301712B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
igf
amino acid
acid sequence
antigen
Prior art date
Application number
CZ20032131A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20032131A3 (cs
Inventor
D. Cohen@Bruce
Beebe@Jean
E. Miller@Penelope
D. Moyer@James
R. Corvalan@Jose
Gallo@Michael
Original Assignee
Pfizer Inc.
Amgen Fremont Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ301712(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Inc., Amgen Fremont Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of CZ20032131A3 publication Critical patent/CZ20032131A3/cs
Publication of CZ301712B6 publication Critical patent/CZ301712B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G01N33/575—
    • G01N33/5759—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)

Abstract

Humánní monoklonální protilátka nebo antigen - vazebná cást protilátky, která se specificky váže na receptor inzulínu podobného rustového faktoru I (IGF-IR), pricemž protilátka obsahuje lehký retezec, který užívá humánní gen V.kapa. A30, inhibuje vazbu IGF-I nebo IGF-II k IGF-IR a inhibuje in vivo rust nádoru. Rešení zahrnuje také odpovídající kódující molekuly nukleové kyseliny, transgenní zvírata obsahující tyto molekuly nukleové kyseliny, zpusoby prípravy anti-IGF-IR protilátky a farmaceutické prípravky, které obsahují tyto protilátky.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká protilátky a antigen vázající části protilátky, která se specificky váže na receptor insulinu podobného růstového faktoru I (IGF-IR), výhodně humánní IGF-IR. Vynález se také týká humánní anti-IGF-lR protilátky, včetně chimérické, bispecifické, derivatizované, jednořetězcové protilátky nebo části fuzního proteinu. Vynález se také týká izolovaného io těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinové molekuly odvozené zanti-IGF-IR protilátky a odpovídající kódující molekuly nukleové kyseliny. Vynález se dále týká způsobu přípravy anti-IGF-IR protilátky a farmaceutických přípravků, které obsahují tyto protilátky. Vynález se týká i použití protilátek a přípravků podle vynálezu při diagnóze a léčení. Vynález se dále týká genové terapie s využitím molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a/nebo lehký řetězec molekul imunoglobulinů, které zahrnují humánní anti-IGF-IR protilátky. Vynález se také týká transgenních zvířat obsahujících molekuly nukleové kyselinové podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
Růstový faktor podobný insulinu (IGF-I) je 7,5-kD polypeptid, který cirkuluje v plazmě ve vysokých koncentracích a je detekovatelný ve většině tkání. IGF-I stimuluje buněčnou diferenciaci a buněčnou proliferací a je vyžadován většinou typů savčích buněk pro udržení proliferace. K takovým buněčným typům patří, mezi jinými, humánní diploidní fibroblasty, epiteliální buňky, buňky hladkého svalstva, T lymfocyty, nervové buňky, myeloidní buňky, chondrocyty, osteoblasty a kmenové buňky kostní dřeně. Pro přehled širokého spektra buněčných typů, u kterých interakce IGF-1/ receptor IGF-I zprostředkuje buněčnou proliferací, viz např. Goldring et aL, Eukar. Gene Expresss., 1: 31-326, 1991.
První krok v transdukční dráze vedoucí k IGF-I-stimulované buněčné proliferací nebo diferenciaci je vazba IGF-I nebo IGF—II (nebo inzulínu ve vyšší než fyziologické koncentraci) k receptoru IGF-I. Receptor IGF-I je složen ze dvou typů podjednotek: alfa podjednotky (130-136 kD protein, který je plně extracelulámí ajeho funkcí je vazba ligandu) a beta podjednotky (95-kD transmembránový protein, s transmembránovými a cytoplazmatickými doménami). IGF-IR patří k rodině receptorů tyrosinkinázových růstových faktorů (Ullrich et al., Cell 61: 203-212,1990) a je strukturálně podobný receptoru inzulínu (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). IGF-IR je nejdříve syntetizován jako jednořetězcový proreceptorový polypeptid, který je opracován glykosylací, proteolytickým štěpením a kovalentní vazbou, takže vytváří zralý 460-kD heterotetramer, který obsahuje dvě alfa-podjednotky a dvě beto pod40 jednotky. Beta podjednotka vykazuje ligandem aktivovanou tyrosinkinázovou aktivitu. Tato aktivita je zapojena do signální dráhy zprostředkovávající působení ligandu, která zahrnuje autofosforylaci beta-podjednotky a fosforylaci IGF-IR substrátů.
V podmínkách in vivo jsou sérové hladiny IGF-I závislé na přítomností růstového hormonu (GH) hypofyzy. Ačkoliv játra jsou hlavním místem GH-závislé syntézy IGF-I, nedávné práce ukazují, že většina normálních tkání také produkuje IGF-I. Celá řada nádorových tkání také produkuje IGF-I. Takže IGF-I může působit jako regulátor normální i abnormální buněčné proliferace prostřednictvím autokrinního, parakrinního a také endokrinního mechanismu. IGF-I a IGF—II se vážou invivo na IGF vazebné proteiny (IGFBP). Dostupnost volného IGF pro interakce s IGF-IR je modulována IGFBP. Přehled IGFBP a IGF-I lze nalézt např. v Grimberg et al., J. Cell. Physiol. 183:1-9,2000.
Existují důkazy pro úlohu IGF-I a/nebo IGF-IR v udržování nádorové buňky in vitro a in vivo.
IGF-IR hladiny jsou zvýšeny v nádorech plic (Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119:
665-668, 1993, Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993, Macauley et al, Cancer Res.,
- 1 CZ 301712 B6
50: 2511—2517, 1990), prsu (Pollak et ak, Cancer Lett. 38: 223-230, 1987, Foekens et ak, Cancer
Res. 49: 7002-7009, 1989, Cullen et ak, Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990, Arteaga et ak,
L Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), prostaty a tračníku (Remaole Bennet et ak, J. Clin.
Endocrinok Metab. 75: 609-616, 1992, Guo et ak, Gastroenterok 102: 1101-1108, 1992).
Deregulovaná exprese IGF—I v epitelu prostaty vede k neoplázii u transgenních myší (Digiovanni et ak, Proč. Nati. ACAD. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Kromě toho se zdá, že IGF-I je autokrinním stimulátorem humánních gliomů (Sandberg-Nordqvist et ak, Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), zatímco IGF-I stimuluje růst fibrosarkomů, které nadměrně exprimují IGF-IR (Butler et ak, Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Dále, jedinci s „vysokou normální“ io hladinou IGF-I mají zvýšené obecné riziko karcinomu ve srovnání s jednotlivci s IGF-Ϊ v „nízké normální“ hladině (Rosen et ak, Trends Endocrinok Metab. 10: 136-41, 1999). Mnoho ztěchto typů nádorových buněk reaguje na IGF-I proliferativním signálem v kultuře (Nakanishi et ak, J. Clin. Invest. 82: 354 359, 1988, Freed et ak, J. Mok Endocrinok 3: 509-514, 1989) a byla proto postulována existence autokrinní nebo parakrinní smyčky pro proliferací in vivo (LeRoíth et ak, Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995, Yee et ak, Mok Endocrinok 3: 509-514, 1989). Přehled o úloze interakce IGF—1/ IGF-I receptor v růstu u celé řady humánních nádorů - viz Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
Zvýšené hladiny IGF-I také korelují s několika patologickými stavy jinými než je rakovina, jako je např. akromegalie a gigantismus (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), zatímco abnormální funkce IGF-I/IGF-1 receptor se zřejmě podílí na psoriáze (Wraight et ak, Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), ateroskleróze a restenóze hladkého svalstva krevních cév po angioplastice (Bayes-Genis et ak, Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Zvýšené hladiny 1GF-1 také mohou být problémem při diabetů nebo jeho komplikacích, jako je například proliferace mikro25 cév (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Snížení hladiny IGF-I, ke kterému dochází, inter alia, v případech, kdy jsou nízké sérové hladiny GH nebo když existuje necitlivost nebo rezistence k GH, je asociováno s takovými chorobnými stavy jako je zakrslost (Laron, Paediatr. Drugs l: 155-159, 1999), neuropatie, pokles objemu svalové hmoty a osteoporóza (Rosen et ak, Trends Endocrinok Metab. 10: 136-141, 1999).
S použitím antisense expresních vektorů nebo antisense oligonukleotidů k IGF-IR RNA bylo ukázáno, že interference s IGF-IR vede k inhibici IGF-I-zprostředkovaného nebo IGF-IIzprostředkovaného buněčného růstu (viz např. Wraight et ak, Na. Biotech. 18: 521-526, 2000). Antisense strategie byla úspěšná pro inhibici buněčné proliferace u několika typů normálních buněk a humánních nádorových buněčných linií. Růst může být také inhíbován s použitím peptidových analogů 1GF-1 (Pietrzkowski et ak, Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 1992, a Pietrzkowski et ak, Mok Cell. Biok, 12: 3883-3889, 1992) nebo vektoru exprimujícího antisense RNA k IGF-I RNA (Trojan et ak, Science 259: 94-97, 1992). Kromě toho, protilátky k IGF-IR (Arteaga et ak, Breast Canc. Res. Treatm., 22: 101-106, 1992, and Kalebic et ak,
Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994) a dominantní negativní mutanty IGF-IR (Prager et ak, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2181-2185, 1994, Li et ak, J. Biok Chem., 269: 32558-32564, 1994 a Jiang et ak, Oncogene 18: 6071-77, 1999) mohou revertovat (zvrátit) transformovaný fenotyp, inhibovat tumorigenezi a indukovat ztrátu metastázujícího fenotypu.
IGF-I je také důležitým činitelem v regulaci apoptózy. Apoptóza, programovaná buněčná smrt, je zapojena v celé řadě vývojových procesů, včetně vyzrávání imunitního a nervového systému. Kromě této úlohy ve vývoji, apoptóza také zřejmě působí jako důležitá buněčná zábrana proti tumorigenezi (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991, Lané, Nátuře 362: 786-787, 1993). Potlačení apoptotického programu celou řadou genetických lézí může přispět k rozvoji a progresi
5fl maligních onemocnění.
IGF-I chrání před apoptózou indukovanou odstraněním cytokinů IL—3 dependentní hemopoetické buňky (Rodriguez-Tarduchy, G. et ak, J. Immunol. 149: 535-540, 1992) a odstraněním séra u Rat-l/mycER buněk (Harrington, E., et ak, EMBO J. 13: 3286-3295, 1994), Anti-apo55 ptotická funkce IGF-I je důležitá v klidovém stupni buněčného cyklu a také u buněk, u kterých je
-2CZ 301712 B6 průběh buněčného cyklu blokován etoposidem nebo thymidinem. Demonstrace toho, že přežívání c-myc řízených fibroblastů je závislé na IGF-I, ukazuje na existenci důležité úlohy IGF-IR při udržování nádorových buněk specifickou inhibici apoptózy, což je úloha zřetelně odlišná od proliferativních účinků IGF—1 nebo IGF-IR. To je podobné úloze, kterou zřejmě hrají i jiné anti-apoptotické geny jako například bcl-2 při podpoře přežívání nádorů (McDonnell et al., Cell 57: 79—88,1989, Hockenberry et al., Nátuře 348; 334-336,1990).
Protektivní účinky IGF-Í na apoptózu jsou závislé na tom, zda jsou na buňkách přítomné IGF-IR pro interakci s IGF-I (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Podpora pro io anti-apoptotickou funkci IGF-IR v udržování nádorových buněk byla také poskytnuta ve studii s použitím antisense oligonukleotidů k IGF-IR, která identifikovala kvantitativní vztah mezi hladinou IGF-IR, rozsahem apoptózy a tumorigenním potenciálem u syngenních nádorů laboratorního potkana (Rescínoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Bylo zjištěno, že overexprese IGF-IR chrání nádorové buňky in vitro před etoposidem indukovanou apoptózou (Seli et al., Cancer Res. 55: 303-306, 1995) a, ještě výrazněji, že pokles hladiny IGF-IR pod hladinu odpovídající divokému typu způsobuje masivní apoptózu nádorových buněk in vivo (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Potenciální strategie pro indukci apoptózy nebo pro inhibici buněčné proliferace spojené se zvýšením hladiny IGF-I, zvýšením IGF—II a/nebo zvýšením IGF-IR receptoru zahrnují snížení hladiny IGF-I nebo IGF-II nebo zabránění vazby IGF-I k IGF-IR. Například dlouhodobě působící somastatinový analog octreotid byl použit k redukci syntézy a/nebo sekrece IGF. Rozpustný IGF-IR byl použít k indukci apoptózy u nádorových buněk in vivo a inhibici tumorigeneze v experimentálním zvířecím systému (D'Ambrosio et ak, Cancer Res. 56: 4013-20, 1996).
Kromě toho, IGF-IR antisense oligonukleotidy, peptidové analogy IGF-I a protilátky k IGF-IR byly použity ke snížení exprese IGF-I nebo IGF-IR (viz výše). Nicméně žádná z těchto sloučenin nebyla vhodná k dlouhodobému podávání (humánním) pacientům. Navíc, ačkoliv IGF-I byl podáván pacientům pro léčení zakrslosti, osteoporózy, snížení objemu svalové hmoty, neuropatie nebo diabetů, vazba IGF-I na IGFBP často způsobila, že taková léčba byla obtížná nebo byla zcela neúčinná.
Tudíž, s ohledem na úlohy, které IGF-I a IGF-IR mají v takových chorobných stavech jako karcinom a jiná proliferativní onemocnění, když jsou IGF-I a/nebo IGF-IR nadměrně exprimovaly, a úlohy příliš malého množství IGF-I a IGF-IR při chorobných stavech, jako například zakmělost a svalová slabost, když jsou IGF-I a/nebo IGF-IR nedostatečně exprimovány, bylo by potřebné připravit protilátky k IGF-IR, které by mohly být použity buďto k inhibici, nebo stimulaci IGF-IR. Přestože bylo publikováno, že anti- IGF-IR protilátky byly zjištěny u některých pacientů trpících autoimunními nemocemi, žádná z těchto protilátek nebyla purifikována a nebylo ukázáno, že by mohla být vhodná k inhibici aktivity IGF-I pro diagnostické nebo terapeutické postupy (Viz např. Thompson et al., Pediat. Res. 32: 455459, 1988, Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714,1988, Weightman et al., Autoimmunity 16:251-257, 1993, Drexhage et al., Nether, J. of Med. 45: 285-293, 1994). Takže se jeví jako potřebné získat vysokoafinitní humánní anti-IGF-IR protilátky, které by mohly být použity při léčení nemocí u lidí.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1A-1C ukazují vzájemné porovnání nukleotidovýeh sekvencí variabilních úseků lehkého řetězce šesti humánních anti-IGF-IR protilátek a také jejich srovnání se sekvencí zárodečné linie.
Obr. IA ukazuje porovnání nukleotidová sekvence variabilních úseků lehkého řetězce (VL) protilátek 2.12.1 (SEKV. ID. Č. 1) 2.13.2 (SEKV. ID. Č. 5), 2.14.3 (SEKV. ID. Č.9) a 4.9.2 (SEKV. ID. Č. 13) navzájem a také se sekvencí zárodečné linie Vk A30 (SEKV. ID. Č. 39).
-3CZ 301712 B6
Obr. IB ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VL protilátky 4.17.3 (SEKV. ID. Č. 17) a sekvence zárodečné linie Vk 012 (SEKV. ID. Č. 41).
Obr. 1C ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VL protilátky 6.1.1 (SEKV. ID. Č. 21) a sekvence zárodečné linie Vk A27 (SEKV. ID. Č. 37). Přiřazení sekvencí také ukazuje CDR úseky VL každé protilátky. Kanonické sekvence pro obr. 1 A-1 C jsou uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 53 až 55, v daném pořadí.
Obr. 2A-2D ukazují vzájemné porovnání nukleotidových sekvencí variabilních úseků těžkého io řetězce šesti humánních anti-IGF-IR protilátek a srovnání se sekvencí zárodečné linie.
Obr, 2A ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VH protilátky 2.12.1 (SEKV. ID. Č. 3) se sekvencí zárodečné linie VH DP-35 (SEKV. ID. Č. 29).
Obr. 2B ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VH protilátky 2.14.3 (SEKV. ID. Č. 11) a sekvence zárodečné linie VIV-4/4,35 (SEKV. ID. Č. 43).
Obr. 2C-1 a 2C-2 ukazují porovnání nukleotidové sekvence VH protilátek 2.13.2 (SEKV. ID. Č. 7), 4.9.2 (SEKV. ID. Č. 15) a 6.1.1 (SEKV. ID. Č. 23) navzájem aještě se sekvencí zárodečné linie VH DP-47 (SEKV. ID. Č. 31).
Obr. 2D ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VH protilátky 4.17.3 (SEKV. ID. Č. 19) se sekvencí zárodečné linie VH DP-71 (SEKV. ID. Č. 35). Porovnání také ukazuje CDR úseky protilátek. Kanonické sekvence pro obr. 2A - 2D jsou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 56-59, v daném pořadí.
Obr. 3 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, 4.9.2 a 2.12.1 inhibují vazbu IGF-I na 3T3-IGF-IR buňky.
Obr. 4 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 4.9.2 inhibuje IGF-I-indukovanou fosforylaci tyrosinu receptoru (horní panel) a indukuje pokles exprese IGF-IR („down-regulace“ IGF-IR) na buněčném povrchu (spodní panel).
Obr. 5 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a 4.9.2 redukují IGF-IR fosfotyrosinovou signalizaci u 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr. 6 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a 4.9.2 redukují IGF-IR u 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr. 7 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 inhibuje in vivo růst 3T3-IGF-IR nádorů, samotná (levý panel) nebo v kombinaci s adriamycinem (pravý panel).
Obr. 8 ukazuje vztah mezi sérovou hladinou anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a IGF-IR down-regulací u 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr. 9 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, samotné nebo v kombinaci s adriamycinem, inhibují in vivo růst 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr.lO ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 v kombinaci s adriamycinem inhibuje nádorový růst in vivo.
Obr. 11 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2,13.2, samotná nebo v kombinaci s 5-deoxyurídinem (5-FLT), inhibuje in vivo růst nádoru Colo 205.
Obr. 12 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, samotné nebo v kombinaci s 5-FU, inhibují in vivo růst nádorů Colo 205.
-4CZ 301712 B6
Obr. 13 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátka 2.13.2, samotné nebo v kombinaci s taxolem, inhibují in vivo růst nádoru MCF-7.
Obr. 14 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2 inhibuje in vivo růst nádoru MCF-7, buďto samotná (levý panel), nebo v kombinaci s adriamycinem (pravý panel).
Obr. 15 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, samotné nebo v kombinaci s tamoxifenem, inhibují in vivo růst nádoru MCF-7.
io
Obr. 16 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 inhibují in vivo růst nádoru A431, a to buď samotné, nebo v kombinaci s inhibitorem CP-358, 774 tyrosinkinázového receptoru epidermálního růstového faktoru (EGF-R).
Obr, 17 ukazuje farmakokinetické hodnocení jediné intravenózní injekce anti-IGF-IR protilátky
2.13.2 u makaka.
Obr. 18 ukazuje, že kombinace anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a adriamycinu zesiluje in vivo down-regulací IGF-IR ve 3T3-IGF-IR nádorech.
Obr. 19A ukazuje počet mutací v různých úsecích těžkého a lehkého řetězce 2.13.2 a 2.12.1 ve srovnání se sekvencí zárodečné linie.
Obr. 19A-D ukazují porovnání aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce protilátek
2,13.2 a 2.12.1 s sekvencí zárodečné linie, ze které pocházející.
Obr. 19B ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce protilátky
2.13.2 (SEKV. ID. Č, 45) se sekvencí zárodečné linie DP-47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEKV. ID. Č. 46).
Obr. 19C ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence lehkého řetězce protilátky 2.13.2 (SEKV. ID. Č. 47) se sekvencí zárodečné linie A30/Jk2 (SEKV. ID. Č. 48).
Obr. 19D ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence těžkého řetězce protilátky 2.12.1 (SEKV. ID. Č. 49) se sekvencí zárodečné linie DP-35 (3-1 l)/D3-3/JH6 (SEKV. ID. Č. 50).
Obr. 19E ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence lehkého řetězce protilátky 2.12.1 (SEKV. ID. Č. 51) se sekvencí zárodečné linie A30/Jkl (SEKV. ID. Č. 52).
Pro obr. 19B-E platí, že signální sekvence jsou uvedeny kurzívou, úseky CDR jsou podtrženy, variabilní domény jsou tučně, mutace kosterních (FR) úseků jsou zvýrazněny znaménkem plus („+“) nad aminokyselinovým zbytkem a mutace úseků CDR jsou zvýrazněny hvězdičkou nad aminokyselinovým zbytkem.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje izolovanou humánní protilátku nebo antigen-vazebnou část (tj. část vázající antigen) protilátky, která se váže na IGF-IR, výhodně na IGF-IR primátů a člověka, přičemž protilátka obsahuje lehký řetězec, který užívá humánní gen Vk A30. Vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která inhibuje vazba IGF-I nebo IGF—II k IGF-IR, a také poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která aktivuje IGF-IR.
-5CZ 301712 B6
Vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující protilátku a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutický přípravek může dále obsahovat další složky, jako například anti-nádorová agens nebo zobrazovací činidlo.
Vynález se dále týká i diagnostických a terapeutických metod. Diagnostické metody se týkají způsobu diagnózy přítomnosti nebo lokalizace tkáně exprimující IGF-IR s použitím anti-IGF-IR protilátky. Terapeutický způsob zahrnuje podávání protilátky pacientovi, který ji potřebuje, výhodně ve spojení s podáváním dalšího terapeutického agens.
io Vynález poskytuje izolovanou buněčnou linii, jako například hybridom, která produkuje antiIGF-IR protilátku.
Vynález také poskytuje molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a/nebo lehký řetězec anti-IGF-IR protilátky nebo jejich antigen-vazebné části.
Vynález dále poskytuje vektory a hostitelské buňky obsahující molekuly nukleové kyseliny, a také způsoby rekombinantní produkce polypeptidů kódovaných molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.
A dále vynález poskytuje transgenní zvířata, organizmy jiného než lidského původu, která exprimují těžký a/nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou Část z anti-IGF-IR protilátky.
Vynález se také týká léčení pacienta, který to potřebuje, podáváním účinného množství molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a/nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část z anti-IGF-IR protilátky.
Podrobný popis vynálezu
Definice termínů a obecné postupy
Není-li uvedeno jinak, vědecké a technické termíny používané v souvislosti s předkládaným vynálezem mají význam, který je odborníkovi obecně srozumitelný a známý. A dále, pokud kontext nevyžaduje jinak, termíny vyjádřené jednotným číslem zahrnují i množné číslo a termíny vyjádřené množným číslem zahrnují i jednotné číslo. Obecně, nomenklatura v tomto textu užívaná ve spojení s metodami buněčných a tkáňových kultur, molekulární biologie, imunologie, mikrobiologie, genetiky a chemie hybridizace proteinů a nukleových kyselin, je obecně v oboru užívána a odborníkovi srozumitelná. Metody a techniky užité v předkládaném vynálezu jsou obecně prováděny podle obvyklých postupů odborníkovi známých, které byly popsány v různých obecných nebo specifických publikacích, které jsou citovány a diskutovány v předkládaném popisu, není-li uvedeno jinak. Jde např. o následující publikace: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y,, 1989, and Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992, and Harlow and Lané antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1990, které jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Enzymatické reakce a purifikační techniky jsou prováděny podle specifikací výrobců, tak, jak se obvykle v oboru užívají, nebo jak je popsáno v tomto textu. Nomenklatura použitá v spojení s laboratorními postupy a technikami analytické chemie, syntetické organické chemie a lékařské a farmaceutické chemie, popisovanými v tomto textu, je obecně známá a používaná v oboru. Pro chemické syntézy, chemické analýzy, formulací farmaceutických přípravků ajejich aplikací při léčení pacientů jsou používány standardní techniky.
-6CZ 301712 B6
Následující termíny, není-li uvedeno ještě jinak, je třeba chápat v následujícím významu:
Termín „polypeptid“ označuje nativní nebo umělý protein, proteinový fragment a polypeptidový analog proteinové sekvence. Polypeptid může být monomemí nebo polymemí.
Termín „izolovaný protein“ nebo „izolovaný polypeptid“ označuje protein nebo polypeptid, který v důsledku svého původu nebo zdroje (1) není asociován s přirozeně asociovanými součástmi, se kterými je asociován ve svém nativním stavu, (2) je zbaven jiných proteinů z téhož biologického druhu, (3) je exprimován buňkou jiného biologického druhu nebo (4) nevyskytuje se v přírodě, io Takže polypeptid, který byl chemicky syntetizován, nebo byl syntetizován v buněčném systému odlišného od buněk, ve kterých se přirozeně tvoří, je „izolovaný“ od svých přirozeně asociovaných složek. Protein je izolací v podstatě zbaven přirozeně asociovaných složek, a sice s využitím technik purifikace proteinů, které jsou dobře známy v oboru.
Protein nebo polypeptid je „v podstatě čistý“, „v podstatě homogenní“ nebo „v podstatě purifikovaný“, když alespoň přibližně 60 až 75 % vzorku vykazuje přítomnost jediného druhu polypeptidu. Polypeptid nebo protein může být monomemí nebo multimemí. V podstatě čistý polypeptid nebo protein bude typicky obsahovat přibližně 50, 60, 70, 80 nebo 90 % (hmotnost/hmotnost) proteinu, obvykle má čistotu přibližně 95 % a výhodně má dokonce čistotu 99 %.
Čistota nebo homogenita proteinu může být demonstrována řadou metod v oboru známých, například elektroforézou proteinového vzorku na polyakrylamidovém gelu, následovanou tím, že se vizualizuje pás odpovídající jednomu polypeptidu obarvením gelu barvivém, které je v oboru známo. Pro některé účely lze dosáhnout vyššího rozlišení s použitím HPLC nebo jiný prostředky purifikace, které jsou v oboru dobře známy.
Termín „polypeptidový fragment“ (zaměnitelný s „fragment polypeptidu“), jak se v tomto textu používá, se týká polypeptidu, který má deleci aminokoncového a/nebo karboxykoncového úseku, ale přitom zbývající aminokyselinová sekvence je totožná s odpovídajícími polohami v přirozeně se vyskytující sekvenci. Fragmenty jsou typicky dlouhé alespoň 5, 6, 8 nebo 10 aminokyselin, výhodně jsou dlouhé alespoň 14 aminokyselin, výhodněji jsou dlouhé alespoň 20 aminokyselin, obvykle jsou dlouhé alespoň 50 aminokyselin, dokonce výhodněji jsou alespoň 70, 80, 90, 100, 150 nebo 200 aminokyselin dlouhé.
Termín „polypeptidový analog“, jak se v tomto textu používá, se týká polypeptidu, který je složen ze segmentu přinejmenším 25 aminokyselin, který je v podstatě identický s částí aminokyselinové sekvence a který má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) specificky se váže k IGF-IR za podmínek vhodných pro vazbu, (2) je schopen blokovat IGF-I nebo IGF—II vazbu na IGF-IR nebo (3) je schopen redukovat expresi IGF-IR na buněčném povrchu nebo fosforylaci tyrosinu in vitro nebo in vivo. Typicky polypeptidový analog obsahuje konzervativní amino40 kyselinové substituce (nebo inzerce nebo delece) ve srovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí. Analogy jsou typicky alespoň 20 aminokyselin dlouhé, výhodně alespoň 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 nebo 200 aminokyselin dlouhé nebo i delší a často jsou stejně dlouhé jako přirozeně se vyskytující polypeptid plné délky.
Výhodné substituce aminokyselin jsou takovém které: (1) redukují citlivost kproteoíýze, (2) redukují citlivost k oxidaci, (3) mění vazebnou afinitu pro vytvoření proteinového komplexu, (4) mění vazebné afinity obecně a (5) propůjčují nebo přizpůsobují další fyzikálně chemické nebo funkční vlastnosti takového analogu. Analogy zahrnují různé muteiny dané sekvence kromě přirozeně se vyskytující peptidové sekvence. Například jednoduchá nebo mnohonásobná substi50 tuce aminokyselin (výhodně konzervativní substituce aminokyselin) může být vytvořena v přirozeně se vyskytující sekvenci (výhodně v Části polypeptidu vně domény (s) vytvářející intermolekulámí kontakty). Konzervativní aminokyselinová substituce by neměla v podstatě změnit strukturální vlastnosti základní sekvence (např. nahrazená aminokyselina by neměla inklinovat k narušení šroubovice, kterou tvoří základní sekvence, nebo k narušení jiného typu sekundární struktury, která je charakteristická pro základní sekvenci). Příklady sekundárních a terciárních
-7CZ 301712 B6 struktur polypeptidů, které jsou odborníkům známy, jsou popsány v publikacích Proteins,
Structures and Molecular Principles (Creighton, Vyd., W. H. Freeman and Company, New York,
1984), Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, vyd., Garland Publishing,
New York, N. Y., 1991), a Thomton et al., Nátuře 354: 105, 1991, které jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu.
Nepeptidové analogy jsou obecně používány ve farmaceutickém průmyslu jako léčiva s vlastnostmi podobnými, jak mají templátové peptidy. Tyto typy nepeptidových sloučenin jsou nazývány „peptidová mimetika“ nebo „peptidomimetika“ (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29, 1986,
Veber a Freidinger TINS p. 392, 1985, a Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229, 1987, který je zahrnut formou odkazu v tomto textu). Takové sloučeniny jsou často konstruovány pomocí počítačového modelování molekul. Peptidomimetika, která jsou strukturálně podobná terapeuticky použitelným peptidům, mohou být použita s dosažením rovnocenného terapeutického nebo profy taktického účinku. Obecně, peptidomimetika jsou strukturálně podobná vzorovému poly15 peptidu (tj. polypeptidů, který má požadovanou biochemickou vlastnost nebo farmakologickou aktivitu), jako je například humánní protilátka, ale mají jednu nebo více peptidových vazeb volitelně nahrazených vazbou vybranou ze skupiny, kterou tvoří -CH2NH2- -CH2S-CHt-CH2- -CH=CH- (cis a trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- a -CH2SO~, a sice metodami dobře známými v oboru. Systematická substituce jedné nebo více aminokyselin kanonická sekvence D-aminokyselinou stejného typu (např. D-lysin místo L-lysinu) může také být využita k přípravě peptidů s vyšší stabilitou. Kromě toho, omezené peptidy obsahující kanonickou sekvenci nebo v podstatě totožnou variaci kanonické sekvence mohou být připraveny metodami známými v oboru (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387, 1992, zahrnuto formou odkazu v tomto textu), například přidáním vnitřního cysteínového zbytku schopného vytvořit intramolekulámí disulfidický můstek, kterým se cyklizuje peptid.
„Imunoglobulin“ je tetramemí molekula. V přirozeně se vyskytujícím imunoglobulinu je každý tetramer složen ze dvou totožných párů polypeptidových řetězců, každý pár obsahuje jeden „lehký“ (přibližně 25 kDa) a jeden „těžký“ řetězec (přibližně 50 až 70 kDa). Aminokoncová část každého řetězce zahrnuje variabilní úsek přibližně 100 až 110 nebo i více aminokyselin, který je primárně zodpovědný za rozpoznávání antigenů. Karboxy koncová část každého řetězce definuje konstantní úsek primárně zodpovědný za efektorové funkce. Humánní lehké řetězce jsou klasifikovány jako K a λ lehké řetězce. Těžké řetězce jsou označovány jako μ, Δ, γ, a nebo ε, čímž jsou definovány protilátkové izotypy IgM, IgD, IgG, IgA a IgE, v daném pořadí. V lehkém a těžkém řetězci jsou variabilní a konstantní úseky spojeny J“ úsekem z přibližně 12 nebo více aminokyselin, a těžký řetězec ještě obsahuje „D“ úsek přibližně 10 či více aminokyselin. Viz Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W„ vyd., 2. vyd. Raven Press, N. Y„ 1989) (zahrnut formou odkazu). Variabilní úseky z každého páru lehkého/těžkého řetězce vytvářejí vazebné místo protilátky, takže intaktní imunoglobulin má dvě vazebná místa.
Imunoglobulinové řetězce vykazují stejnou obecnou strukturu s relativně konzervativními rámcovými úseky (FR) spojenými třemi hypervariabilními úseky, které se označují jako „komplementaritu určující úseky“ nebo CDR. CDR ze dvou řetězců každého páru jsou spojeny rámcovými úseky, což umožňuje vazbu ke specifickému epitopu. Směrem od N-konce k C-konci, lehký a těžký řetězec obsahují domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin do každé domény je v souladu s definicí podle Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 až 1991)), nebo Chothta & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987, Chothia et al. Nátuře 342: 878-883,1989.
Termín „protilátka“ se týká intaktního imunoglobulinu nebo jeho antigen-vazebné části (tj. části protilátky schopné vázat antigen), která kompetuje s intaktní protilátkou o specifickou vazbu.
Antigen-vazebné části mohou být připraveny technikami rekombinantní DNA nebo enzymatickým nebo chemickým štěpením intaktních protilátek. Antigen-vazebné části zahrnují, inter alia,
Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb a fragmenty úseků určujících komplementaritu (CDR), jednořetězco-8CZ 301712 B6 vé protilátky (scFv), chimérické protilátky, tzv. „diabodies“ a polypeptidy, které obsahují alespoň část imunoglobulinu, která je dostatečná k tomu, aby jim propůjčila schopnost specifické vazby k antigenu.
Jak se v tomto textu používá, protilátka, která je označena např. 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2,
4.17.3 nebo 6.1.1, je protilátka, která pochází zhybridomu stejného jména. Například protilátka 2.12.1 pochází zhybridomu 2.12.1.
Fab fragment je monovalentní fragment, který tvoří VL, VH, CL a CH1 domény, F(ab')2 fragio ment je dvoj valentní fragment sestávající ze dvou Fab fragmentů spojených disulfidovým můstkem v tzv. oblasti kloubu, Fd fragment obsahuje VH a CH1 domény, Fv fragment obsahuje VL a
VH domény jednoho ramene protilátky a dAb fragment (Ward et al., Nátuře 341: 544-546, 1989) sestává z VH domény.
Jednořetězcová protilátka (scFv) je protilátka, kde VL a VH úseky jsou párovány a vytvářejí monovalentní molekulu prostřednictvím syntetické spojovací sekvence (linkeru), která umožňuje vytvořit jednoduchý proteinový řetězec (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 and Huston et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Tzv. „diabodies“ jsou divalentní bispecifické protilátky, kde VH a VL domény jsou exprimovány na jednoduchém polypeptidovém řetěz20 ci, ale s použitím linkeru, který je příliš krátký na to, aby se umožnilo párování mezi dvěma doménami na stejném řetězci, a tím jsou domény nuceny k párování s komplementárními doménami dalšího řetězce a vytvářejí se tak dvě vazebná místa pro antigen (viz např. Holliger, P., et ak, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993 a Poljak, R. J„ et al., Structure 2: 1121-1123, 1994). Jeden nebo více úseků CDR může být zaveden do molekuly buďto kovalentné, nebo nekovalentně, čímž se připraví tzv. ímunoadhesin. Imunoadhesiny mohou obsahovat jeden nebo více CDR jako část většího polypeptidového řetězce, mohou kovalentné spojovat CDR s dalším polypeptidovým řetězcem nebo mohou zavést CDR do molekuly nekovalentně. CDR dovolují imunoadhesinům vázat se specificky na požadovaný konkrétní antigen.
Protilátka může mít jedno nebo více vazebných míst. Jestliže existuje více než jedno vazebné místo, pak vazebná místa mohou být navzájem totožná nebo mohou být různá. Například přirozeně se vyskytující imunoglobulin má dvě totožná vazebná místa, jednořetězcová protilátka nebo Fab fragment mají jedno vazebné místo, zatímco „b i specifická“ nebo „bifunkční“ protilátka má dvě různá vazebná místa.
„Izolovaná protilátka“ je protilátka, která (1) není spojena (asociována) se složkami, se kterými je spojena v přírodním stavu, včetně ostatních přirozeně asociovaných protilátek, které ji doprovázejí v jejím nativním stavu, (2) je bez jiných proteinů stejného druhu, (3) je exprimována buňkou jiného biologického druhu nebo (4) vůbec se nevyskytuje v přírodě. Příklady izolovaných proti40 látek zahrnují anti-IGF-IR protilátku, která byla afinitně purifikována s použitím IGF-IR, antiIGF-IR protilátku, která byla syntetizována hybridomem nebo jinou buněčnou linií in vitro a humánní anti-IGF-IR protilátku pocházející z transgenní myši.
Termín „humánní protilátka“ zahrnuje všechny protilátky, které mají jeden nebo více variabilních a konstantních úseků pocházejících z humánní imunoglobulínové sekvence. Ve výhodném provedení všechny variabilní a konstantních domény pocházejí z humánní imunoglobulinové sekvence (plně humánní protilátka). Tyto protilátky mohou být připraveny celou řadou postupů, jak bude popsáno dále.
Humanizovaná protilátka je taková protilátka, která pochází z jiného biologického druhu než člověka, kde určité aminokyseliny v rámcovém úseku a konstantních doménách těžkého a lehkého řetězce byly mutovány tak, aby byla zrušena nebo odstraněna imunitní reakce u lidí. Latemativně, humanizovaná protilátka může být vytvořena fůzí konstantní domény z humánní protilátky s variabilními doménami jiného než lidského původu. Příklady přípravy humanizovaných proti55 látek lze najít v patentech Spojených Států US 6 054 297, US 5 886 152 a US 5 877 293.
-9CZ 301712 B6
Termín „chimérická protilátka“ se týká protilátky, která obsahuje jeden nebo více úseků z jedné protilátky a jeden nebo více úseků z jedné nebo více jiných protilátek. Ve výhodném provedení jeden nebo více CDR pocházejí z humánní anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodnějším provedení všechny CDR pocházejí z humánní anti-IGF-IR protilátky. V dalším výhodném provedení CDR z více než jedné humánní anti-IGF-IR protilátky jsou smíchány a sestaveny v chimérické protilátce. Například chimérická protilátka může zahrnovat CDR1 z lehkého řetězce první humánní anti-IGF-IR protilátky v kombinaci sCDR2 a CDR3 z lehkého řetězce druhé humánní anti-IGF-IR protilátky a CDR těžkého řetězce může pocházet z třetí anti-IGF-IR protilátky, io A dále rámcové úseky mohou pocházet z rámce jedné anti-IGF-IR protilátky, z jedné nebo více různých protilátek, jako například humánní protilátky, nebo z humanizované protilátky.
„Neutralizační protilátka“ nebo „inhibiční protilátka“ je protilátka, která inhibuje vazbu IGF-IR k IGF—I, když nadbytek anti-IGF-IR protilátky redukuje množství IGF-I vázaného k IGF-IR alespoň přibližně o 20 %. Ve výhodném provedení protilátka redukuje množství IGF-I vázaného k IGF-IR alespoň o 40 %, výhodněji o 60 %, dokonce výhodněji o 80 % nebo dokonce ještě výhodněji o 85 %. Redukce vazby může být měřena kteroukoliv metodou v oboru známou, například v /« vitro kompetitivním vazebném testu. Příklad měření redukce vazby IGF-I k IGF-IR je prezentován dále v příkladu 4.
„Aktivační protilátka“ je protilátka, který aktivuje alespoň přibližně 20% IGF-IR, když je přidána k buňce, tkáni nebo organismu, které exprimují IGF-IR. Ve výhodném provedení protilátka aktivuje IGF-IR aktivitu na alespoň 40 %, výhodněji 60 %, dokonce ještě výhodněji 80 % nebo dokonce nej výhodněji 85 %. Ve výhodném provedení aktivačního protilátka je přidána v přítom25 nosti IGF-I nebo IGF—II. V dalším výhodném provedení je aktivita aktivační protilátky měřena tím, že se určuje množství autofosforylace tyrosinu IGF-IR.
Fragmenty nebo analogy protilátek mohou být snadno připraveny odborníkem na základě předloženého popisu. Výhodné aminokoncové a karboxykoncové fragmenty nebo analogy se vyskytují v blízkosti hranic funkčních domén. Strukturální a funkční domény mohou být identifikovány srovnáním nukleotidové a/nebo aminokyselinové sekvence sdaty, která jsou ve veřejných nebo soukromých databází. Výhodně se použijí počítačově srovnávací metody k rozpoznání sekvenčních motivů nebo predikci proteinových konformačních domén, které se vyskytují u jiných proteinů se známou strukturou a/nebo funkcí. Metody identifikace proteinových sekvencí, které se svinuj í do známých trojrozměrných struktur, jsou známy (Bowie et al., Science 253: 164, 1991).
Termín „povrchová plazmonová rezonance“, jak se v tomto textu používá, se týká optického jevu, který umožňuje analyzovat biospecifické interakce v reálném čase tím, že se detekují změny v proteinových koncentracích v biosenzorové matici, například s použitím systému BIACORE (Pharmacia Biosenzor AB, Uppsala, Švédsko a Piscataway, N. J.). Pro další popis např, viz Jonsson, U,, et al., 1993, Ann. Biol, Clin. 51: 19-26, Jonsson, U., et al., 1991, Biotechniques 11: 620-627, Johnsson, B., et al., 1995, J. Mol, Recognit. 8: 125-131 a Johnson, B., et al., 1991, Anal. Biochem. 198: 268-277.
Termín „Koff“ se týká rychlostní konstanty pro oddělení protilátky z komplexu protilátka/antigen. Termín „Kd“ se týká disociační konstanty konkrétní interakce protilátka-antigen.
Termín „epitop“ označuje jakoukoliv proteinovou determinantu schopnou specifické vazby k imunoglobulinu nebo receptoru T lymfocytů. Epitopové determinanty obvykle sestávají z chemicky aktivního povrchového seskupení molekul jalo jsou například aminokyseliny nebo sacharidové postranní řetězce a obvykle mají specifické prostorové (trojrozměrné) strukturální vlastnosti, a také specifické vlastnosti pokud jde o náboj. Protilátky specificky váží antigen, když je disociační konstanta < 1 μΜ, výhodně < 100 nM a nejvýhodněji je < 10 nM.
- 10CZ 301712 B6
Jak se v tomto textu používá, dvacet obvyklých aminokyselin ajejich zkratky se drží toho, co je v oboru zvykem (viz publikace Immunology-A Synthesis, 2“1 Edition, E. S. Golub and
D. R. Gren, Ed., Sinauer Associates, Sounderland, Mass., 1991, kteráje zahrnuta formou odkazu v tomto textu). Stereoizomery (např. D-aminokyselina) dvaceti obvyklých aminokyselin, „neprí5 rodní“ aminokyseliny (v přírodě se nevyskytující) jako například α-, α-disubstituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mléčná a jiné nekonvenční aminokyseliny mohou také být vhodné složky polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Příklady nekonvenčních aminokyselin zahrnují: 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν, N, N-trimethyllylsin, ε-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3-methyIhistídin, 5-hydroxylysin, io ε-N-methylarginin a další podobné aminokyseliny a iminokyseliny (např, 4-hydroxyprolin). V zápisu polypeptidů, který je užíván v tomto textu, je směr doleva amino-koncový směr a směr dopřávaje karboxy-koncový směr, což odpovídá standardu a konvenci.
Termín „polynukleotid“, jak je užíván v tomto textu znamená polymemí formu nukleotidů ales15 poň 10 bází, buďto ribonukleotidů, nebo deoxynukleotidů nebo modifikovaných forem obou z výše uvedených typů nukleotidů. Termín zahrnuje jednoduché a dvojvláknové (dvojřetězcové) formy DNA.
Termín „izolovaný polynukleotid“, jak se v tomto textu používá, znamená polynukleotid geno20 mového, cDNA nebo syntetického původu nebo jakékoliv jejich kombinace, který z důvodu svého původu jako „izolovaný polynukleotid“ (1) není asociován ani se všemi ani částí polynukleotidů, se kterými je „izolovaný polynukleotid“ asociován v přírodě, (2) je operativně spojen s polynukleotidem, se kterým není spojen v přírodě nebo (3) nevyskytuje se v přírodě jako část větší sekvence.
Termín „oligonukleotid“ v tomto textu zahrnuje přirozeně se vyskytující a modifikované nukleotidy spojené přirozeně se vyskytujícími oligonukleotidovými vazbami a oligonukleotidovými vazbami, které se přirozeně nevyskytují. Oligonukleotidy jsou podmnožinou polynukleotidů obecně obsahující 200 bází nebo méně. Výhodně oligonukleotidy jsou dlouhé 10 až 60 bází, a nejvýhodněji 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nebo 20 až 40 bází. Oligonukleotidy jsou obvykle jednoduchá vlákna, např. pro sondy, ačkoliv oligonukleotid může být dvojvláknový, např. oligonukleotid pro použití v konstrukci genových mutant. Oligonukleotidy podle vynálezu mohou být buď „sense“, nebo „antisense“ oligonukleotidy.
Termín „přirozeně se vyskytující nukleotidy“ v tomto textu zahrnuje deoxyribonukleotidy a ribonukleotidy. Termín „modifikované nukleotidy“ v tomto textu zahrnuje nukleotidy s modifikovanými nebo substituovanými sacharidovými skupinami apod. Termín „oligonukleotidové vazby“ v tomto textu zahrnuje oligonukleotidové vazby jako je například vazba fosforothioátová, fosforrodithiátová, fosforoselenoátová, fosforodiselenoátová, fosforoanilothioátová, fosforanilidátová, fosforamidátová apod. (víz např. LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081, 1986, Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077, 1984, Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209, 1988, Zon et al. antiCancer Drug Design 6: 539, 1991, Zon et al. Oligonuklecotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Vyd., Oxford University Press, Oxford England, 1991), Stec et al., patent Spojených Států US 5 151 510, Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:
543, 1990).
Oligonukleotid může obsahovat „značku“ pro detekci, je-li to třeba.
„Operativně spojené“ sekvence zahrnují jak expresní kontrolní sekvence, které jsou bezpro50 středně sousedící s požadovaným genem, tak i expresní kontrolní sekvence, které působí v trans nebo na dálku kontrolují požadovaný gen. Termín „expresní kontrolní sekvence“, jak se v tomto textu používá, se týká polynukleotidových sekvencí, které jsou nutné k realizaci exprese a opracování kódující sekvence, ke které jsou ligovány. Expresní kontrolní sekvence zahrnují vhodné sekvence iniciace a ukončení transkripce, promotorové a enhancerové (zesilující) sekvence, účin55 né sekvence opracování RNA jako například sestřihové a polyadenylační signály, sekvence stabi-11CZ 301712 B6 lizující cytoplazmatickou mRNA, sekvence zesilující translační účinnost (tj. Kozáková kanonická sekvence), sekvence zlepšující stabilitu proteinu, sekvence zesilující sekreci proteinu. Povaha takové kontrolní sekvence závisí na hostitelském organismu, u prokaryot takové kontrolní sekvence obecně zahrnují promotor, ribozomální vazebné místo a sekvenci pro terminaci trans5 kripce, u eukaryot obecně takové kontrolní sekvence zahrnují promotor a sekvenci pro terminaci transkripce. Termín „kontrolní sekvence“ zahrnuje přinejmenším všechny složky, jejichž přítomnost je esenciální pro expresi a opracování a může také zahrnovat další složky, jejichž přítomnost je výhodná, například vedoucí sekvence a fuzní partnerské sekvence.
io Termín „vektor“, jakje použit v tomto textu, se týká molekuly nukleové kyseliny schopné transportovat další nukleovou kyselinu, se kterou byl spojen. Jeden typ vektoru je „plazmid“, což je kruhová dvojvláknová DNA klička, do které mohou být ligovány další segmenty DNA. Dalším typem vektoru je virový vektor, kde další DNA segmenty mohou být ligovány do virového genomu. Určité vektory jsou schopné autonomní replikace v hostitelské buňce, do které jsou vneseny (např. bakteriální vektory mající bakteriální replíkační počátek a episomální savčí vektory). Jiné vektory (např. neepisomální savčí vektory) mohou být integrovány do genomu hostitelské buňky po vnesení do hostitelské buňky a proto jsou kopírovány společně s hostitelským genomem. Navíc určité vektory jsou schopné řídit expresi genu, ke kterému jsou operativně spojeny. Takové vektory jsou nazývány v tomto textu „rekombinantní expresní vektory“ (nebo prostě „expresní vektory“). Obecně platí, že expresní vektory použitelné v rekombinantní DNA technikách jsou často ve formě plazmidu. V předkládaném popisu proto termíny „plazmid“ a „vektor“ mohou být použitelné zaměnitelně, jelikož plazmid je nejobvyklejší používaná forma vektoru. Nicméně, vynález zahrnuje i jiné formy expresních vektorů, jako například virové vektory (např. replikačně defektní retro viry, adenoviry a adeno-asociované viry), které mají ekvivalentní funkce.
Termín „rekombinantní hostitelská buňka“ (nebo prostě „hostitelská buňka“), jak je použít v tomto textu, se týká buňky, do které byl vnesen rekombinantní expresní vektor. Je třeba rozumět, že tento termín nezahrnuje pouze konkrétní buňku, ale i potomstvo takové buňky.
Protože se mohou vyskytovat určité modifikace v následným generacích způsobené buďto mutací, nebo environmentálními vlivy, takové potomstvo nemůže ve skutečnosti být totožné se základní, rodičovskou buňkou, ale přesto je zahrnuto v rozsahu termínu „hostitelská buňka“, jak se v tomto textu používá.
Termín „selektivně hybridizovat“ v tomto textu znamená specificky a detekovatelné vázat. Polynukleotidy, oligonukleotidy a fragmenty podle vynálezu selektivně hybridizují s vláknem nukleové kyseliny za podmínek hybridizace a promývání, které významně minimalizují detekovatelnou vazbu k nespecifickým nukleovým kyselinám. „Vysoce stringentní“ nebo „vysoce přísné“ podmínky se užívají k dosažení selektivní hybridizace jak je v oboru známo a jak je dále ještě disku40 továno. Příkladem „vysoce stríngentních“ nebo „velmi přísných“ podmínek je způsob inkubace polynukleotidu s dalším polynukleotidem, kdy jeden polynukíeotid může být fixován na povrchu pevné látky, jako je například membrána, v hybridizačním pufru obsahujícím 6X SSPE nebo SSC, 50% formamid, 5X Denhardtovo činidlo, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturované DNA z lososího spermatu, při hybridizační teplotě 42 °C po dobu 12 až 16 hodin, po které následuje dvakrát promytí v 55 °C v promývacím pufru s IX SSC, 0,5% SDS (podrobněji viz Sambrook et al„ citován výše, pp. 9,50-9,55).
Termín „procento sekvenční identity“ v kontextu sekvencí nukleové kyseliny se týká dvou sekvencí, které jsou stejné, když se přiřadí (srovnají) pro dosažení maximální shody. Délka sekvence srovnání identity může být alespoň devět nukleotidů, obvykle alespoň 18 nukleotidů, obvykleji alespoň 24 nukleotidů, typicky alespoň přibližně 28 nukleotidů, typičtěji alespoň 32 nukleotidů a výhodně alespoň přibližně 36, 48 nebo ještě více nukleotidů. V oboru je známa řada různých algoritmů, které mohou být použity pro určení míry identity nukleotidových sekvencí. Například polynukleotidové sekvence mohou být porovnávány s použitím algoritmů
FASTA, Gap nebo Bestfit, které jsou součástí programového balíku Wisconsin Package Version
- 12CZ 301712 B6
10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsín. FASTA, který zahrnuje, např.
programy FASTA2 a FASTA3, poskytuje porovnání sekvencí a určí procento sekvenční identity úseku nejlepšího přiřazení (překrytí) mezi dotazovanou a vyhledanou sekvencí (Pearson,
Methods Enzymol. 183: 63-98, 1990, Pearson, Methods Mot. Biol, 132: 185-219, 2000, Pearson,
Methods Enzymol. 266: 227-258, 1996, Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84, 1998, v tomto textu zahrnuto formou odkazu). Není-IÍ uvedeno jinak, pro konkrétní program nebo algoritmus jsou použity standardní parametry. Například procenta sekvenční identity mezi sekvencemi nukieové kyseliny mohou být určena s použitím programu FASTA sjeho standardními parametry (velikost slova 6 a faktor pro skórovací matici NOPAM) nebo s použitím programu GAP se standardními io parametry, které poskytuje GCG Verze 6,1, které jsou v tomto textu zahrnuty formou odkazu.
Pokud se v textu odkazuje na sekvenci nukieové kyseliny, pak je zahrnut í její komplement (komplementární sekvence), není-li uvedeno jinak. Takže pokud se popis týká molekuly nukieové kyseliny mající konkrétní sekvenci, zahrnuje i její komplementární vlákno, sjeho komplementár15 ní sekvencí.
V oboru molekulární biologie se termíny „procenta sekvenční identity“, „procenta sekvenční podonosti“ a „procenta sekvenční homologie“, resp. termíny „sekvenční identita“, „sekvenční podobnost“ a „sekvenční homologie“ užívají zcela zaměnitelně. V této přihlášce mají tyto termí20 ny stejný význam pouze pokud jde o sekvence nukieové kyseliny.
Termín „podstatná podobnost* nebo „podstatná sekvenční podobnost*, ve vztahu k nukleovým kyselinám nebo jejich fragmentům, odkazuje na to, že když se sekvence optimálně přiřadí (srovná) za použití vhodné nukleotidové inzerce nebo delece s další nukleovou kyselinou (nebo jejím komplementárním vláknem), dosáhne se nukleotidové sekvenční identity alespoň přibližně 85 %, výhodně alespoň přibližně 90 % a výhodněji alespoň přibližně 95, 96, 97, 98 nebo 99 % nukleotidových bází, při měření kterýmkoliv známým algoritmem pro sekvenční identitu, jako je například FASTA, BLAST nebo Gap, jak bylo jíž diskutováno výše.
Pokud jde o polypeptidy, pak termín „podstatná identita“ znamená, že dvě peptidové sekvence, když jsou optimálně porovnány, jako například pomocí programu GAP nebo BESTFIT s použitím standardní váhy pro mezeru, sdílejí alespoň 75 nebo 80% sekvenční identitu, výhodně alespoň 90 nebo 95% sekvenční identitu, dokonce výhodněji alespoň 98 nebo 99% sekvenční identitu. Výhodně, pozice zbytků, které nejsou totožné, se liší díky konzervativní substituci aminokyselin. „Konzervativní substituce aminokyseliny“ je taková substituce, kde jeden aminokyselinový zbytek je substituován jiným aminokyselinovým zbytkem majícím postranní řetězec (R skupina) s podobnými chemickými vlastnostmi (jako je např. náboj nebo hydrofobicita). Obecně, konzervativně substituovaná aminokyselina v podstatě nemění funkční vlastnosti proteinu. V případech, kde se dvě nebo více aminokyselinových sekvencí liší konzervativní sub40 stitucí, procenta sekvenční identity nebo míry podobnosti mohou být korigovány směrem k vyšším hodnotám vzhledem ke konzervativní povaze substituce. Prostředky pro takovou úpravu jsou odborníkům známy, viz např. Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31,1994, v tomto textu zahrnuto formou odkazu. Příklady skupin aminokyselin, které mají postranní řetězce s podobnými chemickými vlastnostmi, zahrnují 1) alifatický postranní řetězce: glycin, alanin, valin, leucin a izoleucin, 2) alifatický-hydroxylový postranní řetězce: serin a threonin, 3) amid obsahující postranní řetězec: asparagin a glutamin, 4) aromatický postranní řetězce: fenylalanin, tyrosin a tryptofan, 5) bazický postranní řetězce: lysin, arginin a histidin a 6) síru obsahující postranní řetězec: cystein a methionin. Výhodné konzervativní aminokyselinové substituční skupiny jsou následující: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysín-arginin, alanin-valin, so glutamát-aspartát a asparagin-glutamin.
Alternativně konzervativní substituce je jakákoliv změna mající pozitivní hodnotu v PAM250 log-pravděpodobnostní matici popsané vGonnet et al., Science 256: 1443-45, 1992, v tomto textu zahrnuté formou odkazu. „Mírně konzervativní“ substituce je kterákoliv změna mající hodnotu v PAM250 logaritmické pravděpodobnostní matici jinou než negativní.
- 13CZ 301712 B6
Sekvenční podobnost polypeptidů, která je také nazývána sekvenční identita, je typicky měřena s použitím softwaru pro analýzy sekvence. Software pro analýzy proteinů přiřazuje podobné sekvence na základě míry podobnosti přiřazené různým substitucím, delecím a jiným modifi5 kácím, včetně konzervativních substitucí aminokyselin. Například programový balík GCG obsahuje programy jako například „Gap“ a „Bestfít“, které mohou být použity se standardními parametry pro určování sekvenční homologie nebo sekvenční identity mezi blízce příbuznými polypeptidy, jako jsou například homologní polypeptidy z různých druhů organismů, nebo mezi proteinem divokého typu a jeho muteinem (viz např, GCG Verze 6,1). Polypeptidové sekvence io také mohou být porovnávány pomocí programu FASTA s použitím standardních nebo doporučených parametrů, což je také program v GCG Verzi 6,1. FASTA (např. FASTA2 aFASTA3) poskytuje porovnání a procenta sekvenční identity pro úseky nej lepšího překrývání mezi dotazovanou a vyhledávanou sekvencí (Pearson, 1990, Pearson, 2000). Další výhodný algoritmus pro srovnávání sekvence podle vynálezu s databází obsahující velký počet sekvencí z různých organismů je počítačový program BLAST, obzvláště jeho varianty blastp nebo tblastn, s použitím standardních parametrů (viz např. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, Altschul et ak, Nucleic Acids Res. 25: 3389-402, 1997, v tomto textu zahrnuto formou odkazu).
Délka polypeptidové sekvence porovnávané na homologii je obecně alespoň asi lóamino20 kyselinových zbytků, obvykle alespoň asi 20 zbytků, obvykleji alespoň přibližně 24 zbytků, typicky alespoň přibližně 28 zbytků a výhodně víc než přibližně 35 zbytků. Když se prohledává databáze obsahující sekvence z velkého počtu různých organismů, je výhodné srovnávat aminokyselinové sekvence.
Jak se v tomto textu používá, termíny „značka“ nebo „značený“ se týkají inkorporace další molekuly do protilátky. V jednom provedení vynálezu je značka detekovatelný markér, např. inkorporace radioaktivně značené aminokyseliny do polypeptidu nebo připojení biotinylových skupin k polypeptidu, které mohou být detekovány značeným avidínem (např. streptavidinem obsahujícím fluorescenční markéry nebo enzymatickou aktivitu, které mohou být detekovány optickými nebo kolorimetrickými metodami). V dalším provedení značka nebo markér mohou být terapeutické, např. konjugát s léčivem nebo toxin. Různé metody značení polypeptidů a glykoproteinu jsou známy v oboru a mohou být použity. Příklady značek pro polypeptidy zahrnují, ale bez omezení, následující: radioizotopy nebo radionuklidy (např. 3H, 14C, *’N, 35S, Y, Tc, ”'ln, I251,13ll), fluorescenční značky (např. FITC, rhodamin, lanthanid fosfory), enzy35 matické značky (např. křenová peroxidáza, β-galaktosidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza), chemiluminiscenční značky, biotinylové skupiny, predeterminované polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundárním reportérem (např. sekvence leucinového zipu, vazebná místa pro sekundární protilátky, vazebné domény kovů, epitopové „přívěsky“), magnetická činidla jako například cheláty gadolinia, toxiny jako například toxin Černého kašle, taxol, cytochalasin B, gramícidin D, ethidum bromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxydion anthracinu, mitoxantron, mithramycin, aktinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glukokortikoidy, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol a puromycin ajejich analogy nebo homology.
V některých provedeních jsou značky připojeny pomocí oddělovače, spaceru, různých délek, aby se snížila možnost sterických zábran.
Termín „agens“ nebo „činidlo“ se užívá v tomto textu pro označení chemické sloučeniny, směs chemických sloučenin, biologické makromolekuly nebo extraktu získaného z biologického materiálu. Termín „farmaceutické agens nebo léčivo“, jak se v tomto textu používá, se týká chemických sloučenin nebo kompozic schopných vyvolat požadovaný terapeutický účinek, když jsou vhodně podávány pacientovi. Další chemické termíny v tomto textu jsou použity v souladu se zvyklostmi v oboru, jak lze najít např. v publikaci The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Vyd., McGraw-Hill, San Francisco, 1985), zahrnuté formou odkazu v tomto textu.
-14CZ 301712 B6
Termín „antineoplazické agens“ je používán v tomto textu k označení Činidel, která mají tu funkční vlastnost, že inhibují rozvoj nebo progresi neoplázie čili novotvaru u člověka, konkrétně maligní (rakovinné) leze, jako je například karcinom, zhoubný nádor, lymfom nebo leukémie. Inhibice metastáz je také častou vlastností antineoplazického agens.
Termín pacient zahrnuje pacienty jak humánní, tak i veterinární, tedy lidi i zvířata.
Humánní anti-IGF-IR protilátky ajejich charakterizace
Humánní protilátky zabraňují určitým problémům, které jsou spojeny s protilátkami, které obsahují variabilní a/nebo konstantní úseky z myší nebo laboratorního potkana. Přítomnost sekvence pocházející z myši nebo laboratorního potkana může vést k rychlé clearance protilátek nebo může dokonce vyvolat imunitní reakci pacienta proti podané protilátce.
Proto v jednom provedení vynález poskytuje humanizované anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodném provedení vynález poskytuje plně humánní anti-IGF IR protilátky tak, že humánní iminoglobulinové geny jsou vneseny do hlodavce, takže hlodavec pak vytváří plně humánní protilátky. Výhodnější jsou plně humánní anti-humánní IGF-IR protilátky. Plně humánní anti-IGF-IR protilátky by měly podle očekávání minimalizovat imunogenní a alergickou odpověď, která je vlastní myším nebo z myší odvozeným monoklonálním protilátkám (Mab), a tím zvýšit účinnost a bezpečnost podávání protilátek. Použití plně humánních protilátek by mělo poskytnout podstatné výhody při léčbě chronických a periodických lidských onemocnění, jako je například zánět a karcinom, kdy je vyžadováno opakované podávání protilátky. V dalším provedení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která se naváže na komplement.
Ve výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je protilátka 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4,17,3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka obsahuje lehký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22 nebo jeden nebo více úseků CDR z těchto aminokyselinových sekvencí. V dalším výhodném prove30 dění anti-IGF-IR protilátka obsahuje těžký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo jeden nebo více úseků CDR z těchto aminokyselinových sekvencí.
Třídy a podtřídy Anti-IGF-IR protilátek
Protilátka může být molekula IgG, IgM, IgE, IgA nebo IgD. Ve výhodném provedení protilátka je IgG protilátka a je podtypu IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4. Ve výhodnější provedení anti-IGF-IR protilátka je protilátka podtřídy IgG2. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je stejné třídy a podtřídy jako protilátka 2.12,1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4,9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1, což je IgG2.
Třída a podtřída anti-IGF-IR protilátky mohou být určeny jakýmkoliv způsobem známým v oboru. Obecně, třída a podtřída protilátky mohou být určeny pomocí protilátek, které jsou specifické pro konkrétní třídu a podtřídu protilátky. Takové protilátky jsou dostupné komerčně. Třída a podtřída mohou být určeny např. testem ELISA, Western blot, a jinými technikami.
Alternativně třída a podtřída mohou být určeny sekvencováním celých nebo části konstantních domén těžkého a/nebo lehkého řetězce protilátek, porovnáním jejich aminokyselinové sekvence se známou aminokyselinovou sekvencí různých tříd a podtříd imunoglobulinů a určením třídy so a podtřídy protilátky.
Druhová a molekulová selektivita
V dalším aspektu vynálezu anti-IGF-IR protilátka vykazuje jak druhovou, tak i molekulovou selektivitu. V jednom provedení se anti-IGF-IR protilátka váže k IGF-IR člověka nebo makaků
-15CZ 301712 B6 (Macaca fascicularis nebo M. rhesus). Ve výhodném provedení se anti-IGF-IR protilátka neváže na IGF-IR myši, laboratorního potkana, morčete, psa nebo králíka. V dalším výhodném provedení se anti-IGF-IR protilátka naváže u druhů opic Nového světa jako je například marmoset (Callithrix sp.). Na základě popisu vynálezu je možné určit druhovou selektivitu anti-IGF-IR protilátky pomocí metod dobře známých v oboru. Například je možné určit druhovou selektivitu s použitím testů Western blot, FACS, ELISA nebo RIA. Ve výhodném provedení může být určena druhová selektivita s použitím Western blotu.
V dalším provedení má anti-IGF-IR protilátka selektivitu pro IGF-IR, která je alespoň 50 krát i o větší než její selektivita pro inzulínový receptor. Ve výhodném provedení selektivita anti-IGF-IR protilátka je více než 100 krát vyšší než její selektivita pro inzulínový receptor. V ještě výhodnějším provedení anti-IGF-IR protilátka neprojevuje žádnou patrnou specifickou vazbu na jakýkoliv jiný protein kromě IGF-IR. Selektivita anti-IGF-IR protilátky pro IGR-IR může být určena na základě popisu vynálezu s použitím metod dobře známých v oboru. Například selektivita může být určena pomocí testů Western blot, FACS, ELISA nebo RIA. Ve výhodném provedení může být určena molekulární selektivita s použitím Western blotu.
Vazebná afinita anti-IGF-IR k IGF-IR
V dalším aspektu vynálezu, anti-IGF-IR protilátky se vážou k IGF-IR s vysokou afinitou.
V jednom provedení se anti-IGF-IR protilátka váže k IGF-IR s Kd 1 x 10’8 M nebo menší. Ve výhodnějším provedení se protilátka váže k IGF-IR sKd lx 10~9M nebo menší. V ještě výhodnějším provedení se protilátka váže k IGF-IR sKd 5x 10“'° M nebo menší. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s Kj 1 x 10-10 M nebo menší. V dalším výhod25 ném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka vybraná z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky vybrané z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1,1.
V ještě dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybranou ze SEKV. ID, Č, 2, 4, 6,
8, 10, 12,14, 16,18, 20,22 nebo 24. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky, která obsahuje jednu nebo více aminokyselinových sekvencí vybraných ze SEKV. ID. Č. 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22 nebo 24.
V dalším aspektu vynálezu, anti-IGF-IR protilátka má nízkou rychlost disociace, V jednom provedení anti-IGF-IR protilátka má Koff hodnotu lx I04 s“’ nebo nižší. Ve výhodném provedení Koff je 5 x 10 5 s'1 nebo nižší. V dalším výhodném provedení Koff je v podstatě stejná jako Koff protilátky vybrané zprotilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6. 1,1.
V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Koff jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky vybrané z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6. 1,1, V ještě dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kofy jako protilátka, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybranou ze SEKV. ID. Č. 2,4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18,20,22 nebo 24. V dalším výhodném pro45 vedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Koff jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybraných ze SEKV. ID. Č. 2,4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18,20,22.
Vazebná afinita a rychlost disociace anti-IGF-IR protilátky a IGF-IR mohou být určeny jakým50 koliv způsobem známým v oboru. V jednom provedení je vazebná afinita měřena kompetitivní ELISA, RIA nebo povrchovou plazmonovou resonancí, jako je například systém BIACORE. Rychlost disociace může být také měřena povrchovou plazmonovou resonancí. Ve výhodnějším provedení vazebná afinita a rychlost disociace jsou měřeny povrchovou plazmonovou resonancí.
V ještě výhodnějším provedení vazebná afinita a rychlost disociace jsou měřeny s použitím sys-16CZ 301712 B6 tému BIACORE. Příklady stanovení vazebné afinity a rychlosti disociace jsou popsány dále v příkladu 2.
Poločas anti-IGF-IR protilátky
Podle dalšího předmětu vynálezu, anti-IGF-IR protilátka má biologický poločas in vitro nebo in vivo alespoň jeden den. Ve výhodném provedení má protilátka nebo její část poločas alespoň tři dny. Ve výhodnějším provedení má protilátka nebo její část poločas čtyři dny nebo delší. V dalším provedení má protilátka nebo její část poločas osm dnů nebo delší. V dalším provedení io je protilátka nebo její antigen-vazebná část derivatizována nebo modifikována tak, že má delší poločas, jak je diskutováno ještě dále. V dalším výhodném provedení protilátka může obsahovat bodové mutace, které zvyšují poločas v séru, jako bylo například popsáno ve WO 00/09560, publikované 24. února 2000.
Poločas protilátky může být měřen kteroukoliv z metod známých v oboru. Například poločas protilátky může být měřen pomocí Western biot, ELISA nebo RIA po vhodné časové období. Poločas protilátky může být měřen na jakýchkoliv vhodných zvířatech, např. opicích, jako například makakové, primáti nebo i člověk.
Identifikace IGF-IR epitopů rozpoznávaných protilátkou anti-IGF-IR
Vynález také poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která váže stejný antigen nebo epitop jako humánní anti-IGF-IR protilátka. Dále vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, který zkříženě kompetuje s humánní anti-IGF-IR protilátkou. Ve výhodném provedení humánní anti-IGF-IR protilátka je protilátka 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení humánní anti-IGF-IR obsahuje jeden nebo více úseků CDR z protilátky vybrané z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1. 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. Vještě dalším výhodném provedení humánní anti-IGF-IR obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybraných ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24. V dalším výhodném provedení humánní anti-IGF-IR obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybraných ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24. Ve vysoce výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je další humánní protilátka.
Zda se anti-IGF-IR protilátka váže ke stejnému antigenu je možné určit použitím celé řady metod známých v oboru. Například se může určovat, zda se testovaná anti-IGF-IR protilátka váže ke stejnému antigenu s použitím anti-IGF-IR protilátky k zachycení antigenu, o kterém je známo, že se váže na anti-IGF-IR protilátku, jako například IGF-IR, pak eluovat antigen z protilátky a nakonec určit, zda se testovaná protilátka váže k eluovanému antigenu. Může se určovat také, zda se protilátka váže ke stejnému epitopu jako anti-IGF-IR protilátka, a sice vazbou anti-IGF-IR protilátky k IGF-IR za saturujících podmínek a pak měřením schopnosti testované protilátky vázat se k IGF-IR. Jestliže je testovaná protilátka schopná vázat se k IGF-IR současně jako anti-IGF-IR protilátka, pak se testovaná protilátka váže k odlišnému epitopu než anti-IGF-IR protilátka. Nicméně, jestliže testovaná protilátka není schopná se vázat k IGF-IR současně, pak se testovaná protilátka váže ke stejnému epitopu jako humánní anti-IGF-IR proti45 látka. Tento experiment může být prováděn s použitím ELISA, RIA nebo povrchové plazmonové rezonance. Ve výhodném provedení je experiment prováděn s použitím povrchové plazmonové rezonance. Ve výhodnějším provedení je použit systém BIACORE. Může se také určovat, zda anti-IGF-IR protilátka zkříženě kompetuje s anti-IGF-IR protilátkou. Ve výhodném provedení se může určovat, zda anti-IGF-IR protilátka zkříženě kompetuje s jinou, a to tak, že se použije stejný způsob, kterým se určuje, zda je antí-IGF-IR protilátka schopná vázat se ke stejnému epitopu jako jiná anti-IGF-IR protilátka.
- 17CZ 301712 B6
Využití lehkých a těžkých řetězců
Vynález také poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která obsahuje variabilní sekvence kódované humánním genem κ. Ve výhodném provedení jsou variabilní sekvence kódovány geny rodiny buď Vk A27, A30, nebo 012. Ve výhodném provedení jsou variabilní sekvence kódovány humánní genovou rodinou Vk A30. Ve výhodnějším provedení lehký řetězec obsahuje ne více než deset substituovaných aminokyselin ze zárodečné linie VkA27, A30 nebo 012, výhodně ne více než šest substituovaných aminokyselin a výhodněji ne více než tři substituované aminokyseliny. Ve výhodném provedení jsou aminokyselinové substituce konzervativní substituce.
SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 a 22 poskytují aminokyselinové sekvence variabilních úseků šesti anti-IGF-IR κ lehkých řetězců. SEKV, ID. Č. 38, 40 a 42 poskytují aminokyselinové sekvence tři zárodečných κ lehkého řetězce, z něhož pochází šest anti-IGF-IR κ lehkých řetězců. Obr. 1A-1C ukazují srovnání nukleotidovýeh sekvencí variabilních úseků lehkého řetězce šesti anti-IGF-IR protilátek a zárodečné sekvence, ze které pocházejí. Na základě popisu vynálezu odborník může určit kódované aminokyselinové sekvence pro těchto šest anti-IGF IR κ lehkých řetězců a zárodečného κ lehkého řetězce a stanovit rozdíly mezi zárodečnou sekvencí a sekvencí protilátky.
Ve výhodném provedení VL z anti-IGF-IR protilátky obsahuje stejné substituce aminokyselin, vzhledem k zárodečné aminokyselinové sekvenci, jako kterýkoliv jeden nebo více VL z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. Například VL anti-IGF-IR protilátky může obsahovat jednu nebo více aminokyselinových substitucí, které jsou stejné jako substituce přítomné v protilátce 2.13,2, další aminokyselinovou substituci, která je stejná jako substituce přítomná v protilátce 2.14.3 a další aminokyselinovou substituci, která je stejná jako substituce v protilátce 4.9.2. Tímto způsobem se mohou mísit a spojovat různé rysy vazby protilátky, aby se např. změnila afinita protilátky pro IGF-IR nebo její rychlost disociace od antigenu. V dalším provedení jsou aminokyselinové substituce vytvořeny ve stejných polohách, ve kterých byly zjištěny v kterékoliv jedné nebo více VL z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6. 1,1, přičemž jsou tvořeny konzervativní substituce místo použití zcela stejných aminokyselin.
Například jestliže aminokyselinová substituce srovnávaná se zárodečnou sekvencí v jedné z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1 je glutamát, může být konzervativně substituován aspartát. Podobně, jestliže je substituovaná aminokyselina serin, může být konzervativně substituován threonin.
V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je stejná jako aminokyselinová sekvence VL z 2.12.1, 2.13.2, 2.14,3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6,1.1.
V dalším vysoce výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence, které jsou stejné jako CDR úseky lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci z alespoň jednoho CDR úseku lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13,2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence z CDR z různých lehkých řetězců. Ve výhodnějším provedení CDR z různých lehkých řetězců jsou získány z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3,1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. V dalším provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí nukleové kyseliny vybranou ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21 nebo sekvencí nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci mající 1 až 10 aminokyselinových inzercí, deleci nebo substitucí. Výhodně, substituce aminokyselin jsou konzervativní substituce amino50 kyselin. V dalším provedení vynálezu protilátka nebo její část obsahuje lehký řetězec lambda.
Předkládaný vynález také poskytuje anti-IGF-IR protilátku nebo část protilátky, která obsahuje humánní těžký řetězec nebo sekvenci pocházející z humánního těžkého řetězce. V jednom provedení aminokyselinová sekvence těžkého řetězce pochází z humánní genové rodiny
- 18CZ 301712 B6
VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 nebo VIV-4/4,35. Ve výhodném provedení aminokyselinová sekvence těžkého řetězce pochází z humánní genové rodiny VH DP47. Ve výhodnějším provedení těžký řetězec obsahuje ne více než osm aminokyselinových substitucí ze zárodečné linie VH
DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 nebo VIV-4/4.35, výhodněji ne více než šest aminokyselinových substitucí a dokonce výhodněji ne více než tři aminokyselinové substituce.
SEKV. ID. Č. 4, 8,12, 16,20 a 24 poskytují aminokyselinové sekvence variabilních úseků z šesti anti-IGF-IR těžkých řetězců. SEKV. ID. Č. 30, 32, 34, 36 a 44 poskytují aminokyselinové sekvence a SEKV. ID. Č. 29, 31, 33, 35 a 43 poskytují nukleotidové sekvence zárodečného io těžkého řetězce DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 a VIV-4, v daném pořadí. Obr. 2A-2D ukazují srovnání aminokyselinových sekvencí variabilních úseků šesti anti-IGF-IR protilátek sjim odpovídající zárodečnou sekvencí. Na základě popisu vynálezu odborník může určit kódované aminokyselinové sekvence pro těchto šest anti-IGF-IR těžkých řetězců a zárodečného těžkého řetězce a stanovit rozdíly mezi zárodečnou sekvencí a sekvencí protilátky.
Ve výhodném provedení VH anti-IGF-IR protilátky obsahuje stejné substituce aminokyselin, vzhledem k zárodečné aminokyselinové sekvenci, jako kterýkoliv jeden nebo více VH protilátek 2.12.1,2.13,2,2.14.3, 3.1.1,4.9.2,4.17.3 nebo 6.1.1. Podobně jak bylo již diskutováno výše, VH anti-IGF-IR protilátky může obsahovat jednu nebo více aminokyselinových substitucí, které jsou stejné jako substituce přítomné v protilátce 2.13.2, další aminokyselinovou substitucí, která je stejná jako substituce přítomná v protilátce 2.14.3 a další aminokyselinovou substituci, která je stejná jako v protilátce 4.9.2. Tímto způsobem se mohou mísit a spojovat různé rysy vazby protilátky, aby se např. změnila afinita protilátky pro IGF-IR nebo její rychlost disociace od antigenu. V jiném provedení jsou aminokyselinové substituce vytvořeny ve stejných polohách, ve kterých byly zjištěny v kterékoliv jedné nebo více VH z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 nebo 6. 1,1, přičemž jsou tvořeny konzervativní substituce místo použití zcela stejných aminokyselin.
V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je shodný jako aminokyselinová sekvence VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4,9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším vysoce výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence, které jsou stejné jako CDR úseky těžkého řetězce z 2.12.1, 2,13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci z alespoň jednoho CDR úseku těžkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3,1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence z CDR z různých těžkých řetězců. Ve výhodnějším provedení CDR z různých těžkých řetězců jsou získány z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4,17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 23. V dalším provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí nukleové kyseliny vybranou ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23 nebo sekvencí nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci mající 1 až 10 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí. Výhodně, substituce aminokyselin jsou konzervativní substituce aminokyselin.
Inhibice IGF-IR aktivity anti-IGF-IR protilátkou Inhibice vazby 1GF-1 k IGF-IR
V dalším provedení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která inhibuje vazbu IGF-I k
IGF-IR nebo vazbu IGF—II k IGF-IR. Ve výhodném provedení IGF-IR je humánní. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je humánní protilátka. V dalším provedení protilátka nebo její část inhibuje vazbu mezi IGF-IR a IGF-I s hodnotou IC50 ne vyšší než 100 nM. Ve výhodném provedení IC$0 není vyšší než 10 nM. Ve výhodnějším provedení IC50 není vyšší než nM. Hodnota IC50 může být měřena jakýmkoliv způsobem známým v oboru. Typicky, ICS0 může být měřena ELISA nebo RIA. Ve výhodném provedení IC50 je měřena pomocí RIA.
-19cz 301712 B6
V dalším provedení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která zabraňuje aktivaci IGF-IR v přítomnosti IGF-I. Ve výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka inhibuje IGF-I R-indukovanou fosforylaci tyrosinu, která nastává po obsazení receptoru. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka inhibuje další „downstream“ (po směru) buněčné události. Například anti-IGF-IR může inhibovat fosforylaci tyrosinu Shc a substrátu inzulínového receptoru (IRS) 1 a 2, kdy každý z nich je normálně fosforylován, když jsou buňky ošetřeny IGF-I (Kim et al., J. Biol, Chem. 273. 34543-34550, 1998). Může se určovat, zda anti-IGF-IR protilátka může zabránit aktivaci IGF-IR v přítomnosti IGF-I tím, že se určují hladiny autofosforylace pro IGF-IR, Shc, IRS—1 nebo IRS-2 pomocí Western blotu nebo imunoprecipitace. Ve výhodném io provedení se určí hladiny autofosforylace IGF-IR Western blotem (viz např. příklad 7).
V dalším aspektu vynálezu, protilátka způsobuje down-regulaci IGF-IR z buněk ošetřených protilátkou. V jednom provedení je IGF-IR intemalizován do cytoplasmy buňky. Po navázání anti-IGF-IR protilátky na IGF-IR je protilátka intemalizována, jak ukázala konfokální mikro15 skopie. Bez vazby na jakékoliv teorie, má se za to, že komplex protilátka-IGF-IR je intemalizován do lysosomu a degradován. Může být měřena down-regulace IGF-IR jakýmkoliv způsobem známým v oboru včetně imunoprecipitace, konfokální mikroskopie nebo Western blotu (viz např. příklad 7). Ve výhodném provedení protilátka je vybrána z 2.12,1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje jejich těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebný úsek.
Aktivace IGF-IR vlivem anti-IGF-IR protilátky
Další aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje aktivační anti-IGF-IR protilátky. Aktivační protilátka se tiší od inhibiční protilátky, protože zesiluje nebo nahrazuje účinky IGF-I na IGF-IR.
V jednom provedení aktivační protilátka je schopná vázat se na IGF-IR a přimět ho, aby byl aktivován bez přítomnosti IGF-I. Tento typ aktivační protilátky v podstatě napodobuje IGF-I.
V dalším provedení aktivační protilátka zesiluje účinek IGF-I na IGF-IR. Tento typ protilátky nezpůsobuje aktivaci IGF-ÍR samotného, ale spíše zvyšuje aktivaci IGF-IR v přítomnosti IGF-I. Napodobující anti-IGF-IR protilátka může být snadno odlišena od zesilující anti-IGF-IR proti30 látky, a sice ošetřením buněk in vitro protilátkou v přítomnosti nebo nepřítomnosti nízké hladiny IGF-I. Jestliže je protilátka schopná způsobit aktivaci IGF-IR bez výskytu IGF-I, např. zvyšuje se tyrosinová fosforylace IGF-IR, pak protilátka je napodobující protilátka. Jestliže protilátka nemůže způsobit aktivaci IGF-IR bez výskytu IGF-I, ale je schopná zesílit míru aktivace IGFIR, pak protilátka je zesilující protilátka. Ve výhodném provedení aktivační protilátka je 4.17.3.
V dalším výhodném provedení protilátka obsahuje jeden nebo více úseků CDR z 4,17.3.
V dalším výhodném provedení protilátka je odvozena buďto z jedné, nebo z obou zárodečných sekvencí 012 (lehký řetězec) a/nebo D71 (těžký řetězec).
Inhibice fosforylace tyrosinu IGF-IR, hladiny IGF-IR a nádorové buňky
Růst in vivo s anti-IGF-IR protilátkou
Další provedení vynálezu poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která in vivo inhibuje fosforylaci tyrosinu IGF-IR a hladiny receptoru. V jednom provedení podávání anti-IGF-IR protilátky zvířeti vyvolá snížení IGF-IR fosfotyrosinové signalizace v IGF-IR-exprimuj ících nádorech. Ve výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka vyvolá snížení fosfotyrosinového signálu alespoň o 20%. Ve výhodnějším provedení anti-IGF-IR protilátka způsobí pokles fosfotyrosinového signálu alespoň o 60%, výhodněji 50%, V ještě výhodnějším provedení protilátka způsobí pokles fosfotyrosinového signálu alespoň o 40 %, výhodněji o 30 %, dokonce výhodněji o 20 %.
Ve výhodném provedení protilátka je podávána přibližně 24 hodin před tím, než jsou hladiny tyrosinové fosforylace měřeny. Hladiny fosforylace tyrosinu mohou být měřeny jakýmkoliv způsobem známým v oboru, jako byly například způsoby zmíněné výše (viz také např. příklad 3 a obr. 5). Ve výhodném provedení protilátka je vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje její těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část.
-20CZ 301712 B6
V dalším provedení podávání anti-IGF-IR protilátky zvířeti vyvolá snížení IGF-IR hladiny v IGF-IR-exprimujících nádorech. Ve výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka vyvolá snížení hladiny receptorů alespoň o 20 % ve srovnání sneošetřeným zvířetem. Ve výhodnějším provedení anti-ÍGF-ÍR protilátka způsobí pokles hladiny receptorů na alespoň 60 %, výhodněji
50 % hladiny receptoru u neošetřeného zvířete, V ještě výhodnějším provedení protilátka způsobí pokles hladiny receptoru na alespoň 40 %, výhodněji 30 %. Ve výhodném provedení protilátka je podávána přibližně 24 hodin před tím, než jsou měřeny IGF-IR hladiny. IGF-IR hladiny mohou být měřeny jakýmkoliv způsobem známým v oboru, jak byly např. zmíněny výše (viz také příklad 7 a obr. 6). Ve výhodném provedení je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, io 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje její těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část.
V dalším provedení anti-IGF-IR protilátka inhibuje in vivo růst nádorových buněk. Nádorové buňky mohou pocházet z jakéhokoliv buněčného typu, a to včetně, bez jakéhokoliv omezení, epidermálních, epiteliálních a endotelových buněk, leukemických buněk, buněk sarkomu, buněk mnohačetného myelomu nebo mesodermálních buněk. Příklady nádorové buňky zahrnují buňky A549 (nemalobuněčný plicní karcinom), buňky MCF-7, buňky Colo 205, buňky 3T3/IGF-IR a buňky A431. Ve výhodném provedení protilátka inhibuje růst nádorových buněk ve srovnání s růstem nádoru u neošetřeného zvířete. Ve výhodnějším provedení protilátka inhibuj růst nádo20 rových buněk z 50 %. V ještě výhodnějším provedení protilátka inhibuje růst nádorových buněk z 60, 65, 70 nebo 75 %. V jednom provedení vynálezu je inhibice růstu nádorových buněk měřena alespoň 7 dnů po tom, co zvířata zahájila léčbu s protilátkou. Ve výhodnějším provedení je inhibice růstu nádorových buněk měřena alespoň 14 dnů po tom, co zvířata zahájila léčbu s protilátkou. V dalším výhodném provedení je zvířeti s anti-IGF-IR protilátkou podáváno jiné antineoplázické agens. Ve výhodném provedení antineoplázické agens je schopno další inhibice růstu nádorových buněk. V ještě výhodnějším provedení antineoplázické agens je adriamycin, taxol, tamoxifen, 5-fluordeoxyuridin (5-FU) nebo CP-3 58,774. Ve výhodném provedení souběžné podávání antineoplázického agens a anti-IGF-IR protilátky inhibuje růst nádorových buněk alespoň z 50 %, výhodně 60, 65, 70 nebo 75 %, výhodněji z 80, 85 nebo 90 % po dobu
22 až 24 dnů (viz např. obr. 7 a příklad 9). Ve výhodném provedení je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 6.1.1, nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část takové protilátky.
Indukce apoptózy anti-IGF-IR protilátkami
Další aspekt vynálezu poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která indukuje buněčnou smrt. V jednom provedení protilátka způsobuje apoptózu. Protilátka může indukovat apoptózu buď in vivo, nebo in vitro. Obecně, nádorové buňky jsou citlivější k apoptóze než normální buňky, takže podávání anti-IGF-IR protilátky způsobí apoptózu nádorové buňky spíše než normální buňky.
V dalším provedení vynálezu podávání anti-IGF-IR protilátky sníží hladiny enzymu akt, který se podílí na fosfatidylinositolkinázové (PI-kináza) dráze. PI-kinázová dráha je zase zapojena do buněčné proliferace a prevence apoptózy. Takže inhibice akt může způsobit apoptózu. Ve výhodnějším provedení je protilátka podávána in vivo, aby způsobila apoptózu IGF-IR-exprimujících buněk. Ve výhodném provedení je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 6. 1,1 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část takové protilátky.
Způsoby produkce protilátek a přípravy buněčné linie produkující protilátky
Imunizace
V jednom provedení předkládaného vynálezu jsou humánní protilátky produkovány imunizací zvířete jiného než lidského původu, které obsahují některé nebo všechny humánní imunoglobulinové lokusy s IGF-IR antigenem. Ve výhodném provedení je zvíře odlišné od člověka
XENOMOUSE™, což je geneticky upravený myší kmen, který obsahuje velké fragmenty
-21CZ 301712 Bó humánních imunoglobulinových lokusů a přitom je defektní v produkci myších protilátek (viz např. Green et al. Nátuře Genetics 7: 13-21, 1994, a patenty Spojených Států US 5 916 771
US 5 939 598, US 5 985 615, US 5 998 209, US 6 075 181, US 6 091 001, US 6 114 598 a US 6 130 364, a také WO 91/10741, publikovaná 25. července 1991, WO 94/02602, publikovaná 3. února 1994, WO 96/34096 a WO 96/33735, obě publikované 31. října 1996, WO 98/16654, publikovaná 23. dubna 1998, WO 98/24893, publikovaná 11. června 1998, WO 98/50433, publikovaná 12. listopadu 1998, WO 99/45031, publikovaná 10. září 1999, WO 99/53049, publikovaná 21. října 1999, WO 00 09560, publikovaná 24, února 2000 a WO 00/037504, publikovaná 29. Června 2000. Myši XENOMOUSE™ vytvářejí humánní, io dospělému podobný repertoár plně humánních protilátek a generují antigen-specifícké humánní monoklonální protilátky. Druhá generace myší XENOMOUSE™ obsahuje přibližně 80 % repertoáru humánních protilátek, vnesený zárodečnou konfigurací YAC fragmentů megabázové velikosti obsahujících lokusy humánního těžkého řetězce a lokusy lehkého řetězce κ (viz Mendez et al. Nátuře Genetics 15: 146-156, 1997, Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483—495,
1998, které jsou tímto zahrnuty formou odkazu).
Vynález také poskytuje způsob přípravy anti-IGF-IR protilátek ze zvířat kromě Člověka a myši, a sice imunizací transgenních zvířat s výjimkou Člověka, která obsahují humánní imunoglobulinové lokusy. Taková zvířata mohou být připravena využitím metod popsaných výše. Metody popsané v těchto patentech mohou být modifikovány jak bylo popsáno v patentu Spojených Států US 5 994 619. Ve výhodném provedení vynálezu zvířata jiného než lidského původu jsou laboratorní potkani, ovce, prasata, kozy, hovězí dobytek nebo koně.
V dalším provedení vynálezu zvíře jiného než lidského původu obsahující genové lokusy humán25 ního imunoglobulínu je zvíře, které obsahuje „minilokus“ humánního imunoglobulinu. V metodě „minilokusu“ je exogenní lg místo napodobeno tím, že jsou vloženy jednotlivé geny z lg lokusu. Takže jeden nebo více VH genů, jeden nebo více DH genů, jeden nebo více JH genů, konstantní úsek mí (μ) a druhý konstantní úsek (výhodně konstantní úsek gama (γ)) jsou spojeny do jednoho konstruktu pro inzerci do zvířete. Tento přístup je popsán, inter a/ia, v patentech Spojených Států
US 5 545 807, US 5 545 806, US 5 625, 825, US 5 625 126, US 5 633 425, US 5 661 016, US 5 770 429, US 5 789 650, US 5 814 318, US 5 591 669, US 5 612 205, US 5 721 367, US 5 789 215 a US 5 643 763, které jsou tímto zahrnuty formou odkazu.
Výhodou metody „minilokusu“ je rychlost, se kterou lze vytvářet konstrukty obsahující části lg lokusů vnášet je do zvířat. Nicméně, potenciální nevýhodou metody „minilokusu“ je, že někdy není dostatečná diverzita imunoglobulinu, která by podporovala plný vývoj B lymfocytů, takže může být nižší produkce protilátek.
Aby bylo možné produkovat humánní anti-IGF-IR protilátku, zvíře (jiného než lidského původu) obsahující některé nebo všechny lokusy humánního imunoglobulinu je imunizováno IGF-IR antigenem a pak jsou ze zvířete izolovány protilátky nebo buňky produkující protilátky. IGF-IR antigen může být izolovaný a/nebo purifikovaný IGF-IR a je to výhodně humánní IGF-IR.
V dalším provedení IGF-IR antigen je fragment ÍGF-IR, výhodně extracelulámí doména IGF-IR. V dalším provedení IGF-IR antigen je fragment, který obsahuje alespoň jeden epitop
IGF-IR. V dalším provedení IGF-IR antigen je buňka, která exprimuje IGF-IR na svém buněčném povrchu, výhodně buňka, která nadměrně exprimuje IGF-IR na buněčném povrchu.
Imunizace zvířata může být provedena jakýmkoliv způsobem známým v oboru (viz např. Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990). so Metody imunizace zvířat (jiného než lidského původu) jako jsou například myši, laboratorní potkani, ovce, kozy, prasata, hovězí dobytek a koně jsou v oboru dobře známy (viz např. Harlow and Lané, cit. Výše, a patent Spojených Států US 5 994 619). Ve výhodném provedení IGF-IR antigen je podáván s adjuvans stimulujícím imunitní reakci.
-22CZ 301712 B6
Taková adjuvancía zahrnují úplné nebo neúplné Freundovo adjuvans, RIBI (muramyldi peptidy) nebo ISCOM (imunostimulační komplexy). Tato adjuvancia mohou chránit polypeptid před rychlým rozptýleným tím, že ho zadrží v lokálním depositu nebo mohou obsahovat látky, které stimulují hostitele, aby sekretoval faktory, který jsou chemotaktické pro makrofágy a jiné složky imunitního systému. Výhodně, jestliže je podáván polypeptid, imunizační schéma bude zahrnovat dvě nebo více podání polypeptidů v časovém rozpětí několika týdnů.
Příklad 1 poskytuje protokol pro imunizaci myší XENOMOUSE™ humánním IGF-IR plné délky ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty.
io
Produkce protilátek a buněčné linie produkující protilátky
Po imunizaci zvířete IGF-IR antigenem, protilátky a/nebo buňky produkující protilátky mohou být získány ze zvířete. Sérum obsahující anti-IGF-IR protilátku se získá odběrem krve nebo utra(5 cením zvířete. Sérum může být použito tak, jak je získáno ze zvířete, nebo může být ze séra získána imunoglobulinová frakce nebo mohou být ze séra purifikovány anti-IGF-IR protilátky. Sérum nebo imunoglobuliny získané tímto způsobem jsou polyklonální, což je nevýhodné, protože množství protilátek, které mohou být získány, je omezené, a polyklonální protilátka má heterogenní matici vlastností.
V dalším provádění vynálezu jsou připraveny z imunizovaného zvířete imortalizované hybridomy produkující protilátku. Po imunizaci je zvíře utraceno a splenické B lymfocyty jsou fúzovány s imortalizovanými myelomovými buňkami, jak je v oboru známo (viz např. Harlow and Lané, cit. Výše). Ve výhodném provedení myelomové buňky nesekretují imunoglobulinové poly25 peptidy (nesekretující buněčná linie). Po fúzi a selekci antibiotiky jsou screenovány s použitím IGF-IR, jeho části nebo buněk exprimujících IGF-IR. Ve výhodném provedení počáteční sereening je prováděn s použitím ELISA testu nebo radioimunotestu (R1A), výhodně ELISA. Příklad sereeningu pomocí ELISA je poskytnut ve WO 00/37504, v tomto textu zahrnuté formou odkazu.
Vjiném provedení buňky produkující protilátky mohou být připraveny z Člověka, který má autoimunitní nemoc, a který exprimuje anti-IGF-IR protilátky. Buňky exprimující anti-IGF-IR protilátky mohou být izolovány tak, že se izolují bílé krvinky a podrobí se fluorescencí aktivovanému třídění buněk (FACS), nebo tak, že prohledávají destičky potažené IGF-IR nebo jeho částí.
Tyto buňky mohou být fúzovány s humánními nesekretujícími myelomy, čímž se připraví humánní hybridomy exprimující humánní anti-IGF-IR protilátky. Obecně je toto méně výhodné provedení, protože je pravděpodobné, že anti-ÍGF-IR protilátky budou mít nízkou afinitu pro IGF-IR.
Hybridomy produkující protilátky ANTI-IGF-IR jsou selektovány, klonovány a dále podrobeny sereeningu na žádoucí vlastnosti, zahrnující robustní růst hybridomu, vysokou produkci protilátky a požadované vlastnosti protilátky, jak bude diskutováno dále. Hybridomy mohou být pěstovány a množeny in vivo v syngenních zvířatech, ve zvířatech postrádajících imunitní systém, jako jsou např. nahé myši, nebo in vitro ve tkáňových kulturách. Metody selekce, klonování a množení hybrídomů jsou odborníkům dobře známy.
Výhodně je imunizované zvíře jiné zvíře než lidského původu, které exprimuje geny humánního imunoglobulinu, a splenické B lymfocyty byly izolovány z myelomu pocházejícího ze stejného druhu zvířete jiného než lidského původu. Výhodněji, imunizované zvíře je myš
XENOMOUSE™ a myelomová buněčná linie je nesekretující myší myelom, jako je například myelomová buněčná linie NSO-BCL2 (viz např. příklad 1).
V jednom aspektu vynález poskytuje hybridomy, které produkují humánní anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodném provedení jsou hybridomy myší hybridomy, jak bylo popsáno výše. V dal55 ším výhodném provedení hybridomy jsou vytvořeny z biologického druhu jiného než člověk a
-23CZ 301712 B6 jiného než myši, jako například laboratorního potkana, ovce, prasete, kozy, hovězího dobytka nebo koně. V dalším provedení jsou hybridomy humánní hybridomy, ve kterých je humánní nesekretující myelom fúzován s humánními buňkami exprimujícími anti-IGF-IR protilátku.
Nukleové kyseliny, vektory, hostitelské buňky a rekombinantní metody přípravy protilátek Nukleové kyseliny
Molekuly nukleové kyseliny kódující anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu jsou poskytnuty, ίο V jednom provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje těžký a/nebo lehký řetězec anti-IGF-IR imunoglobulinu. Ve výhodném provedení vynálezu jediná molekula nukleové kyseliny kóduje těžký řetězec anti-IGF-IR imunoglobulinu a další molekula nukleové kyseliny kóduje lehký řetězec anti-IGF-IR imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu kódovaný imunoglobulin je humánní imunoglobulin, výhodně humánní IgG. Kódovaný lehký řetězec může být λ řetězec nebo κ řetězec, výhodně je to κ řetězec.
Molekula nukleové kyseliny kódující variabilní úsek lehkého řetězce může pocházet z A30, A27, nebo 012 Vk genu. Ve výhodném provedení vynálezu lehký řetězec pochází zA30 Vk genu. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující lehký řetězec obsahuje spojovací úsek pocházející z Jkl, Jk2 nebo Jk4. V ještě výhodnějším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující lehký řetězec obsahuje ne více než deset aminokyselinových substitucí z A30 Vk genu zárodečné linie, výhodně ne více než šest aminokyselinových substitucí a dokonce výhodněji ne více než tři aminokyselinové substituce.
Vynález poskytuje molekulu nukleové kyseliny, která kóduje variabilní úsek lehkého řetězce (VL) obsahující nejméně tři aminokyselinové substituce ve srovnání se sekvencí zárodečné linie, přičemž aminokyselinové substituce jsou identické s aminokyselinovými substitucemi ze sekvence VL zárodečné linie jedné zprotilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.143, 3.1.1, 4.9.2, 4,173 nebo 6.1.1. Vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2,143,
3.1.1, 4.9.2, 4.173 nebo 6.1.1. Vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více úseků CDR z kteréhokoliv lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.143, 3.1.1, 4.9.2, 4.173 nebo 6.1.1. Ve výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyse35 liny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci všech úseků CDR kteréhokoliv lehkého řetěze z
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.173 nebo 6.1.1. V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvencí jedné ze sekvencí SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22 nebo obsahuje jednu ze sekvencí SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více CDR z kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14,18 nebo 22 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny jednoho nebo více CDR z kterékoliv sekvence ze SEKV. ID. Č. 1,5, 9, 13, 17 nebo 21. Ve výhodnějším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci všech CDR z kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny všech CDR z kterékoliv ze SEKV. ID, Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21.
Vynález také poskytuje molekuly nukleové kyseliny, které kódují aminokyselinové sekvence VL, které mají aminokyselinové sekvence alespoň ze 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99 % identické s VL popsanou výše, konkrétně s VL, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV. ID. Č, 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny, která je alespoň ze 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99 % identická se sekvencí nukleové kyseliny jedné ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21. V dalším provedení vynálezu vynález poskytuje molekulu nukleové kyseliny kódující VL, která hybridizuje za vysoce stríngentních podmínek s molekulou nukleové kyseliny kódující VL, jak byla popsána výše konkrétně
-24CZ 301712 B6 s molekulou nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny kódující VL, který hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s molekulou nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny jedné ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21.
Vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny kódující variabilní úsek těžkého řetězce (VH) pocházející z DP-35, DP-47, DP-71 nebo Vit—4/4,35 VH genu, výhodně DP-35 VH genu.
V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje VH obsahující spoio jovací úsek pocházející z JH6 nebo JH5, výhodněji JH6. V dalším výhodném provedení vynálezu
D segment pochází z 3-3, 6-19 nebo 4-17. V ještě výhodnějším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje VH obsahující ne více než deset aminokyselinových substitucí z DP47 genu zárodečné linie, výhodně ne více než Šest aminokyselinových substitucí a dokonce výhodněji ne více než tri aminokyselinové substituce. Ve vysoce výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje VH obsahující alespoň jednu aminokyselinovou substitucí ve srovnání se sekvencí zárodečné linie, přičemž kde aminokyselinové substituce jsou identické s aminokyselinovými substitucemi sekvence zárodečné linie od těžkého řetězce jedné z protilátek
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. Vještě výhodnějším provedení vynálezu VH obsahuje alespoň tři aminokyselinové substituce ve srovnání se sekvencí zárodečné linie, kde substituce jsou identické se substitucemi ze sekvence VH zárodečné linie jedné z protilátek 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2,4.17.3 nebo 6.1.1.
V jednom provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více CDR těžkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. Ve výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinové sekvence všech CDR těžkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1.
V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny jedné ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více CDR kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny jednoho nebo více CDR kterékoliv ze SEKV. ID, Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23. Ve výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinové sekvence všech CDR kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny všech CDR kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23.
V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje aminokyselinovou sekvenci VH, která je alespoň ze 70, 75, 80, 85,90,95, 96,97,98 nebo 99 % identická s jednou z aminokyselinových sekvencí kódujících VH, jak byly popsány bezprostředně výše, konkrétně s VH, kteiý obsahuje aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24. Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny, která je alespoň ze 70, 75, 80,85,90,95,96, 97, 98 nebo 99 % identická s jednou ze sekvencí nukleových kyselin SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23. V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující VH je molekula, který hybridizuje za vysoce stringentních podmínek se sekvencí nukleové kyseliny kódující VH, jak byí popsán výše, konkrétně VH obsahující aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV.
ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24, Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny kódující VH, který hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s molekulou nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny ze SEKV. ID. C. 3, 7,11,15,19 nebo 23.
-25CZ 301712 Bó
Molekula nukieové kyseliny kódující buď jeden, nebo oba, jak těžký, tak lehký řetězec anti-IGF-IR protilátky nebo jejich variabilní úseky, může být získána z jakéhokoliv zdroje, který vytváří anti-IGF-IR protilátky. Metody izolace mRNA kódující protilátky jsou v oboru známy (viz např. Sambrook et al.). mRNA mohou být použity pro přípravu cDNA pro další použití v polymerázové řetězové reakci (PCR) nebo cDNA klonování proti látkových genů. V jednom provedení vynálezu, molekuly nukieové kyseliny mohou být získány zhybridomu, který exprimuje anti-IGF-IR protilátku, jak bylo popsáno výše, výhodně hybridomu, který má jako jeden zfúzních partnerů buňku transgenního zvířete jiného než člověka, jako je například XENOMOUSE™, která exprimuje humánní imunoglobulinové geny, nebo zvířete jiného než io člověka, např. myši, nebo zvířete jiného než člověka a jiného než myš. V dalším provedení vynálezu hybridom pochází ze zvířete, které není lidského původu, a není transgenní, a které může být použito např. pro humanizované protilátky.
Molekula nukieové kyseliny kódující celý těžký řetězec z anti-IGF-IR protilátky může být konstruována fúzováním molekuly nukieové kyseliny kódující variabilní doménu těžkého řetězce nebo její antigen-vazebnou doménu s konstantní doménou těžkého řetězce. Podobně, molekula nukieové kyseliny kódující lehký řetězec z anti-IGF-IR protilátky může být konstruována fúzováním molekuly nukieové kyseliny kódující variabilní doménu lehkého řetězce nebo její antigen-vazebnou doménu s konstantní doménou lehkého řetězce. Molekuly nukieové kyseliny kódující VH a VL řetězec mohou být přeměněny na geny kompletních protilátek tím, že se vloží do expresního vektoru, který již kóduje konstantní úseky těžkého řetězce a lehkého řetězce, v daném pořadí, a to tak, že VH segment je operativně spojen se segmentem nebo segmenty konstantního úseku těžkého řetězce (CH) ve vektoru a VL segment je operativně spojen se segmentem nebo segmenty konstantního úseku lehkého řetězce (CL) ve vektoru. Alternativně, molekuly nukieové kyseliny kódující VH nebo VL řetězce jsou změněny na geny kompletní protilátky spojením, např. lígací, molekuly nukieové kyseliny kódující VH řetězec s molekulou nukieové kyseliny kódující CH řetězec s použitím standardních metod molekulární biologie. Stejného výsledku může být dosazeno s použitím molekuly nukieové kyseliny kódující VL a CL řetězce. Sekvence konstantních úseků humánního těžkého a lehkého řetězce jsou v oboru dobře známy (viz např. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5°1 ed. NIH Publ. 91-3242, 1991). Molekuly nukieové kyseliny kódující kompletní těžký a/nebo lehký řetězec mohou pak být exprimovány v buňce, do které byly vloženy, a pak izolovány anti-IGF-IR protilátky.
Ve výhodném provedení vynálezu nukleová kyselina kódující variabilní úsek těžkého řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č, 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 a molekula nukieové kyseliny kódující variabilní úsek lehkého řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. Sekvence SEKV. ID. Č. 28 ukazuje aminokyselinovou sekvenci a SEKV. ID. Č. 27 ukazuje sekvenci nukieové kyseliny kódující konstantní úsek těžkého řetězce zanti-IGF-IR protilátky 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 a 6.1.1. SEKV. ID. Č. 26 ukazuje aminokyselinovou sekvenci a SEKV. ID. Č. 25 ukazuje sekvenci nukieové kyseliny kódující konstantní úsek lehkého řetězce zanti-IGF-IR protilátky 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 a 6.1.1. Ve výhodném provedení vynálezu molekula nukieové kyseliny kódující konstantní doménu těžkého řetězce kóduje SEKV. ID. Č. 28 a molekula nukieové kyseliny kódující konstantní doménu lehkého řetězce kóduje SEKV. ID. Č. 26. Ve výhodnějším provedení vynálezu molekula nukieové kyseliny kódující konstantní doménu těžkého řetězce má sekvenci nukieové kyseliny SEKV. ID. Č. 27 a molekula nukieové kyseliny kódující konstantní doménu má sekvenci nukieové kyseliny SEKV. ID. Č. 25.
so V dalším provedení vynálezu molekula nukieové kyseliny kódující buďto těžký řetězec z antiÍGF-IR protilátky nebo její antigen-vazebnou doménu, nebo lehký řetězec zanti-IGF-IR protilátky nebo jeho antigen-vazebnou doménu, může být izolována ze zvířete jiného než člověk a jiného než myš, které exprimuje humánní imunoglobulinové geny a bylo imunizováno IGF-IR antigenem. V jiném provedení vynálezu molekula nukieové kyseliny může být izolována z buněk produkujících anti-IGF-IR protilátky, kde buňky pocházejí z netransgenního zvířete nebo
-26CZ 301712 B6 z humánního pacienta, který vytváří anti-IGF-IR protilátky. Metody izolace mRNA z buněk produkujících anti-IGF-IR protilátky jsou známy: RNA je z buněk izolována standardními technikami, klonována a/nebo amplifikována s použitím PCR a knihovna je konstruována a pak screenována s použitím standardních postupů, čímž se získají molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a lehký řetězec anti-IGF-IR.
Molekuly nukleové kyseliny mohou být použity pro rekombinantní expresi velkého množství anti-IGF-IR protilátky, jak bude popsáno níže. Molekuly nukleové kyseliny mohou také být použity pro vytvoření chimérických protilátek, jednořetězcových protilátek, imunoadhesinů, „diabodies“, mutovaných protilátek a protilátkových derivátů, jak bude ještě popsáno níže. Jestliže molekuly nukleové kyseliny nepocházejí z člověka ani z transgenního zvířete, molekuly nukleové kyseliny mohou být použity pro humanizaci protilátky, jak bude popsáno níže.
V dalším provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být použity jako sondy nebo PCR primery pro specifické protilátkové sekvence. Například molekula nukleové kyseliny jakožto sonda může být použita v diagnostických metodách nebo molekula nukleové kyseliny jakožto PCR primer může být použita k amplifikování úseku DNA, ktetý může být použit, inter alia, k izolaci sekvence nukleové kyseliny pro použití při produkcí variabilních domén anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodném provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny jsou oligonukleotídy. Ve výhodnějším provedení vynálezu oligonukleotídy jsou z vysoce variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce požadované protilátky. Vještě výhodnějším provedení vynálezu oligonukleotídy kódují celý nebo část jednoho nebo více CDR.
Vektory
Vynález poskytuje vektory obsahující molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část. Vynález také poskytuje vektory obsahující molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, která kóduje lehký řetězec nebo jeho antigenvazebnou část. Vynález také poskytuje vektory obsahující molekuly nukleové kyseliny kódující fuzní proteiny, modifikované protilátky, protilátkové fragmenty a sondy.
Pro expresi protilátek nebo částí protilátek podle vynálezu, DNA kódující část nebo kompletní lehký a těžký řetězec, získané způsobem popsaným výše, mohou být vloženy do expresního vektoru, takže geny jsou operativně spojeny s transkripčními a translačními kontrolními sekven35 cemi. Expresní vektory zahrnují plazmidy, retroviry, kozmidy, YAC, episomy odvozené z EBV apod. Protilátkový gen je ligován do vektoru tak, že transkripční a translační kontrolní sekvence ve vektoru slouží zamýšlené funkci a řídí transkripci a translaci protilátkového genu. Expresní vektor a expresní kontrolní sekvence jsou zvoleny tak, aby byly kompatibilní s použitými expresními hostitelskými buňkami. Gen pro lehký řetězec protilátky a gen pro těžký řetězec protilátky mohou být vloženy do oddělených vektorů. Ve výhodném provedení vynálezu jsou oba geny vloženy do stejného expresního vektoru. Protilátkové geny se vloží do expresního vektoru standardními metodami (jako je např. ligace komplementárních restrikčních míst na fragmentu protilátkového genu a vektoru nebo ligace tupých konců, jestliže žádná restrikční místa nejsou přítomna), které jsou odborníkům známy.
Vhodným vektorem je vektor, který kóduje funkčně kompletní humánní CH nebo CL iminoglobulinové sekvence, s vhodnými restrikčními místy, která jsou vložena metodami genového inženýrství tak, že jakákoliv VH nebo VL sekvence může být do vektoru snadno vložena a exotímována, jak bylo popsáno výše. V takovém vektoru sestřih obvykle nastává mezi donorovým sestřihovým místem vloženým do J úseku a akceptorovým sestřihovým místem předcházejícím humánní C úsek, a také v sestřihových úsecích, které se vyskytují v humánních CH exonech. Polyadenylace a terminace transkripce nastávají v nativních chromozómových místech po směru („downstream“) od kódujícího úseku. Rekombinantní expresní vektor může také kódovat signální peptid, který usnadní sekreci protilátky z hostitelské buňky. Gen pro protilátkový řetězec může být klonován do vektoru tak, že signální peptid je spojen ve shodném čtecím rámci s amino-27CZ 301712 B6 koncem proti látkového řetězce. Signální peptid může být imunoglobulinový signální peptid nebo heterologní signální peptid (tj. signální peptid z jiného proteinu než je imunoglobulin).
Kromě genů pro proti látkové řetězce nesou rekombinantní expresní vektory podle vynálezu regulační sekvence, které řídí expresi genů pro proti látkové řetězce v hostitelské buňce. Odborník si je vědom toho, že konstrukce expresního vektoru, včetně výběru regulační sekvence, závisí na různých faktorech, jako je např. volba hostitelské buňky, která má být transformovaná, hladina exprese proteinu, která má být dosažena apod. Výhodné regulační sekvence pro expresi v savčí hostitelské buňce zahrnují virové elementy, které řídí vysoké hladiny proteinové exprese v sav10 čích buňkách, jako jsou například promotory a/nebo enhancery pocházející z retrovírových LTR, cytomegaloviru (CMV) (jako například promotor CMV), opičího viru 40 (SV40) (jako například promotor SV40), adenoviru (např. adenovirový hlavní pozdní promotor (ADMLP)), polyoma a silné savčí promotory jako například nativní promotory imunoglobulinového aaktinového genu, Pro další popis virových regulačních prvků a sekvencí viz např. patent Spojených Států US 5 is 168 062, Stinski, patent Spojených Států US 4 510 245, Bell et al., a patent Spojených Států US 4
968 615, Schaffner et al.
Kromě genů pro protinádorové řetězce a regulačních sekvencí může rekombinantní expresní vektor podle vynálezu nést další sekvence, jako například sekvence, které regulují replikaci vektoru v hostitelských buňkách (např, počátek replikace), a dále geny selekčních markérů. Geny selekčních markérů umožňují selekci hostitelských buněk, do kterých byl vnesen vektor (viz např. patenty Spojených Států US 4 399 216, US 4 634 665 a US 5 179 017, Axel et al.). Například typicky gen selekčního markéru uděluje rezistenci k léčivu, jako například G418, hydromycinu nebo methotrexatu, hostitelské buňce, do které byl příslušný vektor vnesen. Výhodné markerové geny zahrnují gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) (pro použití vdhťr“ hostitelských buňkách s methotrexatovou selekcí/amplifikací a gen neo (pro selekce G418). Nehybridomové hostitelské buňky a metody rekombinantní produkce proteinů
Molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část a/nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část z anti-IGF-IR protilátky a vektory obsahující tyto molekuly nukleové kyseliny mohou být použity pro transformaci vhodné savčí hostitelské buňky. Transformace může být provedena kterýmkoliv známým způsobem pro vnášení polynukleotidů do hostitelské buňky. Metody vnesení heterologního polynukleotidu do savčích buněk jsou v oboru dobře známy a zahrnují metody jako je např. dextranem zprostředkovaná transfekce, precipitace s fosfátem vápenatým, polybrenem zprostředkovaná transfekce, fuze protoplastů, elektroporace, zabaleni polynukleotid(ů) do lipozomu, biolistická injekce a přímá mikroinjekce DNA do jádra. Kromě toho, molekuly nukleové kyseliny mohou být vneseny do savčích buněk prostřednictvím virových vektorů. Metody transformace buněk jsou v oboru dobře známy, viz např. patenty Spojených Států US 4 399 216, US 4 912 040, US 4 740 461 a US 4 959 455 (které jsou tímto zahrnuty formou odkazu).
Savčí buněčné linie dostupné jakožto hostitelé pro expresi jsou v oboru dobře známy a patří k nim mnohé imortalizované buněčné linie z Americké sbírky mikroorganizmů ATCC (American
Type Culture Collection). Patří sem, inter alia, buňky vaječníků čínského křečka (CHO), NSO, SP2 buňky, HeLa buňky, ledvinné buňky mláďat křečků (BHK), opičí ledvínné buňky (COS) buňky humánního hepatocel ulam ího karcinomu (např. Hep G2), A549 buňky, 3T3 buňky a rada dalších buněčných linií. Savčí hostitelské buňky zahrnují humánní a myší buňky, a dále buňky laboratorního potkana, psa, opice, prasete, kozy, hovězího dobytka, koní a křečků.Výhodné buněčné linie se vyberou tak, že se určí, které buněčné linie mají vysoké hladiny exprese. Další buněčné linie, které mohou být použity, jsou hmyzí buněčné linie, jako například Sf9 buňky, buňky obojživelníků, bakteriální buňky, rostlinné buňky a houbové buňky. Když rekombinantní expresní vektory kódující těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část, lehký řetězec a/nebo jeho antigen-vazebnou Část jsou vneseny do savčích hostitelských buněk, protilátky jsou vytvořeny kultivací hostitelských buněk po období dostatečné pro expresi protilátky v hostitels-28CZ 301712 B6 kých buňkách nebo, výhodněji, pro sekreci protilátky do kultivačního média, ve kterém jsou hostitelské buňky pěstovány. Protilátky mohou být získány z kultivačního média užitím standardních metod purifikace proteinů.
Dále, exprese protilátky podle vynálezu (nebo jejích částí) z produkční buněčné linie může být zesílena s použitím řady známých technik. Například expresní systém glutaminsyntetázového genu (GS systém) je běžný způsob pro zesílení exprese za určitých podmínek. GS systém je diskutován jako celek nebo část v evropských patentech EP 0 216 846, EP 0 256 055 a EP 0 323 997 a evropské patentové přihlášce č. 89303964.4.
io
Je pravděpodobné, že protilátky exprimované v různých buněčných liniích nebo v transgenních zvířatech budou mít vzájemně odlišnou glykosylaci. Nicméně, všechny protilátky kódované molekulami nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nebo obsahující aminokyselinové sekvence podle předkládaného vynálezu spadají do rozsahu předkládaného vynálezu bez ohledu na glykosylaci protilátek.
Transgenní zvířata
Vynález také poskytuje transgenní zvířata s výjimkou člověka obsahující jednu nebo více molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, kterých lze využít k produkci protilátek podle vynálezu. Protilátky mohou být produkovány a získávány z tkáně nebo tělesné tekutiny, jako je například mléko, krev nebo moě, zvířat jako jsou kozy, krávy, koně, prasata, laboratorní potkani, myši, králíci, křečci nebo jiní savci. Viz např. patenty Spojených Států US 5 827 690, US 5 756 687, US 5 750 172 a US 5 741 957. Jak bylo popsáno výše, transgenní zvířata jiného než lidského původu, která obsahují humánní imunoglobulinové lokusy, mohou být vytvořena imunizací IGF-IR nebo jeho částí.
V dalším provedení vynálezu transgenní zvířata jiného než lidského původu jsou vytvořena tak, že se jedna nebo více molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vnese do zvířete standardními transgenními technikami. Viz např. Hogana, cit. výše. Transgenní buňky použití pro přípravu transgenního zvířete mohou být embryonální kmenové buňky nebo somatické buňky. Transgenní organismy jiného než lidského původu mohou být chimérické, nechimérické heterozygoty a nechimérické homozygoty. Viz např. Hogan et al., Manipulationg the Mouše Embryo: A Laboratory Manual 2ed.s Cold Spring Harbor Press, 1999, Jackson et al., Mouše Genetics and
Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000, and Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academie Press, 1999. V dalším provedení vynálezu transgenní organismy jiného než lidského původu mohou mít cílené přerušení a nahrazení, které kóduje požadovaný těžký řetězec a/nebo lehký řetězec. Ve výhodném provedení vynálezu transgenní zvířata obsahují a exprimují molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a lehký řetězec, které se vážou specificky k IGF-IR, výhodně humánnímu IGF-IR. V dalším provedení vynálezu transgenní zvířata obsahují molekuly nukleové kyseliny kódující modifikované protilátky jako je například jednoretězcová protilátka, chimérická protilátka nebo humanizovaná protilátka. anti-IGF-IR protilátky mohou být produkovány ve kterémkoliv transgenním zvířeti. Ve výhodném provedení vynálezu zvířata jiného než lidského původu jsou myši, laboratorní potkani, ovce, prasata, kozy, hovězí dobytek nebo koně. Transgenní zvíře jiného než lidského původu exprimuje kódované polypeptidy v krvi, mléku, moči, slinách, slzách, hlenu či jiných tělesných tekutinách.
Fágové displejové knihovny
Vynález poskytuje způsob přípravy anti-IGF-IR protilátky nebo jejich antígen-vazebných částí zahrnujících kroky syntézy knihovny humánních protilátek ve fágu, sereening knihovny pomocí
IGF-IR nebo jeho části, izolace fágu, kteiý váže IGF-IR a získání protilátky z fága. Jeden způsob přípravy knihovny protilátek obsahuje kroky imunizace hostitelského zvířete jiného než lidského původu obsahujícího humánní imunoglobulinový lokus s IGF-IR nebo jeho antigenní částí, aby
-29CZ 301712 B6 se vyvolala imunitní reakce, extrakce buněk z hostitelského zvířete, které jsou zodpovědné za produkci protilátek, izolace RNA z extrahovaných buněk, reverzní transkripce RNA za vzniku cDNA, amplifikace cDNA s použitím přiměni a inzerce cDNA do fágového displejového vektoru, aby byly protilátky exprimovány na fágu. Rekombinantní anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou být získány právě tímto způsobem.
Rekombinantní anti-IGF-IR humánní protilátky podle vynálezu navíc k anti-IGF-IR protilátkám popsaným v tomto textu mohou být izolovány pomocí screeningu rekombinantní kombinační protilátkové knihovny, výhodně scFv fágové displejové knihovny, připravené s použitím humánní VL a VH cDNA získané z mRNA pocházející z humánních lymfocytů. Metody pro přípravu a screening takové knihovny jsou v oboru známy. Také jsou komerčně dostupné soupravy pro přípravu fágové displejové knihovny (např. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalog č. 27-9400-01, a Stratagene SurfZAPTM phage display kit, katalog č. 240612). Existují také jiné metody a činidla, která mohou být použita pro přípravu a screening protilátkové displejové knihovny (viz např. Ladner et al. patent Spojených Států US 5 223 409, Kang et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/18619, Dower et al., publikovaná PCT přihláška WO 91/17271, Winter et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/20791, Markland et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/15679, Breitling et ak, publikovaná PCT přihláška WO 93/01288, McCafferty et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/01047, Garrard et ak, publikovaná PCT přihláška WO 92/09690, Fuchs et ak, 1991, Bio/Technology 9: 1370-1372, Hay et ak, 1992, Hum. Antibod, Hybridomas 3: 81-85, Huse et ak, 1989, Science 246: 1275-1281, McCafferty et ak, Nature, 1990, 348: 552-554, Griffiths et ak, 1993, EMBO J 12: 725-734, Hawkins et ak, 1992, J, Mok Biol. 226: 889-896, Clackson et ak, 1991, Nature 352: 624-628, Gram et ak, 1992, Proč. Natk Acad. Sci. USA 89: 3576-3580, Garrad et ak, 1991,
Bio/Technology 9: 1373-1377, Hoogenboom et ak, 1991, Nuc Acid Res 19: 4133-4137, and Barbas et ak, 1991, Proč. Natk Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.
Ve výhodném provedení vynálezu pro izolaci humánní anti-IGF-IR protilátky s požadovanými vlastnostmi, humánní anti-IGF-IR protilátka, jak byla popsána v tomto textu, je nejdříve užita pro výběr sekvence humánního těžkého a lehkého řetězce, které mají podobnou vazebnou aktivitu k IGF-IR, s použitím metody epitopového imprintingu, jak byla popsána v Hoogenboom et ak, PCT publikace č. WO 93/06213. Protilátkové knihovny použité při tomto způsobu jsou výhodně scFv knihovny připravené a screenované, jak bylo popsáno v McCafferty et ak, PCT publikace č. WO 92/01047, McCafferty et ak, Nature, 1990, 348: 552-554 a Griffiths et ak,
1993, EMBO J 12: 725-734, ScFv protilátkové knihovny jsou výhodně screenovány s použitím humánního IGF-IR jako antigenu.
Jakmile jsou výchozí humánní VL a VH segmenty vybrány, provedou se experimenty „mix and match“, ve kterých jsou různé páry na začátku vybraných VL a VH segmentů podrobeny screeningu na IGF-IR vazbu, aby se vybraly výhodné kombinace párů VL/VH. A navíc pro další zlepšení kvality protilátky, VL a VH segmenty výhodných párů VL/VH mohou být náhodně mutovány, výhodně v úseku CDR3 VH a/nebo VL, a sice postupem, který je analogický in vivo somatickému mutačnímu postupu zodpovědnému za afinitní zrání protilátek během přirozené imunitní reakce. Toto afinitní zrání in vitro může být uskutečněno tím, že se amplifíkují VH a VL úseky s použitím PCR primerů komplementárních k VH CDR3 nebo VL CDR3, v daném pořadí, přičemž tyto primery byly „zaostřeny“ náhodnou směsí čtyř nukleotidových bází v určité poloze, takže výsledné PCR produkty kódují VH a VL segmenty, do kterých byly zavedeny náhodné mutace do úseků VH a/nebo VL CDR3. Tyto náhodně mutované VH a VL segmenty mohou být testovány screeningem na vazbu k IGF-IR.
Následně po screeningu a izolaci anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu z rekombinantní imunoglobulinové displejové knihovny, může být získána nukleová kyselina kódující vybranou protilátku z displejového balíčku (např. z fágového genomu) a subklonována do jiného expresního vektoru standardními rekombinantními DNA technikami. Je-li to třeba, nukleová kyselina může být dále upravena, aby se vytvořila jiná protilátková forma podle vynálezu, jak bude popsáno
-30CZ 301712 B6 níže. Pro expresi rekombinantní humánní protilátky izolované screeningem kombinační knihovny je DNA kódující protilátku klonována rekombinantního expresního vektoru a vnesena do savčího hostitelské buňky, jak bylo popsáno výše.
Přesmyk tříd
Další aspekte předkládaného vynálezu poskytuje mechanismus, kterým je jedna třída anti-IGFIR protilátky může být presmyknuta (změněna) na jiný. Podle jednoho aspektu vynálezu se molekula nukleové kyseliny kódující VL nebo VH izoluje metodami známými v oboru tak, že io neobsahuje žádné sekvence nukleové kyseliny kódující CL nebo CH. Molekula nukleové kyseliny kódující VL nebo VH je pak operativně spojena se sekvencí nukleové kyseliny kódující
CL nebo CH z odlišné třídy imunoglobulinových molekul.Toho může být dosaženo použitím vektoru nebo molekuly nukleové kyseliny obsahující CL nebo CH řetězec, jak byl popsán výše. Například anti-IGF-IR protilátka, která byla původně IgM může být přesmyknuta na třídu IgG.
Dále přesmyk tříd může být využit k přestavbě jedné IgG podtřídy na jinou, např. IgGl na IgG21. Výhodný způsob přípravy protilátky podle vynálezu obsahující požadované izotypy obsahuje kroky izolace nukleové kyseliny kódující těžký řetězec anti-IGF-lR protilátky a nukleové kyseliny kódující lehký řetězec anti-IGF-IR protilátky, získání variabilního úseku těžkého řetězce, ligace variabilního úseku těžkého řetězce s konstantní doménou těžkého řetězce požadovaného izotypu, exprese lehkého řetězce a ligovaného těžkého řetězce v buňce a odběr anti-IGF-IR protilátky požadovaného izotypu.
Deriváty protilátek
Molekuly nukleové kyseliny popsané výše mohou být použity k přípravě derivátů protilátek s použitím technik a metod, které jsou odborníkům známé.
Humanizované protilátky
Jak bylo již popsáno výše v souvislosti s generováním humánních protilátek, je výhodné produkovat protilátky s redukovanou imunogenicitou. To lze uskutečnit v určitém rozsahu s použitím techniky humanizace a displejové techniky s využitím vhodných knihoven. Odborníkům je známo, že myší protilátky nebo protilátky z jiného biologického druhu mohou být humanizovány nebo primatizovány technikami, které jsou v oboru dobře známy (viz např. Winter and Harris immunol Today 14: 43-46, 1993, a Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125168, 1992). Požadovaná protilátka může být geneticky upravena technikami rekombinantní DNA tak, že se nahradí CH1, CH2, CH3 kloubové domény, a/nebo rámcové domény odpovídajícími humánními sekvencemi (viz WO 92/02190 a patenty Spojených Států US 5 530 101, US 5 585 089, US 5 693 761, US 5 693 792, US 5 714 350 a US 5 777 085). Ve výhodném provedení vynálezu anti40 IGF-IR protilátka může být humanizována tím, že se substituují CH1, CH2, CH3, kloubové domény a/nebo rámcová doména odpovídající humánní sekvencí, zatímco se ponechají všechny CDR těžkého řetězce, lehkého řetězce nebo jak těžkého, tak i lehkého řetězce.
Mutované protilátky
V dalším provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny, vektory a hostitelské buňky mohou být použity pro přípravu mutovaných anti-IGF-IR protilátek. Protilátky mohou být mutovány ve variabilních doménách těžkého a/nebo lehkého řetězce, aby se změnily vazebné vlastnosti protilátky. Například mutace může být vytvořena v jednom nebo více CDR úsecích pro zvýšení nebo snížení hodnoty protilátky pro IGF-IR, pro zvýšení nebo snížení KOfr nebo kvůli změně vazebné specifičnosti protilátky. Techniky místně cílené mutageneze jsou v oboru dobře známy (viz např. Sambrook et al. a Ausubel et al., cit. Výše). Ve výhodném provedení vynálezu jsou mutace vytvořeny v aminokyselinovém zbytku, o kterém je známo, že je ve variabilním úseku odlišný ve srovnání se zárodečnou linií anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodnějším provedení vynálezu jedna nebo více mutací je vytvořeno v aminokyselinovém zbytku, o kterém je známo,
-31 CZ 301712 B6 že byl ve srovnání s variabilním úsekem zárodečné linie nebo CDR úsekem změněn u anti-IGF-IR protilátky 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V jiném provedení vynálezu je jedna nebo více mutací vytvořeno v aminokyselinovém zbytku, o kterém je známo, že byl změněn ve srovnání s variabilním úsekem zárodečné linie nebo CDR úsekem jejichž sekvence jsou uvedeny jako aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12,
14, 16, 18, 20, 22 nebo 24 nebo jejichž sekvence nukleových kyselin jsou uvedeny jako SEKV.
ID. Č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 nebo 23. V dalším provedení vynálezu jsou molekuly nukleové kyseliny mutovány v jednom nebo více rámcových úsecích. Mutace mohou být vytvořeny v rámcovém úseku nebo konstrukční doméně pro zvýšení poločasu anti-IGF-IR io protilátky (viz např. WO 00/09560, publikované 24. února 2000, zahrnuta formou odkazu).
V jednom provedení vynálezu zde může být jedna, tři nebo pět bodových mutací, ale ne více než deset bodových mutací. Mutace v rámcovém úseku nebo konstantní doméně může také být vytvořena, aby se změnila imunogenicita protilátky, poskytlo místo pro kovalentní nebo nekovalentní vazbu k další molekule nebo změnily takové vlastnosti jako je např, fixace komplementu.
Mutace mohou být vytvořeny v každém z rámcového úseku, konstantní domény a variabilních úseků, v jediné mutované protilátce. Alternativně mutace mohou být vytvořeny pouze v jednom z rámcového úseku, variabilních úseků nebo konstantní domény v jediné mutované protilátce.
V jednom provedení není více než deset aminokyselinových substitucí buďto ve VH, nebo VL úseku mutované anti-IGF-IR protilátka ve srovnání s anti-IGF-IR protilátkou před mutací. Ve výhodnějším provedení vynálezu existuje ne více než pět aminokyselinových substitucí buďto ve VH, nebo VL úseku mutované anti-IGF-IR protilátky, ještě výhodněji ne více než tři aminokyselinové substituce. V dalším provedení vynálezu je ne více než patnáct aminokyselinových substitucí v konstantních doménách, výhodněji, ne více než deset aminokyselinových substitucí, dokonce ještě výhodněji ne více než pět aminokyselinových substitucí.
Modifikované protilátky
V dalším provedení vynálezu mohou být vytvořeny fúzní protilátky nebo imunoadhesiny, které obsahují celou nebo část anti-IGF-IR protilátky spojenou s dalším polypeptidem. Ve výhodném provedení vynálezu jsou s polypeptidem spojeny pouze variabilní úseky anti-IGF-IR protilátky.
V dalším výhodném provedení vynálezu VH doména anti-IGF-IR protilátky je spojena s prvním polypeptidem, zatímco VL doména anti-IGF-IR protilátky je spojena s druhým polypeptidem, který asociuje s prvním polypeptidem takovým způsobem, že VH a VL domény mohou interagovat a tím vytvořit protilátkové vazebné místo. V dalším výhodném provedení vynálezu VH doména je oddělena od VL domény spojovací sekvencí (linkerovou sekvencí, linkerem), takže VH a VL domény mohou vzájemně interagovat (viz kapitola jednořetězcové protilátky). Protilátka „VH-linker-VL“ je pak spojena s požadovaným polypeptidem. Fúzní protilátka je užitečná pro cílení polypeptidu do IGF-IR-exprimující buňky nebo tkáně, Polypeptid může být terapeutické agens, jako je například toxin, růstový faktor nebo jiný regulační protein, nebo to může být snadno zviditelněn, jako například křenová peroxidáza. Kromě toho mohou být vytvořeny fúzní protilátky, ve kterých dvě (nebo více) jednořetězcové protilátky spojeny k sobě. To je užitečné, jestliže je třeba vytvořit dvojmocné nebo polyvalentní protilátky s jednoduchým polypeptidovým řetězcem nebo jestliže je třeba vytvořit bispecifickou protilátku.
Pro vytvoření jednořetězcové protilátky (scFv) jsou VH a VL-kódující DNA fragmenty operativně spojeny s dalším fragmentem kódujícím flexibilní spojovací sekvenci (linker), např. kódujícím aminokyselinovou sekvencí (Gly4-Ser)3 (SEKV. ID. Č. 60), takže VH a VL sekvence mohou být exprimovány jako souvislý jednořetězcový protein, s VL a VH úseky spojenými so flexibilním linkerem (viz např. Bird et ak, 1988, Science 242: 423-426, Huston et ak, 1988, Proč.
Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, McCafferty et ak, Nátuře, 1990, 348: 552-554). Jednořetězcová protilátka může být jednomocná, jestliže je použito pouze po jednom VH a VL, dvojmocná, jestliže jsou použity dva VH a VL, nebo polyvalentní, jestliže jsou použity více než dva VHaVL.
-32CZ 301712 B6
V dalším provedení vynálezu mohou být připraveny jiné modifikované protilátky s použitím anti-IGF-IR-kódující molekuly nukleové kyseliny. Například tzv. „Kappa-bodies“ (111 et ak, Protein Eng 10: 949-57, 1997), „Minibodies“ (Martin et al., EMBO J 13: 53039, 1994), „diabodies“ (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448, 1993) nebo Janusiny“ (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659, 1991, a Traunecker et al. „Janusin: new molecular design for bispecifíc reagents“ Int J Cancer Suppl 7: 51-52, 1991) mohou být připraveny s použitím standardních technik molekulární biologie na základě předloženého popisu vynálezu.
Podle dalšího aspektu vynálezu mohou být tvořeny chimérické a bispecifické protilátky. Může io být vytvořena chimérická protilátka, která obsahuje CDR a rámcové úseky z různých protilátek.
Ve výhodném provedení vynálezu CDR chimérické protilátky obsahuje všechny CDR variabilního úseku lehkého řetězce nebo těžkého řetězce z anti-IGF-IR protilátky, zatímco rámcové úseky jsou odvozeny z jedné nebo více různých protilátek. Ve výhodnějším provedení vynálezu CDR chimérické protilátky obsahuje všechny z CDR variabilních úseků lehkého řetězce a těžkého řetězce anti-IGF-IR protilátky. Rámcové úseky mohou být z jiného druhu (biologického) a mohou být, ve výhodném provedení vynálezu, humanizovány. Alternativně rámcové úseky mohou být z jiné humánní protilátky.
Může být také vytvořena bispecifická protilátka, která se váže specificky k IGF-IR prostřednic20 tvím jedné vazebné domény a k druhé molekule prostřednictvím druhé vazebné domény. Bispecifická protilátka může být vytvořena rekombinantními technikami molekulární biologie nebo může být vytvořena vzájemným fyzickým spojením. Kromě toho může být vytvořena jednořetězcová protilátka obsahující víc než jeden úsek VH a VL, která se váže specificky k IGF-IR a k další molekule. Takové bispecifické protilátky mohou být tvořeny s využitím technik, které jsou odborníkům dobře známy, například v spojení s (i) a (ii) viz např. Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81, 1994, a Wright a Harris, výše, a ve spojení s (iii) viz např. Traunecker et a.l. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52, 1992. Ve výhodném provedení vynálezu se bispecifická protilátka váže k IGF-IR a k další molekule, která je exprimována ve vysoké hladině na karcinomových nebo nádorových buňkách. Ve výhodnějším provedení vynálezu je další molekula erbB2 receptor, VEGF, CD20 nebo EGF-R.
V provedení vynálezu jsou modifikované protilátky popisované výše připraveny s použitím jednoho nebo více variabilních úseků nebo jednoho nebo více CDR úseků z jedné zprotilátek vybrané z 2.12.1, 2.13,2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším provedení vynálezu jsou připraveny modifikované protilátky použitím jednoho nebo více variabilních úseků nebo jednoho nebo více CDR úseků, jejichž aminokyselinové sekvence jsou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24 nebo jejichž sekvence nukleové kyseliny je uvedena jako SEKV. ID. Č. 1, 3, 5, 7,9,11,13,15,17,19,21 nebo 23.
Derivatizované a značené protilátky
Protilátka nebo část protilátky podle vynálezu mohou být derivatizovány nebo spojeny s další molekulou (např. dalším peptidem nebo proteinem). Obecně platí, že protilátky nebo jejich části jsou derivatizovány tak, že vazba IGF-IR není nepříznivě ovlivněna derivatizací nebo značením.
Tudíž protilátky a Části protilátky podle vynálezu zahrnují jak intaktní, tak i modifikované formy humánní anti-IGF-IR protilátky popsané v tomto textu. Například protilátka nebo část protilátky podle vynálezu může být funkčně spojena (tím, že chemicky kondenzována, geneticky fúzována, nekovalentně asociována nebo jinak napojena) sjednou nebo více dalšími molekulárními entitami, jako je například další protilátka (např. bispecifická protilátka nebo „diabody“), detekč50 ní agens, cytotoxické agens, farmaceutické agens, a/nebo protein nebo peptid který, může zprostředkovat asociaci protilátky nebo části protilátky s další molekulou (jako je například streptavidinový jádrový úsek nebo polyhistidinový „tag“ („značka“)).
Jeden typ derivatizované protilátky je vytvořen zesítěním dvou nebo více protilátek (stejného typu nebo různých typů, např. pro vytvoření bispecifické protilátky). Vhodná zesíťující činidla
-33CZ 301712 B6 zahrnují taková, která jsou heterobifunkční, mají dvě odlišné reaktivní skupiny oddělené vhodným spacerem (např. m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimid) nebo homobifunkční (např. disukcinimidyl suberát). Takové linkery jsou dostupné např. od firmy Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Další typ derivatizované protilátky je značená protilátka. Použitelná detekční činidla, kterými protilátka nebo část protilátky podle vynálezu může být derivatizována, zahrnují fluorescenční sloučeniny, včetně fluoresceinu, isothiokyanátu fluoresceinu, rhodaminu, 5-dimethylamin-lnaftalenesulfonylchloridu, fykoerytrinu, lanthanidových fosforů apod. Protilátka může také být značena enzymy, které jsou použitelné pro detekci, jako například křenová peroxídáza, β-galaktosidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza, glukózaoxidáza apod. Když je protilátka značena detekovatelným enzymem, je detekována po přidání dalších činidel, která enzym použije za vzniku reakčního produktu, který může být snadno rozpoznán. Například když je jako agens přítomna křenová peroxídáza, přidání peroxidu vodíku a diaminobenzídinu vede k barevnému is reakčnímu produktu, který je detekovatelný. Protilátka může také být značena biotinem a detekována prostřednictvím nepřímého měření vazby avidinu nebo streptavidinu. Protilátka může být také značena magnetickým agens, jako je například gadoliníum. Protilátka může také být značena s předurčenými polypeptidovými epitopy, rozpoznanými sekundárním reportérem (např. párové sekvence leucinového zipu, vazebná místa pro sekundární protilátky, vazebné domény kovů, epitopové přívěsky). V některých provedeních vynálezu jsou značky připojeny oddělovacím raménkem (spacerem) různých délek, aby se redukovaly potenciální sterické zábrany.
Anti-IGF-IR protilátka může být také značena pomocí radioaktivně značené aminokyseliny.
Radioaktivní značka může být použita jak pro diagnostické, tak i terapeutické účely. Například radioaktivní značka může být použita k detekci IGF-IR-exprímuj ících nádorů rentgenem nebo jinou diagnostickou technikou. Dále radioaktivní značka může být použita terapeuticky jako toxin pro rakovinné buňky nebo nádory. Příklady značek pro polypeptidy zahrnují, ale bez omezení, následující radioizotopy nebo radionuklidy 3H, 14C, '*N,3 S, ”Y, 99Tc, lnIn, 1251,1311.
Anti-IGF-IR protilátka může také být derivatizována chemickými skupinami jako je například polyethylenglykol (PEG), methylová skupina nebo ethylová skupina nebo sacharidová skupina. Tyto skupiny mohou být použity ke zlepšení biologických vlastností protilátky, např. prodloužení sérového poločasu nebo zvýšení tkáňové vazby.
Farmaceutické přípravky a soupravy
Vynález se také týká farmaceutického přípravku pro léčení hyperproliferativních chorobných stavů u savce, který obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu afarma40 ceuticky přijatelný nosič. V jednom provedení vynálezu farmaceutický přípravek je určen pro léčbu karcinomu jako je například karcinom mozku, plic, dlaždicových (skvamózních) buněk, močového měchýře, žaludku, pankreatu, prsu, hlavy, krku, ledviny, vaječníků, prostaty, kolorektálni karcinom, karcinom jícnu, karcinom dělohy a štítné žlázy. V jiném provedení vynálezu je farmaceutický přípravek určen k léčení nerakovinných hyperproliferativních chorobných stavů, jako je například restenóza po angioplastice a psoriáza, přičemž tento výčet není omezující. V dalším provedení vynálezu je farmaceutický přípravek určen pro léčbu savce, který potřebuje aktivaci IGF-IR, kde farmaceutický přípravek obsahuje terapeuticky účinné množství aktivační protilátky podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutické přípravky obsahující aktivační protilátky mohou být použity k léčbě zvířat, která trpí nedostatkem IGF-I nebo IGF—II, nebo mohou být použity k léčbě osteoporózy nebo zdravotního oslabení nebo chorobného stavu, kdy savec vylučuje příliš málo aktivního růstového hormonu nebo je neschopen reagovat na růstový hormon,
Anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou být inkorporovány do farmaceutického přípravku vhodného k podávání pacientovi. Typicky farmaceutický přípravek obsahuje protilátku podle
-34CZ 301712 B6 vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Jak se v tomto textu používá, termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ zahrnuje kterékoliv a všechna rozpouštědla, disperzivní média, obalovací činidla, antibakteriální a protiplísňová činidla, izotonizující činidla, činidla zpožďující absorpci apod., která jsou fyziologicky kompatibilní. Příklady farmaceuticky přijatelného nosiče zahrnují jeden nebo více z následujících: voda, fyziologický roztok, fyziologický roztok pufrovaný fosfátty, dextróza, glycerol, ethanol apod., a také jakékoliv jejich kombinace. V mnoha případech bude výhodné zahrnout do farmaceutického přípravku izotonizující činidla, například sacharidy, polyalkoholy jako například mannitol nebo sorbitol, nebo chlorid sodný. Farmaceuticky přijatelné látky zahrnují také látky jako například smáčedla nebo menší množství pomocných látek jako například smáčedla nebo emulgační činidla, konzervační činidla nebo puffy, přičemž tyto látky zlepšují skladovatelnost nebo účinnost protilátky nebo části protilátky.
Přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být v mnoha různých formách. Tyto formy jsou např. například forma kapalná, polotuhá a tuhá léková forma, jako například roztoky (např.
roztok pro injekci a pro infiizi), disperze nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, lipozomy a čípky. Výhodná forma závisí na zamýšleném způsobu podávání a terapeutickém použití. Typické výhodné přípravky jsou ve formě roztoku pro injekcí nebo pro infuzi, podobně jako například přípravky používané pro pasivní imunizaci lidí jinými protilátkami. Výhodný způsob podávání je parenterální (např. intravenózní, subkutánní, intraperitoneální, intramuskulámí). Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána intravenózní infuzi nebo injekcí. V dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána intramuskulámí nebo subkutánní injekcí.
Terapeutické přípravky typicky musejí být sterilní a stabilní v podmínkách výroby a uskladnění. Přípravky mohou být formulovány jako roztok, mikroemulze, disperze, lipozomy nebo jiná uspořádaná struktura vhodná pro vysokou koncentraci léčiva. Sterilní roztoky pro injekci mohou být připraveny tak, že se anti-IGF-IR protilátka vnese v požadovaném množství do vhodného rozpouštědla v kombinaci s jednou nebo více dalšími složkami uvedenými výše, podle potřeby, a pak se provede sterilizace filtrováním. Obecně, disperze jsou připravovány tak, že se vnese účinná sloučenina do sterilního vehikula, která obsahuje základní disperzivní médium a požadované další složky z výše uvedených. V případě sterilního prášku pro přípravu sterilního roztoku pro injekci, výhodné metody přípravy jsou vakuové sušení a lyofilizace, které poskytují účinnou složku včetně kterékoliv další požadované složky ve formě prášku z roztoku, který byl před tím sterilizován filtrováním roztoku. Potřebná tekutost roztoku může být udržována například použitím povlaku, například lecitinu, udržováním požadované velikosti částic a v případě disperze použitím surfaktantů. Prodloužená absorpce injekčních přípravků může být upravena tím, že se do přípravku zahrne agens pro zpožděnou absorpci, například monosolí kyseliny stearové nebo želatina.
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být podávány celou radou způsobů známých v oboru, ačkoli pro mnohé terapeutické aplikace je výhodným způsobem podávání způsob intraperitoneální, subkutánní, intramuskulámí, intravenózní nebo infúzní. Jak je odborníkovi zřejmé, způsob podávání se bude měnit a bude záviset na požadovaném výsledku. V jednom provedení vynálezu jsou protilátky podle předkládaného vynálezu podávány jako jediná dávka nebo mohou být podávány jako opakované (mnohonásobné) dávky.
V určitém provedení vynálezu může být účinná sloučenina připravena s nosičem, který bude chránit sloučeninu před rychlým uvolňováním, jako je například léková forma s řízeným uvolňováním léčiva, která zahrnuje implantáty, transdermální náplasti a mikro-opouzdřené aplikační systémy. Biologicky rozložitelné, biologicky kompatibilní polymery mohou být použity, jako je například ethylvinylacetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná. Mnoho ztěchto způsobů přípravy takových formulací je patentováno a nebo je odborníkům obecně známo (viz např. Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems, J. R. Robinson, vyd., Marcel Dekker, lne., New York, 1978).
-35CZ 301712 B6
V určitém provedení vynálezu anti-IGF-IR podle vynálezu může být podávána perorálně, například s inertním ředidlem nebo stravitelným jedlým nosičem. Sloučenina (a případně další složky, jsou-li třeba) mohou také být uzavřeny v tvrdé nebo měkké želatinové tobolce, lisovány do tablety nebo přimíchávány přímo do pacientovy stravy. Pro perorální terapeutické podávání se sloučeniny vnesou do excipientů a užívají se pak ve formě jako jsou tablety (k polykání), bukální tablety, pastilky, tobolky, elixíry, suspenze, sirupy, oplatky, apod. pro podávání sloučeniny podle vynálezu jiným než parenterálním.
Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují „terapeuticky účinné množství“ nebo „profy10 lakticky účinné množství“ protilátky nebo části protilátky podle vynálezu. Termín „terapeuticky účinné množství“ označuje množství účinné, v dávce a po období, které je nutné, pro dosažení požadovaného terapeutického výsledku. Terapeuticky účinné množství protilátky nebo části protilátky se může měnit podle různých faktorů jako například stav onemocnění, věk, pohlaví a hmotnost jedince, a dále schopnost protilátky nebo části protilátky vyvolat požadovanou reakci v jedinci. Terapeuticky účinné množství je také takové množství, při kterém jakékoliv toxické nebo škodlivé účinky protilátky nebo části protilátky jsou převáženy terapeuticky prospěšnými účinky. Termín „proťylakticky účinné množství“ označuje množství účinné, v dávce a po období, které je nutné, pro dosažení požadovaného profylaktického účinku. Typicky platí, protože profylaktická dávka je používána u pacienta před onemocněním nebo v časnější fázi onemocnění, že proťylakticky účinné množství je menší než terapeuticky účinné množství.
Dávkovači schémata mohou být upravena tak, aby poskytovala optimální požadovanou odpověď (např. terapeutickou nebo profylaktickou odpověď). Například může být podán jednoduchý bolus, několik dílčích dávek v průběhu určité doby nebo může být podána proporcionálně redukovaná nebo naopak zvýšená dávka v závislosti na okolnostech terapeutické situace. Farmaceutický přípravek obsahující protilátku nebo obsahující kombinaci obsahující protilátku a jedno nebo více dalších terapeutických agens může být formulován pro podávání jednorázových nebo opakovaných dávek. Je zvláště výhodné formulovat parenterální přípravky do jednotkové lékové formy pro snadnost podávání a udržení uniformity dávky. Jednotková léková forma, jak se termín v tomto textu používá, se týká fyzicky oddělené jednotky určené jako nečleněná dávka pro podávání savci, který má být léčen, kdy každá jednotka obsahuje předurčené množství účinné sloučeniny vypočtené tak, aby poskytla požadovaný terapeutický účinek, ve spojení s požadovaným farmaceutickým nosičem. Specifikace jednotkové lékové formy podle vynálezu je určována a přímo závisí na (a) jedinečných vlastnostech účinné sloučenina a kon35 krétním terapeutickém nebo profylaktickém účinku, který má být dosažen, a (b) limitacích, které jsou vlastní oboru přípravy účinných sloučenin pro léčbu senzitivity. Konkrétně užitečná formulace je 5 mg/ml anti-IGF-IR protilátky v pufru obsahujícím 20mM citrát sodný, pH 5,5, 140mM NaCl a 0,2 mg/ml polysorbát 80.
Příkladem, který však není omezující, rozsahu terapeuticky nebo profylakticky účinného množství protilátky nebo části protilátky podle vynálezu je 0,1 a 100 mg/kg, výhodněji 0,5 až 50 mg/kg, výhodněji 1 až 20 mg^kg a dokonce ještě výhodněji 1 až 10 mg/kg. Je třeba poznamenat, že dávka se může měnit s typem a závažností onemocnění nebo stavu, který má být zmírněn. Je proto zřejmé, že pro konkrétního pacienta by měla být upravena specifická dávkovači schémata v průběhu času podle individuální potřeby a profesionálního názoru odborníka, který přípravek podává nebo na podávání dohlíží, a že dávky uvedené v tomto textu jsou pouze příklady a nijak neomezují skutečný rozsah dávek přípravku podle vynálezu. V jednom provedení vynálezu je terapeuticky nebo profylakticky účinné množství protilátky nebo její antigen-vazebné části podáváno společně s jedním nebo více dalšími terapeutickými agens.
V dalším aspektu se vynález týká podávání anti-IGF-IR protilátky pro léčbu karcinomu v dávce nižší než 300 mg za měsíc.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje soupravy obsahující anti-IGF-IR protilátky a farmaceutické přípravky obsahující tyto protilátky. Souprava může obsahovat, kromě protilátky
-36CZ 301712 B6 nebo farmaceutického přípravku, diagnostická nebo terapeutická agens, Souprava může také obsahovat instrukce pro použití pri diagnostickém nebo terapeutickém způsobu. Ve výhodném provedení vynálezu souprava obsahuje protilátku nebo její farmaceutický přípravek a diagnostické agens, které mohou být použity při způsobu popsaném níže. V dalším výhodném provedení vynálezu souprava obsahuje protilátku nebo její farmaceutický přípravek a jedno nebo více terapeutických agens, jako je například další antineoplázické agens, protinádorové agens nebo chemoterapeutické agens, která mohou být použita při způsobu popsaném dále.
Předkládaný vynález se také týká farmaceutického přípravku pro inhibicí abnormálního buněč10 ného růstu u savce, který obsahuje množství sloučeniny podle vynálezu v kombinaci s množstvím chemoterapeutického agens, kde množství sloučeniny, její soli, solvátu nebo předléčiva a chemoterapeutického agens jsou společně účinná při ínhibici abnormálního buněčného růstu. V oboru je v současnosti známo mnoho chemoterapeutických agens. V jednom provedení vynálezu je chemoterapeutické agens vybráno ze skupiny, která obsahuje mitotické inhibitory, alkylační činidla, antimetabolity, interkalující antibiotika, inhibitory růstových faktorů, inhibitory buněčného cyklu, enzymy, inhibitory topoisomerázy, protipřežívací agens, modifikátory biologické reakce, antihormony, např. antiandrogeny, a antiangiogenní činidla.
Ve spojení se sloučeninami podle vynálezu mohou být použita anti-angiogenní agens jako napří20 klad inhibitory MMP-2 (matrix-metaloproteináza 2), MMP-9 (matrix-metaloproteináza 9) a inhibitory COX-II (cyklooxygenáza Ií). Příklady použitelných COX-II inhibitorů zahrnují CELEBREX™ (alecoxib), valdecoxib a rofecoxib, Příklady použitelných inhibitorů matrixových metalloproteináz jsou popsány v dokumentech: WO 96/33172 (publikovaná 24. října 1996), WO 96/27583 (publikovaná 7. března 1996), Evropská patentová přihláška č. 97304971.1 (podaná 8. července 1997), Evropská patentová přihláška č. 99308617.2 (podaná 29. října 1999), WO 98/07697 (publikovaná 26. února 1998), WO 98/03516 (publikovaná 29. ledna 1998), WO 98/34918 (publikovaná 13. srpna 1998), WO 98/34915 (publikován 13. srpna 1998), WO98/33768 (publikovaná, srpna 1998), WO 98/30566 (publikovaná 16. července 1998), Evropský patent EP 606 046 (publikován 13. července 1994), Evropský patent EP 931 788 (publikován 28. července 1999), WO 90/05719 (publikovaná 31. května, 1990), WO 99/52910 (publikován 21. října 1999), WO 99/52889 (publikován 21. října 1999), WO 99/29667 (publikovaná 17. června 1999), PCT Mezinárodní přihláška č. PCT/IB98/01113 (podaná 21, července 1998), Evropská patentová přihláška č. 99302232.1 (podaná 25. března 1999), Britská patentová přihláška č. 9912961.1 (podaná 3. června 1999), prozatímní přihláška Spojených Států č. 60/148
4 64 podaná 12. srpna 1999), patent Spojených Států US 5 863 949 (publikovaný 26. ledna 1999), patent Spojených Států US 5 861 510 (publikovaný 19. ledna 1999) a Evropský Patent EP 780 386 (publikovaný 25. června 1997), přičemž každá z těchto publikací je jako celek zahrnuta formou odkazu. Výhodné MMP inhibitory jsou ty, u kteiých se neprojevuje arthralgie. Výhodnější jsou ty, které selektivně ínhibují MMP-2 a/nebo MMP-9 vzhledem k ostatním matrixovým metaloproteinázám (tj. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 a MMP-13). Některé specifické příklady MMP inhibitorů použitelných v předkládaném vynálezu jsou AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 a dále sloučeniny uvedené v následujícím seznamu:
3-[[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfony I]-( 1 -hydroxykarbamoy l-cyklopentyl)amino]propionová kyselina, hydroxamid 3-exo-3-14-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamÍno]-8-oxabicyklo[3.2.1]oktan-3-karboxylové kyseliny, hydroxamid (2R,3R>-l-[4-(2-chlor-4-fluorbenzyloxy)benzensuIfonyI]-3-hydroxy-3-methylpiperidin-2-karboxylové kyseliny, hydroxamid 4-[4-{4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]tetrahydropyran-4-karboxylové kyseliny, 3-[[4-(4-fluorfenoxy)50 benzensulfonyl]-(l-hydroxykarbamoylcykiobutyl)amino]propionová kyselina, hydroxamid 4[4-(4—chlorfenoxy)benzensulfonylamino]tetrahydropyran-4-karboxylové kyseliny, hydroxamid (R}-3-[4(4-chlorfenoxy)benzensulfonylamino]tetrahydropyran-3-karboxylové kyseliny, hydroxamid (2R,3R)- l-[4-(4-fluor-2-methylbenzyloxy)benzensulfonyl]-3-hydroxy-3-methy 1piperidin-2-karboxylové kyseliny, 3-[[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]-(l-hydroxy55 karbamoyl-l-methylethyl)amino]propionová kyselina, 3-[[4-(4~fluorfenoxy)benzensulfonyl]-37CZ 301712 B6 (4-hydroxykarbamoyltetrahydropyran-4-yI)amino]propionová kyselina, hydroxamid 3-exo-3[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxaicklo [3.2.1]oktan-3-karboxylové kyseliny, hydroxamid 3-endo-3-[4~(4-f1uorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxaicykIo[3.2.1 ]oktan-3karboxylové kyseliny a hydroxamid (R)-3-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]tetra5 hydrofuran-3-karboxylové kyseliny, a farmaceuticky přijatelné soli a solváty těchto sloučenin.
Sloučenina podle vynálezu může také být použita s inhibitory signální transdukce, jako jsou například činidla, která inhibují reakce EGF-R (receptor epidermálního růstového faktoru), jako io například EGF-R protilátky, EGF protilátky a molekuly, které jsou inhibitory EGF-R, inhibitory
VEGF (růstový faktor cévního endotelu), jako například VEGF receptory a molekuly, které inhibují VEGF, a inhibitory erbB2 receptorů, jako například organické molekuly nebo protilátky, které se vážou k erbB2 receptorů, například HERCEPTIN™ (Genentech, lne.), inhibitory EGF-R jsou popsány například v následujících publikacích: WO 95/19970 (publikovaná 27. července
1995), WO 98/14451 (publikovaná 9. dubna 1998), WO 98/02434 (publikovaná 22. ledna 1998), patent Spojených Států US 5 747 498 (publikovaný 5. května 1998), a tyto látky mohou být použity v předkládaném vynálezu jak bylo popsáno. EGFR-inhibující činidla zahrnují, aniž by výčet byl omezující, monoklonální protilátky C225 a anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell (Genesys), EMD-7200 (Merck KgA), EMD-5590 (Merck KgA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. a Merck KgaA) a sloučeniny ZDI 834, ZD-1838 a ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartís), PKI-166/CGP75166 (Novartís), PTK 787 (Novartís), CP 701 (Cephalon), leflunomid (Pharmacia/Sugen), CI—1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI—1033Pd 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidin A (Bristol Myers Squibb),
RC-3940-1I (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.),
VRCTC310 (Ventech Research), EGF fuzní toxin (Seragen Inc,), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperiál Cancer Research) Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) a EGF-R vakcínu (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Tato a ještě další EGF-R-inhibující činidla mohou být použita v předkládaném vynálezu.
Se sloučeninami podle předkládaného vynálezu mohou být kombinovány dále VEGF inhibitory, například SU-5416 a SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Sobering) a NX-1838 (NeXstar). VEGF inhibitory jsou popsány například v následujících publikacích: WO 99/24440 (publikovaná 20. května 1999), PCT mezinárodní přihláška PCT/IB99/00797 (podaná 3. května 1999), WO 95/21613 (publikovaná 17. srpna 1995), WO 99/61422 (publikovaná 2. prosince 1999), patent Spojených Států US 5 834 504 (publikovaný 10. Listopadu 1998), WO 98/50356 (publikovaná 12. listopadu 1998), patent Spojených Států US 5 883 1 13 (publikovaný 16. března
1999), patent Spojených Států US 5 886 020 (publikovaný 23. března 1999), patent Spojených
Států US 5 792 783 (publikovaný 11. srpna 1998), WO 99/10349 (publikovaná 4. března 1999), WO 97/32856 (publikovaná 12. září 1997), WO 97/22596 (publikovaná 26. června 1997), WO 98/54093 (publikovaná 3. prosince 1998), WO 98/02438 (publikovaná 22. ledna 1998), WO 99/16755 (publikovaná 8. dubna 1999) a WO 98/02437 (publikovaná 22, ledna 1998), každá z těchto publikací je zahrnuta formou odkazu. Další příklady některých specifických VEGF inhibitorů použitelných v předkládaném vynálezu jsou IM862 (Cytran Inc.), anti-VEGF monoklonální protilátka (Genentech, Inc.) a angiozym, syntetický ribozym (Ribozyme a Chiron). Tyto a ještě další VEGF inhibitory mohou být použity v předkládaném vynálezu jak bylo popsáno výše.
Se sloučeninami podle předkládaného vynálezu mohou být kombinovány dále inhibitory ErbB2 receptorů, jako například GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) a monoklonální protilátky AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) a 2B-1 (Chiron), například jak byly uvedeny v následujících publikacích: WO 98/02434 (publikovaná 22. Ledna 1998), WO 99/35146 (publikovaná
15. července 1999), WO 99/35132 (publikovaná 15. července 1999), WO 98/02437 (publikovaná
-38CZ 301712 B6
22. ledna 1998), WO 97/13760 (publikovaná 17. dubna 1997), WO 95/19970 (publikovaná
27. července 1995), patent Spojených Států US 5 587 458 (publikovaný 24. prosince 1996) a patentu Spojených Států US 5 877 305 (publikovaný 2. března 1999), které jsou všechny zahrnuty formou odkazu. Inhibitory ErbB2 receptoru užitečné v předkládaném vynálezu jsou také popsány v prozatímní patentové přihlášce Spojených Států č. 60/117 341, podané 27. ledna 1999 a č. 60/117 346, podané 27. ledna 1999, které jsou zahrnuty formou odkazu. Inhibitory ErbB2 receptoru a sloučeniny popsané ve výše citovaných PCT přihláškách, patentech Spojených Států a prozatímních přihláškách Spojených Států, a také další sloučeniny a látky, které inhibují erbB2 receptor, mohou být použity se sloučeninami podle vynálezu ve smyslu předkládaného vynálezu.
io
Protipřežívací činidla zahrnují anti-IGF-IR protilátky a anti-integrinová činidla, jako například anti-integrinové protilátky.
Diagnostické metody
Anti-IGF-IR protilátky mohou být použity pro detekování IGF-IR v biologickém vzorku in vitro nebo in vivo. Anti-IGF-IR protilátky mohou být použity v obvyklých imunotestech, včetně testů ELISA, RIA, FACS, tkáňových imunohistochemických testech, Western blotu nebo imunoprecipitaci, aniž by tento výčet byl omezující. Anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou být použity k detekování IGF-IR u lidí. V dalším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátky mohou být použity k detekování IGF-IR u primátů Starého světa jako jsou makakové (např. rhesus), šimpanzové a lidoopi.
Vynález poskytuje způsob pro detekci anti-IGF-IR v biologickém vzorku, který zahrnuje kon25 taktování biologického vzorku s anti-IGF-IR protilátkou podle vynálezu a detekci navázané protilátky, která je navázaná k anti-IGF-IR, pro detekci IGF-IR v biologickém vzorku. V jednom provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je přímo značena detekovatelnou značkou. V dalším provedení vynálezu je anti-IGF-IR protilátka (první protilátka) neznačená a druhá protilátka nebo jiná molekula, která se váže na anti-IGF-IR protilátku, je značená. Jak je v oboru dobře známo, druhá protilátka je zvolena tak, že je schopná specificky vázat specifický druh a třídu první protilátky. Například jestliže anti-IGF-IR protilátka je humánní IgG, pak sekundární protilátka může být anti-humánní-IgG. Jiné molekuly, které se inohou vázat k protilátkám, zahrnují protein A a protein G, které jsou oba komerčně dostupné od firmy Pierce Chemical Co., přičemž tento výčet není omezující.
Vhodné značky pro protilátku nebo sekundární protilátku byly popsány výše a zahrnují různé enzymy, prostetické skupiny, fluorescenční látky, luminiscenční látky, magnetická Činidla a radioaktivní látky. Příklady vhodných enzymů zahrnují křenovou peroxidázu, alkalickou rostatázu, β-galaktosidázu a acetylcholinesterázu, příklady vhodných komplexů prostetické skupiny zahrnují streptavidin/biotin a avidin/biotin, příklady vhodné fluorescenční látky zahrnují, umbeliferon, fluorescein, fluorescein isothiokyanát, rhodamin, dichlortriazinylamin fluoresceinu, dansylchlorid nebo fykoerytrin, příkladem luminiscenční látky je luminol, příkladem magnetického agens je gadolinium a příkladem vhodné radioaktivní látky jsou l25I, 131I,35S nebo 3H.
V alternativním provedení vynálezu IGF-IR může být testován v biologickém vzorku kompetitivním imunotestern využívajícím IGF-IR standardy značené detekovatelnou látkou a neznačené anti-IGF-IR protilátky. V tomto textu se kombinují biologický vzorek, značený IGF-IR standard a anti-IGF-IR protilátka a stanovuje se množství značeného IGF-IR standardu navázaného k neznačené protilátce. Množství IGF-IR v biologickém vzorku je nepřímo úměrné množství značeného IGF-IR standardu vázaného k anti-IGF-IR protilátce.
Imunotesty popsané výše lze použít pro velký počet účelů. V jednom provedení vynálezu mohou být anti-IGF-IR protilátky použity pro detekci IGF-IR v buňkách v tkáňových kulturách. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátky mohou být použity pro určování hladiny fosforylace tyrosinu, autofosforylace tyrosinu z IGF-IR a/nebo množství IGF-IR na buněčném
-39CZ 301712 B6 povrchu po ošetření buněk různými sloučeninami. Tento způsob může být použit pro testování sloučenin, které mohou být použity pro aktivaci nebo inhibici IGF-IR. V tomto způsobu je jeden vzorek buněk podroben působení testované sloučeniny po určité časové období, zatímco další vorek byl ponechán neošetřen. Jestliže má být měřena autofosforylace tyrosinu, buňky jsou lyžovány a fosfory láce tyrosinu IGF-IR je měřena s použitím imunotestu popsaného výše nebo tak, jak bylo popsáno v příkladu III, který používá test ELISA. Jestliže má být měřena hladina celkového IGF-IR, buňky jsou lyžovány a hladina celkového IGF-IR je měřena s použitím jednoho z imunotestů popsaných výše.
ío Výhodným imunotestem pro určování IGF-IR fosforylace tyrosinu nebo pro měření hladin celkového IGF-IR je ELISA nebo Western blot Jestliže má být měřena pouze hladina IGF-IR buněčného povrchu, buňky nejsou lyžovány a hladiny IGF-IR buněčného povrchu jsou měřeny s použitím jednoho z imunotestů popsaných výše. Výhodný imunotest pro určování hladiny IGF-IR buněčného povrchu zahrnuje kroky značení proteinů buněčného povrchu detekovatelnou značkou, jako je například biotin nebo l23I, imunoprecipitaci IGF-IR s anti-IGF-IR protilátkou, a pak detekce značeného IGF-IR. Další výhodný imunotest pro určování lokalizace IGF-IR, např. hladiny buněčného povrchu je použití imunohistochemického vyšetření. Metody, jako je například ELISA, RIA, Western blot, imunohistochemícké vyšetření, značení buněčného povrchu proteinů základní membrány a imunoprecipitace, jsou v oborou dobře známy. Viz např. Harlow a Lané, výše. Kromě toho imunotesty mohou být zvětšeny pro vysoce výkonný screening, aby se testoval velký počet sloučenin bud’ na aktivaci, nebo inhibici IGF-IR.
Anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou také být použity pro určování hladin IGF-IR v tkáni nebo v buňkách pocházejících z tkáně. Ve výhodném provedení vynálezu tkáň je nemoc25 ná tkáň. Ve výhodnějším provedení vynálezu tkáň je nádor nebo jeho biopsie. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu, tkáně nebo jejich biopsie jsou odebrány z pacienta, Tkáň nebo biopsie je pak v imunotestu pro určování např. hladiny IGF-IR, hladiny IGF-IR buněčného povrchu, hladiny fosforylace tyrosinu IGF-IR nebo lokalizace IGF-IR způsoby diskutovanými výše. Způsob může být použit pro určování, zdali nádor exprimuje IGF-IR ve vysoké hladině.
Výše popsaný diagnostický způsob může být použit pro určování toho, zda nádor exprimuje vysoké hladiny IGF-IR, které mohou být indikativem, že nádor bude dobře odpovídat na léčbu anti-IGF-IR protilátkou. Diagnostický způsob může také být použit pro určování, zda nádor je potenciálně rakovinný, jestliže exprimuje vysoké hladiny IGF-IR nebo benigní, jestliže exotimu35 je nízké hladiny IGF-IR. Dále může také být diagnostický způsob použit pro určování, zda léčba anti-IGF-IR protilátkou (viz níže) způsobuje, že nádor exprimuje nižší hladiny IGF-IR a/nebo vykazuje nižší hladiny autofosforylace tyrosinu, a tak může být použit pro určování toho, zda léčebný postup je úspěšný. Obecně, způsob určování, zda anti-IGF-IR protilátka sníží fosforylaci tyrosinu, obsahuje kroky měření hladiny fosforylace tyrosinu v buňce nebo požadované tkáni, inkubaci buňky nebo tkáně s anti-IGF-IR protilátkou nebo její antigen-vazebnou částí, a pak opakované měření hladiny fosforylace tyrosinu v buňce nebo tkáni. Může být měřena fosforylace tyrosinu IGF-IR nebo dalšího proteinu (proteinů). Diagnostický způsob může také být použit pro určování, zda tkáň nebo buňka neexprimuje dostatečně vysoké hladiny IGF-IR nebo dostatečně vysoké hladiny aktivovaného IGF-IR, což může být případ u jedinců s nanismem, osteoporózou nebo diabetem. Diagnóza, že hladiny IGF-IR nebo účinného IGF-IR jsou příliš nízké, muže být použita pro léčení aktivujícími anti-IGF-IR protilátkami, IGF-I nebo dalšími terapeutickými agens pro zvyšování IGF-IR hladin nebo aktivity.
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou také být používány in vivo, aby se lokalizovaly tkáně a orgány, které exprimují IGF-IR. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátky mohou být použity pro lokalizaci IGF-IR-exprimuj ících nádorů. Výhoda anti-IGF-IR protilátek podle předkládaného vynálezu je ta, že nebudou tvořit imunitní reakci při podávání. Způsob obsahuje kroky podávání anti-IGF-IR protilátky nebo jejího farmaceutického přípravku pacientovi, který takový diagnostický test potřebuje, a podrobení pacienta zobrazovací analýze pro určování lokalizace IGF-IR-exprimuj ících tkání. Zobrazovací analýza je dobře známa
-40CZ 301712 B6 v lékařském oboru a zahrnuje, bez omezení, rentgenovou analýzu, zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) nebo počítačovou tomografií (CE). V dalším provedení způsobu podle vynálezu je od pacienta získávána spíše biopsie pro určování, zda požadovaná tkáň exprimuje IGF-IR, než podrobování pacienta zobrazovací analýze. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR proti5 látky mohou být značeny detekovatelným agens, které může být zobrazeno v pacientovi. Například protilátka může být značena kontrastním agens, jako například batyem, které může být použito pro rentgenovou analýzu nebo magnetické kontrastní agens, jako například chelát gadolinia, který může být použit pro MRI nebo CE. Další značící činidla zahrnují, bez omezení, radioizotopy, jako je například ”Tc. V dalším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je neznačena a je zobrazena podáváním druhé protilátky nebo další molekuly, která je detekovatelná a která může vázat anti-IGF-IR protilátku.
Terapeutické způsoby použití
V dalším provedení vynález poskytuje způsob inhibice IGF-IR aktivity podáváním anti-IGF-IR protilátky pacientovi, který to potřebuje. Každý z typů protilátek popsaných v tomto textu může být použit terapeuticky. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je humánní, chimérická nebo humanizovaná protilátka. V dalším výhodném provedení vynálezu IGF-IR je humánní a pacient je člověk. Alternativně, pacient může být savec, který exprimuje IGF-IR, se kterým anti-IGF-IR protilátka reaguje zkříženě. Protilátka může být podávána savci jiného než lidského původu exprimujícímu IGF-IR, se kterým protilátka zkříženě reaguje (tj. primáti nebo makakové Macacafascicularis nebo Macaca mullata („rhesus“)) pro veterinární účely nebo jako zvířecímu modelu humánního onemocnění. Takové zvířecí modely mohou být použitelné pro hodnocení terapeutické účinnosti protilátek podle tohoto vynálezu.
Jak se v tomto textu používá, termín „chorobný stav, ve kterém IGF-IR aktivita je škodlivá“ zahrnuje nemoci a další chorobné stavy, ve kterých bylo prokázáno, že přítomnost vysokých hladin IGF-IR u pacienta trpícího chorobným stavem přímo je, nebo je podezřívána, že je, zodpovědná buď za patofyziologii chorobného stavu, nebo je faktorem, který přispívá ke zhoršování chorobného stavu. V souladu s tím, chorobný stav, ve kterém jsou škodlivé vysoké hladiny IGF-IR aktivity, je chorobný stav, kdy je očekáváno, že inhibice IGF-IR aktivity zmírní symptomy a/nebo průběh chorobného stavu. Takové chorobné stavy mohou být prokázány například zvýšením hladin IGF-IR buněčného povrchu nebo zvýšenou autofosforylací tyrosinu IGF-IR v postižených buňkách nebo tkáních pacienta trpícího chorobným stavem. Zvýšení
IGF-IR hladin může být detekováno například s použitím anti-IGF-IR protilátky, jak bylo popsáno výše.
Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka může být podávána pacientovi, který má nádor exprimující IGF-IR. Nádor může být solidní nádor nebo to může být nádor nesolidní, jako je například lymfom. Ve výhodnějším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka může být podávána pacientovi, který má IGF-IR-exprimující nádor, který je rakovinný. V ještě výhodnějším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je podávána pacientovi, který má plicní nádor, nádor prsu, prostaty nebo tračníku. Ve vysoce výhodném provedení způsob podle vynálezu způsobí, že nádor nezvýší hmotnost nebo objem nebo se jeho hmotnost nebo objem sníží. V dalším provedení způsob podle vynálezu způsobí, že IGF-IR na nádoru budou intemalizovány. Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1,1 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo jejich úsek vázající antigen.
so V dalším výhodném provedení vynálezu antí-IGF-IR protilátka může být podávána pacientovi, který exprimuje nepřiměřeně vysoké hladiny IGF-I. V oboru je známo, že vysoká hladina exprese IGF-I může vést k celé radě běžných karcinomů. Ve výhodnějším provedení vynálezu antí-IGF-IR protilátka je podávána pacientovi s karcinomem prostaty, gliomem nebo fibrosarkomem. V ještě výhodnějším provedení způsob podle vynálezu způsobí, že karcinom přestane
-41 CZ 301712 B6 abnormálně proliferovat nebo se nezvyšuje jeho hmotnost či objem nebo se hmotnost Či objem snižuje,
V jednom provedení vynálezu se způsob týká léčby karcinomů, jako jsou například karcinomy mozku, spinocelulámí karcinom, karcinom močového měchýře, žaludku, pankreatu, prsu, hlavy, krku, jícnu, prostaty, kolorektální karcinomy, karcinomy plic, ledvin, vaječníků, gynekologické karcinomy nebo karcinomy štítné žlázy. Pacienti, kteří mohou být léčeni sloučeninami podle vynálezu způsoby podle tohoto vynálezu zahrnují například pacienty, u kterých bylo diagnostikováno, že mají plicní karcinom, karcinom kostí, karcinom pankreatu, karcinom kůže, karcinomy io hlavy a krku, kožní nebo intraokulámí melanom, karcinom dělohy, karcinom vaječníků, rektální karcinom, karcinom řitní oblasti, karcinom žaludku, karcinom tračníku, karcinom prsu, gynekologické nádory (např. sarkomy dělohy, karcinom vejcovodů, karcinom endometria, karcinom krčku děložního, karcinom vagíny nebo karcinom vulvy), Hodgkinova nemoc, karcinom jícnu, karcinom tenkého střeva, karcinomy endokrinního systému (např. karcinom štítné žlázy, příštít15 ných tělísek nebo nadledvinek), sarkomy měkkých tkání, karcinom uretry, karcinom penisu, karcinom prostaty, chronická nebo akutní leukémie, solidní nádory dětského věku, lymfocytární lymfomy, karcinom močového měchýře, karcinom ledvin nebo ureterů (např. karcinom ledvinných buněk, karcinom ledvinných pánviček) nebo novotvary centrálního nervového systému (např. primární lymfom CNS, nádory míchy, gliomy mozkového kmene nebo adenomy hypoťyzy).
Protilátka může být podávána jednou, ale výhodněji je podávána vícekrát. Protilátka může být podávána třikrát denně až jednou každých šest měsíců. Podávání může být plánované, jako například třikrát denně, dvakrát denně, jednou denně, jednou každé dva dny, jednou každé tři dny, jednou týdně, jednou každé dva týdny, jednou každý měsíc, jednou každé dva měsíce, jednou každé tři měsíce a jednou každých šest měsíců. Protilátka může být podávána prostřednictvím perorální, slízniční, bukální, intranazální, inhalační, intravenózní, subkutánní, intramuskulámí, parenterální, intranádorové nebo topické cesty. Protilátka může být podávána do místa vzdáleného od místa nádoru. Protilátka může také být podávána kontinuálně prostřednic30 tvím minipumpy. Protilátka může být podávána jednou, alespoň dvakrát nebo alespoň po časové období, dokud není chorobný stav léčen, zmírněn nebo vyléčen. Protilátka obecně bude podávána alespoň tak dlouho, dokud je nádor přítomný za předpokladu, že protilátka způsobí, že nádor nebo karcinom zastaví růst nebo se sníží jeho hmotnost či objem. Protilátka bude obecně podávána jako část farmaceutického přípravku, jak bylo popsáno výše. Dávka protilátky bude obecně v rozsahu 0,1 až 100 mg/kg, výhodněji 0,5 až 50 mg/kg, výhodněji I až 20 mg/kg aještě výhodněji 1 až 10 mg/kg. Sérová koncentrace protilátky může být měřena každou metodou v oboru známou, např. viz příklad XVII níže. Protilátka může také být podávána profylakticky, aby se zabránilo výskytu karcinomu nebo nádoru. To může být obzvláště užitečné u pacientů, kteří mají „vysoce normální“ hladinu IGF-1, protože bylo ukázáno, že tito pacienti mají vyšší riziko rozvoje běžných karcinomů. Viz Rosen et al., výše.
V dalším aspektu anti-IGF-IR protilátka může být společně podávána s dalšími terapeutickými agens, jako jsou například antineoplazické léky nebo molekuly, pacientovi, který má hyperproliferativní chorobný stav, jako je například karcinom nebo nádor. V jednom aspektu se vyná45 lez týká způsobu léčby hyperproliferativního chorobného stavu u savce obsahujícího podávání savcovi terapeuticky účinného množství sloučeniny podle vynálezu v kombinaci s anti-nádorovým agens vybraným ze skupiny, kterou tvoří, bez omezení, mitotické inhibitory, alkylační činidla, anti-metabolity, interkalující činidla, inhibitory růstového faktoru, inhibitory buněčného cyklu, enzymy, inhibitory topoizomerázy, modifikátory biologické reakce, anti-hormony, inhi50 bictory kináz, inhibitory metaloproteáz mezibuněěné hmoty, genetická léčiva a anti-androgeny. Ve výhodnějším provedení vynálezu protilátka může být podávána s antineoplázickým agens, jako je například adriamycin nebo taxol. V dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka nebo kombinační léčba podávána spolu s radioterapií, chemoterapií, fotodynamickou terapií, chirurgickou léčbou nebo jinou imunoterapu, V ještě dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána s další protilátkou. Například anti-IGF-IR protilátka může být podávána
-42CZ 301712 Bó s protilátkou nebo jiným agens, o kterém je známo, že inhibuje proliferaci bunék nádoru nebo karcinomu, např. protilátka nebo agens, které inhibuje erbB2 receptor, EGF-R, CD20 nebo
VEGF.
Společné podávání protilátky s dalším terapeutickým agens (kombinační léčba) zahrnuje podávání farmaceutického přípravku obsahujícího anti-IGF-IR protilátku a další terapeutické agens a podávání dvou nebo více samostatných farmaceutických přípravků, jeden obsahující anti-IGF-IR protilátku a druhý obsahující další terapeutické agens. Dále, ačkoli společné podáváni nebo kombinační léčba obecně znamená, že protilátka a další terapeutická činidla jsou podávána současně ve stejnou dobu, zahrnuje také příklady, kdy jsou protilátka a další terapeutická agens podávána v různé časy. Například protilátka může být podávána jednou každé tři dny, zatímco další terapeutické agens je podáváno jednou denně. Alternativně, protilátka může být podávána před nebo po léčbě chorobného stavu dalším terapeutickým agens. Podobně podávání antí-IGFIR protilátky může být aplikováno před nebo po další terapii, jako je například radioterapie, chemoterapie, fotodynamická terapie, chirurgický výkon nebo jiná imunoterapie.
Protilátka a jedno nebo více dalších terapeutických agens (kombinační léčba) může být podávána jednou, dvakrát nebo alespoň po časové období, dokud není chorobný stav léčen, zmírněn nebo vyléčen. Výhodně je kombinační léčba podávána vícekrát. Kombinační léčba může být podávána třikrát denně až jednou každých šest měsíců. Podávání může být plánované, jako například třikrát denně, dvakrát denně, jednou denně, jednou každé dva dny, jednou každé tři dny, jednou týdně, jednou každé dva týdny, jednou každý měsíc, jednou každé dva měsíce, jednou každé tři měsíce a jednou každých šest měsíců nebo kontinuálně prostřednictvím minipumpy. Kombinační léčba může být podávána prostřednictvím perorální, slizniční, bukální, intranazální, inhalační, intra25 venózní, subkutánní, intramuskulární, parenterální, intranádorové nebo topické cesty. Kombinační léčba může být podávána do místa vzdáleného od místa nádoru. Kombinační léčba obecně bude podávána alespoň tak dlouho, dokud je nádor přítomný za předpokladu, že protilátka způsobí, že nádor nebo karcinom zastaví růst nebo se sníží jeho hmotnost či objem.
Vještě dalším provedení vynálezu je anti-IGF-IR protilátka značena radioaktivní značkou, imunotoxinem nebo toxinem nebo fuzním proteinem obsahujícím toxický peptid. Anti-IGF-IR protilátka nebo anti-IGF-IR protilátkový fuzní protein řídí radioaktivní značku, imunotoxin, toxin nebo toxický peptid k IGF-IR-exprimujícímu nádoru nebo karcinomové buňce. Ve výhodném provedení vynálezu radioaktivní značka, imunotoxin, toxin nebo toxický peptid k IGF-IR35 exprimujícímu nádoru nebo karcinomové buňce. Ve výhodném provedení vynálezu radioaktivní značka, imunotoxin, toxin nebo toxický peptid je intemalizován poté, co se anti-IGF-IR protilátka váže k IGF-IR na povrchu nádorové nebo karcinomové buňky.
V dalším aspektu anti-IGF-IR protilátka může být použita terapeuticky k indukci apoptózy specifických buněk u pacienta, který to potřebuje. V mnoha případech buňky cílené pro apoptózu jsou rakovinné nebo nádorové buňky. Ve výhodném provedení tedy vynález způsob indukce apoptózy podáváním terapeuticky účinného množství anti-IGF-IR protilátky pacientovi, který to potřebuje. Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1,2,13.2,2.14.3, 3.1.1,4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo její úsek vázající antigen.
V dalším aspektu anti-IGF-IR protilátka může být použita k léčbě nerakovinných stavů, kdy jsou vysoké hladiny IGF-I a/nebo IGF-IR asociovány s nerakovinným stavem nebo onemocněním.
V jednom provedení vynálezu způsob obsahuje krok podávání anti-IGF-IR protilátky pacientovi, který má nerakovinný patologický stav způsobený nebo exacerbovaný vysokými hladinami
IGF-I a/nebo hladinami či aktivitou IGF-IR. Ve výhodném provedení vynálezu nerakovinný patologicky stav je akromegalíe, gigantismus, psoriáza, ateroskleróza, restenóza hladkého svalstva krevních cév nebo nepatřičná mikrovaskulámí proliferace, jako například proliferace zjišťovaná jako komplikace diabetes, obzvláště oka. Ve výhodnějším provedení vynálezu anti55 IGF-IR protilátka zpomaluje progresi nerakovinného patologického stavu. Ve výhodnějším
-43CZ 301712 B6 provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka zastaví nebo zvrátí, alespoň částečně, nerakovinný patologický stav.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob podávání aktivující anti-IGF-IR protilátky pacien5 tovi, který to potřebuje. V jednom provedení vynálezu aktivující protilátka nebo farmaceutický přípravek je podáván pacientovi, který to potřebuje, v množství účinném ke zvýšení IGF-IR aktivity. Ve výhodnějším provedení vynálezu aktivující protilátka je schopna obnovit normální IGF-IR aktivitu. V dalším výhodném provedení vynálezu aktivující protilátka může být podávána pacientovi, který má malou postavu, neuropatii, snížení svalové hmoty nebo osteoporózu. io V dalším výhodném provedení vynálezu aktivující protilátka může být podávána s jedním nebo více dalšími faktory, které zvyšují buněčnou proliferaci, zabraňují apoptóze nebo zvyšují IGF-IR aktivitu. Takové faktory zahrnují růstové faktory, jako je například IGF-I, a/nebo analogy IGF-I, které aktivují IGF-IR. Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 4.17.3 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebojejich část vázající antigen.
Genová terapie
Molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány pacientovi, který to potřebuje, prostřednictvím genové terapie. Terapie může být buď in vivo, nebo ex vivo.
Ve výhodném provedení vynálezu jsou molekuly nukleové kyseliny kódující jak těžký řetězec, tak lehký řetězec podávány pacientovi. Ve výhodnějším provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny jsou podávány tak, že jsou trvale začleněny do chromozómu B lymfocytů, protože tyto buňky jsou specializovány na produkci protilátek. Ve výhodném provedení vynálezu prekurzorrové B Íymfocyty jsou transfekovány nebo infikovány ex vivo a opětně transplantovány pacien25 tovi, který potřebuje léčbu. V dalším provedení vynálezu prekurzorové B Íymfocyty nebo další buňky jsou infikovány in vivo s použitím viru známého infikovat požadovaný buněčný typ. Typické vektory použité pro genovou terapii zahrnují lipozomy, plazmidy nebo virové vektory, jako jsou například retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry. Po infekci buď in vivo, nebo ex vivo mohou být hladiny exprese protilátek monitorovány odběrem vzorku léčenému pacientovi as použitím kteréhokoliv imunotestu v oboru známého a popsaného v tomto textu.
Ve výhodném provedení vynálezu způsob genové terapie zahrnuje kroky podávání účinného množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo jeho antigenvazebnou část humánní protilátky nebo její části a exprimující molekulu nukleové kyseliny.
V dalším provedení vynálezu způsob genové terapie zahrnuje kroky podávání účinného množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující lehký řetězec netw jeho antigen-vazebnou část humánní protilátky nebo její části a exprimující molekulu nukleové kyseliny. Ve výhodnějším způsobu způsob genové terapie zahrnuje kroky podávání účinného množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část humánní protilátky nebo její části a účinné množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část humánní protilátky nebo její části a exprimující molekulu nukleové kyseliny. Způsob genové terapie může také zahrnovat krok podávání dalších antirakovinných agens, jako je například taxol, tamoxifen, 5-FU, adriamycin nebo CP-358 774.
Pro lepší pochopení vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Tyto příklady jsou pouze pro ilustrační účely a nelze je vykládat jako příklady omezující rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad I
Příprava hybridomů produkujících anti-IGF-IR protilátku
-44CZ 301712 B6
Protilátky podle vynálezu byly připraveny, vybrány a testovány následujícím způsobem: Imunizace a vytvoření hybridomu
Osm až deset týdnů staré myši XENOMICE™ byly imunizovány intraperitoneálně nebo do chodidel jejich zadních nohou buď extracelulámí doménou humánního IGF-IR (10 gg/dávka/myš), nebo buňkami 3T3-IGF-IR nebo 300.19-IGF-IR, což jsou dvě transfekované buněčné linie, které exprimují humánní IGF-IR na svých plazmatických membránách (10 x 106 buněk/dávka/myš). Tato dávka byla opakována pět až sedmkrát po období tří až osmi týdnů. Čtyři dny io před fůzí myši dostaly konečnou injekci extracelulámí domény humánního IGF-IR v PBS. Slezina a lymfocyty z lymfatické uzliny imunizovaných myší byly fúzovány s buněčnou linií nesekrečního myelomu P3-X63-Ag8.653 a byly podrobeny HAT selekci, jak bylo popsáno dříve (Galfre a Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Byl získán panel hybridomu, které všechny sekretovaly IGF-IR specifické humánní IgG2x protilátky. Sedm hybridomů produkuj í15 cích monoklonální protilátky specifické pro IGF-IR bylo vybráno pro další studie a byly nazvány 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2,4.17.3 a 6.1.1.
Hybridomy 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3 byly uloženy v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209,12. prosince 2000 s následujícími přístupovými čísly:
Hybridom Deposit č.
2.12.1 PTA-2792
2.13.2 PTA-2788
2.14.3 PTA-2790
3.1.1 PTA-2791
4.9.2 PTA-2789
4.17.3 PTA-2793
Příklad II
Stanovení afinitních konstant (K4) plně humánních anti-IGF-IR monoklonálních protilátek pomocí BIAcore
Byla prováděna měření afinity purifikovaných protilátek povrchovou plazmonovou rezonancí s použitím přístroje BIAcore 3000, podle protokolů výrobce.
Protokol 1
Pro provádění kinetických analýz byl protein-A imobilizován na povrchu senzorového čipu BIAcore. Senzorový čip pak byl použit pro zachycení anti-IGF-IR protilátek podle předkládaného vynálezu. Na senzorový čip byly injikovány různé koncentrace extracelulámí domény
IGF-IR a byla analyzována vazebná a disociační kinetika interakcí mezi anti-IGF-IR protilátkami a extracelulámí doménou IGF-IR. Data byla vyhodnocena globální shodou dle Langmuira 1:1, s použitím modelů posunu základní linie, které jsou ze software BIAevaluation poskytovaného BIAcore.
Protokol 2
Měření na přístroji BIAcore byla prováděna v podstatě tak, jak bylo popsáno autory Fagerstam et al., „Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping.“ J. Mol. Recog. 3: 208-214., 1990.
-45CZ 301712 B6
Tabulka I uvádí v seznamu měření afinity pro zástupce anti-IGF-IR protilátek podle předkládaného vynálezu.
Tabulka I
Monoklonální Ka (M) Kd (M)
protilátka Protokol 1 Protokol 2
2.12.1 7,37 x IO'9
2.13.2 3,5 x IO5 1,53 x 10’3
2.14.3 6,41 x 10'1
3.1.1 1,15 x 10-9
4.9.2 6,84 x 10'lu 4,27 x 1O'1U
4.17.3 13 x 10’á
6.1.1 5,65 x 10’1
Kinetické analýzy vyjadřují, že protilátky připravené podle vynálezu mají vysoké afinity a silné vazebné konstanty pro extracelulámí doménu IGF-IR.
Příklad IH
Protilátkou zprostředkovaná inhibice IGF-I-indukované fosfory láce IGF-IR is Byly prováděny experimenty ELISA, aby se určilo, zda protilátky podle tohoto vynálezu jsou schopné blokovat IGF-I-zprostředkovanou aktivaci IGF-IR. IGF—I— zprostředkovaná aktivace IGF-IR byla detekována zvýšenou fosfoiylací tyrosinu spojenou s receptorem.
Příprava ELISA destiček
Byly připraveny ELISA záchytné destičky přidáním 100 μΐ blokovacího pufru (3% bovinní sérový albumin [BSA] v Tris-pufrováném fyziologickém roztoku [TBS]) do každé jamky 96 jamkových destiček potažených ReactiBind Protein G (Pierce) a destičky byly inkubovány za třepání po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Králičí pan-specífická SC-713 anti-IGF-IR protilátka byla naředěna (Santa Cruz) v blokovacím pufru na koncentraci 5 pg/m 1 a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ naředěné protilátky. Destičky byly inkubovány za třepání po dobu 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem (TBS+ 0,1 % Tween 20) a zbývající pufr byl jemně odsát na papírových ručníkách. Před přidáním lyzátů nebyly destičky ponechány vyschnout.
Příprava lyzátů z IGF-IR-exprimujících buněk
Buňky NIH-3T3 transfekované IGF-IR byly vloženy (5xl04/ml) do 100 μΐ růstového média (DMEM médium s vysokým obsahem glukózy doplněné 0,29 mg/ml L-glutaminu, 10% teplem inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu na 96 jamkové destičky se dnem jamek ve tvaru U. Destičky byly přes noc inkubovány ve 37 °C, 5% CO2, aby se umožnilo přichycení buněk. Médium bylo slito z destiček a nahrazeno 100 μΐ čerstvého růstového média na jamku. Pro testování byly potenciální anti-IGF-IR protilátky naředěny na pětinásobek požadované konečné koncentrace v růstových médiích a přidány po 25 μΐ na jamku.
-46CZ 301712 Bó
Všechny vzorky byly testovány v trojím opakování. Pak byly destičky ínkubovány ve 37 °C po dobu jedné hodiny. Buňky byly stimulovány 25 μΙ/jamka IGF-I v koncentraci 600 ng/ml (připraveno v růstovém médiu) a destičky byly ínkubovány při teplotě místnosti po dobu minut. Pak bylo médium slito převrácením destiček a jemným osušením na papírových ručníkách a adherované buňky byly lyžovány přidáním 50 μί lyzačního pufru (50mM HEPES, pH7,4, lOmM EDTA, 150mM NaCl, l,5mM MgCl2, l,6mM NaVO4, 1% Triton X-100, 1% glycerol, doplněný bezprostředně před použitím jednou tabletou inhibitoru proteázy bez EDTA [Roche Molecular Sciences] na 50 ml) a třepány po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Do každé jamky bylo přidáno 200 μΐ ředicího pufru (50mM HEPES, pH 7,4, 1,6 mM NaVO4) a mícháno io opakovaným pipetováním. 100 μΐ lyzátu z každé jamky bylo přeneseno do každé jamky ELISA záchytné destičky připravené tak, jak bylo popsáno výše a inkubováno za jemného třepání po dobu dvou hodin při teplotě místnosti.
ELISA s protilátkami anti-tyrosinfosfát (pTYR)
Buněčný lyzát byl odstraněn převrácením destiček, destičky byly promyty pětkrát promývacím pufrem a osušeny na papírových ručníkách. Na jamku bylo přidáno 100 μΐ pTYR-specifické protilátky (HRP-PY54) naředěné blokovacím pufrem na koncentraci 0,2 pg/ml a destičky byly ínkubovány za třepání po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem a osušeny na papírových ručníkách.
Vazba HRP-PY54 protilátky byla detekována přidáním 100 μί TMB peroxidázového substrátového roztoku (Kirkegaard & Perry) na jamku a inkubací za třepání při vývoji barvy (přibližně 2 až 10 minut). Rozvoj barevné reakce byl zastaven přidáním 100 μί na jamku TMB stopovacího roztoku (Kirkegaard & Perry). Pak byly destičky třepány po dobu 10 sekund při teplotě místnosti, aby se roztok promíchal a kvantifikovány měřením v OD4í0nm.
Tabulka II a obrázek 4 ukazují výsledky tohoto experimentu prováděného s několika protilátkami podle vynálezu. Výsledky tohoto experimentu demonstrují schopnost protilátek podle tohoto vynálezu blokovat IGF-I-zprostředkovanou aktivaci IGF-IR, jak ukázáno zvýšenou fosforylací tyrosinu spojenou s receptorem. Kromě toho mohou být tyto výsledky použity pro kvantifikaci relativní účinnosti protilátek podle tohoto vynálezu.
Tabulka II
Monokíonální protilátka IC50 (μς/πιΐ)
2.12.1 0,172
2.13.2 0,0812
2.14.3 0,325
4.9.2 0,0324
Příklad IV
Protilátkou zprostředkovaná blokáda vazby IGF-I/IGF-IR
Byly prováděny ELISA experimenty pro kvantifikaci schopnosti protilátek podle vynálezu inhibovat IGF-I vazbu k IGF-IR v testu založeném na buňkách. Na 96 jamkové destičky se dnem jamek ve tvaru U byly naneseny buňky NIH-3T3 transfekované IGF-IR (5xl04/ml) do
-47CZ 301712 B6
100 μΐ DMEM média s vysokým obsahem glukózy doplněného 0,29 mg/ml L-glutaminu,
10% teplem inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého zgeneticinu, penicilinu a streptomycinu.
Pak byly destičky přes noc inkubovány ve 37 ŮC, 5% CO2, aby se umožnilo přichycení buněk.
Médium bylo slito z destiček a nahrazeno 100 μΙ čerstvého růstového média na jamku. Pro testování byly protilátky nareděny v testovacím médiu (DMEM médium s vysokým obsahem glukózy doplněné L-glutaminem, 10% teplem inaktivovaným FBS, 200 pg/ml BSA a 500 pg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu) na požadovanou konečnou koncentraci a na jamku bylo přidáno 50 pl. Všechny vzorky byly prováděny v trojím opakování. Pak byly destičky inkubovány ve 37 °C po dobu deseti minut. [125I]-IGF-1 byl nareděn na koncentraci ίο 1 pCi/ml v testovacím médiu a do každé jamky destičky bylo přidáno 50 pl. Jako kontrola pro radioaktivitu pozadí byl přidán neznačený IGF—I do konečné koncentrace 100 ng/ml. Destičky byly inkubovány po dobu 10 minut ve 37 °C, média byla slita, destičky byly jemně osušeny na papírových ručníkách a promyty dvakrát testovacím médiem. Pak byly buňky lyžovány přidáním 50 pl 0,lN NaOH, 0,1% SDS a destičky byly třepány pět minut při teplotě místnosti. Pak byly vzorky přeneseny na scintilační destičku, přidáno 150 pl OptiPhase Supermix a signály odečítány na počítači Wallac Micro-Beta.
Tabulka III a obrázek 3 ukazují výsledky tohoto experimentu prováděného se třemi reprezentativními protilátkami podle vynálezu.Tento experiment demonstroval, že protilátky podle vynálezu specificky inhibují vazbu [I2SI]—IGF—I k buňkám nadměrně exprimujícím IGF-IR.
Tabulka III
Monoklonální protilátka IC50
2.12.1 0,45 pg/ml
2.13.2 0,18 pg/ml
4.9.2 0,1 pg/ml
Příklad V
Studie mapování epitopu
Při dokazování, že protilátky podle vynálezu rozpoznávají IGF-IR, byly prováděny studie mapování epitopu s několika protilátkami podle vynálezu. Tyto experimenty byly konkrétně zaměřeny na protilátky 2.12.1,2.13.2,2.14.3 a 4.9.2.
Byly prováděny kompetitivní studie na přístroji BIAcore pro určování, zda se protilátky podle tohoto vynálezu vážou ke stejnému nebo odlišnému místu na IGF-IR molekule. Extracelulámí doména (ECD) IGF-IR byla navázána k senzorovému čipu BIAcore, jak bylo popsáno výše v příkladu II. První protilátka podle vynálezu byla navázána k tomuto IGF-IR navázaném na senzorovém čipu v saturujících podmínkách. Pak byla měřena schopnost následných sekundárních protilátek podle vynálezu kompetovat s primární protilátkou o vazbu k IGF-IR. Tato technika umožnila přiřadit protilátky podle tohoto vynálezu k různým vazebným skupinám.
Tento experiment byl prováděn s protilátkami 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 a 4.9.2. Bylo pozorováno, že
2.13.2 a 4.9.2 kompetovaly o stejné místo na extracelulámí doméně IGF-IR. Další protilátky,
2.12.1 a 2.14.3, se vážou k místům na IGF-IR, která jsou odlišná od sebe navzájem a od místa vázaného 2.13.2 a 4.9.2.
-48CZ 301712 B6
Příklad VI
Druhová zkřížená reaktivita protilátek podle vynálezu
Aby se určila druhová zkřížená reaktivita protilátek podle vynálezu, bylo prováděno několik experimentů včetně imunoprecipitace, protilátkou zprostředkované blokády IGF-I-indukované fosforylace receptoru a analýza FACS.
Pro provádění imunoprecipitačních pokusů byly buňky naneseny do T25 láhví s DMEM médiem s vysokým obsahem glukózy doplněným 0,29 mg/ml L-glutaminu, 10% teplem inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu do 50% konfluence. Pak bylo přidáno 100 μΐ protilátky podle vynálezu v Hankově pufrovaném fyziologickém roztoku (HBSS, Gibco BRL) v koncentraci 1 pg/ml. Destičky byly inkubovány po dobu 30 minut ve 37 °C v inkubátoru, a pak byly buňky stimulovány IGF-I v koncentraci 100 ng/ml po dobu 10 minut při is teplotě místnosti. Buňky byly lyžovány v RIPA pufru (Harlow a Lané, výše) a imunoprecipitovány IGF-IR s 2 pg pan-specifícké SC-713 anti-IGF-IR protilátky (Santa Cruz) plus protein A agarózovými perličkami po dobu 1 hodiny ve 4°C. Perličky byly peletovány a byly třikrát promyty PBS/T (PBS +0,1% Tween-20), a pak byly perličky povařeny ve 40 pl Laemmliho pufru obsahujícím 5% β-ΜΕ.
Vzorky připravené tak, jak bylo popsáno výše, pak byly analyzovány technikou Western blot. 12 pl každého vzorku na dráhu bylo naneseno na gely Novex™ s 4 až 10% gradientem provozované v lx MES pufru (Novex™). Gely byly prováděny ve 150 V po dobu 1 hodiny nebo ve 200V po dobu přibližně 30 minut. Pak byly gely přeneseny na membránu v Novex™ přenosovém pufru s 10% methanolem buď přes noc ve 100 mA, nebo po dobu 1-1,5 hodiny ve 250 mA. Pak byla membrána ponechána úplně uschnout a blokována pri teplotě místnosti pufrem TBS (Trisem pufrovaný fyziologický roztok, pH 8,0) obsahujícím Superblock (Pierce Chemical Co.). Pro detekci imunoprecipitovaného IGF-IR byla přidána IGF-IR blotovací protilátka SC713 (Santa Cruz).
Tento experiment byl prováděn s protilátkami podle vynálezu, konkrétně 2.12.1, 2.13.2, 4,17.3 a 4.9.2, na buňkách z celé rady zvířat. Bylo zjištěno, že protilátky 2.12.1, 2.13.2 a 4.9.2 byly schopny vázat humánní, ale ne psí, morčecí nebo králičí IGF-IR. Dále byly tyto protilátky schopny vázat IGF-IR z COS7 a opic Rhesus, pocházející z opic Starého světa, ale ne IGF-IR z marmoseta, což je opice z Nového světa. Tyto experimenty ukazují, že protilátky jsou vysoce specifické.
Protilátkou zprostředkovaná blokáda vazby IGF-I/IGF-IR u primátů jiného než lidského původu
Po pozorování, že protilátky podle vynálezu rozpoznávají IGF-IR z opic Starého světa, byla také testována jejich schopnost blokovat vazbu IGF-I/IGF-IR v buňkách pocházejících z těchto opic Starého světa. Buňky byly naneseny do T25 láhví sDMEM médiem s vysokým obsahem glukózy doplněným s L-glutaminem, 10% teplem inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu do 50% konfluence. Pak byla přidána protilátka podle vynálezu nebo médium bez protilátky jako kontrola a buňky byly stimulovány IGF-I v koncentraci 100 ng/ml po dobu 10 minut pri teplotě místnosti. Po stimulaci buňky byly lyžovány a imunoprecipitovány IGF-IR s pan-specifíckou IGF-IR protilátkou SC713, jak bylo popsáno výše. Pak byla prováděna analýza Western blot, jak bylo popsáno výše, s použitím HRP-PY54 protilátky pro detekci fosforylovaného tyrosinu v aktivovaném IGF-IR.
Bylo zjištěno, že protilátky podle tohoto vynálezu, konkrétně 2.13.2 a 4.9.2, mohou blokovat
IGF-I indukovanou fosforylaci IGF-IR v buňkách COS7 i Rhesus. Hodnota IC50 pro pozorovanou inhibici byla 0,02 pg/ml a 0,005 pg/ml pro IGF-IR COS7 a Rhesus, v daném poradí.
-49CZ 301712 B6
Stanovení mezidruhové (zkřížené) afinity protilátek podle vynálezu
Byla prováděna FACS analýza pro určování afinity protilátek podle vynálezu pro IGF-IR z ostatních zvířat, konkrétné opic Starého světa popsaných výše. Byly inkubovány alikvoty humánních a opičích buněk (5x105) po dobu 1 hodiny na ledu se stoupající koncentracemi biotinylovaných anti-IGF-IR protilátek podle vynálezu nebo s biotinylovanou protilátkou antihemokyanin přílipky (KLH) (Abgenix) jako negativní kontroly. Pak byly vzorky inkubovány po dobu 30 minut na ledu s RPE (fykoerytrin) konjugovaným se streptavidinem. Vazba byla měřena průtokovou cytometrií a analyzována histogramy intenzity fluorescence (F12-H) proti počtu io buněk s použitím software CellQuest. Vazba (IQ) byla vypočtena pro každou protilátku z grafů průměrné intenzity fluorescence proti koncentraci protilátky. Ve většině experimentů byla měřena vazba v pěstovaných humánních buňkách MCF-7 a buňkách tkáňových kultur makaků rhesus (Macaca mullata) nebo cynomologus (M, fascicularis). Deplece protilátky byla kontrolována měřením vazby v rozsahu koncentrací buněk.
Výše uvedená FACS analýza byla prováděna pro testování schopnosti protilátek podle vynálezu, konkrétně 2.13.2 a 4.9.2, vázat se na humánní buňky a buňky makaků rhesus (Macaca mullata) nebo cynomologus (M. fascicularis). Byla pozorována poloviční maximální vazba (IQ) OJ μίξΛηΙ pro všechny testované buněčné linie.
Příklad VII
Down-regulace receptoru IGF-I
Byly prováděny blokující experimenty v podstatě tak, jak bylo popsáno výše v příkladu IV, až po přidání IGF-I značeného [l2íI], V tomto bodě byly buňky povařeny ve 40 μΐ Laemmliho pufru obsahujícího 50% ME. Vzorky pak byly analyzovány analýzou Western bloty, jak bylo popsáno výše v příkladu VI, a bloty byly zkoušeny s pan-specifickou IGF-IR protilátkou SČ7I3 ke kvantifikaci hladin IGF-IR a s protilátkou HRP-PY54 ke sledování hladin fosforylovaného tyrosinu v aktivovaném IGF-IR.
Jak bylo pozorováno dříve (příklad III), byla zjištěna blokáda IGF-I indukované fosforylace IGF-IR po ošetření buněk protilátkou podle tohoto vynálezu (obrázek 4). Dále bylo pozorováno, že tato blokáda IGF-I indukované fosforylace byla následována down-regulací IGF-IR v těchto buňkách. Viz např. obr, 4,, IGF-IR hladiny byly maximálně redukovány 16 hodin po stimulaci s IGF-I v přítomnosti protilátky podle vynálezu.
Příklad Vlil
Účinky protilátek podle vynálezu na IGF-IR in vivo
Bylo zjišťováno, zda účinky protilátek podle vynálezu na IGF-IR, jak byly popsány v předcho45 zích příkladech, by nastaly in vivo. V athymických myších byly indukovány nádory podle publikovaných metod (V. A. Pollack et al,, „Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in šitu and antitumor effects in athymic mice, Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748,
1999). Krátce, buňky NIH-3T3 transfekované IGF-IR (5x106) byly injikovány subkutánně athy50 mickým (nu/nu) myším ve věku 3 až 4 týdnů s 0,2 ml přípravku Matrigel. Pak byly myši intraperitoneálně injikovány protilátkou podle vynálezu poté, co se vytvořily stabilní nádory (tj.
přibližně 400 mm3).
Po 24 hodinách byly nádoiy extrahovány, homogenizovány a byla určena hladina IGF-IR. Aby se určily hladiny IGF-IR, byla SC—713 protilátka naředěna v blokovacím pufru na konečnou
-50CZ 301712 B6 koncentraci pg/ml a 100 pl bylo přidáno do každé jamky destičky potažené Reacti-Bind kozí anti—králičí protilátkou (GAR) (Pierce). Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu hodiny za třepání a pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem. Pak byly zváženy vzorky nádorů, které byly připraveny tak, jak bylo popsáno výše, a homogenizovány v lyzačním pufru v množství 1 ml/100 mg. 12,5 μΐ nádorového extraktu bylo naředěno lyzačním pufrem na konečný objem 100 μΐ a toto bylo přidáno do každé jamky 96 jamkové destičky. Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti za třepání po dobu 1 až 2 hodin, a pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem. Pak bylo přidáno 100 μΐ HRP-PY54 nebo biotinylované antiIGF-IR protilátky v blokovacím pufru do každé jamky a inkubováno při teplotě místnosti za io třepání po dobu 30 minut. Pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem a destičky byly vyvolány. Destičky testované s HRP-PY54 byly vyvolány přidáním 100 μΐ TMB mikrojamkového substrátu na jamku a rozvoj barvy byl zastaven přidáním 100 μΐ 0,9M H2SO4. Pak byl signál kvantifikován třepáním po dobu 10 sekund a měřením OD45(}ntn. Signál byl normalizován k celkovému proteinu. Destičky zkoušené s anti-IGF-IR protilátkou byly vyvolány přidáním
100 μΐ streptavidinu-HRP naředěného v blokovacím pufru do každé jamky, inkubací při teplotě místnosti za třepání po dobu 30 minut, a pak bylo pokračováno tak, jak bylo popsáno pro HRP-PY54.
Bylo zjištěno, že intraperitoneální injekce protilátky podle tohoto vynálezu, obzvláště 2.13.2 a 4.9.2, měla za následek inhibicí IGF-IR aktivity, jak bylo měřeno poklesem [obou IGF-IR fosfotyrosinu (fosforylovaného IGF-IR) a] celkového IGF-IR proteinu (obrázek 6). Kromě toho byl také pozorován pokles IGF-IR fosfotyrosinu (fosforylovaného IGF-IR) (obrázek 5). Bez vazby na kteroukoliv teorii snížené hladiny IGF-IR fosfotyrosinu mohou být způsobeny sníženými hladinami IGF-IR proteinu in vivo po ošetření protilátkou nebo mohou být způsobeny kombinací snížených hladin IGF-IR proteinu a poklesem fosforylace tyrosinu na IGF-IR, která je přítomná díky blokádě aktivace ligandem (např. IGF-I nebo IGF—II). Kromě toho tato inhibice byla citlivá na dávku injikované protilátky (obrázek 6). Tato data dokazují, že protilátky podle vynálezu jsou schopny cílit IGF-IR in vivo způsobem analogickým způsobu, který byl pozorován in vitro.
Příklad IX
Inhibice růstu (TGI) 3T3/IGF-IR buněčných nádorů
Bylo testováno, zda anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu by působily na inhibicí nádorového růstu. Nádory byly indukovány tak, jak bylo popsáno výše (příklad VIII) a když se vytvořily ustavené zřetelné nádory (tj. 250 mm3, během 6 až 9 dnů), byly myši ošetřeny jednou dávkou 0,20 ml protilátky intraperitoneální injekcí. Velikost nádoru byla měřena Vemierovým kaliperem ve dvou průměrech každý třetí den a objem byl vypočten s použitím vzorce (délka x [šířka]2)/2 s použitím metod zavedených autory Geran, et al., „Protocols for screening Chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems“, Cancer Chemother, Rep.3: 1-104.
Když byla prováděna tato analýza s protilátkou podle vynálezu, bylo zjištěno, že jedno ošetření protilátkou 2.13.2 samotnou inhibovalo růst nádorů indukovaných NIH-3T3 buňkami transfekovanýmí IGF-IR (obrázek 7, levý panel). Kromě toho, v kombinačních studiích s jednou dávkou 7,5 mg/kg intravenózně podávaného adriamycinu bylo pozorováno, že podávání jedné dávky 2.13.2 zesílilo účinnost adriamycinu, známého inhibitoru nádorového růstu. Kombinace adriamycinu $ protilátkou podle vynálezu, 2.13.2, vykázala zpoždění růstu 7 dnů oproti léčbě samotnou protilátkou nebo samotným adriamycinem (obrázek 7, pravý panel).
-51 CZ 301712 B6
Příklad X
Vztah hladin protilátek k down-regulaci IGF-IR
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu VIII. Myši pak byly ošetřeny 125 pg 2.13.2 intraperitoneální injekcí, jak bylo popsáno v příkladu Vlil. Nádory byly extrahovány a hladiny IGF-IR byly měřeny testem ELISA tak, jak bylo popsáno v příkladu Vlil. Obrázek 8 ukazuje sérové hladiny protilátky 2.13.2 a hladiny receptorů IGF-IR v průběhu času. Experiment demonstruje, že IGF-IR je down-regulován protilátkou a že stupeň IGF-IR inhibice io je dle dávky úměrný sérové koncentraci protilátky.
Příklad XI
Inhibice růstu 3T3/IGF-IR nádorů mnohonásobnou dávkou protilátky v kombinaci sadriamycinem
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Myši s ustavenými subkutánnímí nádory o velikosti přibližně 250 mnr byly ošetřeny ve dnech 1, 8, 15 a 22 různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo adriamycinem v dávce 7,5 mg/kg (i.v.), buď jako jednotlivými agens, nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 9 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu Času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou každých sedm dnů inhibuje růst nádorových buněk a zvýší inhibici růstu nádorových buněk v kombinaci s adriamycinem, známým nádoro25 vým inhibitorem.
Příklad XII
Inhibice růstu velkých nádorů
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Myši s velkými ustavenými subkutánnímí nádory trochu menšími než 2000 mm3 byly ošetřeny ve dnech 1 a 8 různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo adriamycinem v dávce 7,5 mg/kg (i.v.), buď jako jednotlivými agens, nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 10 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Kontrolní skupina zvířat, skupina zvířat se samotnou protilátkou a samotným adriamycinem byly ukončeny v den 5, když velikost nádoru překročila 2000 mm3. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou v kombinaci s adriamycinem je vysoce účinné proti velkým nádorům, když jsou podávány mnohonásobné dávky.
Příklad XIII
Inhibice růstu buněk kolorektálních nádorů
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX kromě toho, že byly použity buňky Colo 205 (ATCC CCL 222). Colo 205 buňky jsou buňky humánního kolorektálního adenokarcinomu. Myši s ustavenými subkutánnímí nádory o velikosti přibližně so 250 mm3 byly ošetřeny různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo 5-fluordeoxyuridinem (5-FU, i.v.) v dávce 100 mg/kg, buď jako jednotlivými agens, nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 11 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou inhibuje růst buněk humánního kolorektálního karcinomu, když byla poskytnuta jako jedno agens a zesiluje účinnost 5-FU, známého nádorového inhibitoru.
-52CZ 301712 B6
Myši s ustavenými Colo 205 nádory byly ošetřeny ve dnech 1,8, 15 a 22 s 500 pg 2.13.2 (i.p,),
100 mg/kg 5-FU (i.v.) nebo jejich kombinací. Obrázek 12 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou každých sedm dnů inhibuje růst buněk humánního kolorektálního karcinomu a zesiluje účinnost 5-FU.
Příklad XIV ío Inhibice růstu buněk karcinomu prsu
Nahým myším, jak byly popsány v příkladu VIII, byly implantovány biologicky rozložitelné tablety s estrogenem (0,72 mg 17-p-estradiol/tabieta, 60 dnů uvolňování. Innovative Research of America). Po 48 hodinách byly v nahých myších indukovány nádory v podstatě tak, jak bylo is popsáno v příkladu IX, kromě toho, že byly použity buňky MCF-7 (ATCC HTB-22). Buňky
MCF-7 jsou na estrogenů závislé buňky humánního karcinomu prsu. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 250 mm3 byly ošetřeny 50 pg protilátky 2.13.2 (i.p.) ve dnech 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 a 22 (q3dx7) nebo taxolem v dávce 6,25 mg/kg (i.p.) ve dnech 1, 2, 3,4,5 (gldx5), buď jako jednotlivými agens nebo v kombinací, v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 13 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času.
Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou samotnou inhibuje růst buněk humánního karcinomu prsu, když je podávána jednou každé tři dny, a také zesiluje účinnost taxolu, známého inhibitoru karcinomu prsu, když je podávána v kombinaci.
Myši s ustavenými nádory z buněk MCF-7, jak bylo popsáno bezprostředně výše, byly ošetřeny v den 1 různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) samotnou nebo s adriamycinem v dávce 3,75 mg/kg (i.v), v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 14 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment dokazuje, že jedno ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou samotnou inhibuje růst buněk humánního karcinomu prsu a zesiluje účinnost adriamycinu, známého nádorového inhibitoru.
Myši u stavenými nádory z buněk MCF-7, jak bylo popsáno bezprostředně výše, byly ošetřeny 250 pg protilátky 2.13.2 (í.p.) ve dnech 1, 8, 15 a 23 nebo biologicky rozložitelnou tabletou s tamoxifenem v dávce 25 mg/tableta (volná báze, 60 dnů uvolňování, Innovative Research of
America), buď jako jednotlivými agens, nebo v kombinaci, v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Tableta s tamoxifenem byla implantována v den 1 poté, co byl prokázán nádor. Obrázek 15 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou každých sedm dnů inhibuje samotné růst humánního karcinomu prsu a zesiluje účinnost tamoxifenu, známého nádorového inhibitoru.
Příklad XVI
Inhibice růstu buněk epidermoidního karcinomu
V nahých myších byly indukovány nádory v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX kromě toho, že byly použity buňky A431 (ATCC CRL 1555). Buňky A431 jsou buňky humánního epidermoidního karcinomu, které nadměrně exprimují EGFR. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 250 mm3 byly ošetřeny ve dnech 1,8, 15,22 a 29 s 500 pg protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo byly ošetřeny jednou denně po dobu 27 dnů s CP-358 774 v dávce 10 mg/kg, podávané perorálně (p.o.), buď jako jednotlivými agens, nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. CP-358 774 je popsána v patentu Spojených Států US 5 747 498 a v prácí autorů Moyer et al, Cancer Research, 57: 4838-4848, 1997, zahrnuto formou odkazu v tomto testu.
Obrázek 16 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment
-53CZ 301712 B6 demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou zesiluje účinnost CP-358 774, známého inhibitoru EGF-R tyrosinkinázy, v inhibici růstu humánního epidermoidního karcinomu.
Příklad XVH
Farmakokinetika anti-IGF-IR protilátek in vivo
Aby se vyhodnotila farmakokinetika anti-IGF-IR protilátek, cynomolgním opicím (Macaca io fascicularis) byla podávána intravenózní injekce protilátky 2.13.2 v acetátovém pufru v dávce 3, nebo 100 mg/kg. Opicím bylo odebíráno sérum v různých časových bodech a v období až deset týdnů byla určována koncentrace anti-IGF-IR protilátky u opic. Pro kvantifikaci funkčních sérových hladin protilátky byla extracelulámí doména humánního IGF-IR (IGF-IR-sR, R&D Systems, katalog. Č. 391GR) navázána na 96 jamkové destičky. Opičí sérum (naředěné mezi
1:100 a 1:15 000) bylo přidáno na testovací destičky tak, že každý vzorek byl v lineárním rozsahu kalibrační křivky a inkubován v podmínkách, ve kterých se každá anti-IGF-IR protilátka váže k IGF-I-sR. Po promytí destiček značená anti-humánní IgG protilátka byla přidána na destičky a inkubována v podmínkách, ve kterých se anti-humánní IgG protilátka váže k anti-IGF-IR protilátce. Destičky pak byly promyty a vyvolány a kontrolní kalibrační křivka a její lineární regrese byly použity pro kvantifikaci množství anti-IGF-IR protilátky. Obrázek 17 ukazuje koncentraci z 2.13.2 v séru v průběhu času. Experiment demonstruje, že poločas anti-IGF-IR protilátky je 4,6 až 7,7 dnů a má distribuční objem 74 až 105 ml/kg. Dále experiment demonstruje, že podávaná množství jsou u opic úměrná dávce, což ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka saturovala každé dostupné IGF-IR vazebné místo v organismu dokonce i v nej nižší dávce 3 mg/kg.
Příklad XVIII
Kombinační léčba anti-IGF-IR protilátkou a adriamycinem down-reguluje IGF-IR in vivo
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 400 mm3 byly ošetřeny jednou injekcí 250 gg protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo adriamycinem v dávce 7,5 mg/kg (i.v.), buď jako jednotlivými agens, nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. 72 hodin po podávání agens byly nádory extrahovány, jak bylo popsáno v příkladu VIII, a stejná množství nádorových extraktů byla podrobena elektroforéze v polyakrylamidovém gelu s dodecylfosfátem sodným (SDS-PAGE) a analýze Western blot s použitím anti-IGF-IR protilátky SC-713 (Santa Cruz), Obrázek 18 ukazuje množství IGF-IR v nádorových buňkách u kontrolních zvířat (první tří dráhy každého panelu), u zvířat ošetřených samotnou protilátkou (homí panel), u zvířat ošetřených samotným adriamycinem (prostřední panel) a u zvířat ošetřených protilátkou a adriamycinem (spodní panel). Každá dráha reprezentuje stejné množství proteinu z jednotlivých nádorů od individuálních myší. Experiment demonstruje, že ošetření adriamycinem samotným má malý účinek na hladiny IGF-IR, a že ošetření samotnou protilátkou ukazuje určitý pokles hladin IGF-IR. Překva45 pivě, léčba adriamycinem a protilátkou společně ukazuje dramatický pokles hladin IGF-IR, což demonstruje, že adriamycin a protilátka značně down-regulují hladiny IGF-IR.
Všechny publikace a patentové přihlášky, které byly citovány v tomto popisu, jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu, jako by každá jednotlivá publikace nebo patentová přihláška byla specificky a individuálně uvedena jako zahrnutá formou odkazu. Ačkoli některé detaily předkládaného vynálezu byly popsány ilustrativním způsobem a pomocí příkladů pro účely lepšího porozumění, odborníkům v oboru je zřejmé ve světle nauky tohoto vynálezu, že určité změny a modifikace mohou být vytvořeny bez odchýlení se od vynálezecké myšlenky nebo rozsahu připojených patentových nároků.
-54CZ 301712 B6
Seznam sekvencí <160> 60 < 170> Patentln Ver. 2.1 <21O> 1 <211> 291 <212> DNA io <213> Homo Sapiens <400> 1 tgcatctgta ggagaoagag tcaccttcac tttaggctgg tatcagcaga aaccagggaa cegtttacaa agtggggtcc catcaaggtt tctcacaatc agcagcctgc agcctgaaga taattatcct cggacgttcg gccaagggac ttgccgggca agtcaggaca ttagacgtga 60 agctcctaag cgcctgatct atgctgcatc 120 cagcggcagt ggatctggga eagaatfccac 180 ttttgcaact tattactgtc tacagcataa 240 cgaggtggaa atcatacgaa c 291 <210> 2 <211> 136 <212>PRT <213> Homo Sapiens <400> 2
Ala Ser Val Gly Aap Arg Val Thr Phe Thr Cya Arg Ala Ser Gin Asp
1 5 10 15
Ile Arg Arg Asp Leu 20 Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 25 Gly Lye Ala Pro 30
Lya Arg Leu 35 Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser 40 Gly Val Pro Ser 45
Arg Phe Ser 50 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 55 60 Leu Thr Ile Ser
Ser Leu Gin 65 Pro Glu Aep Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 70 75 Leu Gin His Aen 80
Asn Tyr Pro Arg Thr 85 Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val 90 Glu Tle Ile Arg 95
Thr Val Ala Ala Pro 100 Ser val Phe Ile Phe Pro Pro 105 Ser Aep Glu Gin 110
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Aen Aen Phe Tyr
115 120 125
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp
130 135 <210 3 <211>352 <212> DNA <213> Homo Sapiens
-55CZ 301712 B6 <400> 3 gggaggcttg gtcaagcctg gaggtccctg agactctcct gtgcagcctc cggattcact 60 ttcagtgact actatatgag ctggatccgc caggctccag ggaaggggct ggaatgggfct 120 tcatacatta gtagtagtgg tagtaccaga gactacgcag actctgtgaa gggccgattc 180 accatctcca gggacaacgc caagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 240 gaggaoacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga gatggagtgg aaactacttfc ttactaetac 300 tactacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtqtcctc ag 352 <210>4 <211> 174 <212>PRT <213> Homo Sapiens <400> 4
Gly 1 Arg Leu Gly Gin Ala Trp Arg Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala
5 10 15
Ser Gly Phe Thr Phs Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp ile Arg Gin Ala
20 25 30
Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Zle Ser Ser Ser Gly Ser
35 40 45
Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg
50 55 60
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Aep Gly Val Glu Thr Thr
85 90 95
Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Oly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lyg Gly Pro Ser val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys ser Arg Ser Thr ser Glu ser Thr Ala Ala Leu Gly cys
130 135 140
Leu Val Lye Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr val Ser Trp Asn· Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Cys Ala
165 170 io <210>5 <211> 322 <212>DNA <213> Homo Sapiens
-56CZ 301712 B6 <400> 5 gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcaettgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatcccgtt tgcacagagg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtttacaa cataatagtt acccgtgcag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa ac 322 <210>6 <211> 107 <212>PRT <213> Homo Sapiens
<400> 6
Asp Ile Gin Met Thr Gin Phe Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Asp
20 2S 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Sis Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn ser Tyr Pro Cya
85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<2W>1 io <211>375 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 7 aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct 60 cctgtacagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gaactgggtc cgccaggctc 120 cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtacc acattctacg 180 cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaggacc acgctgtatc 240 tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagatcttg 300 gctggtccga ctcttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg 360 <21O>8 <211> 124 <212> PRT <213> Homo Sapiens
-51CZ 301712 B6 <400> 8
Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ser
1 S 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Asn Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
35 40 45
Ala Ile ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg ASp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cy» Ala
85 90 95
Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyť Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr Val Ser Ser
115 120 <210>9 <211> 302 <212>DNA <213> Homo Sapiens <4GO> 9 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccttca cttgccgggc aagtcaggac 60 attagacgtg atttaggctg gtateagcag aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc 120 tatgctgcat cccgtttaca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg 180 acagaattca ctctcacaat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttattactgt 240 ctacagcata ataattatcc tcggacgttc ggccaaggga ccgaggtgga aatcatacga 300 ac 303 <210> 10 io <211>100 <212> PRT <213> Homo Sapiens
-58CZ 301712 Bó <400> 10
ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly Aep Arg val Thr Phe Thr Cys Arg
1 5 10 15
Ala ser Gin Aep Ile Arg Arg Aep Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
20 25 30
Oly Lya Ala Pro Lya Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser
35 40 45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
50 55 50
Leu Thr ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
05 70 75 80
Leu Glu His Aon Aen Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val
90 95
Glu Ile Ile Arg 100 <210 11 <211> 338 <212>DNA <213> Homo Sapiens <400> 11 gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cc tgt c cctc acctgcactg tctctggtgg 60 ctccatcagt aattactact ggagctggat ccggcagccc gccgggaagg gactggagtg 120 gattgggcgt atctatacca gtgggagccc caactacaae ccctccctca agagtcgagt 180 caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg aagctgaact ctgtgaccgc 240 cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt ggagtggtta ttatctttga 300 ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 338 <210> 12 10 <211> 112 <212> PRT <213> Homo Sapiens
-59CZ 301712 Bó <400> 12
Gly 1 Pro Gly Leu Val 5 Lys Pro Ser GlU Thr Leu 10 Ser Leu Thr Cys IS Thr
val ser Gly Gly 20 Ser Ile ser Asn Tyr Tyr Trp 25 Ser Trp ile 30 Arg Gin
Pro Ala Gly Lys 35 Gly Leu Glu Trp 40 Ile Gly Arg Ile Tyr 45 Thr Ser Gly
Ser Pro 50 Asn Tyr Asn Pro Ser 55 Leu Lys Ser Arg Val óo Thr Met Ser Val
Asp €5 Thr Ser Lys Asn Gin 70 Phe Ser Leu Lys Leu 75 Asn Ser val Thr Ala 80
Ala Asp Thr Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Ala Val Thr 90 Ile Phe Gly val 95 Val
Ile Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ser 100 105 110 <210> 13 <21l> 322 <212>DNA <213> Homo Sapiens <400> ll gacatceaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagcgcct aggttcagcg gcagtggatc gaagattttg caacttatta gggaccaagg tggagatcaa tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 gggcattaga agtgatttag gctggtttca gcagaaacca 120 gatctatgct gcatccaaat tacaccgtgg ggtcccatca 180 tgggacagaa ttcactctca caatcagccg cctgcagcct 240 ctgtctacag cataatagtt accctctcac tttcggcgga 300 ac 323 <210 14 o <211>107 <212> PRT <213> Homo Sapiens
-60CZ 301712 Bó c400> 14
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5
Aep Arg val Thr Ile Thr Cye Arg 20
Leu Gly Trp Phe Gin Gin Lys Pro 35 40
Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Hle Arg 50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 65 70
Glu ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 05
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Val 100
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Ala ser Gin Gly Ile Arg Ser Asp 25 30
Gly Lye Ala Pro Lys Arg Leu Ile 45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gin Pro 75 80
Leu Gin Hia Asn Ser Tyr Pro Leu 90 95
Glu Ile Lys
105 <210> 15 <211> 376 <212>DNA <213> Homo Sapiens <400> 15 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaeatga acagcctgag agccgaggac ggctacggtg acttttacta ctactactac gtcaccgtct cctcag ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 agctatgcca tg&gctgggt ccgccaggct 120 attagtggta gtggtggtat cacatactac ibo tecagagaca ačtccaagaa cacgctgtat 240 acggccgtat attactgtgc gaaagatctg 300 ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 350
375
-61CZ 301712 B6 <210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 16
Glu 1 Val Gin Leu Leu 5 Glu ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cya Ala Ala Ser Gly 25 Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 40 Lys Gly Leu Glu 45 Trp val
ser Ala 50 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr 55 Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile 70 Ser Arg Aap Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gin Met Aan Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Lys Asp Leu Gly Tyr Gly Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr val Ser Ser 115 120 125 <210> 17 <211> 279 <212> DNA io <213> Homo Sapiens <400> 17 caggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagtacc tttttaaatt 60 ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccfca aactcctgat ccatgttgea tccagtttac 120 aag^tggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca 180 tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactaetg tcaacagagt tacaatgccc 240 cactcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaac 279 <210> 18 <211> 92 <2I2>PRT <213> Homo Sapiens <400> 18
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Thr 15 10 15
Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
25 30
-62CZ 301712 B6
Ila His Val Ala Ser Ser Leu Gin Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser ser Leu Gin
50 55 60
Pro GlU Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asn Ala Pro
65 70 75 80
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
90 <210> 19 <211> 341 <212>DNA <213> Homo Sapiens <400> 19 cqqaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc 60 catcagtagt tactactgga gttggatccg gcagccccca gggaagggac tggagtggat 120 tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga gtcgagtcac ISO catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag títgagttctg tgaccgctgc 240 ggacacggcc gtgtattact gtgccaggac gtatagcagt tcgttctact actacggtat 300 ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca g 341 <210> 20 10 <211>U3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 20
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu ser Leu Thr Cye Thr val
1 5 10 15
Sex Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr m Trp ser Trp Ile Arg Gin Pro
20 25 30
Pro Gly Ly* Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser
35 40 45
Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val λβρ
50 55 60
Thr Ser Lya Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu ser Ser Val Thr Ala Ala
45 70 75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr ser Ser Ser Phe Tyr
85 90 95
Tyr Tyr Gly Met Aap val Trp Gly Gin Oly Thr Thr Val Thr Val ser
100 105 110
Set
-63CZ 301712 B6 <21Ο> 21 <211> 274 <212>DNA <213> Homo Sapiens <220>
<221> modifikovaná báze <222> (240) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 21 agagccaccc tctcctgtag ggccagtcag agtgttcgcg gcaggtactt agcctggtac 60 cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg gtgcatccag cagggccact 120 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 180 agactggagc ctgaagattt tgcagtgttt tactgtcagc agtatggtag ttcacctcgn 240 acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaac 274 <210> 22 <211> 91 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 22
Arg 1 Ala Thr Leu Ser Cya Arg Ala Ser Gin Ser Val Arg Gly Arg Tyr
5 10 15
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile
20 25 30
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
35 40 45
Ser Gly ser Gly Thr Aep Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
50 55 60
Olu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Arg
es 70 75 80
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
85 90
<210> 23 <21 i> 367 <212>DNA <213> Homo Sapiens <400> 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caogctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcca 300 gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcag 367
-64CZ 301712 B6 <2l0> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Homo Sapiens <40Q> 24
Olu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 is
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 ser Gly ne Thr Gly ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Aan Ser Lys Aan Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Txp Phe Aap Pro Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 320 <212>DNA io <213> Homo Sapiens <400> 25 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc gotfceaacag gggagagtgt tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60 acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca ISO ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 atcagggcct gagctqgqcc gtcacaaaga 309
320 <210> 26 <211> 106 <212>PRT <213> Homo Sapiens
-65CZ 301712 Bó <400> 26
Thr Val Ala Ala Pro ser Val Phe Ile Phe Pro pro Ser Asp Glu Gin
10 15
Leu Lya Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cya Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
25 30
pro Arg Glu 35 Ala Lys Val Gin Trp 40 Lys Val Aap Asn Ala 45 Leu Gin Ser
Qly Asn 50 Ser Gin Glu 8er Val 55 Thr GlU Gin Asp Ser 60 Lys A8p Ser Thr
Tyr 55 Ser Leu Ser Ser Thr 70 Leu Thr Leu Ser Lys 75 Ala Asp Tyr Glu Lys 80
His Lye Val Tyr Ala as Cys Glu Val Thr His 90 Gin Gly Leu Ser Ser 95 Pro
Val Thr Lye Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 <210>27 <211> 978 <2I2>DNA <213> Homo Sapiens <400> 27 gcctccacca ageacagcgg fcggaactcag ggactctact tacacctgea aaatgttgtg
CtctCCCCCC gtggtggtgg gtggaggtgc gtggtcagcg aaggtctcca cagqqqqgag caggtcagcc gagagcaatg ggctccttct gtcttctcat tccctgtctc agggcccatc ccctgggqtg gcgctctgac ccctcagcag acgtagatca tcgagtgccc caaaacccaa atígtgagcca ataatgccaa tcctcaccgt acaaaggcct aaccacaggt tgaeetgcct ggcagccgga tcctctacag gctcqgtgat cgggtaaa ggtcttcccc cctggtcaag cagcggcgtg cgtggtgacc caagcccagc accgtgccca ggacaccctc cgaagacccc gacaaagcca tgtgcaccag cccagccccc gtacaccctg ggtcaaaggc gaacaactac caagctcacc gcatgaggct ctggcgccct gactacttcc cacaccttcc gtgccctcca aacaccaagg gcaccacctg atgatctccc gaggtccagt
C9gg*ggagc gaatggctga atcgagaaaa cccccatccc ttctacccca aagaccacac gtggacaaga ctgcacaacc gqtcoaggag cogaaccggt cagctgtcct gcaacttcgg tggacaagac tggcaggacc ggacccctga tcaaotggta agttcaacag acggcaagga eeatetccaa gggaggagat gcgacatcgc ctcccatgct gcaggtggca actacacgca cacctccgag gacggtgtcg acagtcctca oacccagacc agttgagcgc gtcagtcttc ggtcacgtgc egtggacggc cacgttccgt gtacaagtgc aaccaaaggg gaccaagaac cgtggagtgg ggactccgac gcaggggaac gaagagcctc
120
ISO
240
300
350
420
480
540
500
550
720
780
840
900
950
978 <210> 28 io <211>32ó <212> PRT <213> Homo Sapiens
-66CZ 301712 B6
<4OO> 28 Gly S Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cye Ser Arg
Ala Seť 1 Thr Lye
10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lye Asp Tyr
30 25 30
Phe Pro Glu Pro val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val Hle Thr Phe Pro Al* Val Leu Gin ser ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 50
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr
es 70 75 80
Tyr Thr Cye Aan val Aep Hia Lye Pro Ser Aen Thr Lye Val Aep Lye
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lye Cye cys Val Glu Cye Pro Pro Cye Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro 115 Ser Val Phe Leu Phe 120 Pro Pro Lye Pro Lys Aep 125
Thr Leu 130 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 135 Thr Cye val val Val Aep 140
Val Ser 145 His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe ISO Aen Trp Tyr Val Aep Gly 155 160
Val Glu Val Hle Asn 165 Ala Lys Thr Lya Pro 170 Arg Glu Glu Gin Phe Asn 175
Ser Thr phe Arg val 180 Val Ser Val Leu Thr 185 Val Val Hle Gin Asp Tip 190
Leu Aan Gly Lye Glu Tyr Lye Cya Lye val 195 300 Ser Aau Lye Gly Leu Pro 205
Ala Pro 210 Ile Glu Lye Thr Ile Ser Lys Thr Lye Gly Gin Pro Arg Glu 215 220
Pro Gin 225 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 230 Glu Glu Met Thr Lye Aen 235 240
Gin Val ser Leu Thr 245 Cye Leu Val Lye Gly 250 Phe Tyr Pro Ser Aep Ile 255
Ala Val Glu Trp Glu 260 Ser Asn Gly Gin Pro 265 Glu Aen Aen Tyr Lye Thr 270
Thr Pro Pro Met Leu 275 Asp Ser Aep Gly ser 280 Phe Phe Leu Tyr ser Lye 285
Leu Thr Val Aep Lye 290 Ser Arg Trp Gin Gin Gly Aan Val Phe Ser Cye 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu Hia Aen Hle Tyr Thr Gin Lye Ser Leu
305 310 315 320
ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
-67CZ 301712 B6 <210> 29 <211> 296 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 29 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 attagtagta gtggtagtac catatactac 180 tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 acggccgtgt attactgtgc gagaga 296 <210> 30 <211> 98 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 30
Gin 1 val Gin Leu val 5 Glu Ser Gly
ser Leu Arg Leu Ser 20 Cys Ala Ala
Tyr Met Ser Trp Ile 35 Arg Gin Ala 40
Ser Tyr Ile Ser Ser 50 Ser Gly Ser 55
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 70
Leu Ala Gin Met Asn Ser 85 Arg Leu Arg Ala
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
45
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser val
60
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cye
90 95
<210>31 <211> 296 <212>DNA <213> Homo Sapiens <400> 31 gaggtgcage tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 acggccgtat attactgtgc gaaaga 296 *68CZ 301712 B6 <210> 32 <211> 98 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 33
Glu val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Sex Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe sex Ser Tyr
20 35 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys <210> 33 <211> 296 <212>DNA io <213> Homo Sapiens <400> 33 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180 aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggaa acggccgtgt attactgtgc gagaga 296 <210> 34 <211> 98 <212>PRT <213> Homo Sapiens
-69Cl 301712 Bó «00» 34
Gin Val 1 Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Úlu ile Tyr His ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gin Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg <2I0> 35 <211> 293 <212>DNA <213> Homo Sapiens <40O> 35 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtcectc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga 293 <210> 36 io <211>97 <212> PRT <213> Homo Sapiens <40O> 36
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lye Pro Ser Olu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 50
Ser Arg Val Thr Xle ser Val Asp Thr Ser Lye Asn Gin Phe Ser Leu
£5 70 75 80
Lys Leu Ser ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
70CZ 301712 B6 <210> 37 <211> 290 <212> DNA <213 > Homo Sapiens gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 Atctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gactteactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc 290 <210> 38 <211> 96 io <212>PRT <213> Homo Sapiens <400> 38
Olu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Olu Arg Ala Thr Leu Ser Cya Arg Ala ser Gin Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin ala Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Oly Ala ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Aap Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
85 70 75 80
Pro Glu Aap Phe Ala val Tyr Tyr Cya Gin Gin Tyr Gly Ser ser Pro
85 90 95
<210> 39 is <211>288 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220>
<221> modifikovaná vazba 20 <222> (288) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 39 gacatccaga tgacceagte tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc eo atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctccn 288
-71CZ 301712 B6 <210> 40 <21O 96 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400» 40
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser Val Gly
1 5 10 15
Aep Arg Val Thr Ile Thr cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Aep Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 <210> 41 <210 288 <212>DNA io <213> Homo Sapiens c400> 41 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcaettgcc gggcaagtea gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagfcggatc tgggacagat tteaetctca ccateagcag tetgcaacct 240 gaagattttg qaacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcch 288 <210> 42 <210 96 is <212>PRT <213> Homo Sapiens
-72CZ 301712 Bó <400> 42
Asp Ile Gin Met 1 Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser Leu 10 Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin 25 ser Ile Ser 30 Ser Tyr
Leu Asn Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala pro Lye 45 Leu Leu Ile
Tyr Ala Ala Ser 50 Ser Leu Gin Ser 55 Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser Gly ser Gly 65 Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser 90 Tyr Ser Thr Pro 95 Pro
<210> 43 <211> 293 <212>DNA <213> Homo Sapiens <400* 43 caggtgcagc acctgcactg gccgggaagg ccctccctca aagctgagct tgcaggagtc tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc gggcccagga ctccatcagt gattgggegt caccatgtca cgcggacacg ctggtgaagc agttactact atctatacca gtagacacgt gccgtgtatt cttcggagac ggagctggat gtgggagcac ccaagaacca actgtgcgag cctgtccctc SO ccggcagccc 120 caactaca&c 1Θ0 gttctccctg 240 aga 293 <210>44 io <211>97 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4O0> 44
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin pro Ala Gly Lys Gly Leu GlU Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
-73CZ 301712 B6 <2lO> 45 <211> 470 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400» 45 Gly Leu 5 Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
Met 1 Glu Phe
10 15
val Gin cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lye Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser ser
130 135 140
-74CZ 301712 B6
Ala Ser 145 Thr Lye Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
150 155 160
Ser Thr Ser GlU Ser 1S5 Thr Ala Ala Leu Gly Cys 170 Leu val Lys Asp Tyr 175
Phe Pro Glu Pro 180 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 185 Gly Ala Leu Thr ser 190
Gly val Hla 195 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 200 Ser Gly Leu Tyr Ser 205
Leu Ser 210 Ser val val Thr val 215 Pro ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 220
Tyr Thr 225 Cya Asn val Asp HiS 230 Lys Pro Ser Asn 235 Thr Lys Val Asp Lys 240
Thr Val Glu Arg Lya 245 Cys cya Val Glu Cys Pro 250 Pro Cys Pro Ala Pro 355
Pro Val Ala Gly 260 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 265 Pro Lys Pro Lys Asp 370
Ήιγ Leu Met 275 ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 280 Cys Val Val Val Asp 285
val Ser 290 Hla Glu Asp Pro Glu 295 Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 300
Val Glu 305 Val His Asn Ala Lys 310 Thr Lye Pro Arg 315 Glu Glu Gin Phe Asn 320
Ser Thr Phe Arg Val 325 Val Ser Val Leu Thr Val 330 Val His Gin Asp Trp 335
Leu Aan Gly Lya 340 Glu Tyr Lys cys Lys Val Ser 345 Asn Lys Gly Leu Pro 350
Ala Pro Ile 35S Glu Lye Thr Ile Ser Lys Thr Lys 360 Gly Gin Pro Arg Glu 365
pro Glu 370 Val Tyr Thr Leu Pro 375 Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 380
Gin Val 385 Ser Leu Thr Cys Leu 390 Val Lys Gly Phe 395 Tyr Pro Ser Asp Ile 400
Ala Val Glu Trp Glu 405 Ser Asn Gly Gin Pro Glu 410 Asn Asn Tyr Lys Thr 415
Thr Pro Pro Met 420 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 425 Phe Leu Tyr Ser Lys 430
Leu Thr val 435 Asp Lya Ser Arg Trp Gin Gin Gly 440 Asn Val Phe Ser Cys 445
-75CZ 301712 B6 ser Val Met His Glu Ala Leu His Aan Hia Tyr Thr Gin Lya Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lya
4S5 470 <210> 46 <2! 1> 470 <2I2>PRT <213> Homo Sapiens
<400> 46
Met 1 Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu val Ala Ile Leu Lys 15 Gly
5 10
val Gin Cys Olu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Oly Gly Leu Val Gin
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lya Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ue Ser Gly ser Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Aap Ser Val Lya Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro val Thr Val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser
180 185 190
Gly Val HiS Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr
210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys
225 230 235 240
-76CZ 301712 B6
Thr Val Glu Arg Lys cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro 260 Ser Val Phe Leu Phe Pro 265 Pro Lys Pro Lys Asp 270
Thr Leu Met 275 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 280 Cya Val Val Val Asp 285
val ser His 290 Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn 295 Trp Tyr Val Asp Gly 300
Val Glu Val 305 His Asn Ala 310 Lys Thr Lys Pro Arg 315 Glu Glu Gin Phe Asn 320
Ser Thr Phe Arg Val 325 Val Ser Val Leu Thr Val 330 Val Hle Gin Asp Trp 33S
Leu Asn Gly Lye Glu 340 Tyr Lys Cys Lys Val Ser 345 Asn Lys Gly Leu Pro 350
Ala Pro Ile 355 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 360 Oly Gin Pro Arg Glu 365
Pro Gin Val 370 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 375 Glu Met Thr Lys Asn 380
Gin Val Ser 385 Leu Thr Cys 390 Leu Val Lys Gly Phe 395 Tyr Pro Ser Asp Ile 400
Ala Val Glu Trp Glu 405 Ser Asn Gly Gin Pro Glu 410 Asn Asn Tyr Lys Thr 415
Thr Pro Pro Met Leu 420 Asp Ser Asp Gly Ser Phe 425 Phe Leu Tyr Ser Lys 430
Leu Thr Val 435 Aap Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 440 Asn Val Phe ser Cys 445
Ser Val Met 450 Ser Leu Ser 465 His Glu Ala Pro Oly Lys 470 Leu Hia Asn His Tyr 455 Thr Gin Lys Ser Leu 460
-77CZ 301712 B6 <210> 47 <211> 236 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 47
Met Asp Met Arg 1 Phe Pro Gly Ala Val 5 Arg Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
Cys Asp 10 15
ile Gin 25 Met Thr Gin Phe Pro 30 Ser Ser
20
Leu Ser Ala ser Val Gly Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Arg Ala ser
35 40 45
Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
ile ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Ser Tyr Pro Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro ser val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gin Leu Lys ser Gly Thr Ala ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu
16S 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
180 185 190
ser Thr Tyr Ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
-78CZ 301712 B6 <210> 48 <211> 236 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 48
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu . Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cya Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser ser Leu Gin Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile
11S 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Aep
130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Txp Lys Val Asp Asn Ala Leu
16S 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Aep Tyr
195 200 20S
Glu Lya Hle Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hie Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cye
225 230 235
-79CZ 301712 B6 <210> 49 <211> 470 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 49
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly
1 5 10 15
Val Glu Cye Gin Ala Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser cye Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Tyr Met ser Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Arg Asp Tyr Ala
65 70 75 80
ASp ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lya Asn
85 90 95
-80CZ 301712 B6
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Aen Ser Leu Arg Ala Glu Aep Thr Ale Val 100 105 HO
Tyr Tyr Cye val Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 12S
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
155 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190
Gly val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Aep His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys
225 230 235 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cye Pro Ala Pro
245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lye Pro Lys Asp 260 265 270
Thr Leu Met ile Ser Arg Thr pro Glu val Thr Cys Val Val val Asp 275 280 285 val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val Hle Gin Aep Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lye Val ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lye Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400
-81 CZ 301712 B6
Ala Val Glu Trp Glu 405 Ser Asn Gly Gin Pro 410 Glu Asn Asn Tyr Lys 415 Thr
Thr Pro Pro Met 420 Leu Aep Ser Asp Gly 425 ser Phe Phe Leu Tyr 430 Ser Lys
Leu Thr val 43S Asp Lys Ser Arg Trp Gin 440 Gin Gly Aen Val 445 Phe Ser cya
Ser Val 450 Met HiS Glu Ala Leu 455 His Asn His Tyr Thr 460 Gin Lys Ser Leu
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 50 <211> 473 <212>PRT <213> Homo Sapiens
<400> 50
Mat 1 Glu Phe Gly Leu ser Trp val 5 Phe Leu 10 Val Ala ile Ile Lys Gly 13
Val Gin Cya Gin Val Gin Leu Val GlU ser Gly Gly Gly Leu val Lye
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cya Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lye Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Vhl Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Αερ Ser Val Lya Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Aap Asn Ala Lys Aen
35 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr CyS Ala Arg Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Aep val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lye Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Cye Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
16S 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val HiS Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro ser Ser Asn Phe Gly
210 215 220
Thr Gin Thr Tyr Thr Cye Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys pro Pro Cye
245 250 255
pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gin Phe Asn ser Thr Phe Arg Val val Ser Val Leu Thr val Val His
325 330 335
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
-83CZ 301712 B6 <210> 51 <21 >236 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 51
Met 1 Αβρ Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala ser
35 40 45
Gin Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val Glu Ile
115 120 125
Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 13S 140
Glu Gin Leu Lye Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 165 Lys Val Gin Trp 170 Lye val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Aen 180 Ser Gin Glu Ser Val 185 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lye Asp
Ser Thr Tyr 195 ser Leu ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 Hle Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu Val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser 225 Pro Val Thr Lys ser 230 Phe Asn Arg Gly Glu 235 Cys
-84CZ 301712 B6 <210> 52 <211> 236 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4OO> 52
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Xle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
20 23 30
Leu Ser Ala Ser Val 35 Gly Asp Arg Val Thr 40 Ile Thr Cys Arg Ala Ser 45
Gin Gly 50 Ile Arg Asn Asp Leu Gly TTp Tyr 55 Gin Gin Lys Pro Gly Lys 60
Ala Pro 65 Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 70 Ser Leu Gin Ser Gly Val 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly ser Gly ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu Thr 95
ile Ser Ser Leu Gin 100 Pro Glu Asp Phe Ala 105 Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 110
His Asn Ser Tyr Pro 115 Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 120 125
Lys Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 135 Ile Phe Pro Pro Ser Asp 140
Glu Gin 145 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 150 Val Cys Leu Leu Asn Asn 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys Val Asp Asn Ala Leu 175
Gin Ser Gly Asn Ser 180 Gin Glu Ser Val Thr 185 Glu Gin Asp Ser Lys Asp 190
Ser Thr Tyr Ser Leu 195 Ser Ser Thr Leu Thr 200 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 205
Glu Lys 210 Ser Pro His Lys Val Val Thr Lys Tyr Ala Cys Glu Val 215 Ser Phe Asn Arg Gly Thr His Gin Gly Leu Sex 220 Glu Cys
225 230 235
-85CZ 301712 B6 <210 53 <211> 326 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <220 <221> modifikovaná báze <222> (289) io <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 53 gacatccaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca 120 gggaaagcyc ctaagcgcct gatctatgct gcatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtytacar cataatartt aycckybens kttyggcerr 300 gggaccrags tggaratcaw acgaac 326 <210 54 <211> 322 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <400> 54 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgyaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagy asctwtttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaarctcct gateyatgyt gcatccagtt trcaargtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacartr ccccayychc tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210 55 <211> 325 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <220 <221> modifikovaná báze <222> (291) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 55 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgya gggccagtca gagtgttragc rgcagetact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca geagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cetgaagatt ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaac 325
-86CZ 301712 B6 <210> 56 <210 376 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <400> 56 caggtgeagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggarkg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac 19 o gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgcca&gaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300 gtggaaacta ctttfctacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag 376 <210> 57 <210 358 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <220>
<220 modifikovaná báze <222> (337) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 57 caggtgeagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ccggcagccc 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcmc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctcectg 240 aagctgarct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt 300 ggagtggtta ttatctttga ctactggggc cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag 359 <210> 58 <210418 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <400> 58 caggtgeagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 6o tcctgtrcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggfcctcagst attaetggka gtggtggtab yacatwctac 180 gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk 300 ggctrskeyg ac tyttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg 360 gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 418
-87CZ 301712 B6 <210> 59 <211> 364 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <4ΰΰ> 59 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagyt ctgtgaccgq tgcggaqacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc 300 agttcgttct aetactacgg tatggacgtq tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcag 364 <210> 60 io <211>15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Gly-Ser Linker <4Q0> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
10 15
Protokoly o uložení vzorků biologického materiálu Hybridom označený v popisu vynálezu 4.9,2.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2789 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 25 1 0801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v soula30 du se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
Hybridom označený v popisu vynálezu 4.17.3.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem 35 PTA 2793 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
-88CZ 301712 B6
Hybridom označený v popisu vynálezu 2.12.1.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem
PTA 2792 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture CoHection 10801 University Boulevard Manassas, Virginía 20110-2209 io United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
Hybridom označený v popisu vynálezu 2.13.2 byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2788 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture CoHection
10801 University Boulevard Manassas, Virginía 20110-2209 United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
Hybridom označený v popisu vynálezu 2.14.3 byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2790 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture CoHection 10801 University Boulevard
Manassas, Virginía 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
Hybridom označený v popisu vynálezu 3.1.1.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2791 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture CoHection 10801 University Boulevard Manassas, Virginía 20110-2209 United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.

Claims (31)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Humánní monoklonální protilátka nebo antigen-vazebná Část protilátky, která se specificky váže k receptoru inzulínu podobného růstového faktoru I (IGF-IR), přičemž protilátka obsahuje lehký řetězec, který užívá humánní gen Vk A30, inhibuje vazbu IGF-I nebo IGF—II k IGF-IR a inhibuje in vivo růst nádorů, kde protilátka obsahuje:
    a) lehký řetězec obsahující aminokyselinové sekvence CDRi, CDR2 a CDR3 z variabilního úseku lehkého řetězce protilátky 2.13.2 (ATCC Č. PTA-2788) nebo 4.9.2 (ATCC č. PTA-2789), a
    15 b) těžký řetězec obsahující aminokyselinové sekvence CDRI, CDR2 a CDR3 z variabilního úseku těžkého řetězce protilátky 2.13.2 nebo 4.9.2.
  2. 2. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 1, kde protilátka nebo část protilátky má alespoň jednu vlastnost vybranou ze skupiny sestávající z vlastnosti:
    a) neváže se k IGF-IR myši, laboratorního potkana, psa nebo králíka,
    b) váže se k IGF-IR Macaca fascicularis nebo Macaca mulatta, ale neváže se k IGF-IR Callithrix sp.,
    c) má selektivitu pro IGF-IR, která je alespoň 50krát vyšší než je její selektivita pro inzulínový receptor,
    d) způsobuje mizení IGF-IR z buněčného povrchu, když je inkubována s buňkou exprimující ao IGF-IR,
    e) inhibuje IGF-IR-indukovanou fosforylaci tyrosinu,
    f) váže se k IGF-IR s KD 8 x 10-9 M nebo menší, a 35
    g) má rychlost oddělení od IGF-IR KOff 10'4 s l nebo menší.
  3. 3. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 2, kde protilátka nebo Část protilátky inhibuje vazbu IGF—I nebo IGF—II k IGF- IR, váže se k IGF-IR s KD 8 x 10~9 M nebo menší a má
    40 selektivitu pro IGF-IR, která je alespoň 5Okřát vyšší než je její selektivita pro inzulínový receptor,
  4. 4. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 2, kde protilátka nebo část protilátky má všechny vyjmenované vlastnosti.
  5. 5. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 1, kde protilátka nebo její antigenvazebná část má alespoň jednu z vlastností vybranou ze skupiny sestávající z vlastností:
    x a) zkříženě kompetuje o vazbu k IGF-IR s protilátkou 2.13,2 (ATCC č. PTA-2788) nebo 4.9.2 50 (ATCC č. PTA-2789),
    b) váže se ke stejnému epitopu IGF-IR jako protilátka 2.13.2 nebo 4.9.2,
    c) váže se ke stejnému antigenu, který je vázán protilátkou 2.13.2 nebo 4.9.2,
    -90CZ 301712 B
  6. 6
    d) váže se k IGF-IR se stejnou hodnotou KDjako protilátka 2.13.2 nebo 4.9.2, a
    e) váže se k IGF-IR se stejnou rychlostí rozpadu jako protilátka 2.13.2 nebo 4.9.2.
    5 6. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 5, kde protilátka nebo její část má všechny vyjmenované vlastnosti.
  7. 7. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde protilátka nebo její část inhibuje vazbu mezi IGF-IR a IGF-I nebo IGF—II s hodnotou IC50 menší než io 100 nM.
  8. 8. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 6 nebo SEKV. ID. Č. 14.
    is
  9. 9. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde protilátka obsahuje těžký řetězec, kde sekvence variabilního úseku obsahuje ne více než osm aminokyselinových substitucí z aminokyselinové sekvence kódované genem zárodečné linie Vh DP47.
  10. 10. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 9, kde těžký řetězec obsahuje
    20 aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 8 nebo SEKV. ID. Č. 16.
  11. 11. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kterou je
    a) molekula imunoglobulinu G (IgG), IgM, IgE, IgA nebo IgD nebo molekula z ní pocházející,
    25 nebo
    b) fragment Fab, fragment F(ab')2, fragment Fv, jednořetězcová protilátka nebo bispecifická protilátka.
    30
  12. 12. Protilátka podle nároku 1, kde protilátka je protilátka 2.13.2 (ATCC Č. PTA-2788) nebo
    4.9.2 (ATCC č. PTA-2789) nebo protilátka, která má stejné aminokyselinové sekvence jako protilátka 2.13.2 nebo 4.9.2.
  13. 13. Protilátka podle nároku 1, kde aminokyselinové sekvence těžkého řetězce a lehkého řetězce
    35 jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří:
    a) aminokyselinová sekvence těžkého řetězce a aminokyselinová sekvence lehkého řetězce protilátky 2.13.2 (ATCC č. PTA-2788), a
    40 b) aminokyselinová sekvence SEKV. ID. Č. 45 bez signální sekvence a aminokyselinová sekvence SEKV. ID. Č. 47 bez signální sekvence.
  14. 14. Monoklonální protilátka podle nároku l, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující aminokyselinové sekvence úseků CDR1, CDR2 a CDR3 ze sekvence
    45 SEKV. ID. Č. 8, a dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce obsahující aminokyselinové sekvence úseků CDR1, CDR2 a CDR3 ze sekvence SEKV. ID. Č. 6.
  15. 15. Monoklonální protilátka podle nároku 14, kde protilátka obsahuje:
    50 I) aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující variabilní úsek aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 8 nebo tuto sekvenci obsahující nejvýše pět konzervativních substitucí aminokyselin, a
    II) aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce obsahující variabilní úsek aminokyselinové
    55 sekvence SEKV. ID. Č. 6 nebo tuto sekvenci obsahující nejvýše pět substitucí aminokyselin.
    -91 CZ 301712 B6
  16. 16. Monoklonální protilátka podle nároku 15, kde protilátka obsahuje:
    I) aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce obsahující variabilní úsek aminokyselinové
    5 sekvence SEKV. ID. Č. 8, a
    II) aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce obsahující variabilní úsek aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 6.
    io
  17. 17. Monoklonální protilátka podle nároku 16, kde aminokyselinová sekvence těžkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 45 bez signální sekvence, a aminokyselinová sekvence lehkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 47 bez signální sekvence.
    15
  18. 18. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku nebo její antigen-vazebnou část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 a farmaceuticky přijatelný nosič.
  19. 19. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že dále obsahuje antineoplázické, chemoterapeutické, antiangiogenní nebo protinádorové agens.
  20. 20. Způsob přípravy protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky;
    a) imunizace savce jiného než lidského původu imunogenem obsahujícím IGF-IR, kde savec je
    25 schopen exprimovat humánní protilátky v B lymfocytech,
    b) izolace B lymfocytů ze savce,
    c) screening B lymfocytů nebo buněčných linií z nich pocházejících pro identifikaci buněčné
    30 linie, která tvoří protilátky, které se vážou k IGF-IR,
    d) kultivace buněčné linie, která exprimuje protilátky, které se vázou k IGF-IR a
    e) izolace protilátek, které se vážou k IGF-IR z buněčné linie.
  21. 21. Izolovaná buněčná linie, která produkuje protilátku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.
  22. 22. Buněčná linie podle nároku 21, která produkuje protilátku 2.13.2 (ATCC č. PTA-2788) nebo 4.9.2 (ATCC č. PTA-2789) nebo protilátku, která má stejné aminokyselinové sekvence
    40 jako protilátka 2.13.2 nebo 4.9.2.
  23. 23. Použití protilátky nebo její antigen-vazebné části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro výrobu farmaceutického přípravku pro diagnostikování přítomnosti nebo lokalizaci nádoru exotimuj ícího IGF-IR.
  24. 24. Použití protilátky nebo její antigen-vazebné částí podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčbu karcinomu.
  25. 25. Použití protilátky nebo její antigen-vazebné části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro
    50 výrobu farmaceutického přípravku.
  26. 26. Použití podle nároku 24 nebo 25, kdy farmaceutický přípravek dále obsahuje antineoplázické, protinádorové, antiangiogenní nebo chemoterapeutické agens.
    -92CZ 301712 B6
  27. 27. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část nebo lehký řetězec nebo jeho antigenvazebnou část z protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až í 7.
    5 28. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 27, kde molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sestávající z:
    a) sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce nebo jeho antigen-vazebné části obsahující tři CDR úseky těžkého řetězce protilátky 2.13.2 (ATCC č.
    ίο PTA-2788) nebo 4.9.2 (ATCC č. PTA-2789),
    b) sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce nebo jeho antigen-vazebné části z protilátky 2.13.2 nebo 4.9.2,
    15 c) sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce nebo jeho antigen-vazebné části obsahující tři CDR sekvence lehkého řetězce protilátky 2.13.2 nebo 4.9.2,
    d) sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce nebo jeho
    20 antigen-vazebné části z protilátky 2.13.2 nebo 4.9.2,
    e) sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEKV. ID. Č. 6, 8,14 a 16, a
    25 f) sekvenci nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sestávající ze SEKV. ID. Č. 5, 7, 13 a 15, kde molekula nukleové kyseliny případně obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 28 nebo SEKV. ID. Č. 26.
  28. 30 29. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 27 nebo 28, kde vektor případně obsahuje expresní kontrolní sekvenci operativně spojenou s molekulou nukleové kyseliny.
    30. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 29 nebo molekulu nukleové kyseliny podle nároku 27 nebo 28.
  29. 31. Způsob přípravy anti-IGF-IR protilátky nebo její antigen-vazebné části, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle nároku 30 nebo buněčné linie podle nároku 21 za vhodných podmínek a získání protilátky nebo její antigen-vazebné části.
    40
  30. 32. Transgenní zvíře jiného než lidského původu obsahující nukleovou kyselinu podle nároku
    27 nebo 28, přičemž transgenní zvíře jiného než lidského původu exprimuje nukleovou kyselinu.
  31. 33. Použití izolované molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo jeho antigenvazebnou část, izolované molekuly nukleové kyseliny kódující lehký řetězec nebo jeho antigen45 vazebnou část nebo molekuly či molekul nukieové kyseliny kódující či kódujících jak lehký řetězec, tak těžký řetězec nebo jejich antigen-vazebné části z protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro výrobu farmaceutického přípravku.
CZ20032131A 2001-01-05 2001-12-20 Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický prípravek obsahující tuto protilátku CZ301712B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20032131A3 CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
CZ301712B6 true CZ301712B6 (cs) 2010-06-02

Family

ID=22987016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032131A CZ301712B6 (cs) 2001-01-05 2001-12-20 Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický prípravek obsahující tuto protilátku

Country Status (51)

Country Link
US (7) US7037498B2 (cs)
EP (4) EP1399483B1 (cs)
JP (4) JP2004531217A (cs)
KR (1) KR100830082B1 (cs)
CN (2) CN1330668C (cs)
AP (1) AP2072A (cs)
AR (1) AR032028A1 (cs)
AT (1) ATE464322T1 (cs)
AU (1) AU2002231368C1 (cs)
BG (3) BG66460B1 (cs)
BR (2) BRPI0116728B1 (cs)
CA (1) CA2433800C (cs)
CR (4) CR7045A (cs)
CU (1) CU23447B7 (cs)
CZ (1) CZ301712B6 (cs)
DE (1) DE60141855D1 (cs)
DK (1) DK1399483T3 (cs)
DZ (1) DZ3494A1 (cs)
EA (1) EA012079B3 (cs)
EC (1) ECSP034711A (cs)
EE (2) EE05724B1 (cs)
ES (1) ES2344592T3 (cs)
GE (1) GEP20084484B (cs)
GT (1) GT200100257A (cs)
HK (1) HK1203521A1 (cs)
HN (1) HN2001000283A (cs)
HR (2) HRP20130659A2 (cs)
HU (1) HUP0302525A2 (cs)
IL (2) IL156661A0 (cs)
IS (1) IS2790B (cs)
MA (1) MA26040A1 (cs)
ME (1) ME00502B (cs)
MX (2) MX349009B (cs)
MY (1) MY143465A (cs)
NO (1) NO339789B1 (cs)
NZ (2) NZ569856A (cs)
OA (1) OA12589A (cs)
PA (1) PA8535501A1 (cs)
PE (1) PE20020801A1 (cs)
PL (3) PL228041B1 (cs)
PT (1) PT1399483E (cs)
RS (1) RS51373B (cs)
SG (1) SG138469A1 (cs)
SK (1) SK287954B6 (cs)
SV (1) SV2007000775A (cs)
TN (1) TNSN01177A1 (cs)
TW (1) TWI324609B (cs)
UA (1) UA87804C2 (cs)
UY (2) UY27087A1 (cs)
WO (1) WO2002053596A2 (cs)
ZA (1) ZA200305995B (cs)

Families Citing this family (306)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SV2007000775A (es) 2001-01-05 2007-03-15 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
CN103232539B (zh) * 2001-06-26 2015-06-03 安姆根弗里蒙特公司 抗opgl抗体
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
CA2473039C (fr) * 2002-01-18 2014-09-23 Pierre Fabre Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
US6936427B2 (en) 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
CA2752143C (en) * 2002-05-15 2014-09-23 Sutter West Bay Hospitals Delivery of nucleic acid-like compounds
NZ554740A (en) 2002-05-24 2009-01-31 Schering Corp Neutralizing human anti-IGFR antibody
AU2004303792A1 (en) * 2003-12-08 2005-07-07 Immunogen, Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
CA2487321A1 (en) * 2002-06-17 2003-12-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary Of The Department Of Health And Human Services Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework
US20040176291A1 (en) * 2002-09-24 2004-09-09 Elly Nedivi Methods and compositions for soluble CPG15
MXPA05008617A (es) * 2003-02-13 2005-11-04 Pfizer Prod Inc Usos de anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento semejante a la insulina i.
BRPI0408317A (pt) * 2003-03-14 2006-03-07 Pharmacia Corp anticorpos do receptor de igf-i para o tratamento de cáncer
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
ATE549359T1 (de) 2003-04-02 2012-03-15 Hoffmann La Roche Antikörper gegen den insulinähnlichen wachstumsfaktor i-rezeptor und deren verwendungen
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EP1479695B1 (en) * 2003-05-14 2010-02-17 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody specific for lipopolysaccharides (LPS) of serotype IATS O6 of Pseudomonas aeruginosa
US7579157B2 (en) * 2003-07-10 2009-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody selection method against IGF-IR
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
CN1835975B (zh) 2003-08-13 2012-11-21 辉瑞产品公司 经修饰的人类igf-1r抗体
DE602004030700D1 (de) * 2003-09-24 2011-02-03 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Rekombinanter antikörper gegen humanen insulin-like growth factor
WO2005032476A2 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for cpg15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
WO2005047512A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Shering Corporation Plasmid system for multigene expression
AR046639A1 (es) * 2003-11-21 2005-12-14 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti- igfr1
BRPI0510716A (pt) * 2004-05-05 2007-11-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc uso de um agente de ligação bi-especìfico, agente de ligação bi-especìfico, composição de um agente de ligação bi-especìfico, e, kit
CN101014365B (zh) 2004-07-16 2011-04-13 辉瑞产品公司 使用抗-igf-1r抗体联合治疗非血液的恶性肿瘤
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
WO2006060419A2 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Schering Corporation Biomarkers for pre-selection of patients for anti-igf1r therapy
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
WO2006105488A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
US20060233810A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-19 Yaolin Wang Methods and compositions for treating or preventing cancer
EP2444421A1 (en) 2005-04-26 2012-04-25 Pfizer Inc. P-Cadherin antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
ES2776657T3 (es) * 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
EP1896505A2 (en) * 2005-06-15 2008-03-12 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
CA2612449A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Imclone Systems Incorporated Receptor antagonists for treatment of metastatic bone cancer
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
CN101517068B (zh) 2005-09-07 2017-02-08 安进弗里蒙特公司 活化素受体样激酶‑1的人单克隆抗体
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
US7820165B2 (en) 2005-11-21 2010-10-26 Merck Serono, S.A. Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
ES2385054T3 (es) 2005-12-13 2012-07-17 Medimmune Limited Proteínas de unión específicas para factores de crecimiento de tipo insulina y usos de las mismas
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
HUE039085T2 (hu) 2006-01-20 2018-12-28 Cell Signaling Technology Inc Transzlokáció és mutáns ROS kináz humán nem-kissejtes tüdõ karcinómában
EP1984011A4 (en) 2006-02-03 2010-08-18 Imclone Llc IGF-IR ANTAGONISTS AS AUXILIARIES FOR THE TREATMENT OF PROSTATE CANCER
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
AU2007229554A1 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-IGF-1R human monoclonal antibody formulation
EP1999149A4 (en) * 2006-03-28 2010-01-20 Biogen Idec Inc ANTI-IGF-1R ANTIBODIES AND USES THEREOF
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
EP2447359B1 (en) 2006-04-14 2015-11-04 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
MX2008013990A (es) 2006-05-09 2009-01-29 Pfizer Prod Inc Derivados de cicloalquilamino acidos.
EP2032989B2 (en) 2006-06-30 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Igfbp2 biomarker
WO2008076278A2 (en) 2006-12-13 2008-06-26 Schering Corporation Methods of cancer treatment with igf1r inhibitors
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
MX2009008754A (es) * 2007-02-14 2009-11-02 Glaxo Group Ltd Anticuerpos novedosos contra igf-1r.
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
US20100323373A1 (en) * 2007-02-27 2010-12-23 Stefan Evers Method for the assessment of the inhibitory activity of antibodies against insulin-like growth factor i receptor
EP2129397B1 (en) * 2007-03-02 2018-10-31 Amgen, Inc. Methods and compositions for treating tumor diseases
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
EP2851091B1 (en) 2007-04-13 2017-12-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer resistant to ERBB therapeutics
EP2559771A3 (en) 2007-05-17 2013-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
WO2009032782A2 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
JP2010537985A (ja) * 2007-08-28 2010-12-09 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド 抗ｉｇｆ−１ｒ抗体およびその使用
US20110097318A1 (en) * 2007-08-31 2011-04-28 Amgen Inc. Solid-State Protein Formulation
CA2701032C (en) * 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
ES2576650T3 (es) 2007-10-18 2016-07-08 Cell Signaling Technology, Inc. Translocación y ROS quinasa mutante en el carcinoma pulmonar no microcítico humano
ES2962777T3 (es) 2007-11-15 2024-03-21 Amgen Inc Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral
PT2594590E (pt) 2007-12-14 2015-01-14 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de ligação ao recetor humano ox40
EP2225273B1 (en) 2007-12-21 2012-05-23 Roche Glycart AG Stability testing of antibodies
JP2011515478A (ja) * 2008-03-25 2011-05-19 シェーリング コーポレイション 結腸直腸がんを処置または予防するための方法
CN102076355B (zh) 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US9109026B2 (en) 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP5674654B2 (ja) 2008-07-08 2015-02-25 アッヴィ・インコーポレイテッド プロスタグランジンｅ２二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
ATE542813T1 (de) 2008-08-06 2012-02-15 Pfizer 6-substituierte 2- heterocyclylaminopyrazinverbindungen als chk-1- inhibitoren
CN103396488A (zh) 2008-12-12 2013-11-20 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 抗igf抗体
US9364477B2 (en) 2009-02-12 2016-06-14 Cell Signaling Technology, Inc. Mutant ROS expression in human cancer
LT3903829T (lt) 2009-02-13 2023-06-12 Immunomedics, Inc. Imunokonjugatai su viduląsteliniu būdu skaldoma jungtimi
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
AR075982A1 (es) 2009-03-31 2011-05-11 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo afucosilado y una o mas de las citoquinas seleccionadas de gm- csf humano, m -csf humano y/o il-3 humano y composicion
CA2758297A1 (en) 2009-04-16 2010-10-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions and methods for treating cancer
CA2758290C (en) * 2009-04-27 2018-04-10 Novartis Ag Antagonistic activin receptor iib (actriib) antibodies for increasing muscle growth
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK2564695T3 (en) 2009-07-08 2015-05-26 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
NZ598929A (en) 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
IN2012DN01663A (cs) 2009-09-16 2015-06-05 Immunomedics Inc
BR112012008833A2 (pt) 2009-10-15 2015-09-08 Abbott Lab imunoglobulinas de dominio variavel duplo e usos das mesmas
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
MX2012004682A (es) 2009-10-26 2012-09-07 Hoffmann La Roche Metodo para la produccion de una inmunoglobulina glicosilada.
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011053779A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
WO2011068845A1 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
PL2505654T5 (pl) 2010-02-08 2020-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mysz ze wspólnym łańcuchem lekkim
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
US8691771B2 (en) 2010-05-21 2014-04-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins for tissue repair
PT2575935E (pt) 2010-06-07 2015-10-20 Amgen Inc Dispositivo de administração de medicamento
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
CA2804185C (en) 2010-07-12 2017-03-21 Covx Technologies Ireland Limited Multifunctional antibody conjugates
PE20131412A1 (es) 2010-08-03 2014-01-19 Abbvie Inc Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2012019132A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic lymphoma kinase in kidney cancer
EP2608803A4 (en) 2010-08-26 2014-01-15 Abbvie Inc IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
MY177065A (en) 2010-09-09 2020-09-03 Pfizer 4-1bb binding molecules
UA114592C2 (uk) * 2010-09-28 2017-07-10 Ноно Інк. Пептид nd2 та спосіб лікування неврологічного захворювання
JP2014500879A (ja) * 2010-11-16 2014-01-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｂｃｍａ発現に相関性を有する疾患を治療する因子及び方法
EP2643694B1 (en) 2010-11-24 2018-01-03 Litron Laboratories Ltd. Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
JP2014510265A (ja) 2011-02-02 2014-04-24 アムジェン インコーポレイテッド Ｉｇｆ−１ｒの阻害に関する方法および組成物
CN103476433A (zh) 2011-02-10 2013-12-25 罗切格利卡特公司 改良的免疫疗法
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
WO2012123755A1 (en) 2011-03-17 2012-09-20 The University Of Birmingham Re-directed immunotherapy
CN107537040A (zh) 2011-03-29 2018-01-05 伊缪诺金公司 通过一步法制备类美登素抗体缀合物
SG193996A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
ES2724801T3 (es) 2011-04-19 2019-09-16 Pfizer Combinaciones de anticuerpos anti-4-1BB y anticuerpos inductores de ADCC para el tratamiento del cáncer
EP2699602B1 (en) * 2011-04-19 2017-03-01 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-igf-1r and anti-erbb3 antibodies
CA3021845C (en) 2011-04-20 2022-03-29 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
AU2012250924B2 (en) 2011-05-02 2017-05-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
WO2013022782A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized universal light chain mice
EP2748197A2 (en) 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
AU2012311286B2 (en) 2011-09-19 2018-07-26 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
WO2013056069A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
SMT201800287T1 (it) 2011-10-14 2018-07-17 Amgen Inc Iniettore e metodo di assiemaggio
WO2013060872A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
SG10201603411WA (en) 2011-10-28 2016-07-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
US9700619B2 (en) 2011-11-11 2017-07-11 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
KR101470700B1 (ko) * 2011-11-25 2014-12-12 서울대학교산학협력단 표적 항암제의 내성 극복 방법
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
ES2655842T3 (es) 2012-04-18 2018-02-21 Cell Signaling Technology, Inc. EGFR y ROS1 en el cáncer
KR102125658B1 (ko) 2012-05-04 2020-06-22 화이자 인코포레이티드 전립선 관련된 항원 및 백신 기재 면역치료 요법
WO2013191982A2 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind igf1r
IN2015DN00552A (cs) 2012-07-19 2015-06-26 Redwood Bioscience Inc
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
PL3434695T3 (pl) 2012-08-07 2021-05-17 Roche Glycart Ag Ulepszona immunoterapia
EP3586874A1 (en) 2012-08-14 2020-01-01 IBC Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
SG11201502429YA (en) 2012-10-04 2015-04-29 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
KR20190096459A (ko) 2012-11-01 2019-08-19 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
AU2013348071B2 (en) 2012-11-21 2018-05-24 Amgen Inc. Drug delivery device
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CA2892042C (en) 2012-11-29 2022-06-14 Chemocentryx, Inc. Cxcr7 antagonists
MX379460B (es) 2012-12-13 2025-03-11 Immunomedics Inc Dosis de inmunoconjugados de anticuerpos y sn-38 para eficacia mejorada y toxicidad reducida.
WO2017004144A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
JP2016510755A (ja) 2013-03-06 2016-04-11 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 抗Ｃ−ＭＥＴタンデムＦｃ二重特異性抗体
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
TWI639453B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
JP6643977B2 (ja) 2013-03-15 2020-02-12 アムゲン・インコーポレーテッド 体輪郭に適応可能な自動注入機デバイス
BR112015023797A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-24 Abbvie Inc proteínas de ligação de especificidade dupla dirigidas contra il-1b e/ou il-17
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN113559363B (zh) 2013-03-22 2023-10-31 美国安进公司 注射器及装配方法
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
BR112015027313A2 (pt) 2013-04-29 2017-09-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd anticorpos anti-cd38 e fusões ao interferon alfa-2b atenuado
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
DK3007704T3 (da) * 2013-06-13 2021-03-29 Antisense Therapeutics Ltd Kombinationsterapi til akromegali
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
EP3041863A4 (en) 2013-09-05 2017-08-16 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
CA2925723A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2015061389A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3789064B1 (en) 2013-10-24 2024-11-27 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US9675671B2 (en) 2014-01-12 2017-06-13 Igf Oncology, Llc Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
MX384646B (es) 2014-02-21 2025-03-14 Ibc Pharmaceuticals Inc Anticuerpo biespecífico que comprende al menos un sitio de unión para trop-2 y al menos sitio de unión para cd3 y su uso para inducir una respuesta inmune
US9139649B2 (en) 2014-02-25 2015-09-22 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD22 antibody
KR102846903B1 (ko) 2014-03-21 2025-08-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
SG11201609219QA (en) 2014-05-07 2016-12-29 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
EP3143404B1 (en) 2014-05-16 2018-08-29 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
US20170124285A1 (en) 2014-06-03 2017-05-04 Amgen Inc. Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
EP3160504B1 (en) 2014-06-24 2020-09-16 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
PT3204018T (pt) 2014-10-07 2021-11-12 Immunomedics Inc Uso neoadjuvante de conjugados anticorpo-fármaco
MX392725B (es) 2014-10-14 2025-03-24 Amgen Inc Dispositivo de inyeccion de farmaco con indicadores visuales y audibles.
KR102639037B1 (ko) 2014-10-29 2024-02-20 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 인터페론 α2b 변이체
AU2015349985A1 (en) 2014-11-19 2017-05-25 Immunogen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
WO2016100055A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
US10583245B2 (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3258959A4 (en) * 2015-02-22 2018-10-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd137
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
CA2981543A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3313443B9 (en) 2015-06-25 2023-10-04 Immunomedics, Inc. Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
ES2863278T3 (es) 2015-10-02 2021-10-11 Silver Creek Pharmaceuticals Inc Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
KR102783230B1 (ko) 2015-11-09 2025-03-19 알.피.쉐러 테크놀러지즈 엘엘씨 항-cd22 항체-메이탄신 콘쥬게이트 및 그것의 사용 방법
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
CA3013125A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Immunogen, Inc. Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
CN116284392A (zh) 2016-03-10 2023-06-23 艾科赛扬制药股份有限公司 活化素2型受体结合蛋白及其用途
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124B1 (en) 2016-06-03 2026-02-11 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
CA3040899A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations and methods of making the same
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
CN110494445B (zh) 2017-01-06 2023-10-20 Abl生物公司 抗α-SYN抗体及其用途
EP3570917A1 (en) 2017-01-17 2019-11-27 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
AU2018220538B2 (en) 2017-02-17 2023-12-14 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
WO2018152073A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
WO2018165143A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
US12503700B2 (en) 2017-03-14 2025-12-23 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
KR102651078B1 (ko) 2017-03-28 2024-03-22 암겐 인코포레이티드 플런저 로드 및 주사기 조립 시스템 및 방법
KR102795415B1 (ko) 2017-05-21 2025-04-14 아이쥐에프 온콜로지, 엘엘씨 골수이형성 증후군을 치료하기 위한 인슐린양 성장 인자-화학치료학적 접합체
CA3061982A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MA49461A (fr) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc Dispositif électronique d'administration de médicament comprenant un bouchon activé par un ensemble commutateur
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
WO2019018169A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Amgen Inc. PERMEABLE GAS SEALING ELEMENT FOR MEDICINE CONTAINER AND METHODS OF ASSEMBLY
MA49677A (fr) 2017-07-25 2021-04-21 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec module d'engrenage et procédé d'assemblage associé
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
US12318593B2 (en) 2017-08-09 2025-06-03 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. Anti-cd137 molecules and use thereof
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20210332141A1 (en) 2017-08-30 2021-10-28 Amgen Inc. Insulin-like growth factor-1 receptor (igf-1r) binding proteins and methods of use
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
EP3694578B1 (en) 2017-10-09 2025-09-24 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
AU2018354418B2 (en) * 2017-10-27 2025-09-11 Immunebridge Inc. Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using derivatives of fluorene
IL273663B2 (en) 2017-11-03 2025-05-01 Amgen Inc System and methods for disinfecting a drug delivery device
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
ES2994389T3 (en) 2017-11-06 2025-01-23 Amgen Inc Drug delivery device with placement and flow sensing
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
JP7747438B2 (ja) 2017-11-16 2025-10-01 アムジエン・インコーポレーテツド 失速及び終点検出を有するオートインジェクタ
CA3085572A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Abl Bio Inc. Bispecific antibody to a-syn/igf1r and use thereof
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
US12325737B2 (en) 2018-03-26 2025-06-10 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN117159846A (zh) 2018-10-02 2023-12-05 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
WO2020072846A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
AR116704A1 (es) 2018-10-15 2021-06-02 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con mecanismo de amortiguación
ES3010833T3 (en) 2018-11-01 2025-04-04 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
IL281908B2 (en) 2018-11-01 2025-06-01 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
EP3895732A4 (en) * 2018-12-03 2022-09-14 Teijin Pharma Limited HUMANIZED ANTI-IGF-I RECEPTOR ANTIBODY
EP3893882A4 (en) 2018-12-12 2022-08-31 ChemoCentryx, Inc. CXCR7 INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF CANCER
AU2019402097A1 (en) 2018-12-17 2021-06-10 Revitope Limited Twin immune cell engager
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
AU2020275413A1 (en) 2019-05-14 2021-12-23 Cedars-Sinai Medical Center TL1A patient selection methods, systems, and devices
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
CN114450593A (zh) 2019-09-26 2022-05-06 美国安进公司 产生抗体组合物的方法
CA3177717A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN119792512A (zh) 2020-10-14 2025-04-11 维里迪安治疗公司 用于治疗甲状腺眼病的组合物和方法
JP2023548767A (ja) 2020-10-15 2023-11-21 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体製造方法における相対不対グリカン
AU2022213913B2 (en) 2021-01-27 2026-01-08 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Single-domain antibody against cd16a and use thereof
JP2024513313A (ja) * 2021-03-08 2024-03-25 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション ＣＤ６６ｅポリペプチドに結合する分子
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
WO2022239720A1 (ja) 2021-05-10 2022-11-17 公益財団法人川崎市産業振興財団 抗原への結合親和性を低減させた抗体
MX2023013640A (es) 2021-05-21 2023-11-30 Amgen Inc Metodo de optimizacion de una receta de llenado para un contenedor de medicamento.
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
WO2023019171A1 (en) 2021-08-10 2023-02-16 Viridian Therapeutics, Inc. Compositions, doses, and methods for treatment of thyroid eye disease
US20250076309A1 (en) 2021-10-05 2025-03-06 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
US20250145723A1 (en) * 2022-01-29 2025-05-08 Minghui Pharmaceutical (Hangzhou) Limited Antigen-binding protein and use thereof
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
AU2024244149A1 (en) * 2023-04-04 2025-08-28 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-igf1r antibodies and uses thereof
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
AU2024287547A1 (en) 2023-07-07 2026-01-22 Viridian Therapeutics, Inc. Methods of treating chronic thyroid eye disease
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1399483A2 (en) * 2001-01-05 2004-03-24 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2090473A1 (en) 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DK1279731T3 (da) 1991-03-01 2007-09-24 Dyax Corp Fremgangsmåde til udvikling af bindende miniproteiner
ATE269401T1 (de) 1991-04-10 2004-07-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
AU658187B2 (en) 1991-04-19 1995-04-06 Boehringer Mannheim Gmbh Human bone derived insulin like growth factor binding protein
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
EP0592677B1 (en) 1992-02-18 2001-11-07 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha Beta-LACTAM COMPOUND AND CEPHEM COMPOUND, AND PRODUCTION THEREOF
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0652950B1 (en) 1992-07-24 2007-12-19 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5861510A (en) 1995-04-20 1999-01-19 Pfizer Inc Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as MMP and TNF inhibitors
CA2218489A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Aya Jakobovits Generation of large genomic dna deletions
DE69637481T2 (de) * 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
JP2000500654A (ja) * 1995-11-14 2000-01-25 トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ 可溶性ｉｇｆ−１受容体による腫瘍成長に対する誘導耐性
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DE69624081T2 (de) 1995-12-20 2003-06-12 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Matrix-metalloprotease Inhibitoren
ES2169355T3 (es) 1996-03-05 2002-07-01 Astrazeneca Ab Derivados de 4-anilinoquinazolina.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) * 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
EP0912559B1 (en) 1996-07-13 2002-11-06 Glaxo Group Limited Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
ES2191187T3 (es) 1996-07-13 2003-09-01 Glaxo Group Ltd Compuestos heteroaromaticos biciclicos como inhibidores de la proteina tirosin-quinasa.
EA199900036A1 (ru) 1996-07-18 1999-06-24 Пфайзер Инк Ингибиторы металлопротеаз матрикса на основе фосфинатов, фармацевтическая композиция, способ лечения
PL331895A1 (en) 1996-08-23 1999-08-16 Pfizer Arylosulphonylamino derivatives of hydroxamic acid
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
DK0950059T3 (da) 1997-01-06 2004-11-01 Pfizer Cycliske sulfonderivater
ATE248812T1 (de) 1997-02-03 2003-09-15 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylhydroxamsäurederivate
JP2000507975A (ja) 1997-02-07 2000-06-27 ファイザー・インク Ｎ−ヒドロキシ−β−スルホニルプロピオンアミド誘導体類及びそれらのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬としての使用
PL334997A1 (en) 1997-02-11 2000-03-27 Pfizer Derivatives or arylosulphonyl-hydroxamic acid
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0984930B1 (en) 1997-05-07 2005-04-06 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
WO1998054093A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
BR9811868A (pt) 1997-08-08 2000-08-15 Pfizer Prod Inc Derivados de ácido ariloxiarilsulfonilamino hidroxâmico
US6294532B1 (en) 1997-08-22 2001-09-25 Zeneca Limited Oxindolylquinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
EP1017682A4 (en) 1997-09-26 2000-11-08 Merck & Co Inc NEW ANGIOGENESIS INHIBITORS
CN1280580A (zh) 1997-11-11 2001-01-17 辉瑞产品公司 用作抗癌药的噻吩并嘧啶和噻吩并吡啶衍生物
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
KR20010034554A (ko) 1998-03-03 2001-04-25 레이몬드, 엠. 위티 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
HUP0103617A2 (hu) 1998-05-29 2002-02-28 Sugen, Inc. Protein kinázt gátló, pirrolilcsoporttal helyettesített 2-indolszármazékok, e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint e vegyületek alkalmazása
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
ES2213985T3 (es) 1998-11-05 2004-09-01 Pfizer Products Inc. Derivados de hidroxiamida de acido 5-oxo-pirrolidin-2-carboxilico.
CA2356215C (en) 1998-12-23 2015-11-24 Pfizer Inc. Human monoclonal antibodies to ctla-4
WO2000050067A1 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Saltech I Göteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic production of insulin-like growth factor-1
DK2168984T3 (da) 1999-03-25 2012-12-10 Abbott Gmbh & Co Kg Humane antistoffer, som binder humant IL-12, og fremgangsmåder til pro-duktion heraf
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US7329745B2 (en) 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
CN103232539B (zh) 2001-06-26 2015-06-03 安姆根弗里蒙特公司 抗opgl抗体
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
CN1835975B (zh) * 2003-08-13 2012-11-21 辉瑞产品公司 经修饰的人类igf-1r抗体
DE602005026779D1 (de) * 2004-01-09 2011-04-21 Pfizer ANTIKÖRPER GEGEN MAdCAM
US9672526B2 (en) 2012-03-13 2017-06-06 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1399483A2 (en) * 2001-01-05 2004-03-24 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kaliman a kol. (1992) J. Biol. Chem. 267 (15), 10645-10651 *
Li a kol. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 92-98 *
Li a kol. (2000) Cancer Immunol. Immunother. 49, 243-252 *
Xiong a kol. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5356-5360 *

Also Published As

Publication number Publication date
EE05724B1 (et) 2014-10-15
US7700742B2 (en) 2010-04-20
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
US7982024B2 (en) 2011-07-19
AP2072A (en) 2009-12-10
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
IL156661A0 (en) 2004-01-04
US9234041B2 (en) 2016-01-12
DE60141855D1 (de) 2010-05-27
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
MX349009B (es) 2017-07-06
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
MY143465A (en) 2011-05-13
AR032028A1 (es) 2003-10-22
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
CR7045A (es) 2005-09-02
PL366340A1 (en) 2005-01-24
TWI324609B (en) 2010-05-11
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
BG108037A (bg) 2005-04-30
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
NO339789B1 (no) 2017-01-30
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
RS51373B (sr) 2011-02-28
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
CR20140001A (es) 2014-02-05
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
GT200100257A (es) 2002-09-02
NZ569856A (en) 2010-03-26
GEP20084484B (en) 2008-09-25
IL156661A (en) 2008-11-26
BR0116728A (pt) 2005-04-12
IS6866A (is) 2003-07-04
US7037498B2 (en) 2006-05-02
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
NO20033074L (no) 2003-07-04
CR10134A (es) 2010-09-14
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
EE201300037A (et) 2014-04-15
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
ME00502B (me) 2011-10-10
CN1330668C (zh) 2007-08-08
ZA200305995B (en) 2004-08-04
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
CU23447B7 (es) 2009-10-16
CN1854157A (zh) 2006-11-01
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
CN1854157B (zh) 2013-01-02
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
EE200300318A (et) 2003-10-15
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
UY27087A1 (es) 2002-06-20
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
EE05715B1 (et) 2014-06-16
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
CN1564829A (zh) 2005-01-12
SG138469A1 (en) 2008-01-28
YU54203A (sr) 2006-03-03
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
UY35948A (es) 2016-08-31
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
ECSP034711A (es) 2003-10-28
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
US7815907B2 (en) 2010-10-19
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
PT1399483E (pt) 2010-07-20
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
OA12589A (en) 2006-06-08
MX337162B (es) 2016-02-15
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
BG112197A (bg) 2016-05-31
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
SV2007000775A (es) 2007-03-15
PA8535501A1 (es) 2003-07-28
US8642037B2 (en) 2014-02-04
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
NZ527302A (en) 2006-10-27
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
CR10786A (es) 2009-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2433800C (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
HK1072059B (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
HK1098162B (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20191220