[go: up one dir, main page]

EE05724B1 - Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile - Google Patents

Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile

Info

Publication number
EE05724B1
EE05724B1 EEP201300037A EEP201300037A EE05724B1 EE 05724 B1 EE05724 B1 EE 05724B1 EE P201300037 A EEP201300037 A EE P201300037A EE P201300037 A EEP201300037 A EE P201300037A EE 05724 B1 EE05724 B1 EE 05724B1
Authority
EE
Estonia
Prior art keywords
igf
antibody
amino acid
nucleic acid
antibodies
Prior art date
Application number
EEP201300037A
Other languages
English (en)
Inventor
Bruce D. Cohen
Jean Beebe
Penelope E. Miller
James D. Moyer
Jose R. Corvalan
Michael Gallo
Original Assignee
Pfizer Inc.
Amgen Fremont Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EE05724(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Inc., Amgen Fremont Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of EE201300037A publication Critical patent/EE201300037A/et
Publication of EE05724B1 publication Critical patent/EE05724B1/et

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • G01N33/575—
    • G01N33/5759—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)

Abstract

Käesolev leiutis käsitleb antikehasid ja nende antigeeni seostavaid osasid, mis seostuvad spetsiifiliselt insuliinitaolise kasvufaktori I retseptoriga (IGF-IR), mis on eelistatavalt inimese IGF-IR. Käesolev leiutis käsitleb samuti inimese anti-IGF-IR-antikehasid, kaasa arvatud kimäärsed, bispetsiifilised, tuletatud, üheahelalised antikehad või fusioonvalkude osad. Leiutis käsitleb samuti immunoglobuliini molekulide isoleeritud raskeid ja kergeid ahelaid, mis on tuletatud anti-IGF-IR-antikehadest, ja nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad niisuguseid molekule. Leiutises kirjeldatakse samuti meetodeid anti-IGF-IR-antikehade valmistamiseks, farmatseutilisi kompositsioone, mis sisaldavad neid antikehasid, ja meetodeid nende antikehade ja kompositsioonide kasutamiseks diagnostikas ja raviks. Samuti kirjeldatakse geeniteraapia meetodeid, milles kasutatakse nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad raskeid ja/või kergeid immunoglobuliini molekule, mis sisaldavad inimese anti-IGF-IR-antikehasid. Samuti käsitletakse geeniteraapia meetodeid ja transgeenseid loomi, mis sisaldavad käesoleva leiutise kohaseid nukleiinhappemolekule.

Description

Käesolev patenditaotlus taotleb, 5. jaanuaril 2001 esitatud patenditaotluse US 60/259927 prioriteeti.
LEIUTISE TAUST
Insuliinitaoliseks kasvufaktoriks (IGF-I) on 7.5 kD polüpeptiid, mis ringleb plasmas suurtes kontsentratsioonides ja on detekteeritav suuremas osas kudedest. IGF-I stimuleerib raku diferentseerumist ja raku proliferatsiooni, ning on vajalik suuremale osale imetaja rakutüüpidst ühtlaseks proliferatsiooniks. Nende rakutüüpide hulka kuuluvad muuhulgas inimese diploidsed fibroblastid, epiteelirakud, silelihasrakud, T-lümfotsüüdid, närvirakud, müeloidrakud, kondrotsüüdid, osteoblastid ja luuüdi tüvirakud. Ülevaate saamiseks laiast spektrist rakutüüpidest, milles IGF-I/IGF-I retseptori interaktsioon vahendab raku proliferatsiooni, vaata artiklit Goldring et al., Eukar. Gene Ekspress., 1: 31-326(1991).
Transduktsiooniraja esimesel etapil, mis viib IGF-I poolt stimuleeritud rakuproliferatsioonile või diferentseerumisele, seostub IGF-I või IGF-II (või insuliini, kui selle kontsentratsioonid on üle füsioloogiliste) IGF-I retseptoriga. See IGF-I retseptor koosneb kahte tüüpi subühikutest: alfasubühik (valk massiga 130-135 kD, mis on tervenisti rakuväline ja mis funktsioneerib, seostades ligandit) ja beetasubühik (transmembraanne valk massiga 95 kD, mis sisaldab transmembraanset ja tsütoplasmaatilist domeeni). IGF-IR kuulub türosiinkinaasi kasvufaktorite retseptorite perekonda (Ullrich et al., Cell 61: 203-212, 1990) ja on struktuurselt analoogne insuliiniretseptoriga (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512,1986). IGF-IR-i sünteesitakse algselt üheahelalise proretseptorpolüpeptiidina, mida seejärel töödeldakse glükosüleerimise, proteolüütilise lõikamise ja kovalentse sidestamisega, et moodustada küps heterotetrameer massiga 460 kD, mis sisaldab kahte alfasubühikut ja kahte beetasubühikut. Sellel (neil) beetasubühiku(i)l on ligandi poolt aktiveeritav türosiinkinaasi aktiivsus. See osaleb ligandi toimet vahendavates signaalradades, mis sisaldavad beetasubühiku autofosforüleerimist ja IGF-IR substraatide fosforüleerimist.
In vivo sõltuvad IGF-I seerumitasemed ajuripatsi poolt eritatava kasvuhormooni (GH - growth hormone) juuresolekust. Kuigi maks on peamiseks kohaks, kus leiab aset GH-st sõltuva IGF-I süntees, on äsjases töös näidatud, et ka enamik normaalsetest kudedest produtseerib IGF-I. Samuti võib IGF-I produtseerida suur hulk neoplastilisi kudesid. Seega, IGF-I võib toimida regulaatorina normaalses ja ebanormaalses rakuproliferatsioonis autokriini või parakriini kaudu, aga ka endokriinsetes mehhanismides. IGF-I ja IGF-II seostuvad IGF-i seostavate valkudega (IGFBP, BP -binding protein) in vivo. Vaba IGF-i saadavust interatsiooniks IGF-IR-ga moduleervad IGFBP-d. Ülevaate saamiseks IGFBP-dest ja IGF-I-st, vaata artiklit Grimberg et al., J.Cell. Physiol. 183: 1-9,2000.
On olulisi tõendeid selle kohta, et IGF-I ja/või IGF-IR hoiavad alal tuumorirakke in vitro ja in vivo. IGF-IR tasemed on kõrgendatud kopsu- (Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990), rinna- (Pollak et al., Cancer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), eesnäärme- ja jämesoole kasvajates (Remaole Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo et al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). Rikutud IGF-I ekspression eesnäärme epiteelis viib transgeensetes hiirtes neoplaasiale (DiGiovanni et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Lisaks sellele, paistab, et IGF-I on autokriinne stimulaator inimese närvitoendkasvajates (Sandberg-Nordqvist et al., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), samal ajal, IGF-I stimuleerib fibrosarkoomide kasvu, mis ekspresseerivad IGF-IR-i liiaga (Butler et al., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Edasi, isenditel, kellel on "kõrged normaalsed" IGF-I tasemed, on suurendatud risk tavaliste vähivormide suhtes, võrreldes isenditega, kellel IGF-I tasemed on "madalate normaalsete" piires (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Paljud nendest tuumoriraku tüüpidest vastavad IGF-I-le kultuuris proliferatiivse signaaliga (Nakanishi et al., J. Clin. Invest. 82: 354-359, 1988; Freed et al., J. Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989), ja in vivo prolieratsiooniks on postuleeritud autokriini- või parakriinikontureid (LeRoith et al., Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995; Yee et al., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Ülevaateks, missugust rolli mängib IGF-I/IGF-I retseptori interaktsioon erinevate inimese tuumorite kasvul, vaata Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
Kõrgendatud IGF-I tasemed on korrelatsioonis ka mitmete patoloogiliste seisunditega, mis ei ole seotud vähiga, sealhulgas akromegaalia ja gigantismiga (Barkan, Ctaseand Clin. J. Med. 65: 343,347-349, 1998), samal ajal, ebanormaalne IGF-I/IGF-I retseptor funktsioon on seotud psoriaasi (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), ateroskleroosi ja veresoonte silelihase restenoosiga, mis leiab aset pärast plastilist operatsiooni veresoontel (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Suurendatud IGF-I tasemed võivad samuti olla probleemiks ka diabeedi või selle komplikatsioonide, näiteks mikrovaskulaarse proliferatsiooni puhul (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Vähendatud IGF-I tasemed, mis leiavad aset muuseas juhtudel, kui GH seerumitasemed on vähendatud, või GH suhtes puudub tundlikkus, või on selle suhtes resistents, on seotud selliste häiretega, nagu väikesekasvulisus (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), neuropaatia, lihasmassi vähenemine ja osteoporoos (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
Kasutades IGF-IR RNA suhtes antisenss ekspressioonivektorit või antisenss oligonukleotiide, on näidatud, et vahelesegamine IGF-IR-ga viib IGF-I või IGF-II poolt vahendatud raku kasvu inhibeerimisele (vaata, näiteks Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). See antisenss-strateegia oli edukas rakuproliferatsiooni inhibeerimisel mitmetes normaalsetes rakutüüpides ja inimese tuumorirakuliinides. Raku kasv võib olla inhibeeritud kasutades IGF-I peptiidanalooge (Pietrzkowski et al., Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 1992; ja Pietrzkowski et al., Mol. Cell. Biol., 12:3883-3889, 1992), või vektorit, mis ekspresseerib antisenss RNA-d IGF-I RNA-le (Trojan et al., Science 259: 94-97, 1992). Lisaks sellele, antikehad IGF-IR-le (Arteaga et al., Breast Canc. Res. Treatm., 22: 101-106, 1992; ja Kalebic et al., Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994) ja dominantsed negatiivsed IGF-IR mutandid (Prager et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 91: 2181-2185, 1994; Li et al., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 ja Jiang et al., Oncogene 18: 6071-77, 1999), võivad transformeeritud fenotüüpi tagasi pöörata, inhibeerida tuumori arengut ja indutseerida metastaatilise fenotüübi hävimist.
IGF-I on tähtis ka apoptoosi reguleerimisel. Apoptoos, mis on programmeeritud rakusurmaks, on kaasatud paljudesse arenguprotsessidesse, kaasaarvatud immuun- ja närvisüsteemi küpsemine. Lisaks sellele, et apoptoos osaleb raku arengus, ta on ka tähtsaks raku kaitsemehhanismiks tuumori arengu vastu (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991; Lane, Nature 362: 786-787, 1993). Apoptootilise programmi mahasurumine suure hulga geneetiliste kahjustuse poolt võib kaasa aidata pahaloomuliste kasvajate tekkele ja arengule.
IGF-I kaitseb apoptoosi eest, mida indutseerib tsütokiini kõrvaldamine IL-3-st sõltuvates vereloomerakkudes (Rodriguez-Tarduchy, G. et al., J. Immunol. 149: 535-540, 1992) ja seerumi kõrvaldamisest Rat-1/mycER rakkudes (Harrington, E., et al., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). IGF-I anti-apoptootiline funktsioon on tähtis rakutsükli toimumise järgses faasis samuti aga rakkudes, mille rakutsükli areng on blokeeritud etoposiidi või tümidiiniga. Demonstratsioon, et c-myc poolt käivitatavad fibroblastid on sõltuvad IGF-I-st nende ellujäämisel, annab võimaluse oletada, et IGF-IR-l on tähtis osa tuumorirakkude alalhoidmisel spetsiifiliselt inhibeeritava apoptoosiga, osa, mis erineb IGF-I või IGF-IR-i proliferatiivsetest toimest. See peaks olema analoogne sellele rollile, mille kohta arvatakse, et nad mängivad teised anti-apoptootilised geenid, näiteks bcl-2 poolt tuumori ellujäämise soodustamisel (McDonnell et al., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry et al., Nature 348: 334-336, 1990).
IGF-I kaitseefektid apoptoosis on sõltuvuses IGF-IR esindatusest rakkude pinnal, mis oleksid võimelised interageerima IGF-I-ga (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Kinnitust IGF-IR antiapoptootilise funktsioonile tuumorirakkude alalhoidmiseks on esitletud uuringutega, milles kasutati antisenssoligonukleotiide IGF-IR-le, mis tegi kindlaks kvuantitatiivse vahekorra IGF IR tasemete, apoptoosi ulatuse ja tuumorigeense potentsiaali vahel roti süngeenses tuumoris (Rescinoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). On leitud, et üleekspresseeritud IGF-IR kaitseb tuumorirakke in vitro etoposiidi poolt indutseeritud apoptoosi eest (Sell et al., Cancer Res. 55: 303-306, 1995) ja veelgi enam, et IGF-IR taasemete vähenemine alla metsiku tüübi tasemete kutsub esile massilise tuumorirakkude apoptoosi in vivo (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Strateegiate hulka, mida on võimalik kasutada apoptoosi indutseerimiseks või kõrgendatud IGF-I, kõrgendatud IGF-II ja/või kõrgendatud IGF-IR retseptori tasemest tingitud raku proliferatsiooni inhibeerimiseks, kuuluvad IGF-I tasemete või IGF-II tasemete mahasurumine või IGF-I IGF-IR-ga seostumise ärahoidmine. Näiteks, pikatoimelist somatostatiini analoogi oktreotiidi on kasutatud IGF sünteesi ja/või sekretsiooni vähendamiseks. Lahustuvat IGF IR on kasutatud indutseerimaks apoptoosi tuumorirakkudes in vivo ja inhibeerimaks tuumorigeneesi eksperimentaalses loomsüsteemis (D'Ambrosio et al., Cancer Res. 56: 4013-20, 1996). Lisaks sellele on IGF-I või IGF-IR ekspressiooni vähendamiseks kasutatud IGF-IR antisenssoligonukleotiide, IGF-I peptiidanalooge ja antikehasid IGF-IR-le (vaata eelpool). Kuid ükski nendest ühenditest ei ole kõlbulik pikaajaliseks manustamiseks inimpatsientidele. Lisaks sellele, kuigi IGF-I on manustatud patsientidele lühikasvulisuse, osteoporosi, vähendatud lihasmassi, neuropaatia või diabeedi raviks, IGF-I seostumine IGFBP-dega teeb selle ravi IGF-I-ga raskeks või ebaefektiivseks.
Järelikult, lähtudes sellest, missuguseid rolle mängivad IGF-I ja IGF-IR niisugustes tervisehäiretes, nagu vähk ja teised proliferatiivsed häired, milles IGF-I ja/või IGF-IR on üleekspresseeritud, ja tervisehäiretes, kus on liiga vähe IGF-I-i ja IGF-IR-i, näiteks selliste haiguste puhul, nagu lühike kasv, nõrkus, kus IGF-I ja/või IGF-IR on alaekspresseeritud, on soovitav genereerida antikehasid IGF-IR vastu, mis võiksid olla kasutatud kas IGF-IR inhibeerimiseks või stimuleerimiseks. Kuigi on teatatud, et teatud autoimmuunseid haigusi põdevates patsientides on leitud anti-IGF-IR-antikehasid, neid antikehasid ei ole puhastatud ja ei ole näidatud nende sobilikkust IGF-I aktiivsuse inhibeerimisel diagnostilistes või kliinilistes meetodites. Vaata näiteks Thompson et al., Pediat. Res. 32: 455-459, 1988; Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; Weightman et al., Autoimmunity 16: 251-257, 1993; Drexhage et al., Nether. J. of Med. 45: 285-293, 1994. Seega, võib olla soovitav saada kõrge affiinsusega inimese anti-IGF-IR-antikehasid, mis võiksid olla kasutatud haiguste raviks inimeses.
JOONISTE LÜHIKIRJELDUS
Joonistel fig 1A-1C on kohakuti paigutatud kuus inimese anti-IGF-IR-antikeha kerge ahela variaabelpiirkondade nukleotiidjärjestust ja eellasjärjestust. Joonisel fig 1A on kohakuti teineteisega paigutatud antikehade kergete ahelate (VL) variaabelpiirkondade nukleotiidjärjestused 2.12.1 (SEQ ID NO: I) 2.13.2 (SEQ ID NO: 5), 2.14.3 (SEQ ID NO: 9) ja 4.9.2 (SEQ ID NO: 13) ja eellasjärjestus VKA30 (SEQ ID NO: 39). Joonisel fig 1B on kõrvutatud antikeha VL nukleotiidjärjestust 4.17.3 (SEQ ID NO: 17) eellasjärjestusega VK012 (SEQ ID NO: 41). Joonisel fig 1C on kõrvutatud antikeha VL nukleotiidjärjestust 6.1.1 (SEQ ID NO: 21) eellasjärjestustega VKA27 (SEQ ID NO: 37). Kõrvutustel on samuti näha iga antikeha VL CDR piirkonda. Konsensusjärjestused joonistele fig 1A-1C on toodud vastavalt järjestustes SEQ ID NO: 53-55.
Joonistel fig 2A-2D on kõrvutatud üksteisega kuue inimese anti-IR antikeha raske ahela variaaebelpiirkondade nukleotiidjärjestust ja eellasjärjestustega. Joonisel fig 2A on kõrvutatud antikeha VH nukleotiidjärjestust 2.12.1 (SEQ ID NO: 3) eellasjärjestustega VH DP-35 (SEQ ID NO: 29). Joonisel fig 2B on kõrvutatud antikeha VH nukleotiidjärjestust 2.14.3 (SEQ ID NO: 11) eellasjärjestustega VIV-4/4.35 (SEQ ID NO: 43). Joonistel fig 2C-1 ja 2C-2 on kõrvutatud antikehade VH nukleotiidjärjestusi 2.13.2 (SEQ ID NO: 7), 4.9.2 (SEQ ID NO: 15) ja 6.1.1 (SEQ ID NO: 23) teine teisega ja eellasjärjestustega VH DP-47 (SEQ ID NO: 31). Joonisel fig 2D on kõrvutatud antikeha 4.17.3 VH nukleotiide järjestust (SEQ ID NO: 19) eellasjärjestustega VH DP-71 (SEQ ID NO: 35). Selles kõrvutuses on toodud ka CDR piirkonnad nendes antikehades. Konsensusjärjestused joonistele fig 2A-2D on toodud vastavalt järjestustes SEQ ID NO: 56-59.
Joonisel fig 3 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikehad 2.13.2, 4.9.2 ja 2.12.1 inhibeerivad IGF-I seostumist 3T3-IGF-IR rakkudega.
Joonisel fig 4 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikeha 4.9.2 inhibeerib IGF-I poolt indutseeritud retseptori türosiini fosforüleerimist (ülemine paneel) ja indutseerib IGF-IR allareguleerimist raku pinnal (alumine paneel).
Joonisel fig 5 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikehad 2.13.2 ja 4.9.2 vähendavad IGF-IR fosfotürosiinisignaali 3T3-IGF-IR tuumorites.
Joonisel fig 6 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikehad 2.13.2 ja 4.9.2 vähendavad IGF-IR hulka 3T3-IGF-IR tuumorites.
Joonisel fig 7 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 inhibeerib 3T3-IGF-IR tuumori kasvu in vivo omaette (vasak paneel) või kombinatsioonis adriamütsiiniga (parem paneel).
Joonisel fig 8 on näidatud sõltuvust anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 seerumitasemete ja IGF-IR allareguleerimise vahel 3T3-IGF-IR tuumorites.
Joonisel fig 9 on näidatud, et mitmesed doosid anti-IGF-IR-antikehasid 2.13.2 inhibeerivad 3T3-IGF-IR tuumori kasvu in vivo omaette või kombinatsioonis adriamütsiiniga.
Joonisel fig 10 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikehad 2.13.2 inhibeerivad suure tuumori kasvu in vivo kombinatsioonis adriamütsiiniga.
Joonisel fig 11 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikehad 2.13.2 inhibeerivad Colo 205 tuumori kasvu in vivo, kas omaette või kombinatsioonis 5-deoksüuridiiniga (5-FU).
Joonisel fig 12 on näidatud, et mitmesed doosid anti-IGF-IR-antikehasid 2.13.2 inhibeerivad Colo 205 tuumori kasvu in vivo kas omaette või kombinatsioonis 5-FU-ga.
Joonisel fig 13 on näidatud, et mitmesed doosid anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 inhibeerivad MCF-7 tuumori kasvu in vivo kas omaette või kombinatsioonis taksooliga.
Joonisel fig 14 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 inhibeerib MCF-7 tuumori kasvu in vivo kas omaette (vasak paneel) või kombinatsioonis adriamütsiiniga (parem paneel).
Joonisel fig 15 on näidatud, et mitmesed doosid anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 inhibeerivad MCF-7 tuumori kasvu in vivo kas omaette või kombinatsioonis tamoksifeeniga.
Joonisel fig 16 on näidatud, et mitmesed doosid anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 inhibeerivad A431 tuumori kasvu kasv in vivo kas omaette või kombinatsioonis epidermaalse kasvufaktori retseptori (EGF-R) türosiinkinaasi inhibiitoriga CP-358,774.
Joonisel fig 17 on toodud farmakokineetiline hinnang ühekordsele anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 intravenoossele injektsioonile , mis oli tehtud ahvidele Künomolgus.
Joonisel fig 18 on näidatud, et anti-IGF-IR-antikeha 2.13.2 ja adriamütsiini kombinatsioon suurendab IGF-IR allaregulatsiooni 3T3-IGF-IR tuumorites in vivo.
Joonisel fig 19A on näidatud mutatsioonide arvu erinevates antikehade 2.13.2 ja 2.12.1 raskete ja kergete ahelate piirkondades võrreldes eellasjärjestustega.
Joonistel 19A-D on kõrvutatud antikehade 2.13.2 ja 2.12.1 aminohappejärjestusi rasketest ja kergetest ahelatest eellasjärjestustega, millest nad tuletatud on. Joonisel fig 19B on kõrvutatud antikeha raske ahela 2.13.2 (SEQ ID NO: 45) aminohappejärjestust eellasjärjestustega DP-47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEQ ID NO: 46). Joonisel fig 19C on kõrvutatud antikeha 2.13.2 kerge ahela aminohappejärjestust (SEQ ID NO: 47) eellasjärjestustega A30/Jk2 (SEQ ID NO: 48). Joonisel fig 19D on kõrvutatud antikeha 2.12.1 raske ahela aminohappejärjestust (SEQ ID NO: 49) eellasjärjestustega DP-35(3-ll)/D3-3/JH6 (SEQ ID NO: 50). Joonisel fig 19E on kõrvutatud antikeha 2.12.1 kerge ahela aminohappejärjestust (SEQ ID NO: 51) eellasjärjestustega A30/Jk1 (SEQ ID NO: 52). Joonistel 19B-E on signaaljärjestused toodud kaldkirjas, CDR-d on alla kriipsutatud, konstantsed domeenid on toodud rasvaselt, karkassi (FR, framework) mutatsioonid on esile tõstetud märgiga pluss ( + ) aminohappejäägi kohal ja CDR mutatsioonid on esile toodud tärniga aminohappejäägi kohal.
LEIUTISE KOKKUVÕTE
Käesolev leiutis esitleb isoleeritud antikeha või selle antigeeni seostavat osa, mis seostub IGF-IR-ga, eelistatavalt seda, mis seostub primaadi ja inimese IGF-IR-ga, ja enam eelistatavalt seda, milleks on inimese antikeha. Käesolev leiutis esitleb anti-IGF-IR-antikeha, mis inhibeerib IGF-I või IGF-II seostumist IGF-IR-ga ning esitleb samuti anti-IGF-IR-antikeha, mis aktiveerib IGF-IR-i.
Käesolev leiutis esitleb farmatseutilist kompositsiooni, mis sisaldab seda antikeha ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandjat. See farmatseutiline kompositsioon võib lisaks sisaldada teist komponenti, näiteks sellist nagu tuumorivastane agens või visualiseeriv reagent.
Käesolevas leiutises on samuti esitletud diagnostilisi ja terapeutilisi meetodeid. Diagnostiliste meetodite hulka kuulub meetod IGF-IR-i ekspresseerivate kudede asukoha või olemasolu kindlaksmääramiseks, kasutades anti-IGF-IR-antikehasid. Terapeutiline meetod sisaldab, selle vajadusel, antikeha manustamist subjektile, eelistatavalt manustamist koos teise terapeutilise agensiga.
Käesolev leiutis esitleb isoleeritud rakuliini, näiteks sellist nagu hübridoom, mis produtseerib anti-IGF-IR-antikeha.
Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad anti-IGF-IR-antikeha rasket ja/või kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa. Käesolev leiutis esitleb vektoreid ja peremeesrakke, mis sisaldavad nukleiinhappemolekule, aga ka meetodeid nukleiinhappemolekulides kodeeritud polüpeptiidide rekombinantseks valmistamiseks.
Samuti on esitletud transgeenseid loomasid, kes ei ole inimene, mis ekspresseerivad anti-IGF-IR-antikeha rasket ja/või kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa. Käesolev leiutis esitleb samuti meetodit subjekti raviks, selle vajadusel, efektiivse koguse anti-IGF-IR-antikeha raske ja/või kerge ahela või selle antigeeni seostava osa kodeeriva nukleiinhappemolekuli abil.
KÄESOLEVA LEIUTISE DETAILNE KIRJELDUS
Definitsioonid ja põhilised meetodid
Kui teisiti öeldud ei ole, siis teaduslikel ja tehnilistel termininitel, mida on kasutatud seoses käesoleva leiutisega, on keskmise spetsialisti poolt üldmõistetavad tähendused. Edasi, kui kontekst teisiti ei nõua, siis sisaldavad ainsuses kasutatud termininid mitmust ja mitmuses olevad termininad sisaldavad ainsust. Üldjuhul on siin kasutatavad nomenklatuurid ja siinkirjeldatud raku ja koekultuuri, molekulaarbioloogia, immunoloogia, mikrobioloogia, geneetika ja valgu ning nukleiinhappe keemia ja hübridisatsiooni meetodid erialaselt hästi tuntud ja üldkasutatavad. Käesoleva leiutise kohaseid meetodeid ja metoodikaid on üldjuhul kasutatud traditsiooniliselt, mis on erialaselt hästi tuntud ja kirjeldatud erinevates üld- ja spetsiifilisemates viidetes, mida on tsiteeritud ja arutatud käesolevas spetsifikatsioonis, kui just teisiti ei ole öeldud. Vaata, näiteks Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ja Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), ja Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990), mis on siin viitena sisse lülitatud. Ensümaatilisi reaktsioone ja puhastusmeetodeid on kasutatud vastavalt valmistajate spetsifikatsioonidele, nagu neid erialaselt tavaliselt kasutatakse või nagu siin kirjeldatud. Siinkasutatud nomenklatuurid ja siinkirjeldatud analüütilise keemia, sünteetilise orgaanilise keemia ja meditsiinilise ja farmatseutilise keemia laboratoorsed metoodikad ja aparatuur on erialaselt hästi tuntud ja üldkasutatavad. Keemilistes sünteesides, keemilistes analüüsides, farmatseutilises ettevalmistustes, preparaatide formuleerimisel ja nende kohaletoimetamisel ning patsientide ravil on kasutatud standardseid meetodeid.
Järgmised terminid, kui teisiti öeldud ei ole, on mõistetavad alljärgnevates tähendustes.
Termin "polüpeptiid" hõlmab natiivseid või kunstlikke valke, valgu fragmente ja valgujärjestuse polüpeptiidanalooge. Polüpeptiid võib olla monomeerne või polümeerne.
Termin "isoleeritud valk" või "isoleeritud polüpeptiid" tähendab valku või polüpeptiidi, mis tänu oma päritolule või päritoluallikale (1) ei ole seotud looduslikult seotud komponentidega selle natiivses olekus, (2) on vaba sama liigi teistest valkudest (3) on ekspresseeritud teise liigi raku poolt või (4) mida ei leidu looduses. Seega polüpeptiid, mis on keemiliselt sünteesitud või sünteesitud rakusüsteemis, mis erineb rakust, millest see looduslikult pärineb, peaks olema "isoleeritud" sellega looduslikult seotud komponentidest. Valk võib samuti olla muudetud sisuliselt vabaks looduslikult assotsieeritud komponentidest eraldamisega, kasutades erialaselt hästi tuntud valgu puhastamise metoodikaid.
Valk või polüpeptiid on "praktiliselt puhas", "praktiliselt homogeenne" või "praktiliselt puhastatud", kui vähemalt umbes 60 kuni 75% proovist on esindatud ühe polüpeptiidiliigiga. See polüpeptiid või valk võib olla monomeerne või multimeerne. Sisuliselt puhas polüpeptiid või valk peaks tüüpiliselt sisaldama umbes 50, 60 ,70, 80 või 90% W/W (kaal/kaal) valguproovist, tavalisemalt umbes 95%, ja eelistatavalt peaks olema üle 99% puhas. Valgu puhtus või homogeensus võib olla näidatud paljude erialaselt tuntud moodustega, näiteks sellisega nagu valguproovi polüakrüülamiidgeelelektroforees, millele järgneb üksiku polüpeptiidriba visualiseerimine geeli värvimisel erialaselt hästi tuntud värviga. Teatud eesmärkidel võib suurem lahutusvõime olla tagatud HPLC või teiste erialaselt hästi tuntud puhastamise mooduste kasutamisega.
Termin "polüpeptiidfragment", kasutatuna siin, viitab polüpeptiidile, millel on aminoterminaalne ja/või karboksüterminaalne deletsioon, kuid seejuures allesjäänud aminohappejärjestus on identne vastavatele positsioonidele looduslikus järjestuses. Fragmendid on tüüpiliselt vähemalt 5, 6, 8 või 10 aminohappejäägi pikkused, eelistatavalt vähemalt 14 aminohappejäägi pikkused, enam eelistatavalt vähemalt 20 aminohappejäägi pikkused, tavaliselt vähemalt 50 aminohappe pikkused ja veelgi enam eelistatavalt vähemalt 70, 80, 90, 100, 150 või 200 aminohappejäägi pikkused.
Termin "polüpeptiidanaloog", kasutatuna siin viitab polüpeptiidile, mis sisaldab segmenti, mis koosneb vähemalt 25-st aminohappest, millel on olemuslik identsus selle osa aminohappejärjestusega, ja millel on vähemalt üks järgmistest omadustest: (1) spetsiifiline seostumine IGF-IR-ga sobivates seostumistingimustes, (2) võime blokeerida IGF-I või IGF-II seostumist IGF-IR-ga, või (3) võime vähendada IGF-IR raku pinna ekspressiooni või türosiini fosforüleerimist in vitro või in vivo. Tüüpiliselt sisaldavad polüpeptiidanaloogid konservatiivseid aminohappeasendusi (kas insertsioon või deletsioon) võrreldes looduslikult leiduva järjestusega. Analoogid on tüüpiliselt vähemalt 20 aminohappejäägi pikkused, eelistatavalt vähemalt 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 või 200 aminohappejäägi pikkused või pikemad ja võivad tihti olla sama pikad kui täispikk looduslikult leiduv polüpeptiid.
Eelistatud aminohappe asendusteks on sellised, mis: (1) vähendavad tundlikkust proteolüüsile, (2) vähendavad tundlikkust oksüdatsioonile, (3) muudavad seostumise afiinsust valgukomplekside moodustamisel, (4) muudavad seostumise afiinsusi ja (4) lisavad niisugustele analoogidele teisi füüsikaliskeemilisi või funktsionaalseid omadusi või moditseerivad neid. Analoogide hulka võivad kuuluda järjestuse erinevad muteerunud variandid, mille järjestus on erinev looduslikult leiduvatest peptiididest. Näiteks, looduslikult leiduvates järjestustes võivad olla tehtud üksiku või mitme aminohappe asendused, eelistatavalt konservatiivsed aminohappe asendused ja eelistatavalt selles polüpeptiidi osas, mis jääb väljapoole domeeni(e), mis moodustab molekulidevahelisi kontakte. Konservatiivne aminohappeasendus ei tohiks muuta oluliselt esialgse järjestuse struktuurseid karakteristikuid (näiteks, aminohappe asendus ei tohiks kutsuda esile esialgses järjestuses oleva a-spiraali katkestamist, või lõhkuda teist tüüpi sekundaarset struktuuri, mis on iseloomulik esialgsele järjestusele). Näiteid erialaselt tunnustatud polüpeptiidi sekundaarsest ja tertsiaarsest struktuurist on kirjeldatud monograafias Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); ja Thornton et al. Nature 354: 105 (1991), millest igaüks on siin viitena sisse lülitatud.
Mittepeptiidanalooge kasutatakse tavaliselt farmatseutilises tööstuses ravimitena, mille omadused on analoogsed ðabloonpeptiidiga. Neid mittepeptiidiühendite tüüpe nimetatakse terminiga "peptiidijäljendajad" või "peptiidimimikeerijad". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); ja Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), mis on siin viidetena sisse lülitatud. Niisugused ühendid on tihti välja arendatud, kasutades arvutiga molekulaarmodelleerimist. Peptiidijäljendajad, mis on struktuurselt analoogsed terapeutiliselt kasulike peptiididega, võivad olla kasutatud ekvivalentse terapeutilise või profülaktilise efekti tekitamiseks. Üldjuhul on peptiidijäljendajad struktuurselt analoogsed paradigma polüpeptiidiga (s.o polüpeptiidiga, millel on soovitav biokeemiline omadus või farmakoloogiline toime), näiteks inimese antikehaga, kuid millesse on sisse viidud üks või enam peptiidsidet, mis on valikuliselt asendatud sidemega, mis on valitud sidemeterühmast, kuhu kuuluvad -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis ja trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, ja -CH2SO-, kasutades erialaselt hästi tuntud meetodit. Süstemaatiline ühe või enama aminohappe asendus konsensusjärjestuses sama tüüpi D-aminohappega (näiteks L-lüsiini asemel D-lüsiin) võib samuti olla kasutatud stabiilsete peptiidide tekitamiseks. Lisaks sellele võivad olla genereeritud piiratud pikkusega peptiidid, mis sisaldavad konsensusjärjestust või praktiliselt identset konsensusjärjestuse variatsiooni, mis võib olla tehtud erialaselt tuntud meetoditega (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), mis on siin viidetena sisse lülitatud); näiteks viies sisse tsüsteiinijäägi, mis on võimeline moodustama molekulidevahelisi sildu, mis võivad tsüklistada seda peptiidi.
"Immunoglobuliin" on tetrameerne molekul. Looduslikus immunoglobuliinis on iga tetrameer moodustatud kahest identsest polüpeptiidahelapaarist, millest iga paar sisalab "kerget" (umbes 25 kDa) ja ühte "rasket" ahelat (umbes 50-70 kDa). Iga ahela aminoterminaalne osa sisaldab variaabelpiirkonda, mis koosneb umbes 100 kuni 110 või enamast aminohappest, mis on primaarselt vastutavad antigeeni äratundmise eest. Iga ahela karboksüterminaalne osa moodustab konstantse piirkonna, mis primaarselt vastutab efektorfunktsiooni eest. Inimese kerged ahelad on klassifitseeritud kapa- ja lambda-kergeteks ahelateks. Rasked ahelad on klassifitseeritud kui müü, delta, gamma, alfa või epsilon, ja on defineeritud kui antikehade isotüübid IgM, IgD, IgG, IgA, ja IgE, vastavalt. Kergetes ja rasketes ahelates on variaabel- ja konstantsed piirkondad omavahel ühendatud J-piirkonnaga, mis koosneb umbes 12 või enamast aminohappest, raske ahel sisaldab lisaks D-piirkonda, mis koosneb veel umbes 10-st aminohappest. Vaata põhiliselt, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (mis on siin täies ulatuses, kõikidel eesmärkidel viitena sisse lülitatud). Variaabelpiirkonnad igas kerge/raske ahela paaris moodustavad antikeha seostava osa, mistõttu intaktsel immunoglobuliinil on kaks seostumissaiti.
Immunoglobuliini ahelatel on suhteliselt konservatiivsed karkasspiirkonnad (FR, framework regions), millel on samalaadne põhistruktuur, mis on seotud kolme hüpervariaabelpiirkonnaga, mida nimetatakse samuti komplementaarsust määravateks piirkondadeks või CDR-deks (CDR, complementarity determinining regiori). CDR-d kahest ahelast igas paaris on kohakuti paigutatud karkasspiirkondadega, mis võimaldab seostumist spetsiifilise epitoobiga. Nii kerge kui raske sisaldavad ahel N-otsast kuni C-otsani, domeene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 ja FR4. Aminohapete kuuluvus igasse domeeni vastab Kabafi definitsioonidega, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 ja 1991)), või Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196 : 901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342 : 878-883 (1989).
Termin "antikeha" käib intaktse immunoglobuliini või selle antigeeni seostava osa kohta, mis konkureerib spetsiifilisel seostumisel intaktse antikehaga. Antigeeni seostav osa võib olla produtseeritud rekombinantse DNA meetoditega või antikehade ensümaatilise või keemilise lõhustamisega. Antigeeni seostav osa sisaldab, muuhulgas selliseid piirkondi, nagu Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, dAb ja komplementaarsust määrava piirkonna (CDR) fragmente, üheahelalisi antikehasid (scFv), kimäärseid antikehasid, kaksikantikehasid ja polüpeptiide, mis sisaldavad vähemalt osa immunoglobuliinist, mis on oluline selleks, et anda sellele polüpeptiidile spetsiifilist antigeeni seostavad omadused.
Siin kasutatuna, antikehaks, mida on tähistatud kui näiteks 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 ja 6.1.1, on antikeha, mis on tuletatud samanimelisest hübridoomist. Näiteks antikeha 2.12.1 on tuletatud hübridoomist 2.12.1.
Fab-fraginent on monovalentne fragment, mis koosneb VL, VH, CL ja CH I domeenidest; F(ab')2-fragment on bivalentne fragment, mis sisaldab kahte Fab fragmenti, mis on omavahel seotud liigendpiirkonnas disulfiidsillaga; Fd-fragment koosneb VH ja CH1 domeenidest; Fv-fragment koosneb VL ja VH domeenidest antikeha ühes poolikus; ja dAb-fragment (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989) koosneb VH domeenist.
Üheahelaliseks antikehaks (scFv) on antikeha, milles VL ja VH piirkonnad on paari pandud sünteetilise linkeriga, moodustamaks monovalentsed molekulid, mis võimaldab neist valmistada üksiku valguahela (Bird et al., Science 242: 423 - 426, 1988 ja Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA 85: 5879 - 5883, 1988). Kaksikantikehad on kahevalentsed, bispetsiifilised antikehad, milles VH ja VL domeenidon ekspresseeritud ühes polüpeptiidahelas, kuid kasutades linkerit, mis on liiga lühike, et võimaldada neid kahte domeenil paari panna samal ahelal, mistõttu need domeenid pannakse kokku komplementaarsete domeenide abil, teisel ahelal ja luues kaks antigeeni siduvat saiti (vaata näiteks Holliger, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993, ja Poljak, R. J., et al., Struktuur 2: 1121-1123, 1994). Üks või enam CDR-i võib olla sisse lülitatud molekuli, kas kovalentselt või mittekovalentselt, et teha see immunoadhesiivseks. Immunoadhesiin võib lülitada endasse CDR-i(d), kui osa suuremast polüpeptiidahelast, võib kovalentselt seostada CDR-i(d) teise polüpeptiidahelaga või võib endasse lülitada CDR-i(d) mittekovalentselt. Need CDR-d võimaldavad sellel immunoadhesiinil spetsiifiliselt seostuda konkreetse, huvipakkuva antigeeniga.
Antikehal võib olla üks või mitu seostumissaiti. Kui sellel on enam kui üks seostumissait, siis need seostumissaidid võivad olla üksteisega identsed või erinevad.
Näiteks looduslikel immunoglobuliinidel on kaks identset seostumissaiti, üheahelalisel antikehal või Fab-fragmendil on üks seostumissait, samal ajal kui "bispetsiifilisel" või "bifunktsionaalsel" antikehal on kaks erinevat seostumissaiti.
"Isoleeritud antikehaks" on antikeha, mis (1) ei ole seotud looduslikult assotsieeritud komponentidega, kaasaarvatud teised looduslikult assotsieeritud antikehad, mis saadavad neid natiivses olekus, (2) on vabad teistest sama liigi valkudest, (3) on ekspresseeritud teise liigi raku poolt, või (4) ei leidu looduses. Isoleeritud antikehade näidete hulka kuuluvad anti-IGF-IR-antikeha, mis on afiinselt puhastatud, kasutades IGF-IR ja on isoleeritud antikeha, anti-IGF-IR-antikeha, mis on sünteesitud hübridoomi või teise rakuliini poolt in vitro, ja inimese anti-IGF-IR-antikeha, mis on tuletatud transgeensest hiirest.
Termin "inimese antikeha" hõlmab kõiki antikehasid, millel on üks või enam variaabel- ja konstantset piirkonda, mis on tuletatud inimese immunoglobuliini järjestustest. Eelistatud teostusvariandis kõik variaabel- ja konstantsed domeenid on tuletatud inimese immunoglobuliini järjestustest (tervest inimese antikehast). Need antikehad, nagu allpool kirjeldatud, võivad olla valmistatud paljudel eri viisidel.
Humaniseeritud antikehaks on antikeha, mis on tuletatud mitte inimliigist, milles teatud aminohapped karkassis ning raske ja kerge ahela konstantsetes domeenides on asendatud nii, et ära hoida või ära muuta immuunvastus inimeses. Alternatiivselt, humaniseeritud antikeha võib olla produtseeritud, sulandades kokku konstantseid domeene inimese antikehast variaabeldomeenidesse, mis on saadud liigist, mis ei ole inimene. Näited sellest, kuidas valmistada humaniseeritud antikehasid, võib leida patentides US 6054297, US 5886152 ja US 5877293.
Termin "kimäärne antikeha" käib sellise antikeha kohta, mis sisaldab ühte või enamat piirkonda ühest antikehast ja ühest või enamast piirkonnast, ühest või enamast teisest antikehast. Eelistatud teostusvariandis, üks või enam CDR-i on tuletatud inimese anti-IGF-IR-antikehast. Enameelistatud teostusvariandis, kõik CDR-d on tuletatud inimese anti-IGF-IR-antikehast. Teises eelistatud teostusvariandis on CDR-d enam kui ühest inimese anti-IGF-IR-antikehast segatud ja sobitatud kimäärsesse antikehasse. Kimäärne antikeha võib näiteks sisaldada CDR1 esimesest inimese anti-IGF-IR-antikehast pärinevast kergest ahelast, mis võib olla kombineeritud CDR2 ja CDR3-ga teisest inimese anti-IGF-IR-antikehast pärinevast kergest ahelast, ja need CDR-d raskest ahelast võivad olla tuletatud kolmandast anti-IGF-IR-antikehast. Edasi, karkassipiirkonnad võivad olla tuletatud ühest neist anti-IGF-IR-antikehadest, "ühest või enamast erinevatest antikehast, näiteks inimese antikehast või humaniseeritud antikehast.
"Neutraliseeriv antikeha" või "inhibiitorantikeha" on antikeha, mis inhibeerib IGF-IR seostumist IGF-I-ga, kui anti-IGF-IR-antikeha liig vähendab IGF-I kogust, mis on seotud IGF-IR-ga vähemalt umbes 20% võrra. Eelistatud teostusvariandis, see antikeha redutseerib IGF-I-i kogust, mis on seotud IGF-IR-ga vähemalt 40% võrra, enam eelistatavalt 60% võrra, veelgi enam eelistatavalt 80% võrra, või isegi veel enam eelistatavalt 85% võrra. Sellist seostumise vähenemist võib mõõta ükskõik millise keskmise kvalifikatsiooniga spetsialistile tuntud moodusega, näiteks mõõtes in vitro seostumist konkurentses seostumistestis. Näide IGF-I IGF-IR-ga seostumise vähenemise mõõtmisest on toodud allpool näites IV.
"Aktiveeriv antikeha" on antikeha, mis aktiveerib IGF-IR-i vähemalt umbes 20% võrra, kui seda on lisatud rakule, koele või organismile, mis ekspresseerib IGF-IR-i. Eelistatud teostusvariandis, see antikeha aktiveerib IGF-IR-i aktiivsust vähemalt 40% võrra, enam eelistatavalt 60% võrra, veel enam eelistatavalt 80% võrra või veelgi enam eelistatavalt 85% võrra. Enameelistatud teostusvariandis seda aktiveerivat antikeha lisatakse IGF-I või IGF-II juuresolekul. Teises eelistatud teostusvariandis aktiveeriva antikeha aktiivsust mõõdeti määrates türosiini autofosforüleerimise ulatust IGF-IR-s.
Antikehade fragmendid või analoogid võivad kergesti olla valmistatud keskmise kvalifikatsiooniga spetsialisti poolt, järgides selles spetsifikatsioonis toodud metoodikaid.
Fragmentide või analoogide eelistatud amino-ja karboksüotsad on funktsionaalsete domeenide läheduses. Struktuursed ja funktsionaalsed domeenid võivad olla identifitseeritud, võrreldes nukleotiid- ja/või aminohappejärjestuse andmeid avalike või eraandmebaasidega. Järjestuse juhtmõtete või teiste tuntud struktuuri ja/või funktsiooniga valkudes leiduvate konformatsioonidomeenide identifitseerimiseks ennustatavas valgus kasutatakse eelistatavalt komputeriseeritud võrdlusmeetodeid.
Kolmemõõtmelist struktuuri moodustavate valgujärjestuste identifitseerimise meetodid on teada. Bowie et al., Science 253: 164 (1991).
Termin "pinnaplasmonresonants", kasutatuna siin viitab optilisele fenomenile, mis võimaldab kasutada biospetsiifiliste interaktsioonide analüüsi reaalajas, detekteerides muutusi valgu kontsentratsioonides biosensormaatriksi siseselt, näiteks süsteemi BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N. J.). Lisa kirjelduste saamiseks vaata Jonsson, U., et al., (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11 : 620-627; Johnsson, B., et al., (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 ; ja Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
Termin "Koff" on konstant, mis käib antikeha väljadissotsieerumise kiiruse kohta antikeha/antigeeni kompleksist.
Termin "Kd" käib konkreetse antikeha-antigeeni interaktsiooni dissotsiatsiooni konstandi kohta.
Termin "epitoop" hõlmab ükskõik millist valgu determinanti, mis on võimeline spetsiifiliselt seostuma immunoglobuliini või T-raku retseptoriga. Epitoopilised determinandid koosnevad tavaliselt keemiliselt aktiivsetest molekulide pinnarühmitustest, näiteks sellistest, nagu aminohapete või suhkru külgahelad, ja neil on iseloomulikud, tavaliselt spetsiifilised kolmemõõtmelised struktuursed karakteristikud, aga ka spetsiifilised laengukarakteristikud. Antikeha seostub spetsiifiliselt antigeeniga, kui selle kompleksi dissotsiatsioonikonstant on väiksem või võrdne 1 mikroM, eelistatavalt väiksem või võrdne 100 nM ja enim eelistatavalt väiksem või võrdne 10 nM.
Kahekümne traditsioonilise aminohappe nimetusi ja nende lühendeid on siin kasutatud traditsioonilises tarvitusviisis. Vaata Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub ja D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), mis on siin viitena sisse lülitatud. Kahekümne traditsiooniline aminohappe stereo isomeerid (näiteks, D-aminohapped), ebaloomulikud aminohapped, näiteks alfa-, alfa-diasendatud aminohapped, N-alküülaminohapped, piimhape ja teised mittetraditsioonilised aminohapped võivad samuti olla sobivateks käesoleva leiutise kohaste polüpeptiidide komponentideks. Mittetraditsiooniliste aminohapete näidete hulka kuuluvad: 4-hüdroksüproliin, gamma-karboksüglutamaat, epsilon-N,N,N-trimetüüllüsiin, epsilon-N-atsetüüllüsiin, O-fosfoseriin, N-atsetüülseriin, N-formüülmetioniin, 3-metüülhistidiin, 5-hüdroksülüsiin, s-N-metüülarginiin ja teised analoogsed amino- ja iminohapped (näiteks, 4-hüdroksüproliin). Vastavalt standardsele kasutamisele ja kokkuleppele on siin kasutatud polüpeptiidi märgistusüsteemi, milles polüpeptildl vasem ots on amino-ots ja parem ots on karboksü-ots.
Termin "polünukleotiid", kasutatuna siin tähendab nukleotiidi polümeerset vormi, mis koosneb pikkupidi vähemalt 10 alusest, milleks on kas ribonukleotiidid või deoksünukleotiidid või ükskõik millist tüüpi nukleotiidi modifitseeritud vorm. See termin hõlmab ühe-ja kahespiraalset DNA vormi.
Termin "isoleeritud polünukleotiid" kasutatuna siin tähendab genoomse, cDNA või sünteetilise päritoluga polünukleotiidi või mõningaid nende kombinatsioone, mis sõltuvalt selle päritolust (1) ei ole assotsieeritud kõikide või osa polünukleotiididega, milles nimetatud "isoleeritud polünukleotiid" looduslikult leidub, (2) kunstlikult seostatud polünukleotiidiga, millega ta ei ole looduslikult seotud, või (3) mida ei leidu looduses, kui osa suuremast järjestusest.
Termin "oligonukleotiid" kasutatuna siin sisaldab looduslikult leiduvaid ja modifitseeritud nukleotiide, mis on seostatud teineteisega looduslike või mittelooduslike oligonukleotiidseostajatega. Oligonukleotiidid on polünukleotiidi alarühm, mille pikkused on tavaliselt 200 või vähem alust. Eelistatavalt on oligonukleotiidid 10 kuni 60 alust pikad ja kõige eelistatavamalt 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, või 20 kuni 40 alust pikad. Oligonukleotiidid on tavaliselt üheahelalised, näiteks sondid; kuigi oligonukleotiidid võivad olla ka kaheahelalised, näiteks kasutamiseks geeni mutandi konstrueerimisel. Käesoleva leiutise kohased oligonukleotiidid võivad olla kas senss- või antisenssoligonukleotiidid.
Termin "looduslikult leiduvad nukleotiidid", kasutatuna siin hõlmab deoksüribonukleotiide ja ribonukleotiide. Termin "modifitseeritud nukleotiidid", kasutatuna siin, hõlmab nukleotiide, mis on modifitseeritud või asendatud suhkrurühmadega, ja muu taoline. Termin "oligonukleotiidsidemed", kasutatuna siin, hõlmab oligonukleotiide ühendavaid sidemeid, näiteks selliseid nagu fosforotioaat, fosforoditioaat, fosforoselenoaat, fosforodiselenoaat, fosforoanilotioaat, fosforaniladaat, fosforoamidaat ja muu taoline. Vaata näiteks LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soe. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analoogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. patent US 5151510; Uhlmann ja Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), mille avalikustused on siin viidetena sisse lülitatud. Oligonukleotiid võib sisaldada, kui vaja, märgist detekteerimiseks.
"Toimivalt seotud" järjestuste hulka kuuluvad nii ekspressioonikontrolli järjestused, mis külgnevad huvipakkuva geeniga ja ekspressioonikontrolli järjestused, mis toimivad trans-asendis või distantseeritus, et juhtida huvipakkuvat geeni. Termin "ekspressioonikontrolli järjestus" kasutatuna siin käib polünukleotiidjärjestuste kohta, mis on vajalikud mõjustamaks kodeerivate järjestuste ekspressiooni ja protsessingut, mille külge nad seostatud on. Ekspressioonikontrolli järjestuste hulka kuuluvad vastavad transkriptsiooni-, initsiatsiooni-, terminatsiooni-, promootor- ja intensiivistajajärjestused; tõhusad RNA protsessingsignaalid, näiteks splaising- ja polüadenülatsioonisignaalid; järjestused, mis stabiliseerivad tsütoplasmaatilist mRNA-d; järjestused, mis intensiivistavad translatsiooni efektiivsust (s.o Kozaki konsensusjärjestus); järjestused, mis tõstavad valgu stabiilsust ja kui soovitav, järjestused, mis intensiivistavad valgu eritumist. Selliste kontrolljärjestuste iseloom erineb sõltuvalt peremeesorganismist; prokarüootides, sellised kontrolljärjestused sisaldavad tavaliselt promootorit, ribosoomset seostumissaiti ja transkriptsiooni terminatsiooni järjestust; eukarüootides kuuluvad niisuguste kontroll-järjestuste hulka tavaliselt promootorid ja transkriptsiooni termininatsiooni järjestus. On ette nähtud, et termin "kontrolljärjestused" hõlmab minimaalselt kõiki komponente, mille juuresolek on oluline ekspressiooniks ja protsessinguks ja võib samuti hõlmata lisa komponente, mille juuresolek on kasulik, näiteks liiderjärjestusi ja fusioonipartnerjärjestusi.
On ette nähtud, et termin "vektor", kasutatuna siin, käib nukleiinhappemolekuli kohta, mis on võimeline transportima teist nukleiinhapet, mille külge ta on seostatud. Üheks vektoritüübiks on "plasmiid", mis tähendab tsirkulaarset kaheahelalist DNA-silmust, millesse võib olla ligeeritud lisa DNA segmente. Teiseks vektoritüübiks viiruslik vektor, mis kujutab viiruse genoomi, millesse võib olla ligeeritud lisa DNA segmente. Teatud vektorid on võimelised autonoomseks replikatsiooniks peremeesrakus, millesse nad sisestatud on (näiteks bakteriaalvektorid, millel on bakteriaalse päritoluga replikatsioon, ja episomaalsed imetaja vektorid). Teised vektorid (näiteks mitte-episomaalsed imetajavektorid) võivad olla integreeritud peremeesraku genoomi, pärast selle sisestamist peremeesrakku, ja seetõttu replitseeruvad koos peremeesgenoomiga. Veelgi enam, teatud vektorid on võimelised suunama geenide ekspressiooni, mille külge nad toimivalt seotud on. Niisuguseid vektoreid nimetatakse siin "rekombinantseteks ekspressioonivektoriteks" (või lihtsalt, "ekspressioonivektoriteks"). Üldjuhul on rekombinantse DNA meetodites kasulikud ekspressioonivektorid tihti plasmiidide kujul. Käesolevas spetsifikatsioonis võivad terminid "plasmiid" ja "vektor" olla kasutatud vastastikku vahetatavalt, sest plasmiid on kõige sagedamini kasutatav vektorivorm. Kuid on ette nähtud, et käesolev leiutis hõlmab ka teisi selliseid ekspressioonivektorite vorme, nagu näiteks viiruslikud vektorid (näiteks vigastatud replikatsiooniga retroviirused, adenoviirused ja adenoassotsieeritud viirused), mis täidavad ekvivivalentseid funktsioone.
On ette nähtud, et termin "rekombinantne peremeesrakk" (või lihtsalt "peremeesrakk"), kasutatuna siin, viitab rakule, millesse rekombinantne ekspressioonivektor on sisestatud. Eelduseks on, et niisugused terminid on mõeldud viitamiseks mitte ainult konkreetsele subjektrakule, vaid ka sellise raku järeltulijatele. Et teatud modifikatsioonid võivad leida aset järgnevates põlvkondades kas mutatsioonide või välismõjutuste tõttu, siis niisugune järeltulija võib faktiliselt olla mitteidentne esialgse rakuga, kuid kasutatuna siin, on ikkagi lülitatud termini "peremeesrakk" ulatusse.
Termin "selektiivselt hübridiseeruma", kasutatuna siin, tähendab seostada detekteeritavalt ja spetsiifiliselt. Polünukleotiidid, oligonukleotiidid ja nende fragmendid, vastavalt käesolevale leiutisele hübridiseerivad selektiivselt nukleiinhape ahelatega hübridisatsiooni ja pesemise tingimustes, mis minimiseerivad märkimisväärsete koguste detekteeritavate mittespetsiifiliste nukleiinhapete seostumist. "Väga karmid" või "suure karmusega" tingimused võivad olla kasutatud selleks, et saavutada selektiivseid hübridisatsiooni tingimusi, mis on erialaselt tuntud ja arutatud siin. Üheks "suure karmusega" või "väga karmide" tingimuste näiteks on meetod, milles ühte polünukleotiidi inkubeeritakse teise polünukleotiidiga, kusjuures üks polünukleotiididest võib olla fikseeritud tahkele pinnale, näiteks membraanile, hübridisatsioonipuhvris, milleks on 6X SSPE või SSC, 50% formamiidi, 5X Denhardti reagenti, 0.5% SDS, 100 mikrog/ml denatureeritud, fragmenteeritud lõhe sperma DNA-d hübridisatsiooni temperatuuril 42 °C 12-16 tunni jooksul, millele järgneb kahekordne pesemine 55 °C juures, kasutades pesemispuhvrina IX SSC-d, mis sisaldab 0.5% SDS-i. Vaata samuti Sambrook et al., supra, pp. 9.50 - 9.55.
Termin "järjestuse identsuse protsent" nukleiinhappe järjestuste kontekstis käib alusejääkide kohta kahes järjestuses, mis on analoogsed nende kohakuti paigutamisel maksimaalseks vastavuseks. Järjestuse pikkus identsuse võrdlemisel võib ahela ulatus olla vähemalt umbes üheksa nukleotiidi, tavaliselt vähemalt umbes 18 nukleotiidi, veelgi tavalisemalt, vähemalt 24 nukleotiidi, tüüpiliselt vähemalt umbes 28 nukleotiidi, veelgi tüüpilisemalt, vähemalt umbes 32 nukleotiidi, ja eelistatavalt vähemalt umbes 36, 48 või enam nukleotiidi. Erialaselt on teada palju erinevaid algoritme, mis võivad olla kasutatud nukleotiidjärjestuse identsuse mõõtmiseks. Näiteks, polünukleotiidjärjestus võib olla võrreldud, kasutades programmi FASTA, Gap või Bestfit, kusjuures need programmid leiduvad paketis: Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA-ga, mis sisaldab näiteks programme FASTA2 ja FASTA3, võimaldab kõrvutada ja leida järjestuse identsuse protsenti kõige paremini kattuvate huvipakkuvate või otsitavate piirkondade järjestuste vahel (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); mis on siin viidetena sisse lülitatud). Kui teisiti täpsustatud ei ole, siis on konkreetse programmi puhul kasutatud etteantud parameetreid või algoritmi. Näiteks järjestuse identsuse protsent nukleiinhappe järjestuste vahel võib olla määratud, kasutades programmi FASTA koos selle etteantud parameetritega (sõna suuruseks on 6 tähte ja NOPAM-faktor hindamismatriksile) või kasutades Gap-i koos selle etteantud parameetritega, nagu on esitletud GCG versioonis 6.1, mis on siin viitena sisse lülitatud.
Viide nukleiinhappe järjestusele hõlmab selle komplementaarset ahelat, kui teisiti kinnitatud ei ole. Seega on eelduseks võetud, et viide nukleiinhappemolekulile, millel on konkreetne järjestus, hõlmab selle komplementaarset ahelat, koos selle komplementaarse järjestusega.
Molekulaarbioloogias kasutavad uurijad termineid "järjestuse identsuse protsent", "järjestuse analoogsuse protsent" ja "järjestuse homoloogia protsent" vastastikku vahetatavalt. Käesolevas patenditaotluses on nendel terminitel sama tähendus ainult nende rakendamisel nukleiinhappe järjestustele.
Termin "tugev analoogsus" või "tugev järjestuse analoogsus", kasutades viitamisel nukleiinhappe või selle fragmendile selle, osutab sellele, et ühe nukleiinhappe, mis sisaldab vastavaid nukleotiidi insertsioone või deletsioone, optimaalsel kõrvutamisel teise nukleiinhappega (või selle komplementaarse ahelaga), nukleotiide järjestuse identsus on vähemalt umbes 85%, eelistatavalt vähemalt umbes 90%, ja enam eelistatavalt vähemalt umbes 95, 96, 97, 98 või 99% nukleotiidialustest, mõõdetuna ükskõik millise hästi tuntud järjestuse identsuse algoritmiga, näiteks sellisega, nagu FASTA, BLAST või Gap, nagu eelpool arutletud.
Rakendamisel polüpeptiididele, termin "tugev identsus" tähendab seda, et kahel peptiidjärjestusel, nende optimaalsel kõrvutamisel, näiteks sellise programmi, nagu GAP või BESTFIT abil, kasutades etteantud tühiku osakaalusid, on vähemalt 75 või 80% järjestuse identsust, eelistatavalt vähemalt 90 või 95% järjestuse identsust, veelgi enam eelistatavalt vähemalt 98 või 99% järjestuse identsust. Eelistatavalt jäägi positsioonid, mis ei ole identsed, on erinevad konservatiivsete aminohappe asenduste poolest. "Konservatiivne aminohappe asendus" on selline, mille puhul aminohappe jääk on asendatud teise aminohappe jäägiga, mille külgahel (R-rühm) on analoogsete keemiliste omadustega (näiteks laengu või hüdrofoobsuse poolest). Üldiselt konservatiivsed aminohappeasendused ei muuda oluliselt valgu funktsionaalseid omadusi. Juhul, kui kaks või enam aminohappejärjestust erinevad üksteisest konservatiivsete asendustega, siis järjestuse identsuse protsent või analoogsuse aste võib olla reguleeritud ülespoole, et korrigeerida, arvestades asenduste konservatiivset iseloomu. Vahendid sellise täpsustamise tegemiseks on selle ala spetsialistile hästi tuntud. Vaata näiteks Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 (1994), mis on siin viitena sisse lülitatud. Analoogseid keemilisi omadusi omavate aminohapete rühmade näidete hulka kuuluvad 1) alifaatsed külgahelad: glütsiin, alaniin, valiin, leutsiin ja isoleutsiin; 2) alifaatsed hüdroksüülrühma sisaldavad külgahelad: seriin ja treoniin; 3) amiidi sisaldavad külgahelad: asparagiin ja glutamiin; 4) aromaatsed külgahelad: fenüülalaniin, türosiin ja trüptofaan; 5) aluselised külgahelad: lüsiin, arginiin ja histidiin; ja 6) väävlit sisaldavad külgahelad, mis on tsüsteiinil ja metioniinil. Eelistatud konservatiivsed aminohappe asenduste rühmadeks on: valiin - leutsiin - isoleutsiin, fenüülalaniin - türosiin, lüsiin - arginiin, alaniin - valiin, glutamaat - aspartaat ja asparagiin - glutamiin.
Alternatiivselt, konservatiivseks asenduseks on ükskõik milline vahetus, millel on positiivne väärtus PAM250 log-tõenäosusmaatriksis, mis on avalikustatud artiklis Gonnet et ah, Science 256: 1443-45 (1992), mis on siin viitena sisse lülitatud. "Mõõdukalt konservatiivne" asendus on ükskõik milline vahetus, millel on mittenegatiivne väärtus PAM250 log-tõenäosusmaatriksis.
Järjestuse analoogsus polüpeptiidide puhul, mida nimetatakse ka järjestuse identsuseks, mõõdetakse tüüpiliselt, kasutades järjestuse analüüsi tarkvara. Valgu analüüsi tarkvara sobitab analoogsed järjestused, kasutades analoogsuse määra, mis on omistatud erinevatele asendustele, deletsioonidele ja teistele modifikatsioonidele, kaasaarvatud konservatiivsed aminohappe asendused. Näiteks GCG sisaldab programe nagu "Gap" ja "Bestfit", mis võivad olla kasutatud etteantud parameetritega selleks, et määrata järjestuse homoloogiat või järjestuse sarnasust lähedases suguluses olevate polüpeptiidide vahel, näiteks homoloogsed polüpeptiidid, mis on pärit erinevatest organismi liikidest või metsiku tüübi ja selle järjestuse muteerunud variandi vahel. Vaata näiteks GCG versioon 6.1. Polüpeptiidjärjestusi võib samuti võrrelda FASTA-ga, kasutades etteantud või soovitatud parameetreid, programmi GCG versioonis 6.1. FASTA (näiteks FASTA2 ja FASTA3) võimaldab kõrvutada ja määrata järjestuste identsuse protsenti piirkondades, mis kõige paremini osaliselt kattuvad huvipakkuvates ja otsitavates järjestustes (Pearson (1990); Pearson (2000). Teiseks eelistatud algoritmiks käesoleva leiutise kohase järjestuse võrdlemisel andmebaasiga, mis sisaldab suurt hulka järjestusi erinevatest organismidest, on arvutiprogramm BLAST, eriti blastp või tblastn, milles on kasutatud etteantud parameetreid. Vaata näiteks Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); mis on siin viitena sisse lülitatud.
Homoloogia suhtes võrreldava polüpeptiidjärjestuse pikkus peaks olema üldjuhul vähemalt umbes 16 aminohappejääki, tavaliselt vähemalt umbes 20 jääki, tavalisemalt vähemalt umbes 24 jääki, tüüpiliselt vähemalt umbes 28 jääki ja eelistatavalt enam, kui umbes 35 jääki. Kui otsingu andmebaas sisaldab järjestusi suurest hulgast erinevatest organismidest, siis on eelistatavam võrrelda aminohappejärjestusi.
Kasutatuna siin, terminid "märgis" või "märgistatud" tähendab teise molekuli sisseviimist antikehasse. Ühes teostusvariandis on selleks märgiseks detekteeritav marker, näiteks radiomärgistatud aminohappe sisseviimine või biotinüüllülide kinnitamine polüpeptiidi külge, mis võib olla detekteeritud märgistatud avidiiniga (näiteks streptavidiin, mis sisaldab fluorestsentset markerit või ensümaatilist aktiivsust, mis võib olla detekteeritud optiliste või või kolorimeetriliste meetoditega). Teises teostusvariandis võib selleks märgiseks või markeriks olla terapeutiline aine, näiteks ravimkonjugaat või toksiin. Erialaselt on teada erinevaid polüpeptiidide ja glükovalkude märgistamise meetodeid. Polüpeptiidide märgistamise näidete hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, radioisotoobid või radionukliidid (näiteks, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), fluroestsentsed märgised (näiteks FITC, rodamiin, lantaniidfosforid), ensümaatilised märgised (näiteks mädarõika peroksidaas, beeta-galaktosidaas, lutsiferaas, leeliseline fosfataas), kemiluminestsentsed markerid, biotinüülrühmad, predetermieeritud polüpeptiidepitoobid, mis tuntakse sekundaarse reporteri poolt (näiteks leutsiin-tõmbluku (leucine zipper) paaride järjestused), seostumissaidid sekundaarsetele antikehadele, metalli seostamise domeenid, epitoopmärgised), magnetagensid, sellised nagu gadoliniumi kelaadid, toksiinid, näiteks läkaköha toksiin, taksool (taxol), tsütokalasiin B, gramitsidiin D, etiidiumbromiid, emetiin, mitomütsiin, etoposiid, tenoposiid, vinkristiin, vinblastiin, kolhitsiin, doksorubitsiin, daunorubitsiin, dihüdroksüantratsiindioon, mitoksantroon, mitramtsiin, aktinomütsiin D, 1-dehüdrotestosteroon, glükokortikoidid, prokaiin, tetrakaiin, lidokaiin, propranolool, ja puromütsiin ja selle analoogid või homoloogid. Mõningates teostusvariantides on märgised kinnitatud erineva pikkusega speisser-ahelatega, et vähendada võimalikke ruumilisi takistusi.
Terminit "agens" on siin kasutatud selleks, et tähistada keemilist ühendit, keemiliste ühendite segu, bioloogilist makromolekuli või ekstrakti, mis on valmistatud bioloogilistest materjalidest. Termin "farmatseutiline agens või ravim", kasutatuna siin käib keemilise ühendi või kompositsiooni kohta, mis on võimeline indutseerima soovitavat terapeutilist efekti selle manustamisel patsiendile. Teisi keemia alaseid termineid on siin kasutatud vastavalt traditsioonilisele erialasele tarvitusviisile, mille kohta on toodud näited käsiraamatus The McGralv-Hill Dictionay of Chemical Termins (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), mis on siin viidetena sisse lülitatud).
Termin "antineoplastiline agens" kasutatuna siin, käib agensite kohta, millel on funktsionaalne omadus inhibeerida kasvaja kujunemist või arengut inimeses, eriti pahaloomulist (kantserogeenset) kahjustust, näiteks sellist nagu kartsinoom, sarkoom, lümfoom või leukeemia. Tihti on antineoplastiliste agensite omaduseks metastaaside pärssimine.
Termin patsient hõlmab inimest ja veterinaariasubjekte.
Inimese anti-IGF-IR-antikehad ja nende iseloomustus.
Inimese antikehad hoiavad ära teatud probleeme, mis on seotud hiirte või rottide antikehade variaabel-ja/või konstantsete piirkondadega. Selliste hiirest või rotist tuletatud järjestuste kasutamisel võib toimuda nende antikehade kiire väljaviimine organismist, või võib see põhjustada patsiendi poolt immuunset reaktsiooni selle antikeha vastu. Seetõttu ühes teostusvariandis esitleb käesolev leiutis humaniseeritud anti-IGF-IR-antikehasid. Eelistatud teostusvariandis esitleb käesolev leiutis tervenisti inimese anti-IGF IR-antikehasid, mis saadakse inimese inimese immunoglobuliini geenide sisestamisel närilisse, mille tulemusena see näriline hakkab produtseerima tervenisti inimese antikehasid. Enam eelistatud on tervenisti inimese inimese IGF-IR-vastased antikehad. Tervenisti inimese anti-IGF-IR-antikehad on ette nähtud selleks, et minimiseerida hiirele omaste või hiirest tuletatud monoklonaalsete antikehade (Mab) immunogeenseid ja allergilisi vastuseid ja seega suurendada manustatud antikehade efektiivsust ja ohutust. Tervenisti inimese antikehade kasutamine annab oodatavalt olulisi eeliseid selliste krooniliste ja ravitavate inimese haiguste ravil, nagu näiteks põletik ja vähk, mis võivad nõuda antikeha korduvat manustamist. Teises teostusvariandis esitleb käesolev leiutis anti-IGF-IR-antikeha, mis ei seosta komplementi.
Eelistatud teostusvariandis anti-IGF-IR-antikehaks on antikeha 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab anti-IGF-IR-antikeha kerget ahelat, mis sisaldab aminohappejärjestust, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 või 22 seast, või ühte või enamat CDR-i nendest aminohappejärjestustest. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab anti-IGF-IR-antikeha rasket ahelat, mis sisaldab aminohappejärjestust, mis on valitud SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 või 24 seast, või ühte või enamat CDR-i nendes aminohappejärjestustest.
Anti-IGF-IR- antikehade klass ja alaklass
Selleks antikehaks võib olla IgG, IgM, IgE, IgA või IgD molekul. Eelistatud teostusvariandis on selleks antikehaks IgG, ja on IgGI, IgG2, IgG3 või IgG4 alatüüp. Enam eelistatud teostusvariandis on anti-IGF-IR-antikeha alaklassist IgG2. Teises eelistatud teostusvariandis on see anti-IGF-IR-antikeha samast kassist ja alaklassist, nagu antikeha 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1, milleks on IgG2.
Anti-IGF-IR-antikehade klass ja alaklass võib olla määratud ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga. Üldjuhul antikeha klass ja alaklass võib olla määratud, kasutades antikehasid, mis on spetsiifilised konkreetse klassi ja alaklassi antikeha suhtes. Niisugused antikehad on kaubanduslikult saadavad. See klass ja alaklass võib olla määratud ELISA, immunoblottanalüüsi või teiste meetodite abil. Alternatiivselt võivad antikeha klass ja alaklass olla määratud nende antikehade raskete ja/või kergete ahelate tervete konstantsete domeenide või nende osade sekveneerimisel, võrreldes seejärel nende aminohappejärjestusi immunoglobuliinide eri klasside ja alaklasside tuntud aminohappejärjestustega ning määrates nende antikehade klassi ja alaklassi.
Liigi- ja molekuliselektiivsus
Käesoleva leiutise teisest aspektist demonstreerib anti-IGF-IR-antikeha nii liigi- kui ka molekuliselektiivsust. Ühes teostusvariandis seostub anti IGF-IR-antikeha inimese, künomolguse või reesuse IGF-IR-ga. Eelistatud teostusvariandis ei seostu anti-IGF-IR-antikeha hiire, roti, merisea, koera või küüliku IGF-IR-ga. Teises eelistatud teostusvariandis ei seostu see anti-IGF-IR-antikeha läänepoolkera ahvidega, sellisega nagu näiteks marmoset. Järgides käesoleva leiutiskirjelduse õpetusi, võib määrata selle anti-IGF-IR-antikeha liigiselektiivsuse, kasutades erialaselt hästi tuntud meetodeid. Näiteks on võimalik määrata liigiselektiivsust kasutades meetodeid: immunoblottanalüüs, FACS, ELISA või RIA. Eelistatud teostusvariandis on võimalik määrata liigi selektiivsust, kasutades immunoblottanalüüsi.
Teises teostusvariandis on sellel anti-IGF-IR-antikehal IGF-IR suhtes selline selektiivsus, mis on vähemalt 50 korda suurem kui selle selektiivsus insuliiniretseptori suhtes. Eelistatud teostusvariandis on selle anti-IGF-IR-antikeha selektiivsus enam kui 100 korda suurem kui selle selektiivsus insuliiniretseptori suhtes. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis see anti-IGF-IR-antikeha ei oma üldse märgatavat spetsiifilisust seostumisel ükskõik millise teise valguga peale IGF-IR-i. On võimalik määrata anti-IGF-IR-antikeha selektiivsust IGR-IR suhtes, kasutades erialaselt hästi tuntud meetodeid, järgides käesoleva leiutiskirjelduse õpetusi. Näiteks on võimalik määrata seda selektiivsust, kasutades niisuguseid meetodeid, nagu immunoblottanalüüs, FACS, ELISA või RIA. Eelistatud teostusvariandis on võimalik määrata molekulaarset selektiivsust, kasutades immunoblottanalüüsut.
Anti-IGF-IR seostumise afiinsus IGF-IR-ga
Käesoleva leiutise teisest aspektist leiutisekohased anti-IGF-IR-antikehad seostuvad IGF-IR-ga suure afiinsusega. Ühes teostusvariandis see anti-IGF-IR-antikeha seostub IGF-IR-ga, mida iseloomustab Kd võrdne 1x10-8 M või väiksem. Enam eelistatud teostusvariandis see antikeha seostub IGF-IR külge Kd-ga, mis on võrdne 1x10-9 M või väiksem. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis, see antikeha seostub IGF-IR külge Kd-ga, mille suurus on kas 5x10-10 M või väiksem. Teises eelistatud teostusvariandis, see antikeha seostub IGF-IR-ga Kd-ga mis on võrdne 1xl0-10 M või väiksem. Teises eelistatud teostusvariandis seostub see antikeha IGF-IR-ga sisuliselt sama Kd-ga, nagu antikeha, mis on valitud 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 seast. Teises eelistatud teostusvariandis seostub see antikeha IGF-IR-ga sisuliselt sama Kd-ga, nagu see antikeha, mis sisaldab ühte või enamat CDR-i antikehast, mis on valitud antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Veel ühes eelistatud teostusvatiandis seostub see antikeha IGF-IR-ga sisuliselt sama Kd-ga, nagu antikeha, mis sisaldab ühte aminohappejärjestustest, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 või 24 seast. Teises eelistatud teostusvariandis see antikeha seostub IGF-IR-ga sisuliselt sama Kd-ga, nagu antikeha, mis sisaldab ühte või enamat CDR-i antikehast, mis sisaldab ühte aminohappejärjestustest, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 või 24 seast.
Käesoleva leiutise teisest aspektist on anti-IGF-IR-antikehadel madal dissotsiatsioonikiirus. Ühes teostusvariandis on anti-IGF-IR-antikehal Koff võrdne lxl0-4 s-1 või madalam. Eelistatud teostusvariandis on Koff 5x10-5 s-1 või madalam. Teises eelistatud teostusvariandis on see Koff praktiliselt sama, nagu antikehal, mis on valitud 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 seast. Teises eelistatud teostusvariandis see antikeha seostub IGF-IR-ga praktiliselt samsuguse Koff-ga, nagu antikeha, mis sisaldab ühte või enamat CDR-i antikehast, mis on valitud 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 seast. Veel ühes eelistatud teostusvatiandis see antikeha seostub IGF-IR-ga praktiliselt sama Koff-ga, nagu antikeha, mis sisaldab aminohappejärjestust, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 või 24 seast. Teises eelistatud teostusvariandis see antikeha seostub IGF-IR-ga praktiliselt samasuguse Koff-ga, nagu antikeha, mis sisaldab ühte või enamat CDR-i antikehast, mis sisaldab aminohappejärjestust, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 seast.
Anti-IGF-IR-antikeha seostumise affiinsus IGF-IR-ga ja selle dissotsiatsiooni kiirus võib olla määrad ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga. Ühes teostusvariandis võib see seostumise affiinsus olla mõõdetud konkurentsete ELISA-de, RIA-de või pinnaplasmonresonantsiga, näiteks BIAcore abil. Dissotsiatsiooni kiirus võib samuti olla mõõdetud pinnaplasmonresonantsiga. Enameelistatud teostusvariandis on need seostumise affiinsus ja dissotsiatsiooni kiirus mõõdetavad pinnaplasmonresonantsiga. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis on seostumise afiinsus ja dissotsiatsiooni kiirus mõõdetavad, kasutades meetodit BIAcore. Näidet seostumise afiinsuse ja dissotsiatsiooni kiiruse määramisest on kirjeldatud allpool näites II.
Anti-IGF-IR-antikehade pooliga
Vastavalt käesoleva leiutise teisele eesmärgile, anti-IGF-IR-antikeha pooliga on vähemalt üks päev in vitro või in vivo. Eelistatud teostusvariandis on selle antikeha või selle osa pooliga vähemalt kolm päeva. Enam eelistatud teostusvariandis on selle antikeha või selle osa pooliga neli päeva või enam. Teises teostusvariandis on selle antikeha või selle osa pooliga kaheksa päeva või enam. Teises teostusvariandis on see antikeha või selle antigeeni seostav osa tuletatud või modifitseeritud nii, et sellel on pikem pooliga, nagu allpool arutletud. Teises eelistatud teostusvariandis võib see antikeha sisaldada punktmutatsioone, mis pikendavad pooliga seerumis, näiteks sellist nagu on kirjeldatud publikatsioonis WO 00/09560, mis on publitseeritud 24. veebruaril 2000.
Antikeha pooliga võib olla mõõdetud ükskõik millise keskmise kvalifikatsiooniga spetsialistile tuntud moodusega. Näiteks antikeha pooliga võib olla mõõdetud, teostades immunoblottanalüüsi, ELISA- või RIA-teste sobivate ajavahemike järel. Antikeha pooliga võib olla mõõdetud ükskõik millises sobivas loomas, sellises, nagu ahvis, näiteks ahvis künomolgus, primaadis või inimeses.
Anti-IGF-IR-antikeha poolt äratuntavate IGF-IR epitoopide identifikatsioon
Käesolev leiutis esitleb samuti anti-IGF-IR-antikeha, mis seostub sama antigeeni või epitoobiga, nagu inimese anti-IGF-IR-antikehagi. Edasi, käesolev leiutis esitleb anti-IGF-IR-antikeha, mis konkureerib inimese anti-IGF-IR-antikehaga, andes sellega ristreaktsioone. Eelistatud teostusvariandis on selleks inimese anti-IGF-IR-antikehaks
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Teises eelistatud teostusvariandis see inimese anti-IGF-IR sisaldab ühte või enamat CDR-i antikehast, mis on valitud 2.12.1,
2.13.1, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 seast. Veel ühes eelistatud teostusvariandis see inimese anti-IGF-IR sisaldab ühte aminohappe järjestust, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 või 24 seast. Teises eelistatud teostusvariandis see inimese anti-IGF-IR sisaldab ühte või enamat CDR-i antikehast, mis sisaldab ühte aminohappe järjestustest, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 või 24 seast. Kõige enam eelistatud teostusvariandis selleks anti IGF-IR-antikehaks on teine inimese antikeha.
Seda, kas anti-IGF-IR-antikeha seostub sellesama antigeeniga on võimalik määrata, kasutades paljusid erinevaid erialaselt tuntud meetodeid. Näiteks on võimalik määrata, kas testitav anti-IGF-IR-antikeha seostub sellesama antigeeniga, kasutades sellise antigeeni kinnihaaramiseks anti-IGF-IR-antikeha, mille kohta on teada, et see seostub anti-IGF-IR-antikehaga, näiteks IGF-IR-i, elueerides seda antigeeni antikehalt ja määrates, kas testitav antikeha seostub elueeritud antigeeniga. On võimalik määrata, kas antikeha seostub sellesama epitoobiga, nagu anti-IGF-IR-antikeha, seostades selle anti IGF-IR antikeha IGF-IR-ga küllastustingimustes ja mõõtes testitava antikeha võimet seostuda IGF-IR-ga. Kui testitav antikeha on võimeline seostuma IGF-IR-ga üheaegselt anti-IGF-IR-antikehaga, siis see testitav antikeha ja anti-IGF-IR-antikeha seostuvad erinevate epitoopidega. Kuid kui testitav antikeha ei ole võimeline seostuma IGF-IR-ga samaaegselt, siis see testitav antikeha seostub sama epitoobiga, millega inimese anti-IGF-IR-antikehagi. See eksperiment võib olla läbi viidud, kasutades selliseid meetodeid, nagu ELISA, RIA või pinnaplasmonresonants. Eelistatud teostusvariandis see eksperiment viiakse läbi kasutades pinnaplasmonresonantsi. Enam eelistatud teostusvariandis on kasutatud meetodit BIAcore. On võimalik samuti määrata, kas anti-IGF-IR-antikeha konkureerib anti-IGF-IR-antikehaga, andes sellega ristreaktsioone. Eelistatud teostusvariandis on võimalik määrata, kas anti-IGF-IR-antikeha konkureerib teise antikehaga, andes sellega ristreaktsioone, kasutades sama meetodit, nagu on kasutatud selleks, et mõõta, kas anti-IGF-IR-antikeha on võimeline seostuma sama epitoobiga, nagu anti-IGF-IR-antikeha.
Kerge ja raske ahela kasutamine
Käesolev leiutis esitleb samuti anti-IGF-IR-antikeha, mis sisaldab variaabeljärjestusi, mis on kodeeritud inimese kapa geenis. Eelistatud teostusvariandis need variaabeljärjestused on kodeeritud kas VkapaA27, A30 või O12 geeniperekonnas. Eelistatud teostusvariandis on need variaabeljärjestused kodeeritud inimese VkapaA30 geeniperekonnas. Enam eelistatud teostusvariandis sisaldab see kerge ahel mitte enam kui kümme aminohappe asendust eellasjärjestuses VkapaA27, A30 või O12, eelistatavalt mitte enam kui kuus aminohappe asendust ja enam eelistatavalt mitte enam kui kolm aminohappeasendust. Eelistatud teostusvariandis on need aminohappeasendused konservatiivseteks asendusteks.
SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 ja 22 esitlevad kuue anti-IGF-IR kapa-kerge ahela variaabelpiirkonna aminohappejärjestusi. SEQ ID NO: 38, 40 ja 42 esitlevad kolme eellasjärjestuse kapa-kerge ahela aminohappejärjestusi, millest on tuletatud kuus anti-IGF-IR kapa-kerget ahelat. Joonistel fig 1A-1C on kõrvutatud teineteisega kerge ahela variaabelpiirkondade nukleotiidjärjestused, mis kuuluvad nendele kuuele anti-IGF-IR-antikehale ja eellasjärjestusele, millest nad on tuletatud. Järgides käesoleva leiutiskirjelduse õpetusi võib keskmise kvalifikatsiooniga spetsialist määrata kuue anti-IGF-IR kapa-kerge ahela ja kapa-kerge ahela eellasjärjestuse kodeeritud aminohappe järjestused ja määrata erinevused eellasjärjestuste ja nende antikehade järjestuste vahel.
Eelistatud teostusvariandis sisaldab anti-IGF-IR-antikeha VL samasuguseid aminohappeasendusi eellasaminohappejärjestuse suhtes nagu ükskõik milline üks või enam VL antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Näiteks anti-IGF-IR-antikeha VL võib sisaldada ühte või enamat aminohappe asendust, mis on samasugused nagu need, mis on esindatud antikehas 2.13.2, teine aminohappeasendus, mis on sama nagu see, mis on antikehas 2.14.3, ja teine aminohappeasendus, mis on sama, mis antikehas 4.9.2. Samal viisil on võimalik segada ja sobitada erinevaid antikeha seostumise iseärasusi, et muuta näiteks antikeha afiinsust IGF-IR suhtes või selle dissotsiatsiooni kiirust kompleksi antigeeniga. Teises teostusvariandis on aminohappeasendused tehtud samas positsioonis nagu need, mis on leitud ükskõik millises ühes või enamas antikehade 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2,4.17.3 või 6.1.1 VL-s, kuid konservatiivsed aminohappeasendused on tehtud kasutades pigem sama aminohapet. Näiteks kui see aminohappeasendus võrreldes eellasjärjestusega ühes antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 on glutamaat, siis võib see olla konservatiivselt asendatud aspartaadiga.
Analoogselt, kui selleks aminohappe asenduseks on seriin, siis võib see asendada konservatiivselt treoniini. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab kerge ahel aminohappejärjestust, mis on samasugune, nagu antikehade 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,3. 1.1,
4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 VL aminohappejärjestus. Teises eriti eelistatud teostusvariandis sisaldab kerge ahel aminohappejärjestusi, mis on samad, nagu antikehade 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 kerge ahela CDR piirkonnad. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab kerge ahel aminohappejärjestust vähemalt ühest CDR piirkonnast antikeha 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6. 1.1 kerges ahelas. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab kerge ahel aminohappejärjestusi erinevate kergete ahelate CDR-dest. Enam eelistatud teostusvariandis on need CDR-d saadud erinevatest kergetest ahelatest, mis kuuluvad antikehadele 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Teises eelistatud teostusvariandis, see kerge ahel sisaldab aminohappejärjestust, mis on valitud SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 või 22 seast. Teises teostusvariandis sisaldab kerge ahel aminohappejärjestust, mis on kodeeritud nukleiinhappejärjestuses, mis on valitud SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 või 21 seast, või nukleiinhappe järjestust, mis kodeerib aminohappejärjestust, milles on 1-10 aminohappe insertsiooni, deletsiooni või asendust. Eelistatavalt on need aminohappeasendused konservatiivsed aminohappeasendused. Teises teostusvariandis sisaldab see antikeha või selle osa lambda-kerget ahelat.
Käesolev leiutis esitleb samuti anti-IGF-IR-antikeha või selle osa, mis sisaldab inimese rasket ahelat või järjestust, mis on tuletatud inimese raskest ahelast. Ühes teostusvariandis on raske ahela aminohappejärjestus tuletatud inimese VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 või VIV-4/4. 35 geeniperekonnast. Eelistatud teostusvariandis on see raske ahela aminohappejärjestus tuletatud inimese VH DP47 geeniperekonnast. Enam eelistatud teostusvariandis sisaldab see raske ahel mitte enam kui kaheksa aminohappe asendust, võrreldes eellasjärjestusega VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 või VIV-4/4. 35, enam eelistatavalt mitte enam kui kuus aminohappe asendust, ja veelgi enam eelistatavalt mitte enam kui kolm aminohappe asendust.
SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 ja 24 esitlevad kuue anti-IGF-IR raske ahela variaabelpiirkonna aminohappejärjestusi. SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36 ja 44 esitlevad aminohappejärjestusi, aga SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35 ja 43 esitlevad raskete ahelate eellasjärjestuste DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 ja VIV-4 nukleotiidjärjestusi vastavalt. Joonistel fig 2A-2D on kõrvutatud aminohappejärjestused variaabel piirkondadest kuues anti-IGF-IR-antikehas eellasjärjestusega. Järgides käesoleva leiutiskirjelduse õpetusi, keskmise kvalifikatsiooniga spetsialist võiks määrata kuue anti-IGF-IR raske ahela ja eellase raskete ahelate kodeeritud aminohappe järjestuse ja määrata erinevuse eellasjärjestuste ja selle antikeha järjestuste vahel.
Eelistatud teostusvariandis sisaldab anti-IGF-IR-antikeha VH samasuguseid aminohappeasendusi eellasaminohappejärjestuse suhtes nagu ükskõik milline üks või enam antikehade 2.12.1, 2.13.2, 2.14. 3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 VH hulgast. Analoogselt sellele, mida arutati eelpool, see anti-IGF-IR-antikeha VH võib sisaldada ühte või enamat aminohappe asendust, mis on samasugused nagu need, mis on esindatud antikehas 2.13.2, teine aminohappeasendus, mis on samasugune nagu see, mis on esindatud antikehas 2.14.3 ja teine aminohappeasendus, mis on samasugune nagu antikehas 4.9.2. Sellisel viisil on võimalik segada ja sobitada antikeha seostumise erinevaid iseärasusi selleks, et muuta näiteks selle antikeha afiinsust IGF-IR suhtes või selle dissotsiatsiooni kiirust antigeen-antikeha kompleksist. Teises teostusvariandis on aminohappeasendus tehtud samas positsioonis nagu see, mis on leitud ükskõik millises ühes või enamas antikehade 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.17.3., 4.9.2 või 6.1.1 VH-s, kuid konservatiivsed aminohappeasendused on tehtud, asendades pigem sama aminohapet.
Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab raske ahel aminohappejärjestust, mis on samasugune, nagu aminohappejärjestus antikehade 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 VH-s. Teises eriti eelistatud teostusvariandis sisaldab see raske ahel aminohappejärjestusi, mis on samasugused, nagu antikehade 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 raske ahela CDR piirkonnad. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab raske ahel aminohappejärjestust vähemalt ühest antikeha 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1 raske ahela CDR piirkonnast. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab raske ahel CDR-de aminohappejärjestusi erinevatest rasketest ahelatest. Enam eelistatud teostusvariandis on CDR-d erinevatest rasketest ahelatest saadud antikehadest 2.12.1, 2.13.2,2.14.3, 3.1.1, 4.9.2,4.17. 3 või 6.1.1. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab see raske ahel aminohappejärjestust, mis on valitud SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 või 24 seast. Teises teostusvariandis see raske ahel sisaldab aminohappejärjestusi, mis on kodeeritud nukleiinhappejärjestusega, mis on valitud SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 või 23 seast, või nukleiinhappejärjestustega, mis kodeerivad aminohappejärjestusi, milles on 1-10 aminohape insertsiooni, deletsiooni või asendust. Teises teostusvariandis on need asendused konservatiivsed aminohappeasendused.
IGF-IR aktiivsuse inhibeerimine anti-IGF-IR-antikehadega
IGF-I IGF-IR-ga seostumise inhibeerimine
Teises teostusvariandis esitleb käesolev leiutis anti-IGF-IR-antikeha, mis inhibeerib IGF-I seostumist IGF-IR-ga, või IGF-II seostumist IGF-IR-ga. Eelistatud teostusvariandis on IGF-IR inimese oma. Teises eelistatud teostusvariandis on anti-IGF-IR-antikeha inimese antikeha. Teises teostusvariandis see antikeha või selle osa inhibeerib IGF-IR ja IGF-I vahelist seostumit IC50-ga, mis on mitte enam kui 100 nM. Eelistatud teostusvariandis on IC50 on mitte enam kui 10 nM. Enam eelistatud teostusvariandis on IC50 mitte enam kui 5 nM. IC50 võib olla mõõdetud ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga. Tüüpiliselt võib IC50 olla mõõdetud ELISA- või RIA-testiga. Eelistatud teostusvariandis on IC50 suurust mõõdetud RIA-ga.
Teises teostusvariandis esitleb käesolev leiutis anti-IGF-IR-antikeha, mis hoiab ära IGF-IR aktiveerimise IGF-I juuresolekul. Eelistatud teostusvariandis inhibeerib anti-IGF-IR-antikeha IGF-IR poolt indutseeritud türosiini fosforüleerimist, mis leiab aset retseptori hõivatud olemise ajal. Teises eelistatud teostusvariandis inhibeerib anti-IGF-IR-antikeha tmete tsellulaarsete sündmuste toimumist. Näiteks võib anti-IGF-IR inhibeerida türosiini fosforüleerimist Shc-s ja insuliiniretseptori substraadis (IRS) 1 ja 2, millest kõik tavaliselt fosforüleeritakse, kui rakke töödeldakse IGF-I-ga (Kim et al., J. Biol. Chem. 273: 34543-34550, 1998). On võimalik määrata, kas anti-IGF-IR-antikeha võib ära hoida IGF-IR aktiveerimist IGF-1 juuresolekul, määrates IGF-IR, Shc, IRS-1 või IRS-2 autofosforüleerimise taset immunoblottanalüüsi või immunopretsiptatsiooniga. Eelistatud teostusvariandis on võimalik määrata IGF-IR-i autofosforüleerimise tasemed immunoblottanalüüsiga. Vaata näiteks näide VII.
Käesoleva leiutise teisest aspektist põhjustab see antikeha IGF-IR allareguleerimist antikehaga töödeldud rakkudes. Ühes teostusvariandis on IGF-IR sisestatud raku tsütoplasmasse. Pärast seda kui anti-IGF-IR-antikeha seostub IGF-IR-ga, siis see antikeha on sisestatud, mida on näha konfokaalse mikroskoobiga. Soovimata olla seotud ükskõik millise teooriaga, võib arvata, et see antikeha-IGF-IR kompleks sisestatakse lüsosoomi ja degradeeritakse. IGF-IR allareguleerimist võib mõõta ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga, kaasaarvatud immunopretsipitatsioon, konfokaalne mikroskoopia või immunoblottanalüüs. Vaata näiteks näide VII. Eelistatud teostusvariandis on see antikeha valitud 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, või 6.1.1 seast või sisaldab see nende raskeid ahelaid, kergeid ahelaid või antigeeni nende seostavat piirkonda.
IGF-IR aktiveerimine anti-IGF-IR-antikehaga
Teine käesoleva leiutise aspekt puudutab aktiveerivaid anti-IGF-IR-antikehasid. Aktiveeriv antikeha erineb inhibeerivast antikehast sellega, et ta võimendab või asendab IGF-I toimet IGF-IR-1. Ühes teostusvariandis on see aktiveeriv antikeha võimeline seostuma IGF-IR-ga ja põhjustab selle aktiveerumise IGF-I puudumisel. See aktiveeriva antikeha tüüp on sisuliselt IGF-I-d imiteeriv. Teises teostusvariandis see aktiveeriv antikeha võimendab IGF-I toimet IGF-IR-1. See antikeha tüüp ei aktiveeri IGF-IR-i iseenesest, vaid pigem suurendab IGF-IR aktiveerimist IGF-1 juuresolekul. Anti-IGF-IR-antikeha imitaator võib kergesti olla eristatud võimendavast anti-IGF-IR-antikehast, kui töödelda rakke in vitro antikehaga selle madalatel IGF-I tasemetel või puudumisel. Kui see antikeha on võimeline põhjustama IGF-IR aktiveerimist IGF-I puudumisel, näiteks see suurendab IGF-IR-i türosiini fosforüleerimist, siis see antikeha on imiteeriv antikeha. Kui see antikeha ei ole võimeline põhjustama IGF-IR-i aktiveerimist IGF-I puudumisel, kuid on võimeline võimendama IGF-IR aktiveerimise mahtu, siis see antikeha on võimendav antikeha. Eelistatud teostusvariandis on selleks aktiveerivaks antikehaks antikeha 4.17. 3. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab see antikeha ühte või enamat CDR-i antikehast 4.17.3. Teises eelistatud teostusvariandis see antikeha on tuletatud kas ühest või mõlemast eellasjärjestusest, 012 (kerge ahel) ja/või D71 (raske ahel).
IGF-IR türosiini fosforüleerimine, IGF-IR tasemete ja tuumoriraku kasvu in vivo inhibeerimine anti-IGF-IR-antikehadega
Käesoleva leiutise teine teostus variant esitleb anti-IGF-IR-antikeha, mis inhibeerib IGF-IR-i türosiini fosforüleerimist ja retseptori tasemeid in vivo. Ühes teostusvariandis põhjustab anti-IGF-IR-antikeha manustamine loomale IGF-IR fosfotürosiini signaali vähenemist IGF-IR-ekspresseerivates tuumorites. Eelistatud teostusvariandis põhjustab anti-IGF-IR-antikeha fosfotürosiinisignaali vähenemist vähemalt 20% võrra. Enameelistatud teostusvariandis põhjustab see anti-IGF-IR-antikeha fosfotürosiinisignaali vähenemist vähemalt 60% võrra, enam eelistatavalt 50%. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis põhjustab see antikeha fosfotürosiini signaali vähenemist vähemalt 40%, enam eelistatavalt 30%, veelgi enam eelistatavalt 20% võrra. Eelistatud teostusvariandis see antikeha manustatakse ligikaudu 24 tundi enne türosiini fosforüleerimise tasemete mõõtmist. Türosiini fosforüleerimise tasemed võivad olla mõõdetud ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga, näiteks sellisega nagu see, mida on kirjeldatud allpool. Vaata näiteks näide III ja joonis fig 5. Eelistatud teostusvariandis on see antikeha valitud antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, või 6.1.1, või sisaldab selle rasket ahelat, kerget ahelat või antigeeni seostavat osa.
Teises teostusvariandis põhjustab anti-IGF-IR-antikeha manustamine loomale IGF-IR tasemete vähenemist IGF-IR-ekspresseerivates tuumorites. Eelistatud teostusvariandis põhjustab see anti-IGF-IR-antikeha retseptori tasemete langust vähemalt 20% võrra võrreldes töötlemata loomaga. Enam eelistatud teostusvariandis põhjustab see anti-IGF-IR-antikeha retseptori tasemete langust vähemalt kuni 60%-ni, enam eelistatavalt 50%-ni retseptori tasemetest töötlemata loomal. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis põhjustab see antikeha retseptori tasemete langust vähemalt kuni 40%-ni, enam eelistatavalt 30%-ni. Eelistatud teostusvariandis see antikeha manustatakse ligikaudu 24 tundi enne IGF-IR tasemete mõõtmist. IGF-IR tasemed võivad olla mõõdetud ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga, näiteks sellisega, nagu allpool kirjeldatud. Vaata näiteks näide VIII ja joonis fig 6. Eelistatud teostusvariandis on see antikeha valitud antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9. 2, või 6.1.1, või sisaldab selle rasket ahelat, kerget ahelat või antigeeni seostavat osa.
Teises teostusvariandis inhibeerib anti-IGF-IR-antikeha tuumori raku kasvu in vivo. Tuumorirakk võib olla tuletatud ükskõik millisest rakutüübist, kaasaarvatud, piiranguteta, epidermaalsest, epiteliaalsest, endoteliaalsest, leukeemia, sarkoomi, mitmese müeloomi või mesodermaalsest rakust. Tuumorirakkude näidete hulka kuuluvad A549 (mitteväikeserakulise kopsukartsinoomi) rakud, MCF-7 rakud, Colo 205 rakud, 3T3/IGF-IR rakud ja A431 rakud. Eelistatud teostusvariandis inhibeerib see antikeha tuumoriraku kasvu võrreldes tuumori kasvuga töötlemata loomas. Enam eelistatud teostusvariandis inhibeerib see antikeha tuumoriraku kasvu 50%. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis inhibeerib see antikeha tuumoriraku kasvu 60, 65, 70 või 75%. Ühes teostusvariandis mõõdeti tuumoriraku kasvu inhibeerimist vähemalt 7 päeva pärast seda, kui loomi hakati töötlema selle antikehaga. Enam eelistatud teostusvariandis mõõdeti tuumoriraku kasvu inhibeerimist vähemalt 14 päeva pärast seda, kui loomi hakati töötlema selle antikehaga. Teises eelistatud teostusvariandis manustati loomale teist antineoplastilist agensit koos anti-IGF-IR-antikehaga. Eelistatud teostusvariandis, see antineoplastiline agens on võimeline veelgi enam inhibeerima tuumoriraku kasvu. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis on selleks antineoplastiliseks agensiks adriamütsiin, taksool, tamoksifeen, 5-fluorodeoksüuridiin (5-FU) või CP-358774. Eelistatud teostusvariandis inhibeerib selline antineoplastilise agensi ja anti-IGF-IR antikeha koosmanustamine tuumoriraku kasvu vähemalt 50% võrra, enam eelistatavalt 60, 65, 70 või 75% võrra, enam eelistatavalt 80, 85 või 90% võrra, pärast 22-24 päevast ajavahemikku. Vaata näiteks joonis fig 7 ja näide IX. Eelistatud teostusvariandis on see antikeha valitud antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 või 6.1.1 või sisaldab selle rasket ahelat, kerget ahelat või antigeeni seostavat osa.
Apoptoosi indutseerimine anti-IGF-IR-antikehadega
Käesoleva leiutise teine aspekt esitleb anti-IGF-IR-antikeha, mis indutseerib raku surma. Ühes teostusvariandis põhjustab see antikeha apoptoosi. See antikeha võib indutseerida apoptoosi kas in vivo või in vitro. Üldjuhul on tuumorirakud tundlikumad apoptoosi suhtes kui normaalsed rakud, mistõttu anti-IGF-IR-antikeha manustamine põhjustab tuumorirakul apoptoosi eelistatavamalt kui normalsel rakul. Teises teostusvariandis vähendab anti-IGF-IR-antikeha manustamine ensüümi akt taset, mis osaleb fosfatidüülinositoolkinaasi rajas (PI, phosphatidyl inositot). See PI kinaasi rada osaleb omakorda proliferatsioonis ja apoptoosi ärahoidmises. Seega akt inhibeerimine võib põhjustada apoptoosi. Enam eelistatud teostusvariandis see antikeha manustatakse in vivo, et esile kutsuda apoptoosi rakkudes, mis ekspresseerivad IGF-IR-i. Eelistatud teostusvariandis on see antikeha valitud 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, või 6. 1.1 seast või sisaldab selle rasket ahelat, kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa.
Meetodid antikehade ja antikehi produtseerivate rakuliinide produtseerimiseks
Immunisatsioon
Ühes käesoleva leiutise teostusvariandis inimese antikehad produtseeritakse, immuniseerides looma, kes ei ole inimene, kes sisaldab mõningaid või kõiki inimese immunoglobuliinilookuseid, IGF-IR antigeeniga. Eelistatud teostusvariandis, selleks loomaks, kes ei ole inimene, on XENOMOUSE , milleks on geneetiliselt muundatud hiireliin, mis sisaldab suuri fragmente inimese immunoglobuliini lookustest ja mis produtseerib puudulikult hiire antikehi. Vaata näiteks Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21, (1994) ja patendid US 5916771, US 5939598, US 5985615, US 5998209, US 6075181, US 6091001, US 6114598 ja US 6130364. Vaata samuti WO 91/10741, publitseeritud 25. juulil 1991, WO 94/02602, publitseeritud 3. veebruaril 1994, WO 96/34096 ja WO 96/33735, millest kumbki on publitseeritud 31. oktoobril 1996, WO 98/16654, publitseeritud 23. aprillil 1998, WO 98/24893, publitseeritud 11. juunil 1998, WO 98/50433, publitseeritud 12. novembril 1998, WO 99/45031, publitseeritud 10. septembril 1999, WO 99/53049, publitseeritud 21. oktoobril 1999, WO 00/09560, publitseeritud 24. veebruaril 2000 ja WO 00/037504, publitseeritud 29. juunil 2000. Hiireliin XENOMOUSE produtseerib täit spektrit antikehi, mis on analoogsed täiskasvanud inimesele omastele antikehadele ja genereerib antigeeni-spetsiifilisi inimese Mab-sid. XENOMOUSE teine põlvkond sisaldab umbes 80% inimese antikehade repertuaarist, mis on sisse viidud megaaluse suuruste eellaskonfiguratsioonis olevate inimese raske ahela lookusi ja K kerge ahela lookusi sisaldavate YAC-fragmentide abil. Vaata Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green ja Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), mille avalikustamised on siin viidetena sisse lülitatud.
Käesolev leiutis esitleb samuti meetodit anti-IGF-IR-antikehade valmistamiseks loomades, kelleks ei ole inimene ega hiir, immuniseerides transgeenset looma, kelleks ei ole inimene, kes sisaldab inimese immunoglobuliini lookuseid. Selliseid loomi võib produtseerida, kasutades meetodeid, mida on kirjeldatud vahetult eelpool. Neid meetodeid, mis on avalikustatud neis patentides, võib modifitseerida, nagu on kirjeldatud patendis US 5994619. Eelistatud teostusvariandis, nendeks loomadeks, kelleks ei ole inimene, võivad olla rotid, lambad, sead, kitsed, veised või hobused.
Teises teostusvariandis, see loom, kelleks ei ole inimene, kes sisaldab inimese immunoglobuliini geeni lookust, on loom, kes omab inimese immunoglobuliinide "minilookust". Sellel minilookus-lähenemisviisil seda eksogeenset lg lookust jäljendatakse Ig-lookuses olevate geenide inklusiooni käigus. Seega üks või enam VH geeni, üks või enam DH geeni, üks või enam JH geeni, müü-konstantne piirkond ja teine konstantne piirkond (eelistatavalt gamma-konstantne piirkond) formeeruvad konstruktiks, mis on sobilik insertsiooniks loomasse. Seda lähenemisviisi on kirjeldatud muuhulgas patentides US 5545807, US 5545806, US 5625825, US 5625126, US 5633425, US 5661016, US 5770429, US 5789650, US 5814318, US 5591669, US 5612205, US 5721367, US 5789215 ja US 5643763, mis on siin viidetena sisse lülitatud.
Minilookus-lähenemisviisi eeliseks on kiirus, millega konstruktid, mis sisaldavad lg lookuse osasid, võivad olla genereeritud ja sisestatud loomadesse. Kuid võimalikuks puuduseks sellel minilookus-lähenemisviisil on see, et seejuures võib puududa piisav immunoglobuliini mitmekesisus, et toetada täielikku B-raku arengut, mistõttu antikeha produktsioon võib olla madalam.
Selleks, et produtseerida inimese anti-IGF-IR-antikeha looma poolt, kes ei ole inimene, kes sisaldab mõnda või kõiki inimese immunoglobuliini lookuseid, immuniseeritakse IGF-IR-antigeeniga ja antikeha või antikeha produtseeriv rakk isoleeritakse loomast. See IGF-IR antigeen võib olla isoleeritud ja/või puhastatud IGF-IR ja selleks on eelistatavalt inimese IGF-IR. Teises teostusvariandis on IGF-IR antigeeniks IGF-IR-i fragment, eelistatavalt IGF-IR-i ekstratsellulaarne domeen. Teises teostusvariandis on IGF-IR-antigeeniks fragment, mis sisaldab vähemalt ühte IGF-IR-i epitoopi. Teises teostusvariandis on IGF-IR antigeeniks rakk, mis ekspresseerib oma pinnal IGF-IR-i ja eelistatavalt rakk, mis ekspresseerib liiaga IGF-IR-i oma rakupinnal.
Loomade immunisatsioon võib olla läbi viidud ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga. Vaata näiteks Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Meetodid loomade, kelleks ei ole inimene, näiteks hiirte, rottide, lammaste, kitste, sigade, veiste ja hobuste immuniseerimiseks on erialaselt hästi tuntud. Vaata näiteks Harlow and Lane ja patent US 5994619. Eelistatud teostusvariandis manustatakse see IGF-IR-antigeen koos adjuvandiga, et stimuleerida immuunvastust.
Selliste adjuvantide hulka kuuluvad Freundi täis- ja mittetäisadjuvant, RIBI (muramüüldipeptiidid) või ISCOM (immunostimuleerivad kompleksid). Niisugused adjuvandid võivad kaitsta polüpeptiidi kiire hajumise eest nende eraldamisega lokaalseks deposiidiks, või nad võivad sisaldada aineid, mis stimuleerivad peremeesorganismi eritama faktoreid, mis on kemotaktikuks makrofaagidele, ja teisi immuunsüsteemi komponente. Eelistatavalt, kui polüpeptiidi manustada, siis see immunisatsioonigraafik sisaldab kahte või enamat polüpeptiidi manustamist, mis on jagatud mitme nädala peale. Näide I esitleb XENOMOUSE immuniseerimisprotokolli, kus immuniseerimine toimub täispika inimese IGF-IR-ga fosfaatpuhvriga puhverdatud füsioloogilises lahuses.
Antikehade ja antikeha produtseerijate rahuliinide produktsioon
Pärast looma immuniseerimist IGF-IR-antigeeniga, sellest loomast võivad olla saadud antikehad ja/või antikehasid produtseerivad rakud. Anti-IGF-IR-antikeha sisaldav seerum saadakse sellest loomast verevõtmisega või selle looma tapmisega. Seda seerumit võib kasutada pärast selle saamist loomast, seerumist võib olla saadud immunoglobuliini fraktsioon, millest võivad olla eraldatud anti-IGF-IR-antikehad. Seerum või immunoglobuliinid, mis on saadud sellisel viisil on polüklonaalsed, mis ei ole hea, sest saadav antikehade hulk on piiratud ja need polüklonaalsed antikehad on väga heterogeensete omadustega.
Teises teostusvariandis võivad immuniseeritud loomast olla valmistatud antikeha produtseerivad immortaliseeritud hübridoomid. Pärast immunisatsiooni loom tapetakse ja põrna B-rakud fuseeritakse immortaliseeritud müeloomirakkudega, mis on erialaselt hästi tuntud. Vaata näiteks Harlow and Lane eelpool. Eelistatud teostusvariandis need müeloomi rakud ei erita immunoglobuliini polüpeptiide (mitteeritavate rakkude liin). Pärast fusiooni ja antibiootilist selektsiooni neid hübridoome skriiniti, kasutades IGF IR-i, selle osa või rakku, mis ekspresseerib IGF-IR-i. Eelistatud teostusvariandis algset skriinimist teostati kasutades ensüümiga seotud immuuntesti (ELISA) või radioimmuuntesti (RIA), eelistatavalt ELISA-t. Näide skriinimisest ELISA abil on toodud publikatsioonis WO 00/37504, mis on siin viitena sisse lülitatud.
Teises teostusvariandis võivad antikeha produtseerivad rakud olla valmistatud inimesest, kellel on autoimmuunsed haigused ja kes ekspresseerib anti-IGF-IR-antikehasid. Rakud, mis ekspresseerivad anti-IGF-IR-antikehasid võivad olla isoleeritud, eraldades valged vererakud ja sorteerides seejärel fluorestsentselt aktiveeritud rakud (FACS - fluoresence-activated eeli sorting) või uhtudes plaatidel, mis on kaetud IGF-IR-ga või selle osaga. Need rakud võivad olla fuseeritud inimese mittesekretoorse müeloomiga, et produtseerida inimese hübridoome, mis ekspresseerivad inimese anti-IGF-IR-antikehasid. Üldjuhul on see vähem eelistatud teostusvariant, sest paistab, et neil anti-IGF-IR-antikehadel on madal afiinsus IGF-IR suhtes.
Anti-IGF-IR-antikeha produtseerivad hübridoomid on valitud, kloonitud ja seejärel skriinitud soovitavate karakteristikute saamiseks, kaasaarvatud jõuline hübridoomi kasv, kõrge antikeha produktsioon ja soovitavad antikeha karakteristikud, nagu on arutletud allpool. Hübridoomid võivad olla kasvatatud kultuuris ja arendatud in vivo süngeensetes loomades, s.o loomades, millel puudub immune süsteem, näiteks karvatus hiires või raku kultuuris in vitro. Meetodid hübridoomide selekteerimiseks, kloonimiseks ja arendamiseks on selle ala keskmise tasemega spetsialistile hästi tuntud.
Eelistatavalt selleks immuniseeritud loomaks on loom, kelleks ei ole inimene, kes ekspresseerib inimese immunoglobuliini geene, ja põrna B-rakud on fuseeritud müeloomile, mis on tuletatud samadest liikidest, nagu see loom, kelleks ei ole inimene. Enam eelistatavalt on immuniseeritud loomaks XENOMOUSE ja müeloomiraku liiniks on mittesekretoorne hiire müeloom, näiteks müeloomirakuliin NSO-bcl2. Vaata, näiteks näide I.
Käesolev leiutis esitleb ühest aspektist hübridoomide produtseerimist, mis produtseerivad inimese anti-IGF-IR-antikehasid. Eelistatud teostusvariandis nendeks hübridoomideks on hiire hübridoomid, nagu eelpool kirjeldatud. Teises eelistatud teostusvariandis on hübridoomid produtseeritud liigis, mis ei ole inimene, ega hiir, sellises, nagu rotid, lambad, sead, kitsed, veised või hobused. Teises teostusvariandis nendeks hübridoomideks on inimese hübridoomid, milles inimese mittesekretoorne müeloom on fuseeritud inimese rakuga, mis ekspresseerib anti-IGF-IR-antikeha.
Nukleiinhapped, vektorid, peremeesrakud ja rekombinantmeetodid antikehade valmistamiseks
Nukleiinhapped
On esitletud käesoleva leiutise kohaseid nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad anti-IGF-IR-antikehasid. Ühes teostusvariandis kodeerib see nukleiinhappemolekul anti-IGF-IR-immunoglobuliini rasket ja/või kerget ahelat. Eelistatud teostusvariandis kodeerib üksik nukleiinhappemolekul anti-IGF-IR immunoglobuliini rasket ahelat ja teine nukleiinhappemolekul kodeerib anti IGF-IR-immunoglobuliini kerget ahelat. Enam eelistatud teostusvariandis on selleks kodeeritud immunoglobuliiniks inimese immunoglobulin, eelistatavalt inimese IgG. Selleks kodeeritud kergeks ahelaks võib olla lambda-ahel või kapa-ahel, eelistatavalt kapa-ahel.
Leiutisekohane nukleiinhappemolekul, mis kodeerib kerge ahela variaabelpiirkonda, võib olla tuletatud A30, A27 või 012 Vkapa geenist. Eelistatud teostusvariandis on see kerge ahel tuletatud A30 Vkapa-geenist. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab leiutisekohane nukleiinhappemolekul, mis kodeerib kerget ahelat, sisaldab ühendavat piirkonda, mis on tuletatud Jkapa1, Jkapa2 või Jkapa4-st. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis see nukleiinhappemolekul, mis kodeerib kerget ahelat, sisaldab mitte enam kui kümmet aminohappe asendust eellase A30 Vkapa-geenis, eelistatavalt mitte enam kui kuus aminohappe asendust ja veelgi enam eelistatavalt mitte enam kui kolm aminohappe asendust.
Käesolev leiutis esitleb nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib kerge ahela (VL) variaabelpiirkonda, mis sisaldab vähemalt kolme aminohappeasendust võrreldes eellasjärjestustega, kusjuures need aminohappe asendused on identsed aminohappe asendustega eellasjärjestustes VL-st ühes järgmistest antikehadest: 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappemolekuli, mis sisaldab nukleiinhappejärjestusi, mis kodeerib kerge ahela variaabelpiirkonna aminohappe järjestusi ühes antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappemolekuli, mis sisaldab nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib ühte või enamat kerge ahela CDR-i aminohappejärjestust ühes antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Eelistatud teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib aminohappejärjestust kõikides CDR-des ükskõik millises kerges ahelas antikehas 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Teises teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib ühte aminohappejärjestustest: SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 või 22, või sisaldab ühte nukleiinhapejärjestust SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 või 21. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhapejärjestust, mis kodeerib ühe või enama CDR-i aminohappejärjestust ühes või enamas järjestustest SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 või 22 või sisaldab nukleiinhappejärjestus ühte või enamat CDR-dest ühe või enama järgmise järjestuse seast: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 või 21. Enam eelistatud teostusvariandis see nukleiinhappemolekul sisaldab nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib aminohappejärjestusi kõikides CDR-s ükskõik millise järjestusega järgmistest SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 või 22 või sisaldab nukleiinhappejärjestus kõiki CDR-e SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 või 21.
Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad VL-i aminohappejärjestust, mille aminohappejärjestus on vähemalt 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 või 99% osas identne VL-i omaga, mida on kirjeldatud eelpool, konkreetselt VL omaga, mis sisaldab ühte järgmistest aminohappejärjestustest: SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 või 22. Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappejärjestust, mis on vähemalt 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 või 99% identne ühe nukleiinhappejärjestusega järgmistest: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 või 21. Teises teostusvariandis esitleb käesolev leiutis nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib VL-i, mis hübridiseerub karmides tingimustes nukleiinhappemolekuliga, mis kodeerib VL-i, nagu eelpool kirjeldatud, eriti nukleiinhappemolekuliga, mis sisaldab nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib aminohappejärjestust: SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 või 22. Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib VL-i, mis hübridiseerub väga karmides tingimustes nukleiinhappemolekuliga, mis sisaldab ühte nukleiinhappejärjestustest: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 või 21.
Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib raske ahela (VH) variaabelpiirkonda, mis on tuletatud geenidest DP-35, DP-47, DP-71 või Vit-4/4.35 VH, eelistatavalt DP-35 VH geenist. Teises eelistatud teostusvariandis see nukleiinhappemolekul, mis kodeerib VH-d, sisaldab ühendavat piirkonda, mis on tuletatud JH6-st või JH5-st, enam eelistatavalt JH6-st. Teises eelistatud teostusvariandis on D segment tuletatud 3-3, 6-19 või 4-17-st. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis see nukleiinhappemolekul, mis kodeerib VH-d, sisaldab mitte enam kui kümme aminohappe asendust eellasjärjestuse DP-47 geenist, eelistatavalt mitte enam kui kuus aminohappe asendust ja veelgi enam eelistatavalt, mitte enam kui kolm aminohappe asendust. Ülimalt eelistatud teostusvariandis sisaldab leiutisekohane nukleiinhappemolekul, mis kodeerib VH-d, sisaldab vähemalt ühte aminohappe asendust võrreldes eellasjärjestusega, kusjuures see aminohappe asendus on identne aminohappe asendusele eellasjärjestuses, raskest ahelast ühes antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis sisaldab, see VH vähemalt kolme aminohappe asendust võrreldes eellasjärjestustega, kusjuures need asendused on identsed nende asendustega eellasjärjestustest VH-st ühes antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1.
Ühes teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib aminohappejärjestust VH-s antikehast 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Teises teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib ühe või enama raske ahela CDR aminohappejärjestust antikehas: 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Eelistatud teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib kõiki CDR-i aminohappejärjestusi raskes ahelas antikehas 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib ühte aminohappejärjestustest SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 või 24, või sisaldab see ühte nukleiinhappejärjestust järgmistest: SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 või 23. Teises eelistatud teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib ühe või mitu CDR-i aminohappejärjestust ükskõik millises järjestustest SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 või 24, või sisaldab nukleiinhappejärjestus ühte või enamat CDR-st ükskõik millise järjestusega järgmistest: SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 või 23. Eelistatud teostusvariandis sisaldab see nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib aminohappejärjestusi kõikidest CDR-st ükskõik millise järjestusega järgmistest: SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 või 24 või sisaldab kõikide CDR-de nukleiinhappejärjestust ükskõik millises järjestusest SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 või 23.
Teises teostusvariandis see nukleiinhappemolekul kodeerib VH aminohappejärjestust, mis on vähemalt 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 või 99% identne ühe aminohappejärjestusega, mida kodeerivad VH-d, nagu on vahetult eelpool kirjeldatud, eriti VH-ga, mis sisaldab ühte aminohappejärjestustest: SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 või 24. Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappejärjestust, mis on vähemalt 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 või 99% identne ühe nukleiinhappejärjestusega järgmistest: SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 või 23. Teises teostusvariandis nukleiinhappemolekul, mis kodeerib VH-d on see, mis hübridiseerub väga karmides tingimustes nukleiinhappejärjestusega, mis kodeerib VH-d, nagu eelpool kirjeldatud, eriti VH-ga, mis sisaldab ühte järgmistest aminohappejärjestustest: SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 või 24. Käesolev leiutis esitleb samuti nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib VH-d, mis hübridiseerub väga karmides tingimustes nukleiinhappemolekuliga, mis sisaldab ühte nukleiinhappejärjestustest SEQ IDNOS: 3,7,11, 15, 19 või 23.
Nukleiinhappemolekul, mis kodeerib kas ühte või mõlemat anti-IGF-IR-antikeha tervest raskest või kergest ahelast või selle variaabelpiirkonnast, võib olla saadud ükskõik millisest allikast, mis produtseerib anti-IGF-IR-antikeha. Meetodid antikeha kodeeriva mRNA eraldamiseks on erialaselt hästi tuntud. Vaata näiteks Sambrook et al. See mRNA võib olla kasutatud cDNA valmistamiseks, et kasutada seda edasi polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR - polymerase chain reaction) või antikehageenide cDNA-kloonimiseks. Ühes käesoleva leiutise teostusvariandis võib see nukleiinhappemolekul olla saadud hübridoomist, mis ekspresseerib anti-IGF-IR-antikeha nagu eelpool kirjeldatud, eelistatavalt hübridoomist, mille fusioonipartneriks on transgeenne loomarakk, mis ekspresseerib inimese immunoglobuliini geene, näiteks XENOMOUSE , transgeenne loom, milleks on mittehumaniseeritud hiir, või transgeenne loom, kelleks ei ole inimene ega hiir. Teises teostusvariandis on see hübridoom tuletatud mitte transgeensest loomast, kes ei ole inimene, mis võib olla kasutatud näiteks humaniseeritud antikehade produtseerimiseks.
Nukleiinhappemolekul, mis kodeerib anti IGF-IR-antikeha tervet rasket ahelat võib olla konstrueeritud, fuseerides nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib raske ahela variaabeldomeeni või selle antigeeni seostavat domeeni raske ahela konstantse domeeniga. Analoogselt sellele nukleiinhappemolekul, mis kodeerib anti-IGF-IR-antikeha kerget ahelat, võib olla konstrueeritud, fuseerides nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib kerge ahela variaabeldomeeni või selle antigeeni seostavat domeeni kerge ahela konstantse domeeniga. Nukleiinhappemolekulid, mis kodeerivad VH- ja VL-ahelaid võivad olla muundatud täispikkadeks antikehageeneideks, sisestades need seejärel ekspressioonivektoritesse, mis juba kodeerivad raske ahela konstantseid ja kerge ahela konstantseid piirkondi vastavalt, nii et VH-segment on toimivalt seotud raske ahela konstantse piirkonna (CH) segmendi(de)ga vektoris ja VL-segment toimivalt seostatud kerge ahela konstantse piirkonna (CL) segmendiga vektoris. Alternatiivselt need nukleiinhappemolekulid, mis kodeerivad VH- või VL-ahelaid, on konverteeritud täispikkadeks antikehageenideks, seostades, näiteks ligeerides, need nukleiinhappemolekulid, mis kodeerivad VH-ahelat, nukleiinhappemolekuliga, mis kodeerib CH-ahelat, kasutades standardseid molekulaarbioloogilisi meetodeid. Sama võib olla saavutatud, kasutades nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad VL- ja CL-, ahelaid. Inimese raske ja kerge ahela konstantsete piirkondade geenide järjestused on erialaselt hästi tuntud. Vaata näiteks Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., MH Publ. No. 91-3242, 1991. Nukleiinhappemolekulid, mis kodeerivad täispikka rasket ja/või kerget ahelat, võivad seejärel olla ekspresseeritud rakust, millesse nad sisestatud on, misjärel anti-IGF-IR-antikeha võib olla eraldatud.
Eelistatud teostusvariandis nukleiinhape, mis kodeerib raske ahela variaabelpiirkonda, kodeerib aminohappejärjestust SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 või 24, ja nukleiinhappemolekul, mis kodeerib kergete ahelate variaabelpiirkondi, kodeerib aminohappejärjestust: SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 või 22. SEQ ID NO: 28 kujutab aminohappejärjestust ja SEQ ID NO: 27 kujutab nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib raske ahela konstantset piirkonda anti-IGF-IR-antikehades 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ja 6.1.1. SEQ BD NO: 26 kujutab aminohappejärjestust ja SEQ ID NO: 25 kujutab nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib kerge ahela konstantset piirkonda anti-IGF-IR-antikehades 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ja 6.1.1. Seega eelistatud teostusvariandis nukleiinhappemolekul, mis kodeerib raske ahela konstantset domeeni, kodeerib järjestust SEQ ID NO: 28, ja nukleiinhappemolekul, mis kodeerib kerge ahela konstantset domeeni, kodeerib järjestust SEQ ID NO: 26. Enam eelistatud teostusvariandis selle nukleiinhappemolekuli nukleiinhappejärjestuseks, mis kodeerib raske ahela konstantset domeeni, on SEQ ID NO: 27, ja nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib konstantset domeeni, nukleiinhappejärjestuseks on SEQ ID NO: 25.
Teises teostusvariandis nukleiinhappemolekul, mis kodeerib kas anti-IGF-IR-antikeha rasket ahelat või selle antigeeni seostavat domeeni, või anti-IGF-IR-antikeha kerget ahelat, või selle antigeeni seostavat domeeni, võib olla isoleeritud loomast, mis ei ole inimene, ega hiir, mis ekspresseerib inimese immunoglobuliini geene ja on immuniseeritud IGF-IR antigeeniga. Teises teostusvariandis võib see nukleiinhappemolekul olla isoleeritud anti-IGF-IR-antikeha-produtseerivast rakust, mis on tuletatud mittetransgeensest loomast või inimpatsiendist, kes produtseerib anti-IGF-IR-antikehasid. mRNA võib olla eraldatud anti-IGF-IR-antikeha produtseerivatest rakkudest on erialaselt hästi tuntud standardsete meetoditega, kloneeritud ja/või amplifitseeritud, kasutades PCR-i ja raamatukogukonstrukstioonimeetodeid, ja skriinitud kasutades standardseid protokolle, et saada nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad anti-IGF-IR raskeid ja kergeid ahelaid.
Need nukleiinhappemolekulid võivad olla kasutatud suurte koguste anti-IGF-IR-antikehade rekombinantseks ekspresseerimiseks, nagu allpool kirjeldatud. Need nukleiinhappemolekulid võivad samuti olla kasutatud kimäärsete antikehade, üheahelaliste antikehade, immunoadhesiinide, kaksikantikehade, muteeritud antikehade ja antikeha derivaatide valmistamiseks, nagu allpool kirjeldatud. Kui need nukleiinhappemolekulid on are tuletatud mittetransgeensest loomast, kelleks ei ole inimene, siis need nukleiinhappemolekulid võivad olla kasutatud samuti antikeha humaniseerimiseks, nagu allpool kirjeldatud.
Teises teostusvariandis, käesoleva leiutise kohased nukleiinhappemolekulid võivad olla kasutatud sondide või PCR-praimeritena konkreetsete antikehajärjestustele. Näiteks, nukleiinhappemolekulide sondid võivad olla kasutatud diagnostilistes meetodites või võib nukleiinhappemolekuli PCR-praimer võib olla kasutatud DNA piirkondade amplifitserimiseks, mis võivad olla kasutatud muu hulgas selleks, et eraldada nukleiinhappejärjestusi kasutamiseks anti-IGF-IR-antikehade variaabeldomeenide produtseerimisel. Eelistatud teostusvariandis on nendeks nukleiinhappemolekulideks oligonukleotiidid. Enam eelistatud teostusvariandis on need oligonukleotiidid pärit huvipakkuva antikeha raske ja kerge ahela kõrge variaablusega piirkondadest. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis need oligonukleotiidid kodeerivad ühte või enamat CDR-i tervenisti või osaliselt.
Vektorid
Käesolev leiutis esitleb vektoreid, mis sisaldavad käesoleva leiutise kohaseid nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad rasket ahelat või selle antigeeni seostavat osa. Käesolev leiutis esitleb samuti vektoreid, mis sisaldavad käesoleva leiutise kohaseid nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa. Käesolev leiutis esitleb ka vektoreid, mis sisaldavad nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad fusioonivalke, modifitseeritud antikehasid, antikehafragmente ja nende sonde.
Et ekspresseerida käesoleva leiutise kohaseid antikehasid või antikeha osi, DNA-d mis kodeerivad osalist või täispikka kerget ja rasket ahelat, mis olid saadud nii, nagu eelpool kirjeldatud, viiakse sisse ekspressioonivektoritesse nii, et need geenid oleksid toimivalt seostatud transkriptsionaalse ja translatsionaalse kontrolljärjestusega. Ekspressioonivektorite hulka kuuluvad plasmiidid, retroviirused, kosmiidid, YACs, EBV poolt juhitavad episoomid ja muu taoline. See antikehageen ligeeritakse vektorisse nii, et transkriptsionaal- ja translatsionaalkontrolljärjestused vektoris täidavad neile ette nähtud funktsiooni antikeha geeni transkriptsiooni, transkriptsiooni ja translatsiooni regulatsioonil. Need ekspressioonivektor- ja ekspressioonikontroll- järjestused on valitud nii, et nad sobivad kokku kasutatava ekspressiooniperemeesrakuga. Antikeha kerge ahela geen ja antikeha raske ahela geen võivad olla sisestatud eraldi vektoritesse. Eelistatud teostusvariandis on mõlemad geenid sisestatud samasse ekspressioonivektorisse. Need antikehageenid sisestatakse ekspressioonivektorisse standardsete meetoditega (näiteks, komplementaarsete restriktsioonisaitide ligeerimisega antikeha geeni fragmendile ja vektorile või nüriotsalise ligatsiooniga, kui puuduvad restriktsioonisaidid).
Sobivaks vektoriks on selline vektor, mis kodeerib funktsionaalselt tervet inimese immunoglobuliini CH- või CL-järjestust, koos vastava restriktsioonisaidiga, mis on valmistatud nii, et ükskõik millineVH- või VL-järjestus võib olla kergesti sisestatud ja ekspresseeritud, nagu eelpool kirjeldatud. Niisugustes vektorites toimub splaising tavaliselt inserditud J piirkonna splaisdoonorsaidi ja splaisaktseptorsaidi vahel, mis eelneb inimese C piirkonnale, ja samuti splaispiirkondades, mis paiknevad inimese CH-eksonites. Polüadenüleerimine ja transkriptsiooni termininatsioon leiab aset natiivses kromosomaalsaidis, mis paikneb allpool kodeerimispiirkondi. See rekombinantne ekspressioonivektor võib samuti kodeerida signaalpeptiidi, mis kergendab antikeha ahela sekretsiooni peremeesrakust. See antikeha ahelgeen võib olla kloonitud vektorisse nii, et signaalpeptiid on seostatud karkassisiseselt antikeha ahelgeeni aminootsaga. Selleks signaalpeptiidiks võib olla immunoglobuliini signaalpeptiid või heteroloogne signaalpeptiid (s.o signaalpeptiid mitte-immunoglobuliinvalgust).
Lisaks antikeha ahelgeenidele võivad need käesolev leiutise kohased rekombinantsed ekspressioonivektorid kanda regulaatorjärjestusi, mis kontrollivad antikeha ahelgeeni ekspressiooni peremeesrakus. Spetsialist teab, et ekspressioonivektori konstrueerimine, kaasaarvatud regulaatorjärjestuste valik võib sõltuda sellistest faktoritest, nagu transformeeritava peremeesraku valik, soovitava valgu ekspressiooni tasemest jne. Eelistatud regulaatorjärjestused imetaja peremeesraku ekspressioonis sisaldavad viiruse elemente, mis suunavad kõrgetasemelist valgu ekspressiooni imetaja rakkudes, näiteks, promootoreid ja/või intensiivistajaid retroviiruslikest LTR-st, tsütomegaloviirusest (CMV) (nagu näiteks CMV promootor/intensiivistaja), arhiviirusest 40 (SV40) (nagu näiteks SV40 promootor/intensiivistaja), adenoviirusest, (näiteks adenoviiruse peamine hiline promootor (AdMLP - adenovirus major läte promoter), polüoomi ja tugevad imetaja promootorid, näiteks natiivse immunoglobuliini ja toime promootorid. Viiruse regulaatorelementide ja nende järjestuste lisakirjelduste saamiseks vaata näiteks patent US 5168062, Stinski, patent US 4510245, Bell et al. ja patent US 4968615, Schaffner et al.
Lisaks nendele antikeha ahelgeenidele ja regulaatorjärjestustele võivad käesoleva leiutise kohased rekombinantsed ekspressioonivektorid kanda lisajärjestusi, näiteks selliseid nagu järjestused, mis reguleerivad selle vektorreplikatsiooni peremeesrakkudes (näiteks replikatsiooni algus) ja selekteeritavad markergeenid. See selekteeritav markergeen kergendab peremeesrakkude selektsiooni, millesse see vektor on sisestatud (vaata näiteks patendid US 4399216, US 4634665 ja US 5179017, kõik välja antud Axel et al.). Näiteks annab see selekteeritav markergeen peremeesrakule, millesse see vektor on sisestatud, tüüpiliselt resistentsi ravimite, näiteks sellisele nagu G418, hügromütsiin või metotreksaat, vastu. Eelistatud seleteeritavate markergeenide hulka kuuluvad dihüdrofolaadi reduktaasi (DHFR - dihydrofolate reductase) geen (kasutamiseks DHFR-peremeesrakkudes metotreksaadi selektsiooniks/amplifikatsiooniks) ja neogeen (G418 selektsiooniks).
Mittehübridoomperemeesrakud ja meetodid rekombinantseks valgu produtseerimiseks
Nukleiinhappemolekulid, mis kodeerivad anti-IGF-IR-antikeha raske ahela või selle antigee no seostava osa ja/või kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa, ja vektoreid, mis sisaldavad neid nukleiinhappe molekule, võivad olla kasutatud sobivate imetajaperemeesrakkude transformatsiooniks. Transformatsioon võib olla teostatud ükskõik millise tuntud meetodiga, mida kasutatakse polünukleotiidide sisestamiseks peremeesrakku. Heteroloogsete polünukleotiidide imetaja rakkudesse sisestamise meetodid on erialaselt hästi tuntud ja nende hulka kuuluvad dekstraani poolt vahendatud transfektsioon, sadestamine kaltsiumfosfaadiga, polübreeni poolt vahendatud transfektsioon, protoplastide fiisioon, elektroporatsioon, polünukleotiidide kapseldamine liposoomides, biolistiline injektsioon ja DNA otsene mikroinjektsioon tuumadesse. Lisaks sellele võivad nukleiinhappemolekulid olla sisestatud imetaja rakkudesse, kasutades viiruslikke vektoreid. Meetodid rakkude transformeerimiseks on erialaselt hästi tuntud. Vaata näiteks patendid US 4399216, US 4912040, US 4740461, ja US 4959455 (need patendid on siin viitena sisse lülitatud).
Imetajarakuliinid, mis on saadavad kui ekspressiooniperemehed, on erialaselt hästi tuntud ja nende hulka kuuluvad paljud immortaliseeritud rakuliinid, mis on kätte saadavad Ameerika Tüüpkultuuri Kollektsioonist (ATCC - American Type Culture Collection). Nende hulka kuuluvad muuseas Hiina hamstri munasari (CHO - Chinese hamsters ovary) rakud, NSO, SP2 raks, HeLa raks, hamstripoja neeru (BHK - baby hamster kidney) rakud, ahvi neerurakud (COS), inimese hepatotsellulaarse kartsinoomi rakud (näiteks Hep G2), A549 rakud, 3T3 rakud ja paljud teised rakuliinid. Imetajate peremeesrakkude hulka kuuluvad inimese, hiire, roti, koera, ahvi, sea, kitse, härja, hobuse ja hamstri rakud. Mõningate konkreetsete eelistega rakuliinid valiti välja määrates, missugustel rakuliinidel on kõrged ekspressioonitasemed. Teisteks rakuliinideks, mis võivad olla kasutatud, on putukaraku liinid, näiteks sellised, nagu Sf9 rakud, amfiibide rakud, bakteriaalrakud, taimerakud ja seenerakud. Kui rekombinantsed ekspressioonivektorid, mis kodeerivad rasket ahelat või selle antigeeni seostavat osa ja leiutisekohast kerget ahelat ja/või selle antigeeni seostavat osa, on sisse viidud imetaja peremeesrakkudesse, siis antikehasid produtseeritakse, kasvatades peremeesrakke ajavahemiku jooksul, mis on piisav selleks, et võimaldada antikeha ekspressiooni peremeesrakkudes või, enam eelistatavalt, et võimaldada antikeha eritumist söötmesse, milles peremeesrakud kasvavad. Antikehad võivad olla saadud söötmest, kasutades standardseid valgu puhastamismetoodikaid.
Edasi, leiutisekohaste antikehade (või nende teiste osade) ekspressiooni produtseerivatest rakuliinidest võib tõsta, kasutades paljusid tuntud meetodeid. Näiteks glutamiinsüntetaasi geeni ekspressioonisüsteemi (GS-süsteem), mis on tavaliseks lähenemisviisiks ekspressiooni intensiivistamisel teatud tingimustes. Seda GS-süsteemi on arutatud tervenisti või osaliselt seoses patentidega EP 0 216 846, EP 0 256 055 ja EP 0 323 997 ja Euroopa patenditaotlusega nr 89303964.4.
Tundub, et antikehad, mis on ekspresseeritud erinevate rakuliinide poolt või transgeensetes loomades, erinevad teineteisest glükosülatsiooni poolest. Kuid kõik antikehad, mis on kodeeritud siinesitletud nukleiinhappemolekulis või mis sisaldavad siin esitletud aminohappejärjestusi, on osa käesolevast leiutisest, sõltumata nende antikehade glükosülatsioonist.
Trctnsgeensed loomad
Käesolev leiutis esitleb ka transgeenseid loomi, mis ei ole inimesed, mis sisaldavad üht või enamat käesoleva leiutise kohast nukleiinhappemolekuli, mis võib olla kasutatud käesoleva leiutise kohaste antikehade produtseerimiseks. Antikehad võivad olla produtseeritud ja kogutud koe või organismi vedelikest, näiteks sellistest nagu piim, veri või uriin, kitsedest, lehmadest, hobustest, sigadest, rottidest, hiirtest, küülikutest, hamstritest või teistest imetajatest. Vaata näiteks patendid US 5827690, US 5756687, US 5750172 ja US 5741957. Nagu eelpool kirjeldatud, mittetransgeensed loomad, mis sisaldavad inimese immunoglobuliini lookuseid võivad olla produtseeritud immuniseerimisel IGF-IR-i või selle osaga.
Teises teostusvariandis loomad, kes ei ole inimene, valmistati sisestades ühte või enamat käesoleva leiutise kohast nukleiinhappemolekuli loomasse, kasutades standardseid transgeenseid meetodeid. Vaata Hogan, eelpool. Transgeense looma valmistamisel kasutatud transgeensed rakud võivad olla embrüonaalsed tüvirakud või somaatilised rakud. Need transgeensed organismid, kelleks ei ole inimene, võivad olla kimäärsed, mittekimäärsed heterosügoodid ja mittekimäärsed homosügoodid. Vaata näiteks Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mõse Genetics ja Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); ja Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Teises teostusvariandis on neil transgeensetel organismidel, kelleks ei ole inimene, tehtud sihtmärklõige ja paigutatud sinna asendus, mis kodeerib huvipakkuvat rasket ahelat ja/või kerget ahelat. Eelistatud teostusvariandis need transgeennsed loomad sisaldavad ja ekspresseerivad nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad rasket ja kerget ahelat, mis seostub spetsiifiliselt IGF IR-ga, eelistatavalt inimese IGF-IR-ga. Teises teostusvariandis need transgeennsed loomad sisaldavad nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad modifitseeritud antikeha, näiteks sellist nagu üheahelaline antikeha, kimäärne antikeha või humaniseeritud antikeha. Need anti-IGF-IR-antikehad võivad olla valmistatud ükskõik millises transgeenses loomas. Eelistatud teostusvariandis on nendeks loomadeks, kelleks ei ole inimene, hiired, rotid, lambad, sead, kitsed, veised või hobused. See transgeenne loom, kelleks ei ole inimene, ekspresseerib nimetatud polüpeptiide verre, piima, uriini, sülge, pisaratesse, limasse ja teistesse organismi vedelikesse.
Faagi displeiraamatukogud
Käesolev leiutis esitleb meetodit anti-IGF-IR-antikeha või selle antigeeni seostava osa produtseerimiseks, mis sisaldab järgmiseid etappe: faagivastaste inimese antikehade teegi sünteesimist, selle teegi skriinimist IGF-IR või selle osaga, IGF-IR-seostava faagi eraldamist ja selle antikeha saamist faagist. Üks antikehade raamatukogu saamise meetoditest sisaldab peremeeslooma, kelleks ei ole inimene, immuniseerimise etappe, kusjuures see loom sisaldab inimese immunoglobuliini lookust IGF-IR-ga või selle antigeenset osa, et tekitada immuunvastus; antikehasid produteerivate rakkude ektraheerimist peremeesloomast; RNA eraldamist ekstraheeritud rakkudest; cDNA saamist eraldatud RNA pöördtranskribeerimisel; saadud cDNA amplifitseerimist, kasutades praimerit ja selle cDNA insertimist faagi displeivektorisse nii, et antikehad ekspresseeritakse faagil. Sellisel viisil võivad olla saadud käesoleva leiutise kohased rekombinantsed anti-IGF-IR-antikehad.
Käesoleva leiutise kohased rekombinantsed anti-IGF-IR inimese antikehad, lisaks siin avalikustatud anti-IGF-IR-antikehadele, võivad olla eraldatud rekombinantsete kombinatoorsete antikehade raamatukogu skriinimisega, eelistatavalt scFv faagi displeiraamatukogu, mis on valmistatud, kasutades inimese VL- ja VH-cDNA-sid, mis on valmistatud inimese lümfotsüütidest tuletatud mRNA-st. Selliste raamatukogude valmistamise ja skriinimise metodoloogiad on erialaselt teada. On olemas kaubanduslikult saadavad komplektid displeiraamatukogude genereerimiseks (näiteks Pharmacia Rekombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; ja Stratagene SurQAP phage display kit, catalog no. 240612). On olemas ka teisi meetodeid ja reagente, mis võivad olla kasutatud antikeha displeiraamatukogude genereerimisel ja skriinimisel (vaata näiteks Ladner et al., patent US 5223409; Kang et al., WO 92/18619; Dower et al., WO 91/17271; Winter et al., WO 92/20791; Markland et al., WO 92/15679; Breitling et al., WO 93/01288; McCafferty et al., WO 92/01047; Garrard et al., WO 92/09690; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372 ; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridoms 3: 81-85; Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths et al., (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Gxametal, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc Hape Res 19: 4133-4137; ja Barbas et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.
Eelistatud teostusvariandis selleks, et eraldada soovitavate karakteristikutega inimese anti-IGF-IR-antikehad, siin kirjeldatud inimese anti-IGF-IR-antikehasid algul kasutatakse selleks, et selekteerida inimese raske ja kerge ahela järjestusi, millel on analoogsed seostumisaktiitvsused IGF-IR suhtes, kasutades epitoobi imprintingmeetodeid, mida on kirjeldanud Hoogenboom et al., WO 93/06213. Antikeharaamatukogud, mida on kasutatud selles meetodis on eelistatavalt scFv-raamatukogudest valmistatud ja skriinitud, nagu on kirjeldanud McCafferty et al., WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; ja Griffiths et al., (1993) EMBO J 12: 725-734. Neid scFv antikeharaamatukogusid skriinitakse eelistatavalt kasutades antigeenina inimese IGF-IR-i.
Kui juba esialgsed inimese VL- ja VH-segmendid on valitud, viidi läbi "sega ja sobita" eksperimendid, milles erinevad paarid esialgselt valitud VL- ja VH-segmente on skriinitud IGF-IR seostumise suhtes, et valida eelistatud VL/VH-paaride kombinatsioonid. Lisaks sellele, et parandada selle antikeha kvaliteeti, need VL- ja VH-segmendid eelistatud VL/VH-paaride st võivad olla juhuslikult muteeritud, eelistatavalt VH ja/või VL-i CDR3 piirkonnas, protsessis, mis on analoogne in vivo somaatilisele mutatsiooniprotsessile, mis vastutab antikehade afiinsuse küpsemise eest loomuliku immuunvastuse puhul. See in vitro affiinsuse küpsemine võib olla läbi viidud, kasutades VH- ja VL-piirkondade amplifitseerimist, milles kasutatakse PCR-praimereid, mis on komplementaarsed VH CDR3-le või VL CDR3-le vastavalt, kusjuures neile praimeritele on lisatud juhuslik segu neljast nukleotiidalusest teatud positsioonides nii, et tulemusena saadud PCR produktid kodeerivad VH- ja VL-segmente, millesse on sisse viidud juhuslikud mutatsioonid VH- ja/või VL-CDR3 piirkondadesse. Need juhuslikult muteeritud VH- ja VL-segmendid võivad olla uuesti skriinitud seostumise suhtes IGF-IR-ga.
Pärast käesoleva leiutise kohast anti-IGF-IR-antikeha skriinimist ja eraldamist rekombinantsest immunoglobuliini displeiraamatukogust, nukleiinhape, mis kodeerib seda valitud antikeha võib olla saadud displeipaketist (näiteks faagi genoomist) ja alakloonitud teistesse ekspressioonivektoritesse standardsete rekombinant-DNA meetoditega. Kui soovitav, siis seda nukleiinhapet võib edasi käsitseda, et luua teisi käesoleva leiutise kohaseid antikehavorme, nagu allpool kirjeldatud. Et ekspresseerida rekombinantset inimese antikeha, mis oli isoleeritud kombinatoorse raamatukogu skriinimisel, DNA, mis kodeerib seda antikeha, klooniti rekombinantsesse ekspressioonivektorisse ja sisestati imetaja peremeesrakkudesse, nagu eelpool kirjeldatud.
Klassi ümberlülitamine
Käesoleva leiutise teiseks aspektiks on esitleda mehhanismi, mille abil sellelt klassilt anti-IGF-IR-antikehadelt võib ümber lülituda teisele klassile antikehadele. Ühest käesoleva leiutise aspektist nukleiinhappemolekul, mis kodeerib VL või VH-d isoleeriti kasutades meetodeid, mis on erialaselt hästi tuntud nii, et see ei sisalda ühtegi nukleiinhappejärjestust, mis kodeeriks CL või CH-d. See nukleiinhappemolekul, mis kodeerib VL või VH-d, seostatakse seejärel toimivalt nukleiinhappejärjestusega, mis kodeerb CL või CH-d eri immunoglobuliinimolekuli klassist. See võib olla saavutatud, kasutades vektorit või nukleiinhappemolekuli, mis sisaldab CL- või CH-ahelat, nagu eelpool kirjeldatud. Näiteks anti-IGF-IR-antikeha, mis oli esialgselt IgM, võib olla lülitatud klassi IgG. Edasi, klassi ümberlülitamist võib kasutada selleks, et muundada üks IgG alaklass teiseks, näiteks alaklassist IgG1 alaklassi IgG2. Eelistatud meetodiks käesoleva leiutise kohase antikeha produtseerimiseks, mis sisaldab soovitavaid isotüüpe, sisaldab järgmiseid etappe: anti-IGF-IR-antikeha rasket ahelat kodeeriva nukleiinhappe eraldamist ja anti-IGF-IR-antikeha kerget ahelat kodeeriva nukleiinhappe eraldamist, saades raske ahela variaabelpiirkonna, raske ahela variaabelpiirkonna ligeerimist soovitava isotüübi raske ahela konstantse domeeniga, selle kerge ahela ja selle ligeeritud raske ahela ekspresseerimist rakus ja soovitavat isotüüpi anti-IGF-IR-antikeha kogumist.
Antikeha derivaadid
Nukleiinhappemolekule, mida on kirjeldatud eelpool, võib kasutada antikehaderivaatide genereerimiseks, kasutades keskmise kvalifikatsiooniga spetsialistile teadaolevat tehnikat ja meetodeid.
Humaniseeritud antikehad
Nagu eelpool arutletud seoses inimese antikeha genereerimisega, vähendatud immunogeensusega antikehade produtseerimisel on eeliseid. See võib olla teostatud mingil määral kasutades humaniseerimistehnikat ja displeitehnikat, kasutades sobivaid raamatukogusid. Tähtis on, et hiirte antikehad või antikehad teistest liikidest võivad olla humaniseeritud või primatiseeritud, kasutades erialaselt hästi tuntud meetodeid. Vaata näiteks, Winter ja Harris, Immunol Today, 14: 43-46 (1993) ja Wright et al., Crit. Reviews in Immunol, 12: 125-168 {1992). Huvipakkuv antikeha võib olla geneetiliselt muundatud, kasutades rekombinant-DNA meetodeid, et asendada CH1, CH2, CH3, hingedomeenid ja/või selle domeenikarkassi vastava inimese järjestusega (vaata WO 92/02190 ja patendid US 5530101, US 5585089, US 5693761, US 5693792, US 5714350, ja US 5777085). Eelistatud teostusvariandis, anti-IGF-IR-antikeha võib olla humaniseeritud, kui asendada selles CH1-, CH2-, CH3-, liigenddomeenid ja/või selle domeeni karkassid vastava inimese järjestusega, toetades samal ajal kõiki ülejäänud raske ahela, kerge ahela või nii raske kui kerge ahela CDRS-e.
Muteeritud antikehad
Teises teostusvariandis leiutisekohane nukleiinhappemolekul, vektorid ja peremeesrakud võivad olla kasutatud muteeritud anti-IGF-IR-antikehade valmistamiseks. Need antikehad võivad olla seostumisomaduste muutmiseks muteeritud raske ja/või kerge ahela variaabeldomeenides. Näiteks mutatsioon võib olla tehtud ühes või enamas CDR-piirkonnas, et suurendada või vähendada antikeha Kd-d IGF-IR suhtes, suurendamaks või vähendamaks Koff, või muutes selle antikeha seostumise spetsiifikat. Saidisuunalise mutageneesi meetodid on erialaselt hästi tuntud. Vaata näiteks Sambrook et al. ja Ausubel et al., eelpool. Eelistatud teostusvariandis on mutatsioonid tehtud aminohappejääkides, mille kohta on teada, et nad on muutunud võrreldes anti-IGF-IR antikeha variaabel piirkonna eellasjärjestusega. Enam eelistatud teostusvariandis, üks või enam mutatsiooni on tehtud aminohapejäägi juures, mille kohta on teada, et see on vahetatud, võrreldes eellasjärjestuse variaabel piirkonna või CDR piirkonnaga ühes antikehadest anti-IGF-IR-antikeha 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9,2,4.17.3 või 6.1.1 seast. Teises teostusvariandis on üks või enam mutatsiooni tehtud aminohapejäägi juures, mille kohta on teada, et see on vahetatud, võrreldes eellasjärjestusega variaabelpiirkonnas või CDR piirkonnas, mille aminohappejärjestus on toodud järjestustes: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 või 24, või mille nukleiinhappejärjestus on toodud järjestustes SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 või 23. Teises teostusvariandis on see nukleiinhappemolekul muteeritud ühes või enamas karkassipiirkonnas. Mutatsioon võib olla tehtud karkassipiirkonnas või konstantses domeenis, suurendamaks anti-IGF-IR-antikeha pooliga. Vaata näiteks WO 00/09560, publitseeritud 24., veebruaril 2000, mis on siin viitena sisse lülitatud. Ühes teostusvariandis võib olla üks, kolm või viis punktmutatsiooni ja mitte enam, kui kümme punktmutatsiooni. Mutatsioon karkassipiirkonnas või konstantses domeenis võib samuti olla tehtud selleks, et muuta antikeha immunogeensust, et tagada paik kovalentseks või mittekovalentseks seostumiseks teise molekuliga, või muuta selliseid omadusi, nagu komplemendi fiksatsioon. Mutatsioonid võivad olla tehtud igas karkassipiirkonnas, konstantses domeenis ja variaabelpiirkonnas ühe muteeritud antikeha piires. Alternatiivselt võivad mutatsioonid olla valmistatud ainult ühes karkassipiirkondadest, variaabelpiirkondadest või konstantsetest domeenidest ühe muteeritud antikeha piires.
Ühes teostusvariandis ei ole muteeritud anti-IGF-IR-antikeha VH- või VL-piirkonnas aminohappemuutusi rohkem kui kümme, võrreldes anti-IGF-IR-antikehaga enne mutatsiooni. Enam eelistatud teostusvariandis ei ole muteeritud anti-IGF-IR-antikeha VH- või VL-piirkonnas aminohappemuutusi rohkem kui viis, võrreldes anti-IGF-IR-antikehaga enne mutatsiooni, enam eelistatavalt mitte enam kui kolm aminohappe vahetust. Teises teostusvariandis on konstantsetes domeenides mitte enam kui viisteist aminohappevahetust, enam eelistatavalt, mitte enam kui kümme aminohappevahetust, veelgi enam eelistatavalt, mitte enam kui viis aminohappevahetust.
Modiftseeritud antikehad
Teises teostusvariandis võib olla valmistatud fusioonantikeha või immunoadhesiin, mis sisaldab tervet anti-IGF-IR-antikeha või osa anti-IGF-IR-antikehast, mis on seotud teise polüpeptiidiga. Eelistatud teostusvariandis on selle polüpeptiidiga seotud ainult anti-IGF-IR-antikeha variaabelpiirkonnad. Teises eelistatud teostusvariandis on esimese polüpeptiidiga seostatud anti-IGF-IR antikeha VH-domeen, samal ajal, kui anti-IGF-IR-antikeha VL-domeen on seostatud teise polüpeptiidiga, mis on seotud esimese polüpeptiidiga sellisel viisil, milles VH- ja VL-domeenid võivad teineteisega interageeruda, moodustamaks antikeha seostumissaidi. Teises eelistatud teostusvariandis on VH-domeen eraldatud VL-domeenist linkeriga nii, et VH- ja VL-domeenid võivad interageerida teine teisega (vaata tagapool üheahelaliste antikehade all). VH-linker-VL-antikeha on seejärel seotud huvipakkuva polüpeptiidiga. Selline fusioonantikeha on kasulik polüpeptiidi suunamisel IGF-IR-ekspresserivasse rakku või koesse. Selleks polüpeptiidiks võib olla terapeutiline agens, näiteks selline, nagu toksiin, kasvufaktor või teine regulatoorne valk, või diagnostiline agens, näiteks selline nagu ensüüm, mis võib kergesti olla visualiseeritud, näiteks selline nagu mädarõika peroksidaas. Lisaks sellele võivad olla loodud sellised fusioonantikehad, milles teineteisega on seostatud kaks (või enam) üheahelalist antikeha. See on kasulik kui soovitakse luua divalentset või polüvalentset antikeha ühel polüpeptiidahelal või kui soovitatakse luua bispetsiifilist antikeha.
Et luua üheahelaline antikeha (scFv), VH- ja VL-d kodeerivad DNA fragmendid seostatakse toimivalt teise fragmendiga, mis kodeerib paindlikku linkerit näiteks sellisega, mis kodeerib aminohappejärjestust (Gly4-Ser)3 (SEQ ED NO: 60) nii, et VH- ja VL-järjestused võivad olla ekspresseeritud ühe külgneva üheahelalise valguna, milles VL- ja VH-piirkonnad on ühendatud paindliku linkeriga (vaata näiteks Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554). See üheahelaline antikeha võib olla monovalentne, kui kasutatud on ainult ühte VH-d ja VL-i, bivalentne, kui kasutatud on kahte VH-d ja VL-i, või polüvalentne, kui kasutatud on enamat kui kahte VH-d ja VL-i.
Teises teostusvariandis võivad olla valmistatud teised modifitseeritud antikehad, kasutades anti-IGF-IR-i kodeerivaid nukleiinhappemolekule. Näiteks, "kappaantikehad" ("kappabodies") (Ill et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "miniantikehad" ("minibodies") (Martin et al., EMBO J 13: 5303-9 (1994)), "kaksiantikehad" ("diabodies") (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)), või "janusiinid" ("janusins") (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) ja Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispetsiific reagents" Int J Cancer Suppi 7: 51-52 (1992)) võivad olla valmistatud kasutades standardseid molekulaarbioloogilisi meetodeid, järgides käesoleva leiutiskirjelduse õpetusi.
Teisest aspektist võivad olla genereeritud kimäärsed ja bispetsiifilised antikehad. Võib olla valmistatud kimäärne antikeha, mis sisaldab CDR-e ja karkasspiirkondi erinevatest antikehadest. Eelistatud teostusvariandis sisaldab see kimäärne antikeha kõiki anti-IGF-lR-antikeha kerge ahela või raske ahela variaabelpiirkondade CDR-e, samal ajal, kui karkassipiirkonnad on tuletatud ühest või enamast erinevast antikehast. Enam eelistatud teostusvariandis kimäärse antikeha CDR-de hulka kuuluvad kõik anti-IGF-IR-antikeha kerge ahela ja raske ahela variaabelpiirkondade CDR-d. Karkassipiirkonnad võivad olla teisest liigist ja võivad eelistatud teostusvariandis olla humaniseeritud. Alternatiivselt võivad need karkassipiirkonnad olla teisest inimese antikehast.
Võib olla genereeritud bispetsiifiline antikeha, mis seostub spetsiifiliselt IGF-IR-ga ühe seostumisdomeeni kaudu, ja teine molekul teise seostumisdomeeni kaudu. See bispetsiifiline antikeha võib olla produtseeritud, kasutades rekombinantse molekulaarbioloogia meetoditega, või võivad nad olla teineteisega seotud füüsiliselt. Lisaks sellele võib olla genereeritud üheahelaline antikeha, mis sisaldab enam, kui ühte VH-d ja VL-i, mis seostub spetsiifiliselt IGF-IR-ga ja teise molekuliga. Niisugused bispetsiifilised antikehad võivad olla genereeritud kasutades meetodeid, mis on hästi tuntud, seoses (i) ja (ii)-ga, vaata näiteks Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) ja Wright ja Harris, üleval, ja seoses (iii)-ga, vaata näiteks, Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppi) 7: 51-52 (1992). Eelistatud teostusvariandis seostub see bispetsiifiline antikeha IGF-IR-ga ja teise molekuliga, mida ekspresseeritakse kõrgel tasemel vähi- ja tuumorirakkudes. Enam eelistatud teostusvariandis selleks teiseks molekuliks on erbB2 retseptor, VEGF, CD20 või EGF-R.
Ühes teostusvariandis modifitseeritud antikehad, mida on kirjeldatud eelpool, valmistatakse, kasutades ühte või enamat variaabelpiirkondadest või ühte või enamat CDR-piirkonda antikehast, mis on valitud järgmistest antikehadest: 2.12.1, 2.13.2, 2.143, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 või 6.1.1. Teises teostusvariandis valmistatakse modifitseeritud antikehad, kasutades ühte või enamat variaabelpiirkondadest või ühte või enamat CDR piirkonda, mille aminohappejärjestus on toodud järjestuste: SEQ ID NO: 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 või 24 seas, või mille nukleiinhappejärjestus on toodud järjestuste SEQ IDNOS: 1,3,5,7,9, 11, 13,15, 17, 19, 21 või 23 seas.
Derivaaditudja märgistatud antikehad
Käesoleva leiutise kohane antikeha või selle antikeha osa võib olla tuletatud või seostatud teise molekuliga (näiteks teine peptiid või valk). Üldjuhul need antikehad või selle osad on tuletatud nii, et seostumine IGF-IR-a ei ole kahjustatud selle derivaatimise või märgistamisega. Järelikult on ette nähtud, et käesoleva leiutise kohased antikehad ja nende antikehade osad sisaldavad nii intaktseid kui modifitseeritud siin kirjeldatud inimese anti-IGF-IR-antikehade vorme. Näiteks käesoleva leiutise kohane antikeha või selle antikeha osa võibolla funktsionaalselt seotud (keemilise kupellimisega, geneetilise fusiooniga, mittekovalentse seostamisega või teisiti) ühe või enama teise iseseisva molekulaarvormiga, näiteks sellisega nagu teine antikeha (näiteks bispetsiifiline antikeha või kaksikantikeha), detektsiooniagens, tsütotoksiline agens, farmatseut il ine agens ja/või valk või peptiid, mis võib vahendada antikeha või selle antikeha osa sidestust teise molekuliga (sellisega nagu streptavidiini tuumapiirkond või polühistidün-tag).
Üks derivaaditud antikeha tüüp on valmistatud kahe või enama antikeha ristsidestamisega (sama tüüpi või erinevat tüüpi, näiteks selleks, et luua bispetsiifilised antikehad). Sobilike ristsidujate hulka kuuluvad heterobifunktsionaalsed ristsidujad, millel on kaks erinevalt reageerivat rühma, mis on eraldatud teine teisest vastava speiseriga (näiteks, m-maleimidobensoüül-N-hüdroksüsuktsiinimiidester), või homobifunktsionaalsed (näiteks disuktsiinimidüülsuberaat). Sellised linkerid on saadavad Pierce Chemical Company'st, Rockford, Ill.
Teine derivaaditud antikeha tüüp on märgistatud antikeha. Kasulike detektsiooniagenside hulka, millega käesoleva leiutise kohane antikeha või selle antikeha osa võib olla derivatiseeritud, kuuluvad fluorestsentsed ühendid, kaasaarvatud fluorestseiin, fluorestseiinisotiotsüanaat, rodamiin, 5-dimetüülamiin-l-naftaleensulfonüülkloriid, fükoerütriin, lantaniidfosforiid ja muu taoline. Antikeha võib olla märgistatud ka ensüümidega, mis on kasulikud detekteerimisel, näiteks sellistega, nagu mädarõika peroksidaas, beeta-galaktosidaas, lutsiferaas, aluseline fosfataas, glükoosi oksidaas ja muu taoline. Kui antikeha on märgistatud detekteeritava ensüümiga, siis selleks detekteerimiseks läheb vaja lisa reagente, mida see ensüüm kasutab, et produtseerida reaktsiooniprodukti, mis võib olla eristatud. Näiteks kui selleks agensiks on mädarõika peroksidaas, siis vesinikperoksiidi ja diaminobensidiini juuresolek viib värvilise reaktsiooniprodukti tekkele, mis on detekteeritav. Antikeha võib olla märgistatud ka biotiiniga ja detekteeritud kaudse avidiini või streptavidiini seostumise mõõtmisega. Antikeha võib olla märgistatud magnetagensiga, näiteks sellisega nagu gadoliinium. Antikeha võib olla märgistatud ka eelnevalt määratud polüpeptiidepitoobiga, mis on tuntav teises reporteriga (näiteks leutsiini tõmblukujärjestused, seostumissaidid teisestele antikehadele, metalli seostavad domeenid, epitoopmärgised). Mõningates teostusvariantides on märgised kinnitatud erinevate pikkustega speiserõlgade abil, et vähendada võimalikke ruumilisi steerilisi takistusi.
Anti-IGF-IR-antikeha võib olla märgistatud ka radiomärgistatud aminohappega. Seda radiomärgist võib kasutada nii diagnostilisel kui ka terapeutilisel eesmärgil. Näiteks seda radiomärgist võib kasutada, detekteerimaks IGF-IR-ekspresseerivaid tuumoreid röntgeni- või teise diagnostilise meetodiga. Edasi, radiomärgist võib kasutada terapeut il iselt toksiinina vähirakkude või tuumorite puhul. Polüpeptiididele ette nähtud märgiste näidete hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, järgmised radioisotoobid või radionukliidid - 3H, 14C, 15N, 35S, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
Anti-IGF-IR-antikeha võib olla derivaaditud keemilise rühmaga, näiteks sellisega, nagu polüetüleenglükool- (PEG), metüül- või etüülrühm või süsivesikrühm. Need rühmad võivad olla kasulikud huvipakkuva antikeha bioloogiliste karakteristikute parandamiseks, näiteks, pikendada selle seerumi pooliga või suurendada seostumist kudedega.
Farmatseutilised kompositsioonid ja komplektid
Käesolev leiutis käsitleb samuti farmatseutilist kompositsiooni hüperproliferatiivse haiguse raviks imetajas, mis sisaldab terapeutiliselt efektiivset kogust käesoleva leiutise kohast ühendit ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandjat. Ühes teostusvariandis nimetatud farmatseutiline kompositsioon on ette nähtud vähi raviks, näiteks aju-, kopsu-, skvamoosse raku, põie-, mao-, pankrease-, rinna-, pea-, selja-, neeru-, munasarja-, eesnäärme-, jäme- ja pärasoole-, söögitoru-, günekoloogilise või kilpnäärmevähi raviks. Teises teostusvariandis nimetatud farmatseutiline kompositsiooni kasutatakse mittevähkjate hüperproliferatiivsete haigustega, näiteks, ilma piiranguteta, restenoos pärast plastilist operatsiooni veresoontel ja psoriaas. Teises teostusvariandis käsitleb käesolev leiutis farmatseutilisi kompositsioone, mis on ette nähtud IGF-IR-i aktivatsiooni vajava imetaja raviks, kusjuures see farmatseutiline kompositsioon sisaldab terapeutiliselt efektiivset kogust käesoleva leiutise kohast aktiveerivat antikeha ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandjat. Farmatseutilised kompositsioonid, mis sisaldavad aktiveerivaid antikehi, võivad olla kasutatud selliste loomade ravil, kellel ei ole piisavalt IGF-I või IGF-II, või siis osteoporoosi raviks, või sellise nõrkuse või häirete raviks, mille puhul imetaja eritab liiga vähe aktiivset kasvuhormooni või on võimetu reageerima kasvuhormoonile.
Käesoleva leiutise kohased anti-IGF-IR-antikehad võivad olla sisse viidud subjektile manustamiseks sobivatesse farmatseutilistesse kompositsioonidesse. Tüüpiliselt sisaldab see farmatseutiline kompositsioon käesoleva leiutise kohast antikeha ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandjat. Kasutatuna siin, termin "farmatseutiliselt aktsepteeritav kandja" hõlmab ükskõik milliseid ja kõiki lahusteid, dispersioonikeskkondi, katteid, antibakteriaalseid ja antifungaalseid agenseid, isotoonilist ja absorptsiooni edasilükkavaid agenseid ja muud taolist, mis on füsioloogiliselt kokkusobivad. Farmatseutiliselt aktsepteeritavate kandjate hulka kuuluvad üks või enam järgmistest ainetest: vesi, füsioloogiline lahus, fosfaatpuhvriga puhverdatud füsioloogiline lahus, dekstroos, glütserool, etanool ja muu taoline, aga ka nende kombinatsioonid. Paljudel juhtudel on eelistatav lülitada kompositsiooni isotoonilised agensid, näiteks suhkrud, polüalkoholid, näiteks mannitool, sorbitool, või naatriumkloriid. Farmatseutiliselt aktsepteeritavad ained, nagu näiteks niiskusesäiliti või väikesed kogused abiaineid, selliseid nagu niiskust säilitavad või emulgeerivad agensid, konservandid või puhvrid, mis pikendavad antikeha või selle antikeha osa säilivusaega või tõstavad selle efektiivsust.
Käesoleva leiutise kohased kompositsioonid võivad olla erikujulised. Nende hulka kuuluvad näiteks, vedelik, pooltahke ja tahke doosivorm, selline, nagu vedelad lahused (näiteks injekteeritavad ja infusiooniga sisseviidavad lahused), dispersioonid või suspensioonid, tabletid, pillid, pulbrid, liposoomid ja suposiidid. Eelistatud vorm sõltub manustamise ja terapeutilise rakendamise moodusest. Tüüpiliselt on eelistatud kompositsioonid injekteeritavad või infusiooniga sisseviidavad lahused, näiteks kompositsioonid, mis on analoogsed nendega, mida kasutatakse inimese passiivsel immunisatsioonil teiste antikehadega. Eelistatud manustamise mooduseks on parenteraalne (näiteks intravenoosne, subkutaanne, intraperitoneaalne, intramuskulaarne). Eelistatud teostusvariandis manustatakse see antikeha intravenoosse infusiooni või injektsiooniga. Teises eelistatud teostusvariandis manustatakse see antikeha intramuskulaarse või subkutaanse injektsiooniga.
Terapeutilised kompositsioonid peavad tüüpiliselt olema steriilsed ja stabiilsed valmistamise ja säilitamise tingimustes. Leiutisekohane kompositsioon võib olla formuleeritud lahusena, mikroemulsioonina, dispersioonina, liposoomide või teiste korrastatud struktuuridena, mis sobivad kokku kõrgete ravimikontsentratsioonidega. Steriilsed injekteeritavad lahused võivad olla valmistatud lülitades nendesse vajalikus koguses anti-IGF-IR-antikeha, sobivas lahustis ühe või enama koostisosa või ülalloetletud koostisosa kombinatsiooniga, ja kui vaja, steriliseerides seejärel filtreerimisega. Tavaliselt dispersioonid valmistatakse, lülitades aktiivne ühend steriilsesse täidisainesse, mis sisaldab põhilist dispersioonikeskkonda ja teisi vajalikke ülalloetletud koostisosi. Steriilsete pulbrite puhul, mis on ette nähtud steriilsete injekteeritavate lahuste valmistamiseks, eelistatud valmistamise meetoditeks on vaakumkuivatus ja külmkuivatus, mis annavad aktiivse ingrediendi pulbri, mis sisaldab ükskõik millst soovitavat lisakoostisosa, mis sisaldus eelnevalt steriilse filtrimisega saadud lahuses. Õiget lahuse voolavust võib säilitada näiteks kasutades katet, milleks võib olla näiteks letsitiin, säilitades vajalikku osakese suurust dispersiooni puhul ja kasutades surfaktantide kasutamisel. Injekteeritavate kompositsioonide pikendatud absorptsiooni võib põhjustada lülitades sellesse kompositsiooni agensit, mis lükkab edasi absorptsiooni, näiteks monostearaadi soolasid ja þelatiini.
Käesoleva leiutise kohased antikehad võivad olla manustatud erinevate, erialaselt tuntud meetoditega, kuigi paljudel terapeutilistel rakendustel eelistatud manustamise rajaks/mooduseks on intraperitoneaalne, subkutaanne, intramuskulaarne, intravenoosne rada või infusioon. Kogenud spetsialist teab, et manustamise rada ja/või moodus varieerub sõltuvalt sellest, missuguseid tulemusi soovitakse saada. Ühes teostusvariandis võivad käesoleva leiutise kohased antikehad olla manustatud üksikdoosina või võivad olla manustatud mitmeste doosidena.
Teatud teostusvariantides võib ravimpreparaat olla valmistatud nii, et aktiivühendi kandja, millega toimeaine kokku segatakse, kaitseb seda ühendit kiire vabanemise eest, näiteks juhitava vabastamisega ravimlahuses, kaasaarvatud implantaadid, transdermaalsed plaastrid ja mikrokapseldatud kohaletoimetamise süsteemid. Biodegradeeruvate, bioühtivate polümeeridena võivad olla kasutatud näiteks etüüleenvinüülatsetaat, polüanhüdriidid, polüglükoolhape, kollageen, polüortoestrid ja polüpiimhape. Paljud meetodid selliste ravimlahuste valmistamiseks on patenteeritud või selle ala spetsialistile üldtuntud. Vaata näiteks Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Teatud teostusvariantides võib käesoleva leiutise kohane anti-IGF-IR olla manustatud suukaudselt, näiteks inertses lahjendajas või omastatavas, söödavas kandjas. See ühend (ja teised koostisosad kui soovitav) võivad samuti olla sulustatud kõvasse või pehmesse þelatiinikapslisse, kokkupressitud tablettideks või lülitatud otse subjektide dieeti. Terapeutiliseks manustamiseks võivad need ühendid olla lülitatud täidisainetesse ja kasutatud seedimatute tablettide, põsetablettide, pastillide, kapslite, eliksiiride, suspensioonide, siirupite, vahvlite ja muu taolisena. Käesoleva leiutise kohase ühendi manustamiseks teisiti, kui parenteraalselt võib olla vajalik katta see ühend inaktivatsiooni ärahoidva materjaliga, või manustada seda koos niisuguse materjaliga.
Leiutisekohastesse kompositsioonidesse võivad olla sisse lülitatud lisa aktiivsed ühendid. Teatud teostusvariant on käesoleva leiutise kohane anti-IGF-IR formuleeritud koos ja/või manustatud koos ühe või enama lisa terapeutilise agensiga, näiteks kemoterapeutilise agensiga, antineoplastilise agensiga või tuumorivastase agensiga. Näiteks anti-IGF-IR-antikeha võib olla formuleeritud ja/või manustatud koos ühe või enama lisa terapeutilise agensiga. Nende agensite hulka kuuluvad piiranguteta, antikehad, mis seostavad teisi sihtmärke (näiteks antikehad, mis seostavad üht või enamat kasvufaktorit või tsütokiine, nende rakupinna retseptorit või IGF-I-i), IGF-I-i seostavad valgud, antineoplastilised agensid, kemoterapeutilised agensid, tuumorivastased agensid, antisenssoligonukleotiidid IGF-IR või IGF-I vastu, peptiidanaloogid, mis blokeerivad IGF-IR-i aktivatsiooni, lahustuv IGF-IR ja/või ühte või enamat erialaselt tuntud keemilist agensit, mis inhibeerivad IGF-I produktsiooni või aktiivsust, näiteks oktreotiidi. Aktiveerivat antikeha sisaldava farmatseutilise kompositsiooni puhul võib anti-IGF-IR-antikeha olla formuleeritud koos faktoriga, mis suurendab raku proliferatsiooni või hoiab ära apoptoosi. Niisuguste faktorite hulka kuuluvad kasvufaktorid, näiteks IGF-I ja/või IGF-I analoogid, mis aktiveerivad IGF-IR-i. Niisuguste kombinatoorsete teraapiate puhul võib vaja minna madalamaid doose anti-IGF-IR-antikehasid, aga ka sellega koos manustatavaid agenseid, et vältida võimalikke toksilisusi või komplikatsioone, mis on seotud erinevate monoteraapiatega. Ühes teostusvariandis on antikeha kombineeritud ühe või enama lisa terapeutilise agensiga.
Käesoleva leiutise kohased farmatseutilised kompositsioonid võivad sisaldada "terapeutiliselt efektiivset kogust" või "profülaktiliselt efektiivset kogust" käesoleva leiutise kohast antikeha või selle antikeha osa. "Terapeutiliselt efektiivne kogus" käib koguse kohta, mis on efektiivne doosides mis antakse vajalikes ajavahemikes, et saavutada soovitatav terapeutiline tulemus. Terapeutiliselt efektiivne kogus antikeha või selle antikeha osa võib varieeruda vastavalt sellistele faktoritele nagu indiviidi haigusseisund, eluiga, sugu ja kaal ja antikeha või antikeha esile kutsuda soovitavat vastust selles indiviidis. Terapeutiliselt efektiivseks koguseks on ka selline kogus antikeha või selle antikeha osa, mille puhul ükskõik milline antikeha või selle antikeha osa poolt esile kutsutud toksiline või kahjulik efekt, kaalutakse üles selle terapeutiliselt kasulike efektidega. "Profülaktiliselt efektiivne kogus" tähendab kogust, mis on efektiivne doosides ja ajavahemikes, mis on vajalikud soovitava profülaktilise tulemuse saavutamiseks. Tüüpiliselt, et profülaktilisi doose kasutatakse subjektides enne haigust või haiguse varajasel staadiumil, siis profülaktiliselt efektiivne kogud on väiksem, kui terapeutiliselt efektiivne kogus.
Doseerimise reþiimid võivad olla sätitud nii, et kindlustada optimaalne soovitav vastus (näiteks terapeutiline või profülaktiline vastus). Näiteks võib olla manustatud üksik boolus, mitu jagatud doosi teatud ajavahemike järel või see doos võib olla proportsionaalselt vähendatud või suurendatud vastavalt terapeutilise situatsiooni vajadusele. Farmatseutiline kompositsioon, mis sisaldab leiutisekohast antikeha, või mis on ette nähtud kombineeritud teraapiaks ja sisaldab leiutisekohast antikeha ja ühte või enamat lisa terapeutilist agensit, võib olla koostatud kas üksikute või mitmeste doosidena. On eriti otstarbekohane koostada parenteraalseid kompositsioone doosiühiku vormis, et oleks hõlpsam manustada ja et doosid oleksid ühtlustatud. Doosühikuvorm kasutatuna siin, tähendab füüsiliselt diskreetset ühikut, mis on sobivas ühikulistes doosides imetajasubjektidele, mida on kavas ravida; iga ühik, mis sisaldab ettemääratud kogust toimeainet, mis on välja arvutatud, produtseerimaks soovitavat terapeutilist efekti koos nõutava farmatseutilise kandjaga. Käesoleva leiutise kohaste doosühikuvormide spetsifikatsioon on ette määratud ja otseselt sõltuv (a) aktiivühendi unikaalsetest karakteristikutest ja saavutatavast konkreetsest terapeutilisest või profülaktilisest efektist ja (b) piirangutest, mis on sellele alale omased nii aktiivsete ühendite segu valmistamisel, mis on ette nähtud tundlikkuse raviks indiviidides. Eriti kasulik formulatsioon sisaldab 5 mg/ml anti-IGF-IR-antikeha 20 mM naatriuntsitraadi puhvris, pH 5,5, milles on 140 mM NaCl ja 0,2 mg/ml polüsorbaati 80.
Käesoleva leiutise kohase antikeha või selle antikeha osa näidislikuks, terapeutiliselt või profülaktiliselt efektiivse koguse mittelimiteerivaks piiriks on 0,1-100 mg/kg, enam eelistatavalt 0,5-50 mg/kg, enam eelistatavalt 1-20 mg/kg, ja veelgi enam eelistatavalt 1-10 mg/kg. Tuleb märkida, et doosi väärtused võivad varieeruda sõltuvalt leevendatava seisundi tüübist ja tõsidusest. Edasi on eelduseks võetud, et ükskõik milline konkreetne subjekt, spetsiifiline doseerimisreþiimid kohandatakse aja jooksul vastavalt individuaalsetele vajadustele ja neid kompositsioone manustava, või järelvaataja professionaalsele otsusele, ja et doosi piirid, mis on siin toodud on vaid näidislikud ja ei ole ette nähtud piirama taotletud kompositsiooni ulatust või praktikat. Ühes teostusvariandis terapeutiliselt või profülaktiliselt efektiivne kogus antikeha või selle antigeeni seostavat osa manustatakse paralleelselt ühe või enama lisa terapeutilise agensiga.
Teisest aspektist käsitleb käesolev leiutis anti-IGF-IR-antikeha manustamist vähi raviks doosides, mis on väiksemad kui 300 mg kuu kohta.
Teisest aspektist esitleb käesolev leiutis komplekti, mis sisaldab anti-IGF-IR-antikehasid ja neid antikehasid sisaldavad farmatseutilisi kompositsioone. See komplekt võib sisaldada lisaks antikehale või farmatseutilisele kompositsioonile, diagnostilisi või terapeutilisi agenseid. Komplekt võib sisaldada ka õpetust kuidas neid kompositsioone kasutada diagnostilises või terapeutilises meetodis. Eelistatud teostusvariandis lülitab see komplekt endasse leiutisekohast antikeha või selle farmatseutilist kompositsiooni ja diagnostilist agensit, mis võivad olla kasutatud allpool kirjeldatud meetodis. Teises eelistatud teostusvariandis lülitab see komplekt endasse leiutisekohast antikeha või seda sisaldavat farmatseutilist kompositsiooni ja ühte või enamat terapeutilist agensit, näiteks sellist nagu lisa antineoplastiline agens, tuumorivastane agens või kemoterapeutiline agens, mis võib olla kasutatud meetodis, mida on kirjeldatud allpool.
Käesolev leiutis käsitleb samuti farmatseutilisi kompositsioone, mis on ette nähtud ebanormaalse rakukasvu inhibeerimiseks imetajas, mis sisaldab teatud kogust käesoleva leiutise kohast ühendit kombinatsioonis kemoterapeutilise agensiga, kusjuures need kogused ühendit, soola, solvaati või eelravimit ja kemoterapeutilist agensit on üheskoos efektiivsed ebanormaalse rakukasvu inhibeerimisel. Käesoleval ajal on erialaselt teada palju kemoterapeutilisi agenseid. Ühes teostusvariandis need kemoterapeutilised agensid on valitud aineterühmast, mis sisaldab mitoosiinhibiitoreid, alküleerimisagenseid, antimetaboliite, interkaleerivaid antibiootikume, kasvufaktori inhibiitoreid, rakutsükli inhibiitoreid, ensüüme, topoisomeraasi inhibiitoreid, elulemusevastaseid agenseid, bioloogilise vastuse modifitseerijaid, antihormoone, näiteks antiandrogeene ja antiangiogeneesiagenseid.
Angiogeneesivastased agensid, näiteks MMP-2 (maatriksmetalloproteaasi 2) inhibiitorid, MMP-9 (maatriksmetalloproteaasi 9) inhibiitorid ja COX-II (tsüklooksügenaasi II) inhibiitorid, võivad olla kasutatud koos käesoleva leiutise kohase ühendiga. COX-II inhibiitorite näidete hulka kuuluvad CELEBREX (alecoxib), valdecoxib ja rofecoxib. Kasulikke maatrismetalloproteaase on kirjeldatud publikatsioonides WO 96/33172 (publitseeritud 24. oktoobril 1996), WO 96/27583 (publitseeritud 7. märtsil 1996), patenditaotluses EP 97304971.1 (registreeritud 8. juulil 1997), patenditaotluses EP 99308617.2 (registreeritud 29. oktoobril 1999), WO 98/07697 (publitseeritud 26. veebruaril 1998), WO 98/03516 (publitseeritud 29 jaanuaril 1998), WO 98/34918 (publitseeritud 13. augustil 1998), WO 98/34915 (publitseeritud 13. augustil 1998), WO 98/33768 (publitseeritud 6. augustil 1998), WO 98/30566 (publitseeritud 16. juulil 1998), patendipublikatsioonis EP 606046 (publitseeritud 13. juulil 1994), patendipublikatsioonis EP 931788 (publitseeritud 28. juulil 1999), WO 90/05719 (publitseeritud 31. mail 1990), WO 99/52910 (publitseeritud 21. oktoobril 1999), WO 99/52889 (publitseeritud 21. oktoobril 1999), WO 99/29667 (publitseeritud 17. juulil 1999), patenditaotlus PCT/IB98/01113 (registreeritud 21. juulil 1998), patenditaotlus EP 99302232.1 (registreeritud 25. märtsil 1999), patenditaotlus GB 9912961.1 (registreeritud 3. juunil 1999), patendi eeltaotlus US 60/148464 (registreeritud 12. augustil 1999), patent US 5863949 (välja antud 26. jaanuaril 1999), patent US 5861510 (välja antud 19. jaanuaril 1999) ja patendipublikatsioon EP 780386 (publitseeritud 25. juunil 1997), millest kõik on siin täies ulatuses viidetena sisse lülitatud. Eelistatud MMP inhibiitoriteks on need, mis ei kutsu esile artralgiat. Enam eelistatud on need MMP inhibiitorid, mis inhibeerivad selektiivselt maatriksmetalloproteaase MMP-2 ja/või MMP-9- võrreldes teiste maatriksmetalloproteaasidega (s.o MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, ja MMP-13). Mõned käesoleva leiutise kasulike MMP inhibiitorite konkreetseteks näideteks on AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 ja ühendid, mis on registreeritud järgmises nimestikus: 3-[[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüül](l-hüdroksükarbamoüültsüklopentüül)amino]-propioonhape; 3-ekso-3-[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüülamino]-8-oksabitsüklo[3.2.1]oktaan-3-karboksüülhappe hüdroksüamiid; (2R,3R) l-[4-(2-kloro-4-fluorobensüüloksü)benseensulfonüül]-3-hüdroksü-3-metüülpiperidiin-2-karboksüülhappe hüdroksüamiid; 4-[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüülamino]tetrahüdropüraan-4-karboksüülhappe hüdroksüamiid; 3-[[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüül]-(l-hüdroksükarbamoüültsüklobutüül)amino]propioonhape; 4-[4-(4-klorofenoksü)benseensulfonüülamino]tetrahüdropüraan-4-karboksüülhappe hüdroksüamiid; (R) 3-[4-(4-klorofenoksü)benseensulfonüülamino]tetrahüdropüraan-3-karboksüülhappe hüdroksüamiid; (2R,3R) l-[4-(4-fluoro-2-metüülbensüüloksü)-benseensulfonüül]-3-hüdroksü-3-metüülpiperidiin-2-karboksüülhappe hüdroksüamiid; 3-[[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüül](l-hüdroksükarbamoüül-l-metüületüül)amino]-propioonhape; 3-[[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüül]-(4-hüdroksükarbamoüül-tetrahüdropüraan-4-üül)amino]propioonhape; 3-ekso-3-[4-(4-klorofenoksü)benseensulfonüülamino]-8-oksa-itsüklo[3.2.1]oktaan-3-karboksüülhappe hüdroksüamiid; 3-endo-3-[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüülamino]-8-oksa-itsüklo[3.2.1]oktaan-3-karboksüülhappe hüdroksüamiid; ja (R) 3-[4-(4-fluorofenoksü)benseensulfonüülamino]tetrahüdrofuran-3-karboksüülhappe hüdroksüamiide; ja nende ühendite farmatseutiliselt aktsepteeritavad soolad ja solvaadid.
Käesoleva leiutise kohane ühend võib olla kasutatud ka koos signaali transduktsiooni inhibiitoritega, näiteks agensitega, mis võivad inhibeerida EGF-R (epidermaalkasvu faktori retseptori) vastuseid, näiteks sellistega, nagu EGF-R antikehad, EGF antikehad ja molekulid, mis on EGF-R inhibiitorid; VEGF-i (vaskulaarse endoteliaalse kasvu faktor) inhibiitorid, näiteks VEGF retseptorid ja molekulid, mis võivad inhibeerida VEGF-i; ja erbB2 retseptori inhibiitorid, näiteks orgaanilised molekulid või antikehad, mis seostuvad erbB2 retseptoriga, näiteks, HERCEPTIN (Genentech, Inc.). EGF-R-i inhibiitoreid on kirjeldatud sellistes publikatsioonides, nagu näiteks WO 95/19970 (publitseeritud 27. juulil 1995), WO 98/14451 (publitseeritud 9. aprillil 1998), WO 98/02434 (publitseeritud 22. jaanuaril 1998) ja patent US 5747498 (välja antud 5. mail 1998), ja niisugused ained, mida on siin kirjeldatud, võivad olla kasutatud käesolevas leiutises. EGFR-inhibeerivate agensite hulka kuuluvad: monoklonaalsed antikehad C225 ja anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. ja Merck KgaA) ja ühendid ZD-1834, ZD-1838 ja ZD-1839 (AstraZeneca), PKM66 (Novartis), PK1-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomiid (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BffiX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF fusion toksin (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50S64 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Cello) ja EGF-R Vaccine (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)), kuid ei ole nendega piiratud. Need ja teised EGF-R-i inhibeerivad agensid võivad olla kasutatud käesolevas leiutises.
VEGF inhibiitorid, näiteks SU-5416 ja SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering), ja NX-1838 (NeXstar) võivad samuti olla kombineeritud käesoleva leiutise kohase ühendiga. VEGF-i inhibiitoreid on kirjeldatud näiteks sellistes publikatsioonides nagu: WO 99/24440 (publitseeritud 20. mail 1999), PCT/IB99/00797 (registreeritud 3. mail 1999), WO 95/21613 (publitseeritud 17. augustil 1995), WO 99/61422 (publitseeritud 2. detsembril 1999), patent US 5834504 (välja antud 10. novembril 1998), WO 98/50356 (publitseeritud 12. novembril 1998), patent US 5883113 (välja antud 16. märtsil 1999), patent US 5886020 (välja antud 23. märtsil 1999), patent US 5792783 (välja antud 11. augustil 1998), WO 99/10349 (publitseeritud 4. märtsil 1999), WO 97/32856 (publitseeritud 12. septembril 1997), WO 97/22596 (publitseeritud 26. juunil 1997), WO 98/54093 (publitseeritud 3. detsembril 1998), WO 98/02438 (publitseeritud 22. jaanuaril, 1998), WO 99/16755 (publitseeritud 8. aprillil 1999), ja WO 98/02437 (publitseeritud 22. jaanuaril 1998), mis kõik on siin kogu tervenisti viidetena sisse lülitatud. Mõningateks teisteks spetsiifilisteks VEGF inhibiitorite näideteks, mis on kasulikud käesolevas leiutises, on IM862 (Cytran Inc.); anti-VEGF monoklonaalne antikeha firmast Genentech, Inc.; ja angiosüüm, sünteetiline ribosüüm firmast Ribozyme ja Chiron. Need ja teised VEGF-i inhibiitorid võivad olla kasutatud käesolevas leiutises nii, nagu siin kirjeldatud.
Käesoleva leiutise kohane ühend võib edasi olla kombineeritud ErbB2 retseptori inhibiitoriitega, näites sellistega nagu GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) ja monoklonaalsete antikehadega AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) ja 2B-1 (Chiron), näiteks sellistega, nagu need, mida on kirjeldatud publikatsioonides WO 98/02434 (publitseeritud 22. jaanuaril 1998), WO 99/35146 (publitseeritud 15. juulil 1999), WO 99/35132 (publitseeritud 15. juulil 1999), WO 98/02437 (publitseeritud 22. jaanuaril 1998), WO 97/13760 (publitseeritud 17. aprillil 1997), WO 95/19970 (publitseeritud 27. juulil 1995), patent US 5587458 (välja antud 24. detsembril 1996) ja patent US 5877305 (välja antud 2. märtsil 1999), mis on kõik siin tervenisti viidetena sisse lülitatud. ErbB2 retseptor inhibiitoreid, mis on kasulikud käesolevas leiutises, on kirjeldatud ka patenditaotluses US 60/117341, registreeritud 27. jaanuaril 1999 ja patenditaotluses US 60/117346, registreeritud 27. jaanuaril 1999, millest kumbki on siin tervenisti viitena sisse lülitatud. Neid erbB2 retseptori inhibiitorühendeid ja aineid, mida on kirjeldatud eelpoolmainitud PCT taotlustes, USA patentides ja USA esialgsetes patenditaotlustes, aga ka teisi ühendeid ja aineid, mis inhibeerivad erbB2 retseptorit, võivad olla kasutatud koos käesoleva leiutise kohaste ühenditega vastavalt käesolevale leiutisele.
Ellujäämisevastaste agensite hulka kuuluvad anti-IGF-IR-antikehad ja anti-integriin agensid, sellised nagu integriinivastased antikehad.
Kasutatavad diagnostikameetodid
Anti-IGF-IR-antikehad võivad olla kasutatud, detekteerimaks IGF-IR-i bioloogilises proovis in vitro või in vivo. Need anti-IGF-IR-antikehad võivad olla kasutatud traditsioonilises immunotestis, kaasaarvatud, ilma piiranguteta, ELISA-testis, RIA-testis, FACS-testis, koe immunohistokeemias, immunoblottanalüüsis või immunopretsipitatsioonis. Käesoleva leiutise kohased anti-IGF-IR-antikehad võivad olla kasutatud, detekteerimaks IGF-IR-i inimesest. Teises teostusvariandis, need anti-IGF-IR-antikehad võivad olla kasutatud, detekteerimaks IGF-IR-i Vana Maailma primaatidest, näiteks sellistest, nagu künomolgus ja reesusahvid, ðimpansid ja inimahvid. Käesolev leiutis esitleb meetodit anti-IGF-IR-i detekteerimiseks bioloogilises proovis, mis sisaldab bioloogilise proovi kontakteerumist käesoleva leiutise kohase anti-IGF-IR-antikehaga ja anti-IGF-IR-ga seostunud antikeha detekteerimist, et detekteerida IGF-IR-i bioloogilises proovis. Ühes teostusvariandis märgistatakse see anti-IGF-IR-antikeha otseselt detekteeritava märgisega. Teises teostusvariandis, see anti-IGF-IR-antikeha (esimene antikeha) on märgistamata ja teine antikeha või teised molekulid, mis võivad seostada neid anti-IGF-IR-antikehi, on märgistatud. Nagu kogenud spetsialist teab, teine antikeha valitakse nii, et see oleks võimeline spetsiifiliselt seostuma esimese antikehaga, mis kuulub konkreetsesse liiki ja klassi. Näiteks kui see anti-IGF-IR-antikeha on inimese IgG, siis see sekundaarne võib olla inimese-IgG vastane antikeha. Teisteks molekulideks, mis võivad seostuda antikehadega, on piiranguteta, valk A ja valk G, millest kumbki on kaubanduslikult saadav näiteks firmast Pierce Chemical Co.
Sobivad märgised antikehale või sekundaarsele antikehale on avalikustatud eelpool ja nende hulka kuuluvad erinevad ensüümid, prosteetilised rühmad, fluorestsentsed materjalid, luminestsentsed materjalid, magnetilised agensid ja radioaktiivsed materjalid. Sobivate ensüümide näidete hulka kuuluvad mädarõika peroksidaas, aluseline fosfataas, P-galaktosidaas, või atsetüülkoliinesteraas; prosteetiliste rühmakomplekside näidete hulka kuuluvad streptavidiin/biotiin ja avidiin/biotiin; fluorestsentsete materjalide näidete hulka kuuluvad umbelliferoon, fluorestseiin, fluorestseiinisotiotsüanaat, rodamiin, diklorotriasinüülamiinfluorestseiin, dansüülkloriid või fukoerütriin; luminestsentsete materjalide hulka kuulub luminool; magneetiliste agensite näidete hulka kuulub gadoliinium; ja sobivate radioaktiivsete materjalide näidete hulka kuuluvad 125I, 131I, 35S või 3H.
Alternatiivses teostusvariandis võib IGF-IR olla testitud bioloogilises proovis, kasutades konkureerivat immunotesti, kasutades IGF-IR-i standardeid, mis on märgistatud detekteeritava ainega ja märgistamata anti-IGF-IR-antikehaga. Selles testis bioloogiline proov, märgistatud IGF-IR standardid ja anti-IGF-IR-antikeha kombineeritakse ja määratakse märgistatud IGF-IR standardi kogus, mis seostub märgistamata antikehaga. IGF-IR-i kogus bioloogilises proovis on pöördvõrdeline märgistatud IGF-IR standardi kogusega, mis on seostunud anti-IGF-IR-antikehaga.
Paljudel eesmärkidel võib kasutada immunotesti, mis on avalikustatud eelpool. Ühes teostusvariandis võivad leiutisekohased anti-IGF-IR-antikehad olla kasutatud IGF-IR-i detekteerimiseks rakkudes rakukultuuris. Eelistatud teostusvariandis võivad need anti-IGF-IR-antikehad olla kasutatud selleks, et määrata türosiini fosforüleerimistaset, IGF-IR-i türosiini autofosforüleerimistaset ja/või IGF-IR hulka raku pinnal pärast rakkude töötlemist erinevate ühenditega. See meetod võib olla kasutatud, testimaks ühendeid, mis võivad olla kasutatud IGF-TR aktiveerimiseks või inhibeerimiseks. Selles meetodis üks proov rakke töödeldakse testühendiga teatud aja jookaul, samal ajal kui teine proov jäetakse töötlemata. Kui türosiini autofosforüleerimine on mõõdetud, siis need rakud lüüsitakse ja mõõdetakse IGF-IR-i türosiini fosforüleerimist, kasutades immunotesti, mida on kirjeldatud eelpool, või nii nagu kirjeldatud näites III, milles on kasutatud ELISA-testi. IGF-IR-i üldtaseme mõõtmiseks rakud lüüsitakse ja mõõdetakse IGF-IR-i üldtaset, kasutades ühte ülalkirjeldatud immunotestidest.
Eelistatud immunotest IGF-IR-i türosiini fosforüleerimise määramiseks või IGF-IR-i tasemete määramiseks on ELISA või immunoblottanalüüs. Kui mõõdetakse ainult rakupinna IGF-IR taset, siis neid rakke ei lüüsita ja rakupinna IGF-IR tasemeid mõõdetakse, kasutades ühte ülalkirjeldatud immunotesti. Eelistatud immunotest rakupinna IGF-IR määramisel sisaldab järgmiseid etappe: rakupinna valkude märgistamine detekteeritava märgisega, näiteks sellisega, nagu biotiin või 125I; IGF-IR-i immunopretsipitatsioon anti-IGF-IR-antikehaga; ja seejärel märgistatud IGF-IR detekteerimine. Teiseks eelistatud immunotestiks, mida kasutatakse IGF-IR-i lokalisatsiooni ja selle tasemete määramisel on immunohistokeemia. Sellised meetodid, nagu nagu ELISA, RIA, immunoblottanalüüs, immunohistokeemia, rakupinna koguvalgu märgistamine ja immunopretsipitatsioon on erialaselt hästi tuntud. Vaata näiteks Harlow ja Lane, supra. Lisaks sellele see immunotest võib olla kohandatud suurema väljundi saamiseks, et testida suurt hulka ühendeid, kas IGF-IR aktivatsiooniks või inhibeerimiseks.
Käesoleva leiutise kohased anti-IGF-IR-antikehad võivad samuti olla kasutatud IGF-IR tasemete määramiseks koes või rakkudes, mis on tuletatud koest. Eelistatud teostusvariandis, selleks koeks on haige kude. Enam eelistatud teostusvariandis selleks koeks on tuumor või selle biopsia. Selle meetodi eelistatud teostusvariandis patsiendist võetakse kude või selle biopsia. Seejärel seda kudet või biopsiat kasutatakse immunotestis, et määrata, näiteks IGF-IR-i tasemeid, IGF-IR-i tasemeid rakupinnal, IGF-IR- türosiini fosforüleerimise tasemeid või määrata IGF-IR-i lokalisatsiooni meetoditega, mida on vaadeldud eelpool. See meetod võib olla kasutatud selleks, et määrata, kas tuumori IGF-IR-i ekspressioonitase on kõrge.
Ülalkirjeldatud diagnostikameetodid võivad olla kasutatud selleks, et määrata, kas tuumor ekspresseerib kõrgeid tasemeid IGF-IR-i, mis võib osutada sellele, et see tuumor reageerib hästi töötlemisele anti-IGF-IR-antikehaga. See diagnostiline meetod võib samuti olla kasutatud selleks, et määrata, kas tuumor on potentsiaalselt kantserogeenne, kui see ekspresseerib kõrgeid tasemeid IGF-IR-i, või on see healoomuline, kui ta ekspresseerib madalaid tasemeid IGF-JR-i. Edasi, seda diagnostilist meetodit võib samuti kasutada, et määrata, kas töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga (vaata allpool) põhjustab tuumori poolt ekspresseeritava IGF-IR taseme languse ja/või türosiini autofosforüleerimise ekspressiooni taseme languse, ja võivad seega olla kasutatud selleks, et määrata, kas see ravi on edukas. Üldiselt see meetod, mis võimaldab määrata, kas anti-IGF-IR-antikeha vähendab türosiini fosforüleerimist, sisaldab etappe huvipakkuva raku või koe türosiini fosforüleerimistaseme mõõtmist, selle raku inkubeerimist anti-IGF-IR-antikeha või selle antigeeni seostava osaga, mõõtes seejärel türosiini fosforüleerimise taset rakus või koes. Võib olla mõõdetud IGF-IR-i türosiini või teis(t)e valkude fosforüleerimise tase. Seda diagnostikameetodit võib kasutatud ka selleks, et määrata, kas kude või rakk ekspresseerib piisavalt kõrgeid IGF-IR tasemeid või piisavalt kõrgeid aktiveeritud IGF-IR tasemeid, mis võivad olla isenditel, kellel on kasvuhäired (kääbuslikkus), osteoporoos või diabeet. Diagnoos, mis näitab, et IGF-IR-i või aktiivse IGF-IR-i tasemed on liiga madalad, võib olla kasutatud ravi määramiseks aktiveerivate anti-IGF-IR-antikehadega, IGF-I-ga või teiste terapeutiliste agensitega, et tõsta IGF-IR-i tasemeid või aktiivsust.
Käesoleva leiutise kohased antikehad võivad olla kasutatud ka in vivo, et lokaliseerida kudesid ja organeid, mis ekspresseerivad IGF-IR-i. Eelistatud teostusvariandis need anti-IGF-IR-antikehad võivad olla kasutatud selleks, et lokaliseerida IGF-IR-i ekspresseerivaid tuumoreid. Käesoleva leiutise kohaste anti-IGF-IR-antikehade eeliseks on see, et nad ei genereeri immuunset reaktsiooni nende manustamisel. See meetod sisaldab järgmiseid etappe: anti-IGF-IR-antikeha või seda sisaldava farmatseutilise kompositsiooni manustamine patsiendile, selle diagnostiline test vajadusel; ja IGF-IR-ekspressiooni lokalisatsiooni määr kudedes, kasutades nende kohtade kujutise analüüsi. Kujutise analüüs on meditsiini alal hästi tuntud ja sisaldab, piiranguteta, röntgenanalüüsi, magnetresonants kujutise saamist (MRI - magnetic resonance imaging) või arvutitomograafia (CE - computed tomography). Selle meetodi teises teostusvariandis patsiendist võetakse biopsia, et määrata, kas huvipakkuv kude ekspresseerib IGF-IR, tegemata seda kujutise analüüsiga. Eelistatud teostusvariandis võivad anti-IGF-IR-antikehad olla detekteeritavad agensiga, mis võib olla visualiseeritud patsiendis. Näiteks see antikeha võib olla märgistatud kontrasteeriva agensiga, näiteks sellisega, nagu baarium, mis võib olla kasutatud röntgenanalüüsis, või magnetkontrastse agensiga, nagu näiteks gadoliiniumkelaat, mis kõik võivad olla kasutatud MRI- või CE-meetodis. Teiste märgistavate agensite hulka kuuluvad piiranguteta radioisotoobid, näiteks 99Tc. Teises teostusvariandis võib anti-IGF-IR-antikeha olla märgistamata, seejuures manustatakse aga teine antikeha või teine molekul, mis on detekteeritav ja mis võib seostuda anti-IGF-IR-antikehaga.
Terapeutiline kasutusmeetod
Teises teostusvariandis esitleb käesolev leiutis meetodit IGF-IR-aktiivsuse inhibeerimiseks, manustades patsiendile selle vajadusel anti-IGF-IR-antikeha. Ükskõik milline siin kirjeldatud antikeha tüüpidest võib olla kasutatud terapeutiliselt. Eelistatud teostusvariandis on see anti-IGF-IR-antikeha inimese-, kimäärne- või humaniseeritud antikeha. Teises eelistatud teostusvariandis on see inimese IGF-IR ja patsiendiks on inimene. Alternatiivselt võib selleks patsiendiks olla imetaja, mis ekspresseerib IGF-IR-i, nii, et anti-IGF-IR-antikeha annab sellega ristreaktsiooni. See antikeha võib olla manustatud patsiendile, kelleks on imetaja, kuid mitte inimene, kes ekspresseerib IGF-IR-i, millega see antikeha annab ristreaktsiooni (s.o primaat, kas künomolgus või reesusahv) veterinaarsetel eesmärkidel või inimese haiguse loomsel mudelil. Niisugused loomsed mudelid võivad olla kasulikud käesoleva leiutise kohaste antikehade terapeutilisel hindamisel.
On ette nähtud, et mõiste "tervisehäire, milles IGF-IR aktiivsus on kahjulik", kasutatuna siin, hõlmab haiguseid ja teisi tervisehäireid, mille puhul on näidatud, et IGF-IR kõrged tasemed tervisehäire all kannatavas subjektis on vastutavad või on kahtlustatavad selle haiguse patofüsioloogia eest, või on faktoriks, mis annavad oma osa haigusseisundi halvenemisse. Järelikult tervisehäire, milles kõrged IGF-IR-aktiivsuse tasemed on kahjulikud, on haiguseks, mille puhul IGF-IR aktiivsuse inhibeerimine leevendab oodatavalt selle haiguse sümptomeid ja/või arengut. Niisugusest haigusest võib anda tunnistust näiteks IGF-IR tasemete kasv raku pinnal või selle suurendatud türosiini autofosforüleerimine kahjustatud rakkudes või kudedes, selle tervisehäire all kannataval subjektil. IGF-IR tasemete kasv võib olla detekteeritud näiteks, kasutades anti-IGF-IR-antikeha nagu eelpool kirjeldatud.
Eelistatud teostusvariandis võib anti-IGF-IR-antikeha olla manustatud patsiendile, kellel on IGF-IR-i ekspresseeriv tuumor. Selleks tuumoriks võib olla tahke tuumor või võib mittetahke tuumor, näiteks selline nagu lümfoom. Enam eelistatud teostusvariandis võib anti-IGF-IR-antikeha olla manustatud patsiendile, kellel on IGF-IR-i ekspresseeriv vähkjas tuumor. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis on see anti-IGF-IR-antikeha manustatud patsiendile, kellel on kopsu, rinna, eesnäärme või jämesoole tuumor. Ülimalt eelistatud teostusvariandis see meetod põhjustab selle tuumori kaalulise või mahulise kasvu peatamise. Teises teostusvariandis põhjustab see meetod IGF-IR internaliseerumise tuumoril. Eelistatud teostusvariandis on see antikeha valitud antikehadest: 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, või 6.1.1, või sisaldab selle rasket ahelat, kerget ahelat või antigeeni seostavat piirkonda.
Teises eelistatud teostusvariandis võib anti-IGF-IR-antikeha olla manustatud patsiendile, kes ekspresseerib sobimatut kõrgeid tasemeid IGF-I. Erialaselt on teada, et kõrge tasemega IGF-I ekspressioon võib viia mitmete tavaliste vähivormide tekkele. Enam eelistatud teostusvariandis on need anti-IGF-IR-antikehad manustatud patsiendile, kellel on eesnäärme vähk, glioom või fibrosarkoom. Veelgi enam eelistatud teostusvariandis see meetod põhjustab vähkkasvaja rakkude ebanormaalse proliferatsiooni peatamise või mittesuurenemise kaalus ja mahus või selle vähenemise kaalus ja mahus.
Ühes teostusvariandis käsitleb nimetatud meetod sellise vähi, nagu aju-, skvamagoosse raku, põie-, mao-, pankrease-, rinna-, pea-, selja-, söögitoru-, eesnäärme-, jäme-ja pärasoole-, kopsu-, neeru-, munasarja-, günekoloogilise või kilpnäärmevähi ravi. Patsientide hulka, kes võivad olla ravitud käesoleva leiutise kohaste ühenditega vastavalt leiutisekohastele meetoditele, kuuluvad näiteks patsiendid, kellel on diagnoositud kopsuvähk, luuvähk, pankreasevähk, nahavähk, pea ja selja vähk, naha- või silmasisene melanoom, emakavähk, munasarjavähk, pärasoolevähk, anaalpiirkonnavähk, maovähk, pärasoolevähk, rinnavähk, günekoloogilised tuumorid (näiteks emaka sarkoom, munajuhade kartsinoom, endomeetriumi kartsinoom, emakakaela kartsinoom, tupe kartsinoom või vulva kartsinoom), Hodgkin'si tõbi, söögitoru vähk, peensoolevähk, endokriinse süsteemi vähk (näiteks kilpnäärme-, paratüreoidnäärme- või neerupealiste vähk), pehmete kudede sarkoom, emakavähk, peenisevähk, eesnäärme vähk, krooniline või akuutne leukeemia, lapsepõlve tahked tuumorid, lümfotsüütsed lümfoomid, kusepõie vähk, neeru- või kusejuha vähk (näiteks neeruraku kartsinoom, neeruvaagna kartsinoom) või kesknärvisüsteemi neoplasmid (näiteks primaarne CNS (central nervous system) lümfoom, selgroo tuumorid; ajutüve glioomid või ajuripatsi adenoomid).
See antikeha võib olla manustatud ühekordselt, kuid enam eelistatavalt mitmes jaos. See antikeha võib olla manustatud kolmest korrast päevas kuni ühe korrani kuue kuu jooksul. See manustamise ajakava võib olla näiteks selline: kolm korda päevas, kaks korda päevas, üks kord päevas, üks kord iga kahe päeva tagant, üks kord iga kolme päeva tagant, üks kord nädalas, üks kord iga kahe nädala tagant, üks kord kuus, üks kord kahe kuu tagant, üks kord kolme kuu tagant, üks kord iga kuue kuu tagant. See antikeha võib olla manustatud suukaudselt, limaskestakaudselt, bukkaalselt, intranasaalselt, sissehingamise teel, intravenoosselt, subkutaanselt, intramuskulaarselt, parenteraalselt, intratumoraalselt või kohalikult. See antikeha võib olla manustatud kohas, mis on kaugel tuumori asupaigast. See antikeha võib samuti olla manustatud pidevalt, kasutades minipumpa. See antikeha võib olla manustatud ühekordselt, vähemalt kahekordselt, vähemalt selle perioodi vältel, kuni seda seisundit ravitud, leevendatud või haiguse ravi jooksul. Seda antikeha manustatakse üldjuhul seni, kuni tuumor on olemas, eeldusel, et see antikeha põhjustab tuumori või vähkkasvaja kasvu peatamise või selle vähenemise kaalus ja mahus. Seda antikeha manustatakse tavaliselt osana farmatseutilisest kompositsioonist, nagu on kirjeldatud eelpool. Selle antikeha doosi suurus kõigub üldjuhul vahemikus 0,1-100 mg/kg, enameelistatavalt 0,5-50 mg/kg, enameelistatavalt 1-20 mg/kg ja veelgi eelistatavamalt 1-10 mg/kg. Selle antikeha kontsentratsioon seerumis võib olla mõõdetud ükskõik millise erialaselt tuntud meetodiga. Vaata näiteks näide XVII allpool. See antikeha võib olla manustatud ka profülaktiliselt, selleks, et ära hoida vähi või tuumori teket. See võib olla eriti kasulik patsientide puhul, kellel on "kõrge normaalne" IGF-I tase, sest nendel patsientidel on tavaliste vähkkasvajate arengu risk kõrgendatud, vaata Rosen et al., eelpool.
Teisest aspektist, see anti-IGF-IR-antikeha võib olla manustatud koos teiste terapeut il iste agensitega, näiteks sellistega, nagu antineoplastilised ravimid või molekulid, patsiendile, kellel on hüperproliferatiivne tervisehäire, selline nagu vähk või tuumor. Ühest aspektist käsitleb käesolev leiutis meetodit hüperproliferatiivse tervisehäire raviks imetajas, mis sisaldab nimetatud loomale terapeutiliselt efetiivse koguse käesoleva leiutise kohase ühendi manustamist kombinatsioonis tuumorivastase agensiga, mis on valitud ainete rühmast, kuhu kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, mitootilised inhibiitorid, alküleerivad agensid, antimetaboliidid, interkalatsiooniagensid, kasvufaktori inhibiitorid, raku tsükli inhibiitorid. ensüümid, topoisomeraasi inhibiitorid, bioloogilise vastuse modifitseerijad, antihormoonid, kinaasiinhibiitorid, maatriksmetalloproteaasi inhibiitorid, geneetilised ravimid ja antiandrogeenid. Enam eelistatud teostusvariandis võib see antikeha olla manustatud koos antineoplastilise agensiga, näiteks adriamütsiin või taksool. Teises eelistatud teostusvariandis see antikeha või kombinatoorne teraapia manustatakse paralleelselt radioteraapia, kemoteraapia, fotodünaamilise teraapia, kirurgia või teiste immunoteraapiatega. Veel ühes eelistatud teostusvariandis manustatakse seda antikeha koos teise antikehaga. Näiteks anti-IGF-IR-antikeha võib olla manustatud koos teise antikeha või teise agensiga, mille kohta on teada, et see inhibeerib tuumori- või vähiraku proliferatsiooni, näiteks antikeha või agens, mis inhibeerib erbB2 retseptorit, EGF-R, CD20 või VEGF-i.
Leiutisekohase antikeha manustamine koos lisa terapeutilise agensiga (kombinatoorne teraapia) hõlmab: farmatseutilise kompositsiooni, mis sisaldab anti-IGF-IR-antikeha, ja lisa terapeutilise agensi manustamist; ja kahe või enama eraldi farmatseutilise kompositsiooni, millest üks sisaldab anti-IGF-IR-antikeha ja teine(sed) sisaldab(vad) lisa terapeutilist agensi(te) manustamist. Edasi, kuigi koosmanustamine või kombinatoorne teraapia üldjuhul tähendab, et leiutisekohane antikeha ja lisa terapeutilised agensid manustatakse üheaegselt teineteisega, hõlmab see ka juhuseid, mille puhul leiutisekohane antikeha ja lisa terapeutilised agensid manustatakse eri aegadel. Näiteks leiutisekohane antikeha võib olla manustatud üks kord iga kolme päeva sees, samal ajal, kui lisa terapeutiline agens manustatakse üks kord päevas. Alternatiivselt leiutisekohane antikeha võib olla manustatud enne või pärast haiguse ravi iga terapeutilise agensiga. Analoogselt võib anti-IGF-IR-antikeha manustada enne või pärast teist ravi, näiteks sellist, nagu radioteraapia, kemoteraapia, fotodünaamiline teraapia, kirurgia või teine immunoteraapia.
Leiutisekohane antikeha ja üks või enam lisa terapeutilist agensit (kombinatoorne teraapia) võivad olla manustatud ühekorraga, kaks korda või aja jooksul, kuni see haigusseisund on ravitud, leevendatud või kuni kestab ravikuur. Eelistatavalt seda kombinatoorset teraapiat manustatakse mitu korda. See kombinatoorne teraapia võib olla manustatud alates kolmest korrast päevas kuni ühe korrani iga kuue kuu sees. Selle kombinatoorse teraapia manustamise graafik võib olla näiteks selline: kolm korda päevas, kaks korda päevas, üks kord päevas, üks kord iga kahe päeva jooksul, üks kord iga kolme päeva jooksul, üks kord nädalas, üks kord iga kahe nädala sees, üks kord igas kuus, üks kord igas kahe kuu jooksul, üks kord iga kolme kuu jooksul ja üks kord iga kuue kuu jooksul, või võib olla manustatud pidevalt minipumbaga. Kombinatsiooniline teraapia võib olla manustatud suukaudselt, limaskestakaudselt, bukaalselt, intranasaalselt, sissehingamisega, intravenoosselt, subkutaanselt, intramuskulaarselt, parenteraalselt, intratumoraalselt või kohalikult. See kombinatoorne teraapia võib olla manustatud eemal tuumori asukohast. Seda kombinatsioonilist teraapiat manustatakse tavaliselt nii kaua, kui tuumor on olemas, eeldusel, et see antikeha põhjustab selle tuumori või vähkkasvaja kasvu peatamist või selle vähenemist kaalus või mahus.
Veel ühes järgmises teostusvariandis on leiutisekohane anti-IGF-IR-antikeha märgistatud radiomärgise, immunotoksiini või toksiiniga, või on fusioonvalk, mis sisaldab toksilist peptiidi. Leiutisekohane anti- IGF-IR-antikeha või anti-IGF-IR-antikeha fusioonvalk suunab seda radiomärgist, immunotoksiini, toksiini või toksilist peptiidi IGF-IR-I ekspresseeriva tuumori või vähiraku juurde. Eelistatud teostusvariandis see radiomärgis, immunotoksiin, toksiin või toksiline peptiid internaliseerub pärast seda, kui leiutisekohane anti-IGF-IR-antikeha seostub IGF-IR-ga tuumori või vähiraku pinnal.
Teisest aspektist, leiutisekohast anti-IGF-IR-antikeha võib kasutada terapeutiliselt, et indutseerida konkreetsete rakkudes apoptoosi patsiendis selle vajadusel. Paljudel juhtudel need sihtmärkrakud, millel kutsutakse esile apoptoos, on vähi- või tuumorirakud. Seega eelistatud teostusvariandis esitleb käesolev leiutis meetodit, mis indutseerib apoptoosi terapeutiliselt efektiivse koguse anti- IGF-IR-antikeha manustamisel patsiendile, selle vajadusel. Eelistatud teostusvariandis see antikeha on valitud antikehadest 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.11, 4.9.2 või 6.11 või sisaldab selle rasket ahelat, kerget ahelat või antigeeni seostavat piirkonda.
Teisest aspektist see anti- IGF-IR antikeha võib olla kasutatud selleks, et ravida mittevähkseisundeid, milles kõrged tasemed IGF-I ja/või IGF-IR on assotsieeritud mittevähkseisundite või -haigusega. Ühes teostusvariandis sisaldab see meetod järgmiseid etappe: anti-IGF-IR-antikeha manustamist patsiendile, kellel on mittevähkjas patoloogiline seisund, mis on esile kutsutud või halvenenud kõrgete IGF-I ja/või IGF-IR tasemete või aktiivsusega. Eelistatud teostusvariandis selleks mittevähkjaks patoloogiliseks seisundiks on akromegaalia, gigantism, psoriaas, ateroskleroos, silelihase veresoonte restenoos või mittekohane mikrovaskulaarne proliferatsioon, näiteks diabeedist tingitud komplikatsioonid, eriti need, mis on seotud silmadega. Enam eelistatud teostusvariandis, leiutisekohane anti-IGF-IR-antikeha aeglustab mittevähkjate patoloogiliste seisundite arengut. Enam eelistatud teostusvariandis leiutisekohane anti-IGF-IR-antikeha peatab või pöörab tagasi, vähemalt osaliselt, mittemittevähkja patoloogilise seisundi.
Teisest aspektist esitleb käesolev leiutis meetodit aktiveeriva anti-IGF-IR-antikeha manustamiseks patsiendile selle vajadusel. Ühes teostusvariandis leiutisekohane aktiveeriv antikeha või farmatseutiline kompositsioon manustatakse patsiendile selle vajadusel koguses, mis on efektiivne selleks, et suurendada IGF-IR aktiivsust. Enam eelistatud teostusvariandis see aktiveeriv antikeha on võimeline taastama normaalse IGF-IR aktiivsuse. Teises eelistatud teostusvariandis see aktiveeriv antikeha võib olla manustatud patsiendile, kellel on väike kasv, neuropaatia, vähendatud lihasmass või osteoporoos. Teises eelistatud teostusviisis leiutisekohane aktiveeriv antikeha võib olla manustatud koos ühe või enama teise faktoriga, mis suurendab rakuproliferatsiooni, hoiab ära apoptoosi või suurendab IGF-IR aktiivsust. Niisuguste faktorite hulka kuuluvad kasvufaktorid, näiteks sellised, nagu IGF-I ja/või analoogsed IGF-I-ga, mis aktiveerivad IGF-IR-i. Eelistatud teostusvariandis on see antikeha valitud antikehadest 4.17.3 või sisaldab rasket ahelat, kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa.
Geeniteraapia
Käesoleva leiutise kohased nukleiinhappemolekulid võivad olla manustatud patsiendile kui vaja, geeniteraapia abil. See võib olla kas in vivo või ex vivo teraapia. Eelistatud teostusvariandis manustatakse patsiendile nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad nii rasket kui ka kerget ahelat. Enam eelistatud teostusvariandis need nukleiinhappemolekulid manustatakse nii, et nad on stabiilselt integreeritud B-raku kromosoomi, sest need rakud on spetsialiseeritud antikehade produktsioonile. Eelistatud teostusvariandis, selle vajadusel, B-rakkude eelkäijad transfekteeritakse või nakatatakse ex vivo ja retransplanteeritakse patsiendisse. Teises teostusvariandis B-rakkude eelkäijad või teised rakud nakatatakse in vivo, kasutades viirust, mille kohta on teada, et see nakatab huvipakkuvat rakku. Tüüpiliste vektorite hulka, mida kasutatakse geeniteraapias, kuuluvad liposoomid, plasmiidid või viiruslikud vektorid, näiteks sellised, nagu retroviirused, adenovirused ja adenoassotsieeritud viirused. Pärast nakatamist kas in vivo või ex vivo, võib antikeha ekspressiooni tasemeid jälgida, võttes proove töödeldud patsientidest ja kasutades selleks ükskõik millist erialaselt tuntud ja siin arutletud immunotesti.
Eelistatud teostusvariandis see geeni teraapiameetod sisaldab etappidena: efektiivse koguse inimese antikeha rasket ahelat või selle antigeeni seostavat osa kodeeriva isoleeritud nukleiinhappemolekuli manustamist ja selle nukleiinhappemolekuli ekspresseerimist. Teises teostusvariandis sisaldab see geeniteraapia meetod etappidena: efektiivse koguse inimese antikeha kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa kodeeriva isoleeritud nukleiinhappemolekuli manustamist ja selle nukleiinhappemolekuli ekspresseerimist. Enam eelistatud meetodis see geeniteraapiameetod sisaldab etappidena: efektiivse koguse inimese antikeha kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa kodeeriva isoleeritud nukleiinhappemolekuli manustamist ja efektiivse koguse inimese antikeha kerget ahelat või selle antigeeni seostavat osa kodeeriva isoleeritud nukleiinhappemolekuli manustamist ja selle nukleiinhappemolekuli ekspresseerimist. Leiutisekohane geeniteraapia meetod võib samuti sisaldada teise vähivastase agensi, näiteks sellise nagu taksool, tamoksifeen, 5-FU, adriamütsiin või CP-358,774, manustamist.
Selleks, et käesolev leiutis oleks paremini mõistetav, on toodud järgmised näited. Nende näidete eesmärgiks on ainult illustreerida käesolevat leiutist ja nad ei ole mingil juhul tõlgendatavad kui käesolevat leiutist piiravad.
NÄIDE 1: Anti-IGF-IR-antikeha produtseerivate hübridoomide genereerimine
Käesoleva leiutise kohased antikehad valmistati, valiti ja testiti järgmisel viisil:
Immunisatsioon ja hübridoomi genereerimine
Kaheksa kuni kümne nädala vanused hiired XENOMICE immuniseeriti intraperitoneaalselt või nende tagakäpapadjakestesse kas inimese IGF-IR (10 mikrog/doos/hiir), ekstratsellulaarse domeeniga või 3T3-IGF-IR-ga või 300.19-IGF-ER rakkudega, mis on kaks transfekteeritud rakuliini, mis ekspresseerivad inimese IGF-IR-i oma plasma membraanidel (10x106 rakku/doos/hiir). Seda doosi korrati viis kuni seitse korda kolme kuni kaheksa nädala jooksul. Neli päeva enne fusiooni hiired said lõppinjektsiooni inimese IGF-IR ekstratsellulaarset domeeni PBS-s. Põrna ja lümfisõlmede lümfotsüüdid immuniseeritud hiirtest fuseeriti mittesekretoorse müeloomi P3-X63-Ag8.653 rakuliiniga ja neid selekteeriti HAT selektsiooni abil, nagu eelpool kirjeldatud (Galfre ja Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Eraldati paneel hübridoome, mis kõik eritavad IGF-IR-i suhtes spetsiifilisi inimese IgG2kapa antikehasid. Edasisteks uuringuteks valiti seitse hübridoomi, mis produtseerivad spetsiifilisi IGF-IR suhtes monoklonaalseid antikehasid ja tähistati nad kui 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ja 6.1.1.
Hübridoomid 2.12,1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 ja 4.17.3 hoiustati Ameerika Tüüpkultuuri Kollektsioonis (ATCC, American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 12. detsembril 2000 järgmiste hoiusenumbritega:
NÄIDE II: Tervenisti inimese anti-IGF-IR-monoklonaalse antikeha afiinsuskonstantide määramine (Kd) BIAcore abil
Me teostasime puhastatud antikehade afiinsuse mõõtmisi pinnaplasmonresonantsiga, kasutades BIAcore 3000 seadet vastavalt valmistaja protokollidele.
Protokoll 1
Kineetiliste analüüside läbiviimiseks valk-A immobiliseeriti BIAcore andurkiibi pinnale. Seda andurkiipi kasutati seejärel käesoleva leiutise kohaste anti-IGF-IR-antikehade püüdmiseks. Andurkiibile injekteeriti erinevad kontsentratsioonid IGF-IR-i ekstratsellulaarset domeeni ja seostumise ja analüüsiti dissotsiatsiooni kineetikat interaktsioonis anti-IGF-IR-antikehade ja IGF-IR ekstratsellulaarse domeeni vahel. Neid andmeid hinnati global fit Langmuir 1:1 abil, kasutades baasjoone triivi mudeleid, mis on olemas tarkvaras BIAevaluation, mis on saadavad BIAcore's.
Protokoll 2
BIAcore mõõtmised viidi läbi sisuliselt nii, nagu on kirjeldanud Fagerstam et al. "Detection of antigen-antibody interaktions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping." J. Mol. Recog. 3: 208-214, (1990).
Tabelis I on loetletud käesoleva leiutise kohaste näidislike anti-IGF-IR-antikehade afiinsuse mõõtmise tulemused:
Tabel I
Need kineetilised analüüsid osutavad sellele, et antikehadel, mis on valmistatud vastavalt käesolevale leiutisele, on kõrged afiinsused ja tugevad seostumiskonstandid IGF-IR-i ekstratsellulaarsete domeenide suhtes.
NÄIDE III: Antikeha poolt vahendatud IGF-I-i indutseeritud IGF-IR fosforüleerimise inhibeerimine
Me teostasime ELISA eksperimente, et määrata, kas käesoleva leiutise kohased antikehad on võimelised blokeerima IGF-I poolt vahendatud IGF-IR-i aktivatsiooni. IGF-I poolt vahendatud IGF-IR aktivatsiooni detekteeriti suurendatud, retseptoriga seotud türosiini fosforüleerimise põhjal.
ELISA plaadi valmistamine
Me valmistasime ELISA haaravad plaadid, lisades 100 mikrol blokeerimispuhvrit (3% härja seerumialbumiini [BSA - bovine serum albumin] Tris-ga puhverdatud füsioloogilises lahuses [TBS - tris-buffered saline]) igasse auku 96-augulistes ReactiBind Valguga G kaetud plaatides (Pierce) ja inkubeeriti neid plaate, loksutades 30 minutit toatemperatuuril. Me lahjendasime küüliku üldspetsiifilise SC-713 anti-IGF-IR-antikeha (Santa Cruz) blokeerimispuhvris kontsentratsioonini 5 mikrog/ml ja lisasime 100 mikrol lahjendatud antikeha lahust igasse auku. Me inkubeerisime neid plaate, loksutades 60-90 minutit toatemperatuuril. Seejärel me pesime neid plaate viis korda pesupuhvriga (TBS+0,1% Tween 20) ja kuivatasime ettevaatlikult puhvri jäägid paberrätikuga. Neil plaatidel ei lastud ära kuivada enne lüsaadi lisamist.
Lüsaadi valmistamine IGF-IR-d ekspresseerivatest rakkudest
Me paigutasime IGF-IR-ga transfekteeritud NIH-3T3 rakud (5xl04/ml) 100 mikrol-s kasvukeskkonnas (DMEM, kõrge glükoosisisaldusega sööde, millele on lisatud L-glutamiini (0,29 mg/ml), 10% kuumaga inaktiveeritud FBS-i, ja 500 ug/ml igat antibiootikumidest genetitsiin, penitsilliin ja streptomütsiin) 96-augulisse U-kujulise põhjaga plaatidele. Me inkubeerisime neid plaate 37 °C juures 5% CO2 juuresolekul üleöö, et lasta rakkudel kinnituda. Me dekanteerisime söötme plaatidelt ja asendasime selle 100 ui värske kasvukeskkonnaga ühe augu kohta. Testimiseks me lahjendasime võimalikud anti-IGF-IR-antikehad kuni viis korda soovitava lõpliku kontsentratsioonini söötmega ja lisasime seda 25 mikrol igasse auku. Kõik proovid valmistati kolmes paralleelis. Seejärel me inkubeerisime neid plaate 37 °C juures üks tund. Me stimuleerisime neid rakke 25 mikrol/auk 600 ng/ml IGF-1 (valmistatud kasvukeskkonnas) ja inkubeerisime neid plaate toatemperatuuril 10 minutit. Seejärel me dekanteerisime sellelt söötme, pöörates need plaadid ümber ja kuivatades ettevaatlikult paberrätikutel ja lüüsisime liibunud rakud, lisades selleks 50 mikrol lüüsipuhvrit (50 mM HEPES, pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1,6 mM NaVO4, l%Triton X-100, 1% glütserooli lisati vahetult enne kasutamist koos ühe EDTA-vaba proteaasiinhibiitori tabletiga [Roche Molecular Sciences] 50 ml kohta) ja loksutades 5 minutit toatemperatuuril. Me lisasime 200 mikrol lahjenduspuhvrit (50 mM HEPES, pH 7,4, 1,6 mM NaVO4) igasse auku ja segasime pipeteerimisega üles-alla. Me viisime 100 mikrol lüsaati igast plaadi august igasse ELISA-haarava plaadi auku, mis oli valmistatud, nagu eelpool kirjeldatud ja inkubeerisime ettevaatlikul loksutamisel kaks tundi toatemperatuuril.
ELISA anti-türosiin-fosfaadi (pTYR) antikehadega
Me eemaldasime raku lüsaadi, pöörates plaadid ümber, pestes neid plaate viis korda pesemispuhvriga ja kuivatati paberkäterätikutega. Me lisasime ühe augu kohta 100 mikrol pTYR-spetsiifilist antikeha (HRP-PY54), lahjendasime blokeerimispuhvris kontsentratsioonini 0,2 mikrog/ml ja inkubeerisime neid plaate loksutades neid 30 minutit toatemperatuuril. Seejärel me pesime neid plaate viis korda pesemispuhvriga ja kuivatasime paberkäterätikutel.
Seejärel me detekteerisime HRP-PY54 antikeha seostumist lisades iga augu kohta 100 mikrol TMB peroksidaasi substraadi lahust (Kirkegaard & Perry) ja inkubeerides loksutamisel kuni värvi ilmumiseni (ligikaudu 2-10 minutit). Me peatasime värvi ilmutamise reaktsiooni lisades igasse auku 100 mikrol TMB stopplahust (Kirkegaard & Perry). Seejärel me loksutasime neid plaate 10 sekundit toatemperatuuril lahuse segamiseks ja kvantifitseerisime, mõõtes OD450nm.
Tabelis II ja joonisel fig 4 on toodud selle eksperimendi tulemused, mis viidi läbi erinevate käesoleva leiutise kohaste antikehadega. Selle eksperimendi tulemused demonstreerivad käesoleva leiutise kohaste antikehade võimet blokeerida IGF-T poolt vahendatud IGF-ER-i aktivatsiooni, nagu on näidatud suurendatud retseptoritasemega seotud türosiini fosforüleerimisega. Lisaks sellele need tulemused võivad olla kasutatud käesoleva leiutise kohaste antikehade võime kvantifitseerimiseks.
Tabel II
NÄIDE IV: Antikeha poolt vahendatud IGF-L/IGF-IR seostumise blokeerimine Me teostasime ELISA eksperimendid, et kvantifitseerida käesoleva leiutise kohaste antikehade võimet inhibeerida IGF-I seostumist IGF-IR-ga rakul baseeruvas testis. Me kandsime plaatidele IGF-IR-ga transfekteeritud NTH-3T3 rakke (5x104/ml) 100 mikrol DMEM söötmes, millel oli kõrge gükoosisisaldus, millesse oli lisatud L-glutamiini (0,29 mg/ml), 10% kuumusega inaktiveeritud FBS-i ja 500 mikrog/ml igat antibiootikumidest: genetitsiin, penitsilliin ja streptomütsiin, 96-augulises U-kujuliste põhjadega plaatides. Seejärel me inkubeerisime neid plaate 37 °C juures, 5% CO2 juuresolekul üleöö, võimaldades rakkudel kinnituda. Seejärel me dekanteerisime söötme plaatidelt ja asendasime selle 100 mikrol värske söötmega iga augu kohta. Testimiseks me lahjendasime antikehad testsöötmega (DMEM, kõrge glükoosisisaldusega sööde, millele oli lisatud L-glutamiini, 10% kuumusega inaktiveeritud FBS-i, 200 mikrog/ml BSA-d ja 500 mikrog/ml igat antibiootikumidest: genetitsiin, penitsilliin ja streptomütsiin) kuni soovitava lõppkontsentratsioonini ja lisati seda 50 mikro l igasse auku. Kõik proovid tehti kolmes paralleelis. Seejärel me inkubeerisime neid plaate 37 °C juures kümme minutit. Lahjendasime [135I]-IGF-I kontsentratsionini 1 mikroCi/ml testsöötmel ja lisasime 50 mikro l igasse plaadi auku. Radioaktiivsuse fooni kontrolliks me lisasime külma IGF-I-d kuni lõppkontsentratsioonini 100 ng/ml. Me inkubeerisime neid plaate 10 minutit 37 °C juures, dekanteerisime söötme, kuivatades ettevaatlikult paberrätikutega ja pesime kaks korda testisöötmega. Seejärel me lüüsisime need rakud lisades lahust, mis sisaldas 50 mikro l 0,1 N NaOH, 0,1 % SDS ja loksutades neid plaate viis minutit toatemperatuuril. Seejärel me kandsime proovid stsintillatsiooniplaadile, lisasime 150 mikro l OptiPhase Supermix'i ja lugesime signaali Wallac Micro-Beta loendajal.
Tabelis III ja joonisel fig 3 on toodud selle eksperimendi tulemused, mis on läbi viidud kolme näidisliku käesoleva leiutise kohase antikehaga. See eksperiment demonstreerib seda, et käesoleva leiutise kohased antikehad inhibeerivad spetsiifiliselt [125I]-IGF-I seostumist rakkudega, mis ekspresseerib liiaga IGF-IR.
Tabel III
NÄIDE V: Epitoobi kaardistamise uuringud
Näidanud, et käesoleva leiutise kohased antikehad tunnevad IGF-IR-i, me viisime läbi epitoobi kaardistamise uuringud mitme käesoleva leiutise kohase antikehaga. Me fokuseerisime need eksperimendid konkreetselt antikehadele 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, ja 4.9.2.
Me viisime läbi BIAcore konkurentsed uuringud, et määrata, kas käesoleva leiutise kohased antikehad seostuvad sama või erinevate saitidega IGF-IR molekulil. Me seostasime selle IGF-IR-i ekstratsellulaarse domeeni (ECD - extracellular domairi) BIAcore andurkiibiga, nagu eelpool näites II kirjeldatud. Me seostasime esimese käesoleva leiutise kohase antikeha selle andurkiibiga seotud IGF-IR-ga küllastustingimustes. Seejärel me mõõtsime pärast seda lisatud teiseste käesoleva leiutise kohaste antikehade võimet konkureerida primaarse antikehaga seostumisest IGF-IR-ga. See meetod võimaldas meil hinnata käesoleva leiutise kohaste antikehade eelistusi erinevate seostumisrühmade suhtes.
Me teostasime selle eksperimendi antikehadega 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 ja 4.9.2. Me täheldasime, et antikehad 2.13.2 ja 4.9.2 konkureerivad samade rühmade pärast IGF-IR ekstratsellulaarsel domeenil. Teised antikehad, 2.12.1 ja 2.14.3, seostuvad selliste saitidega IGF-IR-l, mis erinevad nii teineteisest kui ka saidist, millega seostuvad antikehad 2.13.2 ja 4.9.2.
NÄIDE VI: Käesoleva leiutise kohaste antikehade võime anda riikidevahelisi ristreaktsioone
Selleks, et määrata käesoleva leiutise kohaste antikehade võimet anda liikidevahelisi ristreaktsioone, me viisime läbi mitu eksperimenti, kaasaarvatud immunopretsipitatsioon, IGF-I poolt indutseeritud retseptori fosforüleerimise blokeerimine antikeha vahendusel ja FACS analüüs.
Et läbi viia immunopretsipitatsiooni eksperimente, me külvasime rakud kõrge glükoosisisaldsega DMEM-i, millele oli lisatud L-glutamiini (0,29 mg/ml), 10% kuumusega inaktiveeritud FBS-i ja 500 mikro g/ml igast antibiootikumist: genetitsiini, penitsilliini ja streptomütsuni, ja kasvatasime kuni 50% kokkulaatumiseni T25 kultuurianumates. Seejärel me lisasime 100 mikro l käesoleva leiutise kohast antikeha Hanki puhverdatud füsioloogilises lahuses (HBSS; Gibco BRL) kontsentratsioonil 1 mikrog/ml. Me inkubeerisime neid plaate 30 minutit 37 °C juures inkubaatoris, misjärel stimuleerisime neid IGF-I-ga, 100 ng/ml, 10 minutit toatemperatuuril. Me lüüsisime need rakud RIPA puhvriga (Harlow ja Lane, eelpool) ja IGF-IR 2 mikrog immunopretsipiteeriti panspetsiifilise SC-713 anti-IGF-IR-antikehaga (Santa Cruz), pluss valku A sisaldavad agaroosi graanulitega 1 tund 4 °C juures. Me sadestasime need graanulid ja pesime kolm korda PBS/T-ga (PBS pluss 0,1% Tween-20) misjärel keetsime neid graanuleid 40 mikrol Laemmli puhvris, mis sisaldas 5% beeta-ME-d.
Proove, mis valmistati nagu eelpool kirjeldatud, analüüsiti, kasutades immunoblottanalüüsi. Me kandsime igat proovi 12 mikrol ühe raja kohta 4-10% gradientgeelile (Novex geelid), elektroforeesides IX MES puhvris (Novex ). Elektroforees neis geelides viidi läbi 150 V juures 1 tunni jooksul või 200 V juures ligikaudu 30 minuti jooksul. Seejärel me kandsime lahutatud valgud geelist üle membraanile Novexi ülekandepuhvris, mis sisaldas 10% metanooli, kas üleöö 100 mA juures või 1-1,5 tunni jooksul 250 mA juures. Seejärel lasksime me membraanidel täielikult ära kuivada ja blokeerisime toatemperatuuril TBS-ga (Tris-ga puhverdatud füsioloogiline lahus pH 8,0), mis sisaldas Superblock-i (Pierce Chemical Co.). Me lisasime IGF-IR-i blottingantikeha SC713 (Santa Cruz), et detekteerida immunopretsipiteeritud IGF-IR-i.
See eksperiment viidi läbi käesoleva leiutise kohaste antikehadega, konkreetselt antikehadega 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 ja 4.9.2, rakkudel erinevatest loomadest. Me leidsime, et antikehad 2.12.1, 2.13.2 ja 4.9.2 olid võimelised seostama inimese, kuid mitte koera, merisea, sea või küüliku IGF-IR-ga. Edasi need antikehad olid samuti võimelised seostuma COS7-ga ja reesuse IGF-IR-ga, millest kumbki on tuletatud Vana Maailma ahvidest, kuid mitte küünisahvist pärineva IGF-IR-ga, mis on Uue Maailma ahv. Need eksperimendid näitavad, et need antikehad on ülimalt spetsiifilised.
IGF-I/IGF-IR seostumise blokeerimine antikeha poolt primaatides, milleks ei ole inimene
Vastavalt meie järgmisele tähelepanekule, et käesoleva leiutise kohased antikehad tunnevad ära IGF-IR-i Vana Maailma ahvidest, me testisime ka nende võimet blokeerida IGF-I/IGF-IR seostumist rakkudes, mis on tuletatud Vana Maailma ahvidest. Me külvasime rakud kõrge glükoosisisaldusega DMEM-söötmes, millele oli lisatud L-glutamiini, 10% kuumusega inaktiveeritud FBS-i ja 500 mikrog/ml igat antibiootikumi: genetitsiini, penitsilliini ja streptomütsiini ja kasvatasime kuni 50% laatumiseni T25 kultuurianumates. Seejärel me lisasime kontrollina käesoleva leiutise kohast antikeha või söödet ilma antikeha, ja stimuleerisime rakke IGF-I-ga kontsentratsioonil 100 ng/ml 10 minutit toatemperatuuril. Pärast stimulatsiooni me lüüsisime need rakud ja immunopretsipiteerisime IGF-IR-i panspetsiifilise IGF-IR antikehaga SC713, nagu eelpool kirjeldatud. Seejärel me viisime läbi immunoblottanalüüsi nagu eelpool kirjeldatud, kasutades HRP-PY54 antikeha, et detekteerida fosforüleeritud türosiini aktiveeritud IGF-IR-s.
Me märkasime, et käesoleva leiutise kohased antikehad ja nimelt antilkehad 2.13.2 ja 4.9.2 võisid blokeerida IGF-I-i poolt indutseeritud IGF-IR-i fosforüleerimist nii COS7, kui ka reesuse rakkudes. Vaadeldud inhibeerimise IC50 oli COS7 ja reesuse IGF-IR puhul vastavalt 0,02 mikrog/ml ja 0,005 mikrog/ml.
Käesoleva leiutise kohaste antikehade liikdevahelise ristafiinsuse määramine
Me viisime läbi FACS-analüüsi, et määrata käesoleva leiutise kohaste antikehade afiinsust IGF-IR-de suhtes, mis pärinevad teistest loomadest, eriti Vana Maailma ahvidest, mida on kirjeldatud eelpool. Me inkubeerisime inimese ja ahvi rakkude alikvoote (5x105) üks tund jääl kasvavate kontsentratsioonide biotinüleeritud käesoleva leiutise kohaste IGF-IR-i vastaste antikehadega või biotinüleeritud meriteo hemotsüaniini vastase (KLH -keyhole limpet hemocyanine) antikehaga (Abgenix) negatiivse kontrollina. Seejärel me inkubeerisime seda proovi 30 minutit jääl steptavidiiniga konjugeeritud fükooerütriiniga (RPE - phycoerythriri). Me mõõtsime seostumist läbivoolutsütomeetriaga ja analüüsisime fluorestsentsi intensiivsuse (F12-H) histogramme versus rakkude arv (loendeid) kasutades CellQuest tarkvara. Me arvutasime iga antikeha seostumist (Kd), lähtudes keskmise fluorestsentsi intensiivsuse graafikutest versus antikeha kontsentratsioon. Suuremas osas eksperimentidest me mõõtsime seostumist kultuuris kasvatatavates inimese MCF-7 rakkudes ja kas reesuse või künomolguse koekultuuri rakkudes. Me kontrollisime antikehade ammendamist, mõõtes seostumist erinevate rakukontsentratsioonide juures.
Me viisime läbi eelpoolmainitud FACS-analüüsi, et testida käesoleva leiutise kohaste antikehade võimet, eriti antikehade 2.13.2 ja 4.9.2 võimet seostuda inimese, reesuse ja künomolguse rakkudega. Me täheldasime poolmaksimaalset seostumist (Kd) 0,1 mikrog/ml kõikide testitud rakuliinide puhul.
NÄIDE VII: IGF-I retseptori allareguleerimine
Me oleme läbi viinud blokeerimiseksperimente sisuliselt samuti nagu eelpool kirjeldatud näites IV kuni [125I]-märgistatud IGF-I lisamiseni, me keetsime neid rakke 40 mikrol Laemmli puhvris, mis sisaldas 50% p-ME-d. Me analsüüsisime seejärel neid proove immunoblottanalüüsiga, nagu eelpool näites VI kirjeldatud ja märgistasime sondidega need blotid, kasutades panspetsiifilist IGF-IR-antikeha SC713, et kvantifitseerida IGF-IR ja HRP-PY54 antikehade tasemeid, et jälgida fosforüleeritud türosiini tasemeid aktiveeritud IGF-IR-s.
Nagu eelpool märgitud (Näide III), me täheldasime IGF-I poolt indutseeritud IGF-IR-i fosforüleerimise blokeerimist pärast rakkude töötlemist käesoleva leiutise kohase antikehaga (joonis fig 4). Edasi me täheldasime, et see IGF-I poolt indutseeritud fosforüleerimise blokeerimisele järgnes IGF-IR-i allareguleerimine nendes rakkudes. Vaata näiteks joonis fig 4. IGF-IR-i tasemed olid maksimaalselt vähendatud 16 tundi pärast stimulatsiooni IGF-I-ga käesoleva leiutise kohaste antikehade juuresolekul.
NÄIDE VIII: Käesoleva leiutise kohaste antikehade toime IGF-IR-le in vivo
Me püüdsime kindlaks teha, kas käesoleva leiutise kohaste antikehade toime IGF-IR-le, nagu kirjeldatud eelmistes näidetes, leiavad aset in vivo. Selleks me indutseerisime tuumoreid tüümuseta hiirtes vastavalt publitseeritud meetoditele (V. A. Pollack et al., "Inhibition of epidermal growth faktor retseptor-associated türosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice," J. Pharmakol. Exp. Ther. 291: 739-748 (1999). Lühidalt, me injekteerisime IGF-IR-ga transfekteeritud NIH-3T3 rakke (5x106) subkutaanselt 3-4 nädala vanustesse hiirtesse, kellelt oli eelnevalt eemaldatud tüümus (nu/nu), 0,2 ml Matrigel-preparaati. Seejärel me injekteerisime hiiri käesoleva leiutise kohaste antikehadega intraperitoneaalselt pärast seda, kui indutseeritud (s.o ligikaudu 400 mm3) tuumorid olid formeerunud.
24 tunni pärast me ekstraheerisime neid tuumoreid, homogeniseerisime neid ja määrasime IGF-IR taseme. Selleks, et määrata IGF-IR tasemeid, me lahjendasime SC-713-antikeha blokeerimispuhvris lõppkontsentratsioonini mikrog/ml ja lisasime seda 100 mikro1 igasse Reacti-Bind Goafiga ja küülikuvastaste antikehadega (GAR - goat anti-rabbit) kaetud plaadi (Pierce) auku. Me inkubeerisime neid plaate toatemperatuuril 1 tund, loksutades, misjärel pesime neid plaate viis korda pesupuhvriga. Seejärel me kaalusime tuumoriproovid, mis olid valmistatud nii, nagu eelpool kirjeldatud ja homogeniseerisime neid lüüsipuhvris (1 ml/100 mg). Me lahjendasime 12,5 mikrol tuumoriekstrakti lüüsipuhvriga kuni lõppmahuni 100 mikrol ja lisasime seda igasse 96-augulise plaadi auku. Me inkubeerisime neid plaate toatemperatuuril, loksutades 1-2 tundi ja seejärel pesime neid viis minutit pesupuhvriga. Siis me lisasime 100 mikro1 HRP-PY54 või biotinüleeritud anti-IGF-IR antikeha blokeerimispuhvris igasse auku ja inkubeerisime toatemperatuuril loksutades 30 minutit. Seejärel me pesime neid plaate viis korda pesupuhvriga ja ilmutasime neid plaate. Me ilmutasime neid plaate, mis sisaldasid sondi HRP-PY54, lisades sellele 100 mikro1 TMB microwell-substraati ühe augu kohta ja peatasime värvi ilmutamise lisades sellele 100 mikrol 0,9 M H2SO4. Seejärel me kvantifitseerisime signaali, loksutades 10 sekundit ja mõõtes OD450nm juures. Saadud signaal normaliseeriti koguvalgu suhtes. Me ilmutasime plaate, mis kandsid sondidena anti-IGF-IR-antikeha, lisades igasse auku 100 mikrol streptavidiin-HRP-d, mis oli lahjendatud blokeerimispuhvriga, inkubeerides toatemperatuuril, loksutades 30 minutit ja jätkates nii, nagu on kirjeldatud HRP-PY54 puhul.
Me täheldasime, et käesoleva leiutise kohase antikeha ja eriti antikehade 2.13.2 ja 4.9.2 intraperitoneaalne injektsioon kutsus esile IGF-IR aktiivsuse inhibeerimise, nagu näitasid mõõtmised, mille puhul vähendati [nii IGF-IR fosfotürosiini (fosforüleeritud IGF-IR) ja] üld-IGF-IR-valgu tasemeid (joonis fig 6). Lisaks sellele me täheldasime ka IGF-IR fosfotürosiini (fosforüleeritud IGF-IR-i) taseme vähenemist (joonis fig 5). Soovimata seostada ennast üks kõik millise teooriaga, me arvame, et IGF-IR fosfotürosiini vähendatud tasemed võivad olla tingitud IGF-IR-valgu vähendatud tasemetega in vivo pärast töötlemist leiutisekohase antikehaga või võib olla tingitud vähendatud IGF-IR-valgu taseme ja IGF-IR-i türosiini fosforüleerimise vähenemise kombinatsioonist, mis leiab aset ligandi (näiteks IGF-I või IGF-II) poolt esilekutsutava aktivatsiooni blokeerimise tõttu. Peale selle see inhibeerimine oli vastuseks süstitud antikeha doosile (joonis fig 6). Need andmed demonstreerivad seda, et käesoleva leiutise kohased antikehad on võimelised tabama IGF-IR-i in vivo viisil, mis on analoogne sellele, mida me täheldasime in vitro.
NÄIDE IX: 3T3/IGF-IR-raku tuumorite kasvu inhibeerimine (TGI)
Me oleme testinud, kas käesoleva leiutise kohased anti-IGF-IR-antikehad toimivad tuumori kasvu inhibiitoritena. Me indutseerisime tuumoreid nagu eelpool kirjeldatud (näide VIII) ja kui need kinnitusid, siis moodustusid nad palpeeritavad tuumorid (s.o 250 mm3, 6-9 päeva jooksul), misjärel me töötlesime neid hiiri ühekordse intraperitoneaalselt injekteeritava antikeha doosiga, mille suurus oli 0,20 ml. Me mõõtsime tuumori suurust nooniusega varustatud varbsirkliga kahes ristisuunas iga kolmas päev ja kalkuleerisime selle mahu, kasutades valemit (pikkusx[laius]2)/2, kasutades meetodit, mille oli pakkunud välja Geran, et al., "Protocols for scrining Chemical agents ja natural products against animal tumours and other biological systems," Cancer Chemother. Rep. 3: 1-104.
Kui me olime läbi viinud selle analüüsi käesoleva leiutise kohaste antikehadega, me leidsime, et ühekordne töötlemine ainult antikehaga 2.13.2 inhibeerib IGF-IR-ga transfekteeritud NIH-3T3 rakkudes indutseeritud tuumorite kasvu (joonis fig 7, vasak paneel). Lisaks sellele, kombinatoorses uuringus ühekordse intravenoosse doosiga, mille suurus oli 7,5 mg/kg ja mis sisaldas lisandina adriamütsiini, me nägime, et ühekordse antikeha 2.13.2 doosi manustamine tõstis tuntud tuumorikasvu inhibiitori, adriamütsiini efektiivsust. See adriamütsiini ja käesoleva leiutise kohaste antikehade, 2.13.2 kombinatsioon näitas üles kasvu mahajäämust 7 päeva võrreldes töötlemisega ainult antikeha või adriamütsiiniga (joonis fig 7, parem paneel).
NÄIDE X: Antikeha tasemete sõltuvus IGF-IR-i allaregulatsioonist
Tuumorid indutseeriti karvatutes hiirtes nagu on kirjeldatud näites VIII. Neid hiiri töödeldi 125 mikrog antikehaga 2.13.2, kasutades intraperitoneaalset injektsiooni nagu on kirjeldatud näites VIII. Tuumorid ekstraheeriti ja IGF-IR tasemed mõõdeti ELISA-ga, nii nagu on kirjeldatud näites VIII. Joonis fig 8 näitab antikeha 2.13.2 seerumitasemeid ja IGF-IR retseptori tasemeid ajas. See eksperiment näitab, et IGF-IR on allaregulated antikehaga ja et IGF-IR inhibeerimisaste on doosist sõltuvalt proportsionaalne antikeha seerumikontsentratsiooniga.
NÄIDE XI: 3T3/IGF-IR tuumorite kasvu ihibeerimine mitmese antikeha ja adriamütsiini kombinatsiooni doosiga
Tuumorid indutseeriti karvatutes hiirtes nagu on kirjeldatud näites IX. Hiired, millel hakkasid arenema nahaalused tuumorid suurusega ligikaudu 250 mm3, töödeldi päevadel 1, 8, 15 ja 22 erinevate koguste antikeha 2.13.2 (i.p.) või 7,5 mg/kg adriamütsiiniga (i.v.), kas ainsa agensina või kombinatsioonis, nagu on kirjeldatud näites IX. Joonis fig 9 näitab tuumori suurust sõltuvalt erinevatest töötlemisviisidest ajas. See eksperiment näitab, et töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga, mida on antud üks kord päevas seitsme päeva jooksul, inhibeerib tuumoriraku kasvu ja tõstab tuumori raku kasvu inhibeerimist kombinatsioonis tuntud tuumori inhibiitori, adriamütsiiniga.
NÄIDE XII: Suurte tuumorite kasvu inhibeerimine
Tuumorid indutseeriti karvadeta hiirtes nii, nagu on kirjeldatud näites IX. Hiired suurte, juba kasvavate nahaaluste tuumoritega, mille maht oli veidi väiksem kui 2000 mm3, töödeldi päevadel 1 ja 8 erinevate antikeha 2.13.2 (i.p.) kogustega või 7,5 mg/kg adriamütsiiniga (i.v.), kas omaette agensina või kombinatsioonis, nagu on kirjeldatud näites IX. Joonis fig 10 näitab selle tuumori kasvu sõltuvalt erinevatest töötlustest, ajas. Kontroll-loomade rühmad, kes said ainult antikeha ja ainult adriamütsiini, tapeti 5. päeval, kui selle tuumori suurus ületas 2000 mm3. See eksperiment näitab, et töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga kombinatsioonis adriamütsiiniga on väga efektiivne suurte tuumorite vastu, kui kasutada mitmeseid doose.
NÄIDE XIII: Kolorektaalsete rakutuumorite kasvu inhibeerimine
Tuumorid indutseeriti karvadeta hiirtel nii, nagu on kirjeldatud näites IX, selle erinevuseda, et kasutati Colo 205 rakke (ATCC CCL 222). Colo 205 rakud on inimese koloretaalse adenokartsinoomi rakud. Hiired, kellel arenesid nahaalused tuumorid mahuga ligikaudu 250 mm3, töödeldi erinevate koguste antikehadega 2.13.2 (i.p.) või 100 mg/kg 5-fluorodeoksüuridiiniga (5-FU, i.v.), kas omaette agensitena või kombinatsioonis nii, nagu on kirjeldatud näites IX. Joonis fig 11 näitab tuumori suurust sõltuvalt erinevatest töötlusviisidest, ajas. See eksperiment demonstreerib seda, et töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga, mida on antud ühekordselt, inhibeerib inimese kolorektaalse vähiraku kasvu, kui seda on antud omaette agensina, ja tõstab 5-FU, tuntud tuumori inhibiitori efektiivsust.
Hiiri kasvavate Colo 205 tuumoritega töödeldi päevadel 1, 8, 15 ja 22 500 mikrog antikehaga 2.13.2 (i.p.), 100 mg/kg 5-FU-ga (i.v.) või nende kombinatsiooniga. Joonis fig 12 näitab tuumori suurust sõltuvalt erinevatest töötlemisviisidest, ajas. See eksperiment näitab, et töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga, mida antakse üks kord päevas seitsme päeva jooksul, inhibeerib inimese kolorektaalse vähiraku kasvu ja tõstab 5-FU efektiivsust.
NÄIDE XIV: Rinnavähirakutuumori kasvu inhibeerimine
Karvatutele hiirtele, nagu eelpool näites VIII kirjeldatud, implanteeriti biodegradeeritavad östrogeeni sisaldavad kuulikesed (0,72 mg 17-beeta-estradiooli ühe kuulikese kohta, 60 päevase vabanemisajaga; Innovative Research of America). 48 tunni pärast karvatutel hiirtel indutseeriti tuumorid sisuliselt samal viisil, nagu on kirjeldatud näites IX, selle erinevusega, et kasutati MCF-7-rakke (ATCC HTB-22). MCF-7-rakud on östrogeenist sõltuvad inimese rinnakartsinoomi rakud. Hiiri juurdunud nahaaluste tuumoritega, mille maht oli ligikaudu 250 mm3, töödeldi 50 mikrog antikehaga 2.13.2 (i.p.) päevadel 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 ja 22 (q3dx7) või 6,25 mg/kg taksooliga (i.p.) päevadel 1, 2, 3, 4, 5 (qldx5), kas ühe agensiga või kombinatsioonis, praktiliselt samuti, nagu on kirjeldatud näites IX. Joonis fig 13 näitab tuumori suurust sõltuvalt erinevatest töötlemisviisidest, ajas. See eksperiment näitab, et töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga iseenesest inhibeerib inimese rinnavähiraku kasvu, kui seda manustada üks kord iga kolme päeva jooksul ja tõstab ka tuntud rinnavähi inhibiitori, taksooli efektiivsust, kui neid manustada kombinatsioonis.
Hiiri, kellel olid juurdunud tuumorid MCF-7-rakkudest, nagu kirjeldatud vahetult eelpool, töödeldi päeval 1 erinevate koguste ainult antikehaga 2.13.2 (i.p.) või üheskoos 3,75 mg/kg adriamütsiiniga (i.v.), praktiliselt samuti nagu on kirjeldatud näites IX. Joonis fig 14 näitab tuumori suurust sõltuvalt erinevatest töötlemistest ajas. See eksperiment näitab, et töötlemine ainult anti-IGF-IR-antikehaga iseenesest inhibeerib inimese rinnavähi raku kasvu ja tõstab tuntud tuumori inhibitori, adriamütsiini efektiivsust.
Hiired, kellel on juurdunud tuumorid MCF-7-rakkudest, nagu kirjeldatud vahetult eelpool, töödeldi 250 mikrog antikehaga 2.13.2 (i.p.) päevadel 1, 8, 15 ja 23 või biodegradeeruva tamoksifeeni kuulikesega (25 mg/kuulike, vaba alust, 60 päevase vabastusajaga, Innovative Research of America), kas omaette agensina või kombinatsioonis, praktiliselt samuti, nagu on kirjeldatud näites IX. Tamoksifeeni sade implanteeriti päeval 1 pärast tuumori juurdumist. Joonis fig 15 näitab tuumori suurust sõltuvalt erinevatest töötlemisviisidest ajas. See eksperiment näitab, et töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga, mida on manustatud üks kord iga seitsme päeva sees, inhibeerib inimese rinnavähi kasvu iseenesest ja suurendab tamoksifeeni, tuntud tuumori inhibiitori efektiivsust.
NÄIDE XVI: Epidermoidse kartsinoomiraku tuumorite kasvu inhibeerimine
Tuumorid indutseeriti karvatus hiires praktiliselt samuti, nagu on kirjeldatud näites IX, välja arvatud see, et siin kasutati rakke A431 (ATCC CRL 1555). A431 rakud on inimese epidermoidsed kartsinoomirakud, mis ekspresseerivad liiaga EGFR-i. Hiired juurdunud nahaaluste subkutaansete tuumoritega, mille maht oli ligikaudu 250 mm3, töödeldi päevadel 1,8, 15, 22 ja 29 500 mikrog antikehaga 2.13.2 (i. p.) või töödeldi üks kord päevas 27 päeva jooksul 10 mg/kg CP-358,774-ga, mida manustati suukaudselt (p.o.), kas omaette agensina või kombinatsioonis, nagu kirjeldatud näites IX. CP-358,774 on kirjeldatud patendis US 5747498 ja artiklis Moyer et al., Cancer Research 57: 4838-4848 (1997), mis on siin viidetena sisse lülitatud. Joonis fig 16 näitab tuumori suurust sõltuvuses erinevatest töötlusviisidest, ajas. See eksperiment näitab, et töötlemine anti-IGF-IR-antikehaga tõstab CP-358,774, tuntud EGF-R türosiinkinaasi inhibiitori efektiivsust inimese epidermoidse kartsinoomi tuumori inhibeerimisel.
NÄIDE XVII: Anti-IGF-IR-antikehade farmakokineetika in vivo
Et hinnata anti-IGF-IR-antikehade farmakokineetikat injekteeriti künomolgusahve intravenoosselt 3, 30 või 100 mg/kg antikehaga 2.13.2 atsetaatpuhvris. Seerum koguti ahvidelt erinevatel aegadel ja määrati anti-IGF-IR-antikeha kontsentratsioonid ahvides ajavahemikel, mille pikkus oli kuni kümne nädalat. Et kvantifitseerida antikeha funktsionaalseid tasemeid, inimese IGF-R (IGF-I-sR, R&D Systems, Catalog # 391GR) ekstratsellulaarne domeen seostati 96-auguliste plaatidega. Ahvi seerum (lahjendused vahemikus 1:100 kuni 1:15,000) kanti neile testplaatidele nii, et iga proov oleks standardkõvera lineaarsuse piirides, ja inkubeeriti tingimustes, milles ükskõik milline anti-IGF-IR-antikeha seostuks IGF-I-sR-ga. Pärast plaatide pesemist neile lisati märgistatud inimese IgG-vastased antikehad ja inkubeeriti tingimustes, milles need inimese IgG-vastased antikehad seostuksid anti-IGF-IR-antikehaga. Seejärel neid plaate pesti ja ilmutati ja kasutades kontroll standardkõverat ja lineaarse regressiooni sobitusi, kvantifitseeriti anti-IGF-IR-antikehade kogused. Joonis fig 17 näitab antikeha 2.13.2 kontsentratsiooni seerumis, ajas. See eksperiment demonstreerib seda, et anti-IGF-IR-antikeha pooliga on 4,6 kuni 7,7 päeva ja selle mahujaotuvus on 74-105 ml/kg. Edasi, see eksperiment näitab, et need kogused on proportionaalsed doosiga ahvis, mis osutab sellele, et see anti-IGF-IR antikeha on küllastanud ükskõik millise kättesaadava IGF-IR seostumissaidi selles organismis isegi madalaimal kontsentratsioonil, mis moodustab 3 mg/kg.
NÄIDE XVIII: Anti-IGF-IR-antikeha ja adriamütsiini kombinatoorne teraapia reguleerib alla IGF-IR in vivo
Tuumorid indutseeriti karvatus hiires nii nagu on kirjeldatud näites IX. Hiired juurdunud nahaaluste tuumoritega, mille suurus oli ligikaudu 400 mm3, töödeldi üheainsa injektsiooni 250 mikrog antikehaga 2.13.2 (i.p.) või 7,5 mg/kg adriamütsiiniga (i.v.), kas omaette agensitena või kombinatsioonis, nagu on kirjeldatud näites IX. 72 tundi pärast agensite manustamist tuumorid ekstraheeriti nii, nagu on kirjeldatud näites VIII, ja võrdsed kogused tuumori ekstrakte analüüsiti naatriundodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelelektroforeesi (SDS PAGE) ja immunoblottanalüüsiga, kasutades anti-IGF-IR-antikeha SC-7I3 (Santa Cruz). Joonis fig 18 näitab IGF-IR koguseid kontroll-loomade tuumorirakkudes (esimesed kolm liini igal paneelil), loomades, keda on töödeldud ainult antikehaga (ülemine paneel), loomades, keda on töödeldud ainult adriamütsiiniga (keskmine paneel) ja loomades, keda on töödeldud antikeha ja adriamütsiiniga (alumine paneel). Iga liin esindab võrdseid koguseid valku individuaalsetest tuumoritest, individuaalsetest hiirtest. See eksperiment näitab, et töötlemine ainult adriamütsiiniga annab väikese efekti IGF-IR tasemetele ja et töötlemine ainult antikehaga näitab mõningat langust IGF-IR tasemetes. Üllatuslikult töötlemine adriamütsiini ja antikehaga üheskoos näitab dramaatilist langust IGF-IR tasemetes, mis näitab, et adriamütsiin ja antikeha reguleerivad suuresti IGF-IR tasemeid alla.
Kõik publikatsioonid ja patenditaotlused, mida on käesolevas leiutiskirjelduses tsiteeritud, on siin viidetena sisse lülitatud, nii nagu iga individuaalne publikatsioon või patenditaotlus olid konkreetselt ja individuaalselt näidustatud olema sisse lülitatud viitena. Kuigi eelolevat leiutist on kirjeldatud mõningates detailides, et illustreerida ja tuua näiteid leiutise selgitamiseks ja paremaks mõistmiseks, keskmise kvalifikatsiooniga spetsialistile on päris ilmne, et käesoleva leiutise õpetuste valguses, võib neis teha veel teatud muudatusi ja modifikatsioone, väljumata lisatud nõudluspunktide olemusest ja ulatusest.

Claims (30)

1. Monoklonaalne antikeha või selle antigeeni siduv osa, mis spetsiifiliselt seostub insuliinitaolise kasvufaktori I retseptoriga (IGF-IR), kusjuures nimetatud antikeha raske ahel kasutab inimese idutee VHDP-47 geeni, kus antikehal või osal on vähemalt üks järgmises rühmas sisalduvatest omadustest: a) ristkonkureerib IGF-IR-le antikehaga, mille raske ahel ja kerge ahel sisaldavad aminohappejärjestusi SEQ ID NO: 24 ja SEQ ID NO: 22, vastavalt; b) seostub sama IGF-IR epitoobile nagu antikeha, mille raske ahel ja kerge ahel sisaldavad aminohappejärjestusi SEQ ID NO: 24 ja SEQ ID NO: 22, vastavalt; c) seostub samale antikehale nagu on seotud antikeha, mille raske ahel ja kerge ahel sisaldavad aminohappejärjestusi SEQ ID NO: 24 ja SEQ ID NO: 22, vastavalt; d) seostub IGF-IR-le põhiliselt sama KD väärtusega nagu antikeha, mille raske ahel ja kerge ahel sisaldavad aminohappejärjestusi SEQ ID NO: 24 ja SEQ ID NO: 22, vastavalt; ja e) seostub IGF-IR-le põhiliselt sama väljumiskiirusega nagu antikeha, mille raske ahel ja kerge ahel sisaldavad aminohappejärjestusi SEQ ID NO: 24 ja SEQ ID NO: 22, vastavalt.
2. Antikeha või selle antigeeni siduv osa vastavalt nõudluspunktile 1, kus antikehal või osal on kõik nimetatud omadused.
3. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt nõudluspunktile 1, kus antikehal või osal on vähemalt üks järgmises rühmas sisalduvatest omadustest: a) see ei seostu hiire, roti, koera või küüliku IGF-IR-ga; b) see seostub makaagi või reesuse IGF-IR-ga, kuid ei seostu küünisahvi IGF-IR-ga; c) inhibeerib IGF-I või IGF-II sidumist IGF-IR-ga; d) selle selektiivsus IGF-IR suhtes on vähemalt 50 korda suurem, kui selle selektiivsus insuliiniretseptori suhtes; e) see inhibeerib tuumori kasvu in vivo; f) see põhjustab IGF-IR kadumise raku pinnalt, kui seda inkubeerida rakuga, mis ekspresseerib IGF-IR-i; g) see inhibeerib IGF-IR-i poolt indutseeritud türosiini fosforüleerimist; h) see seostub IGF-IR-ga KD väärtusega 8x10-9 M või väiksem; ja i) sellel on IGF-IR-le konstant Koff 10-4 s-1 või väiksem.
4. Antikeha või selle antigeeni siduv osa vastavalt nõudluspunktile 3, kus antikeha või selle osa inhibeerib IGF-I või IGF-II sidumist IGF-IR-ks, seob IGF-IR-le KD väärtusega 8 x 10-9 M või vähem ja omab selektiivsust IGF-IR suhtes, mis on vähemalt 50 korda suurem kui selle selektiivsus insuliini retseptorile.
5. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt nõudluspunktile 4, kus antikehal või osal on kõik loetletud omadused.
6. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-5, kus antikeha või osa inhibeerib IGF-IR ja IGF-I või IGF-II vahelist sidumist IC50-ga, mis on väiksem kui 100 nM.
7. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-6, kus nimetatud antikeha sisaldab kerge ahela variaabeldomeeni, mille järjestus sisaldab mitte enam, kui kümmet aminohappevahetust võrreldes aminohappejärjestusega, mis on kodeeritud idutee Vkapa A27 geenis.
8. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt nõudluspunktile 7, kus kerge ahela variaabeldomeen sisaldab aminohappejärjestust SEQ ID NO: 22.
9. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-8, kus nimetatud antikeha sisaldab raske ahela variaabeldomeeni, mille järjestus sisaldab mitte enam kui kaheksat aminohappevahetust võrreldes aminohappejärjestusega, mis on kodeeritud VH DP-47 idutees.
10. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt nõudluspunktile 9, kus raske ahela variaabeldomeen sisaldab aminohappejärjestust SEQ ID NO: 24.
11. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktidele 1-10, mis on: a) immunoglobuliini G (IgG), IgM, IgE, IgA või IgD molekul või on tuletatud sellest; või b) Fab-fragment, F(ab')2-fragment, Fv-fragment, üheahelaline antikeha, inimese antikeha, humaniseeritud antikeha, kimäärne antikeha või bispetsiifiline antikeha.
12. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-11, kus antikeha või osa sisaldab vähemalt ühte CDR aminohappejärjestust variaabeldomeenist, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: a) kerge ahela variaabeldomeen, mis sisaldab SEQ ID NO:22; ja b) raske ahela variaabeldomeen, mis sisaldab SEQ ID NO: 24.
13. Antikeha või antigeeni siduv osa vastavalt nõudluspunktile 12, kus antikeha või osa sisaldab kõiki variaabeldomeeni CDR piirkondade aminohappejärjestusi, kus variaabeldomeen(id) on valitud rühmast, mis sisaldab järgmisi: a) kerge ahela variaabeldomeen, mis sisaldab SEQ ID NO: 22; b) raske ahela variaabel domeen, mis sisaldab SEQ ID NO: 24; ja c) raske ahela variaabeldomeen, mis sisaldab SEQ ID NO 24 ja kerge ahela variaabeldomeeni, mis sisaldab SEQ ID NO: 22.
14. Monoklonaalne antikeha vastavalt nõudluspunktile 1, kus nimetatud antikeha sisaldab raske ahela aminohappejärjestust, mis sisaldab CDR1, CDR2 ja CDR3 aminohappejärjestusi SEQ:ID NO: 24-s ja kus nimetatud antikeha sisaldab lisaks kerge ahela aminohappejärjestust, mis sisaldab CDR1, CDR2 ja CDR3 aminohappejärjestust SEQIDNO:22-s.
15. Monoklonaalne antikeha vastavalt nõudluspunktile 14, kus raske ahela aminohappejärjestus sisaldab SEQ ID NO: 24 ja kerge ahela aminohappejärjestus sisaldab SEQ ID NO: 22.
16. Farmatseutiline koostis, mis sisaldab antikeha või osa vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-15 ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandjat.
17. Farmatseutiline koostis vastavalt nõudluspunktile 16, mis lisaks sisaldab antineoplastilist, kemoterapeutilist, antiangiogeenset või tuumorivastast agensit.
18. Antikeha valmistamise protsess vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-15, mis sisaldab järgmisi etappe: a) imetaja, kelleks ei ole inimene, immuniseerimist immunogeeniga, mis sisaldab IGF-IR-i, kus imetaja on võimeline ekspresseerima inimese antikehasid selle B-rakkudes; b) B-rakkude eraldamist sellest imetajast; c) B-rakkude, või nende rakuliinide, millest nad tuletatud on, skriinimine, et identifitseerida rakuliin, mis produtseerib antikehasid, mis seostuvad IGF-IR-ga; d) IGF-IR-ga seostuvaid antikehasid ekspresseeriva rakuliini kultiveerimine; ja e) IGF-IR-ga seostuvate antikehade eraldamine sellest rakuliinist.
19. Isoleeritud rakuliin, mis toodab antikeha vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-15.
20. Antikeha või osa kasutamine vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-15 ravimi tootmiseks, mis diagnoosib vajadusel IGF-IR-i ekspresseeriva tuumori olemasolu või asukoha subjektis.
21. Antikeha või antigeeni siduva osa kasutamine vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-15 ravimi tootmiseks, mis ravib inimeses vähki.
22. Antikeha või antigeeni siduva osa kasutamine vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-15 ravimi tootmiseks, mis ravib vajadusel patsiendis vähki.
23. Kasutamine vastavalt nõudluspunktile 21 või 22, kus nimetatud ravim sisaldab lisaks anti-neoplastilist, tuumorivastast, antiangiogeenset või kemoterapeutilist agensi.
24. Isoleeritud nukleiinhappemolekul, mis sisaldab nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib nõudluspunktidele 1-15 vastava antikeha rasket ahelat või selle antigeeni siduvat osa, nukleiinhappe järjestust, mis kodeerib kerget ahelat või selle antigeeni siduvat osa, või mõlemat.
25. Isoleeritud nukleiinhappemolekul vastavalt nõudluspunktile 24, kus nukleiinhappemolekul sisaldab nukleiinhappejärjestust, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgnevast: a) nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib raske ahela aminohappejärjestust või selle antigeeni osa, mis sisaldab vähemalt ühte CDR järjestust aminohappejärjestusest SEQ ID NO: 24; b) nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib raske ahela aminohappejärjestust või selle antikeha siduvat osa, mis sisaldab kolme CDR järjestust aminohappejärjestusest SEQ ID NO: 24; c) nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib antikeha raske ahela või selle antigeeni siduva osa aminohappejärjestust, mille raske ahel sisaldab aminohappejärjestust SEQ ID NO: 24; d) nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib kerge ahela aminohappejärjestust või selle antigeeni siduvat osa, sisaldades vähemalt ühte CDR järjestust aminohappejärjestustest SEQ ID NO: 22; e) nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib kerge ahela aminohappejärjestust või selle antigeeni siduvat osa, sisaldades vähemalt kolme CDR järjestust aminohappejärjestustest SEQ ID NO: 22; f) nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib antikeha kerge ahela või selle antigeeni siduva osa aminohappejärjestust, mille kerge ahel sisaldab aminohappejärjestust SEQ ID NO: 22; g) nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib aminohappejärjestust SEQ ID NO: 22 või 24; ja h) nukleiinhappejärjestus SEQ ID NO: 21 või SEQ ID NO: 23 kus nukleiinhappemolekul sisaldab valikuliselt nukleiinhappejärjestust, mis kodeerib aminohappejärjestust SEQ ID NO: 28 või SEQ ID NO: 26.
26. Vektor, mis sisaldab nukleiinhappemolekuli vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 24 või 25, kus vektor sisaldab valikuliselt ekspressiooni kontrolli järjestust, mis on toimivalt seostatud nukleiinhappemolekuliga.
27. Peremeesrakk, mis sisaldab nukleiinhappe järjestust, mis kodeerib rasket ahelat või selle antigeeni siduvat osa, nukleiinhappe järjestust, mis kodeerib kerget ahelat või selle antigeeni siduvat osa, või mõlemat, antikeha vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-15.
28. Meetod anti-IGF-IR-antikeha või selle antigeeni siduva osa valmistamiseks, mis sisaldab nõudluspunktile 27 vastava peremeesraku või nõudluspunktile 19 vastava rakuliini kultiveerimist sobivates tingimustes ja antikeha või selle antigeeni siduva osa eraldamist.
29. Transgeenne loom, kelleks ei ole inimene, mis sisaldab nukleiinhappe järjestust, mis kodeerib rasket ahelat või selle antigeeni siduvat osa, nukleiinhappe järjestust, mis kodeerib kerget ahelat või selle antigeeni siduvat osa, või mõlemat, antikeha vastavalt ükskõik millisele asendusnõudluspunktile 1-15, kus transgeenne loom, kelleks ei ole inimene, ekspresseerib nimetatud nukleiinhapet.
30. Isoleeritud nukleiinhappe molekuli kasutamine ravimitootmiseks subjektis vajadusel ravimiseks, kus isoleeritud nukleiinhappe molekul on valitud rühmast, mis koosneb: a) isoleeritud nukleiinhappe molekulist, mis kodeerib rasket ahelat või selle antigeeni siduvat osa vastavalt ükskõik millisele antikehale nõudluspunktides 1-15; b) isoleeritud nukleiinhappe molekul, mis kodeerib kerget ahelat või selle antigeeni siduvat osa vastavalt ükskõik millisele antikehale nõudluspunktides 1-15; ja c) isoleeritud nukleiinhappe molekuli a)-st ja b)-st mõlemast.
EEP201300037A 2001-01-05 2001-12-20 Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile EE05724B1 (et)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05
EEP200300318A EE05715B1 (et) 2001-01-05 2001-12-20 Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EE201300037A EE201300037A (et) 2014-04-15
EE05724B1 true EE05724B1 (et) 2014-10-15

Family

ID=22987016

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EEP201300037A EE05724B1 (et) 2001-01-05 2001-12-20 Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile
EEP200300318A EE05715B1 (et) 2001-01-05 2001-12-20 Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EEP200300318A EE05715B1 (et) 2001-01-05 2001-12-20 Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile

Country Status (51)

Country Link
US (7) US7037498B2 (et)
EP (4) EP2194067B1 (et)
JP (4) JP2004531217A (et)
KR (1) KR100830082B1 (et)
CN (2) CN1854157B (et)
AP (1) AP2072A (et)
AR (1) AR032028A1 (et)
AT (1) ATE464322T1 (et)
AU (1) AU2002231368C1 (et)
BG (3) BG66460B1 (et)
BR (2) BR0116728A (et)
CA (1) CA2433800C (et)
CR (4) CR7045A (et)
CU (1) CU23447B7 (et)
CZ (1) CZ301712B6 (et)
DE (1) DE60141855D1 (et)
DK (1) DK1399483T3 (et)
DZ (1) DZ3494A1 (et)
EA (1) EA012079B3 (et)
EC (1) ECSP034711A (et)
EE (2) EE05724B1 (et)
ES (1) ES2344592T3 (et)
GE (1) GEP20084484B (et)
GT (1) GT200100257A (et)
HK (1) HK1203521A1 (et)
HN (1) HN2001000283A (et)
HR (2) HRP20030627A2 (et)
HU (1) HUP0302525A2 (et)
IL (2) IL156661A0 (et)
IS (1) IS2790B (et)
MA (1) MA26040A1 (et)
ME (1) ME00502B (et)
MX (2) MX349009B (et)
MY (1) MY143465A (et)
NO (1) NO339789B1 (et)
NZ (2) NZ569856A (et)
OA (1) OA12589A (et)
PA (1) PA8535501A1 (et)
PE (1) PE20020801A1 (et)
PL (3) PL224873B1 (et)
PT (1) PT1399483E (et)
RS (1) RS51373B (et)
SG (1) SG138469A1 (et)
SK (1) SK287954B6 (et)
SV (1) SV2007000775A (et)
TN (1) TNSN01177A1 (et)
TW (1) TWI324609B (et)
UA (1) UA87804C2 (et)
UY (2) UY27087A1 (et)
WO (1) WO2002053596A2 (et)
ZA (1) ZA200305995B (et)

Families Citing this family (307)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ME00502B (me) 2001-01-05 2011-10-10 Amgen Fremont Inc Antitjela za insulinu sličan receptor faktora i rasta
BRPI0210579B8 (pt) * 2001-06-26 2021-05-25 Amgen Fremont Inc anticorpo e composição farmacêutica
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
ES2283759T3 (es) * 2002-01-18 2007-11-01 Pierre Fabre Medicament Anticuerpos anti-igf-ir y sus aplicaciones.
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US6936427B2 (en) * 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
CA2486007C (en) 2002-05-15 2011-11-22 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
CN100422316C (zh) 2002-05-24 2008-10-01 先灵公司 抗胰岛素样生长因子受体(igfr)的人源中和抗体
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
EP1551453A4 (en) * 2002-06-17 2007-04-25 Us Gov Health & Human Serv SPECIFICITY GRAFTING OF A MICE RESPONSE TO A HUMAN FRAME
AU2003275240A1 (en) * 2002-09-24 2004-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for soluble cpg15
KR20050109489A (ko) * 2003-02-13 2005-11-21 화이자 프로덕츠 인크. 항-인슐린양 성장인자 ｉ 수용체 항체의 용도
EP1603948A1 (en) * 2003-03-14 2005-12-14 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
CA2519113C (en) * 2003-04-02 2012-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EP1479695B1 (en) * 2003-05-14 2010-02-17 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody specific for lipopolysaccharides (LPS) of serotype IATS O6 of Pseudomonas aeruginosa
AR046071A1 (es) * 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
EA200600234A1 (ru) * 2003-08-13 2006-08-25 Пфайзер Продактс Инк. Модифицированные igf - 1r антитела человека
CA2540138C (en) * 2003-09-24 2013-07-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Recombinant antibody against human insulin-like growth factor
WO2005032476A2 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for cpg15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
CA2545755A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
PE20050928A1 (es) * 2003-11-21 2005-11-08 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti-igfr1
CA2548065A1 (en) * 2003-12-08 2005-07-07 Immunogen, Inc. Anti-igf-i receptor antibody
EP1778270A4 (en) * 2004-05-05 2009-09-02 Merrimack Pharmaceuticals Inc BIS-SPECIFIC BINDER FOR MODULATING BIOLOGICAL ACTIVITY
EP2322217A3 (en) * 2004-07-16 2011-09-28 Pfizer Products Inc. Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-IGF-1R antibody
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
ES2356830T3 (es) * 2004-12-03 2011-04-13 Schering Corporation Biomarcadores para preselección de pacientes para terapia de anti-igf-1r.
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
NZ562453A (en) 2005-03-31 2010-04-30 Agensys Inc Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
MX2007012896A (es) * 2005-04-15 2007-12-10 Schering Corp Metodos y composiciones para tratamiento o prevencion de cancer.
NZ562234A (en) 2005-04-26 2009-09-25 Pfizer P-cadherin antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
EA012801B1 (ru) * 2005-06-14 2009-12-30 Эмджен Инк. Самобуферирующиеся композиции белков
EP1896505A2 (en) * 2005-06-15 2008-03-12 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
DK2100618T3 (en) 2005-06-17 2014-03-03 Imclone Llc Anti-PDGFR alpha antibody for use in the treatment of metastatic bone cancer
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) * 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
DOP2006000195A (es) 2005-09-07 2017-08-15 Amgen Fremont Inc Anticuerpos monoclonales humanos para la quinasa-1 tipo receptor de activina
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
US7820165B2 (en) 2005-11-21 2010-10-26 Merck Serono, S.A. Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
KR101372690B1 (ko) 2005-12-13 2014-03-17 아스트라제네카 아베 인슐린 유사 성장 인자에 특이적인 결합 단백질 및 이의용도
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
JP5554925B2 (ja) 2006-01-20 2014-07-23 セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド ヒト非小細胞肺癌における転座及び変異体ｒｏｓキナーゼ
EP1984011A4 (en) 2006-02-03 2010-08-18 Imclone Llc IGF-IR ANTAGONISTS AS AUXILIARIES FOR THE TREATMENT OF PROSTATE CANCER
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
BRPI0709843A2 (pt) * 2006-03-28 2011-07-26 Biogen Idec Inc anticorpos de anti-igf-1r e usos dos mesmos
EP1998806A1 (en) * 2006-03-28 2008-12-10 F. Hoffmann-Roche AG Anti-igf-1r human monoclonal antibody formulation
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
HUE035732T2 (en) 2006-04-14 2018-05-28 Cell Signaling Technology Inc Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
WO2007132307A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Pfizer Products Inc. Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
US20080112888A1 (en) 2006-06-30 2008-05-15 Schering Corporation Igfbp2 biomarker
MX2009006466A (es) 2006-12-13 2009-06-26 Schering Corp Metodos de tratamiento de cancer con inhibidores del receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina.
US20090068110A1 (en) * 2006-12-22 2009-03-12 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
KR20090114449A (ko) * 2007-02-14 2009-11-03 글락소 그룹 리미티드 Ｉｇｆ-ⅰｒ에 대한 항체
EP2126565B1 (en) * 2007-02-27 2011-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the assessment of the inhibitory activity of antibodies against insulin-like growth factor i receptor
ES2707551T3 (es) * 2007-03-02 2019-04-04 Amgen Inc Métodos y composiciones para tratar enfermedades tumorales
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
JP5926487B2 (ja) 2007-04-13 2016-05-25 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド ＥｒｂＢ療法に耐性である癌を治療するための方法
WO2008144345A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
EP2190480A4 (en) * 2007-08-28 2013-01-23 Biogen Idec Inc ANTI-IGR-1R ANTIBODIES AND ITS USES
JP2010538012A (ja) * 2007-08-28 2010-12-09 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド Ｉｇｆ−１ｒの複数のエピトープに結合する組成物
WO2009029795A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
AU2008304111B2 (en) 2007-09-27 2014-04-24 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3072963B1 (en) 2007-10-18 2020-04-01 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
ES2962777T3 (es) 2007-11-15 2024-03-21 Amgen Inc Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral
CA2707773C (en) 2007-12-14 2017-01-10 Pfizer Inc. Binding molecules to the human ox40 receptor
WO2009080278A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Stability testing of antibodies
US20110104256A1 (en) * 2008-03-25 2011-05-05 Yaolin Wang Methods for treating or preventing colorectal cancer
AU2009241589B2 (en) 2008-04-29 2013-10-10 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX2010013236A (es) 2008-06-03 2011-02-24 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
KR20110031369A (ko) 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
JP5576370B2 (ja) 2008-08-06 2014-08-20 ファイザー・インク Ｃｈｋ−１阻害剤としての６置換２−ヘテロシクリルアミノピラジン化合物
US8318159B2 (en) 2008-12-12 2012-11-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
HUE035769T2 (en) 2009-02-12 2018-05-28 Cell Signaling Technology Inc Mutant ROS expression in human liver cancer
TR201910848T4 (tr) 2009-02-13 2019-08-21 Immunomedics Inc İntraselüler olarak ayrilabi̇len bi̇r bağa sahi̇p i̇mmunokonjugatlar
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
JP5719347B2 (ja) 2009-04-16 2015-05-20 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 癌治療のための組成物及び方法
DK2424895T3 (en) * 2009-04-27 2017-12-18 Novartis Ag Compositions and Methods for Increasing Muscle Growth
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP2604110B1 (en) 2009-07-08 2016-11-30 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US8586714B2 (en) 2009-09-01 2013-11-19 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8287865B2 (en) 2009-09-16 2012-10-16 Immunomedics, Inc. Class I anti-CEA antibodies and uses thereof
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
PL3202785T3 (pl) 2009-10-26 2024-08-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób wytwarzania glikozylowanej immunoglobuliny
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494070A2 (en) 2009-10-30 2012-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
ES2978177T3 (es) 2009-12-02 2024-09-06 Immunomedics Inc Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
FI3540066T3 (fi) 2010-02-08 2026-02-19 Regeneron Pharmaceuticals Inc Yhteisen kevytketjun hiiri
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
US9238080B2 (en) 2010-05-21 2016-01-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
SG194370A1 (en) 2010-06-07 2013-11-29 Amgen Inc Drug delivery device
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
BR112013000951A2 (pt) 2010-07-12 2016-05-17 Covx Technologies Ireland Ltd conjungados de anticorpo multifuncionais
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
US20120101108A1 (en) 2010-08-06 2012-04-26 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic Lymphoma Kinase In Kidney Cancer
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6105470B2 (ja) 2010-09-09 2017-03-29 ファイザー・インク ４−１ｂｂ結合分子
SG189104A1 (en) * 2010-09-28 2013-05-31 Nono Inc Nd2 peptides and methods of treating neurological disease
US20130273055A1 (en) * 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
EP2643694B1 (en) 2010-11-24 2018-01-03 Litron Laboratories Ltd. Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
MX2013008833A (es) 2011-02-02 2013-12-06 Amgen Inc Metodos y composiciones relacionadas con la inhibicion de receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (igf-1r).
JP2014511147A (ja) 2011-02-10 2014-05-12 ロシュ グリクアート アーゲー 改善された免疫療法
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
CA2830349C (en) 2011-03-17 2019-07-16 The University Of Birmingham Re-directed immunotherapy
DK2691155T3 (en) 2011-03-29 2019-03-04 Immunogen Inc PREPARATION OF MAYTANSINOID ANTIBODY CONJUGATES BY A STEP PROCEDURE
MY171008A (en) 2011-03-29 2019-09-23 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
US9480624B2 (en) 2011-03-31 2016-11-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
CA2833643A1 (en) * 2011-04-19 2012-10-26 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Monospecific and bispecific anti-igf-1r and anti-erbb3 antibodies
US20140178368A1 (en) 2011-04-19 2014-06-26 Leslie Lynne SHARP Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
EP4074355A1 (en) 2011-04-20 2022-10-19 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CA2831572C (en) 2011-05-02 2019-11-26 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
SMT202100357T1 (it) 2011-08-05 2021-07-12 Regeneron Pharma Topi di catena leggera universale umanizzata
HK1199883A1 (en) 2011-08-26 2015-07-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
JP5813880B2 (ja) * 2011-09-19 2015-11-17 カイマブ・リミテッド ヒトへの使用に合わせて作製された抗体、可変ドメインおよび鎖
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US20140309229A1 (en) 2011-10-13 2014-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
US9987428B2 (en) 2011-10-14 2018-06-05 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
BR112014009925B1 (pt) 2011-10-28 2022-09-20 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Construtores de polipeptídeos e seus usos
US9700619B2 (en) 2011-11-11 2017-07-11 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
US20140341922A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 SUN R & D Foundation Method for Overcoming Tolerance to Targeted Anti-Cancer Agent
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
SI2838998T1 (en) 2012-04-18 2018-04-30 Cell Signaling Technology, Inc. EGFR AND ROS1 PRI CRAK
HUE044612T2 (hu) 2012-05-04 2019-11-28 Pfizer Prosztata-asszociált antigének és vakcina-alapú immunterápiás rendek
JP6388576B2 (ja) 2012-06-21 2018-09-12 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｉｇｆ１ｒに結合する抗原結合タンパク質
US9181343B2 (en) 2012-07-19 2015-11-10 Redwood Bioscience Inc. Antibody specific for CD22 and methods of use thereof
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
BR112014030414A2 (pt) 2012-08-07 2018-05-29 Roche Glycart Ag combinação de um imunoconjugado, composição farmacêutica, uso de um imunoconjugado, métodos de tratamento e de estímulo, kit e invenção.
CA2874864C (en) 2012-08-14 2023-02-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
RU2018122734A (ru) 2012-10-04 2018-07-24 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент
TW202037609A (zh) 2012-11-01 2020-10-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
ES2860954T3 (es) 2012-11-21 2021-10-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014085490A1 (en) 2012-11-29 2014-06-05 Chemocentryx, Inc. Cxcr7 antagonists
PT2900277T (pt) 2012-12-13 2022-05-25 Immunomedics Inc Doses de imunoconjugados de anticorpos e sn-38 para melhorar a eficácia e diminuir a toxicidade
EA201591652A1 (ru) 2013-03-06 2016-02-29 Мерримак Фармасьютикалз, Инк. ТАНДЕМНЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ Fc-АНТИТЕЛА ПРОТИВ c-MET
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
TWI580452B (zh) 2013-03-15 2017-05-01 安美基公司 用於注射器之匣盒、注射器及使用包括自動注射器及匣盒之設備之方法
TWI592183B (zh) 2013-03-15 2017-07-21 安美基公司 本體輪廓可調適之自動注射器裝置
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
CA2904725C (en) 2013-03-15 2022-04-12 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
CA2904448A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Tariq Ghayur Dual specific binding proteins directed against il-1.beta. and/or il-17
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10850037B2 (en) 2013-03-22 2020-12-01 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
SG11201508923VA (en) 2013-04-29 2015-11-27 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
ES2862125T3 (es) * 2013-06-13 2021-10-07 Antisense Therapeutics Ltd Terapia combinada para acromegalia
TW201605896A (zh) * 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
WO2015049517A2 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2015061389A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
BR112016008946B1 (pt) 2013-10-24 2022-12-27 Amgen Inc Injetores e método para montar os injetor
JP6835590B2 (ja) 2014-01-12 2021-02-24 アイジーエフ オンコロジー、 エルエルシー インスリン様成長因子−１および上皮増殖因子を含む融合タンパク質およびそのバリアントならびにその使用
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
MX384646B (es) 2014-02-21 2025-03-14 Ibc Pharmaceuticals Inc Anticuerpo biespecífico que comprende al menos un sitio de unión para trop-2 y al menos sitio de unión para cd3 y su uso para inducir una respuesta inmune
WO2015130416A1 (en) 2014-02-25 2015-09-03 Immunomedics, Inc. Humanized rfb4 anti-cd22 antibody
EP3895528A1 (en) 2014-03-21 2021-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
WO2015171777A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
JP6671298B2 (ja) 2014-05-16 2020-03-25 アムジェン インコーポレイテッド Ｔｈ１及びｔｈ２細胞集団を検出するためのアッセイ
KR102710533B1 (ko) 2014-06-03 2024-09-26 암겐 인코포레이티드 제어 가능한 약물 전달 시스템 및 사용 방법
US9580495B2 (en) 2014-06-24 2017-02-28 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
PL3204018T3 (pl) 2014-10-07 2022-01-03 Immunomedics, Inc. Neoadiuwantowe zastosowanie koniugatów przeciwciało-lek
EP3943135B1 (en) 2014-10-14 2025-09-24 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
IL251822B2 (en) 2014-10-29 2023-03-01 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Variants of interferon alpha-2-b
RU2711930C2 (ru) 2014-11-19 2020-01-23 Иммуноджен, Инк. Способ получения конъюгатов агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP3233163B1 (en) 2014-12-19 2021-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
AU2016219772A1 (en) * 2015-02-22 2017-09-21 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind CD137
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
AU2016232715A1 (en) 2015-03-19 2017-09-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
US9797907B2 (en) 2015-04-22 2017-10-24 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating Trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
AU2016281622C1 (en) 2015-06-25 2021-11-18 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, Bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
EP3316885B1 (en) 2015-07-01 2021-06-23 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CA3000742A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
AU2016354009B2 (en) 2015-11-09 2021-05-20 R.P. Scherer Technologies, Llc Anti-CD22 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
WO2017136623A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Immunogen, Inc. Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
HRP20241557T1 (hr) 2016-03-10 2025-05-23 Acceleron Pharma Inc. Proteini koji vezuju receptor aktivina tipa 2 i njihova uporaba
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
ES2959783T3 (es) 2016-05-13 2024-02-28 Amgen Inc Conjunto de cubierta protectora de vial
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342B1 (en) 2016-07-01 2025-03-12 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3528787B1 (en) 2016-10-21 2026-01-07 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations and methods of making the same
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
KR102014066B1 (ko) 2017-01-06 2019-10-21 에이비엘바이오 주식회사 항 α-syn 항체 및 그 용도
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
EP3582825A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
WO2018165143A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
EP3592402A1 (en) 2017-03-07 2020-01-15 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
KR102619150B1 (ko) 2017-03-09 2023-12-27 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
CA3056011A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
DK3600491T3 (da) 2017-03-28 2023-10-23 Amgen Inc Stempelstang og sprøjtekonstruktionssystem samt fremgangsmåde
WO2018217669A1 (en) 2017-05-21 2018-11-29 Igf Oncology, Llc An insulin-like growth factor-chemotherapeputic conjugate for treating myelodysplastic syndrome
WO2018226565A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CA3063920A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
IL270784B2 (en) 2017-07-14 2023-11-01 Amgen Inc Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567B1 (en) 2017-08-18 2026-02-18 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
CN111511762B (zh) 2017-08-21 2025-05-06 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20210332141A1 (en) 2017-08-30 2021-10-28 Amgen Inc. Insulin-like growth factor-1 receptor (igf-1r) binding proteins and methods of use
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
IL272636B2 (en) 2017-10-06 2024-10-01 Amgen Inc Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
ES3055487T3 (en) 2017-10-09 2026-02-12 Amgen Inc Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
US11459293B2 (en) * 2017-10-27 2022-10-04 Immunebridge Inc. Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using derivatives of fluorene
MA50528A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Systèmes et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
MA50569A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Ensembles de remplissage-finition et procédés associés
US20200261648A1 (en) 2017-11-06 2020-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
JP7247174B2 (ja) 2017-11-10 2023-03-28 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスのプランジャ
MA50903A (fr) 2017-11-16 2021-05-12 Amgen Inc Auto-injecteur avec détection de décrochage et de point d'extrémité
MA50904A (fr) 2017-11-16 2020-09-23 Amgen Inc Mécanisme d'insertion d'aiguille pour dispositif d'administration de médicament
WO2019117684A1 (ko) 2017-12-14 2019-06-20 에이비엘바이오 주식회사 a-syn/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
CA3093853A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CN112351804A (zh) 2018-07-24 2021-02-09 安进公司 用于施用药物的输送装置
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
AU2019350660B2 (en) 2018-09-28 2024-09-26 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
TWI857975B (zh) 2018-10-02 2024-10-11 美商安進公司 具有內部力傳遞的用於藥物遞送之注射系統
AR116607A1 (es) 2018-10-05 2021-05-26 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con indicador de dosis
KR102848295B1 (ko) 2018-10-15 2025-08-20 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
AU2019359801B2 (en) 2018-10-15 2025-01-02 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
IL281908B2 (en) 2018-11-01 2025-06-01 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
MX2021006495A (es) * 2018-12-03 2021-07-06 Teijin Pharma Ltd Anticuerpo humanizado del receptor anti-igf-i.
AU2019398198B2 (en) 2018-12-12 2025-08-07 Chemocentryx, Inc. CXCR7 inhibitors for the treatment of cancer
KR20210105890A (ko) 2018-12-17 2021-08-27 레비토프 리미티드 트윈 면역 세포 인게이저
EP3958934B1 (en) 2019-04-24 2025-04-09 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
KR20220088529A (ko) 2019-05-14 2022-06-27 프로메테우스 바이오사이언시즈, 인크. Tl1a 환자 선택 방법, 시스템 및 장치
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
CN114450593A (zh) 2019-09-26 2022-05-06 美国安进公司 产生抗体组合物的方法
US20230133118A1 (en) 2020-05-13 2023-05-04 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
TW202229350A (zh) 2020-10-14 2022-08-01 美商維里迪恩醫療股份有限公司 用於治療甲狀腺眼病之組合物及方法
WO2022081824A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
JP2024503933A (ja) 2021-01-27 2024-01-29 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド Ｃｄ１６ａに対する単一ドメイン抗体およびその使用
AU2022233150A1 (en) * 2021-03-08 2023-09-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66e POLYPEPTIDES
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
WO2022239720A1 (ja) 2021-05-10 2022-11-17 公益財団法人川崎市産業振興財団 抗原への結合親和性を低減させた抗体
JP2024523779A (ja) 2021-05-21 2024-07-02 アムジェン インコーポレイテッド 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas
EP4384219A4 (en) 2021-08-10 2025-06-18 Viridian Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS, DOSAGES AND METHODS FOR THE TREATMENT OF THYROID EYE DISEASE
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
US20250145723A1 (en) * 2022-01-29 2025-05-08 Minghui Pharmaceutical (Hangzhou) Limited Antigen-binding protein and use thereof
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
TW202506724A (zh) * 2023-04-04 2025-02-16 大陸商南京正大天晴製藥有限公司 抗igf1r抗體及其用途
WO2024220916A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
TW202509078A (zh) 2023-07-07 2025-03-01 美商維里迪恩醫療股份有限公司 治療慢性甲狀腺眼病之方法
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ES2284161T3 (es) 1990-01-12 2007-11-01 Amgen Fremont Inc. Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
ES2139598T3 (es) 1990-07-10 2000-02-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de miembros de parejas de union especifica.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
AU664976B2 (en) 1990-08-29 1995-12-14 Gene Pharming Europe Bv Homologous recombination in mammalian cells
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP1279731B1 (en) 1991-03-01 2007-05-30 Dyax Corporation Process for the development of binding mini-proteins
US5658727A (en) 1991-04-10 1997-08-19 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
WO1992018154A1 (en) 1991-04-19 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Human bone derived insulin like growth factor binding protein
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
DE69229477T2 (de) 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
EP0592677B1 (en) 1992-02-18 2001-11-07 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha Beta-LACTAM COMPOUND AND CEPHEM COMPOUND, AND PRODUCTION THEREOF
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
MX9708026A (es) 1995-04-20 1997-11-29 Pfizer Derivados del acido arislfulfonil hidroxamico, composiciones que los contienen y uso de los mismos.
WO1996033266A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic dna deletions
EP0822830B1 (en) * 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
EP0861267A4 (en) * 1995-11-14 2000-02-02 Univ Jefferson INDUCTION AND RESISTANCE TO TUMOR GROWTH BY MEANS OF SOLUBLE IGF-1
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ES2183905T3 (es) 1995-12-20 2003-04-01 Hoffmann La Roche Inhibidores de metaloproteasa de matriz.
ES2169355T3 (es) 1996-03-05 2002-07-01 Astrazeneca Ab Derivados de 4-anilinoquinazolina.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) * 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
PE91098A1 (es) 1996-07-13 1999-01-15 Glaxo Group Ltd DERIVADOS DE PIRIDO[3,4-d]PIRIMIDINA
WO1998002434A1 (en) 1996-07-13 1998-01-22 Glaxo Group Limited Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
NZ333303A (en) 1996-07-18 2000-06-23 Lawrence Alan Reiter Phosphinate based inhibitors of matrix metalloproteases
KR20000068248A (ko) 1996-08-23 2000-11-25 디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이 아릴설포닐아미노 하이드록삼산 유도체
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
DE69738539T2 (de) 1996-12-03 2009-03-26 Amgen Fremont Inc. Vollkommen humane Antikörper die EGFR binden
BR9714266A (pt) 1997-01-06 2000-04-18 Pfizer Derivados de sulfona cìclicos.
DK0977733T3 (da) 1997-02-03 2003-11-24 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylaminohydroxamsyrederivater
WO1998034915A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
WO1998034918A1 (en) 1997-02-11 1998-08-13 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2289102A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
AU734009B2 (en) 1997-05-30 2001-05-31 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
NZ502309A (en) 1997-08-08 2002-02-01 Pfizer Prod Inc Aryloxyarylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives and pharmaceutical use
US6294532B1 (en) 1997-08-22 2001-09-25 Zeneca Limited Oxindolylquinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
CA2303830A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
ID23978A (id) 1997-11-11 2000-06-14 Pfizer Prod Inc Turunan-turunan tienopirimidin dan tienopiridin yang berguna sebagai zat-zat anti kangker
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
KR20010034554A (ko) 1998-03-03 2001-04-25 레이몬드, 엠. 위티 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
IL139934A0 (en) 1998-05-29 2002-02-10 Sugen Inc Pyrrole substituted 2-indolinone derivatives and pharmaceutical compositions containing the same
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
ATE260255T1 (de) 1998-11-05 2004-03-15 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidine-2-carbonsäure- hydroxamidderivate
EE05483B1 (et) 1998-12-23 2011-10-17 Pfizer, Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
AU3579200A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Saltech I Goteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic productionof insulin-like growth factor-1
TR200603997T1 (tr) 1999-03-25 2010-01-21 Abbott Gmbh & Co. Kg Beşeri IL-12'yi bağlayan beşeri antikorlar ve bunları üretmek için yöntemler.
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US7329745B2 (en) 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
ME00502B (me) * 2001-01-05 2011-10-10 Amgen Fremont Inc Antitjela za insulinu sličan receptor faktora i rasta
BRPI0210579B8 (pt) 2001-06-26 2021-05-25 Amgen Fremont Inc anticorpo e composição farmacêutica
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EA200600234A1 (ru) * 2003-08-13 2006-08-25 Пфайзер Продактс Инк. Модифицированные igf - 1r антитела человека
EA012872B1 (ru) * 2004-01-09 2009-12-30 Пфайзер Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ MAdCAM
US10181126B2 (en) 2012-03-13 2019-01-15 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
TWI324609B (en) 2010-05-11
US7037498B2 (en) 2006-05-02
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
DE60141855D1 (de) 2010-05-27
IL156661A (en) 2008-11-26
EE200300318A (et) 2003-10-15
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
US7700742B2 (en) 2010-04-20
CU23447B7 (es) 2009-10-16
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
SV2007000775A (es) 2007-03-15
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
ZA200305995B (en) 2004-08-04
PL366340A1 (en) 2005-01-24
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
CR10786A (es) 2009-06-04
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
US7815907B2 (en) 2010-10-19
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
US8642037B2 (en) 2014-02-04
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
MX337162B (es) 2016-02-15
UY27087A1 (es) 2002-06-20
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
NO20033074L (no) 2003-07-04
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
ECSP034711A (es) 2003-10-28
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
US7982024B2 (en) 2011-07-19
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
CN1564829A (zh) 2005-01-12
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
BG108037A (bg) 2005-04-30
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
BG112197A (bg) 2016-05-31
GT200100257A (es) 2002-09-02
BR0116728A (pt) 2005-04-12
PT1399483E (pt) 2010-07-20
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
RS51373B (sr) 2011-02-28
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
NO339789B1 (no) 2017-01-30
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
PA8535501A1 (es) 2003-07-28
MY143465A (en) 2011-05-13
CN1854157A (zh) 2006-11-01
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
GEP20084484B (en) 2008-09-25
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
US9234041B2 (en) 2016-01-12
NZ569856A (en) 2010-03-26
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
CR10134A (es) 2010-09-14
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
SG138469A1 (en) 2008-01-28
IS6866A (is) 2003-07-04
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
OA12589A (en) 2006-06-08
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
IL156661A0 (en) 2004-01-04
EE201300037A (et) 2014-04-15
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
ME00502B (me) 2011-10-10
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
NZ527302A (en) 2006-10-27
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
AP2072A (en) 2009-12-10
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
UY35948A (es) 2016-08-31
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
YU54203A (sr) 2006-03-03
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
CR20140001A (es) 2014-02-05
EE05715B1 (et) 2014-06-16
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
CN1330668C (zh) 2007-08-08
MX349009B (es) 2017-07-06
AR032028A1 (es) 2003-10-22
CR7045A (es) 2005-09-02
CN1854157B (zh) 2013-01-02
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
EP2194067B1 (en) 2017-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9234041B2 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
US7371378B2 (en) Modified human IGF-IR antibodies
AU2002231368A1 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
RS54203B1 (sr) Preparati za primenu gelova za nokte koji se lako mogu ukloniti i postupci njihove upotrebe
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor

Legal Events

Date Code Title Description
MA4A Abandonment or withdrawal

Effective date: 20181220