MX2012004682A - Metodo para la produccion de una inmunoglobulina glicosilada. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para remover un medio líquido (112) de un envase (118). El método comprende los siguientes pasos: a) proporcionar un dispositivo de remoción (116) que tiene una cámara interior cerrada (122) que puede esterilizarse, en donde se recibe al menos un elemento de aguja (138, 140) en el interior de la cámara (122), en donde la cámara (122) está cerrada por al menos un elemento de sellado (126) que puede perforarse, b) proveer el envase (118) que contiene el medio líquido (112), en donde el envase (118) comprende al menos una pared del envase (162) que tiene por lo menos un segmento (148) que puede perforarse, c) conectando el dispositivo de remoción (116) y el envase (118), en donde el segmento (148) que puede perforarse y el elemento de sellado (126) que pueden perforarse están interconectados de tal forma que se crea al menos un área protegida (166) entre el segmento (148) que puede perforarse y el elemento de sellado (126) que puede perforarse, en donde el área protegida (166) se cierra por medio de la conexión a un sustancialmente bajo conteo de gérmenes con relación al entorno (170), y d) perforar el elemento de sellado (126) que puede perforarse y el segmento (148) que puede perforarse por el elemento de aguja (138, 140), en donde el elemento de aguja (138, 140) penetra el área protegida (166).

Description

METODO PARA LA PRODUCCION DE UNA INMUNOGLOBULINA GLICOSILADA Campo de la Invención En la presente se reporta un método en el campo de producción de inmunoglobulina en células, por lo que el patrón de glicosilacion de la inmunoglobulina producida puede ser modificado con base en las condiciones de cultivo.

Antecedentes de la Invención En años recientes, la producción de inmunoglobulinas se ha incrementado constantemente y es probable que las inmunoglobulinas sean el grupo más grande de agentes terapéuticos disponibles para el tratamiento de varias enfermedades en el futuro cercano. El impacto de las inmunoglobulinas surge de su especificidad, que comprende su función de reconocimiento de objetivo específico y unión, así como la activación de efectos específicos concurrentemente con o después de unión a antígeno/Fc-receptor .

El reconocimiento de objetivo específico y unión es mediado por la región variable de la inmunoglobulina. Otras partes de la molécula de inmunoglobulina, de la cual se originan los efectos, son modificaciones postraduccionales , tales como el patrón de glicosilacion. Las modificaciones postraduccionales tienen influencia sobre la eficacia, estabilidad, potencial inmunogénico, unión, etc., de una Ref. 228639 inmunoglobulina . En conexión con las mismas, se tiene que hacer frente a la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) , citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) e inducción de apoptosis.

Se ha reportado que el patrón de glicosilación de las inmunoglobulinas, es decir, la composición de sacárido y el número de glicoestructuras unidas, tiene una fuerte influencia en las propiedades biológicas (véase, v.gr., Jefferis, R . , Biotechnol . Prog. 21 (2005) 11-16). Las inmunoglobulinas producidas por células de mamífero contienen 2-3% en masa de carbohidratos (Taniguchi, T . , et al, Biochem. 24 (1985) 5551-5557). Esto es equivalente, v.gr., en una inmunoglobulina de clase G (IgG) a 2.3 residuos de oligosacárido en una IgG de origen de ratón (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394) y a 2.8 residuos de oligosacárido en una IgG de origen humano (Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457), de donde generalmente dos están ubicados en la región Fe y el resto en la región variable (Saba, J. A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31) .

En la región Fe de una inmunoglobulina de clase G, los residuos de oligosacárido pueden ser introducidos por N-glicosilación en el residuo de aminoácido 297, que es un residuo de asparagina (denotado como Asn297) . Youings et al., han mostrado que existe un sitio de N-glicosilación adicional en 15% a 20% de moléculas de IgG policlonales en la región Fab (Youings, A., et al., Biochem. J. , 314 (1996) 621-630; véase, v.gr., también Endo, T., et al., Mol. Immunol . 32 (1995) 931-940) . Debido al procesamiento de oligosacáridos no homogéneo, es decir, asimétrico, existen isoformas múltiples de una inmunoglobulina con diferente patrón de glicosilación (Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845; Ip, C.C., et al, Arch. Biochem. Biophys . 308 (1994) 387-399; Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748). Concurrentemente, la estructura y distribución de los oligosacáridos es altamente reproducible (es decir, no aleatoria) y específica del sitio (Dwek, R.A. , et al, J. Anat. 187 (1995) 279-292).

Algunas características de una inmunoglobulina están directamente enlazadas a la glicosilación de la región Fe (véase, v.gr., Dwek, R.A. , et al, J. Anat. 187 (1995) 279-292; Lund, J. , et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969; Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119; right, A. y Morrison, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402), tales como, por ejemplo, estabilidad térmica y solubilidad (West, CM. , Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20), antigenicidad (Turco, S.J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339) , inmunogenicidad (Bradshaw, J. P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351; Feizi, T. y Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987) 1- 11; Schauer, R. , Adv. Exp. ed. Biol . 228 (1988) 47-72), tasa de aclaramiento/vida media circulatoria (Ashwell, G. y Harford, J. , Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554; McFarlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135; Baenziger, J.U. , Am. J. Path. 121 (1985) 382- 391; Chan, V.T. y Wolf, G. , Biochem. J. 247 (1987) 53-62; right, A. , et al . , Glycobiology 10 (2000) 1347-1355; Rifai, A. , et al , J. Ex . Med. 191 (2000) 2171-2182; Zukier, L.S., et al . , Cáncer Res. 58 (1998) 3905-3908), y actividad específica biológica (Jefferis, R. y Lund, J. , en Antibody Engineering, ed. de Capra, J.D., Chem. Immunol . Basel, Karger, 65 (1997) 111-128) .

Se han investigado los factores que influyen en el patrón de glicosilación, tales como, por ejemplo, la presencia de suero de ternera fetal en el medio de fermentación (Gawlitzek, M. , et al, J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131) , condiciones reguladoras de pH (Muthing, J. , et al, Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334), concentración de oxígeno disuelto (Saba, J.A. , et al, Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31; Kunkel, J.P., et al, J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71; Lin, A. A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350) , posición y conformación del oligosacárido así como tipo de célula hospedera y estado de crecimiento celular (Hahn, T.J. y Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987; Jenkins, N. , et al., Nat . Biotechnol. 14 (1996) 975-981), metabolismo de azúcar de nucleótide celular (Hills, A.E., et al, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251), limitaciones de nutrientes (Gawlitzek, M., et al, Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544; Hayter, P.M., et al, Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335), especialmente restricción de glucosa (Tachibana, H., et al, Cytotechnology 16 (1994) 151-157), y pH extracelular (Borys, M.C., et al, Bio/Technology 11 (1993) 720-724) .

Las estructuras de oligomanosa incrementadas, así como estructuras de oligosacárido truncadas han sido observadas por la expresión recombinante de inmunoglobulinas v.gr., en células de mieloma de NSO (Ip, C.C., et al, Arch. Biochem. Biophys . 308 (1994) 387-399; Robinson, D.K., et al, Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735). Bajo condiciones de agotamiento de glucosa, variaciones en glicosilación, tales como unión de oligosacáridos precursores pequeños o ausencia completa de porciones de oligosacárido, se han observado en células CHO, células 3T3 de murino, células de hepatoma de rata, células de riñon de rata y células de mieloma de murino (Rearick, J.I., et al, J. Biol . Chem. 256 (1981) 6255-6261; Davidson, S.K. y Hunt, L.A., J. Gen. Virol . 66 (1985) 1457-1468; Gershman, H. y Robbins, P. ., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780; Baumann, H. y Jahreis, G.P., J. Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949; Strube, K.-H., et al, J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771 ; Stark, N.J. y Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609) . Una estrategia basada en concentraciones bajas de glutamina/glucosa fue reportada por Wong, D.C.F., et al, Biotechnol . Bioeng. 89 (2005) 164-177.

La solicitud de patente japonesa JP 62-258252 reporta un cultivo de perfusión de células de mamífero, mientras que el documento US 5,443,968 reporta un método de cultivo intermitente con alimentación para células secretoras de proteína. En el documento WO 98/41611, un método para cultivar células se reporta efectivo para adaptar las células a un estado metabólico caracterizado por la producción baja de lactato. Un método para cultivar células a fin de producir sustancias se reporta en el documento WO 2004/048556. Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534, reporta que las células de mamífero, cuando se incuban en ausencia de estructuras que contienen mañosa-5 de transferencia de glucosa en lugar de estructuras que contienen mañosa- 9 a proteínas. La dependencia de pC02 influye durante la limitación de glucosa sobre el crecimiento de células CHO, metabolismo y producción de IgG es reportado por Takuma, S., et al. en Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488.

Sumario de la Invención Se ha encontrado que la cantidad de la glicoestructura de manosa-5 en el patrón de glicosilación de un polipéptido producido por una célula eucariótica puede ser modificada con base en la cantidad de glucosa provista a la célula en el proceso de cultivo. Al reducir la cantidad de glucosa disponible, v.gr., al cambiar el valor de DGL de 1.0 a valores menores de, v.gr., 0.8, 0.6, 0.5, 0.4 ó 0.2, se puede obtener una modificación en la cantidad de la glicoestructura de manosa-5 en el patrón de glicosilación . El valor de DGL o respectivamente la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo tiene que mantenerse constante y a un valor reducido definido por unidad de tiempo .

Un primer aspecto como se reporta en la presente es un método para la producción de un polipéptido, en una modalidad de una inmunoglobulina, en una célula eucariótica, que comprende los siguientes pasos: a) proveer una célula eucariótica que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido, b) cultivar la célula bajo condiciones en donde el grado de limitación de glucosa (DGL, por sus siglas en inglés) se mantiene constante y en donde el DGL es menor que 0.8, y c) recuperar el polipéptido del cultivo, en donde la fracción del polipéptido con una glicoestructura de 5-manosa es 10% o menos de la suma que comprende la cantidad del polipéptido con una glicoestructura de 5-manosa, la cantidad de la isoforma G(0) del polipéptido, la cantidad la isoforma G(l) del polipéptido y la cantidad de la isoforma G(2) del polipéptido.

En una modalidad, el DGL se mantiene constante en el intervalo de 0.8 a 0.2. En una modalidad adicional, el DGL se mantiene constante en el intervalo de 0.6 a 0.4. En otra modalidad, la fracción del polipéptido con una glicoestructura de 5-manosa es 8% o menos de la suma que comprende el polipéptido con una glicoestructura de 5-manosa, la isoforma G(0) del polipéptido, la isoforma G(l) del polipéptido, y la isoforma G(2) del polipéptido. En otra modalidad adicional, el polipéptido es una inmunoglobulina, en una modalidad una inmunoglobulina de clase G o E.

Otro aspecto que se reporta aquí es un método para la producción de una inmunoglobulina que comprende los siguientes pasos: a) proveer una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina, b) cultivar la célula en un medio de cultivo en donde la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitado a menos de 80% de la cantidad que podría ser utilizada al máximo por las células en el medio de cultivo por unidad de tiempo, y c) recuperar la inmunoglobulina de las células o el medio de cultivo.

En una modalidad, la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor en el intervalo de 80% a 20%.

En una modalidad adicional, el intervalo es de 60% a 40%. En otra modalidad, las células en el medio de cultivo son las células viables en el medio de cultivo.

En una modalidad de los aspectos como se reporta en la presente, la célula eucariótica se selecciona de células CHO, células NSO, células HEK, células BHK, células de hibridoma, células PER.C6®, células de insecto o células Sp2/0. En una modalidad, la célula eucariótica es una célula de ovario de hámster chino (CHO) . En otra modalidad de los aspectos como se reporta en la presente, el cultivo es a un valor de pH en el intervalo de aproximadamente pH 7.0 a aproximadamente pH 7.2.

En otra modalidad adicional de los aspectos como se reporta en la presente, el cultivo es un cultivo continuo o intermitente con alimentación. Los métodos pueden comprender en otra modalidad un paso final de purificar el polipéptido. En otra modalidad adicional, la célula es cultivada durante seis a veinte días o durante seis a quince días. En una modalidad adicional, la célula es cultivada durante seis a ocho días.

Otro aspecto como se reporta en la presente es una composición que comprende una inmunoglobulina, en donde la composición se ha preparado con un método como se reporta en la presente.

En una modalidad, la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R. En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-IL-6R comprende Tocilizumab. En otra modalidad, la glicoestructura de 5-manosa unida al anticuerpo anti-IL-6R es 8% o menos. En una modalidad adicional, la glicoestructura de 5-manosa es 6% o menos. En otra modalidad, la glicoestructura de 5-manosa es 4% o menos. En una modalidad adicional, la glicoestructura G(0) unida al anticuerpo anti-IL-6R está en el intervalo de 40% a 46% y la glicoestructura G(2) unida al anticuerpo anti-IL-6R está en el intervalo de 9% a 11%.

Breve Descripción de las Figuras Figuras la-lb. La densidad de células viables Figura la y los perfiles de viabilidad de las células Figura Ib en el modo intermitente con alimentación mediante el uso del control de DGL; círculo abierto: densidad de las células inicial de 8 x 105 células/ml; triángulo relleno: densidad de las células inicial de 10 x 105 células/ml; cuadros abiertos: densidad de las células inicial de 12 x 105 células/ml.

Figura 2. Cursos de tiempo de DGL en el modo intermitente con alimentación en producción de inmunoglobulina; círculo: densidad de células inicial de 8 x 105 células/ml; triángulo: densidad de células inicial de 10 x 105 células/ml; cuadro: densidad de células inicial de 12 x 105 células/ml.

Figura 3. Perfiles de alimentación basados en DGL por el modo intermitente con alimentación en producción de inmunoglob lina; círculos: densidad de células inicial de 8 x 105 células/ml; triángulo: densidad de células inicial de 10 x 105 células/ml; cuadro: densidad de células inicial de 12 x 105 células/ml.

Figura . Perfiles de producción de inmunoglobulina por el modo intermitente con alimentación en el control de DGL; círculos abiertos: densidad de células inicial de 8 x 105 células/ml; triángulo relleno: densidad de células inicial de 10 x 105 células/ml; cuadro abierto: densidad de células inicial de 12 x 105 células/ml; círculo pequeño relleno: método de alimentación constante: FR = 0.02 g glucosa/hr (control) .

Figura 5. Curso de tiempo de DGL durante un cultivo intermitente con alimentación de una célula: diamante: alimentación diaria con alimentación individual, cuadro: alimentación diaria con alimentación dual; triángulo: alimentación de perfil con alimentación individual; X: alimentación de perfil con alimentación dual.

Descripción Detallada de la Invención En la presente se reporta un método para la producción de una inmunoglobulina que comprende los siguientes pasos: a) cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo a un DGL constante de menos de 0.8 (es decir, la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo es constante y 80% o menos de la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo) , y b) recuperar la inmunoglobulina de las células o el medio de cultivo.

Con el método como se reporta en la presente, se puede obtener una inmunoglobulina en donde la cantidad de la inmunoglobulina con una glicoestructura de 5 -mañosa depende del valor de DGL adjuntado, y en donde la cantidad es la fracción de la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glicoestructura de 5-manosa, y de la isoforma de inmunoglobulina G(0), de de la isoforma de la inmunoglobulina G(l), y de la isoforma de la inmunoglobulina G(2). En una modalidad, el DGL es de 0.8 a 0.2. En esta modalidad, la fracción es 10% o menos. En otra modalidad, el DGL es de 0.6 a 0.4. En esta modalidad, la fracción es 6% o menos. Con el método como se reporta en la presente, se puede obtener una inmunoglobulina en donde la fracción de la inmunoglobulina que tiene una glicoestructura de 5-manosa es 10% o menos de la suma que comprende la cantidad de la inmunoglobulina con una glicoestructura de 5-manosa, la cantidad de la isoforma de la inmunoglobulina G(0), la cantidad de la isoformá de la inmunoglobulina G(l) y la cantidad de la isoforma de la inmunoglobulina G(2). En otra modalidad, la fracción es el % de fracción de área determinado en un método de cromatografía de líquidos. En una modalidad, el DGL se mantiene en el intervalo de 0.8 a 0.2. En otra modalidad, el DGL se mantiene en el intervalo de 0.6 a 0.2. En otra modalidad adicional, el DGL se mantiene en el intervalo de 0.6 a 0.4. En una modalidad la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo es la cantidad promedio de glucosa que es utilizada en un cultivo en el cual todos los compuestos están disponibles en exceso, es decir, ningún compuesto limita el crecimiento de la célula, determinado con base en por lo menos cinco cultivos. En una modalidad, la fracción se determina el día siete del cultivo.

Los métodos y técnicas conocidos por un experto en la técnica, que son útiles para llevar a cabo la presente invención, se describen, v.gr., en Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocole in Molecular Biology, Volúmenes I a III (1997), iley and Sons; Sambrook, J., et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Glover, N.D. (ed. ) , DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (1985); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1986); Miller, J.H. y Calos, M.P. (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987); atson, J.D., et al., Recombinant DNA, segunda edición, N.Y., W.H. Freeman and Co (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J. (ed.), Cell Biology, segunda edición, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Techniques, segunda edición, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987).

El uso de tecnología de AND recombinante permite la producción de numerosos derivados de un polipéptido. Esos derivados, por ejemplo, pueden ser modificados en posiciones de aminoácido individuales o varias posiciones de aminoácido por sustitución, alteración o intercambio. La derivación, por ejemplo, se puede llevar a cabo por medio de mutagénesis dirigida al sitio. Esas variaciones pueden ser realizadas fácilmente por un experto en la técnica (Sambrook, J., et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (2001) ; Hames, B.D. y Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Inglaterra) .

El término "ácido nucleico" denota una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente o que no ocurre naturalmente parcialmente o completamente, que codifica un polipéptido. El ácido nucleico puede ser construido de fragmentos de ADN que son ya sea aislados o sintetizados por medios químicos. El ácido nucleico puede ser integrado en otro ácido nucleico, v.gr. , en un plásmido de expresión o el genoma/cromosoma de una célula eucariótica. El término "plásmido" incluye plásmidos de lanzadera y de expresión. Generalmente, el plásmido también comprenderá una unidad de propagación procariótica que comprende un origen de replicación (v.gr., el origen de replicación ColEl) y un marcador seleccionable (v.gr., gen de resistencia a ampicilina o tetraciclina) , para replicación y selección, respectivamente, del plásmido en células procarióticas . Para un experto en la técnica, los procedimientos y métodos son bien conocidos para convertir una secuencia de aminoácidos, v.gr., de un polipéptido, en un ácido nucleico correspondiente que codifica la secuencia de aminoácidos respectiva. Por lo tanto, un ácido nucleico se caracteriza por su secuencia de ácido nucleico que consiste de nucleótidos individuales y similares por la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el mismo.

El término "cásete de expresión" denota un ácido nucleico que contiene los elementos necesarios para expresión y opcionalmente para secreción de por lo menos el gen estructural contenido en/desde una célula, tal como un promotor, sitio de poliadenilación, y regiones 3 ' - y 5 ' -no traducidas .

El término "gen" denota v.gr., un segmento en un cromosoma o en un plásmido, que es necesario para la expresión de un polipéptido. Además de la región codificante, un gen comprende otros elementos funcionales que incluyen un promotor, introñes, y uno o más terminadores de transcripción. Un "gen estructural" denota la región codificante de un gen sin una secuencia de señal.

El término "expresión" denota la transcripción y traducción de un gen estructural dentro de una célula. El nivel de transcripción de un gen estructural en una célula se puede determinar sobre la base de la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula. Por ejemplo ARNm transcrito de un ácido nucleico seleccionado puede ser cuantificado por PCR o por hibridación de Northern (véase, v.gr., Sambrook et al. (supra) ) . Un polipéptido codificado por un ácido nucleico puede ser cuantificado por varios métodos, v.gr., por ELISA, por determinación de la actividad biológica del polipéptido o por métodos que son independientes de la actividad tales como Western blotting o radioinmunoensayo, al usar antibióticos que reconocen y se unen al polipéptido (véase, v.gr., Sambrook et al. (supra)).

El término "célula" denota una célula en la cual un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en una modalidad de un polipéptido heterólogo ha sido introducida. El término "células" incluye tanto células procarióticas usadas para la propagación de plásmidos/vectores como células eucarióticas usadas para la expresión del gen estructural. En una modalidad, una célula eucariótica para la expresión de una inmunoglobulina es una célula de mamífero. En otra modalidad, la célula de mamífero se selecciona de células CHO, células NSO, células Sp2/0, células COS, células HEK, células BHK, células PER.C6® y células de hibridoma. Una célula eucariótica se puede seleccionar además de células de insecto, tales como células de oruga ( {Spodoptera frugiperda , células sf ) , células de la mosca de la fruta ( (Drosophila melanogaster) , células de mosquito (Aedes aegypti, Aedes albopictus) , y células del gusano de ceda (Bombyx Mori) , y similares .

El término "polipéptido" denota un polímero de residuos de aminoácido unidos por enlaces peptídicos, ya sean producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos pueden referirse como "péptidos" . Los polipéptidos de más de 100 residuos de aminoácidos o agregados covalentes y no covalentes que comprenden más de un polipéptido pueden referirse como "proteínas". Los polipéptidos pueden comprender componentes que no son aminoácido, tales como grupos carbohidrato. Los componentes que no son aminoácido se pueden añadir al polipéptido por la célula en la cual es producido el polipéptido, y pueden variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen aquí en términos de su secuencia de aminoácido en la dirección N-terminal a C-terminal . Adiciones a los mismos tales como grupos carbohidrato, por lo general no son especificadas, pero pueden sin embargo pueden estar presentes.

El término "ADN heterólogo" o "polipéptido heterólogo" denota una molécula de ADN o un polipéptido, o una población de moléculas de ADN o una población de polipéptidos , que no existen naturalmente dentro de una célula dada. Las moléculas de ADN heterólogas a una célula particular pueden contener ADN derivado de la especie de célula (es decir, ADN endógeno) siempre que el ADN se combine con ADN que no sea del hospedero (es decir, ADN exógeno) . Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN que no es de la célula, v.gr., que codifica un polipéptido, operablemente enlazado a un segmento de ADN de la célula, v.gr., que comprende un promotor, se considera que es una molécula de ADN heteróloga. Asimismo, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen estructural endógeno operablemente enlazado a un promotor exógeno. Un polipéptido codificado por una molécula de ADN heteróloga es un polipéptido "heterólogo" .

El término "plásmido de expresión" denota un ácido nucleico que comprende por lo menos un gen estructural que codifica un polipéptido que ha de ser expresado. Típicamente, un plásmido de expresión que comprende una unidad de propagación de plásmido procariótico, que incluye un origen de replicación y un marcador de selección, v.gr. , para E. coli, un marcador de selección eucariótico, y uno o más casetes de expresión para la expresión del gen (es) estructural (es) de interés cada vez, cada uno comprende un promotor, por lo menos un gen estructural, y un terminador de transcripción que incluyen una señal de poliadenilación. La expresión de gen usualmente se coloca bajo el control de un promotor, y el gen estructural ha de ser "operablemente enlazado" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor de núcleo están operablemente enlazados si el elemento regulador modula la actividad del promotor de núcleo.

El término "polipéptido aislado" denota un polipéptido que es esencialmente libre de componentes celulares asociados, tales como carbohidrato, lípido u otras impurezas proteináceas y no proteináceas , que no están covalentemente asociadas con el polipéptido. Típicamente, una preparación de un polipéptido contiene en ciertas modalidades el polipéptido en una forma altamente purificada, es decir, por lo menos aproximadamente 80% puro, por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, más de 95% puro o más de 99% puro. Una forma de mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por la apariencia de una sola banda después de electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-page) de la preparación y tinción del gel con azul brillante de Coomassie. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros, o formas alternativamente glicosiladas o derivadas.

Las inmunoglobulinas en general son asignadas a cinco clases diferentes: IgA ( inmunoglobulina de clase A), IgD, IgE, IgG y IgM. Entre estas clases, las inmunoglobulinas difieren en su estructura global y/o secuencia de aminoácidos pero tienen los mismos bloques de construcción. Las inmunoglobulinas completas son construidas de dos pares de cadenas de polipéptido, cada una de las cuales comprende una cadena de polipéptido ligera de inmunoglobulina (cadena ligera: corta) y una cadena de polipéptido pesada de inmunoglobulina (cadena pesada: corta) . A su vez, las cadenas comprenden una región variable y una región constante. En una cadena ligera, ambas regiones consisten de un dominio, mientras que en una cadena pesada la región variable consiste de un dominio y la región constante comprende hasta cinco dominios (en la dirección N-terminal a C-terminal) : el dominio CH1-, opcionalmente el dominio de región de gozne, el dominio CH2-, el dominio CH3-, y opcionalmente el dominio CH4-. Una inmunoglobulina puede ser bisecada en una región Fab o una región Fe. La cadena ligera entera, el dominio variable de cadena pesada y el dominio CH1- se refieren como región Fab (región de unión a antígeno de fragmento) . La región Fe comprende los dominios CH2-, CH3- y opcionalmente el dominio CH4 - .

Como se usa en la presente, el término "inmunoglobulina" denota una proteína que consiste de uno o más polipéptido. Los genes de inmunoglobulina codificantes incluyen los genes de región constantes diferentes así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. El término "inmunoglobulina" comprende en una modalidad anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, tales como una cadena pesada aislada, o una región constante de cadena pesada, así como polipéptidos de fusión, que comprende por lo menos un dominio CH2- de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad del método, como se reporta en la presente, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina completa; en otra modalidad, la inmunoglobulina es una región Fe de una inmunoglobulina completa. En otra modalidad, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina o un conjugado de inmunoglobulina.

El término "fragmento de inmunoglobulina" denota un polipéptido que comprende por lo menos el dominio <¾2- de una cadena pesada delta, épsilon o alfa de inmunoglobulina y/o el dominio CH3- de una cadena pesada delta, épsilon o alfa de inmunoglobulina. También se abarcan derivados y variantes de los mismos en donde el motivo de N-glicosilación Asn-Xaa-Ser/Thr en los dominios CH2- o CH3- no se cambia.

El término "conjugado de inmunoglobulina" denota un polipéptido que comprende por lo menos el dominio CH2- de una cadena pesada delta, épsilon o alfa de inmunoglobulina y/o el dominio CH3 - de una cadena pesada delta, epsilon o alfa de inmunoglobulina fusionada a un polipéptido que no es inmunoglobulina. Por lo tanto, el motivo de N-glicosilación Asn-Xaa-Ser/Thr en los dominios CH2- o CH3- no se cambia.

Los oligosacáridos unidos a Asn297 (IgG, IgE) o Asn263 (IgA) de un dominio CH2- y/o a Asn394 , Asn445 , o Asn496 (IgE, IgD) de un dominio CH3- de una cadena pesada de inmunoglobulina tienen una cadena pesada biantenaria (Mizuochi, T. , et al., Arch. Biochem. Biophys . 257 (1987) 387-394), es decir, consiste de una estructura de núcleo de Man (al-4) GlcNAc (ß1-4) GlcNAc?Asn con un enlace Fuc(al-6) opcional en el residuo GlcNAc terminal . Dos brazos externos están conectados a la mañosa terminal de la estructura de núcleo que tiene la formula Gal ( 1-4)GlcNAc( l-2)Man(cxl-6)?Man, y Gal (ß?-4) GlcNAc ( ß1-2 ) Man (al-3 )?Man, en donde los residuos de galactosa terminal son opcionales (Man = mañosa, GlcNAc = N-acetilglucosa, Gal = galactosa; Fue = fucosa) .

Tabla 1: Sitios de glicosilación de inmunoglobulinas El término "cantidad de la isoforma G(0) de inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(l) de inmunoglobulina, y la cantidad de la isoforma G(2) de inmunoglobulina" denota la suma de las cantidades de los diferentes oligosacáridos heterogéneos biantenarios N- enlazados a una asparagina (Asn) de una inmunoglobulina . La isoforma G(2) tiene un residuo de galactosa terminal en cada uno de los brazos externos de la estructura de oligosacarido, la isoforma G(l) contiene solo un residuo de galactosa en cualquiera de los brazos externos enlazados (al-6) o (al-3) , y la isoforma G(0) no contiene residuo de galactosa en ambos brazos externos.

El término "glicoestructura de manosa-5" denota una estructura de oligomanosa enlazada a un residuo de Asn de un polipéptido que comprende o que consiste de cinco residuos de mañosa y dos residuos de núcleo de N-acetil glucosa, que forman una estructura triantenaria .

Un aspecto como se reporta en la presente, es un método para la producción de inmunoglobulina que comprende los siguientes pasos: a) cultivar una célula eucariótica, preferiblemente una célula de mamífero, que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican la inmunoglobulina en un medio de cultivo en donde la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor menor que 80% de la cantidad que podría ser utilizada al máximo por las células eucarióticas en el cultivo por unidad de tiempo, y b) recuperar la inmunoglobulina de la célula o el medio de cultivo y con el mismo producir una inmunoglobulina.

Con este método, se obtiene una inmunoglobulina que comprende cuando mucho 10% de una inmunoglobulina con una glicoestructura de manosa-5. El 10% se calcula con base en la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glicoestructura de manosa-5, la cantidad de la isoforma G(0) de inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(l) de inmunoglobulina, y la cantidad de la isoforma G(2) de inmunoglobulina .

Los términos "grado de limitación de glucosa" y su abreviatura "DGL" , que se pueden usar indistintamente en la presente, denotan la relación de la tasa de consumo de glucosa específica actual de una célula individual en un cultivo a la tasa de consumo de glucosa específica conocida máxima de la célula individual o una célula individual del mismo tipo. El grado de limitación de glucosa se define como qGlc DGL = GlCmax Con qGlc=tasa de consumo de glucosa específica actual de una célula individual; qGlcmax= tasa de consumo de glucosa específica conocida máxima para la célula individual o una célula individual del mismo tipo.

El DGL puede variar entre DGLmantenimien o y 1 por lo DGLmantenimiento (<1 Y >0) denotan limitación de crecimiento completo y 1 denota sin limitación o exceso de glucosa completo .

La introducción de glicoestructuras a polipéptidos , v.gr., inmunoglobulinas , es una modificación postraduccional . Debido a que no se completa el procedimiento de glicosilación de la célula respectiva cada polipéptido expresado se obtiene con un patrón de glicosilación que comprende diferentes glicoestructuras. Por lo tanto, un polipéptido se obtiene a partir de una célula que lo expresa en forma de una composición que comprende formas glicosiladas de manera diferente del mismo polipéptido, es decir, con la misma secuencia de aminoácidos. La suma de las glicoestructuras individuales se denota como patrón de glicosilación, que comprende v.gr., polipéptidos completamente sin glicoestructuras , glicoestructuras procesadas de manera diferente, y/o glicoestructuras compuestas de manera diferente .

Una glicoestructura es una glicoestructura de 5-mañosa (también denotada como con alto contenido de mañosa, Man5, M5 , u oligo-manosa) . Se ha reportado que la fracción de polipéptidos recombinantemente producidos con la glicoestructura de 5 -mañosa es incrementada con tiempo de cultivo prolongado o bajo condiciones de agotamiento de glucosa (Robinson, D.K., et al, Biotechnol . Bioeng. 44 (1994) 727-735; Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534).

Se ha encontrado que la cantidad de la glicoestructura de 5-manosa en el patrón de glicosilación de un polipéptido producido por una célula eucariótica puede ser modificado con base en la cantidad de glucosa provista a la célula en el procedimiento de cultivo. Se ha encontrado que al reducir la cantidad de glucosa, es decir, al cambiar el valor de DGL. de 1.0 a valores más pequeños de v.gr., 0.8, 0.6, 0.5, 0.4 ó 0.2, se puede lograr una modificación en la cantidad de glicoestructura de 5-manosa en el patrón de glicosilación. En una modalidad, el valor de DGL se mantiene constante a un valor dentro de un intervalo, tal como de 0.8 a 0.2, o de 0.6 a 0.4. Es decir, la producción de una polipéptido, en una modalidad de una inmunoglobulina, se puede realizar bajo condiciones en donde una cantidad restringida de glucosa está disponible a la célula cultivada para obtener el polipéptido con una cantidad definida de la glicoestructura de 5-manosa en el patrón de glicosilación. Se ha encontrado que un cultivo con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo de 80% o menos de la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la células por unidad de tiempo, en una modalidad al hacer crecer exponencialmente las células, es decir, con un DGL de 0.8 o menos, da un polipéptido con un patrón de glicosilación en el cual la cantidad de la glicoestructura de 5-manosa se cambia en comparación con un cultivo con un DGL de 1.0. En una modalidad, la densidad de células es la densidad de células viables. Además, el rendimiento de polipéptido obtenido es incrementado .

El término "la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo" denota la cantidad de glucosa que es consumida o utilizada o metabolizada al máximo por unidad de tiempo por una célula individual bajo condiciones de crecimiento óptimas en la fase de crecimiento exponencial en un cultivo sin ninguna limitación de nutrientes. Por lo tanto, la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo se puede determinar al determinar la cantidad de glucosa que es metabolizada por unidad de tiempo por una célula bajo condiciones de crecimiento óptimas en la fase de crecimiento exponencial en un cultivo sin ninguna limitación de nutrientes. Un incremento adicional de la cantidad de glucosa disponible no se incrementará adicionalmente , es decir, cambiará, la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo. Esta cantidad define el nivel máximo de consumo de glucosa de una sola célula. Esto no denota que una versión genéticamente modificada de la célula no podría tener un nivel máximo aún más alto de consumo de glucosa. Alternativamente la cantidad de glucosa que puede ser aumentada al máximo por la célula por unidad de tiempo se puede determinar con base en cultivos previos y los datos monitoreados .

El procedimiento como se reporta en la presente es particularmente simple de llevar a cabo, asociado con un esfuerzo mínimo para medir y controlar, y particularmente económico .

Sin restricciones, v.gr., suministro insuficiente de nutrientes, las células cultivadas crecen y consumen nutrientes a tasas máximas de una manera no económica. Uno de los nutrientes del medio de cultivo consumidos es la glucosa, que es metabolizada por las células cultivadas a fin de producir energía y bloques de construcción para el metabolismo de la célula. En presencia de exceso de glucosa, el metabolismo de la célula se realiza a una tasa de recambio máxima para la glucosa. La cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo por ejemplo se puede determinar a partir del consumo de glucosa de células que crecen exponencialmente en presencia de exceso de glucosa cultivadas con o bajo las mismas condiciones de cultivo que también se usarán en el cultivo con glucosa restringida, es decir, con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo que es menor que la que se puede utilizar por la célula. Esta cantidad máxima se puede calcular fácilmente al determinar la densidad de células y concentración de glucosa al principio y al final de un intervalo de tiempo fijado. El valor está normalmente en un intervalo de 0.006 a 190 mmol/hora/109 células (Baker, K.N. , et al, Biotechnol. Bioeng. 73 (2001) 188-202; WO 98/41611; Müthing, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334; WO 2004/048556) . En una modalidad, el qGlCmax es aproximadamente 0.142 mmol/hora/109 células bajo condiciones de procedimiento estándares a pH 7.0.

El método como se reporta en la presente, se realiza en una modalidad bajo condiciones en donde la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo se mantiene constante y a 80% o menos de la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo (0.8 > DGL > 0) , en una modalidad la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante y a 60% o menos (0.6 > DGL > 0) , en otra modalidad a 50% o menos (0.5 > DGL > 0) ( y en otra modalidad adicional a aproximadamente 40%. El término "aproximadamente" , como se usa dentro de esta solicitud, denota que el valor no es valor exacto, es simplemente el punto central de un intervalo en donde el valor puede variar hasta 10%, es decir, el término "aproximadamente 40%" denota un intervalo de 44% a 36% (DGL = 0.44 - 0.36) .

En una modalidad, el cultivo es con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo que se mantiene constante en un intervalo entre 80% y 10% de la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula por unidad de tiempo (0.8 > DGL > 0.1) . En otra modalidad, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre 60% y 10% (0.6 > DGL > 0.1). En una modalidad adicional, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre 50% y 10% (0.5 > DGL > 0.1) . En otra modalidad, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre 45% y 20% (0.45 > DGL > 0.2) . También en una modalidad, la cantidad de glucosa disponible se mantiene entre 80% y 60% (0.8 > DGL > 0.6) .

En una modalidad, el método comprende el paso de cultivar la célula bajo condiciones en donde el DGL se mantiene constante y a un valor de aproximadamente 0.4, por lo que el cultivo comprende empezar con un DGL entre 1.0 y 0.5, reducir el DGL a un valor de aproximadamente 0.4, y mantener el DGL constante en lo posterior. En una modalidad, la reducción del DGL esta dentro de un período de 100 horas. El término "mantener el DGL constante" y equivalentes gramaticales del mismo denotan que el valor de DGL se mantiene durante un período, es decir, la variación del valor de DGL está dentro de 10% del valor (véase, v.gr., figura 2) .

La inmunoglobulina es recuperada después de la producción, ya sea directamente o después de desintegración de la célula. La inmunoglobulina recuperada está en una modalidad purificada con un método conocido por un experto en la técnica. Diferentes métodos son bien establecidos y ampliamente usados para purificación de proteína, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (v.gr., cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio de iones (v.gr., intercambio de cationes (resinas de carboximetilo) , de intercambio de aniones (resinas de aminoetilo) y de intercambio de modo mixto), cromatografía de adsorción tiofílica (v.gr., con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH) , interacción hidrofóbica o absorción aromática (v.gr., con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofílicas , o ácido m-aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad de quelatos de metal (v.gr., con material de afinidad a Ni(II) y Cu(II) ) , cromatografía de exclusión de tamaño, y métodos electroforéticos (tales como electroforesis de gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A. , Ap l . Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) .

Por ejemplo, un procedimiento de purificación para inmunoglobulinas en general comprende una parte cromatográfica de pasos múltiples. En el primer paso, los polipéptidos que no son inmunoglobulina son separados de la fracción de inmunoglobulina por cromatografía de afinidad, v.gr., con proteína A o G. Posteriormente, v.gr., se puede realizar cromatografía de intercambio de iones para desunir las clases de inmunoglobulina individuales y para remover trazas de proteína A, que han sido co-eluidas de la primera columna. Finalmente se utiliza un paso cromatográfico para separar monómeros de inmunoglobulina de multímeros y fragmentos de la misma clase.

Los métodos cromatográficos generales y su uso son conocidos por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5a. edición, Parte A: Fundamentáis and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl , Z. (ed. ) , Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, Países Bajos, (1998); Poole, C.F. y Poole, S.K. , Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, R.K., Protein Purification: Principies and Practice (1982); Sambrook, J. , et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); o Ausubel, F. M . , et al. (eds.), Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1990).

En una modalidad, la inmunoglobulina recuperada se caracteriza por la cantidad de la inmunoglobulina que tiene una glicoestructura de 5 -mañosa con respecto a la cantidad de una población, que es la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glicoestructura de 5-manosa, la isoforma G(0) de inmunoglobulina, la isoforma G(l) de inmunoglobulina y la isoforma G(2) de inmunoglobulina. Con el método como se reporta en la presente, la cantidad de la inmunoglobulina con una glicoestructura de 5-manosa es en una modalidad 10% o menos de la población, en otra modalidad 8% o menos de la población, y en una modalidad adicional 6% o menos de la población.

El método como se reporta en la presente se puede realizar en ciertas modalidades como cultivo continuo, como cultivo intermitente con alimentación, o como combinación de los mismos, v.gr., al empezar como cultivo intermitente con alimentación con cambio subsecuente a un cultivo continuo. Además, el método como se reporta en la presente se puede realizar en diferentes formas. Por ejemplo, en una modalidad previa al cultivo bajo condiciones con un valor de DGL inferior a 1.0, es decir, por ejemplo bajo condiciones en donde la cantidad disponible de glucosa es 80% o menos de la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por la célula en el cultivo por unidad de tiempo, el cultivo es con un exceso de glucosa, es decir, un valor de DGL de 1.0. En otra modalidad, el cultivo se empieza con una cantidad de glucosa como está contenida en un medio de cultivo estándar, v.gr., entre 1 y 10 g/1 de medio de cultivo, v.gr., para obtener una densidad de células predefinida, v.gr., en una modalidad de 105 células/ml. En una modalidad adicional, el inicio del cultivo es en presencia de una cantidad excesiva de glucosa, es decir, un DGL de 1.0, y se añade una cantidad de glucosa por unidad de tiempo, que es 80% o menos de la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por unidad de tiempo por las células en el cultivo. En otra modalidad, la alimentación se inicia una vez que la cantidad de glucosa presente en el medio de cultivo ha caído a o por abajo de un valor prefijado en el cultivo. En los últimos dos casos, la cantidad de glucosa disponible en el cultivo es reducida por el metabolismo de las células en el cultivo.

En una modalidad, la cantidad de glucosa que está disponible o es añadida por unidad de tiempo y que es menor que la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo, se mantiene al mismo valor, es decir, constante, en el método como se reporta en la presente. Por ejemplo, si una cantidad de 50% de la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por unidad de tiempo está disponible, esta cantidad está disponible en todas las unidades de tiempo del método en el cual se realiza una alimentación de glucosa restringida. Se ha señalado que este valor es un valor relativo. No obstante, a medida que la densidad de células viables cambia durante el cultivo (es decir, incrementa al principio, alcanza un máximo, y cae de nuevo posteriormente) la cantidad absoluta de glucosa disponible cambia de acuerdo con ello, ya que es un valor relativo que depende de la densidad de células viables absoluta. A medida que el valor relativo se mantiene constante (es decir, at v.gr. , 80%), pero el valor de referencia absoluto cambia (es decir, v.gr. , incrementa la densidad de células viables) también el valor absoluto relativo (es decir, 80% de un valor cada vez mayor también son cada vez mayores) .

El término "por unidad de tiempo" denota un intervalo de tiempo fijo, tal como 1 minuto, 1 hora, 6 horas, 12 horas o 24 horas. En una modalidad, la unidad de tiempo es 12 horas o 24 horas. El término "cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo" , como se usa dentro de esta solicitud, denota la suma de 1) la cantidad de glucosa contenida en el medio de cultivo de un cultivo al principio de un intervalo de tiempo fijo y 2) la cantidad de glucosa añadida, es decir, alimentada, durante la unidad de tiempo.

Por lo tanto, una cantidad de glucosa se añade al medio de cultivo de células, v.gr., al recipiente de cultivo, que incrementa la cantidad de glucosa en el medio de cultivo al principio del intervalo de tiempo fijo a la cantidad predeterminada. Esta cantidad de glucosa se puede añadir, v.gr., como sólida, disuelta en agua, disuelta en un regulador de pH, o disuelta en un medio de nutrientes, por lo que el agua y regulador de pH no deben contener glucosa. La cantidad de glucosa que se ha de añadir corresponde a la cantidad de glucosa que ha de estar disponible reducida por la cantidad de glucosa presente en el medio en el recipiente de cultivo. El procedimiento de añadir la cantidad de glucosa se puede realizar ya sea como una adición individual, como adición múltiple de pequeñas fracciones iguales, o como una adición continua durante una unidad de tiempo como se describió antes.

El método como se reporta en la presente es adecuado para cualquier tipo de cultivo y cualquier escala de cultivo. Por ejemplo, en una modalidad, el método se usa para procedimientos continuos o intermitentes alimentados; en otra modalidad, el volumen de cultivo es de 100 mi hasta 50,000 1, en otra modalidad de 100 1 a 10,000 1. El método como se reporta en la presente es útil para la producción de inmunoglbbulinas con 10% o menos, u 8% o menos, o 6% o menos de la inmunoglobulina que tiene una glicoestructura de 5- mañosa. En una modalidad, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina G o E. El método como se reporta en la presente comprende una célula eucariótica, en donde la célula a su vez comprende un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma y un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. La célula eucariótica es en una modalidad seleccionada de células CHO, células NSO, células BHK, células de hibridoma, células PER.C6®, células Sp2/0, células HEK y células de insecto.

Un experto en la técnica está familiarizado con composiciones y componentes del medio así como concentraciones de nutrientes requeridas por diferentes células para crecimiento óptimo además de la cantidad de glucosa y escogerán un medio apropiado para el cultivo de la célula (véase, v.gr., Mather, J. P., et al., en Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis , and Bioseparation, Vol . 2 (1999) 777-785).

En una modalidad, la cantidad de glucosa que ha de estar disponible para las células en un cultivo de conformidad con el método como se reporta en la presente se calcula al multiplicar la densidad de células viables, que se puede lograr normalmente en el recipiente de cultivo en un cierto punto de tiempo del cultivo, con el volumen del recipiente de cultivo y la cantidad de glucosa que puede ser utilizada al máximo por las células en crecimiento exponencial por unidad de tiempo y por el DGL destinado. Con mayor detalle, a partir del curso de concentración de glucosa en el cultivo y el curso de la densidad de células en el cultivo previo al punto de tiempo real, el curso futuro de la concentración de glucosa y la densidad de células se predicen. Con esta predicción, la cantidad de glucosa que se ha añadido al cultivo para lograr el DGL destinado se calcula con la siguiente fórmula: (glucosa que se ha de añadir [pg de glucosa/ml/hr] ) = (densidad de células actual [células/ml] ) x (tasa de consumo de glucosa de la célula [pg glucosa/célula/hr] ) x (valor de DGL) - cantidad de glucosa presente en el medio en el recipiente cultivo.

En una modalidad, el valor de pH del cultivo es entre pH 6.5 y pH 7.8. En otra modalidad, el valor de pH es entre pH 6.9 y pH 7.3. En una modalidad adicional, el valor de pH es entre pH 7.0 y 7.2. Se ha encontrado, como se delinea en el ejemplo 1, que en combinación con una alimentación de glucosa restringida con un valor de pH de 7.0 en el método de alimentación constante el contenido de M5 puede ser eficientemente regulado a valores definidos, es decir, por abajo de 8%, en comparación con un valor de pH de 7.2. En los cultivos, en el método intermitente con alimentación a valores de pH de 7.0 ó 7.2, respectivamente, se encontró que con el método de control de DGL el contenido de M5 podría ser regulado para ser menor que 5.5%. Se ha encontrado que con una reducción del valor de pH del cultivo, un incremento de la cantidad de M5 debido a la reducción del valor de DGL puede ser impedido.

El cultivo es, en una modalidad, realizado a una temperatura entre 27°C y 39°C, en otra modalidad entre 35°C y 37.5°C.

Con el método como se reporta en la presente, cualquier polipéptido que contiene una glicoestructura puede ser producido, tal como inmunoglobulinas , interferones , citocinas, factores de crecimiento, hormonas, activador de plasminógeno, eritropoyetina y similares.

El cultivo en el método como se reporta en la presente se puede realizar por cualesquiera dispositivos de cultivo agitados o movidos por oscilación para cultivo de células de mamífero, por ejemplo, un dispositivo de cultivo con tanque de tipo termentador, un dispositivo de cultivo de tipo de elevación de aire, un un dispositivo de cultivo de tipo de matraz de cultivo, un un dispositivo de cultivo de tipo de movimiento giratorio, un un dispositivo de cultivo de tipo de microportador, un dispositivo de cultivo de tipo de lecho fluidizado, un dispositivo de cultivo de tipo de fibra hueca, un dispositivo de cultivo de tipo de botella rodante, o un un dispositivo de cultivo de tipo de lecho empacado.

El método como se reporta en la presente se realiza en una modalidad hasta por 15 días. En otra modalidad, el cultivo es por 6 a 15 días. En una modalidad, la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R.

El método como se reporta en la presente es ilustrado con un anticuerpo a receptor de interleucina-6 humano como se reporta, v.gr., en EP 0 409 607, EP 0 628 639, US 5,670,373, o US 5,795,965 (incorporado aquí por referencia en su totalidad) a medida que este anticuerpo y la línea de células que lo expresa estaban disponibles en cantidad suficiente en el laboratorio de los inventores de la presente en el tiempo de la invención. Esto no pretende restringir el alcance de la invención.

Los siguientes ejemplos y figuras están disponibles para ayudar a entender la presente invención, cuyo alcance verdadero se expone en las reivindicaciones anexas. Se entiende que las modificaciones se pueden hacer en los procedimientos expuestos sin apartarse de la esencia de la invención.

Ej emplos Materiales y Métodos Línea de células: Una línea de células CHO ilustrativa en la cual la cantidad de la glicoestructura de 5 -mañosa de una inmunoglobulina recombinantemente producida puede ser modificada es una línea de células CHO que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-receptor IL-6 de conformidad con los documentos EP 0 409 607 y US 5,795,965. Para el cultivo de la célula CHO recombinante , se puede usar cualquier medio de cultivo siempre que se pueda realizar complementación de glucosa de conformidad con el método de la invención. Medios de cultivo ilustrativos son IMDM, DMEM o medio F12 de Ham o combinaciones de los mismos, que han sido adaptados al método como se reporta en la presente en tantas como relaciones de masa de los componentes del medio de cultivo a glucosa sean adoptados. Es probablemente posible excluir glucosa del medio de cultivo y añadirlo al cultivo por separado.

Cultivo : Células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-6R se cultivaron en un recipiente de fermentación de 1 1 o 2 1. El medio de alimentación con tenía 15 a 40 g/1 de glucosa. La glucosa se pudo alimentar con una solución concentrada separada que contenía de, v.gr. , 400 g/1 de glucosa. El cultivo se llevó a cabo a un valor de pH en el intervalo de pH 7.0 a pH 7.2.

Determinación de la glicoestructura: Para el análisis del patrón de glicosilación de IgG, se usó un método de conformidad con Kondo et al. (Kondo, A., et al., Agrie. Biol. Chem. 54 (1990) 2169-2170). La IgG se purificó del sobrenadante centrifugado del medio de cultivo mediante el uso de una columna de proteína A de escala pequeña. El oligosacárido de la IgG purificada fue liberado mediante el uso de N-glicosidasa F (Roche Diagnostics GmbH, annheim, Alemania) y marcada con 2-amino piridine en el término reductor. El oligosacárido marcado fue analizado por cromatografía de fase inversa (HPLC) . Cada pico fue asignado por espectrometría de masa y estándares para los oligosacáridos .

Determinación de glucosa: La concentración de glucosa se determinó mediante el uso de un analizador YSI 2700 SELECT™ (YSI, Yellow Springs, OH, E.U.A.) con un método de conformidad con el manual del fabricante.

Determinación de densidad de células viables : La densidad de células viables se determinó mediante el uso de un sistema de procesamiento de imagen y análisis automático (CEDEX®; Innovatis, Alemania) y el método de exclusión con colorante azul de tripano.

Ejemplo 1 Efectos del control de DGL y pH sobre la producción de anticuerpo y contenido de gl icoestructura de 5-manosa (M5) Se realizó una prueba mediante el uso de una cepa de células CHO que producen anticuerpo anti-receptor humano de IL-6 humanizado (Tocilizumab, RoACTEMRA®) , que se preparó de conformidad con el método descrito en el ejemplo de referencia 2 de la publicación de patente no examinada japonesa No. 99902/1996 mediante el uso del promotor la de factor de alargamiento humano como se reporta en el ejemplo 10 de la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 92/19759 (correspondiente a US 5,795,965, US 5,817,790 y US 7,479, 543) .

En el método de alimentación de cantidad absoluta constante, se observaron los efectos de control del pH sobre la producción de inmunoglobulina . La tabla 2 muestra los efectos de control del pH sobre la producción de oligosacáridos de anticuerpo y contenido de M5 en modo de alimentación constante.

Tabla 2; Efectos de control del pH en el modo de alimentación de cantidad absoluta constante A pH 7.0, la cantidad de la gl icoes tructura de 5-manosa (M5) fue regulada a menos de 5.5%. El valor de DGL declinó de 0.80 a 0.21 debido al cambio de densidad de células. Por otra parte, a pH 7.2, la cantidad de M5 fluctuó entre 8.7% y 25.2% y fue más alta que a pH 7.0. El valor de DGL a pH 7.2 varió de 0.73 a 0.25. Más aún, en este caso, la producción de inmunoglobul ina a pH 7.2 fue más de 120% (valor relativo en comparación con pH 7.0) . La producción más alta de inmunoglobul ina en el método de alimentación de cantidad absoluta constante induce un contenido de M5 más alto de más de 8%. Por lo tanto, con un control de pH 7.0 en el método de alimentación de cantidad absoluta constante, el contenido de M5 pudo ser eficientemente regulado a valores más bajos, es decir, por abajo de 8%, en comparación con el método de control de pH 7.2.

El método de control de DGL (=método de alimentación de cantidad relativa constante) también se usó para la producción de inmunoglobul ina por modo intermitente con alimentación a varios valores de pH , y el contenido de M5 se analizó. La tabla 3 muestra los efectos de control de DGL después del inicio de alimentación en el día 2-3 y pH sobre la producción de inmunoglobul ina y contenido de M5.

Tabla 3: Efectos de control de DGL y pH en modo intermitente con alimentación A pH 7.0, el método de control de DGL se aplicó en el intervalo de a DGL de 0.2 a 0.8. Como resultado, el contenido de M5 fue regulado para ser igual a o menor que 4.0%. Por otra parte, a pH 7.2, el valor de DGL se operó en el intervalo de 0.4 a 0.6. Aquí, el contenido de M5 pudo ser controlado para ser menor que 5.5%.

Ejemplo 2 Cultivo con diferentes valores de DGL El cultivo de una célula CHO que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6R se realizó con diferentes valores de DGL. Los resultados se resumen en la siguiente tabla 4.

Tabla 4: Efectos de control de valor de DGL sobre la ción de inmunoglobulina y contenido de M5 En comparación con una alimentación constante, se muestra la estrategia de DGL controlada con un valor de DGL de 0.4 a 0.6 de un contenido de mañosa- 5 reducido.

Ejemplo 3 Cultivo con diferentes estrategias de alimentación El cultivo de una célula de CHO que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6R se llevó a cabo con un valor de DGL pero con diferentes estrategias de alimentación. Los resultados se resumen en la siguiente tabla 5.

Tabla 5: Efectos de estrategia de alimentación sobre la viabilidad y densidad de células viables En los experimentos de alimentación individual, se usó un solo alimento que contenía todos los nutrientes y glucosa. En los experimentos de alimentación dual, se usaron dos alimentos: el primer alimento contenía todos los nutrientes y glucosa a una concentración baja de 15 g/1 y el segundo alimento contenía una alta concentración de glucosa. Estos diferentes experimentos de alimentación se llevaron a cabo en un conjunto con un ajuste diario de la tasa de alimentación y en otro conjunto que siguió un perfil predeterminado basado en el registro de desarrollo de densidad de células viables en cultivos anteriores. Como se puede ver de la tabla 5, la viabilidad y densidad de células viables son comparables independientemente de la estrategia de alimentación utilizada.

Ejemplo 4 Grado de control de limitación de glucosa (DGL) para la producción de inmunoglobulina por el modo intermitente con alimentación Células CHO (8.0-12 x 105 células/ml) fueron inoculadas en medio de cultivo libre de suero como se describió antes. Las células se hicieron crecer a 37°C, 98% de humedad relativa, y atmósfera de 10% de C02. En el cultivo intermitente con alimentación, el medio de alimentación que contenía glucosa se empezó a alimentar al termentador principal en el 2° o 3er día del inicio del cultivo. La estrategia de alimentación seguida por el método para controlar el grado de limitación de glucosa (DGL) de conformidad con la publicación de solicitud de patente de U.S. No. US 2006/0127975 Al. El DGL se puede definir como la relación de la tasa de consumo de glucosa específica observada a la tasa de consumo de glucosa específica conocida máxima cuando la glucosa está libremente disponible para estas células (DGL = Q (glc) /Q (glc) máx/ en donde Q(glc) = tasa de consumo de glucosa específica actualmente observada; Q(glc)max = tasa de consumo de glucosa específica conocida máxima para estas células) .

Las figuras la- Ib muestran la densidad de células viables y perfiles de viabilidad de las células del cultivo. El DGL fue controlado para estar a un valor de 0.4 - 0.5 en varias densidades de células como se muestra en la figura 2. Las tasas de alimentación se cambiaron una vez o dos veces al día de acuerdo con la densidad de células en ese tiempo. La figura 3 muestra los perfiles de alimentación basados en DGL por el modo intermitente con alimentación. La tasa de alimentación se cambió entre 0.8 y 1.6 ml/hr de acuerdo con la densidad de células. Con esta estrategia de alimentación aplicada, se obtuvo un perfil de producción de inmunoglobulina como se muestra en la figura 4. Al usar el tamaño de inoculación de 10 x 105 células/ml y 12 x 105 células/ml, la producción de inmunoglobulina fue casi la misma y más de 120% de la producción de inmunoglobulina en el método de alimentación constante en el día siete como se muestra en la tabla 6 (tasa de alimentación de 0.02 g glucosa/hr) . A pesar de la diferencia de 20% en las densidades de células iniciales, fue posible con el método de control de DGL obtener un título de inmunoglobulina aproximadamente equivalente. Más aún, cuando el tamaño de inoculación se fijó a 8.0 x 105 células/ml, a pesar del retraso de 20 horas desde el punto de inicio de la alimentación, la inmunoglobulina obtenida fue más de 110% (valor relativo) en el día siete. En estos resultados, el método de control de DGL pudo lograr una producción estable de inmunoglobulina en varios tamaños de inoculación.

Ejemplo 5 Los efectos del control de DGL sobre la glicoestructura de 5- manosa y galactosilación de oligosacáridos De la inmunoglobulina producida por cultivo intermitente con alimentación mediante el uso del control de DGL, se analizó el patrón de glicosilación. La tabla 6 muestra el resultado del análisis de oligosacárido para la inmunoglobulina obtenida del cultivo intermitente con alimentación controlado por DGL en comparación con el método de alimentación constante (tasa de alimentación: 0.02 g de glucosa/hr). Al tamaño de inoculación de 8.0 x 105 células/ml, el contenido de glicoestructura de 5-manosa (M5) fue 2.8%. Al tamaño de inoculación de 10 x 105 células/ml y 12 x 105 células/ml, el contenido de M5 fue 4.1% y 3.8%, respectivamente. En todas las condiciones de cultivo, el método de control de DGL fue capaz de regular el contenido de M5 a menos de 5.0%.

Mientras tanto, en cada condición, la isoforma G(0) de inmunoglobulina y la isoforma G(2) de inmunoglobulina se controlaron en el intervalo de 40% a 46% y de 9.0% a 11%, respectivamente .

Tabla 6; Efectos del valor de control de DGL sobre la producción de inmunoglobulina y patrón de glicosilación Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención.

Claims (23)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para la producción de una inmunoglobulina caracterizado porque comprende a) cultivar una célula eucariótica, que comprende un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo en donde la relación del consumo de glucosa específica actual de una célula individual en un medio de cultivo a la tasa de consumo de glucosa específica máxima conocida del tipo de célula se mantiene constante, y b) recuperar la inmunoglobulina del cultivo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la relación es de 0.8 a 0.2.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la relación es de 0.6 a 0.4.

4. Un método para la producción de una inmunoglobulina caracterizado porque comprende a) cultivar una célula eucariótica que comprende un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo en donde la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor constante de menos de 80% de la cantidad que podría se utilizada al máximo por las células en el medio de cultivo por unidad de tiempo, y b) recuperar la inmunoglobulina del cultivo.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el valor constante es menor que 80% y mayor que 20%.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cultivo es un cultivo intermitente con alimentación.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el cultivo es un cultivo intermitente con alimentación en donde la alimentación se inicia en el día 2 o día 3 del cultivo.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cultivo es a un valor de pH de 6.5 a 7.5.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el cultivo es a un valor de pH de 6.9 a 7.3.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el cultivo es a un valor de pH de 6.95 a 7.05 o a un valor de pH de 7.15 a 7.25.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de clase G o clase E.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula hospedera eucariótica se selecciona del grupo que comprende células CHO, células NSO, células HEK, células BHK, células de hibridoma, células PER.C6®, células de insecto y células Sp2/0.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la célula eucariótica es una célula de ovario de hámster chino (CHO) .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cultivo de la célula hospedera se lleva a cabo por seis a veinte días .

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R.

16. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para reducir la cantidad de una inmunoglobulina con una glicoestructura de 5-mañosa en una preparación de inmunoglobulina.

17. Una composición que comprende una inmunoglobulina, caracterizada porque la composición ha sido preparada con un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el anticuerpo anti-IL-6R comprende Tocilizumab.

20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque la glicoestructura de 5-manosa unida al anticuerpo anti-IL-6R es 8% o menos.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la glicoestructura de 5-manosa es 6% o menos.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la glicoestructura de 5-manosa es 4% o menos.

23. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada porque la glicoestructura G(0) unida al anticuerpo anti-IL-6R está en el intervalo de 40% a 46% y la glicoestructura G(2) unida al anticuerpo anti-IL-6R está en el intervalo de 9% a 11%.