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MXPA03006034A - Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina. - Google Patents

Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina.

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MXPA03006034A
MXPA03006034A MXPA03006034A MXPA03006034A MXPA03006034A MX PA03006034 A MXPA03006034 A MX PA03006034A MX PA03006034 A MXPA03006034 A MX PA03006034A MX PA03006034 A MXPA03006034 A MX PA03006034A MX PA03006034 A MXPA03006034 A MX PA03006034A
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MX
Mexico
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antibody
igf
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
MXPA03006034A
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English (en)
Inventor
Gallo Michael
Original Assignee
Pfizer
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Publication date
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Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of MXPA03006034A publication Critical patent/MXPA03006034A/es
Publication of MX337162B publication Critical patent/MX337162B/es

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Abstract

Anticuerpos y porciones que ligan antigeno de los mismos que se ligan especificamente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-IR), factor que es preferentemente el IGF-IR humano. La invencion tambien se refiere a anticuerpos anti-IGF-IR humanos incluyendo anticuerpos quirmericos, biespecificos, derivatizados de cadena simple o porciones de proteinas de fusion. La invencion tambien se refiere a moleculas aisladas de la cadena pesada y liviana de inmunoglobulina derivadas de anticuerpos anti-IGF-IR y a moleculas de acido nucleico que codifican tales moleculas. La presente invencion(-tambien se refiere a metodos para hacer anticuerpos anti-IGF-IR, a composiciones farmaceuticas que comprenden estos anticuerpos y a metodos para usar los anticuerpos y las composiciones que los contienen para diagnostico y tratamiento. La invencion tambien provee metodos terapeuticos con genes que usan moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas de inmunoglobulina pesada y/o liviana que comprenden los anticuerpos anti-IGF-IR humanos. La invencion tambien se refiere a metodos terapeuticos con genes y a animales transgenicos que comprenden las moleculas de acido nucleico de la presente invencion.

Description

ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A INSULINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de crecimiento similar a la insulina (Insulin-like growt factor) (IGF-I) es un polipéptido de 7,5 kD que circula en altas concentraciones en el plasma y es detectable en la mayoría de los tejidos. El IGF-I estimula la diferenciación celular y la proliferación celular y es requerido por la mayoría de los tipos celulares mamíferos para una proliferación sostenida. Estos tipos celulares incluyen, entre otros, fibroblastos diploides humanos, células epiteliales, células de la musculatura lisa, linfocitos T, células neuronales, células mieloides, condrocitos, osteoblastos y células del tronco de la médula ósea humanos. Para un resumen de la amplia variedad de tipos celulares para los cuales la interacción IGF-I / receptor de IGF-I hace de intermediario para la proliferación celular, vea Goldring et al., Eukar . Gene Express, 1: 31-326 (1991). La primera etapa en la ruta de transducción que lleva a la proliferación o diferenciación celular estimulada por IGF-I es la ligadura de IGF-I o IGF-II (o insulina en P03/101-PFA concentraciones suprafisiológicas ) al receptor IGF-I. El receptor IGF-1 está compuesto por dos tipos de subunidades: una subunidad alfa (una proteína de 130-135 kD que es completamente extracelular y funciona en la unión del ligando) y una subunidad beta (una proteína transmembranal de 95 kD, con dominios transmembranales y citoplasmáticos) . El IGF-IR pertenece a la familia de los receptores del factor de crecimiento tirosinaquinasa (Ullrich et al., Cell 61: 203-212, 1990), y es estructuralmente similar al receptor de insulina (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986) . El IGF-IR es sintetizado inicialmente como un polipéptido pro-receptor de cadena simple que es procesado por glicocilación, segmentación proteolítica y ligadura covalente para ser ensamblado en un heterotetrámero maduro de 460 kD que comprende dos subunidades alfa y dos subunidades beta. La(s) subunidad (es) beta posee (n) actividad de tirosinaquinasa activada por el ligando. Esta actividad está implicada en la acción del ligando que hace de intermediario en las rutas de señalización, acción que implica la autofos forilación de la subunidad beta y la fosforilación de sustratos de IGF-IR. In vivo, los niveles de IGF-I en suero dependen de la presencia de la hormona de crecimiento pituitaria (GH) . Si P03/101-PFA bien el hígado es un sitio principal de la síntesis de IGF-I dependiente de la GE, un trabajo reciente indica que la mayor parte de los tejidos normales también producen IGF-I. Una variedad de tejidos neoplásticos también produce IGF-I. De este modo, IGF-I puede actuar como un regulador de la proliferación celular normal y anormal a través de mecanismos autocrinos o paracrinos, como asi también endocrinos. IGF-I e IGF-II se unen a proteínas ligantes de IGF (IGF binding proteins (IGFBPs) ) in vivo. La disponibilidad de IGF libre para la interacción con IGF-IR está modulada por las IGFBPs . Para un resumen de IGFBPs e IGF-I, vea Grimberg et al., J. Cell Physiol-, 183: 1-9, 2000. Existe una considerable evidencia para un rol de IGF-I y/o IGF-IR en la manutención de células tumorales in vitro e in vivo. Los niveles de IGF-IR son elevados en tumores pulmonares (Kaiser et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol., 119: 665-668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Cáncer Res., 50: 2511-2517, 1990), tumores de la mama (Pollak et al., Cáncer Lett-, 38: 223-230, 1987; Foekens et al., C ncer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen et al., Cáncer Res: 49: 7002-7009, 1990: Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423; 1989), P03/101-PFA tumores de la próstata y del colon (Remaole-Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo et al., Gastroenterol . 102: 1101-1108, 1992). La expresión irregular de IGF-I en el epitelio de la próstata lleva a neoplasia en ratones transgénicos (Di Giovanni et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97 : 3455-60, 2000). Además, el IGF-I parece ser un estimulante autocrino de gliomas humanos (Sandberg-Nordqvist et al., Cáncer Res. 53: 2475-2478, 1993), mientras que IGF-I estimuló el crecimiento de gibrosarcomas que sobreexpresaron IGF-IR (Butler et al., Cáncer Res,, 58: 3021-27, 1998). Además, individuos con niveles "normalmente elevados" de IGF-I tienen un riesgo aumentado de cánceres comunes en comparación con individuos con niveles de IGF-I en la gama "normalmente baja" (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab., 10: 136-41, 1999). Muchos de estos tipos de células tumorales responden a IGF-I con una señal proliferativa en el cultivo (Nakanishi et al., J. Clin. Invest. 82: 354-359, 1988; Freed et al., J. Mol Endocrinol. 3: 509-514, 1989) y se han postulado bucles autocrinos o paracrinos para la proliferación in vivo (Le Roith etal., Endocrine Revs. 16: 143, 163; 1995: Yee et al., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Para un resumen del rol que juega la interacción IGF-I / receptor del IGF-I P03/101-PFA en el crecimiento de una variedad de tumores humanos, vea Macaulay, Br. J. Cáncer, 65: 311-320, 1992. Niveles aumentados de IGF-I también están correlacionados con varios estados patológicos no cancerosos, incluyendo acromegalia y gigantismo (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), mientras que una función anormal IGF-I / receptor de IGF-I ha sido implicada en psoriasis (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), aterosclerosis y re-estenosis de la musculatura lisa de vasos sanguíneos después de angioplastia (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000) . Niveles aumentados de IGF-I también pueden ser un problema en diabetes o en complicaciones de la misma, tal como proliferación microvascular (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Niveles disminuidos de IGF-I, que se producen, ínter alia, en casos con niveles disminuidos de la GH en suero o cuando existe una insensibilidad o resistencia a la GH, están asociados con trastornos tales como estatura pequeña (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999) , neuropatía, disminución de la masa muscular y osteoporosis (Rosen et al., Trends Endocrinol . Metab. 10: 136-141, 1999) . Usando vectores de expresión antisentido u P03/101-PFA oligonucleótidos antisentido para el RNA del IGF-IR, se ha mostrado que la interferencia con IGF-IR lleva a la inhibición del crecimiento celular en el cual 1GF-I o IGF-II hacen de intermediario (vea, por ejemplo, Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). La estrategia antisentido fue exitosa para inhibir la proliferación celular en varios tipos celulares normales y en lineas celulares tumorales humanas. El crecimiento también puede ser inhibido usando análogos peptidicos de IGF-I (Pietrzkowski et al., Cell Growth & Diff 3: 199-205, 1992; y Pietrzkowski et al., Mol. Cell. Biol . , 12: 3883-3889, 1992) , o un vector que expresa un RNA antisentido para el RNA de IGF-I (Trojan et al., Science 259: 94-97, 1992). Además, anticuerpos contra IGF-IR (Arteaga et al., Breast Canc. Res. Treatm. 22: 101-106, 1992; y Kalebic et al., Cáncer Res. 54: 5531-5534, 1994), y mutantes negativos dominantes de IGF-IR (Prager et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 91: 2181-2185, 1994; Li et al., J. Biol. Chem. , 269: 32558-32564, 1994 y Jiang et al., Oncogene 18: 6071-77, 1999) pueden revertir el fenotipo transformado, inhibir tumorigénesis e inducir pérdida del fenotipo metastático. El IGF-I también es importante en la regulación de apoptosis. La apoptosis, que es muerte celular programada, P03/101-PFA está implicada en una amplia variedad de procesos de desarrollo, incluyendo la maduración del sistema inmune y nervioso. Además de su rol en el desarrollo, la apoptosis también ha sido implicada como un protector celular importante contra tumorigenesis (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991; La e, Nature 362: 786-787, 1993). La supresión del programa apoptótico, por una variedad de lesiones genéticas, puede contribuir con el desarrollo y la progresión de tumores malignos. El IGF-I protege de la apoptosis inducida por la remoción de citoquina en células hematopoiéticas dependientes de IL-3 (Rodriguez-Tarduchy, G- et al., J. Immunol. 149: 535-540, 1992), y de la remoción de suero en células 1/mycER de rata (Harrington, E . , et al., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). La función anti-apoptótica del IGF-I es importante en la etapa posterior al cometido del ciclo celular y también en células cuya progresión del ciclo celular es bloqueada por etoposide o timidina. La demostración de que fibroblastos inducidos por c- yc son dependientes del IGF-I para su supervivencia sugiere que el IGF-IR tiene un rol importante en la manutención de células tumorales al inhibir específicamente apoptosis, un rol distinto de los efectos proliferativos de IGF-I o IGF-IR.
P03/10I-PFA Este sería un rol similar al jugado por otros genes anti-apoptóticos tales como bcl-2 al promover la supervivencia de tumores (McDonnell et al., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry et al., Nature 348: 334-336, 1990). Los efectos protectores de la apoptosis del IGF-I dependen de que haya IGF-IR presente sobre las células para interactuar con IGF-I (Resnicoff et al., Cáncer Res. 55: 3739-3741, 1995) . Un sostén para la función anti-apoptótica de IGF-IR en la manutención de células tumorales también fue provisto por un estudio que usa oligonucleótidos antisentido para IGF-IR, estudio que identificó una relación cuantitativa entre niveles de IGF-IR, el grado de apoptosis y el potencial tumorigénico de un tumor singénico de rata (Rescinoff et al., Cáncer Res. 55: 3739-3741, 1995) . Se encontró que un IGF-IR sobrexpresado protege células tumorales in vitro de la apoptosis inducida por etoposide (Sel! et al., Cáncer Res. 55: 303-306, 1995) y, aún más dramáticamente, que una disminución de los niveles de IGF-IR por debajo de los niveles naturales causó una apoptosis masiva de células tumorales in vivo (Resnicoff et al., Cáncer Res. 55: 2463-2469, 1995). Estrategias potenciales para inducir apoptosis o para inhibir proliferación celular asociada con niveles P03/101-PFA aumentados de IGF-I, IGF-II y/o IGF-IR incluyen suprimir niveles de IGF-I o niveles de IGF-II o prevenir la ligadura de IGF-I al IGF-IR. Por ejemplo, el análogo de somatostatina de acción prolongada, octreotide, ha sido empleado para reducir la síntesis y/o la secreción de IGF. IGF-IR soluble ha sido usado para inducir apoptosis en células tumorales in vivo y para inhibir tumorigenesis en un sistema animal experimental (D'Ambrosio et al., Cáncer Res. 56: 4013-20, 1996). Además, se han usado oligonucleótidos antisentido de IGF-IR, análogos peptídicos de IGF-I y anticuerpos contra IGF-IR para disminuir la expresión de IGF-I o IGF-IR (vea supra) . Sin embargo, ninguno de estos compuestos ha sido adecuado para una administración prolongada a pacientes humanos. Además, si bien el IGF-I ha sido administrado a pacientes para el tratamiento de corta estatura, osteoporosis, masa muscular disminuida, neuropatía o diabetes, la ligadura de IGF-I a IGFBPs ha hecho muchas veces el tratamiento con IGF-I difícil o inefectivo. Por lo tanto, en vista de los roles que tienen IGF-I e IGF-IR en trastornos tales como cáncer y otros trastornos proliferativos cuando IGF-I y/o IGF-IR son sobrexpresados, y de los roles que tienen demasiado pocos IGF-I e IGF-IR en P03/101-PFA trastornos tales como corta estatura y fragilidad cuando IGF-I y/o IGF-IR son subexpresados, sería deseable generar anticuerpos contra IGF-IR que podrían ser usados, ya sea para inhibir o para estimular IGF-IR. Si bien se ha informado que se encontraron anticuerpos anti-IGF-IR en ciertos pacientes con enfermedades autoinmunes, ninguno de estos anticuerpos ha sido purificado y ninguno mostró ser adecuado para inhibir la actividad de IGF-I con fines diagnósticos o clínicos. Vea, por ejemplo, Thompson et al., Pediat. Res. 32: 455-459, 1988; Tappy et al., Diabetes 37; 1708-1714, 1988; eightman et al., Autoimmunity 16: 251-257, 1993; Drexhage et al., Nether J. of Med. 45: 285-293, 1994. Por lo tanto, sería deseable obtener anticuerpos anti-IGF-IR humanos de alta afinidad que podrían ser usados para tratar enfermedades en humanos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras ??-IC muestran alineamientos de las secuencias nucleotídicas de las regiones variables de la cadena liviana de seis anticuerpos anti-IGF-IR humanos, entre sí y con las secuencias de la línea germinal. La Figura 1A muestra el alineamiento de las secuencias nucleotídicas de la región variable de la cadena liviana P03/101-PFA (VL) de los anticuerpos 2.12.1 (SEQ ID No: 1) , 2.13.2 (SEQ ID NO: 5), 2.14.3 (SEQ ID NO: 9) y 4.9.2 (SEQ ID NO: 13) entre si y con la secuencia de la linea germinal Vk A 30 (SEQ ID NO: 39) . La Figura IB muestra el alineamiento de la secuencia nucleotidica de la VL del anticuerpo 4.17.3 (SEQ ID NO: 17) con la secuencia Vk 012 de la linea germinal (SEQ ID NO: 41) . La Figura 1C muestra el alineamiento de la secuencia nucleotidica de la VL del anticuerpo 6.1.1 (SEQ ID NO: 21) con la secuencia VkA27 de la linea germinal (SEQ ID NO: 37) . Los alineamientos también muestran las regiones CDR de la VL de cada anticuerpo. Las secuencias de concenso para las Figuras 1A-1C se ilustran en las SEQ. ID. NOS. 53-55, respectivamente. Las figuras 2A-2D muestran alineamientos de las secuencias nucleotidicas de las regiones variables de la cadena pesada de seis anticuerpos anti-IGF-IR humanos, entre si y con las secuencias de la linea germinal. La Figura 2A muestra el alineamiento de la secuencia nucleotidica de la VH del anticuerpo 2.12.1 (SEQ ID NO: 3) con la secuencia VH DP-35 de la linea germinal (SEQ ID NO: 29) . La Figura 2B muestra el alineamiento de la secuencia nucleotidica de la VH del anticuerpo 2.14.3 (SEQ ID NO: 11) con la secuencia VIV-4/4.35 de la linea germinal (SEQ ID P03/101-PFA NO: 43) . La Figura 2C muestra los alineamientos de las secuencias nucleotidicas de la VH de los anticuerpos 2.13.2 (SEQ ID NO: 7), 4.9.2 (SEQ ID NO: 15) y 6.1.1 (SEQ ID NO: 23) , entre si y con la secuencia VH DP-47 de la linea germinal (SEQ ID NO: 31) . La Figura 2D muestra el alineamiento de las secuencias nucleotidicas de la VH del anticuerpo 4.17.3 (SEQ ID NO: 19) con la secuencia VH DP-71 (SEQ ID NO:35). El alineamiento también muestra las regiones CDR de los anticuerpos. Las secuencias de concenso para las Figuras 2A-2D se ilustran en las SEQ. ID. NOS. 56-59r respectivamente. La Figura 3 muestra que los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2, 4.9.2 y 2.12.1 inhiben la ligadura de IGF-I con las células 3T3-IGF-IR. La Figura 4 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 4.9.2 inhibe la fosforilación de la tirosina del receptor inducida por IGF-I (panel superior) e induce la disminución de la actividad (downregul tion) del IGF-IR en la superficie celular (panel inferior) . La Figura 5 muestra que los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2 y 4.9.2 reducen la señal de fosfotirosina del IGF-IR en tumores 3T3-IGF-IR. La Figura 6 muestra que los anticuerpos anti-IGF-IR P03/101-PFA 2.13.2 y 4.9.2 reducen IGF-IR en tumores 3T3-IGF-IR. La Figura 7 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento del tumor 3T3-IGF-IR in vivo, solo (panel izquierdo) o en combinación con adriamicina (panel derecho) . La Figura 8 muestra la relación entre los niveles en suero del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 y la disminución de la actividad de IGF-IR en tumores 3T3-IGF-IR. La Figura 9 muestra que dosis múltiples del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor 3T3-IGF-IR in vivo, solo o en combinación con adriamicina. La Figura 10 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe un gran crecimiento de tumor in vivo en combinación con adriamicina. La Figura 11 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento del tumor Coló 205 in vivo, solo o en combinación con 5-desoxiuridina (5-FU) . La Figura 12 muestra que dosis múltiples del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor Coló 205 in vivo, solo o en combinación con 5-FU. La Figura 13 muestra que dosis múltiples del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo solo o en combinación con taxol.
P03/101-PFA La Figura 14 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo, solo (panel izquierdo) o en combinación con adriamicina (panel derecho) . La Figura 15 muestra que dosis múltiples del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo, solo o en combinación con tamoxifen. La Figura 16 muestra que dosis múltiples del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor A431 in vivo, solo o en combinación con el inihibidor de la tirosinaquinasa del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGF-R) CP-358.774. La Figura 17 muestra una evaluación farmacocinética de una sola inyección intravenosa de un anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 en monos Cynomologus . La Figura 18 muestra que la combinación de anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 y adriamicina aumenta la disminución de la actividad de IGF-IR sobre tumores 3T3-IGF-IR in vivo. La Figura 19A muestra el número de mutaciones en diferentes regiones de las cadenas pesadas y livianas de 2.13.2 y 2.12.1 en comparación con las secuencias germinales . Las Figuras 19A-D muestran los alineamientos de las P03/101-PFA secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos 2.13.2 y 2.12.1 con las secuencias de la línea germinal de las cuales están derivadas. La Figura 19B muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 2.13.2 (SEQ ID NO: 45) con la secuencia de la línea germinal DP-47 (3-23) /D6-19/JH6 (SEQ ID NO: 46) . La Figura 19C muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana del anticuerpo 2.13.2 (SEQ ID NO: 47) con la secuencia A30/Jk2 de la línea germinal (SEQ ID NO: 48) . La Figura 19D muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1 (SEQ ID NO: 49) con la secuencia DP-35 (3-11) /D3-3/JH6 de la línea germinal (SEQ ID NO: 50) . La Figura 19E muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana del anticuerpo 2.12.1 (SEQ ID NO: 51) con la secuencia A30/Jkl de la línea germinal (SEQ ID NO: 52) . En las Figuras 19B-E, las secuencias señal están representadas en cursiva, las CDRs están subrayadas, los dominios constantes están en negrita, y las mutaciones de las regiones framework (FR) [N. de T.: regiones poco variables de las inmunoglobulinas] están señaladas con un signo "+" sobre el residuo aminoácido y las mutaciones de las regiones CDR están P03/101-PFA señaladas con un asterico sobre el residuo aminoácido.
OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un anticuerpo aislado o una porción que liga antígeno del mismo que se liga a IGF- IR, preferentemente a un anticuerpo que se liga al IGF-IR de primates y humanos, y más preferentemente a un anticuerpo que es un anticuerpo humano. La invención provee un anticuerpo anti-IGF-IR que inhibe la ligadura de IGF-I o IGF-II a IGF-IR, y también provee un anticuerpo anti-IGF-IR que activa IGF-IR. La invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además otro componente, tal como un agente anti-tumoral o un reactivo para diagnóstico por imagen. La invención también provee métodos diagnósticos y terapéuticos. Los métodos diagnósticos incluyen un método para diagnosticar la presencia o ubicación de un tejido que expresa IGF-IR usando un anticuerpo anti-IGF-IR. Un método terapéutico comprende administrar el anticuerpo a un sujeto que lo necesita, pref rentemente conj ntamente con la administración de otro agente terapéutico.
P03/101-PFA La invención provee una linea celular aislada, tal como un hibridoma, que produce un anticuerpo anti-IGF-IR. La invención también provee moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y/o liviana, o porciones que ligan antigeno de la misma, de un anticuerpo anti-IGF-IR. La invención provee vectores y células hospedantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico, como asi también métodos para producir recombinantemente los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico . También se proveen animales transgénicos no humanos que expresan la cadena pesada y/o liviana, o porciones que ligan antigeno de la misma, de un anticuerpo anti-IGF-IR. La invención también provee un método para tratar un sujeto que necesita tal tratamiento con una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y/o liviana, o porciones que ligan antigeno de la misma, de un anticuerpo anti-IGF-IR.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y técnicas generales Salvo que se indique lo contrario, los términos P03/101-PFA cientificos y técnicos usados en conexión con la presente invención deben tener los significados entendidos comúnmente por los entendidos en el arte. Además, siempre que el contexto no requiera lo contrario, los términos en singular deben incluir el plural y los términos en plural deben incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en ésta son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en el arte . Los métodos y las técnicas de la presente invención son realizadas generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en el arte y según lo descrito en varias referencias generales y más específicas que son citadas y discutidos en toda la presente memoria descriptiva, siempre que no se indique lo contrario. Vea, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Cold Spirng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Pxotocols in Molecular Blology, Greene Publishing Associates (1992) , y Harlow and Lañe Antibodies : A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), los que P03/10I-PFA son incorporados en ésta por referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación son realizadas de acuerdo con las especificaciones del fabricante según lo realizado comúnmente en el arte o de acuerdo con lo descrito en ésta. Las nomenclaturas usadas en conexión con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritos en ésta son aquellos bien conocidos y usados comunmente en el arte. Se usan técnicas estándar para síntesis química, análisis químicos, preparaciones farmacéuticas, formulaciones, administración y tratamiento de pacientes. Los términos siguientes, salvo indicación en contrario, deben ser entendidos con los significados siguientes . El término "polípéptido" comprende proteínas naturales o artificiales, fragmentos proteicos y análogos polipeptídicos de una secuencia proteica. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o un polipéptido que debido a su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes que lo acompañan en su estado natural, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por P03/101-PFA una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza- Por lo tanto, un polipéptido que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula en la cual se origina naturalmente será "aislado" de los componentes con los que está asociado naturalmente. Una proteína también puede ser convertida en una proteína sustancialmente libre de componentes con los cuales está asociada naturalmente por medio de una aislación que usa técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en el arte. Una proteína o un polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una sola especie de polipéptido. El polipéptido o la proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o una proteína sustancialmente puro comprenderá típicamente aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% p/p de una muestra proteica, más usualmente aproximadamente 95%, y preferentemente el polipéptido tendrá una pureza mayor del 99%. La pureza o la homogeneidad de la proteína puede ser indicada por un número de medios bien conocidos en el arte, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de P03/10I-PFA proteína, seguido por la visualizacion de una sola banda de polipéptido al colorear el gel con un colorante bien conocido en el arte. Para ciertos propósitos, puede proveerse una resolución mayor usando HPLC u otros medios de purificación bien conocidos en el arte. El término "fragmento de polipéptido", según lo usado en ésta, hace referencia a un polipéptido que tiene una deleción de un terminal amino y/o un terminal carboxi, pero en el cual la secuencia de aminoácidos remanente es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que ocurre naturalmente. Fragmentos típicos tienen una longitud de 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos 14 aminoácidos, y m s preferentemente una longitud de al menos 20 aminoácidos, usualmente una longitud de al menos 50 aminoácidos, y aún más preferentemente una longitud de al menos 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos. El término "polipéptido análogo", según lo usado en ésta, hace referencia a un polipéptido que está compuesto de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos y que tiene al menos una de las propiedades siguientes: (1) ligadura especifica a IGF-IR bajo P03/101-PFA condiciones adecuadas de ligadura, (2) capacidad para bloquear la ligadura de IGF-I o IGF-II al IGF-IR, o (3) la capacidad de reducir la expresión de IGF-IR en la superficie celular o la fosforilación de tirosina in vitro o in vivo. Típicamente, los polipéptidos análogos comprenden una sustitución (o inserción o deleción) de aminoácidos conservativos con respecto a la secuencia que ocurre naturalmente. Análogos típicos tienen una longitud de al menos 20 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos o mayor, y los análogos pueden tener muchas veces la longitud del polipéptido de longitud completa que ocurre naturalmente . Sustituciones preferidas de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) modifican la afinidad de ligadura para formar complejos proteicos, (4) modifican afinidades de ligadura, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos . Los análogos pueden incluir varias mutaciones de una secuencia diferentes de la secuencia peptídica que se encuentra naturalmente. Por ejemplo, pueden efectuarse sustituciones simples o múltiples de P03/101-PFA aminoácidos (preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativos) en la secuencia natural (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del (de los) dominio (s) que forma (n) contactos intermoleculares). Una sustitución con un aminoácido conservativo no debe modificar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un reemplazo de un aminoácido no debe tender a romper una hélice que existe en la secuencia parental, o romper otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia parental) . Ejemplos de estructuras polipéptidas secundarias y terciarias reconocidas por el arte están descritos en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds . , Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); y Thornton et al., Nature 354: 105 (1991)), que son incorporados cada uno en ésta por referencia. Análogos no peptidicos son usados comúnmente en la industria farmacéutica como drogas con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptidicos son llamados "péptidomiméticos" . Fauchere, J. Adv. Drug. Res. 15: 29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.
P03/I01-PFA 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem, 30: 1229 (1987), incorporados en ésta por referencia. Tales compuestos son desarrollados muchas veces con la ayuda de un modelaje molecular coiaputarizado . Los peptidomiméticos que tienen una estructura similar a los péptidos terapéuticamente útiles pueden ser usados para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada) , tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado entre el grupo formado por: -CH2NH-, -C¾S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans) -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -C¾SO-, por métodos bien conocidos en el arte. También puede usarse la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, P-lisina en lugar de L-lisina) , para generar péptidos más estables. Además, péptidos minimizados (constrained peptides) que comprenden una secuencia de consenso o una secuencia de consenso sustancialmente idéntica, pueden ser generados por métodos conocidos en el arte (Rizo and Gxerasch Ann. Rev. Biochem. , P03/101-PFA 61: 387 (1992), incorporado en ésta por referencia); por ejemplo, por agregar residuos internos de cisteina capaces de formar puentes intramoleculares de disulfuro que ciclizan el péptido. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptidicas, teniendo cada par una cadena "liviana" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, primariamente responsables por el reconocimiento del antigeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante, responsable primariamente por la función activa. Las cadenas livianas humanas son clasificadas como cadenas livianas ? y ?. Las cadenas pesadas son clasificadas como µ, ?, ?, ó e, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas pesadas y livianas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Vea en general, P03/101-PFA Fundamental Immunology, Capitulo 7 (Paul, W. , editores, 2o edición, Raven Press, N.Y. (1989)) incorporado en ésta por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Las regiones variables de cada par de cadenas liviana/pesada forman el sitio de ligadura del anticuerpo, de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de ligadura. Las cadenas de una inmunoglobulina exhiben la misma estructura general de regiones framework (FR) relativamente conservativas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementaridad o CDRs . Las CDRs de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones framework, permitiendo la ligadura a un epitope específico. Desde el terminal N hasta el terminal C, ambas cadenas livianas y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de abat Sequences of Proteins of Immunologica.1 Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989) . Un "anticuerpo" hace referencia a una inmunoglobulina intacta, o a una porción de la misma que se une a antígeno P03/101-PFA que compite con el anticuerpo intacto para una ligadura especifica. Las porciones que ligan antígeno pueden ser producidas por técnicas de DNA recom inante o por segmentación enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones que ligan antígeno incluyen, inter alia, fragmentos Fab, Fab1, (ab' )2/ Fv, dAb y de la región determinante complementaria (CDR) , anticuerpos de cadena simple (scFv) , anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina suficiente para conferir al polipéptido la capacidad de ligarse con un antígeno específico. Según lo usado en ésta, un anticuerpo al cual se hace referencia como, por ejemplo, 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 y 6.1.1 es un anticuerpo que está derivado del hibridoma del mismo nombre Por ejemplo/ el anticuerpo 2.12.1 está derivado del hibridoma 2.12.1. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH I; un fragmento F(ab' )2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en una región de bisagra; un fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH 1; un fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward P03/101-PFA et al., Nature 341: 544-546, 1989) consiste de un dominio VH. Un anticuerpo de cadena simple (scFv) es un anticuerpo en el cual una región VL y una región VH están apareadas para formar una molécula monovalente vía un engarce sintético que permite a las regiones ser fabricadas como una sola cadena proteica (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 y Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988) . Los diacuerpos (diabodies) son anticuerpos bivalentes, biespecificos, en los cuales dominios VH y VL son expresados sobre una sola cadena polipéptida, pero usando un engarce que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, forzando los dominios de este modo a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de ligadura de antigeno (vea, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444- 6448, 1993 y Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1121-1123, 1994) . Una o más CDRs pueden ser incorporadas en una molécula, ya sea covalentemente o no covalentemente, para transformarla en una inmunoadhesina . Una inmunoadhesina puede incorporar la(s) CDR(s) como parte de una cadena polipeptxdica mayor, puede ligar covalentemente la(s) CDR(s) a otra cadena polipeptidica o puede incorporar la(s) P03/10I-PFA CDR(s) covalentemente . Las CDRs permiten que la inmunoadhesina se ligue específicamente a un antígeno particular de interés. Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de ligadura. Si existe más de un sitio de ligadura, los sitios de ligadura pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina natural tiene dos sitios de ligadura idénticos, un anticuerpo de cadena simple o un fragmento Fab tiene un sitio de ligadura, mientras que un anticuerpo "bioespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de ligadura diferentes. Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes con los cuales está asociado naturalmente, incluyendo otros anticuerpos asociados naturalmente, que lo acompañan en su estado natural, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente o (4) no se encuentra en la naturaleza. Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-IGF-IR que ha sido purificado por afinidad usando IGF-IR, un anticuerpo anti-IGF-IR que ha sido sintetizado por un hibridoma u otra línea celular in vitro, y un anticuerpo anti-IGF-IR humano derivado de un ratón transgénico.
P03/101-PFA El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de la inmunoglobulina humana. En una realización preferida, todos los dominios variables y constantes están derivados de las secuencias de la inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano) . Estos anticuerpos pueden ser preparados de varios modos según lo descrito más abajo. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que está derivado de una especie no humana, en el cual ciertos aminoácidos en los dominios framework y constantes de las cadenas pesada y liviana han sido sometidos a mutación para evitar o anular una respuesta inmune en humanos. Alternativamente, un anticuerpo humanizado puede ser producido por la fusión de dominios constantes de un anticuerpo humano a los dominios variables de una especie no humana. Ejemplos de modos de fabricación, de anticuerpos humanizados pueden encontrarse en las Patentes de los Estados Unidos Nos: 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes. En una realización preferida, una o más de las CDRs están P03/101-PFA derivadas de un anticuerpo anti-IGF-IR humano. En una realización más preferida, todas las CDRs están derivadas de un anticuerpo anti-IGF-IR humano. En otra realización preferida, las CDRs de más de un anticuerpo anti-IGF-IR humano están mezcladas y unidas en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de una cadena liviana de un primer anticuerpo anti-IGF-IR que puede ser combinada con CDR2 y CDR3 de la cadena liviana de un segundo anticuerpo anti-IGF-IR humano, y las CDRs de la cadena pesada pueden ser derivadas de un tercer anticuerpo anti-IGF-IR humano. Además, las regiones frame ork pueden estar derivadas de uno de los mismos anticuerpos anti-IGF-IR, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. Un "anticuerpo neutralizante" o un "anticuerpo inhibitorio" es un anticuerpo que inhibe la ligadura de IGF-IR a IGF-I cuando un exceso del anticuerpo anti-IGF-IR reduce la cantidad de IGF-I ligado a IGF-IR en al menos aproximadamente 20%. En una realización preferida, el anticuerpo reduce la cantidad de IGF-I ligado a IGF-IR en al menos 40%, más preferentemente 60%, aún más preferentemente 80%, o aún más preferentemente 85%. La P03/101-PFA reducción de la ligadura puede ser medida por cualquier medio conocido ppr un entendido en el arte, por ejemplo, por medio del ensayo de ligadura competitiva in vítro. Un ejemplo de la medición de la reducción de la ligadura de IGF-I a IGF-IR está presentado más abajo en el Ejemplo IV. ün "anticuerpo activante" es un anticuerpo que activa IGF-IR en al menos aproximadamente 20% cuando es agregado a una célula, un tejido u organismo que expresa IGF-IR. En una realización preferida, el anticuerpo activa la actividad del IGF-IR en al menos 40%, más preferentemente 60%, aún más preferentemente 80%, o aún más preferentemente 85%. En una realización más preferida, el anticuerpo activante es agregado en presencia de IGF-I o IGF-II. En otra realización preferida, la actividad del anticuerpo activante es medida por la determinación de la cantidad de autofosforilación de la tirosina del IGF-IR. Los fragmentos o análogos de anticuerpos pueden ser preparados fácilmente por los entendidos en el arte siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva. Los terminales amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se encuentran cerca de los limites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden ser identificados por la comparación de los datos de P03/101-PFA las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con los datos de bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferentemente, se usan métodos de comparación computarizados para identificar motivos secuenciales o dominios previstos de conformación proteica que se encuentran en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Son conocidos métodos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al., Science 253: 164 (1991). El término "resonancia en la superficie de un sensor recubierto con la muestra" (surface plasmon resonance), según lo usado en ésta, hace referencia a un fenómeno óptico que permite el .análisis de interacciones bioespecificas en tiempo real por la detección de alteraciones de concentraciones proteicas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, üppsala, Suecia, y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, vea Jonsson U. et al., (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al., (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B. et al (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; y Johnson, B., et al (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277. El término " 0ff" hace referencia a la constante del P03/101-PFA grado de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno. El término " d" hace referencia a la constante de afinidad de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "epítope" incluye un determinante proteico capaz de ligarse específicamente a un receptor de inmunoglobulina o célula T. Los epítopes (determinantes proteicos) consisten usualmente de grupos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen usualmente características estructurales tridimensionales específicas, como así también características de carga específica. Se dice que un anticuerpo se liga específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 µ?, preferentemente < 100 uM y más preferentemente < 10 nM. De acuerdo con lo usado en ésta, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaciones siguen el uso convencional. Vea I munology - A Synthesis (Segunda Edición, E.S. Golub y D. R. Gren, editores, Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que es incorporado en ésta por referencia. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-,a- P03/101-PFA disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetil-lisina, s-N-acetil-lisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en ésta, la posición de la izquierda es la posición del terminal amino y la posición de la derecha es la posición del terminal carboxi, de acuerdo con el uso y la convención estándar. El término "polinucleótido" , de acuerdo con lo referido en ésta, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye las formas de una sola hebra y de hebra doble del DNA. El término "polinucleótido aislado", según lo usado en ésta, significará un polinucleótido de origen genómico, cDNA, o sintético o alguna combinación de los mismos. Debido a su origen, el "polinucleótido aislado" (1} no está P03/101-PFA asociado con todo el, o una porción del, polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" es encontrado naturalmente, (2) está ligado operativamente a un polinucleótido al cual no está ligado en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. • El término "oligonucleótido" referido en ésta incluye nucleótidos encontrados naturalmente, y nucleótidos modificados, enlazados entre si por enlaces oligonucleotídicos que se encuentran o no en la naturaleza. Los oligonucleótidos son un subco unto de polinucleótido que comprende una longitud de 200 bases o menor. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases y más preferentemente una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases. Los oligonucleótidos tienen usualmente una sola hebra, por ejemplo, para sondas, si bien oligonucleótidos pueden tener dos hebras, por ejemplo para ser usados en la construcción de un mutante de gen. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. El término "nucleótidos que se encuentran naturalmente" referido en ésta incluye desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos . El término P03/101-PFA "nucleótidos modificados" referido en ésta incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y semejantes. El término "enlaces oligonucleotídicos" referido en ésta, incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato, y semejantes. Vea, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucí. Acids. Res., 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp . 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford Uhiversity Press, Oxford England (1991)); Stec et al., U.S. Patent No. 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), cuyas revelaciones están incorporadas en ésta por referencia. Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si deseada. Secuencias "enlazadas operativamente" incluyen ambas, secuencias de control de expresión que se encuentran en posición contigua con el gen de interés y secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión", según lo usado en ésta, hace P03/101-PFA referencia a secuencias polinucleotidicas que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, promotoras e intensificadoras; señales de procesamiento de RNA eficientes, tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el mRNA citoplasmático; secuencias que aumentan la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia de consenso de ozak) ; secuencias que aumentan la estabilidad de la proteína; y, si deseado, secuencias que aumentan la secreción de la proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere en dependencia del organismo hospedante; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente el promotor, el sitio de ligadura ribosomal y la secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y la secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" tiene la intención de incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir también componentes P03/10I-PFA adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias conductoras y secuencias de compañero de fusión.
El término "vector", según lo usado en ésta, tiene la intención de hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", término que hace referencia a un bucle circular de DNA de doble hebra en el cual pueden ligarse segmentos adicionales de DNA. Otro tipo de vector es un vector viral, en el cual segmentos de DNA adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden ser integrados en el genoma de una célula hospedante al ser introducidos en la célula hospedante, y de este modo son replicados conjuntamente con el genoma del hospedante. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están lig-ados operativamente. A tales vectores se hace referencia en ésta como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los P03/101-PFA vectores de expresión útiles en las técnicas de DNA recombinante se encuentran muchas veces en la forma de plásmido. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden ser usados en forma intercambiable,, ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, la invención tiene la intención de incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) , que tienen funciones equivalentes . El término "célula hospedante recombinante" (o simplemente "célula hospedante"), de acuerdo con lo usado en ésta, tiene la intención de referirse a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe ser entendido que tales términos tienen la intención de no referirse solamente a la célula objeto particular, sino a la progenie de tal célula. Como pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas, debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie de hecho puede ser no idéntica a la célula parental, pero aún está incluida dentro del alcance del término "célula hospedante" como usado en ésta. El término "hibridar selectivamente" referido en ésta P03/101-PFA significa ligar en forma detectable y especifica. Polinucleótídos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención hibridan selectivamente con hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan la ligadura de cantidades detectables apreciables a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "elevada severidad" o "altamente estrictas" para lograr condiciones de hibridación selectiva, condiciones que son conocidas en el arte y discutidas en ésta. Un ejemplo de condiciones de "elevada severidad" o "altamente estrictas" son presentadas en un método para incubar un polinucleótido con otro polinucleótido, método en el cual un polinucleótido puede ser fijado a una superficie sólida, tal como una membrana, en un buffer de hibridación de SSPE o SSC 6X, formamida al 50%, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5%, 100 µg m.l desnaturalizado, DNA de esperma de salmón fragmentado a una temperatura de hibridación de 42 °C durante 12-16 horas, seguido por dos lavados a 55 °C usando un buffer de lavado de SSC IX, SDS al 0,5%. Vea también Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55. El término "porcentaje de identidad de secuencias", en el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos, hace P03/101-PFA referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando las secuencias son alineadas para su máxima correspondencia. La longitud de la secuencia en la cual se compara la identidad puede tener una extensión de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más usualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferentemente al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. En el arte se conoce un número de algoritmos diferentes que pueden ser usados para medir la identidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, secuencias de polinucleótidos pueden ser comparadas usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas de la versión 10.0 del paquete de Software Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, isconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, provee alineamientos y porcentaje de identidad de secuencias de las regiones que presentan la mejor superposición entre las secuencias problema y de referencia (between the query and search sequences) (Pearson, Methods Enzymol, 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000): Pearson, Methods P03/10I-PFA Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); incorporados en ésta por referencia). Siempre que no sea especificado de otro modo, se usan parámetros predeterminados para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencias entre ácidos nucleicos puede ser determinado usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntaje) o usando Gap con sus parámetros predeterminados provistos en la versión 6.1 de GCG, incorporada en ésta por referencia. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico comprende su complemento, siempre que no sea especificado de otro modo. Por lo tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular comprende su hebra complementaria, que es su secuencia complementaria. En el arte de la biología molecular, los investigadores usan los términos "porcentaje de identidad de secuencias", "porcentaje de similitud de secuencias" y "porcentaje de homología de secuencias" en forma intercambiable. En esta Solicitud, estos términos deben tener el mismo significado solamente con respecto a secuencias de ácidos nucleicos.- P03/10J-PFA El término "similitud sustancial" o "similitud sustancial de secuencia", al hacer referencia a un ácido nucleico o un fragmento del mismo, indica que al alinear el ácido nucleico óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria) , existe una identidad de secuencias de nucleótidos en al menos aproximadamente 85%, preferentemente al menos aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases nucleotidicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido para determinar la identidad de secuencias, tal como FASTA, BLAST o Gap, discutidos precedentemente . Si el término "identidad sustancial" es aplicado a polipéptidos, significa que cuando dos secuencias peptidicas son alineadas óptimamente, tal como por el programa GAP o BESTFIT, usando pesos predeterminados del intervalo no homólogo (gap), comparten una identidad de secuencias de al menos 75% u 80%, preferentemente al menos una identidad de secuencias de 90% o 95%, aún más preferentemente una identidad de secuencias de al menos 98% o 99%, Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticos difieren en sustituciones con aminoácidos P03/101-PFA conservativos . Una "sustitución con un aminoácido conservativo" es una sustitución en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo ) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) . En general, una sustitución con un aminoácido conservativo no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los cuales dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencias o el grado de similitud puede ser ajustado hacia arriba para compensar la sustitución conservativa. Medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los entendidos en el arte. Vea, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol . 24: 307: 31 (1994), incorporada en ésta por referencia. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales aüfáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxil-aüfáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptóf no; 5) cadenas laterales básicas: glicina, arginina e P03/101-PFA histidina; y 6) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina . Alternativamente, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de semejanza logarítmica (log-likelihood matrix) PAM250 revelada en Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992), incorporada en ésta por referencia. Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de semejanza logarítmica PAM250. la similitud de secuencias para polipéptidos, a la cual también se hace referencia como identidad de secuencias, es medida típicamente usando software para análisis de secuencias. Un software para análisis de proteínas compara secuencias similares, usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones con aminoácidos conservativos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" o "Bestfit" que pueden ser usados con parámetros predeterminados para determinar P03/10I-PFA homologia de secuencias o. identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteina natural y una mutación de la misma. Vea, por ejemplo, GCG, Versión 6.1. Las secuencias polipeptidicas también pueden ser comparadas usando FASTA con parámetros predeterminados o recomendados, que es un programa en GCG, Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3 ) provee alineaciones y porcentajes de identidad de secuencias de las regiones de mejor superposición entre las secuencias problema y de referencia (query and search sequences) (Pearson (1990) , Pearson (2000) ) . Otro algoritmo preferido, al comparar una secuencia de la invención con una base de datos que tiene un gran número de secuencias de diferentes organismos, es el programa para computadora BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros predeterminados. Vea, por ejemplo, Atschul et al., J. Mol. Biol . 215: 403-410 (1990); Atschul et al., Nucleic Acids Res: 25: 3389-402 (1997); incorporados en ésta por referencia. La longitud de las secuencias polipeptidicas cuya homología se compara será generalmente de al menos aproximadamente 16 residuos de aminoácidos, usualmente de P03/I01-PFA al menos aproximadamente 20 residuos, más usualmente de al menos aproximadamente 24 residuos, típicamente de al menos aproximadamente 28 residuos, y preferentemente más de aproximadamente 35 residuos. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos . De acuerdo con lo usado en ésta, los términos "marcador" o "marcado" hacen referencia a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una realización, el marcador es un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido con marcador radioactivo o fijación a un polipéptido de grupos biotinilo que pueden ser detectados por avidina marcada (por ejemplo, streptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por métodos ópticos o colorimétricos) . En otra realización, el marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de droga o toxina. En el arte se conocen varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas que pueden ser usados.
Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, U1ln, P03/101-PFA , marcadores fluorescentes, por ejemplo, FITC, rodamina, sustancias fosforescentes a base de lantámidos, marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , marcadores quimioluminescentes, grupos biotinilo, epitopes polipeptidicos predeterminados reconocidos por un repórter secundario, (por ejemplo, secuencias apareadas de cierres de leucina (leucine zipper pair sequences), sitios de ligadura para anticuerpos secundarios, dominios que ligan metales, etiquetas de epitopes), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-de idrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas realizaciones, los marcadores están unidos por brazos espaciadores de longitud variable para reducir el potencial de impedimiento estérico. El término "agente" es usado en ésta para significar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, P03/101-PFA una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos. El término "agente farmacéutico o droga" según lo usado en ésta, hace referencia a un compuesto o una composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado al ser administrado apropiadamente a un paciente. Otros términos químicos en ésta son usados de acuerdo con el uso convencional en el arte, según lo e emplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker s., Ed., McGraw-Hill, San Francisco, (1985) ) , incorporado en ésta por referencia. El término "agente antineoplástico" es usado en ésta para hacer referencia a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o la progresión de un neoplasma en un humano, particularmente de una lesión maligna (cancerosa) , tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. Una propiedad frecuente de agentes neoplásticos es la inhibición de metástasis. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios. Anticuerpos anti-IGF-IR y caracterización de los mismos Los anticuerpos humanos evitan ciertos problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o P03/101-PFA constantes de ratón o rata. La presencia de tales secuencias derivadas de ratón o rata puede llevar a una rápida desaparición de los anticuerpos o puede llevar a lá generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente. Por lo tanto, en una realización, la invención provee anticuerpos anti-IGF-IR. En una realización preferida, la invención provee anticuerpos anti-IGF-IR completamente humanos por la introducción de genes de inmunoglobulina humana en un roedor, de modo que el roedor produce anticuerpos completamente humanos. Más preferidos son anticuerpos anti-IGF-IR humano completamente humanos. Se espera que anticuerpos anti-IGF-IR completamente humanos minimizan las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a anticuerpos monoclonales de ratón y derivati zados de ratón y que aumentan de este modo la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos completamente humanos provee una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación y cáncer, que pueden requerir administraciones repetidas del anticuerpo. En otra realización, la invención provee un anticuerpo anti-IGF-IR que no se liga con un complemento .
P03/101-PFA En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 o 22, o una o más CDRs de estas secuencias de aminoácidos. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 o 24 o una o más CDRs de estas secuencias de aminoácidos. Clases y subclases de anticuerpos anti-IGF-IR El anticuerpo puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En una realización preferida, el anticuerpo es una IgG y es un subtipo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG . En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es de la subclase IgG2. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es de la misma clase y subclase del anticuerpo 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, que es de clase IgG2. La clase y subclase de anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser determinadas por cualquier método conocido en el arte. En general, la clase y subclase de un anticuerpo pueden ser determinadas usando anticuerpos que son específicos para P03/101-PFA una clase y subclase particular del anticuerpo. Tales anticuerpos son disponibles comercialmente . La clase y subclase puede ser determinada por ELISA, transferencia de Western, como asi también por otras técnicas. Alternativamente, la clase y subclase pueden ser determinadas por la secuenciación del total o una porción de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o livianas de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos. Selectividad para especies y moléculas En otro aspecto de la invención, el anticuerpos anti-IGF-IR demuestra selectividad para especies y selectividad molecular. En una realización, el anticuerpo anti-IGF-IR se liga con IGF-IR de humanos, de Macoca cynomologus o de rhesus. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR no se liga con IGF-IR de ratón, rata, conejo de las Indias, perro o conejo. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR no se liga a una especie de mono New World, tal como marmoset. Siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva, se puede determinar la selectividad para especies del anticuerpo anti-IGF-IR usando métodos P03/I01-PFA bien conocidos en el arte. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad para especies usando Western blot, FACS, ELISA o RIA. En una realización preferida, puede determinarse la selectividad para especies utilizando Western blot. En otra realización, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una selectividad para IGF-IR al menos 50 veces mayor que su selectividad para el receptor de insulina. En una realización preferida, la selectividad del anticuerpo anti-IGF-IR es más de 100 veces mayor que su selectividad para el receptor de insulina. En una realización aún más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR no exhibe una unión especifica apreciable con cualquier proteina que no sea IGF-IR. La selectividad del anticuerpo anti-IGF-IR para IGF-IR puede ser determinada usando métodos bien conocidos en el arte, siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad usando Western blot, FACS, ELISA o RIA. En una realización preferida, puede determinarse la selectividad molecular usando Western blot. Afinidad de ligadura de Anti-IGF-IR a IGF-IR En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-IGF-IR se ligan a IGF-IR con una afinidad elevada. En una P03/101-PFA realización, el anticuerpo anti-IGF-IR se liga con IGF-IR con una KD de 1 x 10~8 M o menor. En una realización más preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con una Ko de 1 x 10~;' M o menor. En una realización aún más preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con una KD de 5 x 10"lu M o menor. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con una KD 1 x 10"i0 M o menor. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con sustancialmente la misma KD como un anticuerpo seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1.
En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con sustancialmente la misma ¾ como un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En aún otra realización preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con sustancialmente la misma KD como un anticuerpo que comprende una de las secuencias aminoácidas seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con sustancialmente la misma D como un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, P03/101-PFA 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una velocidad de disociación baja. En una realización, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una K0ff de 1 x 10"4 s-1 o menor. En una realización preferida, la Koff es 5 x 10_s s_J o menor. En otra realización, preferida, la off es sustancialmente la misma como la de un anticuerpo seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga con IGF-IR con sustancialmente la misma K.ff como un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En aún otra realización preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con sustancialmente la misma c,ff como un anticuerpo que comprende una de las secuencias aminoácidas seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a IGF-IR con sustancialmente la misma Koff como un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22. La afinidad de ligadura y la velocidad de disociación P03/101-PFA entre un anticuerpo anti-IGF-IR y el receptor IGF-IR pueden ser determinadas por cualquier método conocido en el arte. En una realización, la afinidad de ligadura puede ser medida por ensayos competitivos ELISAs, RIAs o resonancia en la superficie de un sensor recubierto con la muestra, tal como BIAcore. La velocidad de disociación también puede ser medida por resonancia en la superficie de un sensor recubierto con la muestra. En una realización más preferida, la afinidad de ligadura y la velocidad de disociación son medidas por resonancia en la superficie de un sensor recubierto con la muestra (surface plasmon resonance) . En una realización aún más preferida, la afinidad de ligadura y la velocidad de disociación son medidas usando un BIAcore. Un ejemplo de la determinación de afinidad de ligadura y velocidad de disociación está descrito más abajo en el Ejemplo II. Vida media de anticuerpos anti-IGF-IR De acuerdo con otro objeto de la invención, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una vida media de al menos un dia in vitro o in vivo. En una realización preferida, el anticuerpo o una porción del mismo tiene una vida media de al menos tres dias. En una realización más preferida, el anticuerpo o una porción del mismo tiene una vida media de P03/101-PFA cuatro días o mayor. En otra realización, el anticuerpo o una porción del mismo tiene una vida media de ocho días o mayor. En otra realización, el anticuerpo o una porción del mismo que se liga a antígeno es derivatizado o modificado de modo que tiene una vida media más larga, según lo discutido más abajo. En otra realización preferida, el anticuerpo puede contener mutaciones puntuales para aumentar la vida media en suero, tal como descrito en la WO 00/09560, publicada el 24 de febrero de 2000. La vida media del anticuerpo puede ser medida por cualquier medio conocido para los entendidos en el arte. Por ejemplo, la vida media del anticuerpo puede ser medida por Western blot, ELISA o RIA durante un período de tiempo apropiado. La vida media del anticuerpo puede ser medida en cualquier animal apropiado, por ejemplo, un mono, tal como un Cynomologus, un primate o un humano. Identificación de epitopes del IGF-IR reconocidos por el anticuerpo anti-IGF-IR. La invención también provee un anticuerpo anti-IGF-IR que se liga con el mismo antígeno o epítope como un anticuerpo anti-IGF-IR humano. Además, la invención provee un anticuerpo anti-IGF-IR que compite en forma cruzada con un anticuerpo anti-IGF-IR humano. En una realización P03/101-PFA preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR humano es 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR comprende una o más CDRs de un anticuerpo seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En aún otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR humano comprende una de las secuencias aminoácidas seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR humano comprende una o más CDRs de un anticuerpo que comprende una de las secuencias aminoácidas seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24. En una realización altamente preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es otro anticuerpo humano. Es posible determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR se liga al mismo antigeno usando una variedad de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR de ensayo se liga al mismo antigeno, usando un anticuerpo anti-IGF-IR para capturar un antigeno del cual se sabe que se liga al anticuerpo anti-IGF-IR, tal como IGF-IR, eluyendo el antigeno del anticuerpo, y determinando luego si el anticuerpo de ensayo se ligará al antigeno eludido. Uno puede determinar si un P03/101-PFA anticuerpo se liga al mismo epitope al que se liga un anticuerpo anti-IGF-IR, ligando el anticuerpo anti-IGF-IR a IGF-IR bajo condiciones de saturación, y midiendo luego la capacidad del anticuerpo de ensayo para ligarse a IGF-IR. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de ligarse al IGF-IR simultáneamente con el anticuerpo anti-IGF-IR, entonces el anticuerpo de ensayo se liga con un epitope diferente al que se liga el anticuerpo anti-IGF-IR. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de ligarse al IGF-IR simultáneamente, entonces el anticuerpo de ensayo se liga al mismo epitope al que se liga el anticuerpo anti-IGF-IR. Este experimento puede ser realizado usando ELISA, RIA o resonancia en la superficie de un sensor recubierto con la muestra (surface plasmon resonance) . En una realización preferida, el experimento es realizado usando resonancia en la superficie de un sensor recubierto con la muestra. En una realización más preferida, se usa BIAcore. También puede determinarse si un anticuerpo anti-IGF-IR compite en forma cruzada con un anticuerpo anti-IGF-IR. En una realización preferida, se puede determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR compite en forma cruzada con otro, usando el mismo método usado para medir si el anticuerpo anti-IGF-IR es capaz de ligarse al mismo epitope al que se liga otro P03/101-PFA anticuerpo anti-IGF-IR. Uso de cadenas livianas y pesadas La invención también provee un anticuerpo anti-IGF-IR que comprende secuencias variables codificadas por un gen K humano. En una realización preferida, las secuencias variables son codificadas por cualquier gen de la familia VK A27, A30 u 012. En una realización preferida, las secuencias variables son codificadas por un gen humano de la familia VK 30. En una realización más preferida, la cadena liviana comprende no más de diez sustituciones de aminoácidos de la linea germinal VK A27, A30 u 012, preferentemente no más de seis sustituciones de aminoácidos, y más preferentemente, no más de tres sustituciones de aminoácidos. En una realización preferida, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservativas . Las SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 y 22 proveen las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de seis cadenas livianas ? anti-IGF-IR. Las SEQ ID NOS: 38, 40 y 42 proveen las secuencias de aminoácidos de las tres cadenas livianas ? de la linea germinal de las cuales son derivadas las seis cadenas livianas ? anti-IGF-IR. Las Figuras 1A-1C P03/10I-PFA muestran los- alineamientos de las secuencias nucleotidicas de las regiones variables de las cadenas livianas de los seis anticuerpos anti-IGF-IR entre sí y con las secuencias de la linea germinal de las cuales son derivadas. Siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva, un entendido en el arte puede determinar la secuencia de aminoácidos codificada de las seis cadenas livianas anti-IGF-IR y las cadenas livianas ? de la línea germinal, y puede determinar las diferencias entre las secuencias de la línea germinal y las secuencias del anticuerpo. En una realización preferida, la VL del anticuerpo anti-IGF-IR contiene las mismas sustituciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia del aminoácido de la línea germinal, como cualquiera o varias de las VL de los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. Por ejemplo, la VL del anticuerpo anti-IGF-IR puede contener una o- más sustituciones de aminoácidos que son iguales a las presentes en el anticuerpo 2.13.2, otra sustitución de aminoácido que es igual a la presente en el anticuerpo 2.14.3, y otra sustitución de aminoácido que es igual a la presente en el anticuerpo 4.9.2. De este modo se pueden mezclar y unir diferentes características de ligadura de un anticuerpo para modificar, por ejemplo, la P03/101-PFA afinidad del anticuerpo para IGF-IR o su velocidad de disociación del antígeno. En otra realización, las sustituciones de aminoácidos son efectuadas en la misma posición como las posiciones encontradas en cada una o varias de las VL de los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, pero se hacen sustituciones con aminoácidos conservativos en vez de usar el mismo aminoácido. Por ejemplo, si la sustitución de un aminoácido, en comparación con la linea germinal, en uno de los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, es con glutamato, se puede sustituir conservativamente con aspartato. Similarmente, si la sustitución de un aminoácido es con serina, se puede sustituir conservativamente con treonina. En otra realización preferida, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la VL de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización altamente preferida, la cadena liviana comprende secuencias de aminoácidos que son iguales a las regiones CDR de la cadena liviana de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos de al menos P03/101-PFA una región CDR de la cadena liviana de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, la cadena liviana comprende secuencias de aminoácidos de CDRs de cadenas livianas diferentes. En una realización más preferida, las CDRs de cadenas livianas diferentes son obtenidas de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 o 22. En otra realización, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 o 21, o por una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones en la misma. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones con aminoácidos conservativos. En otra realización, el anticuerpo o una porción del mismo comprende una cadena liviana lambda. La presente invención también provee un anticuerpo anti-IGF-IR o una porción del mismo que comprende una cadena pesada humana o una secuencia derivada de una cadena pesada humana. En una realización, la secuencia de P03/10J-PFA aminoácidos de la cadena pesada es derivada de un gen de la familia VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 o VIV-4/4.35. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es derivada de un gen de la familia VH DP-4 . En una realización más preferida, la cadena pesada comprende no más de ocho cambios de aminoácidos de la linea germinal VK DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 o VIV-4/4.35, más preferentemente, no más de seis cambios de aminoácidos, y aún más preferentemente, no más de tres cambios de aminoácidos . Las SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 y 24 proveen las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de seis cadenas pesadas anti-IGF-IR. Las SEQ ID NOS: 30, 32, 34, 36 y 44 proveen las secuencias de aminoácidos y las SEQ ID NOS: 29, 31, 33, 35 Y 43 proveen las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de la linea germinal DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 y VTV-4, respectivamente. Las Figuras 2A-2D muestran los alineamientos de las secuencias de aminoácidos de la región variable de los seis anticuerpos anti-IGF-IR con sus secuencias de la linea germinal correspondientes . Siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva, un entendido en el arte puede determinar la secuencia de aminoácido codificada de las seis cadenas pesadas anti-IGF-IR y las cadenas pesadas de la linea germinal y puede P03/101-PFA determinar las diferencias entre las secuencias de la linea germinal y las secuencias del anticuerpo. En una realización preferida, la VH del anticuerpo anti-IGF-IR contiene las mismas sustituciones de aminoácidos, con relación a la secuencia de aminoácidos de la linea germinal, como cada una o varias de las VH de los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. Similármente con lo discutido precedentemente, la "VH del anticuerpo anti-IGF-IR puede contener una o más sustituciones de aminoácidos que son las mismas que están presentes en el anticuerpo 2.13.2, otra sustitución de aminoácidos que es la misma como la presente en el anticuerpo 2.14.3 y otra sustitución de aminoácido que es la misma presente en el anticuerpo 4.9.2.
De este modo, se pueden mezclar y unir diferentes características de ligadura del anticuerpo para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo para IGF-IR o su velocidad de disociación del antígeno. En otra realización, las sustituciones de aminoácidos son efectuadas en la misma posición como las posiciones encontradas en cada una o varias de las VH de los anticuerpos 2.12.1, 2,13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, pero se hacen sustituciones P03/101-PFA con aminoácidos conservativos en vez de usar los mismos aminoácidos . En otra realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la VH de 2,12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización altamente preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos que son iguales a las regiones CDR de la cadena pesada de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos una región CDR de la cadena pesada de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos de CDRs de diferentes cadenas pesadas. En una realización más preferida, las CDRs de diferentes cadenas pesadas son obtenidas de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 o 24. En otra realización la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 o P03/10I-PFA 23, o por una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones en la misma. En otra realización, las sustituciones son sustituciones con aminoácidos conservativos . Inhibición de la actividad IGF-IR por un anticuerpo anti-IGF-IR Inhibición de la ligadura de IGF-I a IGF-IR En otra realización, la invención provee un anticuerpo anti-IGF-IR que inhibe la ligadura de IGF-I a IGF-IR o la ligadura de IGF-II a IGF-IR. En una realización preferida, el IGF-IR es humano. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es un anticuerpo humano. En otra realización, el anticuerpo o una porción del mismo inhibe la ligadura entre IGF-IR e IGF-I con una IC50 no mayor de 100 nM. En una realización preferida, la IC50 es no mayor de 10 nM. En una realización más preferida, la IC50 es no mayor de 5 nM. La IC50 puede ser medida por cualquier método conocido en el arte. Típicamente, una IC50 puede ser medida por ELISA o RIA. En una realización preferida, la IC50 es medida por RIA. En otra realización, la invención provee un anticuerpo presencia de IGF-I. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe la fosforilación de tirosina inducida por IGF-IR que ocurre con la ocupación del receptor. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe que se produzcan eventos celulares corriente abajo. Por ejemplo, el anti-IGF-IR puede inhibir la fosforilación de la tirosina de Shc y del sustrato de los receptores de insulina (IRS) 1 y 2, fosforilaciones que se producen normalmente si las células son tratadas con IGF-I (Kim et al., J. Biol . Chem. , 273: 34543-34550, 1998). Es posible determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR puede prevenir la activación de IGF-IR en presencia de IGF-I, determinando los niveles de autofosforilación para IGF-IR, Shc, IRS-1 o IRS-2 por Western blot o inmunoprecipitación . En una realización preferida, se determinan los niveles de autofosforilación de IGF-IR por Western blot. Vea, por ejemplo, Ejemplo VII. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo causa la disminución de la actividad (down regulation) del IGF-IR de una célula tratada con el anticuerpo. En una realización, el IGF-IR es internalizado en el citoplasma de la célula. Después de que el anticuerpo anti-IGF-IR se liga a IGF-IR, el anticuerpo es internalizado, según lo mostrado P03/101-PFA por microscopía con focal. Sin desear ligarse a cualquier teoría, se considera que el complejo anticuerpo anti-IGF-IR es internalizado en un lisosoma o es degradado. Se puede medir la disminución de la actividad del IGF-IR por cualquier método conocido en el arte, incluyendo inmunoprecipitación, microscopía confocal o Western blot. Vea, por ejemplo, Ejemplo VII. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una región que se liga con antígeno del mismo. Activación de IGF-IR por un anticuerpo anti-IGF-IR Otro aspecto de la presente invención implica activar anticuerpos anti-IGF-IR. Un anticuerpo activante difiere de un anticuerpo inhibidor porque amplifica o sustituye los efectos de IGF-I sobre IGF-IR. En una realización, el anticuerpo activante es capaz de ligarse al IGF-IR y de activarlo en ausencia de IGF-I . Este tipo de anticuerpo activante es esencialmente un mimetizador de IGF-I. En otra realización, el anticuerpo activante amplifica el efecto de IGF-I sobre IGF-IR. Este tipo de anticuerpo no activa al IGF-IR de por sí, sino aumenta más bien la activación de IGF-IR en presencia de IGF-I. Un anticuerpo anti-IGF-IR P03/101-PFA mimetizante puede ser distinguido fácilmente de un anticuerpo anti-IGF-IR amplificador al tratar células in vitro con el anticuerpo en presencia o en ausencia de bajos niveles de IGF-I. Si el anticuerpo es capaz de causar activación de IGF-1R en ausencia de IGF-I, por ejemplo, si aumenta la fosforilación de la tirosina del IGF-IR, entonces el anticuerpo es un anticuerpo mimetizante. Si el anticuerpo no puede causar la activación de IGF-IR en ausencia de IGF-I, pero es capaz de amplificar la cantidad de activación del IGF-IR, entonces el anticuerpo es un anticuerpo amplificador. En una realización preferida, el anticuerpo activante es 4.17.3. En otra realización preferida, el anticuerpo comprende una o más CDRs de 4.17.3. En otra realización preferida, el anticuerpo es derivado de cualquiera o de ambas secuencias 012 (cadena liviana) y/o 071 (cadena pesada) de la linea germinal. Inhibición de la fosforilación de la tirosina del IGF-IR, de los niveles de IGF-IR y del crecimiento de células tumorales xn vivo por anticuerpos anti-IGF-IR Otra realización de la invención provee un anticuerpo anti-IGF-IR que inhibe la fosforilación de la tirosina del IGF-IR y los niveles del receptor in vivo. En una realización, la administración del anticuerpo anti-IGF-IR a P03/101-PFA un animal causa una reducción de la señal de fosfotirosina de IGF-IR en tumores que expresan IGF-IR. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR causa una reducción de la señal de fosfotirosina en al menos 20%. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR causa una disminución de la señal de fosfotirosina en al menos 60%, más preferentemente 50%. En una realización aún más preferida, el anticuerpo causa una disminución de la señal de fosfotirosina de al menos 40%, más preferentemente 30%, aún más preferentemente 20%. En una realización preferida, el anticuerpo es administrado aproximadamente 24 horas antes de que sean medidos los niveles de la fosforilación de la tirosina. Los niveles de fosforilación de tirosina pueden ser medidos por cualquier método conocido en el arte, tal como aquellos descritos infra. Vea, por e emplo, Ejemplo III y Figura 5. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una porción que se liga a antigeno del mismo. En otra realización, la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR a un animal causa una reducción en los niveles de IGF-IR en tumores que expresan IGF-IR. En P03/101-PFA una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR causa una reducción en los niveles del receptor de al menos 20%, en comparación con un animal no tratado. En una realización aún más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR causa una disminución en los niveles del receptor a al menos 60%, más preferentemente 50% de los niveles del receptor en un animal no tratado. En una realización aún más preferida, el anticuerpo causa una disminución en los niveles del receptor a al menos 40%, más prefere teme te 30%. En una realización preferida, el anticuerpo es administrado aproximadamente 24 horas antes de la medición de los niveles de IGF-IR. Los niveles de IGF-IR pueden ser medidos por cualquier método conocido en el arte, tal como los descritos infra. Vea, por ejemplo, Ejemplo VIII, Figura 6. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado entre 2.12.1, 2,13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una porción que se liga a antígeno del mismo. En otra realización, un anticuerpo anti-IGF-IR inhibe el crecimiento de una célula tumoral in vivo. La célula tummoral puede estar derivada de cualquier tipo celular, incluyendo, sin limitación células epidemiales, epiteliales, endoteliales, de leucemia, de sarcoma, de P03/101-PFA iuieloma múltiple o mesodermales . Ejemplos de células tumorales incluyen células A549 (carcinoma pulmonar de células no pequeñas), células MCF-7, células Coló 205, células 3T3/IGF-IR y células A431. En una realización preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en comparación con el crecimiento de un tumor en un animal no tratado. En una realización más preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en 50%. En una realización aún más preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en 60%, 65?,, 70% o 75%. En una realización, la inhibición del crecimiento de las células tumorales es medida al menos 7 días después de haber comenzado el tratamiento de los animales con el anticuerpo. En una realización más preferida, la inhibición del crecimiento de las células tumorales es medida al menos 14 días después de comenzar el tratamiento de los animales con el anticuerpo. En otra realización preferida, se administra otro agente antineoplástico al animal, conjuntamente con el anticuerpo anti-IGF-IR. En una realización preferida, el agente antineoplástico es capaz de inhibir un crecimiento ulterior de las células tumorales. En una realización aún más preferida, el agente antineoplástico es adriamicina, taxol, tamoxifen, 5- P03/101-PFA fluorodeoxiuridina (5-FU) o CP-358.774. En una realización preferida, la coadministración de un agente antineoplástico con el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe el crecimiento de las células tumorales en al menos 50%, más preferentemente 60%, 65%, 70% o 75%, más preferentemente, 80%, 85% o 90% después de un periodo de 22-24 días. Vea, por ejemplo, Fig. 7 y Ejemplo IX. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una porción que se liga con antigeno del mismo. Inducción de apoptosis por anticuerpos anti-IGF-IR Otro aspecto de la invención provee un anticuerpo anti-IGF-IR que induce la muerte celular. En una realización, el anticuerpo causa apoptosis. El anticuerpo puede inducir apoptosis o in vivo o in vitro. En general, las células tumorales son más sensibles a apoptosis que células normales, de modo que la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR causa preferentemente apoptosis a una célula tumoral que a una célula normal. En otra realización, la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR disminuye los niveles de una enzima, akt, la que está implicada en la ruta de fosfatidilinositol (PI) quinase. La ruta de la PI quinasa, a su vez, está implicada en la P03/101-PFA proliferación celular y prevención de la apoptosis. Por lo tanto, la inhibición de akt puede causar apoptosis. En una realización más preferida, el anticuerpo es administrado zn vivo para causar apoptosis de una célula que expresa IGF-IR. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1, o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una porción que se liga con antigeno del mismo. Métodos para producir anticuerpos y lineas celulares que producen anticuerpos Inmunización En una realización de la presente invención, anticuerpos humanos son producidos por la inmunización con un antigeno IGF-IR de un animal no humano que comprende alguno o todos los locus de inmunoglobulina humana. En una realización preferida, el animal no humano es un ratón XenoMouse™, que es una cepa de ratón producida por ingeniería genética que comprende grandes fragmentos de los loci de la inmunoglobulina humana y que es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Vea, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21, (1994) y Patentes de los Estados Unidos, 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Vea también WO P03/101-PFA 91/10741, publicada el 25 de julio de 1991, WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambas publicadas el 31 de octubre de 1996, WO 98/16654, publicada el 23 de abril de 1998, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 98/50433, publicada el 12 de noviembre de 1998, WO 99/45031, publicada el 10 de setiembre de 1999, WO 99/53049, publicada el 21 de octubre de 1999, WO 00/09560 publicada el 24 de febrero de 2000 y WO 00/037504, publicada el 29 de junio de 2000. El XenoMouse™ produce un repertorio de anticuerpos humanos completos, semejante al de un humano adulto, y genera anticuerpos monoclonales humanos antigeno-especificos . Una segunda generación del XenoMouse™ contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos por la introducción de fragmentos de YAC con la configuración de la linea germinal, del tamaño de una megabase, de los loci de la cadena humana pesada y los loci de la cadena liviana kappa humana. Vea Méndez et al., Nature Genetics 15; 146-156 (1997), Green and Jakobovits, Exp. Med. 188: 4483-495 (1998) , cuyas revelaciones son incorporadas en ésta por referencia . La invención también provee un método para fabricar anticuerpos anti-IGF-IR a partir de animales no humanos, no P03/I0J-PFA ratón por la inmunización de animales transgénicos no humanos que comprenden loci de la inmunoglobulina humana. Tales animales pueden ser producidos usando los métodos descritos inmediatamente arriba. Los métodos revelados en estas Patentes pueden ser modificados según lo descrito en la Patente de los Estados Unidos 5.994.619. En una realización preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. En otra realización, el animal no humano que comprende loci del gen de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el enfoque de minilocus, se mimetiza un locus de Ig exógena por la inclusión de genes individuales del locus de la Ig. De este modo, uno o más genes VH, uno o más genes DK, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferentemente una región constante gamma) son conformados en una construcción para la inserción en un animal. Este enfoque está descrito, inter3.Ha., en las Patentes US Nos. 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 y 5,643.763, incorporadas en ésta por referencia. Una ventaja del enfoque de minilocus es la rapidez con P03/101-PFA la cual las construcciones que incluyen porciones del locus de la Ig pueden ser generadas e introducidas en animales. Sin embargo, una desventaja potencial del enfoque de minilocus es que la diversidad de inmunoglobulinas puede ser no suficiente para soportar un desarrollo de células B completas, de modo que puede haber una producción baja de anticuerpos . Para producir un anticuerpo anti-IGF-lR, un animal no humano que comprende alguno o todos los loci de la inmunoglobulina humana es inmunizado con un antigeno IGF-IR y el anticuerpo o la célula que produce el anticuerpo es aislada del animal. El antigeno IGF-IR puede ser un IGF-IR aislado y/o purificado y es preferentemente un IGF-IR humano. En otra realización, el antigeno IGF-IR es un fragmento de IGF-IR, preferentemente el dominio extracelular de IGF-IR. En otra realización, el antígeno IGF-IR es un fragmento que comprende al menos un epitope de IGF-IR. En otra realización, el antigeno IGF-IR es una célula que expresa IGF-IR sobre su superficie celular, preferentemente una célula que sobrexpresa IGF-IR sobre su superficie celular. La inmunización de animales puede ser efectuada por cualquier método conocido en el arte. Vea, por ejemplo, P03/101-PFA Harlo y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno y caballos son bien conocidos en el arte. Vea, por ejemplo, Harlow y La e y Patente de los Estados Unidos 5.994.619. En una realización preferida, el antigeno IGF-IR es administrado con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen el adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes ) . Tales adyuvantes pueden proteger el polipéptido de una dispersión rápida, secuestrándolo en un depósito local, o los adyuvantes pueden contener sustancias que estimulan al hospedante para segregar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Preferentemente, cuando se administra un polipéptido, el plan de inmunización implicará dos o más administraciones de polipéptidos, repartidas en varias semanas. El Ejemplo I provee un protocolo para inmunizar un Xenomouse™ con IGF-IR humano de longitud completa en solución fisiológica bufferada con fosfato. Producción de anticuerpos y líneas celulares que producen anticuerpos P03/101-PFA Después de la inmunización de un animal con un antígeno IGF-IR, pueden obtenerse anticuerpos y/o células que producen anticuerpos del animal. Un suero que contiene anticuerpo anti-IGF-IR es obtenido del animal por desangrar o sacrificar al animal. El suero puede ser usado tal como es obtenido del animal, una fracción de inmunoglobulina puede ser obtenida del suero, o los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser purificados del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidos de este modo son policlonales, lo que constituye una desventaja porque la cantidad de anticuerpos que puede ser obtenida es limitada y el anticuerpo policlonal tiene un conjunto de propiedades heterogéneas . En otra realización, hibridomas inmortalizados que producen anticuerpos pueden ser preparados a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal es sacrificado, y las células B del bazo son fusionadas con células de mieloma inmortalizadas, como es bien conocido en el arte. Vea, por ejemplo, Harlow y Lañe, supia. En una realización preferida, las células de mieloma no segregan polipéptidos de iniaunoglobulina (una linea celular no secretoria) . Después de la fusión y la selección del antibiótico, los hibridomas son rastreados usando IGF-IR, P03/101-PFA una porción del mismo, o una célula que expresa IGF-IR. En una realización preferida, el rastreo inicial es realizado usando un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA) , preferentemente un ELISA. Un ejemplo de rastreo con ELISA está provisto en O 00/37504, incorporado en ésta por referencia. En otra realización, las células que producen anticuerpos pueden ser preparadas a partir de un humano que tiene un trastorno autoinmune y que expresa anticuerpos anti-IGF-IR. Células que expresan los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser aisladas, aislando leucocitos y sometiéndolos a selección de células con activación de fluorescencia (fluorescence-activated cell sorting (FACS) ) , o incubando las células sobre placas recubiertas con IGF-IR o una porción del mismo ("panning") . Estas células pueden ser fusionadas con un mieloma no secretorio humano para producir hibridomas humanos que expresan anticuerpos anti-IGF-IR. En general, esta es una realización menos preferida, debido a que es probable que los anticuerpos anti-IGF-IR tengan una afinidad baja para IGF-IR. Los hibridomas que producen anticuerpos anti-IGF-IR son seleccionados, clonados y luego rastreados por hibridoma robusto, elevada producción de anticuerpos y características deseables del anticuerpo, tal como será discutido más abajo. Los hibridomas pueden ser cultivados y expandidos in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en un cultivo celular in vitro. Métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos para los entendidos en el arte. Preferentemente, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y las células B del bazo son fusionadas con un mieloma derivado de la misma especie del animal no humano. Más preferentemente, el animal inmunizado es un XENOMOUSE™ y la linea celular del mieloma es una linea del mieloma no secretorio de ratón, tal como la línea celular del mieloma NS0-bcl2. Vea, por ejemplo, Ejemplo 1. En un aspecto, la invención provee la producción de hibridomas que producen anticuerpos anti-IGF-IR humanos. En una realización preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, según lo descrito precedentemente. En otra realización preferida, los hibridomas son producidos en especies no humanas, no ratón tales como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado bovino o caballos. En otra P03/10J-PFA realización, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales un mieloma no secretorio humano es fusionado con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-IGF-IR. Acidos nucleicos, vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para fabricar anticuerpos Acidos nucleicos Se proveen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-IGF-IR de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o liviana de una inmunoglobulina anti-IGF-IR. En una realización preferida, una sola molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-IGF-IR y otra molécula de ácido nucleico codifica la cadena liviana de una inmunoglobulina anti-IGF-IR. En una realización más preferida, la inmunoglobulina codificada es una inmunoglobulina humana, preferentemente una IgG humana. La cadena liviana codificada puede ser una cadena ? o una cadena K, preferentemente una cadena ?. La molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena liviana puede ser derivada del gen V A30, A27 u 012. En una realización preferida, la cadena liviana es derivada del gen VK A30. En otra realización P03/101-PFA preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana comprende la región de unión (joining región) derivada de J I, JK2 O J 4. En una realización aún más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana contiene no más de diez cambios de aminoácidos del gen VKA30 de la linea germinal, preferentemente no más de seis cambios de aminoácidos, y aún más preferentemente no más de tres cambios de aminoácidos . La invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena liviana (VL) que contiene al menos tres cambios de aminoácidos en comparación con la secuencia de la linea germinal, región variable en la cual los cambios de aminoácidos son idénticos a los cambios de aminoácidos de la linea germinal de la región variable de uno de los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 9.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 9.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la P03/101-PFA secuencia de aminoácidos de una o más CDRs de cualquiera de las cadenas livianas de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 9.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de las cadenas livianas de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 9.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 o 22 o comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una de las SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 o 21. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 o 22 o comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una o más de las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 o 21. En una realización más preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 o 22 o comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una o más de las CDRs de cualquiera P03/101-PFA de las SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 o 21. En una realización más preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 o 22 o comprende una secuencia de ácidos nucleicos de todas las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 o 21. La invención también provee moléculas de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos de una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una VL arriba descrita, particularmente a una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 o 22. La invención provee también una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico de una de las SEQ ID NOS: 1, 5, 9 , 13, 17 o 21. En otra realización, la invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica una VL que ibridiza bajo condiciones altamente estrictas a una molécula de ácido nucleico que codifica una VL como arriba descrita, particularmente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica P03/101-PFA una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 o 22. La invención también provee una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una VL que hibridiza bajo condiciones altamente estrictas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una de las SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 o 21. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (VH) está derivada del gen VH DP-35, DP-47, DP-51 o VIV-4/4.35, preferentemente del gen VH DP-35. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH comprende la región de unión derivada de JH6 o JH5, más preferentemente JH6. En otra realización preferida, el segmento D es derivado de 3-3, 6-19 o 4-17. En una realización aún más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene no más de diez cambios de aminoácidos del gen DP-47 de la linea germinal, preferentemente no más de seis cambios de aminoácidos, y aún más preferentemente no más de tres cambios de aminoácidos. En una realización altamente preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene al menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de la linea germinal, cambio que es idéntico con P03/101-PFA el cambio de aminoácido en la secuencia de la linea germinal de la cadena pesada de uno de los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En una realización aún más preferida, la VH contiene al menos tres cambios de aminoácidos en comparación con las secuencias de la linea germinal, cambios que son idénticos a aquellos cambios con respecto a la secuencia de la linea germinal de la VH de uno de los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En una realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de la VH de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de la cadena pesada de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de la cadena pesada de 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 9.9.2, 4.17.3 o 6,1.1. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que P03/101-PFA codifica la secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 o 24 o que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una de las SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 o 23. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 o 24 o comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una o más de las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 o 23. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica las secuencias de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 o 24 o que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de todas las CDRs de cualquiera de las SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 o 23. En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos de una VH que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos de una VH como descrita inmediatamente arriba, particularmente a una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24. La invención también P03/101-PFA provee una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos de una de las SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 17, 19, 21 o 23. En otra realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una VH es una molécula que híbrida bajo condiciones altamente estrictas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una VH como arriba descrito, particularmente con una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS: 4, ,8, 12, 16, 20 o 24. La invención también provee una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una VH que híbrida bajo condiciones altamente estrictas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una de las SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 o 23. La molécula de ácido nucleico que codifica una o ambas de las cadenas enteras pesadas y livianas de un anticuerpo anti~IGF-IR o las regiones variables del mismo, puede ser obtenida a partir de cualquier fuente que produce un anticuerpo anti-IGF-IR. Métodos para aislar mRNA que codifica un anticuerpo son bien conocidos en el arte. Vea, por ejemplo, Sambrook et al. El mRNA puede ser usado para producir cDNA ha ser usado en la reacción en cadena de la P03/101-PFA polimerasa (PCR) o en la clonación con cDNA de genes del anticuerpo. En una realización de la invención, las moléculas de ácido nucleico pueden ser obtenidas de un hibridoma que expresa un anticuerpo anti-IGF-IR, como arriba descrito, preferentemente un hibridoma que tiene como compañero de fusión una célula de animal transgénico que expresa genes de inmunoglobulina humana, tal como un Xenomouse™, un animal transgénico no humano, ratón o un animal transgénico no humano, no ratón. En otra realización, el hibridoma es derivado de un animal no transgénico no humano, que puede ser usado, por ejemplo, para anticuerpos humanizados. Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada entera de un anticuerpo anti-IGF-IR puede ser construida fusionando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena pesada, o el dominio que liga antigeno de la misma, con un dominio constante de una cadena pesada. Similarmente, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana de un anticuerpo anti-IGF-IR puede ser construida fusionando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena liviana, o un dominio que liga antigeno de la misma, con un dominio constante de una cadena liviana. Las P03/101-PRA moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VH y VL pueden ser convertidas a genes del anticuerpo de longitud completa, insertándolas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de la cadena pesada y regiones constantes de la cadena liviana, respectivamente, de modo que el segmento YH está ligado operativamente al (a los) segmento (s) de la región constante de la cadena pesada (CH) dentro del vector y el segmento VL está ligado operativamente al segmento de la región constante de la cadena liviana (CL) dentro del vector. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VH o VL son convertidas en genes del anticuerpo de longitud completa enlazando, por ejemplo, ligando, la molécula de ácido nucleico que codifica una cadena VH con una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena CH, usando técnicas estándar de la biología molecular. Lo mismo puede ser logrado usando moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas VL y CL. Las secuencias de genes de la región constante de cadenas pesadas y livianas humanas son conocidas en el arte. Vea, por ejemplo, Kabat et al., Seguetees of Proteins of Immunological Interest, 5° Edición, Publicación NIH N° 91-3242, 1991. Luego, moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y/o P03/101-PFA livianas de longitud completa pueden ser expresadas por una célula en la cual ha sido introducido el anticuerpo anti-IGF-IR aislado. En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, y la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de las cadenas livianas codifica las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22. La SEQ ID NO: 28 representa la secuencia de aminoácidos y la SEQ ID NO: 27 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifican la región constante de la cadena pesada de los anticuerpos anti-IGF-IR 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 9.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. La SEQ ID NO: 26 representa la secuencia de aminoácidos y la SEQ ID NO: 25 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifican la región constante de la cadena liviana de los anticuerpos anti-IGF-IR 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 9.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. De este modo, en una realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena pesada codifica la SEQ ID NO: 28, y la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena liviana codifica la SEQ ID NO: 26. En una P03/10I-PFA realización más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena pesada tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 27, y la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 25. En otra realización, una molécula de ácido nucleico que codifica cadenas cualesquiera de la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR o un dominio que liga antigeno de la misma, o la cadena liviana de un anticuerpo anti-IGF-IR o un dominio que liga antigeno de la misma puede ser aislada de un animal no humano, no ratón que expresa genes de inmunoglobulina humana y que ha sido inmunizado con un antigeno IGF-IR. En otra realización, la molécula de ácido nucleico puede ser aislada de una célula que produce un anticuerpo anti-IGF-IR derivada de un animal no transgénico o de un paciente humano que produce anticuerpos anti-IGF-IR. Células que producen mRNA del anticuerpo anti-IGF-IR pueden ser aisladas por métodos que usan técnicas estándar, clonadas y/o amplificadas usando técnicas de PCR y construcción de bibliotecas, y rastreadas usando protocolo estándar para obtener moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y livianas del anti-IGF-IR.
P03/I01-PFA Las moléculas de ácido nucleico pueden ser usadas para expresar recombinantemente grandes cantidades de anticuerpos anti-IGF-IR, según lo descrito más abajo. Las moléculas de ácido nucleico también pueden ser usadas para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena simple, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos imitados y anticuerpos derivados, según lo descrito más abajo. Si las moléculas de ácido nucleico están derivadas de un animal no transgénico, no humano, las moléculas de ácido nucleico pueden ser usadas para la humanización de anticuerpos, también como descrito más abajo. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser usadas como sondas o cebadores PCR para secuencias especificas del anticuerpo. Por ejemplo, una sonda de molécula de ácido nucleico puede ser usada en métodos diagnósticos o una molécula de ácido nucleico puede ser usada como sonda PCR para amplificar regiones de DNA que pueden ser usadas, interaliar para aislar secuencias de ácido nucleico a ser usadas para producir dominios variables de anticuerpos anti-IGF-IR. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos . En una realización más preferida, los oligonucleótidos pertenecen a las regiones altamente P03/101-PFA variables de las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo de interés. En una realización aún más preferida, los oligonucleótidos codifican el total o una parte de una o varias de las CDRs . · Vectores La invención provee vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena pesada o la porción que liga antigeno de la misma. La invención también provee vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena liviana o la porción que liga antigeno de la misma. La invención también provee vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpos y sondas de los mismos. Para expresar los anticuerpos o porciones de los anticuerpos de la invención, DNAs que codifican cadenas livianas y pesadas de longitud parcial o completa, obtenidos según lo descrito precedentemente, son insertados en vectores de expresión de modo que los genes son ligados operativamente a secuencias de control de transcripción y traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YACs, episomas derivados del EBV, y P03/101-PFA semejantes. El gen del anticuerpo es ligado en un vector de modo tal que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector pueden ejercer su función de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión son elegidas de modo que son compatibles con la célula hospedante usada para la expresión. El gen de la cadena liviana del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden ser insertados en vectores separados. En una realización preferida, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo son insertados en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo con el vector, o ligadura con formación de extremos romos si no existen sitios de restricción) . Un vector conveniente es un vector que codifica una secuencia de CH o CL de la inmunoglobulina humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados preparados por métodos de ingeniería genética de modo tal que la secuencia VH o VL puede ser insertada y expresada fácilmente, según lo arriba descrito. En vectores P03/101-PFA tales, el corte y empalme se produce usualmente entre el sitio dador de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que existen dentro de los exones de la CH humana. La poliadenilación y terminación de la transcripción tienen lugar en sitios cromosomales nativos corriente abajo de las regiones de codificación. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula hospedante. El gen de la cadena del anticuerpo puede ser clonado en el vector de modo que el péptido señal es ligado en el marco de lectura al terminal amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es una inmunoglobulina) . Además de los genes de las cadenas del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias regulatorias que controlan la expresión de los genes de las cadenas del anticuerpo en una célula hospedante. Será apreciado por los entendidos en el arte que el diseño del vector de expresión, incluyendo la P03/101-PFA replicación del vector en células hospedantes (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de las células hospedantes en las cuales el vector ha sido introducido (vea, por ejemplo, Patentes US. Nos: 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel et al). Por ejemplo típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a drogas tales como G418, higromicina o metotrexate, en una célula hospedante en la cual el vector ha sido introducido. Genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen hidrofolato reductasa (DHFR) (a ser usado en células hospedantes dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418) . Células hospedantes no hibridoma y métodos recombinantes para producir proteínas Moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada o una porción que liga antígeno de la misma y/o la cadena liviana o una porción que liga antigeno de la misma de un anticuerpo anti-IGF-IR, y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico pueden ser usados para la transformación de una célula hospedante mamífera adecuada. La transformación puede ser realizada por cualquier método P03/101-PFA conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedante. Métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células mamiferas son bien conocidos en el arte e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del (de los) polinucleótido ( s) en liposomas, inyección biolistica y microinyección directa del DNA en núcleos. Además, moléculas de ácido nucleico pueden ser introducidas en células mamiferas por vectores virales. Métodos para la transformación de células son bien conocidos en el arte. Vea, por ejemplo, Patentes U.S. Nos: 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455 (patentes que son incorporadas en esta por referencia) . Líneas celulares mamiferas disponibles como hospedantes para la expresión son bien conocidas en el arte e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la colección American Type Culture Collection (ATCC) . Estas líneas celulares incluyen, interalia, células del ovario del hámster chino (Chínese hámster ovary = CHO) , NSO, células SP2, células HeLa, células del riñon de la cría del h mster (baby h mster kidney = BHK) , células del riñon del mono (COS) , · células P03/101-PFA del carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) , células A549, células 3T3, y un número de otras lineas celulares. Células hospedantes mamiferas incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de chancho, de cabra, de ganado vacuno, de caballo y de h mster. Lineas celulares de particular preferencia son seleccionadas por la determinación de cuáles células tienen elevados niveles de expresión. Otras lineas celulares que pueden ser usadas son lineas celulares de insectos, tales como células Sf9, células anfibias, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican la cadena pesada o porciones que ligan antigeno de la misma, la cadena liviana y/o porciones que ligan antigeno de la misma en células hospedantes mamiferas, los anticuerpos son producidos cultivando las células hospedantes durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedantes o , más preferentemente, por la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospedantes. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo usando métodos estándar para la purificación de proteínas. Además, la expresión de los anticuerpos de la F03/10I-PFA invención (u otros grupos funcionales de los mismos) de lineas celulares de producción puede ser intensificada por un número de técnicas bien conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de genes con glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque común para aumentar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS es discutido totalmente o parcialmente en conexión con las Patentes Europeas Nos: 0.216.846, 0.256.055, y 0.323.997 y la Solicitud de Patente Europea 89303964.4. Es probable que anticuerpos expresados por diferentes lineas celulares o en animales transgénicos tendrán una diferente glicosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico provistas en ésta, o que comprenden las secuencias de aminoácidos provistas en ésta, son parte de la presente invención, independientemente de la glicosilación. Animales transgénicos La invención también provee animales transgénicos no humanos que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de la invención que pueden ser usadas para producir anticuerpos de la invención. Anticuerpos pueden ser producidos en, y recuperados de, tejidos o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina de cabras, P03/10J-PFA vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hamsters u- otros mamíferos. Vea, por ejemplo, Patentes US Nos. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, y 5.741.957. Como descrito precedentemente, animales transgénicos no humanos que comprenden loci de la inmunoglobulina humana pueden ser producidos por la inmunización con IGF-IR o una porción de la misma. En otra realización, los animales transgénicos no humanos son producidos por la introducción de una o más moléculas de ácido nucleico de la invención en el animal por técnicas transgénicas estándar. Vea, Hogan, supra. Las células transgénicas usadas para hacer el animal transgénico pueden ser células del tronco embriónico o células somáticas. Los organismos transgénicos no humanos pueden ser quiméricos, heterocigotas no quiméricos y homocigotas no quiméricos. Vea, por ejemplo, Hogan et al., Manipulatinq the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2° Edición, Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mose Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000) ; y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) . En otra realización, los organismos transgénicos no humanos pueden tener moléculas diana provenientes de corte y P03/101-PFA reemplazo que codifican una cadena pesada y/o una cadena liviana de interés. En una realización preferida, los animales transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y livianas que se ligan específicamente al IGF-IR, preferentemente IGF-IR humano. En otra realización, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser hechos en cualquier animal transgénico. En una realización preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado bovino o caballos. Los animales transgénicos no humanos expresan dichos polipéptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales . Bibliotecas de exhibición en fagos La invención provee un método para producir un anticuerpo anti-IGF-IR o una porción que liga antígeno del mismo que comprende las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fagos, rastrear la biblioteca con un IGF-IR o una porción del mismo, aislar el fago que liga IGF-IR, y obtener el anticuerpo del fago. Un método para P03/101-PFA preparar la biblioteca de anticuerpos comprende las etapas de inmunizar un animal hospedante no humano que comprende un locus de inmunoglobulina humana con IGF-IR o una porción antigénica del mismo para crear una respuesta inmune, extraer células de las células del animal hospedante que son responsables para la producción de anticuerpos, aislar de las células extraídas RNA, efectuar transcripción inversa con el RNA para producir cDNA, amplificar el cDNA usando un cebador e insertar el cDNA en un vector de exhibición en fagos, de modo que los anticuerpos son expresados en el fago. De este modo pueden obtenerse anticuerpos anti-IGF-IR recombinantes de la invención. Los anticuerpos recombinantes anti-IGF-IR humanos de la invención, además de los anticuerpos anti-IGF-IR revelados en ésta, pueden ser aislados rastreando una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes, preferentemente una biblioteca que exhibe en fagos scFv, preparada usando cDNAs de VI y VH humanas preparados de inRNA derivado de linfocitos humanos. Las metodologías para preparar y rastrear tales bibliotecas son conocidas en el arte. Existen equipos comercialmente disponibles para generar bibliotecas que exhiben en fagos (por ejemplo, el sistema de anticuerpos recombinantes en fagos Pharmacia P03/101-PFA { Pharmacia Recombinant Phage Antibody System) número de catálogo 27-9400-01; y el equipo de exhibición en fagos Stratagene SurfZAP™, número de catálogo 240612) . También existen otros métodos y reactivos que pueden ser usados para generar y rastrear bibliotecas que exhiben anticuerpos, (vea, por ejemplo, Ladner et al., Patente U.S. No: 5.223.409; ang et al., Publicación PCT No: WO 92/18619; Dower et al., Publicación PCT No. WO 91/17271; inter et al., Publicación PCT No: WO 92/20791; Markland et al., Publicación PCT No. WO 92/15679; Breitling et al., Publicación PCT No: WO 93/01288; Me Cafferty et al., Publicación PCT No: WO 92/01047; Garrard et al., Publicación PCT No: WO 92/09690; Fuchs et al., (1991), Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; Griffit s et al., (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucí. Acid. Res 19: 4133-4137; y Barbas et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.
P03/I01-PFA En una realización preferida, para aislar anticuerpos anti-IGF-IR humanos con las características deseadas, primero se usa un anticuerpo anti-IGF-IR humano como descrito en ésta para seleccionar secuencias de cadenas pesadas y livianas humanas que tengan una actividad de ligadura similar hacia IGF-IR, usando métodos de imprinting de epitopes (epitope imprinting methods) descritos en Hoogenboom et al., Publicación PCT No: WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este método son preferentemente bibliotecas en scFv preparadas y rastreadas según lo descrito en McCafferty et al., Publicación PCT No: WO 92-01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554 y Griffiths et al., (1993) EMBO J 12: 725-734. Las bibliotecas de anticuerpos en scFv son rastreadas preferentemente usando como antigeno IGF-IR humano. Una vez seleccionados segmentos iniciales VL y VH humanos, se realizan experimentos de "mix and match" ("mezclar y unir"), en los cuales son rastreados diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionados para la ligadura con IGF-IR, para seleccionar combinaciones preferidas de pares VL/VH. Además, para mejorar aún más la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH del (de los) par (es) preferido (s) VL/VH pueden ser sometidos a mutación P03/101-PFA -HO-aleatoria, preferentemente dentro de la región CDR3 de la VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable por la maduración de la afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduración de la afinidad in vitro puede ser lograda por la amplificación de regiones VH y VL, usando cebadores PCR complementarios a la VH CDR3 o VL CDR3, respectivamente, cebadores a los cuales se ha agregado ("spiked") una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotidicas en ciertas posiciones, de modo que los productos PCR resultantes codifiquen segmentos VH y VL en los cuales han sido introducidas mutaciones aleatorias en las regiones VH CDR3 y/o VL CDR3. Estos segmentos VH y VL sometidos a mutación aleatoria pueden ser rastreados nuevamente para la ligadura con IGF-IR. Después de la selección y aislación de un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención de una biblioteca que exhibe inmunoglobulina recombinante, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado puede ser recuperado del paquete de exhibición (display package) (por ejemplo, del genoma del fago} y subclonado en otros vectores de expresión por técnicas de DNA recombinante estándar. En caso deseado, el ácido nucleico puede ser sometido a P03/101-PFA manipulación adicional para crear otras formas del anticuerpo de la invención, según lo descrito más abajo. Para expresar un anticuerpo humano recorabinante aislado por el rastreo de una biblioteca combinatoria, el DNA que codifica el anticuerpo es clonado en un vector de expresión recombinante e introducido en células hospedantes mamiferas, como descrito precedentemente. Conmutación de clase Otro aspecto de la presente invención es proveer un mecanismo por el cual la clase de un anticuerpo anti-IGF-IR puede ser conmutada por otra. En un aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica una VL o VH es aislada usando métodos bien conocidos en el arte, de modo que no incluye ninguna secuencia de ácido nucleico que codifica CL o CH. Luego, la molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH es ligada operativamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una CL o CH de una clase diferente, de molécula de inmunoglobulin . Esto puede ser logrado, usando un vector o una molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o CH, tal como arriba descrito. Por ejemplo, el anticuerpo anti-IGF-IR que originalmente era una IgM puede ser cambiado de clase a una IgG, Además, la conmutación de clase puede ser usada para P03/101-PFA convertir una subclase IgG a otra subclase, por ejemplo, de IgGl a IgG2. Un método preferido para producir un anticuerpo de la invención que comprende un isotipo deseado, comprende las etapas de aislar un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR y un ácido nucleico que codifica la cadena liviana de un anticuerpo anti-IGF-IR, obtener la región variable de la cadena pesada, ligar la región variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresar la cadena liviana y la cadena pesada ligada en una célula, y recolectar el anticuerpo anti-IGF-IR con el isótopo deseado. Derivados de anticuerpos Las moléculas de ácido nucleico arriba descritas pueden ser usadas para generar derivados de anticuerpos usando técnicas y métodos conocidos para un entendido en el arte . Anticuerpos humanizados Tal como fue discutido precedentemente en conexión con la generación de anticuerpos humanos, existen ventajas al producir anticuerpos con inmunogenicidad reducida. Esto puede ser logrado, en cierta medida, usando técnicas de humanización y técnicas de exhibición usando bibliotecas P03/101-PFA apropiadas. Será apreciado que anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies pueden ser humanizados o primatizados usanto técnicas bien conocidas en el arte. Vea, por ejemplo, inter y Harris Immunol. Today 14: 43-46 (1993) y Wirghy et al., Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992) . El anticuerpo de interés puede ser producido por técnicas de DNA recombinantes para sustituir los dominios CH1, CH2, CH3, bisagra y/o el dominio frame ork con las secuencias humanas correspondientes (vea O 92/02190 y Patentes ÜS Nos: 5.130.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 y 5.777.085). En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR puede ser humanizado por la sustitución de los dominios CH1, CH2, CH3, dominios de bisagra, y/o el dominio framework con la secuencia humana correspondiente, manteniendo todas las CDRs de la cadena pesada, la cadena liviana o ambas, las cadenas pesada y liviana. Anticuerpos mutados En otra realización, las moléculas de ácido nucleico, los vectores y las células hospedantes pueden ser usados para hacer anticuerpos anti-IGF-IR mutados. Los anticuerpos pueden ser mutados en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras para modificar una propiedad de unión P03/101-PFA del anticuerpo. Por ejemplo, puede efectuarse una mutación en una o más de las regiones CDR para aumentar o disminuir la D del anticuerpo para el IGF-IR, para aumentar o disminuir K0ff o para modificar la especificación de ligadura del anticuerpo. Técnicas de mutagenesis dirigida a un sitio son bien conocidas en el arte. Vea, por ejemplo, Sambrook et al., y Ausubel et al., supra. En una realización preferida, las mutaciones son efectuadas en un residuo de aminoácido del cual se sabe que ha sido cambiado, con respecto a la linea germinal, en una región variable de un anticuerpo anti-IGF-IR. En una realización más preferida, se efectúan una o más mutaciones en un residuo de aminoácido del cual se sabe que ha sido cambiado, en comparación con la línea germinal, en una región variable o región CDR de uno de los anticuerpos anti-IGF-IR 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización, una o más mutaciones son efectuadas en un residuo de aminoácido del cual se sabe que ha sido cambiado, en comparación con la línea germinal, en una región variable o región CDR cuya secuencia de aminoácidos está indicada en SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24, o cuya secuencia de ácido nucleico está indicada en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, P03/101-PFA 13, 15, 17, 19, 21 o 23. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico han sido mutadas en una o más de las regiones framework. Una mutación puede ser efectuada en una región framework o un dominio constante para aumentar la vida media del anticuerpo anti-IGF-IR. Vea, por ejemplo, WO 00/09560, publicada el 24 de Febrero de 2000, incorporada en ésta por referencia. En una realización, pueden existir una, tres o cinco mutaciones puntuales y no más de diez mutaciones puntuales. Una mutación en una región framework o un dominio constante también puede ser efectuada para modificar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proveer un sitio para la unión covalente o no covalente con otra molécula o para modificar tales propiedades como la fijación de complemento. Las mutaciones pueden ser efectuadas en cada una de las regiones framework, el dominio constante y las regiones variables en un solo anticuerpo mutado. Alternativamente, las mutaciones pueden ser efectuadas en sólo una de las regiones framework, las regiones variables o el dominio constante en un solo anticuerpo mutado. En una realización, no hay más de diez cambios de aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IGF-IR mutado, en comparación con el anticuerpo anti-IGF-IR previo a la mutación. En una P03/101-PFA realización más preferida, no hay más de cinco cambios de aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IGF-IR mutado, más preferentemente no más de tres cambios de aminoácidos. En otra realización, no hay más de quince cambios de aminoácidos en los dominios constantes, más preferentemente, no más de diez cambios de aminoácidos, aún más preferentemente, no más de cinco cambios de aminoácidos . Anticuerpos modificados En otra realización, puede fabricarse un anticuerpo de fusión o una inmunoadhesina que comprende el total o una porción de un anticuerpo anti-IGF-IR ligado con otro polipéptido. En una realización preferida, sólo las regiones variables del anticuerpo anti-IGF-IR son ligadas al polipéptido. En otra realización preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-IGF-IR es ligado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-IGF-IR es ligado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de un modo tal que los dominios VH y VL pueden interactuar entre si para formar un sitio de ligadura del anticuerpo. En otra realización preferida, el dominio VH es separado del dominio VL por un engarce, de modo que los dominios VH y VL pueden P03/101-PFA interactuar entre sí (vea abajo bajo anticuerpos de una sola cadena) . Luego, el anticuerpo VH-engarce-VL es ligado con el polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido hacia una célula o un tejido que expresa IGF-IR. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, un factor de crecimiento u otra proteína regulatoria, o puede ser un agente diagnóstico, tal como una enzima que puede ser visualizada, tal como peroxidasa de rábano picante. Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de una sola cadena están ligados entre sí. Eso es útil, si uno desea crear un anticuerpo di alente o polivalente sobre una sola cadena polipéptida, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico . Para crear un anticuerpo de cadena simple (scFv) , los fragmentos DNA que codifican VH y VL son ligados operativamente con otro fragmento que codifica un engarce flexible, por ejemplo, codifica la secuencia de aminoácidos (gly4-Ser)3, (SEQ. ID. NO. 60) de modo que las secuencias VH y VL pueden ser expresadas como una proteína de cadena simple contigua, con las regiones VL y VH unidas por el engarce flexible (vea, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988), Proc . Nati.
Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCAfferty et al., Nature (1990) 348: 552-554). El anticuerpo de cadena simple puede ser monovalente, si se usa solamente una sola VH y VL, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y VL . En otra realización, pueden prepararse otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifican anti-IGF-IR. Por ejemplo, "cuerpos-kappa" (111 et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "Minicuerpos " (Martin et al., EMBO J 13: 5303-9 (1994)), "Diacuerpos" (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)) o "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) y Traunecker et al., "Janusin: new molecular design for bispecifid reagents", Int J Cáncer Suppl 7: 51-52 (1992)) pueden ser preparados usando técnicas de biología molecular estándar siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva . En otro aspecto, pueden generarse anticuerpos quiméricos y biespecífieos . Puede prepararse un anticuerpo quimérico que comprende regiones CDRs y framework de anticuerpos diferentes. En una realización preferida, las CDRs del anticuerpo quimérico comprenden la totalidad de las CDRs de la región variable de una cadena liviana o una P03/101-PFA cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR, mientras que las regiones framework son derivadas de uno o más anticuerpos diferentes. En una realización preferida, las CDRs del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDRs de las regiones variables de la cadena liviana y de la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR. Las regiones framework pueden ser de otras especies y, en una realización preferida, pueden ser humanizadas. Alternativamente, las regiones framework pueden ser de otro anticuerpo humano. Puede generarse un anticuerpo biespecifico que se liga específicamente a IGF-IR a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. El anticuerpo biespecifico puede ser producido por medio de técnicas de biología molecular recombinante, o los dominios pueden ser conjugados físicamente entre sí.
Además, puede generarse un anticuerpo de cadena simple que contiene más de una VH y VL que se liga específicamente a IGF-IR y a otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden ser generados usando técnicas bien conocidas, por ejemplo, en conexión con (i) y (ii) vea, por ejemplo, Fanger et al., Im unol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, supra, y en conexión con (iii) vea, por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cáncer (Suppl) 7: 51-52 (1992).
P03/101-PFA En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico se liga a IGF-IR y a otra molécula expresada en elevados niveles sobre células de cáncer o células turaorales. En una realización más preferida, la otra molécula es el receptor erB2, VEGF, CD20 o EGF- . En una realización, los anticuerpos modificados precedentemente descritos pueden ser preparados usando una o más de las regiones variables o una o más de las regiones CDR de uno de los anticuerpos seleccionados entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 o 6.1.1. En otra realización, los anticuerpos modificados son preparados usando una o más de las regiones variables o una o más de las regiones CDR cuyas secuencias de aminoácidos están presentadas en SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24, o cuyas secuencias de ácido nucleico están presentadas en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23. Anticuerpos derivatizados y marcados Un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención puede ser derivatizado o ligado con otra molécula (por ejemplo, con otro péptido o proteina) . Generalmente, el anticuerpo o una porción del mismo es derivatizado de modo tal que la unión con IGF-IR no es afectada P03/10J-PFA adversamente por la derivatización o el marcado. Por lo tanto, los anticuerpos y las porciones del anticuerpo de la invención incluyen ambas, las formas intactas y modificadas de los anticuerpos anti-IGF-IR humanos descritos en ésta. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede estar enlazado funcionalmente (por enlace químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) con una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecifico o un diacuerpo) , un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o un péptido que puede mediar en la asociación del anticuerpo o porción del anticuerpo con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o un rótulo de polihistidina) . Un tipo de anticuerpo derivatizado es producido por reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecificos) . Reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, teniendo dos grupos reactivos claramente separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimídico) , u homobifuncional, (por ejemplo, suberato de P03/101-PFA disuccinimidilo) . Tales reticulantes son disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, III. Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado. Agentes de detección útiles con los cuales un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención puede ser derivatizado incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, cloruro de 5-dimetilamino-l-naftalensulfonilo, ficoeritrina, sustancias fosforescentes a base de lantánidos y semejantes. Un anticuerpo también puede estar marcado con enzimas que son útiles para la detección, tales como peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa/ fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y semejantes. Cuando un anticuerpo está marcado con una enzima detectable, es detectado por el agregado de reactivos adicionales usados por la enzima para producir un producto de reacción que puede ser discernido. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, el agregado de peróxido de hidrógeno y diammobencidina lleva a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo también puede ser marcado con biotina, y ser detectado por medición indirecta de la ligadura de avidina o streptavidina . Un anticuerpo puede P03/101-PFA ser marcado con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo también puede estar marcado con epitopes polipéptidos predeterminados reconocidos por un repórter secundario (por ejemplo, secuencias apareadas de cierres de leucina, sitios de ligadura para anticuerpos secundarios, dominios que ligan metales, rótulos de epitopes) . En algunas realizaciones, los marcadores son fijados por brazos espaciadores de longitud variada para reducir el impedimento estérico potencial. Un anticuerpo anti-IGF-IR también puede estar marcado con un aminoácido radiomarcado . El radiomarcador puede ser usado tanto con propósitos de diagnóstico como con propósitos terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede ser usado para detectar tumores que expresan IGF-IR por rayos X u otras técnicas de diagnóstico. Además, el radiomarcador puede ser usado terapéuticamente como una toxina para células cancerosas o tumores. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los radioisótopos o radionuclidos siguientes: ¾, láC, 15N, 35S, 90Y, "Te, _llIn, 1251 , 131I. Un anticuerpo anti-IGF-IR también puede ser derivatizado con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG) , un grupo metilo o etilo, o un grupo hidrato de P03/101-PFA carbono. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la vida media en suero o para aumentar la ligadura al tejido. Composiciones y equipos farmacéuticos La invención también se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno iperproliferativo en un mamífero, composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, tal composición farmacéutica es para el tratamiento de cáncer, tal como cáncer de cerebro, de pulmón, de células escamosas, de vejiga, gástrico, pancreático, de mama, de cabeza, del cuello, renal, de riñon, de ovarios, de próstata, colorectal, de esófago/ ginecológico o de tiroides. En otra realización, dicha composición farmacéutica se refiere a trastornos hiperproliferativos no cancerosos tales como, sin limitación, reestenosis después de angioplastía y psoriasis. En otra realización, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un mamífero que requiere la activación del IGF-IR, comprendiendo la composición farmacéutica una cantidad P03/101-PFA terapéuticamente efectiva de un anticuerpo activante de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos activantes pueden ser usadas para tratar animales que carecen de suficiente IGF-I o IGF-11, o pueden ser usadas para tratar osteoporosis, fragilidad o trastornos en los cuales el mamífero segrega demasiado poca hormona de crecimiento activa o es incapaz de responder a la hormona de crecimiento. Los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención pueden ser incorporados en composiciones farmacéuticas adecuadas para ser administradas a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Según lo usado en ésta, "excipiente f rmacéuticamente aceptable" incluye cada uno y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y excipientes semejantes que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más entre agua, solución fisiológica, solución fisiológica bufferada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y semejantes, como así también P03/101-PFA combinaciones de los mismos. En muchos casos será preferible incluir en la composición agentes isotónicos/ por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. También pueden agregarse cantidades menores de sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de humectación o emulsión, preservativos o buffers, que aumentan la vida en estante o la efectividad del anticuerpo o de la porción de anticuerpo. Las composiciones de esta invención pueden estar en varias formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación liquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y de infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo deseado de administración y de la aplicación terapéutica. Composiciones preferidas típicas están en la forma de soluciones inyectables o de infusión, tales como las composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es el parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular) . En una realización preferida, el anticuerpo P03/101-PFA es administrado por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo ' es administrado por inyección intramuscular o subcutánea. Composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada de droga. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas por la incorporación del anticuerpo anti-IGF-IR en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o varios de los ingredientes arriba enumerados, según lo requerido, seguido por filtración y esterilización. Generalmente, las dispersiones son preparadas por la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre aquellos arriba e umerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacio y liofilización que provee un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración de tales ingredientes. Puede P03/101-PFA mantenerse la fluidez adecuada de una solución, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y por el uso de agentes tensoactivos . La absorción prolongada de composiciones inyectables puede ser obtenida por la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser administrados por una variedad de métodos conocidos en el arte, si bien para muchas aplicaciones terapéuticas la ruta y/o el modo de administración preferido es intraperitoneal, subcutáneo, intramuscular, intravenoso o por infusión. Como será apreciado por el entendido en el arte, la ruta y/o el modo de administración dependerá de los resultados deseados. En una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden ser administrados como dosis simple o pueden ser administrados como dosis múltiples. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede ser preparado con un excipiente que protegerá el compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados .
P03/101-PFA Pueden usarse polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como vinilacetato de etileno, polianhldridos, ácido poliglicólico, colágenos, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son patentados o generalmente conocidos a los entendidos en el arte. Vea, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. En ciertas realizaciones, el anti-IGF-IR de la invención puede ser administrado oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un excipiente comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si deseado) también puede ser encerrado en una cápsula de gelatina dura o blanda, comprimido en tabletas o incorporado directamente en la dieta del sujeto. Para una administración terapéutica oral, los compuestos pueden ser incorporados con excipientes y ser usados en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y semejantes. Para administrar un compuesto de la invención con otro tipo de administración que la parenteral puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación.
P03/101-PFA También pueden ser incorporados en las composiciones compuestos activos suplementarios. En ciertas realizaciones, un anti-IGF-IR de la invención es co-formulado y/o co-administrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente quimioterapéutico, un agente antineoplástico o un agente antitumo al . Por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF-IR puede ser co-formulado y/o co-administrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que se ligan con otros blancos (por ejemplo, anticuerpos que se ligan con uno o más factores de crecimiento o citoquinas, sus receptores en la superficie celular o IGF-I), proteínas que se ligan con IFG-I, agentes antineoplásticos, agentes quimioterapéuticos, agentes antitumorales , oligonucleótidos antisentido contra IGF-IR o IGF-I, análogos peptídicos que bloquean la activación de IGF-IR, IGF-IR soluble, y/o uno o más agentes químicos que inhiben la producción o actividad de IGF-I que son conocidos en el arte, por ejemplo, octreotide. Para una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activante, el anticuerpo anti-IGF-IR puede ser formulado con un factor que aumenta la proliferación celular o previene apoptosis. Tales factores incluyen factores de P03/101-PFA -Olerecimien o tales como IGF-1, y/o análogos de IGF-I que activan IGF-IR. Tales terapias de combinación pueden requerir dosificaciones menores del anticuerpo anti-IGF-IR como asi también de los agentes co-administrados, evitando asi posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las varias monoterapias . En una realización, la composición farmacéutica puede contener el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente activa" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" hace referencia a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción, de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y de la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una cantidad con la cual cualquier efecto tóxico o pernicioso del anticuerpo o porción de anticuerpo es P03/101-PFA compensado por los efectos beneficiosos terapéuticos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" hace referencia a una cantidad efectiva, con dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como una dosis profiláctica es usada en sujetos previo a, o en una etapa anterior de, la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proveer la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas durante un período de tiempo, o la dosis puede ser reducida o aumentada proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo, o que comprenden el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales para una terapia de combinación, pueden ser formuladas para dosis simples o múltiples. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para la facilidad de administración y la uniformidad de la dosificación. "Forma de unidad de P03/10I-PFA dosificación", según lo usado en ésta, hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para ser administradas a sujetos mamíferos a ser tratados, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el excipiente farmacéutico requerido. La especificación de las formas de unidad de dosificación de la invención son dictadas por, y dependientes directamente de, (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes al arte de formular la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la enfermedad en individuos. Una formulación particularmente útil es la que contiene 5 mg/ml de anticuerpo anti-IGF-IR en un buffer de citrato de sodio 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM, y 0,2 mg/ml de polisorbato 80. Un ejemplo de gama no limitante para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0,1-100 mg/kg, más preferentemente 0,5-50 mg/kg, más pr ferentemente 1-20 mg/kg, y aún más pref rentemente 1-10 mg/kg. Debe ser observado que los valores de dosificación P03/I0J-PFA pueden variar con el tipo y la severidad de la condición a ser aliviada. Debe ser entendido además, que para cada sujeto particular, deben ajustarse regímenes de dosificación especificos a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y la evaluación profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones , y que las gamas de dosificación expuestas en ésta son dadas solamente a modo de ejemplo y no tienen la intención de limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. En una realización, la cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o una porción que liga antígeno del mismo es administrada con untamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales. En otro aspecto, la invención se refiere a la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR para el tratamiento de cáncer en una dosis menor de 300 mg por mes . Otro aspecto de la presente invención provee equipos que comprenden los anticuerpos anti-IGF-IR y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un equipo puede incluir, además del anticuerpo o la composición f rmacéutica, agentes diagnósticos o terapéuticos. Un equipo también puede incluir instrucciones P03/101-PFA de uso para un método diagnóstico o terapéutico. En una realización preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y un agente diagnóstico que puede ser usado en un método descrito más abajo. En otra realización preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente antineoplástico, un agente anti- umo al o un agente quimioterapéutico adicionales, que pueden ser usados en un método descrito más abajo. Esta invención se refiere también a composiciones farmacéuticas para inhibir el crecimiento celular anormal en un mamífero, composición que comprende una cantidad de un compuesto de la invención en combinación con una cantidad de un agente quimioterapéutico, en la cual las cantidades del compuesto, sal, solvato, o prodroga, y del agente quimioterapéutico son con untamente efectivas para inhibir un crecimiento celular anormal. Actualmente el arte conoce muchos agentes quimioterapéuticos . En una realización, el agente quimioterapéutico es seleccionado del grupo formado por inhibidores mitóticos, agentes de alquilación, anti-metabolitos, antibióticos de intercalado, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del P03/101-PFA ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, agentes de anti-supervivencia, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, por ejemplo, anti-andrógenos, y agentes de anti-angiogénesis . Agentes de anti-angiogénesis, tales como inhibidores de MMP-2 (matriz-metaloproteinasa 2), inhibidores de MMP-9 (matriz-metaloproteinasa 9) , e inhibidores de COX-II (ciclo-oxigenasa II), pueden ser usados conjuntamente con un compuesto de la invención. Ejemplos de inhibidores de COX-II útiles incluyen CELEBREX™ (alecoxib) , valdecoxib y rofecoxib. Ejemplos de inhibidores de matriz-metaloproteinasas útiles están descritos en WO 96/33172 (publicada el 24 de Octubre de 1996), WO 96/27583 (publicada el 7 de Marzo de 1996) , Solicitud de Patente Europea No. 97304971.1 (presentada el 8 de Julio de 1997), Solicitud de Patente Europea No. 99308617.2 (presentada el 29 de Octubre de 1999), WO 98/07697 (publicada el 26 de Febrero de 1998), WO 98/03516 (publicada el 29 de Enero de 1998), WO 98/34918 (publicada el 13 de Agosto de 1998), WO 98/34915 (publicada el 13 de Agosto de 1998), WO 98/33768 (publicada el 6 de Agosto de 1998), WO 98/30566 (publicada el 16 de Julio de 1998), Publicación de Patente Europea 606.046 (publicada el 13 de Julio de 1994), Publicación de P03/10I-PFA Patente Europea 931.788 (publicada el 28 de Julio de 1999), WO 90/05719 (publicada el 31 de Mayo de 1990), WO 99/52910 (publicada el 21 de Octubre de 1999), WO 99/52889 (publicada el 21 de Octubre de 1999), WO 99/29667 (publicada el 17 de Junio de 1999) , Aplicación Internacional PCT No. PCT/IB98/01113 (presentada el 21 de Julio de 1998), Solicitud de Patente Europea No. 99302232.1 (presentada el 25 de Marzo de 1999), Solicitud de Patente de Gran Bretaña No. 9912961.1 (presentada el 10 de Julio de 1999), Solicitud Provisoria de los Estados Unidos No, 60/148.464 (presentada el 12 de Agosto de 1999), Patente de Estados Unidos 5.863.949 (concedida el 26 de Enero de 1999), Patente de Estados Unidos 5.861.510 (concedida el 19 de Enero de 1999), y Publicación de Patente Europea 780.386 (publicada el 25 de Junio de 1997), todas las cuales son incorporadas en ésta en su totalidad por referencia. Inhibidores de MMP preferidos son aquellos que no muestran artralgia. Más preferidos son aquellos que inhiben selectivamente MMP-2 y/o MMP- 9 con relación a las otras matriz-metaloproteinasas (es decir, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y MMP-13) . Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP útiles en la presente invención son AG-3340, RO 32-3555, RS P03/101-PFA 13-0830, y los compuestos enumerados en la lista siguiente ácido 3- [ [4- (4-fluorofenoxi) -bencensulfonil] - (1 hidroxicarbamoil-ciclopentil ) -amino] -propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3- [4- (4-fluorofenoxi) bencensulfonilamino] -8-oxa-biciclo [3.2.1] octan-3-carboxilico; hidroxíamida del ácido (2R, 3R) 1- [4- (2-cloro 4-fluoro-benciloxi) -bencensulfonil] -3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxilico; hidroxíamida del ácido 4- [4- (4 fluorofenoxi) -bencensulfonilamino] -tetrahidropiran-4-carboxilico; ácido 3- [ [4- ( 4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] (1-hidroxicarbamoil-ciclobutil) -amino] -propiónico; hidroxíamida del ácido 4- [ 4- ( 4-clorofenoxi ) bencensulfonilamino] -tetrahidropiran- -carboxilico; hidroxíamida del ácido (R) 3- [4- (4-clorofenoxi) bencensulfonilamino] -tetrahidropiran-3-carboxílico; hidroxíamida del ácido (2R, 3R) 1- [4- (4-fluoro-2 metilbenciloxi) -bencensulfonil] -3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico; ácido 3- [ [ 4- ( -fluoro-fenoxi ) bencensulfonil] - (l-hidroxicarbamoil-l-metil-etil) -amino] -propiónico; ácido 3- [ [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] ( -hidroxicarbamoil-tetrahidropiran-4-il) -amino] -propiónico; hidroxamida del ácido 3-exo-3- [4- (4-cloro fenoxi) -bencensulfonilamino] -8-oxa-biciclo [3.2.1] octan-3- P03/101-PFA carboxílico; hidroxamida del ácido 3-endo-3- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonílamíno] -8-oxa-biciclo [3.2.1] octan-3-carboxilico e hidroxamida del ácido (R) 3- [ - ( -fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -tetrahidrofuran-3-carboxilico; y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos . Un compuesto de la invención también puede ser usado con inhibidores de transducción de señales, tales como agentes que pueden inhibir respuestas al EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidermal), tales como anticuerpos EGF-R, anticuerpos EGF y moléculas que son inhibidoras de EGF-R; inhibidores del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , tales como receptores del VEGF y moléculas que pueden inhibir VEGF; e inhibidores del receptor erbB2, tales como moléculas orgánicas o anticuerpos que se ligan al receptor erbB2, por ejemplo, HERCEPTIN™ (Genetech Inc.). Los inhibidores del EGF-R están descritos, por ejemplo, en O 95/02434 (publicada el 27 de Julio de 1995), WO 98/14451 (publicada el 22 de enero de 1998), y la Patente de Estados Unidos 5.747.498 (concedida el 5 de mayo de 1998) , y tales sustancias pueden ser usadas en la presente invención según lo descrito en la misma. Los agentes inhibidores del EGFR incluyen, pero no están P03/101-PFA limitados a, los anticuerpos monoclonales C225 y el anticuerpo monoclonal anti-EGFR 22 (ImClone System Incorporated) , ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys) , EMD-7200 (Merck KgaA) , EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. y Merck KgaA), y los compuestos ZD-1834, ZD-1838 y ZD- 1839 (AstraZeneca) , PKI-166 (Novartis}, PKI-166/CGP-75766 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon) , Leflunomide (Pharmacia/Sugen) , CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183.805 (Warner Lambert Parke Davis) CL-787.785 (Wyeth- Ayerst) , BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim) , OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusión EGF (Seragen Inc.), TAB-389 (Seragen/Lilgand) , ZM-252808 (Imperial Cáncer Research Fund) , RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cáncer Center) , WHI-P97 (Parker Hughes Cáncer Center), GW-28294 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) y vacuna EGF-R (York Medical/Centro de Inmunología Molecular (CIM) ) . Estos y otros agentes inhibidores de EGF-R pueden ser usados en la presente invención . Los inhibidores de VEGF, por ejemplo, SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) y NX-1838 (NeXstar) P03/10I-PFA también pueden ser combinados con los compuestos de la presente invención. Inhibidores del VEGF están descritos, por ejemplo, en O 99/24440 (publicada el 20 de mayo de 1999), la Solicitud Internacional PCT PCT/IB99/00797 (presentada el 3 de mayo de 1999), WO 95/21613 (publicada el 17 de Agosto de 1995), WO 99/61422 (publicada el 2 de diciembre de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.834.504 (concedida el 10 de noviembre de 1998), WO 98/50356 (publicada el 12 de noviembre de 1998), Patente de los Estados Unidos 5.883,113, (concedida el 16 de marzo de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.883.020 (concedida el 23 de marzo de 1999) , Patente de los Estados Unidos 5.792.783 (concedida el 11 de Agosto de 1998), WO 99/10349 (publicada el 4 de marzo de 1999), WO 97/32856 (publicada el 12 de setiembre de 1997), WO 97/22596 (publicada el 26 de julio de 1997), WO 98/94093 (publicada el 3 de diciembre de 1998), WO 98/02438 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 99/17755 (publicado el 8 de abril de 1999), y WO 98/02437 (publicada el 22 de Enero de 1998), todas las cuales están incorporados en ésta en su totalidad por referencia. Otros ejemplos de algunos inhibidores del VEGF específicos útiles en la presente invención son IM862 (Cytran Inc.); el anticuerpo monoclonal anti-VEGF de P03/101-PFA Genentech, Inc.; y angiozyme, una ribozima sintética de Ribozyme y Chiron. Estos y otros inhibidores de VEGF pueden ser usados en la presente invención según lo descrito en ésta . Los inhibidores del receptor ErbB2, tales como GW- 282974 (Glaxo Welcome pie), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceutical Inc.) y 2B-1 (Chiron) pueden ser combinados además con los compuestos de la invención/ por ejemplo tales indicados en WO 98/02434 (publicada el 22 de Enero de 1998), WO 99/35146 (publicada el 15 de Julio de 1999), WO 99/35132 (publicada el 15 de Julio de 1999), WO 98/02437 (publicada el 22 de Enero de 1998), WO 97/13760 (publicada el 17 de Abril de 1997), WO 95/19970 (publicada el 27 de Julio de 1995) , Patente de los Estados Unidos 5.587.458 (concedida el 24 de Diciembre de 1996), y Patente de los Estados Unidos 5.877.305 (concedida el 2 de Marzo de 1999) , todas las cuales están incorporadas en ésta en su totalidad por referencia. Inhibidores del receptor ErbB2 útiles en la presente invención también están descritos en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No: 60/117.341, presentada el 27 de Enero de 1999, y en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No: 60/117.346, presentada el 27 de Enero de 1999), siendo P03/101-PFA ambas incorporadas en ésta en su totalidad por referencia. Los compuestos y las sustancias que inhiben el receptor erbB2 descritos en las Solicitudes PCT, las Patentes US y las Solicitudes Provisionales US previamente mencionadas, como asi también otros compuestos y sustancias que inhiben el receptor erbB2 pueden ser usados con los compuestos de la presente invención de acuerdo con lo descrito en la presente invención. Agentes anti-supervivencía incluyen anticuerpos anti-IGF-IR y agentes anti-integrina, tales como anticuerpos anti-integrina . Métodos diagnósticos usados Los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser usados para detectar IGF-IR en una muestra biológica in vitro o in vivo. Los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser usados en un inmunoensayo convencional, incluyendo, sin limitación, ELISA, RIA, FACS, ensayo inmunohistoquímico de tejidos, Western blot o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-1GF-IR de la invención pueden ser usados para detectar el IGF-IR de humanos. En otra realización, los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser usados para detectar IGF-IR en Primates Oíd World tales como monos Cynomologus y rhesus, chimpancés y simios. La invención provee un método para P03/101-PFA detectar anti-IGF-IR en una muestra biológica, método que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención y detectar el anticuerpo ligado que se ha ligado con IGF-IR, para detectar el IGF-IR en la muestra biológica. En una realización, el anticuerpo anti-IGF-IR está marcado directamente con un marcador detectable. En otra realización, el anticuerpo anti-IGF-IR (el primer anticuerpo) no está marcado y un segundo anticuerpo u otra molécula que se puede ligar con el anticuerpo anti-IGF-IR está marcado. Como es bien conocido para un entendido en el arte, el segundo anticuerpo es elegido de modo de ser capaz para ligarse específicamente a la especie y clase específica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-IGF-IR es una IgG humana, entonces el segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo anti - IgG humana. Otras moléculas que pueden ligarse con los anticuerpos incluyen, sin limitaciones, proteína A y proteína G, las cuales son ambas comercialmente disponibles, por ejemplo, de Pierce Chemical Co. Marcadores adecuados para el anticuerpo o el anticuerpo secundario han sido revelados supra e incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales P03/101-PFA fluorescentes, materiales luminescentes, agentes magnéticos y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen streptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol; un ejemplo de un agente magnético incluye gadolinio; y ejemplos de un material radiactivo adecuado incluyen 1 5I, 131I, 35S o ¾. En una realización alternativa, el IGF-IR puede ser ensayado en una muestra biológica por un ínmunoensayo competitivo, utilizando estándares de IGF-IR marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IGF-IR no marcado. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares IGF-IR marcados y el anticuerpo anti-IGF-IR son combinados y se determina la cantidad de estándar de IGF-IR marcado ligado al anticuerpo no marcado. La cantidad de IGF-IR en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad del estándar IGF-IR marcado ligado al P03/101-PFA anticuerpo anti-IGF-IR. Los inmunoensayos arriba revelados pueden ser usados con varios propósitos. En una realización, los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser usados para detectar en un cultivo celular el IGF-IR en células. En una realización preferida, los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser usados para determinar el nivel de fosforilación de la tirosina, autofosforilación de la tirosina, autofosforilación de la tirosina del IGF-IR y/o la cantidad de IGF-IR sobre la superficie celular después del tratamiento de las células con varios compuestos . Este método puede ser usado para ensayar compuestos que pueden ser usados para activar o inhibir IGF-IR. En este método, una muestra de células es tratada con un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo, mientras que otra muestra es dejada sin tratar. Si se desea medir la autofosforilación de la tirosina, las células son sometidas a lisis y se mide la fosforilación de la tirosina del IGF-IR, usando un inmunoensayo como descrito previamente o como descrito en el Ejemplo 3, que usa un ELISA. Si desea medirse el nivel total del IGF-IR, las células son sometidas a lisis y se mide el nivel total de IGF-IR, usando uno de los inmunoensayos descritos previamente .
P03/101-PFA Un inmunoensayo preferido para determinar la fosforilación de la tirosina del IGF-IR o para medir los niveles totales de IGF-IR es un ensayo ELISA o transferencia de Western (Western blot) . Si sólo desea medirse el nivel de IGF-IR en la superficie celular, las células no son sometidas a lisis, y se miden los niveles de IGF-IR en la superficie celular usando uno de los inmunoensayos previamente descritos. Un inmunoensayo preferido para determinar los niveles de IGF-IR en la superficie celular incluye las etapas de marcar las proteínas de la superficie celular con un marcador detectable, tal como biotina o 125I, inmunoprecipitar el IGF-IR con un anticuerpo anti-IGF-IR y luego detectar el IGF-IR marcado. Otro inmunoensayo preferido para determinar la localización del IGF-IR, por ejemplo, sus niveles en la superficie celular, es el uso de inmunohistoquimica. Métodos tales como ELISA, RIA, transferencia de Western, inmunohistoquimica, marcado en la superficie celular de proteínas que integran la membrana e inmunoprecipitación son bien conocidos en el arte. Vea, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra. Además, puede aumentarse la escala de los inmunoensayos para una selección con alto rendimiento con el fin de ensayar un gran número de compuestos para la P03/10I-PFA activación o inhibición del IGF-IR. Los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención también pueden ser usados para determinar los niveles de IGF-IR en un tejido o en células derivadas de un tejido. En una realización preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una realización más preferida, el tejido es un tumor o una biopsia del mismo. En una realización preferida del método, un tejido o una biopsia del mismo es separado de un paciente. Luego, el tejido o la biopsia es usado en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, niveles de IGF-IR, niveles de IGF-IR en la superficie celular, niveles de fosforilación de la tirosina IGF-IR, o localización de IGF-IR por los métodos arriba discutidos. El método puede ser usado para determinar si un tumor expresa IGF-IR en un nivel elevado. El método diagnóstico arriba descrito puede ser usado para determinar si un tumor expresa altos niveles de IGF-IR, lo que podría indicar que el tumor responderá al tratamiento con anticuerpo anti-IGF-IR. El método diagnóstico también puede ser usado para determinar si un tumor es potencialmente canceroso, cuando expresa elevados niveles de IGF-IR, o si es benigno, si expresa niveles bajos de IGF-IR. Además, el método diagnóstico también P03/101-PFA puede ser usado para determinar si el tratamiento con el anticuerpo anti-IGF-IR (vea abajo) causa que un tumor exprese bajos niveles de IGF-IR y/o expresa bajos niveles de autofosforilación de tirosina, y de este modo el método diagnóstico puede ser utilizado para determinar si el tratamiento es exitoso. En general, un método para determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR disminuye la fosforilación de la tirosina comprende las etapas de medir el nivel de fosforilación de la tirosina en una célula o un tejido de interés, incubar la célula o el tejido con un anticuerpo anti-IGF-IR o una porción que liga antigeno del mismo, y medir luego nuevamente el nivel de la fosforilación de la tirosina en la célula o el tejido. Puede medirse la fosforilación de la tirosina del IGF-IR o de otra(s) proteina(s). El método diagnóstico también puede ser usado para determinar si un tejido o una célula no expresa niveles suficientemente altos de IGF-IR o niveles suficientemente altos de IGF-IR activado, lo que puede ser el caso para individuos con enanismo, osteoporosis o diabetes. Un diagnóstico que indica niveles de IGF-IR o de IGF-IR activo demasiado bajos puede indicar la necesidad de un tratamiento con anticuerpos anti-IGF-IR activantes, IGF-I u otros agentes terapéuticos que aumentan los niveles o P03/101-PFA la actividad de IGF-IR. Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser usados in vivo para localizar tejidos y órganos que expresan IGF-IR. En una realización preferida, los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser usados para localizar tumores que expresan IGF-IR. La ventaja de los anticuerpos anti-IGF-IR de la presente invención es que estos anticuerpos no generarán una respuesta inmune al ser administrados. El método comprende las etapas de administrar un anticuerpo anti-IGF-IR o una composición farmacéutica del mismo a un paciente que necesita tal ensayo diagnóstico y someter al paciente a análisis por imágenes para determinar la ubicación de los tejidos que expresan el IGF-IR. El análisis de diagnóstico por imágenes es bien conocido en el arte médico, e incluye, sin limitación, análisis por rayos X, diagnóstico por imagen con resonancia magnética (MRI) o tomografia computarizada (CE) . En otra realización del método, en vez de someter al paciente a un análisis por imágenes, se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interés expresa IGF-IR. En una realización preferida, los anticuerpos anti-IGF-IR pueden ser marcados con un agente detectable que puede ser usado como reactivo para P03/101-PFA diagnóstico por imagen. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado con un agente de contraste, tal como bario, que puede ser usado para análisis de rayos X, o un agente de contraste magnético, tal como quelato de gadolinio, que puede ser usado para MRI o CE. Otros agentes de marcado incluyen, sin limitación, radioisótopos tales como 9STc. En otra realización, el anticuerpo anti-IGF-IR no será marcado y será detectado por imagen por la administración de un segundo anticuerpo u otra molécula que es detectable y que puede ligar el anticuerpo anti-IGF-IR. Métodos terapéuticos usados En otra realización, la invención provee un método para inhibir la actividad del IGF-IR por la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR a un paciente que necesita tal administración. Tipos cualesquiera de anticuerpos descritos en ésta pueden ser usados terapéuticamente. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es un anticuerpo humano, quimérico o humanizado. En otra realización preferida, el IGF-IR es humano y el paciente es un paciente humano. Alternativamente, el paciente puede ser un mamífero que expresa un IGF-IR con el cual el anticuerpo anti-IGF-IR reacciona en forma cruzada. El anticuerpo puede ser administrado a un mamífero no humano que expresa un P03/101-PFA IGF-IR con el cual el anticuerpo reacciona en forma cruzada (es decir, un primate o un mono Cynomologus o rhesus) con fines veterinarios o para usar el animal como modelo para enfermedades humanas. Tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de esta invención. De acuerdo con el uso en ésta, el término "un trastorno en el cual la actividad del IGF-IR es perniciosa" tiene la intención de incluir enfermedades y otros trastornos en los cuales se ha mostrado que la presencia de altos niveles del IGF-IR en un sujeto que sufre de tal trastorno es, o supuestamente es, responsable por la patofisiologia del trastorno o es, o supuestamente es, un factor que contribuye con el empeoramiento del trastorno. Por lo tanto, un trastorno en el cual elevados niveles de actividad de IGF-IR son perniciosos es un trastorno en el cual se espera que la inhibición de la actividad del IGF-IR alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Tales trastornos pueden ser puestos en evidencia, por ejemplo, por un aumento en los niveles de IGF-IR sobre la superficie celular o por una autofosforilación aumentada de la tirosina del IGF-IR en las células o los tejidos afectados de un sujeto que sufre tal trastorno. El aumento de los P03/10I-PFA niveles de IGF-IR puede ser detectado, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IGF-IR como descrito precedentemente. En una realización preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR puede ser administrado a un paciente que tiene un tumor que expresa IGF-IR, Un tumor puede ser un tumor sólido o puede ser un tumor no sólido, tal como un linfoma. En una realización más preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR puede ser administrado a un paciente que tiene un tumor canceroso que expresa IGF-IR. En una realización aún más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es administrado a un paciente que tiene un tumor de pulmón, mama, próstata o colon. En una realización altamente preferida, el método causa que el tumor no aumente de peso o volumen o que disminuya en peso o volumen. En otra realización, el método causa que el IGF-IR sobre el tumor sea internalizado. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 o 6.1.1, o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una región que liga antigeno de los mismos. En otra realización preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR puede ser administrado a un paciente que expresa niveles inapropiad mente elevados de IGF-I. Es sabido en el arte que un alto nivel de expresión de IGF-I puede llevar a una P03/101-PFA variedad de cánceres comunes. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es administrado a un paciente con cáncer de próstata, glioma o fibrosarcoma . En una realización aún más preferida, el método causa que la proliferación anormal del cáncer se detenga, o que el cáncer no aumente en peso o volumen o que disminuya en peso o volumen. En una realización, dicho método se refiere al tratamiento de un cáncer tal como cáncer de cerebro, de células escamosas, de vejiga, gástrico, pancreático, de mama, de cabeza, de cuello, esofágico, de próstata, colorectal, de pulmón, renal, de riñon, de ovarios, ginecológico o de tiroides. Pacientes que pueden ser tratados con un compuesto de la invención de acuerdo con los métodos de esta invención incluyen, por ejemplo, pacientes a los cuales se ha diagnosticado cáncer de pulmón, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, c ncer de cabeza y de cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer estomacal, cáncer del colon, cáncer de las mamas, tumores ginecológicos (por ejemplo, sarcomas uterinos, carcinoma de las trompas de Faloppio, carcinoma del endometrio, carcinoma cervical, P03/10I-PFA carcinoma de la vagina o carcinoma de la vulva) , enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino (por ejemplo, cáncer de la tiroides, paratiroides o de las glándulas adrenales), sarcomas de los tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, tumores sólidos de la niñez, linfomas linfociticos, cáncer de la vejiga, c ncer del riñon o de la uretra (por ejemplo, carcinoma de las células renales, carcinoma de la pelvis renal), o neoplasmas del sistema nervioso central (por ejemplo, linforna del sistema nervioso central (CNS) primario, tumores del eje espinal, gliomas del tronco cerebral o adenomas pituitarios) . El anticuerpo puede ser administrado una sola vez, pero más preferentemente es administrado varias veces. El anticuerpo puede ser administrado desde tres veces diariamente a una vez cada seis meses. El esquema de administración puede ser, por ejemplo, tres veces por día, dos veces por día, una vez por día, una vez cada dos días, una vez cada tres dias, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo puede ser administrado via una ruta oral, P03/101-PFA mucosal, bucal, intranasal, por inhalación, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. El anticuerpo puede ser administrado en un sitio distante del sitio del tumor. El anticuerpo también puede ser administrado en forma continua vía una mini-bomba. El anticuerpo puede ser administrado una vez, al menos dos veces o durante al menos el periodo de tiempo necesario para que la condición sea tratada, aliviada o curada. El anticuerpo será administrado generalmente mientras que el tumor esté presente, siempre que el anticuerpo cause la detención del crecimiento o la disminución del peso o volumen del tumor. El anticuerpo será administrado generalmente como parte de una composición farmacéutica como descrita supra . La dosificación del anticuerpo estará generalmente en la gama de 0, 1-100 mg/kg, más preferentemente 0,5-50 mg/kg, más preferentemente 1-20 mg/kg, y aún más preferentemente 1-10 mg/kg. La concentración del anticuerpo en suero puede ser medida por cualquier método conocido en el arte. Vea, por ejemplo, Ejemplo XVII abajo. El anticuerpo también puede ser administrado profilácticamente con el fin de prevenir la formación de un cáncer o tumor. Esto puede ser especialmente · útil en pacientes que tienen un nivel P03/101-PFA "normalmente alto" de IGF-I, debido a que se mostró que estos pacientes tienen un mayor riesgo de desarrollar cánceres comunes. Vea Rosen et al., supra. En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR puede ser co-administrado con otros agentes terapéuticos, tales como drogas o moléculas antineoplásticas, a un paciente que tiene un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer o un tumor. En un aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo en un mamifero, método que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención en combinación con un agente anti-tumoral seleccionado del grupo formado por, pero no limitado a, inhibidores mitóticos, agentes de alquilación, anti-metabolitos, agentes de intercalado, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, inhibidores de la quinasa, inhibidores de la matriz-metaloproteasa, productos terapéuticos genéticos y anti-andrógenos . En una realización más preferida, el anticuerpo puede ser administrado con un agente antineoplástico, tal como adriamicina o taxol . En otra realización preferida, el P03/101-PFA anticuerpo o la composición para terapia de combinación es administrado con untamente con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia . En aún otra realización preferida, el anticuerpo será administrado con otro anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-IGF-I puede ser administrado con un anticuerpo u otro agente del cual se sabe que inhibe la proliferación de un tumor o de células cancerosas, por ejemplo, un anticuerpo o agente que inhibe receptor erbB2, EGF-R, CD20 o VEGF. La co-administración del anticuerpo con un agente terapéutico adicional (terapia de combinación) comprende administrar una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-IGF-IR y el agente terapéutico adicional, y comprende administrar por separado dos o más composiciones farmacéuticas, comprendiendo una el anticuerpo anti-IGF-IR y comprendiendo la(s) otra(s) el (los) agente (s) terapéutico (s) adicional (es) . Además, a pesar de que la coadministración o terapia de combinación significa generalmente administrar el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales simultáneamente, también comprende casos en los cuales el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales son administrados en tiempos diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser P03/101-PFA administrado una vez cada tres dias, mientras que el agente terapéutico adicional es administrado una vez por dia. Alternativamente, el anticuerpo puede ser administrado antes o después del tratamiento del trastorno con el agente terapéutico adicional, similarmente, la administración del anticuerpo anti-IGF-IR puede ser realizada antes o después de otra terapia, tal como radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia. El anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales (la terapia de combinación) pueden ser administrados una vez, dos veces o al menos durante el período de tiempo necesario para que la condición sea tratada, aliviada o curada. Preferentemente, la terapia de combinación es administrada varias veces. La terapia de combinación puede ser administrada desde tres veces por día hasta una vez cada seis meses. El esquema de administración puede ser, por ejemplo, tres veces por día, dos veces por día, una vez por día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses, o la terapia de combinación puede ser administrada continuamente vía una mini-bomba. La terapia de combinación puede ser P03/101-PFA administrada vía una ruta oral, mucosal, bucal, intranasal, por inhalación, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. La terapia de combinación puede ser administrada en un sitio distante del sitio del tumor. La terapia de combinación será administrada generalmente mientras que el tumor esté presente, siempre que el anticuerpo cause la detención del crecimiento o la disminución del peso o volumen del tumor. En aún otra realización, el anticuerpo anti-IGF-IR es marcado con un radiomarcador, una inmunotoxina o una toxina, o es una proteina de fusión que comprende un péptido tóxico. El anticuerpo anti-IGF-IR o la proteina de fusión que comprende el anticuerpo anti-IGF-IR dirige el radiomarcador, la inmunotoxina, la toxina o el péptido tóxico hacia el tumor o la célula cancerosa que expresa el IGF-IR. En una realización preferida, el radiomarcador, la inmunotoxina, la toxina o el péptido tóxico es internalizado después que el anticuerpo anti-IGF-IR se liga al IGF-IR sobre la superficie del tumor o de la célula cancerosa. En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR puede ser usado terapéuticamente para inducir apoptosis de células especificas en un paciente que necesita tal apoptosis. En P03/I01-PFA muchos casos, las células que son blancos para la apoptosls son células cancerosas o tumorales. De este modo, en una realización preferida, la invención provee un método para inducir apoptosis por la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-IGF-IR a un paciente que necesita tal administración. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado entre 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 o 6.1.1, o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una región que liga antigeno de los mismos. En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR puede ser usado para tratar estados no cancerosos en los cuales altos niveles de IGF-I y/o IGF-IR han sido asociados con un estado o una enfermedad no cancerosa. En una realización, el método comprende la etapa de administrar un anticuerpo anti-IGF-IR a un paciente que tiene un estado patológico no canceroso causado o exacerbado por altos niveles o alta actividad de IGF-I y/o IGF-IR. En una realización preferida, el estado patológico no canceroso es acromegalia, gigantismo, psoriasis, aterosclerosis, reestenosis de la musculatura lisa de los vasos sanguíneos o una proliferación microvascular inapropiada, tal como la encontrada en la complicación de la diabetes, especialmente P03/101-PFA en el ojo. En una realización más preferida/ el anticuerpo anti-IGF-IR lentifica el progreso del estado patológico no canceroso. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR detiene o invierte, al menos en parte, el estado patológico no canceroso. En otro aspecto, la invención provee un método para administrar un anticuerpo anti-IGF-IR activante a un paciente que necesita tal anticuerpo. En una realización, el anticuerpo o la composición farmacéutica activante es administrado a un paciente que necesita los mismos en una cantidad efectiva para aumentar la actividad de IGF-IR. En una realización más preferida, el anticuerpo activante es capaz de restaurar la actividad IGF-IR norm l. En otra realización preferida, el anticuerpo activante puede ser administrado a un paciente que tiene pequeña estatura, neuropatía, una disminución de la masa muscular u osteoporosis . En otra realización preferida, el anticuerpo activante puede ser administrado con uno o más factores adicionales que aumentan la proliferación celular, previenen apoptosis o aumentan la actividad de IGF-IR. Tales factores incluyen factores de crecimiento, tales como IGF-I y/o análogos de IGF-I que activan IGF-IR. En una realización preferida, el anticuerpo es seleccionado de P03/101-PFA 4.17.3 o comprende una cadena pesada, una cadena liviana o una porción que liga antígeno del mismo. Terapia con genes Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser administradas a un paciente que necesita tal administración por medio de terapia con genes. La terapia puede ser o in vivo o ex vivo. En una realización preferida, moléculas de ácido .nucleico que codifican ambas, una cadena pesada y una cadena liviana, son administradas a un paciente. En una realización más preferida, las moléculas de ácido nucleico son administradas de modo que son integradas en forma estable en el cromosoma de las células B, debido a que estas células están especializadas en la producción de anticuerpos. En una realización preferida, células precursoras B son transfectadas o infectadas ex vivo y re-transplantadas en un paciente que necesita tales células. En otra realización, células precursoras B u otras células son infectadas in vivo usando un virus conocido para infectar el tipo celular de interés. Vectores típicos usados para la terapia con genes incluyen liposoraas, plásmidos, o vectores virales, tales como retrovirus, adenovirus, y virus adeno-asociados . Después de la P03/10 I-PFA infección, ya sea in vivo o ex vivo, los niveles de expresión del anticuerpo pueden ser monitoreados tomando una muestra del paciente tratado y usando un inmunoensayo conocido en el arte y discutido en ésta. En una realización preferida, el método de terapia con genes comprende las etapas de administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada, o la porción que liga antigeno de la misma, del anticuerpo humano o una porción del mismo, y expresar el ácido nucleico. En otra realización, el método de terapia con genes comprende las etapas de administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico aislado que codifica la cadena liviana, o la porción que liga antigeno de la misma, del anticuerpo humano o una porción del mismo, y expresar el ácido nucleico. En un método más preferido, el método de terapia con genes comprende las etapas de administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico aislado, codificar la cadena pesada, o la porción que liga antigeno de la misma, del anticuerpo humano o una porción del mismo y una cantidad efectiva de un ácido nucleico aislado que codifica la cadena liviana, o la porción que liga antigeno de la misma, del anticuerpo humano o una porción del mismo, y expresar los ácidos nucleicos. El P03/101-PFA método de terapia con genes también puede comprender la etapa de administrar otro agente anti-canceroso, tal como taxol, tamoxifen, 5-FU, adriamicina o CP-353.774. Para que esta invención pueda ser mejor entendida, se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos son provistos solamente con fines de ilustración y no deben ser interpretados de ninguna forma como limitantes del alcance de la invención. EJEMPLO I : Generación de un anticuerpo anti-IGF-IR que produce hibridomas Anticuerpos de la invención fueron preparados, seleccionados y ensayados como sigue; Inmunización y generación de hibridomas Ratones XENOMICE"5 de ocho a diez semanas de edad fueron inmunizados intraperitonealmente o en las plantas de sus patas traseras, o con el dominio extracelular de IGF-IR humano (10 g/dosis ratón) , o con células 3T3-IGF-IR o 300.19-IGF-IR, las que son dos lineas celulares transfectadas que expresan sobre sus membranas plasmáticas IGF-IR (10 x 10'" células por dosis por ratón) . Esta dosis fue repetida cinco a siete veces durante un periodo de tres a ocho semanas. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección final del dominio extracelular de P03/101-PFA IGF-IR humano en PBS . Linfocitos del bazo y del nodo linfático de los ratones inmunizados fueron fusionados con la línea celular de mieloma no secretorio P3-X63-Ag8.653 y fueron sometidos a selección en medio HAT como previamente descrito (Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981) . Se recuperó un panel de hibridomas que segregan todos anticuerpos IgG2K humanos específicos para IGF-IR. Siete hibridomas que producen anticuerpos monoclonales específicos para IGF-IR fueron seleccionados para estudios adicionales y fueron designados 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 y 6.1.1. Los hibridomas 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,' 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3 fueron depositados en la colección American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Bouievard, Manassas, VA 20110-2209, el 12 de diciembre de 2000 con los números de depósitos siguientes: Hibridoma Depósito N° 2.12.1 PTA-2792 2.13.2 PTA-2788 2.14.3 PTA-2790 3.1.1 PTA-2791 4.3.2 PTA-2 89 4.17.3 PTA-2793 P03/101-PFA EJEMPLO II: Determinación de las constantes de afinidad (K.j) de anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR completamente humanos por BIAcore Realizamos medidas de afinidad de anticuerpos purificados por resonancia en la superficie de un sensor recubierto con la muestra (surface plasmon resonance) usando el instrumento BIAcore 3000, siguiendo los Protocolos del fabricante. Protocolo i. Para efectuar análisis cinéticos, proteina A fue inmovilizada sobre las superficies del chip sensor del BIAcore, Luego, el chip sensor fue usado para capturar los anticuerpos anti-IGF-IR de la presente invención. Se inyectaron diferentes concentraciones del dominio extracelular del IGF-IR sobre el chip sensor y se analizó la cinética de ligadura y disociación de las interacciones entre ios anticuerpos anti-IGF-IR y el dominio extracelular del IGF-IR. Los datos fueron evaluados con el modelo de adaptación total de los datos Langmuir 1:1 (global fit Langmuir 1:1) usando modelos de desplazamiento de la linea base disponibles en el Software de evaluación BIA provisto por BIAcore , Protocolo 2, P03/101-PFA Las mediciones con BIAcore fueron realizadas esencialmente como descrito por Fagerstam et al. "Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping" . J. Mol. Recog. 3: 208-214 (1990) . La Tabla 1 indica mediciones de afinidad para anticuerpos anti-IGF-IR representativos de la presente invención: Tabla 1 Los análisis cinéticos indican que los anticuerpos preparados de acuerdo con la invención poseen constantes de afinidad que indican una elevada ligadura con el dominio extracelular de IGF-IR. EJEMPLO III: Inhibición de la fosforilación del IGF-IR P03/101-PFA inducida por IGF-I por medio del anticuerpo Realizamos experimentos ELISA para determinar si los anticuerpos de esta invención eran capaces de bloquear la activación del IGF-IR mediada por IGF-I . La activación de IGF-IR mediada por IGF-I fue detectada por la fosforilación aumentada de la tirosina asociada con el receptor. Preparación de placas ELISA Preparamos placas de captación ELISA agregando a cada cavidad de una placa de 96 cavidades recubiertas con proteina G ReactiBind (Pierce) 100 µ? de buffer de bloqueo (3% de suero de albúmina bovino [BSA] en solución fisiológica bufferada con Tris [TBS] ) , e incubamos las placas con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diluimos anticuerpo anti-IGF-IR de conejo SC-713 pan-especifico (N. de . : de especificidad muy amplia) {Santa Cruz) en buffer de bloqueo a una concentración de 5 µg/ml y agregamos a cada cavidad 100 µ? de anticuerpo diluido. Incubamos las placas con agitación durante 60-90 minutos a temperatura ambiente. Luego lavamos las placas cinco veces con buffer de lavado (TBS + 0,1 de Tween 20) y secamos el buffer remanente suavemente sobre toallas de papel. No se dejó secar las placas antes del agregado del lisado .
P03/101-PFA Preparación de Usado a partir de células que expresan IGF-IR Colocamos células NIH-3T3 transíectadas con IGF-IR (5 x lOVml) en 100 µ? de medio de cultivo (medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con L-glutamina (0,29 mg/ml) , 10% de FBS inacti ado con calor, y 500 µg/ml de cada una de geneticina, penicilina y streptomicina) en placas de 96 cavidades con fondo en U. Incubamos las placas a 3 °C, 5% de C02, durante la noche para dejar que las células se adhieran. Decantamos el medio de las placas y lo reemplazamos con 100 µ? por cavidad de medio de cultivo fresco. Para el ensayo, diluimos los anticuerpos anti-IGF-IR potenciales a cinco veces la concentración final deseada en medio de cultivo y agregamos 25 µ? por cavidad. Todas las muestras fueron preparadas por triplicado. Luego, incubamos las placas a 37 °C durante una hora. Estimulamos las células con 25 µ?/cavidad de IGF-I 600 ng/ml (preparado en medio de cultivo) e incubamos las placas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, decantamos el medio invirtiendo las placas y secando suavemente sobre toallas de papel y Usamos las células adherentes por el agregado de 50 µ? de buffer de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,4, EDTA 10 P03/10I-PFA p?, NaCl 150 iriM, MgCl2 1,5 mM, NaV0 1,6 mM, 1% de Tritón X-100, 1% de glicerol suplementado inmediatamente antes del uso con una tableta de inhibidor de proteasa libre de EDTA [Roche Molecular Sciences] por 50 mi) y agitamos durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agregamos a cada cavidad 200 µ? de buffer de dilución (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaV(¾ 1,6 mM) y mezclamos por aspiración y expulsión en pipeta. Transferimos 100 µ? de Usado de cada cavidad a cada cavidad de la placa de captación ELISA preparada como arriba descrito e incubamos con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente. ELISA con anticuerpos anti - fosfato de tirosina (pTYR) Sacamos el lisado celular invirtiendo las placas, lavamos las placas cinco veces con buffer de lavado y secamos sobre toallas de papel. Agregamos 100 µ? por cavidad de anticuerpo pTYR-especifico (HRP-PY54) diluido en buffer de bloqueo a una concentración de 0,2 g/ml e incubamos las placas con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego lavamos estas placas cinco veces con buffer de lavado y secamos sobre toallas de papel . Determinamos la ligadura del anticuerpo HRP-PY54 agregando 100 µ? por cavidad de solución de sustrato de TMB P03/101-PFA peroxidasa (Kirkegaard & Perry) e incubamos con agitación a medida que se desarrolló el color (aproximadamente 2-10 minutos) . Interrumpimos la reacción de desarrollo de color agregando 100 µ? por cavidad de solución de detención TMB (Kirkegaard & Perry) . Luego agitamos las placas durante 10 segundos a temperatura ambiente para mezclar la solución y efectuamos la medición cuantitativa a una densidad óptica OD450**,. La Tabla 2 y la Figura 4 muestran los resultados de este experimento realizado con varios anticuerpos de la invención. Los resultados de este experimento demuestran la capacidad de los anticuerpos de esta invención de bloquear la activación de IGF-IR mediada por IGF-I, lo que es mostrado por la fosforilación aumentada de la tirosina asociada al receptor. Además, estos resultados pueden ser usados para cuantificar la potencia negativa de los anticuerpos de esta invención. Tabla II P03/101-PFA 2.14.3 0,325 4.9.2 0, 0324 EJEMPLO IV: Bloqueo de la ligadura IGF-I/IGF-IR por medio del anticuerpo Realizamos experimentos ELISA para cuantificar la capacidad de los anticuerpos de la invención para inhibir la ligadura de IGF-I a IGF-IR en un ensayo realizado con células. Sembramos en placas células NIH-3T3 transfectadas con IGF-IR (5 x 104/ml) en 100 µ? de medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inacti ado con calor, y 500 µ?/?a? de cada una de geneticina, penicilina y streptomicina, en placas de 96 cavidades con fondo en forma de U. Luego incubamos las placas a 37 °C, 5% CO2, durante la noche para permitir que las células se adhieran. Luego decantamos el medio de las placas y lo reemplazamos con 100 µ? de medio fresco por cavidad. Para el ensayo, diluimos los anticuerpos en medio de ensayo (medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con L-glutamina, 10% de FBS inactivado con calor, 200 µg/ml de BSA y 500 µg/ml de cada una de geneticina, penicilina y streptomicina) hasta la concentración final deseada y agregamos 50 µ? por cavidad. Todas las muestras fueron preparadas por P03/101-PFA triplicado. Luego incubamos las placas a 37 °C durante 10 minutos. Diluimos [125I] -IGF-1 a una concentración de 1 µ??/???? en medio de ensayo y agregamos 50 µ? por cavidad de la placa. Como control para la radioactividad de fondo, agregamos IGF-I frío a una concentración final de 100 ng/ml . Incubamos las placas durante 10 minutos a 37 °C, decantamos el medio secando suavemente sobre toallas de papel y lavamos dos veces con medio de ensayo. Luego lisamos las células agregando 50 µ? de NaOH 0,1 N, 0,1% de SDS y agitamos las placas durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego transferimos las muestras a una placa de centelleo, agregamos 150 µ? de OptiPhase Supermix y leímos la señal con un contador Wallac Micro-Beta. La Tabla III y la Figura 3 muestran los resultados de este experimento realizado con tres anticuerpos representativos de la invención. Este experimento demostró que los anticuerpos de la invención inhiben específicamente la ligadura de [12al] -IGF-I a células que sobrexpresan IGF-IR. Tabla III P03/101-PFA 2.12.1 0,45 µg/ml 2.13.2 0,18 µg/ml 4.9.2 0,1 µg ml EJEMPLO V: Estudios de elaboración de mapas de epitopes Habiendo demostrado que los anticuerpos de la invención reconocen IGF-IR, realizamos estudios de elaboración de mapas de epitopes con varios anticuerpos de la invención. Dirigimos estos experimentos particularmente a los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 y 4.9.2. Realizamos estudios de competición con BIAcore para determinar si los anticuerpos de esta invención se ligan a sitios iguales o distintos sobre la molécula IGF-IR. Ligamos el dominio extracelular (ECD) del IGF-IR a un chip sensor BIAcore de acuerdo con lo descrito precedentemente en el Ejemplo II. Ligamos un primer anticuerpo de la invención a este IGF-IR ligado al chip sensor bajo condiciones de saturación. Luego medimos la capacidad de anticuerpos de la invención secundarios subsecuentes para competir con el anticuerpo primario por la ligadura a IGF-IR. Esta técnica nos permitió asignar los anticuerpos de esta invención a diferentes grupos de ligadura. Realizamos este experimento con anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 y 4.9.2. Observamos que 2.13.2 y 4.9.2 P03/101-PFA compiten por el mismo sitio sobre el dominio extracelular de IGF-IR. Los otros anticuerpos, 2.12.1 y 2.14.3, se ligan a sitios sobre IGF-IR que son diferentes entre sí y del sitio al que se liga 2.13.2 y 4.9.2. EJEMPLO VI: Reactividad cruzada especifica de los anticuerpos de la invención Para determinar la reactividad cruzada específica de los anticuerpos de la invención, realizamos varios experimentos incluyendo análisis de inmunoprecipitación, bloqueo de la fosforilación del receptor inducida por IGF y FACS. Para realizar experimentos de inmunoprecipitación, sembramos placas con células en medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con L-glutamina (0,29 mg/ml) , 10% de FBS inactivado con calor, y 500 µg ml de cada una de geneticina, penicilina y streptomicina hasta una confluencia de 50% en frascos T25. Luego agregamos 100 µ? de un anticuerpo de la invención en solución fisiológica bufferada de Hank (HBSS; GIBCO VRL) a una concentración de 1 g ml . Incubamos las placas durante 30 minutos a 37 °C en un incubador y luego estimulamos las células con IGF-I a 100 ng/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lisamos las células en buffer RIPA (Harlow y La e, supra) e P03/101-PFA inmunoprecipitamos IGF-IR con 2 µg de anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 pan-especifico (Santa Cruz) plus perlas de agarosa de proteína R durante una hora a 4°C. Peletizamos las perlas y lavamos tres veces con PBS/T (PBS más 0,1% de Tween 20) y luego hervimos las perlas en 40 µ? de buffer Laemmli que contiene 5% de ß??. Luego, las muestras preparadas según lo descrito precedentemente fueron analizadas por transferencia de Western. Cargamos 12 µ? de cada muestra por pista sobre geles Novex™ con un gradiente de 4-10% (de acrilamida más bisacrilamida, N. de T.) embebidos con buffer IX MES ("NovexlM"). Los geles fueron sometidos a 150 V durante una hora o a 200 V durante aproximadamente 30 minutos. Luego, transferimos el gel a una membrana en buffer de transferencia Novex™ con 10% de metanol, o durante la noche a 100 IDA o durante 1-1,5 horas a 250 mA, Luego dejamos secar la membrana completamente y bloqueamos a temperatura ambiente con TBS (solución fisiológica bufferada con Tris, pH 8,0) que contiene Superblock (Pierce Chemical Co.). Luego agregamos el anticuerpo de revelación SC713 (blotting antibody) de IGF-IR (Santa Cruz) para detectar el IGF-IR inmunoprecipitado . Este experimento fue realizado con anticuerpos de la P03/101-PFA invención, particularmente con 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 y 4.9.2, sobre células de una variedad de animales. Encontramos que los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2 y 4.9.2 eran capaces de ligarse al IGF-IR humano, pero no al IGF-IR de perros , chanchos de las Indias y conejos. Además, estos anticuerpos eran capaces de ligarse con IGF-IR de C0S7 y rhesus, derivados ambos de monos Oíd World, pero no con IGF-IR del marmoset, que es un mono New World. Estos experimentos indican que los anticuerpos son altamente específicos . Bloqueo de la ligadura IGF-I/IGF-IR en primates no humanos por medio del anticuerpo Siguiendo nuestra observación de que los anticuerpos de la invención reconocen el IGF-IR de monos Oíd World, también ensayamos su capacidad de bloquear la ligadura IGF-I/IGF-IR en células derivadas de estos monos Oíd World. Sembramos placas con células en medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con L-glutamina, 10% de FBS inacti ado con calor, y 500 µ?/ml de cada una de geneticina, penicilina y streptomicina hasta 50% de confluencia en frascos T25. Luego agregamos un anticuerpo de la invención, o como control medios sin anticuerpo, y estimulamos las células con IGF-I a 100 ng/ml durante 10 P03/101-PFA minutos a temperatura ambiente. Después de la estimulación, Usarnos las células e inmunoprecipitamos IGF-IR con anticuerpo IGF-IR pan-específico SC713, según lo arriba descrito. Luego realizamos análisis de transferencia de Western según lo descrito precedentemente, usando anticuerpo HRP-PY54 para detectar tirosina fosforilada en el IGF-IR activado. Observamos que anticuerpos de esta invención, en particular 2.13.2 y 4.9.2, podían bloquear la fosforilación del IGF-IR inducida por IGF-I en ambas, células de C0S7 y rhesus. La IC50 para la inhibición observada era 0,02 µg/ml y 0,005 g/ml para IGF-IR de COS7 y rhesus, respectivamente . Determinación de afinidad cruzada específica de anticuerpos de la invención. Realizamos análisis FACS para determinar la afinidad de los anticuerpos de la invención para el IGF-IR de otros animales, particularmente de monos Oíd World, arriba descrito. Incubamos alícuotas de células humanas y de mono (5 x 105) durante 1 hora sobre hielo con concentraciones crecientes de anticuerpos de la invención anti-IGF-IR biotinilados o con un anticuerpo "anti-keyhole limpet heniocyanin" (KLH) (Abgenix) como control negativo. Luego P03/101-PFA incubamos las muestras durante 30 minutos sobre hielo con RPE conjugado con esteptavidina (ficoeritrina) . Medimos la ligadura por citometria de flujo y analizamos los histogramas de intensidad de fluorescencia (F12-H) en función del número de células (conteos) usando el software CellQuest. Calculamos la ligadura (KD) para cada anticuerpo a partir de gráficos de la intensidad de fluorescencia promedio en función de la concentración del anticuerpo. En la mayoría de los experimentos, medimos la ligadura en células MCF-7 humanas cultivadas o en células cultivadas de tejido de rhesus o Cynomologus . Controlamos el agotamiento del anticuerpo midiendo la ligadura en una gama de concentraciones celulares. Realizamos el análisis FACS arriba mencionado para ensayar la capacidad de los anticuerpos de la invención, particularmente 2.13.2 y 4.9.2, para ligar células humanas, de Rhesus y de Cynomologus. Observamos una ligadura (¾) máxima media de 0,1 µg/ml para todas las líneas celulares ensayadas . EJEMPLO VII: Disminución de la actividad del receptor IGF-1 Realizamos experimentos de bloqueo, esencialmente como descrito precedentemente en el Ejemplo IV, hasta el agregado de IGF-I marcado con [125I] . En este punto, P03/101-PFA hervimos las células en 40 µ? de buffer Laemmli que contiene 50% de me. Luego analizamos las muestras por análisis de transferencia de Western, como descrito precedentemente en el Ejemplo VI, y examinamos las manchas transferidas con ambos, anticuerpo IGF-IR SC713 pan-específico para cuantificar los niveles de IGF-IR y anticuerpo HRP-PY54 para monitorear los niveles de tirosinafosforilada en el IGF-IR activado. Como observado previamente (Ejemplo III) , observamos bloqueo de la fosforilación del IGF-IR inducida por IGF-I después del tratamiento de células con un anticuerpo de esta invención (Figura 4) . Además, observamos que este bloqueo de fosforilación inducida por IGF-I fue seguida por una disminución de la actividad del IGF-IR en estas células. Vea, por ejemplo, Figura 4. La reducción máxima de los niveles de IGF-IR se produjo 16 horas después de la estimulación con IGF-I en presencia de un anticuerpo de la invención. EJEMPLO VIII: Efectos de los anticuerpos de la invención sobre IGF-IR in vivo Determinamos si los efectos de los anticuerpos de la invención sobre IGF-IR descritos en los ejemplos previos ocurrirían in vivo. Inducimos tumores en ratones atímicos P03/10J-PFA de acuerdo con métodos publicados (V.A. Pollack et al., "Inhibition of epidermal growth factor receptor . associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358.774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice", J. Pharmacol, Exp. Ther. 291: 739-748 (1999)) . Brevemente, ratones {nu/nu) atimicos de tres a cuatro semanas de edad fueron inyectados subcutáneamente con células NIH-3T3 transíectadas con IGF-IR (5 x 105) con 0,2 mi de preparación Matrigel. Luego, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con un anticuerpo de la invención después de la formación de tumores establecidos (es decir, aproximadamente de 400 itim3) . Después de 2'4 horas, extraimos los tumores, los homogeneizamos y determinamos el nivel de IGF-IR. Para determinar los niveles de IGF-IR, diluimos el anticuerpo SC-713 en buffer de bloqueo a una concentración final de µg/ml y agregamos 100 µ? a cada cavidad de una placa recubierta con anticuerpo anti-IgG de conejo preparado en cabra (goat anti-rabbit (GAR) reacti-bind) (Pierce) . Incubamos las placas a temperatura ambiente durante una hora con agitación y luego lavamos las placas cinco veces con buffer de lavado. Luego pesamos muestras del tumor que P03/101-PFA habia sido preparado como arriba descrito y las homogeneizamos en buffer de lisis (1 ml/100 mg) . Diluimos 12,5 µ? del extracto de tumor con buffer de lisis a un volumen final de 100 µ? y agregamos esta dilución a cada cavidad de una placa de 96 cavidades. Incubamos las placas a temperatura ambiente con agitación durante 1-2 horas y luego lavamos las placas cinco veces con buffer de lavado. Luego agregamos a cada cavidad 100 µ? de HRP-PY54 o de anticuerpo anti-IGF-IR biotinilado en buffer de bloqueo e incubamos a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. Luego lavamos las placas cinco veces con buffer de lavado y desarrollamos las placas. Desarrollamos las placas examinadas con ???-??54 agregando 100 µ? por cavidad del sustrato de TMB para microcavidades e interrumpimos el desarrollo del color con el agregado de 100 µ? de H2SO4 0,9 M. Luego determinamos la señal cuantitativamente agitando durante 10 segundos y midiendo a la densidad óptica OD450mm-La señal fue normalizada para proteina total. Desarrollamos las placas examinadas con anticuerpo anti-IGF-IR agregando a cada cavidad 100 µ? de estreptavidina-HRP diluida en buffer de bloqueo, incubando a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos y continuando luego como P03/101-PFA descrito para HRP-PY54. Observamos que la inyección intraperitoneal de un anticuerpo de esta invención, particularmente 2.13.2 y 4.9.2, resultó en la inhibición de la actividad del IGF-IR de acuerdo con lo medido por una disminución de [ambas, la fosfotirosina del IGF-IR (IGF-IR fosforilado) y] la proteina total de IGF-IR (Figura 6) . Además, también observamos una disminución de la fosfotirosina del IGF-IR (IGF-IR fosforilado) (Figura 5) . Sin desear estar ligado a cualquier teoria, los niveles disminuidos de la fosfotirosina del IGF-IR pueden ser debidos a los niveles disminuidos de la proteina IGF—IR in vivo después del tratamiento con el anticuerpo o pueden ser debidos a una combinación de niveles disminuidos de proteina IGF-IR y una disminución de la fosforilación de la tirosina del IGF-IR presente, debido al bloqueo de la activación por el ligando (por ejemplo, IGF-I o IGF-II) . Además, esta inhibición respondió a la dosis del anticuerpo inyectado (Figura 6) . Estos -datos demuestran que los anticuerpos de la invención son capaces de dirigirse al IGF-IR como blanco in vivo de un modo análogo al observado in vítro. EJEMPLO IX: Inhibición del crecimiento (TGI) de tumores celulares 3T3/IGF-IR P03/101-PFA Ensayaiaos si los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención funcionarían para inhibir el crecimiento de tumores. Inducimos tumores según lo arriba descrito (Ejemplo VIII) y una vez establecidos tumores palpables (es decir, de 250 mm3, dentro de 6-9 días), tratamos los ratones con una sola dosis de 0,20 mi del anticuerpo por inyección intraperitoneal . Medimos el tamaño del tumor con calibres Vernier, midiendo cada tercer día la longitud de dos diámetros, y calculamos el volumen con la fórmula (longitud x [ancho]2)/2, usando métodos establecidos por Geran, et al., "Protocols for screening cheiuical agents and natural products against animal tumors and other biological systems." Cáncer Chemother. Rep. 3: 1-104. Al realizar este análisis con un anticuerpo de la invención, encontramos que un solo tratamiento con solamente el anticuerpo 2.13.2 inhibió el crecimiento de tumores inducidos por células NIH-3T3 transfectadas con IGF-IR (Figura 7, panel izquierdo) . Además, en estudios combinados con una sola dosis de 7,5 mg/Jg de adriamicina aplicada intravenosamente, observamos que la administración de una sola dosis de 2.13.2 aumentó la efectividad de la adriamicina, un inhibidor conocido del crecimiento tumoral . La combinación de adriamicina con un anticuerpo de la P03/101-PFA invención, 2.13.2, demostró un retardo del crecimiento de 7 días con respecto al tratamiento con solamente anticuerpo o adriamicina (Figura 7, panel derecho) . EJEMPLO X: Relación entre niveles del anticuerpo y disminución de la actividad de IGF-IR Se indujeron tumores en ratones desnudos según lo descrito en el Ejemplo VIII. Luego, los ratones fueron tratados con 125 µg de 2.13.2 por inyección intraperitoneal, según lo descrito en el Ejemplo VIII. Los tumores fueron extraídos y los niveles de IGF-IR se midieron con ELISA según lo descrito en el Ejemplo VIII. La Figura VIII muestra los niveles en suero del anticuerpo 2.13.2 y los niveles del receptor IGF-IR en función del tiempo. El experimento demuestra que la actividad del IGF-IR es disminuida por el anticuerpo y que el grado de inhibición de IGF-IR es proporcional a la concentración del anticuerpo en el suero. EJEMPLO XI : Inhibición del crecimiento de tumores 3T3/IGF-IR con dosificación múltiple de un anticuerpo en combinación con adriamicina Se indujeron tumores en ratones desnudos según lo descrito en el Ejemplo IX. Ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm3 fueron tratados los P03/101-PFA dias 1, 8, 15 y 22 con varias cantidades de anticuerpo 2.13.2 (i.p.) o con 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.), ya sea como agentes simples o en combinación, según lo descrito en el Ejemplo IX. La Figura 9 muestra el tamaño del tumor en relación con los varios tratamientos en función del tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR dado una vez cada siete días inhibe el crecimiento de células tumorales y aumenta la inhibición del crecimiento de células tumorales en combinación con adriamicina, un inhibidor tumoral conocido. EJEMPLO XII : Inhibición del crecimiento de tumores grandes Se indujeron tumores en ratones desnudos según lo descrito en el Ejemplo IX. Ratones con tumores subcutáneos grandes establecidos ligeramente menores de 2000 mm3 fueron tratados los días 1 y 8 con varias cantidades del anticuerpo 2.13.2 (i.p.) o con 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.), ya como agentes simples o en combinación, según lo descrito en el Ejemplo IX. La Figura X muestra el tamaño del tumor en relación con los varios tratamientos en función del tiempo. Los ensayos con los grupos animales de control, con solamente anticuerpo y con solamente adriamicina fueron terminados el día 5, cuando el tamaño del tumor excedió 2000 mm3. El experimento demuestra que el P03/101-PFA tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR en combinación con adriamicina es altamente eficaz contra tumores grandes cuando se dan dosis múltiples. EJEMPLO XIII: Inhibición del crecimiento de tumores de células colorectales . Se indujeron tumores en ratones desnudos según lo descrito en el Ejemplo IX, con excepción de usar células Coló 205 (ATCC CCL 222) . Las células Coló 205 son células del adenocarcinoma colorectal humano. Ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm3 fueron tratados con varias cantidades de anticuerpo 2.13.2 (i.p.) o con 100 mg/kg de 5-fluorodeoxiuridina (5-FU, i.v.), ya sea como agentes simples o en combinación, según lo descrito en el Ejemplo IX. La Figura 11 muestra el tamaño del tumor en relación con los varios tratamientos en función del tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR dado una vez inhibe el crecimiento de las células cancerosas colorectales humanas si es provisto como agente simple y aumenta la efectividad de 5-FU, un inhibidor tumoral conocido . Ratones con tumores Coló 205 establecidos fueron tratados los días 1, 8, 15 y 22 con 500 µg de 2.13.2 P03/I01-PFA (i.p.), 100 µg Kg de 5-FU (i.v.) o una combinación de los mismos. La Figura 12 muestra el tamaño del tumor en relación con los varios tratamientos en función del tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR dado una vez cada 7 días inhibe el crecimiento de células cancerosas coloréeteles humanas y aumenta la efectividad de 5-FU. EJEMPLO XIV: Inhibición del crecimiento de tumores de células de cáncer de mama A ratones desnudos como descritos en el Ejemplo VIII se implantaron pellas de estrogeno biodegradables (0,72 mg de 17-p-estradiol/pella, liberación 60 días; Innovative Research of America) . Después de 48 horas, se indujeron tumores en ratones desnudos esencialmente como descrito en el Ejemplo IX, con excepción de usar células MCF-7 (ATCC HTB-22). Células MCF-7 son células del carcinoma de mama humano estrógeno-dependientes . Ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm3 fueron tratados con 50 µg de anticuerpo 2.13.2 (i.p.) los días 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 y 22 (q3dx7) o con 6,25 mg/kg de taxol (i.p.) los días 1, 2, 3, 4, 5 (qldx5) , ya sea como agentes simples o en combinación, esencialmente como descrito en el Ejemplo IX. La Figura 13 muestra el tamaño del tumor en P03/101-PFA relación con los varios tratamientos en función del tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado solo inhibe el crecimiento de las células del cáncer de mama humano si es administrado . una vez cada tres dias y también aumenta la efectividad de taxol, un inhibidor de cáncer de mama conocido, al ser administrado en combinación. Ratones que tienen tumores establecidos de células MCF-7, según lo descrito inmediatamente arriba, fueron tratados el dia 1 con varias cantidades de anticuerpo 2.13.2 (i.p.), solo o con 3,75 mg/kg de adriamicina (i.v,), esencialmente como descrito en el Ejemplo IX. La Figura 14 muestra el tamaño del tumor en relación con los varios tratamientos en función del tiempo. El experimento demuestra que un solo tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado solo inhibe el crecimiento de las células del cáncer de mama humano y aumenta la efectividad de la adriamicina, un inhibidor tumoral conocido. Ratones que tienen tumores establecidos de células MCF-7, según lo descrito inmediatamente arriba, fueron tratados con 250 g de anticuerpo 2.13.2 (i.p.) los dias 1, 8, 15 y 23 o con una pella de tamoxifen biodegradable (25 mg/pella, base libre, liberación 60 dias, Innovative ¡f P03/10I-PFA Research of America) , ya sea como agentes simples o en combinación, esencialmente como descrito en el Ejemplo IX. La pella de tamoxifen fue implantada el día 1 después del establecimiento del tumor. La Figura 15 muestra el tamaño del tumor en relación con los varios tratamientos en función del tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado una vez cada siete dias inhibe el crecimiento del cáncer de mama humano al ser administrado solo y aumenta la efectividad de tamoxifen, un inhibidor tumoral conocido. EJEMPLO XVI: Inhibición del crecimiento de tumores de células de carcinoma epidermoide Se indujeron tumores en ratones desnudos esencialmente como descrito en el Ejemplo IX, excepto de que se usaron células A431 (ATCC CRL 1555) . Las células A431 son células del carcinoma epidermoide humano que sobrexpresan EGFR. Ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm3 fueron tratados los días 1, 8, 15, 22 y 29 con 500 µg de anticuerpo 2.13.2 (i.p.) o una vez por dia por 27 días con 10 mg/kg de CP-358.774 dados oralmente (p.o.) ya sea como agentes simples o en combinación, según lo descrito en el Ejemplo IX. La célula CP-358.774 está descrita en la Patente de los Estados P03/101-PFA ünidos 5.747.498 y en Moyer et al., Cáncer Research 57: 4838-4848 (1997), incorporados en ésta por referencia. La Figura 16 muestra el tamaño del tumor en relación con los varios tratamientos en función del tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR aumenta la efectividad de CP-358.774, un inhibidor conocido de la tirosinaquinasa del EGF-R, para inhibir el crecimiento de un tumor de carcinoma epidermoide humano. EJEMPLO XVII: Farmacocinética de anticuerpos anti-IGF-IR in vivo Para evaluar la farmacocinética de los anticuerpos anti-IGF-IR, a monos Cynomologus se inyectaron intravenosamente 3,30 o 100 mg/kg de anticuerpo 2.13.2 en buffer de acetato. Se recolectó suero de los monos en varios tiempos y se determinaron las concentraciones de anticuerpo anti-IGF-IR en los monos durante un periodo de hasta diez semanas. Para determinar cuantitativamente los niveles de anticuerpo funcional en suero, el dominio extracelular de IGF-IR humano (IGF-I-sR, R&D Systems, Catálogo #391 GR) fue ligado a placas de 96 cavidades. A las placas de ensayo se agregó suero de mono (diluido entre 1:100 y 1:15.000), de modo que cada muestra estarla comprendida dentro de la gama lineal de la curva estándar, P03/101-PFA y las placas se incubaron bajo condiciones en las cuales el anticuerpo anti-IGF-IR se liga a IGF-sR. Después de lavar las placas, se agregó a las mismas un anticuerpo anti - IgG humana marcado y se incubó bajo condiciones en las cuales el anticuerpo anti - IgG humana se ligaría al anticuerpo anti-IGF-IR. Luego, las placas fueron lavadas y desarrolladas y se usaron una curva de control estándar y ajustes de regresión lineal para la determinación cuantitativa de la cantidad de anticuerpos anti-IGF-IR. La Figura 17 muestra la concentración de 2.13.2 en suero en función del tiempo. El experimento demuestra que la vida media del anticuerpo anti-IGF-IR es de 4,6 a 7,7 días y que tiene una distribución de volumen de 74-105 mL/kg. Además, el experimento demuestra que las cantidades dadas son proporcionales a las dosis en el mono, lo que indica que el anticuerpo anti-IGF-IR tiene saturado cualquier sitio de ligadura a IGF-IR disponible en el cuerpo, aún a la dosis más baja de 3 mg/kg. EJEMPLO XVIII: La terapia de combinación con anticuerpo anti-IGF-IR y adriamicina disminuye la actividad de IGF-IR in vivo Se indujeron tumores en ratones desnudos según lo descrito en el Ejemplo IX. Ratones con tumores subcutáneos P03/101-PFA establecidos de aproximadamente 400 mía3 fueron tratados con una sola inyección de 250 ? de anticuerpo 2.12.2 (i.p.) o con 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.), ya sea como agentes simples o en combinación, según lo descrito en el Ejemplo IX. 72 horas después de la administración de los agentes los tumores fueron extraídos según lo descrito en el Ejemplo VIII, y cantidades iguales de los extractos de tumor fueron sometidas a análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilfosfato de sodio (SDS PAGE) y transferencia de Western, usando el anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 (Santa Cruz) . La Figura 18 muestra las cantidades de IGF-IR en células tumorales en animales de control (las primeras tres pistas de cada panel), en animales tratados solamente con anticuerpo (panel superior) , en animales tratados solamente con adriamicina (panel medio) y en animales tratados con anticuerpo y adriamicina (panel inferior) . Cada pista representa cantidades iguales de proteína de tumores individuales de ratones individuales. El experimento demuestra que el tratamiento con solamente adriamicina tiene poco efecto sobre los niveles de IGF-IR y que el tratamiento con solamente anticuerpo muestra alguna disminución de los niveles IGF-IR. Sorprendentemente, el tratamiento conjunto con adriamicina y anticuerpo muestra P03/10I-PFA una disminución dramática de los niveles de IGF-IR, demostrando que la adriamicina y el anticuerpo conjuntamente disminuyen grandemente los niveles de IGF-IR.
Todas las publicaciones y Solicitudes de Patentes citadas en esta memoria descriptiva son incorporadas en ésta por referencia como si hubiese sido indicado específicamente e individualmente para cada publicación o Solicitud de Patente individual que debe ser incorporada en ésta por referencia. Si bien la invención precedente ha sido descrita con ciertos detalles a modo de ilustración y con Ejemplos con el propósito de claridad de entendimiento, será fácilmente aparente a los entendidos en el arte, a la luz de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden ser efectuados en la misma sin apartarse del espíritu o el alcance de las reivindicaciones anexas.
P03/101-PFA

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal humanizado, quimérico o humano o una porción que liga antígeno del mismo, caracterizado porque se liga especificamente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-IR) . 2. El anticuerpo o una porción del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el IGF-IR es humano . 3. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo o una porción del mismo tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo formado por a) no liga IGF-IR de ratón, rata, perro o conejo; b) se liga al IGF-IR de Cynomologus o rhesus, pero no a IGF-IR de marmoset; c) inhibe la ligadura de IGF-I o IGF-II a IGF-IR; d) tiene una selectividad para IGF-IR que es al menos 50 veces mayor que su selectividad para el receptor de insulina; e) inhibe el crecimiento tumoral in vivo; f) causa la desaparición de IGF-IR de la superficie celular al ser incubado con una célula que expresa IGF-IR; P03/101-PFA g) inhibe la fosforilación de tirosina inducida por IGF-IR; h) se liga a IGF-IR con una KQ de 8 x 1CT9 m o menor; e i) tiene un grado de disociación para IGF-IR Koff de 10-4 o menor. 4. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo o una porción del mismo tiene todas las propiedades mencionadas. 5. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracteri ado porque el anticuerpo o una porción del mismo tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo formado por: a) compite en forma cruzada por la ligadura a IGF-IR con un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; b) se liga al mismo epitope de IGF-IR como un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; c) se liga al mismo antigeno al que se liga el anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; P03/101-PFA d) se liga a IGF-IR con sustancialmente la misma KD como un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; y e) se liga a IGF-IR con sustancialmente el mismo grado de disociación como un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3. 6. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo o una porción del mismo comprende todas las propiedades mencionadas. . El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 6, caracterizado porque dicho anticuerpo o una porción del mismo inhibe la ligadura entre IGF-IR e IGF-I o IGF-II con una IC50 menor de 100 mM. 8. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 7, caracterizado porque dicho anticuerpo, o una porción que liga antigeno del mismo comprende una región variable de una cadena liviana ? comprendiendo la secuencia de dicha región variable de dicha cadena liviana ? no más de diez cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por una linea germinal del gen VKA30, A27 u P03/101-PFA 012. 9. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de la cadena liviana ? comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22, o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a dichas secuencias. 10. El anticuerpo o una porción que liga antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque dicho anticuerpo o una porción que liga antígeno del mismo comprende una región variable de una cadena pesada, comprendiendo la secuencia de dicha región variable no más de 8 cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por un gen de la línea germinal VH DP47, DP35, DP71 o VIV-4. 11. El anticuerpo o una porción que liga antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: P03/101-PFA 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a dichas secuencias. 12. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 11, caracterizado porque dicho anticuerpo es a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) , IgM, IgE, IgA o IgD, o es derivado de la misma; o b) un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecifico. 13. El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 12, caracterizado porque el anticuerpo o una porción del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de al menos una región CDR de una región variable, siendo seleccionada dicha región variable del grupo formado por: a) una región variable de la cadena liviana de un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; b) una región variable de una cadena liviana que P03/101-PFA comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22, o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a dichas secuencias; c) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; y d) una región variable de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 24 o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a dichas secuencias . 1 . El anticuerpo o una porción que liga antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo o una porción del mismo comprende todas las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR de una región variable, siendo seleccionada dicha región variable del grupo formado por: a) una región variable de la cadena liviana de un P03/101 -PFA anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; b) una región variable de una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22, o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a dichas secuencias . c) una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; d) una región variable de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a dichas secuencias; y e) las regiones variables de la cadena liviana y de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3. 15. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, P03/101-PFA caracterizado porque el anticuerpo es seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3. 16. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, caracteri ado porque dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, siendo seleccionadas las secuencias de aminoácidos de la cadena liviana y de la cadena pesada del grupo formado por a) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana de 2.12,1; b) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana de 2.13.2; c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; d) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. 17. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDRs de los anticuerpos 2.12.1 o 2.13.2 o las CDRs de dichos anticuerpos que tienen no más de cinco cambios con aminoácidos conservativos . 18. Una composición farmacéutica, caracterizada por P03/10J-PFA comprender el anticuerpo o una porción del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y un excipiente f rmacéuticamente aceptable. 19. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada por comprender además un agente antineoplástico, quimioterapéutico o anti-tumoral . 20. Un proceso para hacer un anticuerpo que se liga a IGF-IR, caracterizado por comprender las etapas de: a) inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende IGF-IR, siendo el mamífero capaz de expresar anticuerpos humanos en células B del animal; b) aislar células B del mamífero; c) rastrear dichas células B, o líneas celulares derivadas de las mismas, para identificar una línea celular que produce anticuerpos que se ligan con IGF-IR; d) cultivar la línea celular que expresa anticuerpos que se ligan a IGF-IR; y e) aislar anticuerpos que se ligan al IGF-IR de la línea celular. 21. Una línea celular aislada, caracterizada porque produce el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17. 22. La línea celular de acuerdo con la reivindicación P03/101-PFA 20, caracterizada porque produce un anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3, o un anticuerpo que tiene las mismas secuencias de aminoácidos de dichos anticuerpos . 23. Un método para diagnosticar la presencia o ubicación de un tumor que expresa IGF-IR en un sujeto que necesita tal diagnóstico, estando el método caracterizado por comprender las etapas de: a) inyectar el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en el sujeto; b) determinar la expresión de IGF-IR en el sujeto por la localización del sitio en el cual se ha ligado el anticuerpo; c) comparar la expresión determinada en la parte (b) con la expresión de un sujeto de referencia normal o un estándar, y d) diagnosticar la presencia o ubicación del tumor. 24. Un método para tratar cáncer en un humano, caracterizado porque comprende tratar el cáncer con un anticuerpo o una porción que se liga a antigeno del mismo que se liga específicamente al IGF-IR, comprendiendo el método la etapa de administrar al humano una cantidad del anticuerpo efectiva para tratar dicho cáncer. P03/101-PFA 25. Un método para tratar un paciente que necesita tal tratamiento, caracterizado porque comprende tratar con el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o una porción que liga antigeno del mismo, comprendiendo el método la etapa de administrar al paciente una cantidad efectiva del anticuerpo. 26. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25, caracterizado por comprender además la etapa de administrar un agente anti-neoplástico, anti-tumoral, anti-angiogénico o quimioterapéutico . 27. Una ¦ molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada por comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada, o una porción que liga antigeno de las mismas, o una cadena liviana, o una porción que liga antigeno de la misma, de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17. 28. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo formado por: a) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una región CDR de la cadena pesada del anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, P03/I01-PFA 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; b) una secuencia de ácido nucleico que codifica las tres regiones CDR de -la cadena pesada del anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3/ c) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, o la porción que liga antigeno de la misma, del anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; d) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una secuencia CDR de la cadena liviana del anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; e) una secuencia de ácido nucleico que codifica las tres secuencias CDR de la cadena pesada del anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; f) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana, o la porción que liga antigeno de la misma, del anticuerpo seleccionado del grupo formado por 2.12.1, 2,13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3; P03/101-PFA g) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22/ y ) una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 21, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO : 26. 29. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 o 28, comprendiendo el vector opcionalmente una secuencia de control de expresión enlazada operativamente con la molécula de ácido nucleico. 30. Una célula hospedante, caracterizada por comprender el vector de acuerdo con la reivindicación 29, o la molécula de ácido nuclecio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 o 28. 31. Un método para hacer un anticuerpo anti-IGF-IR o una porción que liga antigeno del mismo, caracterizado por comprender cultivar la célula .hospedante de acuerdo con la reivindicación 30 o la. linea celular de acuerdo con la reivindicación 21 bajo condiciones adecuadas y recuperar P03/101-PFA dicho anticuerpo o porción que liga antigeno. 32. Un animal transgénico no humano, caracterizado por comprender el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 o 28 expresando el animal transgénico no humano dicho ácido nucleico. 33. Un método para tratar un sujeto que necesita tal tratamiento, caracterizado porque el tratamiento es con un anticuerpo o una porción que liga antígeno del mismo que se liga específicamente a IGF-IR, comprendiendo el método las etapas de a) administrar una cantidad efectiva de una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o la porción que liga antigeno de la misma, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la cadena liviana o la porción que liga antigeno de la misma, o ambas, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana y la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o las porciones que ligan a antígeno de las mismas; y b) expresar la molécula de ácido nucleico. P03/101-PFA
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