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TW201605896A - Gitr抗原結合蛋白 - Google Patents

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TW201605896A
TW201605896A TW103129286A TW103129286A TW201605896A TW 201605896 A TW201605896 A TW 201605896A TW 103129286 A TW103129286 A TW 103129286A TW 103129286 A TW103129286 A TW 103129286A TW 201605896 A TW201605896 A TW 201605896A
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seq
antigen binding
binding protein
chain variable
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TW103129286A
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科特尼 比爾斯
傑森 Ｃ 歐尼爾
伊恩 福爾茲
藍道 Ｒ 凱臣
茱莉亞 Ｃ 皮亞塞茨基
Original Assignee
安美基股份有限公司
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Abstract

提供一種活化GITR的抗原結合蛋白。亦提供編碼抗原結合蛋白的核酸和含有這些核酸的載體以及細胞。抗原結合蛋白在治療方法中具有價值，在該方法中，其是有用於刺激GITR訊息，因此誘導或增進主體內的免疫反應。因此，該抗原結合蛋白具有在各種免疫療法治療內的效用，包含各種癌症和感染的治療。

Description

GITR抗原結合蛋白 相關申請案之交互參照
本申請案主張於2013年8月30日申請之美國專利申請案號61/872,125，以及2014年7月30日申請之美國專利申請案號62/031,036之效益，其兩者在各方面之全部內容皆透過引用而併入本文。
本發明係關於一種抗原結合蛋白，特別係關於一種活化GITR的抗原結合蛋白、編碼抗原結合蛋白的核酸、含有這些核酸的載體以及細胞及利用該抗原結合蛋白的治療方法。
醣皮質素誘導TNFR相關基因(Glucocorticoid-induced TNFR-related gene，GITR：TNFRSF18)，有時也被稱為活化誘導TNFR家族成員(Activation-Inducible TNFR family member，AITR)，是屬於TNF受體超家族(TNF receptor superfamily，TNFRSF)的一種受體。其被該同族配體，GITR配體(GITRL，TNFSF18)活化。GITR是含有富含半胱胺酸細胞外區域(extracellular domain)的I型跨膜蛋白，其中富含半胱胺酸細胞外區域是TNFR家族成員的特徵。GITR的細胞質區域，例如，與某些其他TNFR家族成員，像是4-1BB及CD27共用密切的同源性(Nocentini，等人，1997年，美國國家科學院論文集(Proc.Natl.Acad.Sci.)，94：6216-6221))。
人類GITR在響應者的靜息T細胞內表現低量，而CD4+細胞相對於CD8+細胞展現了增加的表現。T細胞活化後GITR表現顯著地上調幾天。GITR於調控T細胞(regulatory T cells，Tregs)內是以高量組成性地表現，像是CD4+CD25+或CD8+CD25+細胞，且當這些細胞被活化的時候(Nocentini與Riccardi，2005年，歐洲免疫學期刊(E.J.Immunol)，35：1016-1022)，進一步地上調。GITR表現不僅僅限制在T細胞內。然而，也已經有報導指出GITR表現在自然殺手細胞、巨噬細胞、B細胞、樹突細胞(dendritic cell)、肥大細胞(mast cell)及單核球(Nocentini與Riccardi，2005年，歐洲免疫學期刊，35：1016-1022)。
GITRL是II型跨膜蛋白，且其對大部分的TNF配體家族成員而言是典型的。近來研究指明人類GITRL典型地存在作為三聚體，雖然其也可表示為單體或集合成其他多聚體形式(Chattopadhyay，等人，2007年，美國國家科學院論文集，104：19452-19457；Zhou，等人，2008年，美國國家科學院論文集，105：635-640)。有一些證據顯示也可產生GITRL的可溶性形式(Baltz，等人，2008年，血液期刊(Blood)，112：3735-3743；Mahesh，等人，2006年，歐洲免疫學期刊，36：2128-2138)。GITRL主要表現在抗原呈現細胞(antigen presenting cell，APC)，包括可用作為APC的巨噬細胞、B細胞、樹突細胞以及內皮細胞(endothelial cell)(Nocentini與Riccardi，2005年，歐洲免疫學期刊，35：1016-1022；Agostini，等人，2005年，感染與免疫期刊(Infect.Immun.)，73：7502-7508；以及Nocentini，等人，2007年，歐洲免疫學期刊，37：1165-1169)。
結合在APC上的GITRL與響應者T細胞上的GITR，觸發GITR發訊號，其共同刺激響應者T細胞且壓制Treg細胞的抑制活性。GITR發訊號用作為對CD4+與CD8+處女T細胞(naïve T cell)兩者的共活化訊息，因而誘導或增進增生和作用功能，特別是當T細胞受體(T cell receptor，TCR)刺激是次優的時候(Schaer，等人，2012年，免疫學當前觀點(Curr.Opin.Immunol)，24：217-224)。更特定地， GITR在作用T細胞以及調控T細胞上可具有多種效用，包括：作用T細胞的共刺激和活化，使其更耐抑制、壓抑調控T細胞、藉由循環內的調控T細胞和調控T細胞的部分缺失來減少作用T細胞對抑制的敏感性(Nocentini，等人，2007年，歐洲免疫學期刊，37：1165-1169)。
總結來說，前面的活性，特別是響應者T細胞的共刺激與調控T細胞的抑制因子活性的終止，表示GITR活性導致增強的免疫反應。這樣的活性具有潛力以恢復對感染及對腫瘤的免疫反應。因此，能夠活化GITR的分子在想要觸發增強的免疫反應的設定中將具有作為免疫刺激劑的價值。
結合GITR，像是人類GITR，的抗原結合蛋白被描述於此。抗原結合蛋白可為抗體或其片段或可為一個或多個互補性決定區被嵌入或被插入在其中之其他分子支架的類型，前提是分子具有結合像是人類GITR之GITR的能力。抗原結合蛋白為GITR的促效劑且如此能誘導或增進GITR訊號傳遞。GITR在免疫反應的刺激中扮演特定的角色，抗原結合蛋白具有治療多種GITR相關的疾病或病症的效用，在該疾病或病症中期望增加免疫反應。舉例來說，抗原結合蛋白可被使用在多種免疫治療應用裡，像是多種癌症或感染的治療。
在實施例1裡，抗原結合蛋白被提供包含(a)分別為重鏈可變域(heavy chain variable domain，VH)和輕鏈可變域(light chain variable domain，VL)的CDRH3及CDRL3，其中重鏈可變域與該輕鏈可變域係為選自囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59之任一個的相同抗原結合蛋白的一部分；(b)含有CDRH1、CDRH2以及CDRH3的變異型(variant)重鏈可變域，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3的一或多個，相對於選自囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗原結合蛋白之重鏈可變域的相應CDRH1、CDRH2以及CDRH3而言，在 序列上相異，然而，其前提是相對於重鏈可變域序列的相應互補性決定區(CDRs)而言，變異型重鏈可變域的CDRH1、CDRH2以及CDRH3內的序列差異集體總和不超過1、2、3、4或5個胺基酸；(c)含有CDRL1、CDRL2以及CDRL3的變異型輕鏈可變域，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3的一或多個，相對於選自囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗原結合蛋白之輕鏈可變域的相應CDRL1、CDRL2以及CDRL3而言，在序列上相異，然而，其前提是相對於輕鏈可變域序列的相應互補性決定區(CDRs)，變異型輕鏈可變域的CDRL1、CDRL2以及CDRL3內的序列差異集體總和不超過1、2、3、4或5個胺基酸；(d)(b)的變異型重鏈可變域以及(c)的變異型輕鏈可變域，前提是變異型重鏈可變域以及變異型輕鏈可變域，分別為相同抗原結合蛋白的重鏈可變域及輕鏈可變域的變異型；(e)含有CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重鏈可變域，其中CDRH1包含序列X1YGMX2(SEQ ID NO：436)，其中X1是S或N；且X2是H或Y；CDRH2包含序列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(SEQ ID NO：437)，其中X1是E、V、A、P；且X2是K或R；CDRH3包含序列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(SEQ ID NO：438)，其中X1是Q、L、E或R；X2是G、R、或S；X3是K、Y、L、F、或R；以及X4是Y或D；且X5是Y或S；(f)含有CDRL1、CDRL2以及CDRL3的輕鏈可變域，其中CDRL1包含序列RASQX1IRNDLG(SEQ ID NO：439)，其中X1是G或V；CDRL2包含序列X1X2SX3LQS(SEQ ID NO：440)，其中X1是A或D；X2是A或T；且X3是S或T； CDRL3包含序列X1QX2X3X4YPX5T(SEQ ID NO：441)，其中X1是L或Q；X2是H或L；X3是N或H；X4是S、N或T，且X5是W、L或I；(g)(e)的重鏈可變域和(f)的輕鏈可變域；(h)CDRH1、CDRH2以及CDRH3，各來自囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的相同重鏈可變域；(i)CDRL1、CDRL2以及CDRL3，各來自囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的相同輕鏈可變域；(j)(h)的CDRH1、CDRH2以及CDRH3以及(i)的CDRL1、CDRL2以及CDRL3，其中重鏈可變域與輕鏈可變域是來自相同的抗原結合蛋白；(k)重鏈可變域，其係為至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的胺基酸序列相同於囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的重鏈可變域序列；(l)輕鏈可變域，其係為至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的胺基酸序列相同於囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的輕鏈可變域序列；(m)(k)的重鏈可變域及(l)的輕鏈可變域，其中重鏈可變域及輕鏈可變域是來自相同的抗原結合蛋白；(n)含有囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任何一個的重鏈可變域的胺基酸序列的重鏈可變域；(o)含有囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任何一個的輕鏈可變域的胺基酸序列的輕鏈可變域；(p)(n)的重鏈可變域以及(o)的輕鏈可變域，其中重鏈可變域以及輕鏈可變域是來自相同的抗原結合蛋白；(q)至少90%、95%、97%或99%胺基酸序列相同於囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任何一個的全長重鏈序列的全長重鏈(heavy chain，HC)；(r)至少90%、95%、97%或99%胺基酸序列相同於囊括抗原結合蛋白Ab1 至Ab59的任何一個的全長輕鏈序列的全長輕鏈(light chain，LC)；(s)(q)的全長重鏈以及(r)的全長輕鏈，其中全長重鏈和全長輕鏈是來自於相同的抗原結合蛋白；(t)全長重鏈，其包含囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的全長重鏈的胺基酸序列；(u)全長輕鏈，其包含囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的全長輕鏈的胺基酸序列；或者(v)(t)的全長重鏈和(u)的全長輕鏈，其中全長重鏈以及全長輕鏈是來自於相同的抗原結合蛋白。
在實施例2裡，抗原結合蛋白包含CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3，且其中CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3的一個或更多，相對於選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的相應CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3，在序列上相異，然而，前提是在互補性決定區內的序列差異集體總和不超過1、2、3、4或5個胺基酸。
在實施例3裡，抗原結合蛋白包含CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3，且其中：(a)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：11、CDRL3包含SEQ ID NO：19、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：36以及CDRH3包含SEQ ID NO：47；(b)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：18、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：40以及CDRH3包含SEQ ID NO：52；(c)CDRL1包含SEQ ID NO：10、CDRL2包含SEQ ID NO：17、CDRL3包含SEQ ID NO：28、CDRH1包含SEQ ID NO：35、CDRH2包含SEQ ID NO：45以及CDRH3包含SEQ ID NO：62；(d)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：29、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：37以及CDRH3包含SEQ ID NO：58；(e)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：14、CDRL3包含SEQ ID NO：30、CDRH1包含SEQ ID NO：3、CDRH2包含SEQ ID NO：36以及CDRH3包含SEQ ID NO：63；(f)CDRL1包含SEQ ID NO：10、CDRL2包含SEQ ID NO：17、CDRL3包含SEQ ID NO：28、CDRH1包含SEQ ID NO：35、CDRH2包含SEQ ID NO：45以及CDRH3包含SEQ ID NO：76；(g)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：29、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：37以及CDRH3包含SEQ ID NO：58；(h)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：14、CDRL3包含SEQ ID NO：30、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：71以及CDRH3包含SEQ ID NO：63；(i)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：11、CDRL3包含SEQ ID NO：19、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：71以及CDRH3包含SEQ ID NO：47；或是(j)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：18、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：73以及CDRH3包含SEQ ID NO：52。
在實施例4裡，抗原結合蛋白包含輕鏈可變域與重鏈可變域，且其中：(a)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：119，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：138；(b)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：124，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：143；(c)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：134，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：153；(d)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：135，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：154；(e)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：136，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：155；(f)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：242，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：282；(g)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：255，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：295；(h)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於 SEQ ID NO：262，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：302；(i)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：267，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：307；(j)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：272，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：312。
在實施例5裡，抗原結合蛋白包括輕鏈可變域和重鏈可變域，且其中：(a)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：119且重鏈可變域包含SEQ ID NO：138；(b)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：124且重鏈可變域包含SEQ ID NO：143；(c)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：134且重鏈可變域包含SEQ ID NO：153；(d)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：135且重鏈可變域包含SEQ ID NO：154；(e)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：136且重鏈可變域包含SEQ ID NO：155；(f)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：242且重鏈可變域包含SEQ ID NO：282；(g)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：255且重鏈可變域包含SEQ ID NO：295；(h)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：262且重鏈可變域包含SEQ ID NO：302；(i)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：267且重鏈可變域包含SEQ ID NO：307；(j)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：272且重鏈可變域包含SEQ ID NO：312。
在實施例6裡，抗原結合蛋白包含輕鏈和重鏈，且其中：(a)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：317且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：336；(b)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：322 且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：341；(c)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：332且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：351；(d)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：333且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：352；(e)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：334且該重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：353；(f)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：360且該重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：400；(g)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：373且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：413；(h)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：380且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：420；(i)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：385且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：425；(j)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：390且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：430。
在實施例7裡，抗原結合蛋白包含輕鏈和重鏈，且其中：(a)輕鏈包含SEQ ID NO：317且重鏈包含SEQ ID NO：336；(b)輕鏈包含SEQ ID NO：322且重鏈包含SEQ ID NO：341；(c)輕鏈包含SEQ ID NO：332且重鏈包含SEQ ID NO：351；(d)輕鏈包含SEQ ID NO：333且重鏈包含SEQ ID NO：352；(e)輕鏈包含SEQ ID NO：334且重鏈包含SEQ ID NO：353；(f)輕鏈包含SEQ ID NO：360且重鏈包含SEQ ID NO：400； (g)輕鏈包含SEQ ID NO：373且重鏈包含SEQ ID NO：413；(h)輕鏈包含SEQ ID NO：380且重鏈包含SEQ ID NO：420；(i)輕鏈包含SEQ ID NO：385且重鏈包含SEQ ID NO：425；(j)輕鏈包含SEQ ID NO：390且重鏈包含SEQ ID NO：430。
在實施例8裡，抗原結合蛋白競爭與參考抗原結合蛋白對人類GITR之結合，其中參考抗原結合蛋白是如第五個實施例描述的抗原結合蛋白。
在實施例9裡，第八個實施例的抗原結合蛋白以及參考抗體交互競爭對人類GITR之結合。
在實施例10裡，實施例1至9中之任一個的抗原結合蛋白具有下列特徵的一個或多個：(a)為單株抗體；(b)為人類抗體、人源化抗體、或嵌合抗體；(c)為多特異性抗體；(d)為IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4類型的；(e)為抗原結合抗體片段；(f)為Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、或Fv片段；(g)為雙體、單鏈抗體、域抗體、或奈米抗體；(h)是被標記的。
在實施例11裡，實施例1至10中之任一個的抗原結合蛋白是全人抗體。
在實施例12裡，實施例1至11中之任一個的抗原結合蛋白促效人類GITR的活性。
在實施例13裡，實施例1至12中之任一個的抗原結合蛋白具有下列活性的一個或多個：(a)與GITRL交互競爭對GITR的結合；(b)可被內化進入人類CD4細胞；(c)禁止調控T細胞的抑制；(d)降低循環調控T細胞；(e)活化作用T細胞；(f)在人類血清裡具有至少6、7、9或12天的半衰期。
在實施例14裡，實施例1至13中之任一個的抗原結合蛋白是全人IgG1抗體。
在實施例15裡，實施例1至14中之任一個的抗原結合蛋白能夠結合Fcγ受體(Fc gamma receptor，FcγR)。
在實施例16裡，實施例1至15中之任一個的抗原結合蛋白能夠結合Fcγ受體(FcγR)，從而形成抗體結合蛋白的叢簇。
在實施例17裡，實施例1至16中之任一個的抗原結合蛋白結合人類GITR(例如，SEQ ID NO：1)。
在實施例18裡，實施例1至17中之任一個的抗原結合蛋白具有下列特徵的一個或多個：(a)以小於10nM的KD結合至SEQ ID NO：1的人類GITR多肽；(b)以小於500nM的KD結合至SEQ ID NO：2的食蟹獼猴GITR多肽。
在實施例19裡，實施例1至18中之任一個的抗原結合蛋白是促效人類GITR的IgG1類型的全人單株抗體。
在實施例20裡，實施例1至19中之任一個的抗原結合蛋白以KD 10nM結合SEQ ID NO：1的人類GITR以及以KD 500nM結合SEQ ID NO：2的食蟹獼猴GITR。
在實施例21裡，實施例1至20中之任一個的抗原結合蛋白是醣苷化的(glycosylated)。
在實施例22裡，一種核酸被提供，其編碼：(a)實施例1至20中之任一個的抗原結合蛋白的輕鏈可變域、重鏈可變域或兩者；或是(b)實施例1至20中之任一個的抗原結合蛋白的輕鏈或重鏈或兩者。
在實施例23裡，核酸包含：(a)如闡述於選自囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗體之輕鏈可變域核苷酸序列及/或重鏈可變域核苷酸序列；(b)如闡述選自囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗體之輕鏈核苷酸序列及/或重鏈核苷酸序列。
在實施例24裡，一種包含實施例22或23之核酸的媒介體被提供。
在實施例25裡，一種細胞被提供，其包含實施例22或23之核酸或實施例24之媒介體。
在實施例26裡，一種製造實施例1至21中之任一個的抗原結合蛋白的方法，其中該方法包含培養實施例25之細胞在允許抗原結合蛋白的表現之條件下，以及選擇性地從培養基分離抗原結合蛋白。
在實施例27裡，包含根據實施例1至21中之任一個的至少一個抗原結合蛋白以及藥學上可接受載體或稀釋劑的一種藥學組成物被提供。
在實施例28裡，實施例27的的藥學組成物實施例，進一步包含由免疫反應促進劑、抗血管生成劑、以及化學治療劑組成的群體中挑選的添加活性成分。
在實施例29裡，實施例1至21中之任一個的抗原結合蛋白或是實施例27或28的藥學組成物被用於治療。
在實施例30裡，實施例1至21中之任一個的抗原結合蛋白，或是實施例27或28的藥學組成物是被用於在主體內誘導或增進免疫反應的方法，該方法包含施以抗原結合蛋白至主體。
在實施例31裡，於主體內誘導或增進免疫反應的方法被提供，該方法包含施以主體對誘導或增進免疫反應有效的數量之實施例1至21中之任一個的抗原結合蛋白或是實施例27或28的藥學組成物。
在實施例32裡，實施例31的方法涉及產生針對腫瘤抗原的免疫反應。
在實施例33裡，實施例31的方法涉及產生針對傳染媒介物的免疫反應。
在實施例34裡，實施例31至33中之任一個的方法涉及將抗原結合蛋白以足以在主體內達成下列一個或多個的數量施以：(a)降低調控T細胞對作用T細胞的活性的抑制；(b)減少循環調控T細胞的量；(c)作用T細胞的活化；(d)誘導或增進作用T細胞增殖；(e)抑制腫瘤生長；以及(f)誘導腫瘤退化。
在實施例35裡，在具有癌症的主體內治療癌症的方法被提供，在其中該方法包含施以該主體的有效量之實施例1至21中之任一個的抗原結合蛋白或是實施例27或28的藥學組成物。
在實施例36裡，實施例35的方法是治療實體癌症。
在實施例37裡，實施例35的方法是治療血液的癌症。
在實施例38裡，實施例35的方法是治療黑色素癌、肺癌、頭頸部癌、腎細胞癌、或直腸癌。
在實施例39裡，在具有癌症的主體內抑制轉移癌的方法被提供，該方法包含施以主體有效量的實施例1至21中之任一個的抗原結合蛋白或是實施例27或28之藥學組成物該。
在實施例40裡，實施例31至39中之任一個的方法進一步包括下列一個或多個：(a)施以化學療法；(b)施以放射治療；(c)施以一或多個其他的治療劑。
在實施例41裡，方法係如於實施例40之描述且其他的治療劑是免疫刺激劑。
在實施例42裡，方法係如於實施例41之描述且免疫刺激劑是從由T-VEC、PD1拮抗劑、PDL1拮抗劑、CTLA-4拮抗劑以及BiTE所組成的群體中挑選。
在實施例43裡，方法係如於實施例40之描述，且化學療法、放射治療、或治療劑係在抗原結合蛋白之前、同時或之後施予。
在實施例44裡，用於治療具有感染的主體的方法被提供，該方法包含施以對治療感染有效之量之實施例1至21中之任一之抗原結合蛋白，或是實 施例27或28的藥學組成物。
第1A圖至第1D圖為結合圖表，其共同演示像是本文所提供的GITR抗體與人類-GITRL為了結合至兩個不同T細胞(名為CD4+CD25+T細胞以及CD8+CD25+ T細胞)的亞族群的交互競爭。具體而言，總結於第1A圖和第2B圖的結果顯示像是本文所提供的GITR抗體阻斷GITRL結合至這兩個T細胞的亞組群。在這個實驗的部分，適當地活化的T細胞族群與多種莫耳濃度變化的GITR抗體(9H6、5H7、41G5)一起培養10分鐘，在其後添加4mM His-標籤人類GITRL且於4℃再培養該混合物30分鐘。細胞接著被洗滌且隨後與螢光地標籤之抗-His抗體一起培養以偵測結合的GITRL。以流動式細胞測量術測定結合的GITRL的MFI(平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity)。第1A圖和第1B圖是MFI的圖式，其為針對兩個不同的細胞族群之GITR抗體：GITRL莫耳濃度比值的函數。第1C圖和第1D圖是顯示逆向實驗結果的圖表，並演示GITRL可阻斷抗-GITR抗體對該兩個T細胞亞族群的結合。在這些測試中，GITRL，而非GITR抗體的不同濃度，是首先與適當活化的T細胞族群一起培養。隨後添加GITR抗體(4mM 9H6、5H7、41G5)且結果混合物於4℃培養30分鐘。結合的GITR抗體藉由與螢光標記的抗-人類Fc一起培養而被偵測。結合藉由流動式細胞測量術分析來測定。第1C圖和第1D圖為MFI的圖表，其為針對兩個不同的細胞族群之GITRL：GITR抗體莫耳濃度比值的函數。
第2圖是說明諸如本文提供的GITR抗體可減少調控T細胞(Tregs)對作用T細胞的抑制。在實驗中，Tregs細胞和T響應者與同等數目的T細胞活化珠子，且與以個別GITR抗體塗層的不同濃度的珠子一起培養5天。細胞以3H的1 uCi在培養的最後16小時脈衝激發，收成且判定計數。圖表是GITR抗體塗層珠子：細胞比值的函數的計數數量。
第3圖總結測定諸如本文提供的幾個GITR抗體(9H6v3、5H7v2以及41G5v2)造成在人源化NSG小鼠模型(無患有腫瘤)中循環調控T細胞的數目下降之的實驗結果。在這個實驗中，藉由轉植CD34+胎肝細胞進入小鼠內來誘導NSG小鼠產生人類CD4+和CD8+作用T細胞以及調控T細胞。單一腹膜內劑量的25mg/kg GITR抗體被注射進小鼠且以流動式細胞測量術來測定表現調控T細胞標記物FoxP3的循環人類CD4+ T細胞的百分比。
第4A圖和第4B圖為顯示可造成如本文所提供的GITR抗體的叢簇之兩個不同形式的Fc gamma受體(FcγR)的圖。在第4A圖內的結果演示在增殖測定中，FcγRIIa可叢簇代表性的GITR抗體(5H7、9H6、7A10以及41G5)以活化初級人類T細胞。第4B圖顯示FcγRIIIa具有相似的叢簇活性。在每個實驗中，加入不同濃度的GITR抗體或人類IgG1同型控制組至初級人類CD4+ T細胞和改造的293T細胞的共培養基中以表現Fcγ受體中的一個。添加少量CD3塗層的珠子以提供次適的TCR刺激。細胞被培養96小時且以1uCi 3H於培養的最後18小時脈衝激發以測定被抗體誘導的細胞增殖的數量。圖式為三孔盤的抗體濃度和表現平均±StDev的函數的3H計數圖表，且是來自5個人類捐贈者的5個實驗的代表。
第5A圖至第5D圖總結來自演示像是本文所揭露的一些GITR抗體差別結合至4個不同的人類T細胞的亞族群的實驗結果。特別是，結果顯示本文描述的三個抗體(5H7、9H6以及41G5)，(1)結合CD4+CD25+ T細胞但不結合CD4+CD25- T細胞(第5A圖和第5B圖)，以及(2)結合CD8+CD25+ T細胞但不結合CD8+CD25-T細胞(第5C圖和第5D圖)。這些結果與那些從另一個已知GITR抗體，其(1)也結合至CD4+CD25+ T細胞但不結合CD4+CD25-T細胞，但(2)不像5H7、9H6和41G5，結合CD8+CD25+ T細胞和CD8+CD25- T細胞兩者所獲得的 結果相比較。在每個圖中，平均螢光強度(MFI)相對於抗體濃度(nM)作圖。實驗的細節被提供在實例12。
第6圖提供來自除了實驗是以GITRL而非GITR抗體來執行以外，與第5A圖至第5D圖相關的描述相似的實驗的結果的圖表。結果顯示，GITRL，像抗體5H7、9H6以及41G5，(1)結合CD4+CD25+ T細胞但不結合CD4+CD25- T細胞，且(2)結合CD8+CD25+T細胞但不結合CD8+CD25-T細胞。如此，觀察到之與5H7、9H6和41G5的結合的選擇性是相似於觀察到的與天然配體的結合的選擇性。
第7圖是顯示如本文所提供的抗體(9H6、5H7以及41G5)被內化進入初級人類CD4+細胞的圖式。相比之下，另一個已知的抗體顯示明顯較低的內化。在該實驗中，CD4+細胞被放置入孔盤中並接著於Alexa-488或Alexa-647標記的抗體培養30分鐘。洗滌之後，細胞在37℃，5% CO2中培養各種時間週期，在其之後，收集細胞並將細胞均等地分開成兩個孔盤。一個孔盤以含有0.2M醋酸的溶液培養，然而細胞的其他孔盤在完全培養基中培養。在培養之後，洗滌細胞且接著以抗-人類CD25 APC或抗-人類CD25 PE中之其一在染色緩衝液中染色30分鐘。洗滌細胞，將細胞以2%聚甲醛(paraformaldehyde)固定且接著以流動式細胞測量術來分析。
第8A圖和第8B圖提供如本文提供的親代抗體的輕鏈(VL)的可變域的胺基酸序列的比對。其顯示CDRs(CDR1、CDR2與CDR3)以及骨架區(framework regions)(FR1、FR2、FR3以及FR4)。整個序列以FR1、CDR1、FR2以及CDR2包含在第8A圖且FR3、CDR3以及FR4區域延伸到第8B圖地跨越兩個圖式。CDRs以Kabat定義。當比對編號是如根據AHo編號公約定義的時候，破折號簡易地交代編號的差別(參閱，例如，Honegger,A.以及Pluckthun,A.(2001年)分子生物學期刊309：657-670)。
第9A圖和第9B圖提供如本文提供的親代抗體的重鏈(VH)的可變域的胺基酸序列的比對。其顯示CDRs(CDR1、CDR2與CDR3)以及骨架區域(FR1、FR2、FR3以及FR4)。整個序列以FR1、CDR1、FR2以及CDR2包含在第9A圖且FR3、CDR3以及FR4區域延伸到第9B圖地跨越兩個圖式。當比對編號是如根據AHo編號公約定義的時候，破折號簡易地交代編號的差別(參閱，例如，Honegger,A.以及Pluckthun,A.(2001年)分子生物學期刊309：657-670，其完整內容藉由於此引用而併入)。
第10A圖和第10B圖提供如本文提供的改造抗體的輕鏈(VL)的可變域的胺基酸序列的比對。其顯示CDRs(CDR1、CDR2與CDR3)以及骨架區域(FR1、FR2、FR3以及FR4)。整個序列以FR1、CDR1、FR2以及CDR2包含在第10A圖且FR3、CDR3以及FR4區域延伸到第10B圖地跨越兩個圖式。當比對編號是如根據AHo編號公約定義的時候，破折號簡易地交代編號的差別(參閱，例如，Honegger,A.以及Pluckthun,A.(2001年)分子生物學期刊309：657-670)。
第11A圖和第11B圖提供如本文提供的改造抗體的重鏈(VH)的可變域的胺基酸序列的比對。其顯示CDRs(CDR1、CDR2與CDR3)以及骨架區域(FR1、FR2、FR3以及FR4)。整個序列以FR1、CDR1、FR2以及CDR2包含在第11A圖且FR3、CDR3以及FR4區域延伸到第11B圖地跨越兩個圖式。當比對編號是如根據AHo編號公約定義的時候，破折號簡易地交代編號的差別(參閱，例如，Honegger,A.以及Pluckthun,A.(2001年)分子生物學期刊309：657-670)。
第12A圖和第12B圖演示在活化GITR訊號傳遞(GITR signaling)中GITR抗體的醣苷化(glycosylation)狀態的重要性。測試以被醣苷化的天然IgG1 GITR抗體以及在297位置上具有從天門冬醯胺酸到麩醯胺酸的取代，而消除了用以使Fc對Fcγ受體的結合的關鍵之N-連接的醣苷化位點之改造的IgG1 GITR抗體執行。以Fcγ-RIIa或Fcγ-RIIIa中之其一所提供的GITR抗體叢簇，測試天然和無醣 苷化變異型中，他們介導(mediate)CD4+ T細胞活性的能力。如在第12A圖和第12B圖，Fcγ RIIa(第12A圖)和RIIIa(第12B圖)能夠叢簇天然IgG1 GITR抗體和驅動作用T細胞的增殖。然而，無醣苷化的抗體，由於其不能結合且無法被Fcγ Rs叢簇而不顯示任何活性。
本文所用的章節標題僅用於組織目的，並且不被解釋為限制描述的申請標的。
除非本文另有定義，結合本申請所使用的科學和技術用語具有所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。此外，除非內文中另有要求，單數用語應包括複數，並且複數用語應包括單數。
通常，與本文中描述的細胞與組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質及核酸化學以及雜合相結合所使用的命名以及其技術，是所屬技術領域中習知且常使用的。除非另有說明，本申請的方法和技術根據在所屬技術領域中習知的常規方法以及如在通篇本說明書中被引用並討論之各種一般及更特定的參考資料中描述的，來一般性地執行。參閱，例如，Sambrook等人，《分子選殖：實驗室手冊》，第三版，冷泉港實驗室出版，紐約。2001年(Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual),3rd ed).,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))；Ausubel等人，《當前分子生物學》，格林出版協會。1992年(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992))；以及Harlow與Lane，《抗體：實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約。1990年(Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990))，其於此併入做為參考。酶反應(enzymatic reaction)以及純化 技術是根據製造商的說明書而執行，如所屬技術領域中通常實現的或如本文所述的。本文中描述的於此用於與分析化學、合成有機化學、以及醫學與藥物化學相結合的用語以及其實驗室程式和技術是所屬技術領域中習知的且常使用的。標準技術可使用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送、以及病患的治療。
應當理解的是，本發明並不限定於本文描述之特定的方法、方案和試劑等，且因此可有所變化。本文所用的用語僅用於描述特定實施例的目的，且不旨在限制所公開的範疇，公開的範疇係單獨由申請專利範圍來限定。
除了在操作範例裡，或其另有說明，在本文中使用以表現成分或反應條件的量的所有數值應在所有實例中皆被理解為以用語「大約」修飾。用語「大約」與百分比結合使用時可表示±1%。
相較於藉由本文特定的段落所定義的變異，範疇以任何方式更窄的所有實施例被認為是包括在本公開中。舉例來說，某些態樣被描述為一個屬類，而應當理解的是，一個屬類的每個成員可單獨地為一個實施例。此外，被描述為一個屬類或選擇一個屬類的成員的態樣也應被理解為包含該屬類的兩個或多個成員的組合。也應當被理解的是，雖然在說明書中各個實施例使用「包括」語言呈現，在各種情況下，相關的實施例，也可使用「由......組成」或「實質上由......組成」的語言來描述。
在本申請中，除非另有說明，「或」的使用表示「及/或」。更甚者，用語「包含(including)」的使用，以及其他形式，諸如「包含(includes)」和「包含(included)」亦非限制性的。另外，除非另有特別聲明，用語例如「元件」或「組件」涵蓋包含一個單元的元件與組件，以及包含多於一個子單元的元件與組件兩者。
I. 定義
如用於本文中，用語「GITR」指稱「醣皮質素誘導TNF相關基因(Glucocorticoid-induced TNF-related gene)」，在所屬技術領域中也被稱為TNF受體超家族18(TNF receptor superfamily 18，TNFRSF 18)。針對人類及鼠類形式的GITR之胺基酸和核酸序列被描述在WO 98/06842，其於此併入做為參考。也可參閱基因銀行(GenBank)寄存號Q9Y5U5(人類胺基酸序列)以及AF109216(鼠類核酸與胺基酸序列)。成熟人類GITR多肽的一個特定範例的胺基酸序列被闡述在SEQ ID NO：1。來自食蟹獼猴(cynomolgus monkey)的一個示例性成熟GITR蛋白具有如顯示於SEQ ID NO：2的胺基酸序列。來自小鼠(mouse)的成熟GITR的胺基酸序列被顯示在SEQ ID NO：3內。本文所使用的用語GITR也包括天然(naturally occurring)對偶基因(allele)。
如用於本文中，用語「GITRL」指稱GITR的天然配體(ligand)。 GITRL多肽的胺基酸序列被提供於基因銀行寄存號AAQ89227。人類GITRL的示例性胺基酸序列被提供在SEQ ID NO：4裡。
如用於本文中「抗原結合蛋白(antigen binding protein)」表示特定地結合一特異的標的抗原的任意蛋白，像是GITR多肽(例如，諸如在SEQ ID NO：1內提供的人類GITR多肽)。用語包含含有至少一個抗原結合區域的多肽。 用語也涵蓋包含至少兩個全長重鏈和兩個全長輕鏈的完整抗體，以及其衍生物、變異型、片段、和突變，其範例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段。抗原結合蛋白也包括域抗體像是如以下進一步描述之奈米抗體以及單鏈抗體，以及雙特異性抗體。該用語不包括GITRL。
通常，當抗原結合蛋白展現對非GITR分子結合之基本背景時，GITR抗原結合蛋白被稱為「特異地結合」其標的抗原GITR。然而，特異性結合GITR的抗原結合蛋白可與來自不同物種的GITR多肽交互反應。典型地，當透過表面電漿共振(surface plasmon resonance)技術(例如，BIACoreTM，GE-Healthcare 生命科學公司，Uppsala，瑞典)而測量得之解離常數(dissociation constant，KD)是10-7M時，GITR抗原結合蛋白特異地結合人類GITR。再次使用諸如BIACoreTM的方法為測量，當KD是5x 10-8M，GITR抗原結合蛋白以「高親和力」特異性結合人類GITR，且當KD是5x 10-9M時，以「非常高親和力」特異性結合人類GITR。
「抗原結合區域」表示蛋白的部分，像是抗體或片段、衍生物、或其變異型，其特異地結合特異的抗原。舉例來說，含有與抗原相互作用以及賦予該抗原結合蛋白其針對抗原的特異性及親和力的胺基酸殘基(residue)的抗原結合蛋白的那部分被稱為「抗原結合區域」。抗原結合區域可包括一或多個「互補性決定區(complementarity determining regions，CDRs)」。某些抗原結合區域也包括一個或多個「骨架(framework)」區域。互補性決定區是貢獻抗原結合特異性及親和力的一胺基酸序列。「骨架」區域可直接地對抗原結合蛋白的特異結合作出貢獻，但典型地在維持互補性決定區的合適構型上有所助益以促進抗原結合區域和抗原之間的結合。
包含重組GITR抗原結合蛋白之「重組蛋白(recombinant protein)」，是使用重組技術，亦即，透過如本文描述的重組核酸的表現，所製作成的蛋白。重組蛋白的生產方法和技術在所屬技術領域中為公知。
用語「抗體」指稱任何同型(isotype)的完整免疫球蛋白，或可與完整抗體競爭特異性結合至標的抗原的片段，且包括，例如，嵌合、人源化、全人以及雙特異性抗體。因此「抗體」是抗原結合蛋白的一種。在一些實施例裡，完整的抗體包含至少兩個全長重鏈以及兩個全長輕鏈。在其他實施例裡，完整抗體包括較少的鏈，像是在駱駝科內的天然抗體，其可僅包含重鏈。抗體可獨自衍生自單一來源，或可被「嵌合」，亦即，如以下進一步的描述，抗體的不同部分可從兩個不同抗體衍生。抗原結合蛋白、抗體、或結合片段可藉由 重組DNA技術，或藉由完整抗體的酵素或化學裂解，產生於融合瘤中。除非另有說明，用語「抗體」除了含有兩個全長重鏈以及兩個全長輕鏈的抗體以外，包括其衍生物、其變異型、其片段、以及其突變，其範例包括Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、像是Nanobodies®與單鏈抗體的區域抗體，其如以下更詳細之描述。
對於抗原結合蛋白、抗體或其片段使用的用語「輕鏈」，包括全長輕鏈以及具有足夠的可變區序列以授予結合特異性的其片段。全長輕鏈包括可變區區域(variable region domain)VL，以及恆定區區域(constant region domain)CL。輕鏈的可變區區域是在多肽的胺基終端。輕鏈包括κ鏈以及λ鏈。
對於抗原結合蛋白、抗體或其片段使用的用語「重鏈」，包括全長重鏈與具有足夠的可變區序列以授予結合特異性的其片段。全長重鏈包括可變區區域VH，以及三個恆定區區域，CH1、CH2、CH3。VH區域是在多肽的胺基終端，且CH區域是在羧基終端，且CH3是最靠近多肽的羧基終端。重鏈可為任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM與IgE。
如用於本文中，抗體或免疫球蛋白鏈(重或輕鏈)的用語「免疫功能片段(immunologically functional fragment)」(或是簡單地為「片段」)，是包含缺少至少一些在全長鏈裡存在的胺基酸的抗體的一部分(不論該部分是如何獲得或合成的)的抗原結合蛋白，但是其可特異性地結合至抗原。這樣的片段於其特異地對標的抗原結合上是生物活性的且可與其他抗原結合蛋白，包括完整抗體競爭特異的結合至給定的表位(epitope)。在一個態樣裡，這樣的片段將保留存在於全長輕或重鏈裡的至少一個互補性決定區，且在某些實施例裡將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。這些生物活性片段可藉由重組DNA技術產生，或可藉由抗原結合蛋白，包括完整抗體，的酵素或化學裂解產生。免疫功能免疫球蛋白片段包括，但不限於，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗體以及單鏈抗體，且可從任 何哺乳類來源衍生，包含但不限於人類、小鼠、大鼠、駱駝科或兔類。進一步被預期的是本文所揭露的抗原結合蛋白的功能性部分，例如，一個或多個互補性決定區，可被共價結合至第二蛋白或至小分子以創造直接對體內特定標的、其具備雙功能治療特性、或具有延長的血清半衰期的治療劑。
「Fab片段」是由一個輕鏈和CH1以及一個重鏈的可變區組成。Fab分子的重鏈不能與其他重鏈分子形成雙硫鍵。
「Fc」區域包含含有抗體的CH2和CH3域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段。兩個重鏈片段藉由兩個或更多雙硫鍵以及藉由CH3域的疏水相互作用維繫在一起。
「Fab'片段」包含一個輕鏈以及含有VH域以及CH1域且還有在CH1與CH2域之間的區域的一個重鏈的一部分，使得鏈間雙硫鍵可在兩個Fab'片段的兩個重鏈之間形成以形成F(ab')2分子。
「F(ab)2片段」包含兩個輕鏈及含有CH1及CH2域之間的恆定區的一部分的兩個重鏈，使得鏈間雙硫鍵被形成在兩個重鏈之間。F(ab')2片段因此係由被兩重鏈之間的雙硫鍵維繫在一起之兩個Fab’片段所組成。
「Fv區域」包含來自重與輕鏈兩者的可變區，但缺乏恆定區。
「單鏈抗體」係為Fv分子，在其中該重鏈與輕鏈可變區已經被可撓的連接物聯結以形成單一多肽鏈，其形成抗原結合區域。單鏈抗體在國際專利申請公開號WO 88/01649及美國專利號4,946,778與5,260,203裡被詳細的討論。
「域抗體」是僅含有重鏈的可變區或輕鏈的可變區的免疫功能免疫球蛋白片段。域抗體的範例包括Nanobodies®。在某些例子中，兩個或更多VH區與肽連接物共價地連接以創造二價域抗體。二價域抗體的兩個VH區域可標的相同或不同抗原。
「二價抗原結合蛋白」、「二價抗體」或「雙特異性抗體」包含兩個抗原結合區。在某些範例，兩個結合區具有相同抗原特異性。二價抗原結合蛋白和二價抗體可為雙特異性的。
「多特異性抗原結合蛋白」或「多特異性抗體」是標的多於一個抗原或表位的一種抗原結合蛋白或抗體。
「雙特異性」、「雙重特異性」、或「雙功能」抗原結合蛋白或抗體分別是具有兩個不同的抗原結合位置的雜交(hybrid)抗原結合蛋白或抗體。 雙特異性抗原結合蛋白及抗體是多特異性抗原蛋白或多特異性抗體的一種且可由多種方法包括，但不限於，融合瘤的聚變或Fab'片段的連接而產生。參閱，例如，Songsivilai與Lachmann，1990年，臨床與實驗免疫學期刊(Clin.Exp.Immunol)，79：315-321；Kostelny等人，1992年，免疫學期刊(J.Immunol)，148：1547-1553。雙特異性抗原結合蛋白或抗體的兩個結合位置相結合至兩個不同的表位，其可駐留在相同或相異的蛋白標的上。
用語「競爭」當被使用在競爭相同的表位的抗原結合蛋白(例如，抗體)之內文中時，表示抗原結合蛋白之間的競爭且其藉由測定來決定，在該測定內，於測試下之抗原結合蛋白(例如，抗體或其免疫功能片段)防止或抑制對共同抗原(common antigen)(例如，GITR或其片段)之參考抗原結合蛋白的特異結合。可使用眾多種類的競爭結合測定，例如：固相直接或間接放射免疫測定(solid phase direct or indirect radioimmunoassay，RIA)、固相直接或間接酵素免疫分析(solid phase direct or indirect enzyme immunoassay，EIA)、夾心式競爭測定(sandwich competition assay)(參閱，例如，Stahli等人，1983年，《酵素學方法》(Methods in Enzymology)，9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白酵素免疫分析(solid phase direct biotin-avidin EIA)(參閱，例如，Kirkland等人，1986年，免疫學期刊，137：3614-3619)、固相直接標記測定(solid phase direct labeled assay)、固相直接標記夾心式測定(solid phase direct labeled sandwich assay)(參閱，例如，Harlow與Lane，1988年，《抗體：實驗室手冊》，冷泉港出版)；使用I-125標記的固相直接標記放射免疫測定(參閱，例如，Morel等人，1988年，分子免疫學期刊(Molec.Immunol.)，25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白酵素免疫分析(參閱，例如，Cheung等人，1990年，病毒學期刊(Virology)，17：546-552)；以及直接標記放射免疫測定(direct labeled RIA)(Moldenhauer等人，1990年，斯堪地那維亞免疫學期刊(Scand.J.Immunol.)，32：77-82)。典型地，這樣的測定涉及結合至表現抗原的固體表面或細胞上之純化的抗原、未標記的測試抗原結合蛋白與標記的參考抗原結合蛋白的使用。競爭抑制在測試抗原結合蛋白的存在下，藉由測定結合至固體表面或細胞的標記的數量來測量。通常測試抗原結合蛋白是過量地存在。藉由(競爭抗原結合蛋白的)競爭測定鑑定的抗原結合蛋白包括結合至與參考抗原結合蛋白相同表位的抗原結合蛋白，以及包括結合至足夠接近於由參考抗原結合蛋白結合的該表位之鄰近表位的抗原結合蛋白，以發生立體阻礙(steric hindrance)。關於用於測定競爭結合的其他詳細方法被提供在本文範例中。舉例，在一個實施例中，競爭是根據BiaCore測定來決定。通常，當競爭抗原結合蛋白過量地存在時，將會抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之對共同抗原的參考抗原結合蛋白的特異結合。在某些方面，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%、或97%或更多。
用語「抗原」指稱可被選定的結合劑結合的分子或分子的一部分，諸如(包括，例如，抗體，的)抗原結合蛋白、以及其他可被使用在動物上以產生可結合至此類抗原的抗體。抗原可擁有一個或多個可與不同的抗原結合蛋白，例如，抗體相互作用的表位。
用語「表位」是被抗原結合蛋白(舉例說明，抗體)結合的分子的一部分。該用語包括能夠特異地結合至抗原結合蛋白，諸如抗體的任何決定位(determinant)。表位可為連續或不連續(非連續)(例如，在多肽裡，於多肽序列上彼此不鄰近但在被抗原結合蛋白結合的該分子的前後關係內的胺基酸殘基)。構型的表位(conformational epitope)是存在在活性蛋白的構型內但不存在於變性蛋白內的表位。在特定實施例裡，表位可被模擬於其中，其包含相似於用以產生抗原結合蛋白的表位的三維結構，然卻未包含或包含僅一些在用以產生抗原結合蛋白的表位裡發現的胺基酸殘基。最常見的，表位位在蛋白質上，但在某些例子裡可位在其他種類的分子上，諸如核酸。表位決定位可包括分子像是胺基酸的化學活性表面群集、糖側鏈(sugar side chain)、磷醯基(phosphoryl)或磺醯基，以及可具有特異的三維結構特性、及/或特異的電荷特徵。通常，針對特定標的抗原特異的的抗原結合蛋白將優先辨識在蛋白及/或巨分子的複雜混和物內之標的抗原上的表位。
「胺基酸」包括其在所屬技術領域中的通常意思。二十個天然胺基酸以及它們的衍生物遵循常規用法。參閱，《免疫學：合成》(Immunology：A Synthesis)，第二版，(E.S.Golub與D.R.Green，編)，Sinauer出版協會，桑德蘭(Sunderland)，麻州，1991年，為了任何目的併入本文中做為參考。二十個常規胺基酸的立體異構物(例如，D-胺基酸)、非天然的胺基酸像是[α]-,[α]-雙取代的胺基酸([alpha]-,[alpha]-disubstituted amino acid)、N-烷基胺基酸(N-alkyl amino acid)、以及其他非常規胺基酸也可為多肽之合適的成分，且被包括在詞語「胺基酸」內。非常規胺基酸的範例包括：4-羥脯胺酸(4-hydroxyproline)、[γ]-羧基麩胺酸([gamma]-carboxyglutamate)、[ε]-N,N,N-三甲基離胺酸([epsilon]-N,N,N-trimethyllysine)、[ε]-N-乙醯離胺酸([epsilon]-N-acetyllysine)、O-磷絲胺酸(O-phosphoserine)、N-乙醯絲胺酸(N-acetylserine)、N-甲醯甲硫胺酸 (N-formylmethionine)、3-甲基組胺酸(3-methylhistidine)、5-羧離胺酸(5-hydroxylysine)、[σ]-N-甲基精胺酸([sigma]-N-methylarginine)、以及其他相似胺基酸和亞胺基酸(imino acid)(例如，4-羥脯胺酸(4-hydroxyproline))。本文中使用的多肽符號中，以標準用法和慣例，左手方向是胺基末端方向且右手方向是羧基末端方向。
本文中用語「多肽」或「蛋白」被互換地使用以指稱胺基酸殘基的聚合物。該用語也應用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然胺基酸的類似物或模擬，還有天然胺基酸聚合物之胺基酸聚合物。用語也能包含已經例如，藉由醣類殘基的加成修飾以形成醣蛋白，或磷酸的的胺基酸聚合物。多肽和蛋白可藉由天然或非重組的細胞來產生或是藉由遺傳工程的或重組的細胞來產生，且可包含具有天然蛋白質的胺基酸序列的分子，或具有天然序列的一或多個胺基酸的缺失形式、加成、及/或取代的分子。用語「多肽」以及「蛋白」具體涵蓋GITR抗原結合蛋白、抗體、或具有抗原結合蛋白的一個或多個胺基酸的缺失形式、加成、及/或取代的序列。用語「多肽片段」指稱當與全長蛋白相比時，具有胺基末端缺失、羧基末端缺失、及/或內部缺失的多肽。與全長蛋白比較時，此種的片段也可內含修飾的胺基酸。在特定實施例裡，片段為約5至500個胺基酸長。舉例來說，片段可至少為5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸長。有用的多肽片段包括抗體的免疫功能片段，其包含結合域。在GITR抗體的情況裡，有用的片段包括但不限於互補性決定區、重或輕鏈的可變域、抗體鏈的一部分或只是其包括兩個互補性決定區的可變區域、以及類似物。
用語「分離蛋白」表示主體蛋白(1)是不含通常會與其一起被發現的至少一些其它蛋白，(2)基本上不含來自相同來源，例如，來自相同物種，的其他蛋白，(3)藉由來自不同物種的細胞表現，(4)已經從在自然界中與其相關聯 的至少約50%的多核苷酸、脂質、醣類、或其他材料中分離，(5)是(藉由共價或非共價相互作用)可操作地與其在自然界不相關聯的多肽相關聯，或(6)不存在於自然界中。典型地，「分離蛋白」構成給定樣品的至少約5%、至少約10%、至少約25%、或至少約50%。合成來源的基因體DNA、cDNA、mRNA或其它RNA，或其任何組合可編碼這樣的分離蛋白。優選地，分離蛋白是實質上不含被發現在其自然環境中會幹擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白或多肽或者其它汙染物。
多肽的「變異型」(例如，諸如抗體之抗原結合蛋白)包含相對於其他多肽序列，其中一個或多個胺基酸殘基被插入進該胺基酸序列、從該胺基酸序列被剔除及/或取代進該胺基酸序列之胺基酸序列。變異型包括融合蛋白。
多肽的「衍生物」是已經在一些與插入、缺失、取代變異型截然不同的方式被化學地修飾的多肽(例如，諸如抗體之抗原結合蛋白)，例如，透過共軛(conjugation)至另一個化學基團/部分。
用語「天然(naturally occurring)」當使用在與生物材料諸如多肽、核酸、宿主細胞等相關的通篇說明書內時，指稱其在自然界中被發現的材料。
用語「多核苷酸」或「核酸」包括單股和雙股核苷酸聚合物兩者。 包含多核苷酸的核苷酸可為核醣核苷酸或去氧核醣核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。修飾包括鹼基修飾像是溴尿核苷(bromouridine)以及肌核苷(inosine)衍生物、核醣修飾像是2’,3’-雙去氧核醣(2’,3’-dideoxyribose)、核苷酸間鍵(internucleotide linkage)修飾諸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)以及胺基磷酸酯(phosphoroamidate)。
用語「寡核苷酸」表示包含200個或更少核苷酸的多核苷酸。在某些實施例裡，寡核苷酸是10至60個鹼基長度。在其它實施例裡，寡核苷酸是12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40個核苷酸長度。寡核苷酸可為單股或雙股，例如，為了用於突變基因內的結構。寡核苷酸可為義(sense)或反義(antisense)寡核苷酸。寡核苷酸可包括用於檢測測定(detection assay)的標記，其包括放射標記、螢光標記、半抗原(hapten)或抗原的標記。寡核苷酸可用作為，例如，如PCR引子、選殖引子、或雜合探針。
「分離核酸分子」表示基因體的DNA或RNA、mRNA、cDNA、或合成來源或其某些組合，其不與其中分離之多核苷酸係在自然界中發現之所有或一部分的多核苷酸相關聯，或與在自然界中不連鎖(linked)的多核苷酸連鎖。為了本公開的目的，應當被理解的是「包含(特定的核苷酸序列)的核酸分子」不涵蓋完整染色體。分離核酸分子「包含」特定的核酸序列可包括，除了特定的序列以外，用於高達十或甚至高達二十的其它蛋白或其部分之編碼序列，或可包括控制讀取核酸序列的編碼區域的表現的可操作連鎖調控序列，及/或可包括媒介體序列。
除非另有說明，本文討論的任何單股多核苷酸序列之左端是5’端；雙股多核苷酸序列之左手方向稱為5’方向。新生(nascent)RNA轉錄本的5’至3'加成的方向被稱為轉錄方向；在具有與為RNA轉錄本的5'至5'端的RNA轉錄本相同的序列的DNA股上的序列區域被稱為「上游序列(upstream sequence)」；在具有與為RNA轉錄本的3’至3’端的RNA轉錄本相同的序列的DNA股上的序列區域被稱為「下游序列(downstream sequence)」。
用語「控制序列(control sequence)」指稱可影響對其連接的編碼序列之表現和處理的多核苷酸序列。此種控制序列的性質可取決於宿主有機體。在特定實施例裡，針對原核生物的控制序列可包括啟動子(promoter)、核醣體結 合位(ribosomal binding site)、以及轉錄終止序列(transcription termination sequence)。舉例來說，針對真核生物的控制序列可包括含有一個或複數個針對轉錄因數的辨識位(recognition site)的啟動子、轉錄強化子序列(transcription enhancer sequence)、以及轉錄終止序列。「控制序列(control sequence)」可包括前導序列(leader sequence)及/或融合夥伴序列(fusion partner sequence)。
用語「媒介體(vector)」表示用以傳送蛋白質編碼資訊進入宿主細胞的任何分子或個體(entity)(例如，核酸、質體、噬菌體或病毒)。
用語「表現媒介(expression veator)」或「表現構建(expression construct)」指稱適合宿主細胞的轉形作用(transformation)的媒介體，且含有針對及/或控制(在與宿主細胞結合)有效地連結至一或更多異位的編碼區域的表現的核酸序列。表現建構可包括，但不限於，影響或控制轉錄、轉譯的序列，且，若內含子(intron)存在，影響有效連結至其的編碼區域的RNA剪接的序列。
如用於本文中，「有效連結(operably linked)」表示適用該用語的組件是處於一種允許它們在合適的條件下執行其固有的功能之關係。舉例來說，在「有效連結」至蛋白質編碼序列的媒介體內之控制序列被連接其上，使得在蛋白質編碼序列的表現在與控制序列的轉錄活性相容的情況下實現。
用語「宿主細胞(host cell)」表示具有已經以核酸序列轉形且因而表現感興趣的基因的細胞。用語包括母細胞(parent cell)的子代，不論該子代是否在形態上或在遺傳組成上同源於來源母細胞，只要感興趣的基因存在。
用語「同源(identity)」指稱當藉由比對和比較序列來判定時，兩個或更多多肽分子或兩個或更多核酸分子的序列之間的關係。「百分比同源(percent identity)」表示在胺基酸或核苷酸在比較分子之間的相同殘基百分比，以且其係基於被比較的分子的最小尺寸來計算。針對這些計算，比對的空位(若有的話)必須經由特定數學模型或電腦程式(即，演算法)來處理。可用以計算比對 的核酸或多肽的同源的方法包括被描述在《計算分子生物學》(Computational Molecular Biology)，(Lesk,A.M，編)，1988年，紐約：牛津大學出版社；《生物計算：資訊學及基因體計畫》(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，(Smith,D.W，編)，1993年，紐約：學術出版社；《序列資料的計算分析，第一部》(Computer Analysis of Sequence Data,Part I)，(Griffin,A.M.與Griffin,H.G.編)，1994年，紐澤西：Humana出版社；von Heinje,G.，1987年，《分子生物學的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，紐約：學術出版社；《序列分析引子》(Sequence Analysis Primer)，(Gribskov,M.與Devereux,J.編)，1991年，紐約：M.Stockton出版社；以及Carillo，等人，1988年，SIAM應用數學期刊(SIAM J.Applied Math)，卷48：1073的那些方法。
在計算百分比同源時，被比較的序列在給予序列之間最大匹配的方法下被比對。被使用以判定百分比同源的電腦程式是GCG程式包(GCG program package)，其包括GAP(Devereux等人，1984年，核酸研究期刊(Nucl.Acid Res)，12：387；遺傳電腦組，威斯康辛大學，麥迪遜，威斯康辛(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。計算演算法GAP被使用以比對待測定其該百分比序列同源之兩個多肽或是多核苷酸。序列係比對它們各自胺基酸或核酸的最適匹配(如藉由演算法測定的「匹配跨度」(matched span))。空位開放罰分(gap opening penalty)(其被計算為3X平均對角線，其中「平均對角線(average diagonal)」是被使用的對比矩陣的對角線的平均值；「對角線(diagonal)」是藉由特定對比矩陣被分配給每個完美胺基酸匹配的評分或數目)以及和空位延伸罰分(gap extension penalty)(其通常是空位開放罰分的1/10)，以及對比矩陣諸如PAM250或BL0SUM62與該演算法結合使用。在某些實施例中，標準對比矩陣(對於PAM250對比矩陣，參閱Dayhoff，等人，1978年，〈蛋白質序列和結構圖集〉(Atlas of Protein Sequence and Structure)，5：345-352；對於BL0SUM62對比矩 陣，參閱Henikoff，等人，1992年，美國國家科學院論文集(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，89：10915-10919)也被該演算法使用。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列的百分比同源的建議參數如下：演算法：Needleman，等人，1970年，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)，48：443-453；對比矩陣：BL0SUM62來自Henikoff，等人，1992年，同上；空位罰分：12(但是無末端空位罰分)
空位長度罰分：4
相似度閾值：0
用於比對兩個胺基酸序列的某些比對方案可得到僅兩個序列的短區域的匹配，並且該小比對區域可具有非常高的序列同源，即使兩個全長序列之間沒有顯著關聯。因此，如果希望得到跨度標的多肽的至少50個連續胺基酸的比對，則可調整選擇的比對方法(GAP程式)。
如用於本文中，「大致上純的」表示所描述的分子種類是優勢種類的存在，亦即，以莫耳計，它比在相同混合物中任何其他個體種類更豐富。在特定實施例中，大致上純的分子是組成物，在其中主體種類包含存在的所有巨分子種類的至少50%(以莫耳計)。在其他實施例中，大致上純的組成物將包含組成物中存在的所有巨分子種類之至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，主體種類被純化至必要的同質性，其中藉由常規檢測方法不會在組成物中檢測到汙染種類，並且因此組成物係由單一可檢測巨分子種類組成。
用語「治療」指稱成功在損傷、病理或病症內的任何指示，包含任何客觀或主觀的參數諸如減低；緩解；症狀的遞減；或是使損傷、病理或病症對病患更能忍受；減緩退化或衰退的速度；使退化的終點較少衰弱；增進病 人的生理或精神健康。所述症狀的治療或改善可基於客觀或主觀的參數；包括生理檢查、神經精神檢查、及/或精神評估的結果。舉例來說，本文中呈現的某些方法藉由，例如，減低癌症的進展或擴散、抑制腫瘤生長、導致腫瘤的緩解及/或改善與癌症或腫瘤相關的症狀成功地治療癌症和腫瘤。同樣地，本文提供的其他方法藉由減少感染的進展或擴散、減輕感染的程度及/或改善與感染相關的症狀來治療感染性疾病。
「有效量(effective amount)」通常是其量足以減少症狀的嚴重性及/或頻率、消除症狀及/或潛在原因、避免症狀及/或其潛在原因的發生，及/或改善或修復癌症導致或與癌症相關聯的損害。在一些實施例中，有效量是治療上有效的量或預防有效的量。「治療有效量(therapeutically effective amount)」是指足以彌補疾病狀態(例如，癌症)或症狀的量，特別是與疾病狀態相關聯的狀態或症狀，或是以其它方式避免、阻礙、延緩或逆轉疾病狀態或任何其他與該疾病以任何方式相關聯的不想要的症狀的進展。「預防有效量(prophylactically effective amount)」是一種藥學組成物的量，當施予主體，將具有所意圖的預防效果，例如，預防或延遲癌症的發病(或復發)、或減少癌症或癌症症狀的發病(或復發)的可能性。充分的治療或預防效果不一定藉由一個劑量的給藥而發生，且可僅發生在一系列劑量的給藥之後。因此，治療或預防有效量可被施予一次或多次的給藥。
詞語「GITR相關疾病(GITR-associated disease)」及其他相似詞語指稱與藉由誘導或增進GITR活性，例如，透過如本文提供的促效GITR抗體的使用，為可治療的疾病的疾病或病症。
用語「癌症(cancer)」、「腫瘤(tumor)」、「癌的(cancerous)」、「惡性的(malignant)」指稱或描述在哺乳動物中，典型地具有不受控制的細胞生長特色的生理狀況。癌症的例子包括但不限於，包括腺癌(adenocarcinoma)、淋 巴瘤(lymphoma)、胚細胞瘤(blastoma)、黑色素瘤、肉瘤(sarcoma)和白血病(leukemia)的癌(carcinoma)。此類癌症的更具體實例包括黑色素瘤、肺癌、頭頸部癌、腎細胞癌、結腸癌、大腸癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、霍金氏(Hodgkin's)和非霍金氏淋巴瘤、胰腺癌、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)、神經膠質瘤(glioma)、子宮頸癌(cervical cancer)、卵巢癌、諸如肝細胞癌(hepatic carcinoma)和肝腫瘤(hepatoma)之肝癌、膀胱癌、乳癌、子宮內膜癌(endometrial carcinoma)、骨髓瘤(如多發性骨髓瘤(multiple myeloma))、唾液腺癌、例如腎細胞惡性腫瘤和威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)之腎癌、基底細胞癌(basal cell carcinoma)、前列腺癌(prostate cancer)、外陰癌(vulval cancer)、甲狀腺癌、睾丸癌和食道癌。
「腫瘤」指稱當癌性細胞生長和繁殖時形成的組織塊，其可侵入並破壞正常的鄰近組織。癌細胞可脫離的惡性腫瘤並進入血液或淋巴系統中，使得癌細胞從原發腫瘤擴散以在其他器官中形成新的腫瘤。
「實體腫瘤(solid tumor)」指通常不包含包囊(cyst)或液體區域之組織的異常生長或塊。實體腫瘤可為良性的(非癌性)或惡性(癌性)。不同類型的實體腫瘤被以形成它們的細胞類型命名。實體腫瘤的範例有肉瘤、癌及淋巴瘤。白血病(血癌)一般不形成實體腫瘤。
「血液的癌症(hematological cancers)」是在造血組織中起始的癌症，諸如骨髓，或在免疫系統的細胞內。血液的癌症的實例是白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。
本文使用的「主體」或「病患」可為任何哺乳類。在典型的實施例裡，主體或病患是人類。
本文所使用的「促效(agonist)」通常地指稱分子，例如，像是本文提供的抗原結合蛋白，其能結合GITR與促進GITR發訊號。
詞語「免疫調節物」指稱誘導、增進或抑制免疫反應的分子。免疫活化蛋白(immune activator)是誘導或放大免疫反應的分子。免疫抑制因子(immune suppressor)是減低或抑制免疫反應的分子。如此，活化免疫療法是涉及給予分子以誘導或增進主體的免疫系統的療法。抑制免疫療法是其中主體以分子治療以減低或抑制主體的免疫系統之療法。
II. 總覽
提供用於針對調節GITR的活性之各種選擇性的結合劑。這些劑包含，舉例來說，含有特異地結合至GITR多肽，特別係人類GITR(例如，SEQ ID NO：1)的抗原結合域的抗原結合蛋白。所提供的抗原結合蛋白是GITR促效劑，且可從而誘導或增進GITR訊號傳遞。就其作為GITR促效劑的活性的觀點來說，所提供的抗原結合蛋白能可使用在各種免疫療法的應用。
本文描述的抗原結合蛋白透過廣泛的挑選過程以鑑定可合適於免疫療法的抗體而獲得，特別是作為免疫刺激物(immunostimulant)。第一選擇是產生全人抗體而非人源化或嵌合抗體的決定。全人抗體被選擇以緩和當被施予一主體時，抗體可能會產生抗抗-GITR抗體本身的風險-預期在免疫療法應用中被放大的風險，其中在該免疫療法裡，GITR抗體被給藥以上調(up-regulated)主體的免疫反應。
用於獲得此種全人抗體的過程藉由於Xenomouse®動物裡進行三個分開的免疫接種活動(immunization campaigns)而啟動。這些活動採用三個不同免疫接種策略以及三個不同小鼠的品系，致力於最大化可從其中挑選之候選抗體的抗體的數目和序列多樣性。從這些三個活動中獲得的結果初始抗體接著透過以序列為基礎、生物物理以及功能篩選的多重回合以鑑定有著想要的特性的一群親代抗體。這些親代抗體改造的變異型以進一步增進挑選的親代抗體的一 個或多個特徵的目標被依序地產生。最終，挑選來自親代與改造的抗體的一群抗體以用於進一步分析。
舉例來說，關於序列分析，親代抗體是從初始抗體，基於許多準則而挑選，諸如氧化作用、去胺作用、異構化作用、酸水解作用及/或聚合、以及免疫原性(immunogenicity)。生物物理分析包括基於表現量、聚集傾向、以及穩定性評估抗體。功能上，親代抗體就活性而挑選，諸如針對GITR的親和力、活化和刺激作用T細胞的能力以及減少被調控T細胞抑制的能力。
挑選的親代抗體接著被改造以致力於改善抗體。從親代抗體的最終挑選和其改造形式也基於許多準則，包括細胞株的穩定性、純化屬性(purification attribute)、製造評鑑以及想要的功能屬性。
在某些實施例裡，抗原結合蛋白因為其展現對不同T細胞的子類(subclass)的差別結合而被挑選。特別是，此種抗原結合蛋白對CD4+CD25+ T細胞的結合更強於對CD4+CD25- T細胞的結合，且對CD8+CD25+ T細胞的結合更強於對CD8+CD25- T細胞的結合。這種結合選擇性異於觀察到的一些其他已知GITR抗體的結合選擇性。該選擇性可為重要的，因為觀察到的與本文提供的GITR抗原結合蛋白的差別結合是相似於與自然配體，GITRL，上觀察到的。因此，結合的選擇性可減低針對與非特異性結合至其他T細胞子集(subset)相關的不想要的效果的潛在可能，以及可更近似地模仿GITRL的結合。
在一實施例，也挑選抗原結合蛋白使得Fc區域被醣苷化。如此，舉例來說，抗原結合蛋白可為其中重鏈是IgG1亞型的重鏈的抗體。Fc域的醣苷化在抗體結合至Fcγ受體和形成抗體叢簇(cluster)的能力中是重要的。這樣的叢簇在特定抗原結合蛋白更有效地誘導或增進GITR發訊號的能力裡是重要的。
如上所提，在其作為GITR促效劑的活性的觀點，所提供的抗原結合蛋白在各種其中渴望誘導或增進主體的免疫反應之免疫療法中具有價值，例如在各種癌症、免疫失調和感染的治療裡。
本文揭露的抗原結合蛋白具有各種附加的效用。抗原結合蛋白，例如，在特異性結合測定中、GITR的親和力純化中、以及鑑定其他GITR活性的促效劑的篩選測定中是有用的。其他抗原結合蛋白的用途包括，舉例來說，GITR相關疾病或病徵的診斷以及包括以判定GITR存在或不存在的篩選測定。
III. GITR抗原結合蛋白
雖然包括在本文中範例描述的抗原結合蛋白是抗體，本文提供的抗原結合蛋白不限於抗體。一般來說，本文提供的抗原結合蛋白包含支架，像是一個多肽或是複數個多肽，在其中如本文描述的，包埋及/或連結一個或多個(例如，1、2、3、4、5或6)互補性決定區(complementarity determining regions，CDRs)。在某些抗原結合蛋白裡，互補性決定區被包含進「骨架」區域，其定位互補性決定區，以達成互補性決定區的合適的抗原結合特性。可被進一步包含入支架的其他類型的互補性決定區進一步描述如下。
如此，在某些抗原結合蛋白，互補性決定區序列被包含在蛋白質支架或其他生物相容聚合物裡。在其他實施例裡，抗原結合蛋白是抗體或從抗體衍生的。另外，所提供的一些抗原結合蛋白的範例包括，但不限於，單株抗體、雙特異性抗體、小分子抗體(minibody)、像是奈米抗體®(Nanobodies®)的域抗體、合成抗體(synthetic antibody)(在本文有時被稱為「抗體模擬物(antibody mimetics)」)、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、抗體融合物(antibody fusions)(有時候被稱為「抗體結合物(antibody conjugates)」)、以及分別各個的部分或片段。 在某些範例，抗原結合蛋白是完整抗體(例如，Fab、Fab'、F(ab)2、scFv、域抗體或小分子抗體)的免疫功能片段。各種結構在本文進一步描述和定義。
鑑於它們活化GITR的能力，所提供的抗原結合蛋白可以任意組合展現下列的一個或多個生物活性(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個)：a. 誘導或增進體外或體內GITR訊號傳遞；b. 為了結合至GITR與GITRL交互競爭；c. 可被內化進入人類CD4細胞；d. 減低調控T細胞對作用T細胞的抑制；e. 降低在體外或體內的循環調控T細胞的量；f. 在體外或體內活化作用T細胞；g. 誘導或增進作用T細胞在體外或體內增殖；h. 具有在人類血清裡至少6、7、9或12天的半衰期；i. 抑制腫瘤生長；以及j. 誘導腫瘤抑制。
A. GITR抗原結合蛋白與天然抗體結構
提供的一些抗原結合蛋白具有典型地與天然抗體相關聯的結構。這些抗體的結構單元典型地包含一個或多個四聚體(tetramer)，每個由多肽鏈的兩個相同對聯(couplet)組成，雖然某些哺乳類物種也產生僅具有單一重鏈的抗體。在典型的抗體裡，每對或對聯包括一個全長「輕」鏈(在特定實施例裡，大約25kDa)以及一個全長「重」鏈(在特定實施例裡，大約50-70kDa)。每個個體免疫球蛋白鏈是由幾個「免疫球蛋白域(immunoglobulin domain)」組成，每個含有大約90至110個胺基酸且表現特徵摺疊模式(characteristic folding pattern)。這 些域是其抗體被組成的基本單元。每個鏈的胺基末端部分典型地包括負責抗原辨識的可變域。來自重鏈的可變域當本文被指稱時有時候被簡稱為VH。相似地，來自輕鏈的可變域被簡稱為VL。羧基末端部分在演化上較其他鏈的終端更保守，且被稱為「恆定區(constant region)」或「C區(C region)」。人類輕鏈一般被分類為κ與λ輕鏈，且這些的每個含有一個可變域及一恆定域。重鏈典型地被分類為μ、δ、γ、α、或ε鏈，且這些將抗體的同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA、以及IgE。IgG具有幾個亞型，包括但不限於，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。 IgM亞型包括IgM與IgM2。IgA亞型包括IgA1和IgA2。在人類中，IgA和IgD的同型包含四條重鏈和四條輕鏈；IgG和IgE的同型含有兩條重鏈和兩條輕鏈；且IgM的同型包含五條重鏈和五條輕鏈。重鏈C區典型地包含可負責作用性功能的一個或多個域。重鏈恆定區域域的數量將取決於同型。IgG重鏈，例如，每一個包含已知的三個C區域域為CH1，CH2和CH3。所提供的抗體可具有任意這些同型和亞型。在某些實施例中，GITR抗體是IgG1、IgG2、或IgG4亞型的抗體。
在全長輕和重鏈中，可變與恆定區被大約12個或更多胺基酸的「J」區域接合，伴與也包括大約10個或更多胺基酸的「D」區域的重鏈。參閱，例如，《基礎免疫學》(Fundamental Immunology)，第二版，第七章，(Paul,W.編著)1989年，紐約：渡鴉出版社(Raven Press)(出於所有目的藉由引用併入其全部內容)。各個輕/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位置。
示例性GITR單株抗體的IgG1重鏈恆定域的一個範例具有胺基酸序列： (SEQ.ID NO：442)；(星號對應終止密碼子)。
示例性GITR單株抗體的λ輕鏈恆定域的一個範例具有胺基酸序列：QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*(SEQ ID NO：443)；(星號對應終止密碼子)。
示例性GITR單株抗體的κ輕鏈恆定域的一個範例具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：444)；(星號對應終止密碼子)。
針對本文提供的抗體，免疫球蛋白鏈的可變區通常展現相同整體結構，其包含被三個高度變異區(hypervariable region)接合之相對地保守的骨架區(framework region，FR)，更常被稱為「互補性決定區」或CDRs。來自各個上述提及的重鏈/輕鏈對的兩個鏈的互補性決定區(CDRs)通常藉由骨架區比對以形成特異性地結合至GITR上特異性表位的結構。從N-端至C-端，天然輕和重鏈可變區皆通常遵從下列這些元素的順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。來自重鏈的互補性決定區(CDRs)在本文通常被指稱為CDRH1、CDRH2、及CDRH3。同樣地，來自輕鏈的互補性決定區(CDRs)在本文通常被指稱為CDRL1、CDRL2及CDRL3。編號系統已經被設計用於對佔據這些結構域的每個位置的胺基酸指定號碼。編號系統被定義在Kabat，《感興趣的免疫學蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，(1987年與1991年，NIH， Bethesda，馬里蘭州)，或Chothia與Lesk，1987年，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)，196：901-917；Chothia等人，1989年，自然期刊(Nature)，342：878-883。
如在範例中所述地製備之特異性全人單株抗體的序列資訊被總結在表1。此表列出各個抗體的六個互補性決定區、重鏈可變域(VH)、輕鏈可變域(VL)、全長重鏈(HC)以及全長輕鏈(LC)。表1包括所挑選之親代抗體的序列資訊，以及透過蛋白質工程獲得的親代抗體的改造變異型。序列的比對被提供在第8A圖、第8B圖、第9A圖、第9B圖、第10A圖、第10B圖、第11A圖以及第11B圖。
一般來說，本文所提供的抗原結合蛋白包括一個或多個互補性決定區、一個或多個可變域、及/或如列表於表1裡的抗體的一個或多個全長重或輕鏈序列、以及這樣的序列的變異型或衍生物。
B. GITRd抗原結合蛋白-互補性決定區
舉例來說，在一實施例中，抗原結合蛋白包含其中一個或多個互補性決定區被移植、插入及/或接合至其的支架。在特定實施例中，支架是多肽。 舉例來說，互補性決定區能為具有上述天然結構的抗體的部分。支架的其他範例包括，但不限於，纖網蛋白(fibronectin)、新抑癌蛋白CBM4-2(neocarzinostatin CBM4-2)、脂質運載蛋白(lipocalin)、蛋白A域(Z蛋白)(protein-A domain(protein Z))、Im9、TPR蛋白(TPR protein)、鋅指域(zinc finger domain)、pVIII、GC4、運鐵蛋白(transferrin)、以及C-型凝集蛋白樣域(C-type lectin-like domain)。可被使用在特定實施例中的進一步支架被描述在Gebauer及Skerra(2009年)，化學生物學當前觀點期刊(Curr.Opin.Chem.Biol.)，13：245-255，以及Binz，等人(2005年)，自然生物科技期刊(Nat.Biotech)，23：1257-1268，兩者的全部內容皆藉由引用併入本文。
抗原結合蛋白可具有1個、2個、3個、4個、5個或6個互補性決定區。抗原結合蛋白可具有選自表列於表1的互補性決定區序列，舉例來說，一個重鏈CDR1(「CDRH1」)、及/或一個重鏈CDR2(“CDRH2”)、及/或一個重鏈CDR3(「CDRH3」)、及/或一個輕鏈CDR1(「CDRL1」)、及/或一個輕鏈CDR2(「CDRL2」)、及/或一個輕鏈CDR3(「CDRL3」)。
一些抗原結合蛋白包括CDRH3和CDRL3兩者，各個來自表列於表1的相同抗體。
一些抗原結合蛋白包含CDRL1、CDRL2以及CDRL3，每個來自選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的相同可變輕鏈。在另外的實施例裡，抗原結合蛋白包含CDRL1、CDRL2、以及CDRL3，各個來自表列於表1中的相同抗體，其中CDRL1、CDRL2、以及CDRL3的各個的胺基酸序列是如表1中針對該抗體所指明的。
在另一個實施例裡，抗原結合蛋白包含CDRL1、CDRL2以及CDRL3，其中，相對於選自Ab1至Ab59的群體的任何單抗體的可變域的相應CDRL1、CDRL2以及CDRL3的序列，CDRL1、CDRL2以及CDRL3的一個或多個在序列上相異，但前提是那樣的序列差異集體總和不超過1個、2個、3個或4個胺基酸差異。
其他抗原結合蛋白包含CDRH1、CDRH2以及CDRH3，各個來自選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的相同可變重鏈。在另一個實施例，抗原結合蛋白包含CDRH1、CDRH2以及CDRH3，各個來自如表列於表1的相同抗體，其中CDRH1、CDRH2以及CDRH3的各個的胺基酸序列是如表1中針對該抗體所指明的。
又另一個實施例中，抗原結合蛋白包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中相對於選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的可變域的相應CDRH1、CDRH2及CDRH3，CDRH1、CDRH2及CDRH3的一個或多個在序列上相異，但前提是那樣的序列差異集體總和不超過1個、2個、3個或4個胺基酸差異。
再一其他抗原結合蛋白包含選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的所有六個互補性決定區。在又另一個實施例中，抗原結合蛋白包含選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的所有六個互補性決定區，其中六個互補性決定區各包含如表列在表1的胺基酸序列。
其他抗原結合蛋白包含如選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的所有六個互補性決定區，除了相對於挑選的抗體之相應CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3的一個或多個在序列上相異，但前提是那樣的序列差異集體總和不超過1個、2個、3個、4個、5個或6個胺基酸差異。
C. GITRd抗原結合蛋白-可變域
亦提供包含選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何抗體的輕鏈可變域(VL)之抗原結合蛋白。在另一個實施例裡，抗原結合蛋白包含選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何抗體的VL，其中VL的胺基酸序列被指明於表1。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含變異型VL序列，其至少80%、85%、90%、95%、97%或99%在胺基酸序列上相同於如表1中指明的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的VL序列。
其他抗原結合蛋白包含變異型VL序列，其異於來自如表1指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的VL的胺基酸序列，不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個胺基酸。在另一個態樣，變異型VL序列差異不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸。
某些抗原結合蛋白包含選自囊括Ab1至Ab59群體的任何抗體的重鏈可變域(VH)。在另一個實施例，抗原結合蛋白包含選自表1中指明的囊括Ab1至Ab59群體的任何抗體的VH，其中VH的胺基酸序列是如表1中指明的。
在另一個實施例中，抗原結合蛋白包含變異型VH序列，其至少80%、85%、90%、95%、97%或99%在胺基酸序列上相同於囊括Ab1至Ab59的抗原結合蛋白的任一個的VH序列。
其他抗原結合蛋白包含變異型VH序列，其異於來自如表1指明的囊括Ab1至Ab59的抗原結合蛋白的任一個的VL的胺基酸序列，不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個胺基酸。在另一個態樣，變異型VH序列差異不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸。
又其它抗原結合蛋白包含VL及VH，各來自選自由囊括Ab1至Ab59組成的群體的相同抗體。在另一個實施例中，抗原結合蛋白包含來自選自 由囊括Ab1至Ab59組成的群體的相同抗體的VL及VH，其中VL及VH的胺基酸序列是如在表1所指明的。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包含VL及VH，各自來自選自群體Ab1至Ab59的相同抗體，其中VL及VH的一個或兩者是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%在胺基酸序列上分別與相對於囊括Ab1至Ab59的抗原結合蛋白之任一個的VL或VH序列相同。
某些抗原結合蛋白包含變異型VL及/或變異型VH，在其中變異型VL及變異型VH的一個或兩者，異於選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的分別VL或VH序列，提供在VH和VL中序列差異集體總和不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個胺基酸。在另一個實施例中，差異總和不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸。
仍另一個實施例中，抗原結合蛋白包含來自選自囊括Ab1至Ab59的群體的相同抗體的VH和VL，除了1個、2個、3個或4個胺基酸從VH及/或VL序列的N-端末端消失之外。這樣的改變可，例如，由於在表現或儲存的其間的斷裂而發生。
D. GITR抗原結合蛋白-全長序列
亦提供包含全長重鏈的抗原結合蛋白，其包含如在表1內指明的抗體的任一個的全長重鏈的胺基酸序列。
其他抗原結合蛋白包含含有如表1中指明的抗體的任一個的全長輕鏈的胺基酸序列的全長輕鏈。
如此，在一個實施例中，抗原結合蛋白是抗體且包含全長重鏈以及全長輕鏈，各個從如列表在表1中的相同抗體而獲得。在另一個實施例中，抗 體含有兩條相同的輕鏈以及兩條相同重鏈，各從列表在表1中的相同抗體而獲得。
再一其他抗原結合蛋白是顯示於表1中的任何單一抗體的變異型，在其中變異型抗體的全長輕及/或全長重鏈具有胺基酸序列，其至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於表列在表1中相應抗體的輕和重鏈的胺基酸序列。如此，在一個實施例中，抗原結合蛋白包括全長輕鏈，其具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的胺基酸序列相同於表列於表1中的抗體的輕鏈的胺基酸序列。在另一態樣中，抗原結合蛋白包括全長重鏈，其具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的胺基酸序列相同於表列於表1中的抗體的重鏈的胺基酸序列。
顯示於表1中的抗體的其他變異型，被提供包含如同表列於表列於表1中的單一抗體之全長輕鏈和全長重鏈，除了鏈的一個或兩者序列的異於在表1中指明的相應序列不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸殘基。
在又另一個態樣，包含表列於表1的互補性決定區、可變域及/或全長序列的抗原結合蛋白是單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、多特異性抗體、或前述的抗體片段。在另一個實施例中，本文提供的分離抗原結合蛋白的抗體片段是基於有著表列於表1的序列的抗體之Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙體、或單鏈抗體分子。
在進一步實施例中，本文提供的分離抗原結合蛋白是有著如在表1中闡述的序列之人類抗體且是IgG1-、IgG2-、IgG3-、或IgG4-型的。在特定實施例，抗體是IgG1-的。
一些抗原結合蛋白包含如同選自表1的囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體所指明的互補性決定區、可變域及/或全長序列，且其特徵為進一 步具有下列特徵的一個或多個：(a)結合人類GITR像是KD是300nM、是150nM、是100nM、是75nM、是50nM、是10nM、是5nM、是2nM、或是1nM；(b)在人類血清內具有至少6、7、9或12天的半衰期；(c)結合SEQ ID NO：1的人類GITR和SEQ ID NO：2的食蟹獼猴GITR；(d)以KD 10nM結合SEQ ID NO：1的人類GITR以及以KD 500nM結合SEQ ID NO：2的食蟹獼猴GITR；(e)結合SEQ ID NO：1的人類GITR以及SEQ ID NO：2的食蟹獼猴GITR但沒有SEQ ID NO：3的小鼠GITR。
在某些實施例裡，抗原結合蛋白具有至少104/M×秒、至少105/M×秒、或至少106/M×秒的GITR啟速率(on-rate)(ka)，其係藉由，舉例來說，如以下範例內所描述地測量。所提供的一些抗原結合蛋白具有慢的解離速率或是止速率(off-rate)。例如，某些抗原結合蛋白具有1x 10-2s-1、或1x 10-3s-1、或1x 10-4s-1、或1x 10-5s-1的kd(止速率)。在特定實施例中，抗原結合蛋白具有少於25pM、50pM、100pM、500pM、1nM、5nM、10nM、25nM或50nM的KD(平衡結合親和力(equilibrium binding affinity))。
在另一態樣中，抗原結合蛋白被提供具有在體外或體內(例如，當給藥至人類主體時)至少一天的半衰期。在一實施例裡，抗原結合蛋白具有至少三天的半衰期。在多個其他實施例中，抗原結合蛋白具有4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、或60天或更久的半衰期。在另一個實施例中，抗原結合蛋白是衍生的或被修飾的，使其相比於非衍生或非修飾的抗體時，具有較長的半衰期。在另一個實施例中，抗原結合蛋白包含點突變以增加血清半衰期。以下提供，關於突變和衍生形式的進一步細節。
E. GITR抗原結合蛋白-共通序列(consensus Sequence)
在另一個態樣裡，抗原結合蛋白被提供包含有著衍生自如本文揭露的相關抗體的群體的共通胺基酸序列的互補性決定區。如本文所描述的，「共通序列」指稱具有在給定的胺基酸序列組內不同的一些序列和可變胺基酸之間共同之保守的胺基酸的胺基酸序列。所提供的互補性決定區共通序列包括相應於CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、及CDRL3的各個的互補性決定區。
在一實施例中，共通序列是源自Abs 1-8、11-14及18-19的互補性決定區，如同在表1中和圖裡總結的。
因此，在一實施例中，抗原結合蛋白包含其本身包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH，其中：CDRH1包含序列X1YGMX2(SEQ ID NO：436)，其中X1是S或N；且X2是H或Y；CDRH2包含序列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(SEQ ID NO：437)，其中X1是E、V、A、P；且X2是K或R；CDRH3包含序列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(SEQ ID NO：438)，其中X1是Q、L、E或R；X2是G、R、或S；X3是K、Y、L、F、或R；以及X4是Y或D；且X5是Y或S。
在另一個實施例中，抗原結合蛋白包含其本身包含CDRL1、CDRL2以及CDRL3的VL，其中：CDRL1包含序列RASQX1IRNDLG(SEQ ID NO：439)，其中X1是G或V；CDRL2包含序列X1X2SX3LQS(SEQ ID NO：440)，其中X1是A或D；X2是A或T；且X3是S或T；CDRL3包含序列X1QX2X3X4YPX5T(SEQ ID NO：441)，其中X1是L或Q；X2是H或L；X3是N或H；X4是S、N或T，且X5是W、L或I。
在又另一個實施例中，抗原結合蛋白包含VH和VL，各有著分別如上所描述的共通互補性決定區序列。
F. 競爭性抗原結合蛋白
在另一實施裡中，所提供的抗原結合蛋白與以上描述特異結合至GITR(例如，SEQ ID NO：1的人類GITR)的例示性抗體或功能性片段的其中之一競爭。這樣的抗原結合蛋白可結合至如本文描述的抗原結合蛋白的其中之一的相同表位，或結合至重疊的表位。預期與例示性抗原結合蛋白競爭的抗原結合蛋白和片段顯示相似的功能特質。例示性抗原結合蛋白和片段包括以上描述者，包括那些有著包括在表1之重和輕鏈、可變區蛋白域和互補性決定區。如此，作為具體的例子，所提供的抗原結合蛋白包括具有：(a)針對表列在表1中之相同抗體表列的所有六個互補性決定區；(b)針對表列在表1中的相同抗體表列的VH和VL；或(c)如針對表列在表1中相同抗體指明的兩條輕鏈和兩條重鏈，的與抗體競爭的抗原結合蛋白。
在一實施例中，競爭是藉由BIAcore測定來判定。
G. 單株抗體
所提供的抗原結合蛋白包括結合至GITR的單株抗體。單株抗體可使用所屬技術領域的任何已知技術來產生，藉由使免疫接種程序完成之後，從基因轉殖動物獲得的無限增殖的脾臟細胞。脾臟細胞可使用任何所屬技術領域的已知技術無限增殖，例如，藉由將其與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。用於在融合瘤產生的融合過程中使用的骨髓瘤細胞融合程序優選地是無抗體產生、具有高融合親和力、酵素缺失，使其無法在僅支持想要的融合細胞(融合瘤)的生 長之特定的選擇性培養基裡生長。用於使用在小鼠融合的合適的細胞株的例子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7以及S194/5XXO Bul；使用在大鼠融合細胞株的範例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F以及4B210。使用於細胞融合的其他細胞是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2以及UC729-6。
在某些情況，融合瘤細胞株係藉由賦予著GITR蛋白免疫原的動物免疫性(例如，基因轉殖的具有人類免疫球蛋白序列的動物)來產生；從免疫的動物收成脾臟細胞；融合收成的脾臟細胞至骨髓瘤細胞株；因而產生融合瘤細胞；從融合瘤細胞中建立融合瘤細胞株，且鑑定生產結合GITR多肽的抗體的融合瘤細胞株。這樣的融合瘤細胞株，以及藉由它們生產的抗GITR單株抗體，是本申請的態樣。
融合瘤細胞株分泌的單株抗體可使用任何所述技術領域的習知技藝來純化。融合瘤或mAbs可進一步篩選以鑑定具有特定特質的mAbs，像是誘導或增進GITR活性的能力。此種篩選的範例被提供於以下的示範範例中。
H. 嵌合及人源化抗體
亦提供基於上述序列的嵌合及人源化抗體。用於使用作為治療劑的單株抗體可在使用前以多種方式修飾。一個範例是嵌合抗體，其為由來自共價地接合以產生功能性免疫球蛋白輕或重鏈或其免疫功能部分的不同的抗體之蛋白段所組成的抗體。一般而言，重鏈及/或輕鏈的一部分是相同與或同源於在抗體內的相應序列，該抗體衍生自特定物種或屬於特定抗體類(class)或子類(subclass)，而鏈的其餘部分(remainder)是相同於或同源於在抗體內的相應序列，該抗體衍生自另一個物種或屬於另一個抗體類或子類。關於嵌合抗體的方法，參照，例如，美國專利號4,816,567；以及Morrison等人，1985年，美國國家科 學院論文集，81：6851-6855，其藉由引用併入於此。互補性決定區移植被描述在，舉例來說，在美國專利號6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089、以及5,530,101。
通常，製造嵌合抗體的目標是創造其中來自目標主體物種(intended patient species)的胺基酸的數目是最大化之嵌合體。一個範例是「互補性決定區移植的(CDR-grafted)」抗體，其中抗體包含一個或多個來自特定物種或屬於特定抗體類或子類的互補性決定區域(CDRs)，而抗體鏈的其餘部分是相同於或同源於在衍生自另一個物種或屬於另一個抗體類或子類的抗體內的相應序列。對於在人類的使用上，來自囓齒類動物(rodent)抗體的可變區域或挑選的互補性決定區通常被移植進入人類抗體，取代人類抗體的天然可變區域或互補性決定區。
一個有用的嵌合抗體的類型是「人源化」抗體。通常，人源化抗體是從初始在非人類動物中養成的單株抗體而產生。在此單株抗體裡的一些胺基酸殘基，典型地來自抗體的非抗原辨識部分，被修飾以同源至在相應同型的人體內的相應殘基。人源化可使用例如，藉由取代至少囓齒類動物可變區的一部分為人類抗體的相應區域之多種方法執行(參考，例如，美國專利號5,585,089、以及5,693,762；Jones，等人，1986年，自然期刊(Nature)，321：522-525；Riechmann等人，1988年，自然期刊(Nature)，332：323-27；Verhoeyen，等人，1988年，科學期刊(Science)，239：1534-1536)。
在一態樣中，本文提供的抗體之輕和重鏈可變區域的的互補性可變區(參閱，表1)是被移植至來自相同、或不同的，親緣關係物種的抗體的骨架區域(FRs)。為了創造共通人類骨架區域，來自幾個人類重鏈或輕鏈胺基酸序列的骨架區域可被比對以鑑定共通胺基酸序列。在其他實施例裡，本文揭露的重鏈或輕鏈骨架區域是以來自不同重鏈或輕鏈的骨架區域替換。在一個態樣中， 在GITR抗體的重和輕鏈的骨架區域內的稀有胺基酸沒有被替換，而骨架區域胺基酸的其餘部分被替換。「稀有胺基酸(rare amino acid)」是一個特異位於其中這些特定的胺基酸通常不在骨架區域內被發現的位置的胺基酸。或者，來自一個重或輕鏈的移植的可變區域可被與相異於那些如本文揭露的特定重或輕鏈之恆定區的恆定區一同使用。在其他實施例中，移植的可變區域是單鏈Fv抗體的部分。
在特定實施例中，來自人類以外的種族的恆定區可與人類可變區域一起使用以產生雜交抗體。
I. 全人抗體
亦提供全人類GITR抗體。不將人類暴露於該抗原(「全人抗體」)地製造特異於給定抗原的全人抗體的方法是可行的。提供以實施全人抗體的生產的一個具體的方法是小鼠體液性的免疫系統的「人源化」。人類免疫球蛋白(Ig)基因座引介進入其中內生的Ig基因已經為失去活性的小鼠內，是產生全人單株抗體(mAbs)於小鼠內的手段，其中小鼠為可以任何想要的抗原免疫接種的動物。使用全人抗體可最小化有時候藉由施以小鼠或小鼠衍生的mAbs給人類作為治療劑所造成的免疫性與過敏性的反應。
全人抗體可藉由免疫接種能夠產生在缺乏內生性免疫球蛋白的生產下，產生人類抗體集庫(repertoire)的基因轉殖動物(通常為小鼠)來產生。針對這個目的的抗原典型地具有六個或更多連續胺基酸，且選擇性地結合至載體，像是半抗原。參照，例如，Jakobovits，等人，1993年，美國國家科學院論文集(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：2551-2555；Jakobovits等人，1993年，自然期刊(Nature)，362：255-258；以及Bruggermann等人，1993，年度免疫學(Year in Immunol)，7：33。在此種方法的一個實施例裡，基因轉殖動物藉由癱瘓編碼 其中該小鼠之重和輕免疫球蛋白鏈的內生性小鼠免疫球蛋白基因座，且安插入含有編碼人類重和輕鏈蛋白的基因座的大片段人類基因體DNA至小鼠基因體而產生。部分修飾的動物，其具有小於人類免疫球蛋白基因座的全補體，接著被雜交以獲得具有所有想要的免疫系統修飾。當施以免疫原時，這些基因轉殖動物產生對免疫原免疫特異性的抗體但具有人類而非鼠類胺基酸序列，包括該可變區域。針對此種方法的細節，參閱，例如，WO96/33735與WO94/02602。關於製造人類抗體的基因轉殖小鼠的其他方法被描述在美國專利號5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299；以及5,545,806；在PCT公開號WO91/10741、WO90/04036、以及於歐洲專利546073B1、以及歐洲專利546073A1。
以上描述的基因轉殖小鼠，在本文被稱為「HuMab」小鼠，其含有編碼未重排的人類重([μ]及[γ])以及[κ]輕鏈免疫球蛋白序列的人類免疫球蛋白基因迷你基因座(minilocus)，加上去活化內生性[μ]和[κ]鏈基因座的標的突變(Lonberg，等人，1994年，自然期刊(Nature)，368：856-859)。因此，小鼠展現減少的小鼠IgM或[κ]的表現且對免疫接種反應，且引介的人類重和輕鏈轉殖基因經歷類別轉換以及體突變以產生高親和力人類IgG[κ]單株抗體(Lonberg，等人，同上；Lonberg及Huszar，1995年，國際免疫學評論(Intern.Rev.Immunol.)，13：65-93；Harding及Lonberg，1995年，紐約科學院年鑑(Ann.N.Y Acad.Sci.)，764：536-546)。HuMab小鼠的準備被詳細地描述在Taylor，等人，1992年，核酸研究期刊(Nucleic Acids Research)，20：6287-6295；Chen，等人，1993年，國際免疫學期刊(International Immunology)，5：647-656；Tuaillon，等人，1994年，免疫學期刊(J.Immunol.)，152：2912-2920；Lonberg，等人，1994年，自然期刊(Nature)，368：856-859；Lonberg，1994年，實驗藥理學手冊(Handbook of Exp.Pharmacology)，113：49-101；Taylor，等人，1994年，國際免疫學期刊6：579-591； Lonberg以及Huszar，1995年，國際免疫學評論(Intern.Rev.Immunol.)，13：65-93；Harding以及Lonberg，1995年，紐約科學院年鑑(Ann.N.Y Acad.Sci.)，764：536-546；Fishwild，等人，1996年，自然生物技術期刊(Nature Biotechnology)，14：845-851；上述文獻的全部內容因此藉由引用的方式出於全部目的併入本文。 參閱，進一步美國專利號5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；以及5,770,429；以及美國專利號5,545,807；國際申請號WO 93/1227；WO 92/22646；以及WO 92/03918，所有這些文獻的內容出於所有目的於此藉由引用併入在其全部內容。利用以在這些基因轉殖小鼠中生產人類抗體的技術也公開在WO 98/24893、以及Mendez，等人，1997年，自然遺傳學期刊(Nature Genetics)，15：146-156，其全文藉由引用併入於此。舉例來說，HCo7與HCo12基因轉殖小鼠品系可被使用以生產抗GITR抗體。關於使用基因轉殖小鼠生產人類抗體的進一步細節提供在以下的範例中。
使用融合瘤技術，具有想要的特異性的抗原特異性人類mAbs可被產生且從諸如那些以上描述的基因轉殖小鼠中挑選。這樣的抗體可使用合適的媒介體和宿主細胞被轉殖且表現，或是抗體可從培養的融合瘤細胞中收成。
全人抗體可衍生自噬菌體顯示庫(phage-display libraries)(如被揭露在Hoogenboom，等人，1991年，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)，227：381；以及Marks，等人，1991年，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)，222：581)。噬菌體顯示技術透過絲狀噬菌體的表面上抗體集庫的顯現，且藉由其結合至選定的抗原的噬菌體的後續挑選而模仿免疫挑選。一個這樣的技術被描述在PCT申請號WO 99/10494(藉由引用於此併入)。
表1包括像是本文所提供的數個全人抗原結合蛋白的序列資訊。
J. 雙特異性或雙功能抗原結合蛋白
所提供的抗原結合蛋白也包括包含如上述的一個或多個互補性決定區或一個或多個可變區之雙特異性和雙功能抗體。雙特異性或雙功能性抗體在某些情況裡是具有兩條不同重/輕鏈對和兩個不同結合位置的人工雜合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法包括，但不限於，融合瘤的融合或Fab’片段的連結而製造。參閱，例如Songsivilai以及Lachmann，1990，臨床&實驗免疫學期刊(Clin.Exp.Immunol.)，79：315-321；Kostelny，等人，1992年，免疫學期刊(J.Immunol.)，148：1547-1553。
K. 變異型
在一個實施例裡，舉例來說，抗原結合蛋白是以上揭露的抗原結合蛋白(例如，那些具有表列在表1中的序列)的變異型形式。例如，某些抗原結合蛋白於表列在表1的一個或多個重或輕鏈、可變區或互補性決定區裡具有一個或多個保守的胺基酸取代。
天然胺基酸可基於共同側鏈特性被區分類別：(1)疏水性的：正白胺酸(norleucine)、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)鹼性的：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向的殘基：：Gly、Pro；以及(6)芳香的：Trp、Tyr、Phe。
保守的胺基酸取代可涉及這些類別的一個的成員與相同類別的其他成員的交換。保守的胺基酸取代可包含非天然產生的胺基酸殘基，其典型地藉由化學肽合成而非藉由在生物系統中合成而引入。這些包括擬肽物及其他胺基酸部分的反轉或倒置形式。
非保守的取代可涉及上述類別的一個的成員對來自另一個類別的成員的交換。這樣的取代殘基可被引介進入同源於人類抗體的抗體的區域、或進入分子的非同源區域。
在進行這樣的變化時，根據一些實施例，胺基酸的親水指數(hydropathic index)可被考慮。蛋白質的親水輪廓(profile)透過指定各個胺基酸一數值(「親水指數」)來計算且接著重複地沿著肽鏈平均這些值。各個胺基酸基於其疏水性和電荷特徵被指定親水指數。其為：異白胺酸(isoleucine)(+4.5)；纈胺酸(valine)(+4.2)；白胺酸(leucine)(+3.8)；苯丙胺酸(phenylalanine)(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(cysteine/cystine)(+2.5)；甲硫胺酸(methionine)(+1.9)；丙胺酸(alanine)(+1.8)；甘胺酸(glycine)(-0.4)；蘇胺酸(threonine)(-0.7)；絲胺酸(serine)(-0.8)；色胺酸(tryptophan)(-0.9)；酪胺酸(tyrosine)(-1.3)；脯胺酸(proline)(-1.6)；組胺酸(histidine)(-3.2)；麩胺酸(glutamate)(-3.5)；麩醯胺酸(glutamine)(-3.5)；天門冬胺酸(aspartate)(-3.5)；天門冬醯胺(asparagines)(-3.5)；離胺酸(lysine)(-3.9)；以及精胺酸(arginine)(-4.5)。
在蛋白質上授予相互作用的生物功能的親水輪廓的重要性在所屬技術領域中是被理解的(參閱，Kyte，等人，1982年，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)，157：105-131)。已知的是一些胺基酸可取代其他具有相似的親水指數或分數的胺基酸，且仍維持相似的生物活性。在基於親水指數進行改變時，在特定實施例中，包括其親水指數在±2以內的胺基酸的取代。在某些態樣中，包括那些是在±1以內的，且在其他態樣中，包括那些±0.5以內的。
在所屬技術領域中也被理解的是，相似的胺基酸的取代可在親水性(hydrophilicity)之基礎上被有效率地進行，特別是其中從而創造的生物功能蛋白或胜肽是旨在用於免疫學實施例中的用途，就像在目前案例中。在特定實施 例中，蛋白質的最大局部平均親水性，如由其相鄰胺基酸的親水性所管轄的，與其免疫原性和抗原結合或免疫原性，即，與該蛋白質的生物性質相關。
下列親水性值已經被分配給這些胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天門冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天門冬醯酸(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)以及色胺酸(-3.4)。在基於相似的親水性值進行改變時，在特定實施例中，包括親水指數在±2以內的胺基酸的取代，在其他實施例中，包括那些是在±1以內的，且在又其他實施例中，包括那些±0.5以內的。在某些情形中，一種取代也可基於親水性，鑑定來自一級胺基酸序列的表位。這些區域也被稱為「表位核心區域(epitopic core region)」。
示例性保守的胺基酸取代被闡述於表2。
所屬領域技術人員使用公知的技術將能夠決定如同本文闡述的多肽之合適的變異型。所屬領域技術人員可藉由不被認為對於活性係重要的之標的區域，不摧毀活性地鑑定可被改變的分子的合適區域。所屬領域技術人員也將能夠鑑定在相似的多肽之間保守的分子的殘基及部分。在進一步實施例中，即使是可為對生物活性或結構是重要的區域可無摧毀生物活性或無不利的影響該多肽結構地受到保守的胺基酸取代。
更甚者，所屬領域技術人員可產生含有單一胺基酸取代在各個想要的胺基酸殘基的測試變異型。這些變異型可接著使用針對GITR抗原結合蛋白的測定法來篩選，(參閱以下範例)如此產生關於哪些胺基酸可被改變而哪些一定不能被改變的資訊。換句話說，基於從此些常規實驗中搜集的資訊，所屬領域技術人員可容易決定不論是單獨或與其他突變結合，胺基酸位置何處之進一步取代應當被避免。
數個科學發表已經致力於二級結構的預測。參閱Moult，1996年，生物技術當前觀點(Curr.Op.in Biotech.)，7：422-427；Chou，等人，1974年，生物化學期刊(Biochem.)，13：222-245；Chou，等人，1974年，生物化學期刊(Biochemistry)，113：211-222；Chou，等人，1978年，分子生物學的酵素學及相關領域進展期刊(Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.)，47：45-148；Chou，等人，1979年，生物化學年度評鑑(Ann.Rev.Biochem.)，47：251-276；以及Chou， 等人，1979年，生物物理學期刊(Biophys.J.)，26：367-384。更甚者，近來電腦程式可用於輔助預測二級結構。
在某些實施例裡，胺基酸取代造成：(1)減低對蛋白水解的敏感性，(2)減低對氧化反應的敏感性，(3)改變對形成蛋白複合物的結合親和力，(4)改變配體或抗原結合親和力，及/或(5)授予或修飾在這樣的多肽上之其他物理化學或功能性特質。舉例來說，單一或多個胺基酸取代(在特定實施例中，保守的胺基酸取代)可在天然序列中進行。取代可在形成分子間接觸的域外面的抗體的部分進行。在這樣的實施例中，保守的胺基酸取代可被使用而不實質上改變親代序列的結構特徵(例如，一個或多個替換胺基酸並不阻斷賦予親代或天然抗原結合蛋白特徵的二級結構)。所屬領域普通技術人員所知悉的多肽二級和三級結構被描述在《蛋白質、結構與分子原則》(Proteins,Structures and Molecular Principles)中，(Creighton，編著)，1984年，W.H.紐約：佛里曼與公司(Freeman and Company)；《蛋白質結構介紹》(Introduction to Protein Structure)(Branden與Tooze，編著)，1991年，紐約：Garland出版社(Garland Publishing)；以及Thornton等人，1991年，自然期刊(Nature)，354：105，其每篇內容藉由引用於此併入。
其他優選抗體變異型包括半胱胺酸變異型，其中在親代或天然胺酸序列中的一個或多個半胱胺酸殘基被消除或是以另一個胺基酸(例如，絲胺酸)取代。半胱胺酸變異型是有用的，特別是當抗體必須被重新折疊成生物性功能構型時。半胱胺酸變異型可具有較少於天然抗體的半胱胺酸殘基，且通常具有偶數個以最小化未配對半胱胺酸所導致的交互作用。
所揭露的重與輕鏈、可變區域和互補性決定區可被使用於製備含有可特異地結合至GITR的抗源結合區域的多肽。舉例來說，表列於表1中的一個或多個互補性決定區可被共價地或非共價地合併進入分子(例如，多肽)以造成免疫黏附(immunoadhesion)。免疫黏附可併入互補性決定區作為較大多肽鏈的一部 分，可共價地結合互補性決定區至另一個多肽鏈，或可非共價地合併互補性決定區。互補性決定區能夠使免疫黏附特異性地結合至特定的有興趣的抗原(例如，GITR多肽或其表位)。
L. 模擬物
也提供基於本文所描述的可變區域域和互補性決定區的模擬物(例如，「胜肽模擬物(peptide mimetics)」或「擬肽物(peptidomimetics)」)。這些類似物可為胜肽、非胜肽或胜肽和非胜肽區的組合。Fauchere，1986年，藥物研究進展期刊(Adv.Drug Res.)，15：29：Veber與Freidinger，1985年，TINS，頁次392；以及Evans，等人，1987年，藥物化學期刊(J.Med.Chem.)，30：1229，其用於任何目的於此藉由參考而併入。結構相似於治療有用的胜肽的胜肽模擬物可被使用於產生相似的治療或預防效應。這樣的化合物通常伴與電腦分子模型的幫助來發展。通常，擬肽物是結構上相似於展示想要的生物活性的抗體的蛋白質，像這裡是能夠特異性地結合GITR者，但具有藉由在所屬技術領域內公知的方法，選擇性地被選自-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式與反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、以及-CH2SO-的鍵聯替換的一個或多個胜肽鍵聯。以相同類型的D-胺基酸的共通序列之一個或多個胺基酸的系統分類取代(例如，D-離胺酸取代L-離胺酸)可被使用在特定的實施例中，以產生更多穩定的蛋白質。另外，可由所屬技術領域技術人員公知的方法來產生包含共通序列或大致上相同的共通序列變異的約束胜肽(constrained peptide)(Rizo與Gierasch，1992年，生物化學年度評鑑(Ann.Rev.Biochem.)，61：387)，藉由參考併入本文，舉例來說，藉由添加能夠形成環化該胜肽的分子內雙硫鍵的內生的半胱胺酸殘基。
M. 衍生物
本文所描述的抗原結合蛋白的衍生物也被提供。衍生的抗原結合蛋白可包含傳授想要的特質給抗體或片段之任何分子或受質，像是增加特定使用中的半衰期。衍生的抗原結合蛋白可包含，例如，可偵測的(或標記的)部分(例如，放射性的、比色的、抗原的或酵素的分子)、可偵測的珠子(像是磁性的或電緻密(electrodense)的(例如，金珠))、或結合至另一個分子的分子(例如，生物素(biotin)或是鏈霉親和素(streptavidin))、治療的或診斷的部分(例如，放射性的、細胞毒的、或藥學上活性本體)、或增加針對特定用途的抗原結合蛋白的合適性的分子(例如，給藥至主體、像是人類主體、或其他體內或體外用途)。可被使用以衍生抗原結合蛋白的分子範例包括白蛋白(albumin)(例如，人類血清白蛋白)以及聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。抗原結合蛋白的白蛋白鏈結的以及聚乙二醇化(PEGylated)的衍生物可使用在所屬技術領域中公知的技術來製備。一些的抗原結合蛋白包括如本文描述的聚乙二醇化單鏈多肽。在一個實施例中，抗原結合蛋白被共軛或是另外連結至轉甲狀腺素(transthyretin，TTR)、或TTR變異型。TTR或TTR變異型可被以例如從由聚葡糖(dextran)、聚(n-乙烯吡咯啶酮)poly(n-vinyl pyrrolidone)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、丙二醇同元聚合物(propropylene glycol homopolymers)、聚環氧丙烷/環乙烷共聚物(polypropylene oxide/ethylene oxide co-polymers)、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyols)以及聚乙烯醇(polyvinyl alcohols)組成的群體中挑選的化學藥品化學地修飾。
其他衍生物包括GITR抗原結合蛋白與其他蛋白或多肽的共價物或聚集共軛物，像是藉由包含融合至GITR抗原結合蛋白的N-端或C-端的異位多肽的重組融合蛋白之表現。舉例來說，共軛胜肽可為異位的訊號(或前導)多肽，例如，酵母α-因子前導物、或胜肽，像是表位標籤。含有GITR抗原結合蛋白的融合蛋白可包含添加以促進GITR抗原結合蛋白的純化或鑑定的胜肽(例如，多-His(poly-His))。GITR抗原結合蛋白也可連接至FLAG胜肽，如描述在Hopp，等 人，1988年，生物/技術期刊(Bio/Technology)，6：1204；以及美國專利號5,011,912。FLAG胜肽是高度抗原的且提供一表位，其可逆地被特異的單株抗體(mAb)結合，使表現的重組蛋白能夠快速測定且靈巧的純化。其中融合FLAG胜肽至給定的多肽之用於製備融合蛋白的試劑，是市售的(西格瑪(Sigma)，St.Louis，MO)。
N. 寡聚體(Oligomers)
含有一個或多個GITR抗原結合蛋白的寡聚體可做為GITR促效劑來使用。寡聚體可為共價地連結或非共價地連接的二聚體、三聚體、或更高的寡聚體的形式。在一實施例中，包含兩個或更多GITR抗原結合蛋白的寡聚體被提供，以一同二聚體(homodimer)的範例。其他寡聚體包括異二聚體(heterodimer)、同型三聚體(homotrimer)、異三聚體(heterotrimer)、同四聚體(homotetramer)、異四聚體(heterotetramer)以及其類似物。
一個實施例是涉及含有透過融合至GITR抗原結合蛋白的胜肽部分之間的共價或非共價的交互作用而連結的多GITR結合多肽。這樣的胜肽可為胜肽聯結物(間隔物)、或具有促進低聚合作用(oligomerization)特質的胜肽。白胺酸拉鍊(leucine zipper)以及衍生自抗體的一些多肽，是在能夠促進其附著的GITR抗原結合蛋白的低聚合作用的胜肽之間，如以下更詳細的描述。
在特定實施例中，寡聚體包含二至四個GITR抗原結合蛋白。寡聚體的GITR抗原結合蛋白部分可為在上述描述的任意形式地，例如，變異型或片段。優選地，寡聚體包含具有促效劑活性的GITR抗原結合蛋白。
在一個實施例中，寡聚體是使用衍生自免疫球蛋白的多肽來製備。包含融合至抗體衍生的多肽之不同部分的一些異種的多肽的融合蛋白質的製備已經描述於，例如，Ashkenazi，等人，1991年，美國國家科學院論文集(Proc. Natl.Acad.Sci.USA)，88：10535；Byrn，等人，1990年，自然期刊(Nature)，344：677；以及Hollenbaugh，等人，1992年，〈免疫球蛋白融合蛋白的構建〉"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins"，於免疫學的當前程序(Current Protocols in Immunology)，補充資料4，頁次10.19.1-10.19.11中。
一個實施例是針對含有藉由融合GITR抗原結合蛋白至抗體的Fc區域創造之兩個融合蛋白的二聚體。二聚體可藉由，例如，插入編碼融合蛋白的基因融合進入合適的表現媒介體中，以重組表現媒介體在轉形的宿主細胞內表現該基因融合，且允許表現的融合蛋白裝配的很像抗體分子，於是內鍵雙硫鍵在Fc本體之間形成以產生二聚體。
本文所使用的用語「Fc多肽(Fc polypeptide)」包括從抗體的Fc區域衍生的多肽的自然與突變蛋白形式。含有促進二聚作用的樞紐區域的這樣的多肽的截斷形式也被包括。包含Fc部分的融合蛋白(以及自其形成的寡聚體)提供藉由親和力層析儀在蛋白A柱或蛋白G柱(Protein A or Protein G column)促進純化的優勢。
一個合適的Fc多肽，被描述在PCT申請WO 93/10151以及美國專利號5,426,048以及5,262,522，是從人類IgG1抗體的Fc區域的N-端樞紐區域延伸至天然C-端的單鏈多肽。另一個有用的Fc多肽是描述在美國專利號5,457,035以及Baum，等人，1994年，歐洲分子生物學組織期刊(EMBO J.)，13：3992-4001中的Fc突變蛋白。這個突變蛋白的胺基酸序列是相同於那個發表在WO 93/10151的天然Fc序列，除了第19個胺基酸已經從Leu被改變成Ala、第20個胺基酸已經從Leu被變成Glu、第22個胺基酸已經從Gly被變成Ala。突變蛋白對Fc受體展現降低的親和性。
或者，寡聚體是包含多GITR抗原結合蛋白的融合蛋白，其具有或沒有胜肽聯結物(間隔物胜肽)。在所有合適的胜肽聯結物之間的是那些被描述在美國專利號4,751,180以及4,935,233者。
用於製備寡聚體的GITR抗原結合蛋白衍生物的另一個方法涉及白胺酸拉鏈的使用。白胺酸拉鏈域是促進在其中他們被發現的蛋白質的低聚合作用的胜肽。白胺酸拉鏈最初是在幾個DNA結合蛋白中被鑑定(Landschulz，等人，1988年，科學期刊(Science)，240：1759)，以及已經在多種不同的蛋白質中被發現。所有已知的白胺酸拉鏈是天然胜肽及其二聚化或三聚化的衍生物。適合用於產生可溶性寡聚體的蛋白質的白胺酸拉鍊域之範例被描述在PCT申請案WO 94/10308中，且衍生自肺界面活性劑蛋白質D(surfactant protein D，SPD)的白胺酸拉鏈被描述在Hoppe，等人，1994年，歐洲生物化學學會聯盟通訊(FEBS Letters)，344：191，於此透過引用併入。修飾的白胺酸拉鏈的使用允許與之融合的異種的蛋白質的穩定三聚化，被描述在Fanslow，等人，1994年，免疫學研討會期刊(Semin.Immunol.)，6：267-278，中。在一種方式中，重組融合蛋白，其包含GITR抗原結合蛋白片段或融合至白胺酸拉鍊胜肽的衍生物，是表現於合適的宿主細胞中，且可溶的寡聚體GITR抗原結合蛋白片段或形成的衍生物是從培養基上清液回收。
O. GITR抗原結合蛋白的物種交互反應性
在一個實施例中，GITR抗原結合蛋白(例如，有著那些如表1中描述的序列)結合人類GITR蛋白(SEQ ID NO：1)但不結合小鼠GITR(SEQ ID NO：3)。在另一個實施例中，GITR抗原結合蛋白結合人類GITR蛋白(SEQ ID NO：1)以及食蟹獼猴GITR蛋白(SEQ ID NO：2)。在仍另一個實施例中，GITR抗原結合 蛋白結合人類GITR(SEQ ID NO：1)以及食蟹獼猴GITR(SEQ ID NO：2)但不結合小鼠GITR(SEQ ID NO：3)。
在多種實施例中，GITR抗原結合蛋白以小於1、2、5、10、20或50nM的KD結合人類GITR蛋白(例如，SEQ ID NO：1)，且以小於50、100、150、200、300、400、500、600或700nM的KD結合至食蟹獼猴GITR蛋白(例如，SEQ ID NO：2)。在一個態樣裡，藉由，例如，BiaCore，判定結合至人類和食蟹獼猴GITR。
P. GITR抗原結合蛋白的醣苷化狀態
抗原結合蛋白可具有醣苷化模式，其為異於或選自那些在天然物種中發現的模式。如所屬領域技術人員已知的，醣苷化模式可取決於序列和蛋白質兩者(例如，特定的醣苷化胺基酸殘基的存在或缺乏，描述於下)，或其中產生蛋白質之宿主細胞或生物體。以下描述特定的表現系統。
多肽的醣苷化典型地為N-聯結(N-linked)的或O-聯結(O-linked)中的其一。N-聯結指稱醣類部分對天冬醯胺酸殘基的側鏈的附著。其中X是任何胺基酸除了脯胺酸之三胜肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸以及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸，是用於醣類部分對天冬醯胺酸側鏈的酵素的附著的辨識序列。如此，無論是在多肽中這些三胜肽序列的存在創造了潛在的醣苷化位置。O-聯結的醣苷化指糖類N-乙醯半乳胺糖(N-acetylgalactosamine)、半乳糖(galactose)、或木糖(xylose)的一個對羥基胺基酸(hydroxyamino acid)的附著，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，儘管5-羥脯胺酸(5-hydroxyproline)或5-羥離胺酸(5-hydroxylysine)也可被使用。
醣苷化位置對抗原結合蛋白的附加是，藉由改變胺基酸序列而簡易地完成，使其含有一個或多個上述三胜肽序列(用於N-聯結醣苷化位置)。改 變也可藉由一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基對起始序列(針對O-聯結醣苷化位置)的添加、或取代來進行。為了方便，抗原結合蛋白胺基酸序列可透過在DNA層級的變化來改變，特別是藉由在預選鹼基突變編碼標的多肽的DNA，使得產生將轉譯出想要的胺基酸的密碼子。
增加在抗原結合蛋白上醣類部分的數量的另一種方法是藉由醣苷對蛋白質的化學或酵素耦合。這些程序的優勢在於，其在它們不需要在具有針對N-及O-聯結醣苷化的醣苷化能力的宿主細胞內之蛋白質的生產。取決於所使用的耦合模式，糖可被附著至(a)精胺酸及組胺酸，(b)自由羧基，(c)自由硫氫基，像是半胱胺酸的那些，(d)自由羥基，像是絲胺酸、蘇胺酸、或羥補胺酸的那些，(e)芳香殘基，像是苯丙胺酸、酪胺酸、或色胺酸的那些，或(f)麩醯胺酸的醯胺基。這些方法被描述在WO 87/05330，公開於1987年9月11日，以及於Aplin與Wriston，1981年，生物化學與分子生物學的關鍵評測(CRC Crit.Rev,Biochem.)，頁次，259-306。
展現在起始抗原結合蛋白上的醣類部分的移除可化學地或酵素地完成。化學去醣苷化(deglycosylation)需將要蛋白質的暴露於化合物三氟甲磺酸(trifluoromethanesulfonic acid)，或是當量化合物。此處理導致除了連鎖糖(N-乙醯葡萄胺糖(N-acetylglucosamine)或N-乙醯半乳胺糖(N-acetylgalactosamine)之外，大部分或全部糖類的裂解，而保持多肽完整。化學的去醣苷化被描述在Hakimuddin，等人，1987年，生物化學與生物物理檔案(Arch.Biochem.Biophys.)，259：52以及被Edge，等人，1981年，分析生物化學期刊(Anal.Biochem.)，118：131。在多肽上的醣類部分的酵素裂解可藉由多種內生與外生醣苷酶的使用來達成，如被Thotakura，等人，1987年，酵素學方法(Meth.Enzymol.)，138：350描述的。在潛在的醣苷化位置的醣苷化可藉由化合物衣黴素(tunicamycin)的使用來 防止，如被Duskin，等人，1982年，生物化學期刊(J.Biol.Chem.)，257：3105描述的。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷聯鎖的形成。
因此，態樣包括抗原結合蛋白的醣苷化變異型，其中醣苷化位置的數目及/或類型相比於親代多肽的胺基酸序列已經被改變。在特定實施例中，抗體蛋白變異型比起天然抗體，包含較大或較少N-聯結醣苷化位置的數目。N-聯結的醣苷化位置藉由序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr賦予特徵，其中稱為X的胺基酸殘基，可為除了脯胺酸以外的任何胺基酸殘基。胺基酸殘基的取代為創造此序列提供用於N-聯結的碳水化合物鏈的添加之潛在的新位置。或者，消除或是改變這序列的取代，將防止存在在天然多肽中的N-聯結碳水化合物鏈的添加。舉例來說，醣苷化可藉由Asn的消除或藉由用不同的胺基酸來取代Asn來被降低。在其他實施例中，一個或多個新的N-聯結位置被創造。抗體典型地在Fc區域內具有N-聯結的醣苷化位置。
如在範例中描述的，發現一些GITR抗原結合蛋白的醣苷化狀態可為影響蛋白質的促效劑活性的重要因子。特別是，發現抗原結合蛋白於被醣苷化時具有增進的活性。因此，在某些實施例中，抗原結合蛋白是抗體，在其中恆定區是IgG1，像是免疫球蛋白具有允許用於結合至Fc受體(FcR)的醣苷化狀態。在細胞表面上抗體對Fc受體的結合觸發多種生物反應，包括內化與胞吞抗體外披的顆粒的後續破壞、免疫複合物的淨空、被殺手細胞溶解之抗體外披的標的細胞(被稱為抗體依賴性細胞中介細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)之過程，或簡稱ADCC)、免疫球蛋白生產的控制及炎症介質的釋放。如在實施例中所表現的，被抗原結合蛋白結合的FcR導致蛋白質的更大叢簇，其反而被發現導致改善的促效劑活性。此發現相反於建議使用具有降低的作用物功能及/或醣苷化的GITR抗體維持促效劑活性的一些報告。
Q. 具有標記之抗原結合蛋白及作用物群體
在某些實施例中，抗原結合蛋白包含一個或更多標記。用語「標記群體」或「標記」表示任何可偵測的標記。標記群體的合適範例包括，但不限於，下列：放射性同位素或放射性核種(radionuclide)(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光群體(例如，FITC、鹼性蕊香紅(rhodamine)、鑭系磷光體(lanthanide phosphor)、酵素群體(例如，山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、螢光素酶(luciferase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase))、化學發光群體(chemiluminescent groups)、生物素群體(biotinyl groups)、或藉由二級報導者(reporter)辨識的預定多肽表位(例如，白胺酸拉鏈對序列、二級抗體的結合位置、金屬結合域、表位標籤)。在某些實施例中，標記群體是透過各種長度的間隔物臂耦合至抗原結合蛋白以減低潛在的立體阻礙。用於標記蛋白的各種方法是所屬技術領域已知的，且於被認為是合適的時候使用。
用語「作用物群體(effector group)」表示任何耦合至抗原結合蛋白的群體，其用作為細胞毒性劑。合適的作用物群體的範例是放射性同位素或放射性核種(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其他合適的群體包括毒素、治療群體、或化學治療群體。合適群體的範例包括卡奇黴素(calicheamicin)、奧里斯他丁(auristatins)、格爾德黴素(geldanamycin)以及美登素(maytansine)。在某些實施例中，作用物群體是透過各種長度的間隔物臂耦合至抗原結合蛋白以減低潛在的立體阻礙。
在一般情況下，標記落入各種類別，這取決於它們要被檢測的分析：(a)同位素標記，其可為放射性的或重同位素；(b)磁性標記(例如，磁性顆粒；(c)氧化還原反應活性部分；(d)螢光增白染料(optical dye)；(e)酵素群體(例如，山葵過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；(f)生物素化群體； 以及(g)藉由二級報導者辨識的預定多肽表位(例如，白胺酸拉鏈對序列、二級抗體的結合位置、金屬結合域、表位標籤等)。在某些實施例中，標記群體是透過各種長度的間隔物臂耦合至抗原結合蛋白以減低潛在的立體阻礙。用於標記蛋白的各種方法是所屬技術領域已知的。
具體的標記包括螢光增白染料，其包括，但不限於，發色基(chromophore)、磷光體、螢光團(fluorophore)，而後者在許多情況中是特異性的。螢光團可為「小分子」螢光(fluores)或是蛋白質的螢光(proteinaceous fluores)中之其一。
藉著「螢光標記(fluorescent label)」是表示任何分子可透過固有的螢光特質而被偵測到。合適的螢光標記包括，但不限於，螢光素(fluorescein)、鹼性蕊香紅、四甲基鹼性蕊香紅(tetramethylrhodamine)、曙紅(eosin)、紅螢素(erythrosine)、香豆素(coumarin)、甲基-香豆素(methyl-coumarins)、芘(pyrene)、孔雀石綠(Malacite green)、茋(stilbene)、螢光黃(Lucifer Yellow)、Cascade® Blue、Texas Red®、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon Green®、Alexa-Fluor®染料系列(Alexa Fluor® 350、Alexa Fluor® 430、Alexa Fluor® 488、Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 568、Alexa Fluor® 594、Alexa Fluor® 633、Alexa Fluor® 660、Alexa Fluor® 680)、Cascade Blue、Cascade® Yellow以及R-藻紅素(R-phycoerythrin，PE)(分子探針公司(Molecular Probes)，Eugene，俄勒岡州)、FITC、鹼性蕊香紅、以及Texas Red(Pierce公司，Rockford，伊利諾州)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，賓州)。合適的光學染料，包括螢光團，其被描述在Richard P.Haugland撰寫之〈分子探針手冊〉(Molecular Probes Handbook)中，其於此透過引用明確地併入。
合適的蛋白質螢光標記也包括，但不限於，綠色螢光蛋白，其包括Renilla、Ptilosarcus、或GFP的水母物種(Chalfie，等人，1994，科學期刊 (Science)，263：802-805)、EGFP(Clontech Labs.公司，基因銀行寄存號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP，量子生物科技公司(Quantum Biotechnologies,Inc.)，魁北克，加拿大；Stauber，1998年，生物技術期刊(Biotechniques)，24：462-471；Heim，等人，1996年，當代生物學期刊(Curr.Biol.)，6：178-182)、強化的黃色螢光蛋白(EYFP，Clontech Labs.公司)、螢光素酶(Ichiki，等人，1993年，免疫學期刊(J.Immunol.)，150：5408-5417)、β-半乳糖苷酶(Nolan，等人，1988年，美國國家科學院論文集(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，85：2603-2607)以及Renilla(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利號5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。
III. 編碼GITR抗原結合蛋白的核酸
用於編碼於此描述之抗原結合蛋白的核酸，或其部分，也被提供，其包含編碼抗體的一的或兩鏈的核酸、或片段、衍生物、突變蛋白、或其變異型、編碼重鏈可變區或僅互補性決定區的多核苷酸、足以用作為雜合探針的多核苷酸、用於鑑定、分析、使突變或放大編碼多肽的多核苷酸的PCR引子或定序引子、用於抑制多核苷酸的表現的反義核酸、以及上述的互補序列。核酸可為任何長度。它們可為，例如，5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、75個、100個、125個、150個、175個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、750個、1,000個、1,500個、3,000個、5,000個或更多個核苷酸長度，及/或可包含一個或更多其他序列，例如，調控序列，及/或較大核酸的部分，例如，媒介體。核酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核苷酸，以及其人造變異型(例如，胜肽核酸)。表3顯示編碼IgG1重鏈恆定區以及IgG1κ與λ輕鏈恆定區的示例性核酸序列。任何本文提供的可變區可被 附著於那些恆定區以形成完整重與輕鏈序列。然而，應當理解的是，這些恆定區序列僅被提供作為特定的範例。在某些實施例中，可變區序列被結合至其他恆定區序列，在所屬技術領域中為公知的。編碼重及輕鏈可變區的示例性核酸序列被提供在表3及表4。
表4提供編碼抗原結合蛋白之重鏈及輕鏈可變域的示例性核酸序列的總結；這些序列也編碼被包含在可變域中的多種CDRH1、CDRH2、CDRH3、 CDRL1、CDRL2以及CDRL3序列。如此，在一個實施例中，提供被下列核酸編碼的抗原結合蛋白。
編碼特定抗原結合蛋白的核酸，或其部分(例如，全長抗體、重或輕鏈、可變域、或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、或CDRL3)可從已經以GITR或其免疫原片段賦予免疫性之小鼠的B細胞中分離。核酸可藉由常規程序，諸如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)來分離。噬菌體顯示是已知技術的另一個範例，從而可製備抗體的衍生物及其他抗原結合蛋白。在一個方法中，為感興趣的抗原結合蛋白的組件的多肽，是表現在任何合適的重組表現系統中，且表現的多肽是被允許整合以形成抗原結合蛋白。
提供在表3及表4的核酸只是示例性。由於遺傳密碼的簡併(degeneracy)，表列在表3及表4內的多肽序列的每個或本文另有描述的也被大數目的除了那些提供的之外之其他核酸序列編碼。
一態樣進一步提供在特定雜合條件下雜合至其他核酸之核酸(例如，包含表列於表3及表4中的核苷酸序列的核酸)。用於雜合核酸的方法在所屬技術領域中是公知的。參閱，例如，分子生物學的當代協議(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，紐約(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定義的，適度地嚴格雜合條件使用含有5x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)的預洗溶液、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)、約50%甲醯胺的雜合緩衝液、6x SSC、以及55℃的雜合溫度(或其他相似雜合溶液，像是含有約50%甲醯胺者，與42℃的雜合溫度)、以及60℃的洗滌條件，於0.5x SSC，0.1% SDS內。嚴格雜合條件雜合於6x SSC，在45℃，隨後跟隨著一次或多次在0.1x SSC，0.2% SDS中於68℃洗滌。此外，所屬領域技術人員可操縱雜合及/或洗滌條件以增加或減少雜合的嚴格度，使得包含至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%彼此相同的核苷酸序列的核酸，典型地維持對彼此的雜合。
影響雜合條件的選擇以及用於區分合適條件的導引的基本參數是藉由，例如，Sambrook、Fritsch、以及Maniatis(2001年，《分子選殖：實驗室手冊》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版，冷泉港實驗室，紐約，如前述；以及分子生物學的當代協議(Current Protocols in Molecular Biology)，1995年，Ausubel，等人，編著，John Wiley & Sons公司，章節2.10以及6.3-6.4)闡述，且可在，例如，核酸的長度及/或鹼基組成的基礎上，被所屬領域技術人員容易地決定。
改變可藉由突變而引介入核酸內，因而導致其編碼之多肽的胺基酸序列的變化(例如，抗體或抗體衍生物)。突變可使用任何所屬技術領域已知的技術來引介。在一個實施例中，一個或多個特定胺基酸殘基使用，舉例來說，定點突變(site-directed mutagenesis)方法改變。在另一個實施例中，一個或多個隨 機挑選的殘基使用，舉例來說，隨機突變方法改變。然而，其造成一個突變多肽可被表現並針對期望的屬性篩選。
突變可被引介進入到核酸內而不顯著改變其編碼的多肽的生物活性。舉例來說，其可使導致在非必需胺基酸殘基上的胺基酸取代的核苷酸取代。或者，一個或多個突變可被引介進入到選擇性地改變其編碼的多肽的生物活性之核酸。舉例來說，突變可定量或定性地改變生物活性。定量變化的範例包括增加、減少或消除活性。定性變化的範例包括改變的抗體的抗原特異性。 在一個實施例中，編碼本文所述的任何抗原結合蛋白的核酸可使用所屬技術領域中被公認的分子生物學技術突變以改變胺基酸序列。
另一個態樣提供合適於作為核酸序列偵測的引子或雜合探針之核酸分子。核酸分子可僅包含編碼全長多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探針或引子的片段，或編碼多肽的活性部分(例如，GITR結合部分)的片段。
基於核酸的序列的探針可被使用於偵測核酸或相似的核酸，例如，編碼多肽的轉錄本。探針可包含標記群體，例如，放射性同位素、螢光化合物、酵素或酵素輔因子。這樣的探針可被使用於鑑定表現該多肽的細胞。
另一個態樣提供媒介體，其包含編碼多肽或其部分(例如，含有一個或多個互補性決定區或一個或多個可變區域域的片段)的核酸。媒介體的範例包括，但不限於，質體、病毒媒介體，非游離型(non-episomal)哺乳動物媒介體以及表現媒介體，例如，重組表現媒介體。重組表現媒介體可包含核酸於適合該核酸在宿主細胞中表現的形式。重組表現媒介體包括一種或多種調控序列，其於宿主細胞的基礎上選擇以用於(基因)表現，其可操作地連結至核酸序列以被表現。調控序列包括那些在許多宿主細胞的類型中，直接構成核苷酸序列的表現的序列(例如，SV40早期基因強化子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子及細胞巨大病毒(cytomegalovirus)啟動子)、那些僅在特定宿主細胞中核苷酸序 列的直接表現(例如，組織特異性調控序列(tissue-specific regulatory sequences)，參閱，Voss，等人，1986年，生物化學科學趨勢(Trends Biochem.Sci.)，11：287；Maniatis，等人，1987年，科學期刊(Science)，236：1237)、以及那些在響應於特定治療或病症中可誘導的核苷酸序列的直接表現(例如，在哺乳動物細胞中之金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子以及在原核和真核系統兩者中之TET響應(tet-responsive)及/或鏈黴素(streptomycin)響應啟動子)。表現媒介體的設計可取決於這樣的因素，如宿主細胞的選擇以被轉形以及所需蛋白質的表現量。表現媒介體可被引介進入宿主細胞，從而產生蛋白質或胜肽，其包括融合蛋白或胜肽，其由如本文所述的核酸來編碼。
另一個態樣提供重組表現媒介體被引介入其中之宿主細胞。宿主細胞可為任何原核細胞(例如，大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如，酵母、昆蟲或哺乳動物細胞(例如，CHO細胞))。媒介體DNA可透過常規轉形作用或轉染作用(transfection)技術被引介到原核或真核細胞。對於哺乳動物細胞的穩定轉染作用，已知的是，根據所用的表現媒介體和轉染技術，只有一小部分的細胞可整合外來DNA到它們的基因體中。為了鑑定並挑選這些整合體，編碼可篩選標記(selectable marker)的基因(例如，用於對抗生素的抗性)通常連同感興趣的基因一起被引介進入到宿主細胞。優選的可篩選標記包括那些賦予對藥物的抗性的可篩選標記，例如G418、潮黴素(hygromycin)和胺甲喋呤(methotrexate)。在所有其他方法中，以引介入的核酸穩定地轉染的細胞可藉由藥物選擇來鑑定(例如，已併入可篩選標記基因的細胞將存活，而其他細胞死亡)。
IV. 製備GITR抗原結合蛋白
所提供的非人類抗體可為，舉例來說，源自從任何產生抗體的動物，諸如，如小鼠、大鼠、兔、山羊、驢、或非人靈長類(像是猴(例如食蟹獼猴 或恒河猴(rhesus monkey))或猿(如，黑猩猩))。非人類抗體可用於，例如，在體外細胞培養以及基於細胞培養的應用、或其中免疫響應對於抗體不會發生或不顯著的情形，可被防止、是無關緊要、或者是期望的之任何其他應用。在某些實施例中，抗體可藉由以全長GITR或其片段免疫接種來製備。或者，一些非人類抗體可藉由以胺基酸免疫接種而被提升，其是形成本文中提供的一些抗體結合至其表位的部分的GITR的節段(segment)。所述抗體可為多株的、單株的、或者可藉由表現重組DNA來合成於宿主細胞中。
全人抗體可如上述的藉由免疫接種含有人類免疫球蛋白基因座的基因轉殖動物，或藉由選擇表現人類抗體的集庫的噬菌體顯示庫而製備。
單株抗體(mAbs)可藉由多種技術來生產，包括常規的單株抗體方法，例如，Kohler以及Milstein，1975年，自然期刊(Nature)，256：495的標準體細胞雜合技術。或者，可採用其他用於產生單株抗體的技術，例如，B-淋巴球的病毒或致癌的轉形作用。用於製備融合瘤的合適動物系統是鼠類系統，其為非常完善的程序。分離用於融合之免疫化脾細胞的免疫接種方案和技術是所屬技術領域已知的。對於這樣的過程，來自免疫化的小鼠的B細胞與合適的無限增殖的融合配偶融合，例如鼠類骨髓瘤細胞株。如果需要的話，大鼠或其他哺乳動物而非小鼠，和來自這樣的動物的B細胞可與鼠類骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤。或者，來自除了小鼠以外的來源的骨髓瘤細胞株可被使用。用於製備融合瘤的融合程序也是眾所周知的。
所提供的單鏈抗體可藉由透過胺基酸橋(短胜肽連接物)聯結重與輕鏈可變域(Fv區域)片段來形成，造成單一多胜肽鏈。這樣的單鏈Fvs(scFvs)可藉由融合編碼在編碼兩條可變域多肽(VL及VH)的DNA之間的胜肽連接物的DNA來製備。結果多肽可折疊回其本身已形成抗原結合單體，或是他們能形成多聚體(例如，二聚體、三聚體、或四聚體)，取決於在兩條可變域之間的可撓性連結 物的長度(Kortt，等人，1997年，蛋白質工程設計與選型期刊(Prot.Eng.)，10：423；Kortt，等人，2001年，生物分子工程期刊(Biomol.Eng.)，18：95-108)。藉由組合不同的含有-VL及VH的多肽，其可形成結合至不同表位的多聚體的scFvs(Kriangkum，等人，2001年，生物分子工程期刊(Biomol.Eng.)，18：31-40)。 所發展之用於單鏈抗體的生產的技術包括那些描述在美國專利號4,946,778；Bird，1988年，科學期刊(Science)，242：423；Huston，等人，1988年，美國國家科學院論文集(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，85：5879；Ward，等人，1989年，自然期刊(Nature)，334：544，de Graaf，等人，2002年，分子生物學的方法(Methods Mol Biol.)，178：379-387。本文提供的衍生自抗體的單鏈抗體包括，但不限於包含如表1中指明的重與輕鏈可變區組合的可變域的scFvs，或包括表1中指明的互補性決定區輕及重鏈可變域的組合。
本文所提供的抗體是可藉由使用子類交換方法(subclass switching methods)被改變成來自不同的子類的抗體的一個子類的抗體。因此，例如，IgG抗體可以從IgM的抗體衍生，反之亦然。這樣的技術允許具有抗原結合給定抗體(親本抗體)的性質的新的抗體的製備方法，而且亦表現出與不同於親本抗體之抗體同種型或亞類相關聯的生物學性質。也可以使用重組DNA技術。編碼特定抗體多肽之複製的DNA可以用在這樣的程序，例如，編碼所需同種型的抗體的恆定域之DNA。
因此，所提供的抗體包括那些包含，舉例來說，所描述的可變域、以上、具有想要的同型(舉例來說，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、以及IgD)還有其Fab或F(ab’)2片段之組合。甚至，若IgG4是想要的，其也可被期望在樞紐區域引介點突變(CPSCP(SEQ ID NO：448)→CPPCP(SEQ ID NO：449))如描述於Bloom，等人，1997年，蛋白質科學期刊(Protein Science)，6：407，其於此 藉由參考併入，以緩和形成可在IgG4抗體內導致異質性的內-H鏈雙硫鍵結的趨勢。
更甚，用於衍生具有不同特質之抗體(即，對於他們所結合至的抗原的不同之親和力)的技術也是已知的。一種這樣的技術，被稱為鏈洗牌(chain shuffling)，涉及顯示在絲狀噬菌體的表面上之免疫球蛋白可變域基因集庫，通常被稱為噬菌體顯示。鏈洗牌已經被使用於製備對半抗原2-苯基唑啉-5-酮(2-phenyloxazol-5-one)高親和力的抗體，如被Marks，等人，1992年，生物科技期刊(BioTechnology)，10：779，所描述的。
保守的修飾可對描述在表1內的重及輕鏈可變區進行，或是對描述在表1內的互補性決定區(以及對該編碼的核酸進行相應的修飾)進行以產生具有功能性及生物化學性特徵的GITR抗原結合蛋白。用於達成這樣修飾的方法為上述。
GITR抗原結合蛋白可以多種方式進一步修飾。舉例來說，若其被使用於治療的目的，他們可與聚乙二醇(聚乙二醇化)結合以延長血清半衰期或以強化蛋白質傳遞。另外，主體抗體的V區或其片段可與不同抗體分子的Fc區域融合。針對此目的所使用的Fc區域可被修飾，以使得其非互補結合，如此當融合蛋白質被使用作為治療劑時，減低在病患中誘導細胞溶解的可能性。另外，主體抗體或其功能性片段可與人類血清白蛋白共軛以強化抗體或其片段的血清半衰期。另一個對於抗原結合蛋白或其片段有用的融合夥伴是轉甲狀腺素(TTR)。 TTR具有形成四聚體的能力，因此抗體-TTR融合蛋白可形成多價抗體，其可增進其結合之結合性(avidity)。
或者，在本文所描述的抗原結合蛋白的功能性及/或生物化學性特徵上的實質上修飾，可藉由在重及輕鏈的胺基酸序列中創造取代來達成，其重及輕鏈在它們維持(a)在取代的區域內分子骨架的結構，例如：如褶板(sheet)或螺 旋構造、維持(b)在標的位置分子的電荷或疏水性、或(c)側鏈的笨重程度(bulkiness)，的效果上明顯有所不同。「保守性胺基酸取代」可涉及以對在該位置之胺基酸殘基的極性或電荷具有小的或無效應之外來殘基之天然胺基酸殘基的取代。參閱，表2，以上。更甚者，任何在多肽裡的天然殘基也可經丙胺酸取代，如先前針對丙胺酸篩選突變誘發(alanine scanning mutagenesis)的描述。
主體抗體的胺基酸取代(不論保守性或非保守性)可被那些所屬領域技術人員藉由施行常規技術來執行。胺基酸取代可被使用以鑑定本文提供之抗體的重要殘基，或增加或減少這些抗體對於GITR的親和力。
V. 表現抗原結合蛋白的方法
在包含至少一個如上述的多核苷酸的質體、表現媒介體、轉錄或表現組合(expression cassettes)的形式之表現系統和基因建構(constructs)也提供於本文中，以及包含這樣表現系統或基因建構的宿主細胞。
本文提供的抗原結合蛋白可藉由複數常規技術的任一來製備。舉例來說，GITR抗原結合蛋白可藉由重組表現系統來產生，其使用在所屬領域中已知的任何技術。參閱，例如，《單株抗體，融合瘤：生物學分析的新維度》(Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses)，Kennet，等人，(編著)，Plenum Press，紐約(1980年)；以及《抗體：實驗室手冊》，Harlow以及Lane(編著)，冷泉港實驗室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，紐約，(1988年)。
抗原結合蛋白可被表現在融合瘤細胞株裡(例如，在特定抗體中可被表現在融合瘤裡)，或融合瘤之外的細胞株。編碼該抗體的表現建構可被使用以轉形哺乳類、昆蟲或微生物宿主細胞。轉形作用可使用任何用於引介多核苷酸進入宿主細胞中的已知方法，例如在病毒內或噬菌體內打包多核苷酸以及藉 由在所屬領域已知的傳導程序傳導宿主細胞該建構，如同被美國專利號4,399,216、4,912,040、4,740,461、4,959,455所示例的。所使用的最佳轉形作用程序將取決於被轉形宿主細胞的類型。用於將異源多核苷酸的引介進入哺乳動物細胞的方法於所屬領域中是公知的，且包括但不限於，聚葡醣媒介轉染作用、磷酸鈣沉澱、聚凝胺(polybrene)媒介的轉染作用、原生質體融合(protoplast fusion)、電穿孔(electroporation)、在脂質體內多核苷酸的封裝、混合核酸與正電荷的脂質、以及DNA進入核內的直接顯微注射。
重組表現建構典型的包含編碼多肽的核酸分子，其包含一個或多個下列：本文提供的一個或多個互補性決定區；輕鏈恆定區；輕鏈可變區；重鏈恆定區(例如：CH1、CH2及/或CH3)；及/或GITR抗原結合蛋白的其他支架部分。 這些核酸序列使用標準連接(ligation)技術插入合適的表現媒介體中。在一個實施例中，重或輕鏈恆定區被附加到抗-GITR特異性重或輕鏈可變區的C-端，且其被連接進入表現媒介體中。媒介體典型地被挑選以在採用之特定的宿主細胞中係為功能性的(即，媒介體是與該宿主細胞機制相容，允許可發生基因的放大及/或表現)。在某些實施例中，媒介體被使用，採用使用蛋白質報導者之蛋白-片段互補測定(protein-fragment complementation assay)，諸如二輕葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)(參閱，舉例來說，美國專利號6,270,964，其藉由參考於此併入)。合適的表現媒介體可從，舉例來說，英傑生命技術公司(Invitrogen Life Technologies)或BD生物科學公司(正式稱為Clontech)購得。用於選殖和表現抗體及片段的其他有用媒介體包括那些被描述在Bianchi及McGrew，2003年，生物技術與生物工程期刊(Biotech.Biotechnol.Bioeng.)，84：439-44，其藉由參考於此併入。其他合適表現媒介體被討論在，舉例來說，在酵素學方法(Methods Enzymol.)，卷185，(D.V.Goeddel，編著)，1990年，紐約：學術出版社。
典型地，被使用在任何宿主細胞中的表現媒介體將含有用於質體維持及用於外生性的(exogenous)核苷酸序列的選殖和表現。這樣的序列，在一些實施例中被統稱為「毗鄰序列(flanking sequence)」，將典型地包括下列核苷酸序列的一個或更多：啟動子、一條或更多強化子序列、複製起始點(origin of replication)、轉錄終止序列、含有供體和剪接接受位(acceptor splice site)的完整內含子序列、編碼用於多肽分泌的引導序列(leader sequence)之序列、核醣體結合位、多腺核苷酸化(polyadenylation)序列、用於插入編碼被表現的多肽之核酸的聚連接物(polylinker)區域、以及可選的標記元件。以下討論這些序列的每個。
選擇性的，媒介體可含有「標籤」編碼的序列，即，位在GITR抗原結合蛋白編碼序列(coding sequence)5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列編碼多His(像是六His(SEQ ID NO：450)，或像是FLAG®、HA(血球凝集流感病毒(hemaglutinin influenza virus))、或myc基因的另一個「標籤」，其存在有商業上可得的抗體。這個標籤典型地根據多肽的表現融合至多肽，且可作為用於來自宿主細胞之GITR抗原結合蛋白的親和力純化或偵測的工具。親和力純化可，舉例來說，藉由使用拮抗該標籤之抗體作為親和力基質之管柱色層分析法完成。選擇性地，標籤可隨後藉由諸如使用用於裂解的特定肽酶之多種方法從純化的GITR抗原結合蛋白上移除。
毗鄰序列可為同源的(即，與宿主細胞來自相同物種及/或品系)、異源的(即，來自與宿主物種或品系不同的物種)、雜交(即，來自不只一個來源的毗鄰序列的組合)、合成的或天然的。因此，毗鄰序列的來源可為任何原核或真核有機體、任何脊椎或無脊椎有機體、或任何植物，前提是毗鄰序列是功能性的，且可被宿主細胞機制活化。
在媒介體中有用的毗鄰序列可藉由幾種所屬技術領域習知的方法中之任一來獲得。通常，本文中有用的毗鄰序列將已經預先藉由定位(mapping) 及/或藉由限制性內切酶(restriction endonuclease)消化來鑑定，且如此可使用適當的限制性內切酶來從適當組織來源分離。在某些情況下，毗鄰序列的全部核苷酸序列可為已知。於此，毗鄰序列可使用本文所描述之用於核酸合成或選殖的方法來合成。
不論是否毗鄰序列的全部或僅有一部分是已知，其可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由以合適的探針，諸如寡核苷酸及/或來自相同或另一個物種的毗鄰序列片段，來篩選基因體庫(genomic library)而獲得。其中毗鄰序列是未知的，含有毗鄰序列的DNA片段可從可獲得之DNA的較大部分分離，例如，編碼序列或甚至另一個基因或多個基因。分離可藉由限制性內切酶消化以產生適當的DNA片段，接著用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®管柱色層分析法(Chatsworth，CA)的、或其他所屬技術領域已知的方法進行分離來完成。用以完成這個目的之合適的酵素的選擇對所屬領域技術人員而言將是顯而易見的。
複製起始點(序列)通常為商業上購買的那些原核表現媒介體中的一部分，且在宿主細胞中該起始點有助於媒介體的放大。若選擇的媒介體不含有複製位置之起始點，其可基於已知的序列而化學合成，並連接至媒介體中。 舉例來說，來自質體pBR322(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)，Beverly，MA)的複製起始點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，而各種病毒起始點(如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)、或乳頭狀瘤病毒(papillomavirus)像是HPV或BPV)是可用於哺乳動物細胞中的轉殖媒介體。通常，哺乳動物表現媒介體不需要複製成分起始點(例如，通常使用所述SV40起始點僅因為它也包含病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區的3'端，並且用於終止轉錄。 通常，在原核細胞中的轉錄終止序列是富含GC的片段，接著多-T(poly-T)序列。 而序列容易從基因庫中複製或者甚至商業上購買而作為媒介體的一部分，它也可使用如本文所述的那些核酸合成的方法來輕易地合成。
可篩選標記基因編碼在選擇培養基中生長的宿主細胞之存活和生長所必需的蛋白質。典型的可篩選標記基因編碼蛋白質，其：(a)賦予原核宿主細胞對抗生素或其它毒素，例如：胺芐青黴素、四環素、康黴素，的抗性；(b)補償細胞的營養缺陷；或是(c)供給無法從複合培養基或合成培養基取得的關鍵的營養素。特異性的可篩選標記是康黴素抗性基因、胺芐青黴素抗性基因和四環素抗性基因。優勢的是，新黴素抗性基因也可用於在原核和真核宿主細胞兩者中篩選。
其它可篩選的基因可使用於放大將被表現的基因。放大作用是其中所需要用來生產生長或細胞存活的關鍵蛋白質的基因被在連續幾代的重組細胞的染色體內重申串聯的過程。用於哺乳動物細胞的合適可篩選標記的實例包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和無啟動子胸苷激酶基因。哺乳動物細胞轉形體(transformant)被放置於選汰壓力(selection pressure)下，其中僅轉形體被獨特地憑藉著存在於媒介體內的可篩選基因調整以生存。選汰壓力是藉由在其中培養基中篩選劑的濃度是連續增加之條件下培養變形的細胞來強加，因而導致可篩選基因和編碼另一個基因，像是結合GITR多肽的抗原結合蛋白的DNA，兩者的放大作用。其結果是，諸如抗原結合蛋白之多肽的增加量，係從被放大的DNA來合成。
核糖體結合位通常對於mRNA的轉譯起始是必要的，且其特徵為Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。元素典型地位在啟動子之3'(端)以及要被表現的所述多肽的編碼序列的5'(端)。
在一些情況下，像是其中在真核宿主細胞表現系統中醣苷化被需要的情況下，其可操縱各種前-序列(pre-sequence)或後-序列(pro-sequence)以增進 醣苷化或產率。舉例來說，其可改變特定訊號胜肽的肽酶切割位，或者添加後-序列，其也可影響醣苷化。最終的蛋白產物在-1位置(相對於成熟蛋白的第一個胺基酸)可具有，一個或多個將要表現的附加胺基酸，其可不被完全移除。舉例來說，最終的蛋白產物可具有在肽酶切割位發現，附接於胺基末端的一個或兩個胺基酸殘基。或者，如果該酵素在成熟多肽的此種區域內切割的話，一些酵素切割位的使用可導致所需多肽的略為截短的形式。
表現和轉殖媒介體將典型地含有啟動子，其被宿主生物體辨識以及可操作地連結到編碼GITR抗原結合蛋白的分子。啟動子是位於上游(即，5')以起始控制結構基因的轉錄的結構基因(一般大約在100至1000個bp)之密碼子的非轉錄序列。啟動子常規地被分組成兩類之一：可誘導型啟動子(inducible promoter)和組成型啟動子(constitutive promoter)。可誘導型啟動子相應於在培養條件內的一些變化，諸如營養物的存在與否或溫度的變化，開始在其控制下來自DNA轉錄量的增加。組成型啟動子，在另一方面，均勻地轉錄它們可操作地與其連接的基因，亦即，很少或根本沒有控制基因表現。啟動子的大多數，被多種潛在宿主細胞辨識，是眾所皆知的。合適的啟動子透過限制酶消化從來源DNA移除啟動子並且插入想要的啟動子序列進入媒介體來可操作地連接到編碼包含GITR抗原結合蛋白的重鏈或輕鏈之DNA。
適合與酵母宿主一起使用的啟動子也是所屬技術領域眾所周知的。酵母強化子具有優勢地與酵母啟動子一起使用。適合與哺乳動物宿主細胞一起使用的啟動子是眾所周知的，並且包括，但不限於，那些從病毒的基因體獲得的，像是如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2型)、牛乳頭狀瘤病毒(bovine papilloma virus)、禽類肉瘤病毒(avian sarcoma virus)，細胞巨大病毒(cytomegalovirus)、反轉錄病毒(retroviruses)、B型肝炎病毒(hepatitis-B virus)、以 及和猿猴病毒40型(Simian Virus 40，SV40)。其它合適的哺乳動物啟動子包括異種的哺乳動物啟動子，例如，熱休克啟動子和肌動蛋白啟動子。
強化子序列可插入到媒介體中，以藉由高等真核生物增加編碼包含GITR抗原結合蛋白的輕鏈或重鏈的DNA之轉錄。強化子是DNA的同側作用元件(cis-acting element)，通常大約10-300bp長，其作用在啟動子上以增加轉錄作用。強化子是相對地定向和位置獨立，已被發現在對轉錄單元5'和3'兩者的位置。 從哺乳動物基因可得到幾個強化子序列是已知的(例如，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲型胎兒蛋白(alpha-feto-protein)以及胰島素)。然而，典型地，使用來自病毒的強化子。所屬技術領域中已知的SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子、以及腺病毒強化子是示例性的強化元件，用於真核細胞啟動子的活化。而強化子可被放置在媒介體內對編碼序列的任一5'端或3'端，它典型地位在從啟動子算起的5'端位置。編碼適當的天然或異位訊號序列(引導序列或訊號胜肽)的序列可被併入到表現媒介體中，以促進抗體的細胞外分泌。訊號胜肽或引導(序列)的選擇係取決於其中產生抗體之宿主細胞的種類，且異位信訊號序列可取代天然訊號序列。在哺乳動物宿主細胞中有功能的訊號胜肽的例子包括如下：在美國專利號4,965,195中描述的介白素-7(IL-7)的訊號序列；描述在Cosman，等人，1984年，自然期刊，312：768中描述的介白素-2受體的訊號序列；在歐洲專利號0367566中描述的介白素-4受體訊號胜肽；在美國專利號4,968,607中描述的第一型介白素-1受體訊號胜肽；在歐洲專利號0460846中描述的第二型介白素-1受體訊號胜肽。
提供的表現媒介體可從諸如市售媒介體起始媒介體被建構。這樣的媒介體可包含或可不包含想要的毗鄰序列的全部。其中，本文描述的毗鄰序列的一個或多個並未已經存在於媒介體中，它們可被單獨地獲得，並連接到媒介體內。被使用於獲得毗鄰序列的每個的方法是所屬技術領域人員熟知的。
媒介體已被建構，且編碼包含GITR抗原結合序列的輕鏈、重鏈、或輕鏈和重鏈的核酸分子已經被插入到媒介體的適當位置之後，完整的媒介體可被插入到用於放大作用及/或多肽表現的合適宿主細胞中。用於使抗原結合蛋白至所選擇的宿主細胞的表現媒介體的轉形作用可藉由眾所皆知的方法包括轉染作用、感染、磷酸鈣共沉澱、電穿孔、顯微注射、脂質轉染(lipofection)、DEAE-聚葡醣媒介轉染作用、或其他已知的技術來完成。挑選的方法將部分地是宿主細胞被使用的類型的功能。這些方法和其它合適的方法是所屬技術領域人員眾所周知的，並且被闡述在，例如，在Sambrook，等人，2001年，同上。
宿主細胞，當培養在適當條件下，合成抗原結合蛋白，其可接續地從培養基收集(若宿主細胞分泌該蛋白進入培養基中)或是直接從生產該蛋白的宿主細胞中收集(如果其為不分泌)。合適的宿主細胞的選擇將取決於各種因素、像是想要的表現量、對於活性可望的或需要的多肽修飾(如醣苷化或磷酸化)以及折疊成生物活性分子的容易度。
可用作為表現的宿主之哺乳動物細胞株是所屬技術領域眾所周知的，並且包括，但不限於，可得自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)的永生細胞株，包括但不限於中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(baby hamster kidney，BHK)細胞、猴腎細胞(monkey kidney cells，COS)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、以及許多其它細胞株。在某些實施例中，細胞株可透過確定哪些細胞株具有高表現量和組成地產生有GITR結合特性的抗原結合蛋白來挑選。在另一個實施例中，來自不製作自己其自身抗體但具有製作和分泌異種抗體能力的B細胞系(cell lineage)的細胞株，可被挑選。
VI. GITR抗原結合蛋白在治療中的用途
GITR在免疫反應中扮演的關鍵角色使其成為用於免疫療法的吸引目標，包括誘導或強化針對所需腫瘤抗原或病原性抗原(例如，病毒和其他致病微生物)的免疫反應。因此，該抗原結合蛋白具有在各種癌症和感染性疾病的治療效力。
如上所述，GITR活化作用發送共活化訊號(co-ativating signal)到CD4+和CD8+ T細胞並防止藉由調控T細胞之免疫反應的抑制。因此，在一個實施例中，施用GITR抗原結合蛋白以禁止藉由調控T細胞之作用T細胞活性的抑制。這種禁止作用可藉由多種所屬技術領域已知的方法，包括，舉例來說，藉由監測T細胞增殖、活化的已知標記的表現、或細胞介素分泌，來進行測定。在另一個實施例中，施用GITR抗原結合蛋白於主體以降低調控T細胞的量，例如循環調控T細胞的量。在又一個實施例中，作用T細胞的活性藉由施用如本文所提供的抗原結合蛋白來被誘導或強化。對於這些方法的每個的具體測定被提供在實施例中。
A. 癌症的治療
GITR生物上的一些面貌使其成為對於多種癌症的治療的潛在標靶。第一是GITR活化作用，如上述，活化免疫系統。另外，GITR-表現作用T細胞和調控T細胞滲入多種腫瘤類型，但在非造血細胞上很少或沒有GITR的表現。這種分佈輪廓意味著GITR-表現的細胞可在腫瘤變得集中。活性和分布的組合統整地使得GITR活化作用成為用於治療多種癌症的有吸引力的途徑。抗原結合蛋白能被使用於治療實體腫瘤、以及血液的癌症，包括白血病。
多種不同的腫瘤已經被證實含有GITR陽性免疫細胞。因此，這些腫瘤是特別有吸引力的標的。這樣的腫瘤包括，例如，黑色素瘤(包括第三期和第四期的惡性黑色素瘤)、肺癌(例如，非小細胞肺癌-NSCLC)、頭頸部癌、腎細胞癌和直腸癌。
可以抗原結合蛋白治療的其他癌症包括，但不限於，乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腎癌、食道癌、睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、鱗狀細胞癌(例如，頭頸部的鱗狀細胞癌-SCCHN)、葡萄膜黑色瘤(uveal melanoma)、濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、子宮頸癌、腦癌、胰臟癌、肝癌、淋巴瘤、霍金氏病、多發性骨髓瘤、胃癌、以及星形細胞癌症(astrocyctic cancer)。
在治療任意上述癌症中，所提供的治療方法可用以在具有腫瘤的個體內抑制進一步的腫瘤生長、誘導腫瘤退化、增加無進展存活率(increase progression-free survival)及/或延伸整體存活率。在一些實施例中，抗原結合蛋白也可延緩或防止轉移的發作。在治療中的進展可使用各種方法來監測。例如，禁止作用可導致減少的腫瘤尺寸及/或在腫瘤內降低的代謝活性。舉例來說，這些參數兩者可藉由MRI或PET掃描來測量。禁止作用還可藉由活體組織切片(biopsy)來監測，以確定壞死的量、腫瘤細胞死亡以及腫瘤內血管形(vascularity)的量。轉移的程度能使用已知的方法來監測。
儘管所提供的GITR抗原結合蛋白可被單獨施用，但是在其他實施例中，抗原結合蛋白被與另一種治療劑(例如，化學治療劑)、放射治療及/或外科手術組合施用。如果與另一種治療劑一起施用，該抗原結合蛋白可被施用於該劑之前、之後或與該劑同時地施用(例如，作為相同組成物的一部分)。可與抗原結合蛋白結合的其它治療劑包括，例如，其它免疫療法劑、各種標靶治療(例如，在癌症治療中使用的治療性抗體)、血管生成抑制劑、化學治療劑、以及抑制與癌症轉移相關的骨缺失的藥劑。
舉例來說，在一個實施例中，抗原結合蛋白與另一個免疫療法的藥劑，亦即，誘導或強化免疫反應的免疫刺激劑一起被施用。這樣的試劑可包 括，例如：1)樹突細胞的活化劑、2)疫苗佐劑、3)T細胞刺激劑、4)免疫檢查點的抑制劑、和5)抑制的細胞、細胞介素及/或酵素的抑制劑。
因此，在一個實施例中，抗原結合蛋白被與樹突細胞生長因子，像是Flt3L一起施用。
在另一個實施例中，抗原結合蛋白與刺激抗原呈現細胞的試劑組合。這種試劑的實例包括各種CD40拮抗劑，像是促效劑抗CD40抗體或CD40L。
一些方法涉及與疫苗佐劑一起施用抗原結合蛋白。這樣的佐劑包括，例如，IL-12、以及各種類鐸受體(TLR)促效劑、包括CpG(TLR9促效劑)、單磷氧基脂質A(monophosphoryl lipid A，MPL-一TLR4促效劑)、PolyI：C或PolyICLC(TLR3促效劑)、以及雷西莫特(resiquimod)和852A(TLR7/8促效劑)。
在其它治療方法中，抗原結合蛋白與T細胞生長因子，像是IL-15及/或IL-17，或這些分子的活化劑組合施予。在相關的方法中，T細胞的刺激物與抗原結合蛋白結合。這樣刺激物包括4-1BB的促效劑，像是促效劑抗4-1BB抗體以及4-1BBL。
在某些實施例中，抗原結合蛋白與T細胞檢查點抑制劑，例如，發送抑制性訊號至免疫系統的分子一起被施用。這種試劑的實例包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制劑，諸如抗PD-1抗體，包括nivolumab(必治妥施貴寶)以及lambrolizumab，也被稱為MK-3475(默克)、pidilizumab(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)、以及抗PD-L1的抗體，包括MPDL3280A(羅氏)、MDX-1105(必治妥施貴寶)、MEDI-4736(阿斯利康製藥)以及MSB-0010718C(默克)。其他檢查點抑制劑包括CTLA-4的拮抗劑，諸如抗CTLA-4抗體。示例性抗CTLA4抗體是由必治妥施貴寶銷售的Yervoy®(ipilimumab)。其它示例性CTLA-4抗體包括tremelimumab(輝瑞藥廠)、Ticilimumab(阿斯利康製藥)以及AMGP-224(荷商葛蘭素史克藥廠(Glaxo Smith Kline))。
在另外的方法中，抗原結合蛋白是與具有免疫抑制效果的酵素的抑制劑組合施用。實例為1-甲基色胺酸(1-methyl tryptophan，1MT)，其為吲哚胺2,3二氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase)的小分子抑制劑。
抗原結合蛋白也可與美國安進公司(Amgen)之T-VEC(Talimogene laherparepvec)組合使用。
在特定實施例中，抗原結合蛋白與BiTE®分子組合施用，BiTE®分子為可被使用作為抗癌藥物的雙特異性抗體的一類。分子針對癌細胞定向宿主的免疫系統，特別是T細胞的胞毒性活性。實例包括由美國安進公司開發中的AMG-103(blinatumumab)以及AMG-110(solitomab)。
抗原結合蛋白也能與多種標靶治療組合給藥。標靶治療的實例包括，但不限於，治療性抗體的使用。示例性抗體包括但不限於，那些結合至細胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、黏蛋白類醣蛋白、以及呈現在腫瘤細胞上的表皮生長因子受體(EGFR)的抗體，並且選擇性地誘導展現這些蛋白質之腫瘤細胞上的細胞增殖及/或細胞毒性影響。示例性抗體也包括賀癌平®(HERCEPTIN®)(賀癌平凍晶注射劑(trastuzumab))，其可用於治療乳癌和其它形式的癌症、以及(RITUXAN®)(利妥昔單抗(rituximab))、ZEVALINTM(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan))、GLEEVEC®和LYMPHOCIDETM(Epratuzumab)，其可被使用於治療非霍金氏淋巴瘤和其它形式的癌症。特定示例性抗體也包括panitumumab(維必施®(VECTIBIX®))、ERBITUX®(IMC-C225)；得舒緩膜衣錠(ertinolib)(艾瑞沙(Iressa))；BEXXARTM(碘131 tositumomab)；KDR(激酶結構域受體)抑制劑；抗-VEGF抗體和拮抗劑(例如，癌思停®(Avastin®)、motesanib和VEGAF-TRAP)；抗VEGF受體抗體以及和抗原結合區域；抗Ang-1和Ang-2抗體以及抗原結合區域；對TIE-2和其他Ang-1以及Ang-2受體的抗體；Tie-2配體；針對Tie-2激酶抑制劑的抗體；HIF-1a的抑制劑、以及CampathTM(Alemtuzumab)。 在特定實施例中，癌症治療劑是選擇性地誘導在腫瘤細胞內的細胞凋亡的多肽，包括但不限於，TNF相關的多肽的TRAIL。
在特定實施例中，如本文所提供的抗原結合蛋白與一種或多種減少血管生成的抗血管生成劑組合使用。一些此類試劑包括，但不限於，IL-8拮抗劑；Campath，B-FGF；FGF拮抗劑；Tek拮抗劑(Cerretti等人，美國專利公開號2003/0162712；Cerretti等人，美國專利號6,413,932，以及Cerretti等人，美國專利號6,521,424)；抗TWEAK劑(其包括，但不限於，抗體和抗原結合區域)；可溶性TWEAK受體拮抗劑(威利，美國專利6,727,225號)；ADAM小蛋白分子(distintegrin)結構域以拮抗整聯蛋白對其配體的結合(Fanslow等人，美國專利公開號2002/0042368)；抗eph受體和抗ephrin抗體；抗原結合區域，或拮抗劑(美國專利號5,981,245；5,728,813；5,969,110；6,596,852；6,232,447；6,057,124)；抗VEGF劑(例如，特異性結合VEGF的抗體或抗原結合區域，或者可溶性VEGF受體或其配體結合區域)諸如癌思停®或VEGF-TRAPTM、以及抗-VEGF受體劑(例如，抗體或特異性結合於此的抗原結合區域)、EGFR抑制劑(例如，特異性結合至其的抗體或抗原結合區域)諸如panitumumab、IRESSATM(艾瑞莎膜衣錠(gefitinib))、得舒緩®(TARCEVATM)(erlotinib)、抗Ang-1和抗Ang-2劑(例如，特異性結合至其、或至他們的受體的抗體或抗原結合區域，例如，Tie-2/TEK)、以及抗Tie-2激酶抑制劑(例如，特異性結合並抑制生長因子活性之抗體或抗原結合區域，像是肝細胞生長因子(HGF，也稱為分散因子(Scatter Factor))的拮抗劑)、以及特異性結合其受體”c-met”(例如，rilotumumab和AMG337，美國安進公司)的抗體或抗原結合區域；抗PDGF-BB拮抗劑；對PDGF-BB配體的抗體和抗原結合區域；以及PDGFR激酶抑制劑。
可與抗原結合蛋白組合使用的其它抗血管生成劑，包括藥劑諸如MMP-2(基質-金屬蛋白酶2(matrix-metalloproteinase 2))抑制劑、MMP-9(基質-金 屬蛋白酶9)抑制劑、和COX-II(環氧合酶II(cyclooxygenase II))抑制劑。有用的COX-II抑制劑的實例包括CELEBREXTM(希樂葆膠囊(celecoxib)、valdecoxib、rofecoxib。
本文所提供的抗原結合蛋白也可與生長因子抑制劑組合使用。這類試劑的實例，包括，但不限於，可抑制EGF-R(表皮生長因子受體)反應之藥劑，諸如EGF-R抗體(例如，panitumumab(維必施®)、EGF抗體、以及是EGF-R抑制劑的分子；VEGF(血管內皮生長因子)抑制劑，諸如VEGF受體以及可抑制VEGF的分子；erbB2受體抑制劑，諸如結合於erbB2受體的有機分子或抗體，例如，賀癌平®(基因泰克公司(Genentech,Inc.)。EGF-R抑制劑，描述於，例如在美國專利號5,747,498、WO98/14451、WO95/19970和WO98/02434。
在一些治療應用中，特別是當癌症已經轉移到骨頭，使得骨頭受到負面影響時，其可有用於給藥該抗原結合蛋白與抑制進一步骨缺失或輔助該已丟失的骨質恢復的治療劑。因此，抗原結合蛋白可與治療有效量的骨生長促進(合成代謝的)劑或骨抗吸收劑一起給藥，骨生長促進(合成代謝的)劑或骨抗吸收劑包括但不限於：指定的BMP1至BMP12的骨形態發生因子；轉形生長因子(transforming growth factor)-β與TGF-β家族成員；纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor)FGF-1至FGF-10；介白素-1抑制劑(包括IL1ra、對IL-1的抗體以及對IL-1受體的抗體)；TNFα抑制劑(包括etanercept、adalibumab以及infliximab)；RANK配體抑制劑(包括可溶性RANK、促骨生成蛋白受體(osteoprotegerin)以及特異地結合RANK或RANK配體的拮抗性抗體，諸denosumab(癌骨瓦®(XGEVA®))、DKK-1抑制劑(例如，抗-DKK-1抗體)、副甲狀腺素、E系列前列腺素、雙膦酸鹽類藥物以及骨強化礦物質諸如氟化物和鈣。可與抗原結合蛋白以及其功能片段組合使用的同化劑包括副甲狀腺素以及似胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)，其中後者藥劑是優選地與IGF結合蛋白組合。 適於此種組合治療的IL-1受體拮抗劑被描述在WO89/11540中，且合適的可溶性TNF受體-1被描述在WO 98/01555中。示例性RANK配體拮抗劑已被公開，例如，在WO 03/086289、WO 03/002713，美國專利號6,740,511和6,479,635。
在某些實施例中，治療方法涉及組合如本文提供的抗原結合蛋白與一種或多種化學治療劑的組合。此種治療的實例包括，但不限於，包括烷化劑的抗腫瘤劑，其包括：芥子氣(nitrogen mustard)、諸如甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、依氟醯胺(ifosfamide)、黴法蘭(melphalan)、以及氯芥苯丁酸(chlorambucil)；亞硝脲，諸如雙氯乙基亞硝脲(carmustine)(BCNU)、lomustine(CCNU)、semustine(甲基-CCNU)；帝盟多膠囊TM(TemodalTM)(temozolamide)、伸乙亞胺(ethylenimine)/甲基三聚氰胺(methylmelamine)諸如三乙三聚氰胺(thriethylenemelamine，TEM)、三伸基(triethylene)、硫代磷(thiophosphoramide(thiotepa))、六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)(HMM，altretamine)；烷基磺酸鹽(alkyl sulfonate)諸如硫酸布他卡因(busulfan)；三(triazines)諸如達卡巴仁(dacarbazine，DTIC)；抗代謝藥(antimetabolites)包括葉酸類似物諸如胺甲喋呤(methotrexate)和三甲曲沙(trimetrexate)、嘧啶類似物諸如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5FU)、氟去氧尿苷(fluorodeoxyuridine)、gemcitabine、阿糖胞苷(cytosine arabinoside，AraC，cytarabine)、5-氮雜胞苷(5-azacytidine)、2,2'-difluorodeoxycytidine、嘌呤類似物諸如6-硫醇嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、2'-脫氧柯福黴素(2'-deoxycoformycin)(pentostatin)、赤羥基壬腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)(EHNA)、氟阿腺苷磷酸鹽(fludarabine phosphate)，2-chlorodeoxyadenosine((cladribine，2-CDA)；天然產物，包括抗有絲分裂藥物如紫杉醇(paclitaxel)、長春花生物鹼類包括長春鹼(vinblastine，VLB)、長春新鹼(vincristine)、以及溫諾平(vinorelbine)、剋癌易(taxotere)、 estramustine、以及estramustine phosphate；pipodophylotoxins諸如，醫百幸注射劑(etoposide)以及teniposide；抗生素諸如放線菌素D(actimomycin D)、柔紅黴素(daunomycin)(rubidomycin)、阿黴素(doxorubicin)、雙羥蒽醌(mitoxantrone)、艾達黴素(idarubicin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)(光輝黴素(mithramycin))、絲裂黴素(mitomycin C)、和放線菌素(actinomycin)；酵素諸如L-天門冬醯胺酶(L-asparaginase)；生物反應調節劑諸如干擾素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；雜劑(miscellaneous agents)包括鉑配位複合物諸如順鉑和卡鉑(carboplatin)、蒽醌(anthracenedione)諸如雙羥蒽醌，經取代的尿素諸如羥基尿素(羥基脲)、甲肼(methylhydrazine)衍生物包括N-甲肼(N-methylhydrazine，MIH)和甲基芐肼(procarbazine)、腎上腺皮質抑制劑諸如米托坦(mitotane)(鄰，對-DDD)和胺麩精(aminoglutethimide)；荷爾蒙和拮抗劑，包括腎上腺皮質類固醇拮抗劑諸如強體松(prednisone)和等價物、迪皮質醇(dexamethasone)以及胺麩精；GemzarTM(gemcitabine)、黃體素諸如羥孕酮巳酯(hydroxyprogesterone caproate)、甲羥助孕酮醋酸鹽(medroxyprogesterone acetate)、甲地孕酮醋酸鹽(megestrol acetate)；雌激素類如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和乙烯雌二醇(ethinyl estradiol)等價物；抗雌激素諸如太莫西芬(tamoxifen)；雄激素類包括丙酸睪固酮(testosterone propionate)和氟羥甲基睪酮(fluoxymesterone)/等價物；抗雄激素諸如護腺寧(flutamide)、性腺釋素類似物(gonadotropin-releasing hormone analogs)以及柳菩林(leuprolide)；和非類固醇抗雄激素劑諸如護腺寧。針對表觀遺傳機制療法包括，但不限於，組蛋白去乙醯酶抑制劑、去甲基化劑(例如，Vidaza)和釋放的轉錄抑制(ATRA)療法也可與抗原結合蛋白結合。
化學治療劑的其他特異性實例包括，紫杉醇、紫杉烷(taxene)(例如，docetaxel和剋癌易)、修飾的紫杉醇(paclitaxel)(例如，Abraxane和Opaxio)小紅莓(doxorubicin)、癌思停®、紓癌特(Sutent)，蕾莎瓦(Nexavar)、和其它多激酶 抑制劑、順鉑、和卡鉑、醫百幸注射劑、gemcitabine、以及長春鹼。其它激酶的特異性抑制劑也可與抗原結合蛋白組合使用，包括但不限於，MAPK路徑抑制劑(例如，ERK、JNK和p38的抑制劑)、PI3激酶/AKT抑制劑和Pim抑制劑。其它抑制劑包括Hsp90抑制劑、蛋白酶體抑制劑(例如，萬科(Velcade))和作用抑制劑的多種機制諸如Trisenox。
在一些實施例中，GITR抗原結合蛋白共軛至藥物以形成抗體藥物共軛物(ADC)。一般而言，ADC包括共軛至化學治療劑的抗體，例如，細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、或放射性試劑，諸如，例如，上述的那些。連接物分子可使用於共軛藥物至抗體。在ADC技術中有用的多種連接物和藥物是所屬技術領域已知的，且可被使用於含有GITR抗原結合蛋白的ADC的形成中。(參閱，例如，US2009/0028856；US2009/0274713；US2007/0031402；WO2005/084390；WO2009/099728；美國專利號5,208,020；美國專利號5,416,064；美國專利號5,475,092、5,585,499、6,436,931、6,372,738、和6,340,701，其每一個在此併入作為參考)。
B. 感染的治療
除了在治療癌症上使用外，在另一個實施例中，所提供的抗原結合蛋白可被用於誘導或強化對抗外來抗原的免疫反應，像是那些存在於各種傳染媒介物(infectious agent)上的外來抗原。針對其可產生免疫反應的存在於傳染媒介物上的抗原實例，包括，但不限於存在於病毒、寄生物(parasistes)、細菌和其他微生物上的蛋白質、醣蛋白、脂蛋白和醣脂。
在某些實施例中，所提供的GITR抗原結合蛋白被併入抵抗傳染媒介物之疫苗中作為預防性治療的一部分。在這樣的治療中，個體以含有期望對其免疫的抗原及如本文所揭露的抗原結合蛋白的疫苗免疫接種。或者，編碼用於病原抗原的基因以及該抗原結合蛋白的表現媒介體可被用於疫苗接種。
C. 偵測與診斷方法
本文所描述的抗原結合蛋白可被使用於偵測GITR蛋白(例如，在生物樣品中，例如血清或血漿)以及用於診斷目的以偵測、診斷或監測與GITR相關的疾病及/或病症或GITR治療。舉例來說，所揭露的抗原結合蛋白使用所屬領域技術人員已知的經典免疫組織學方法(例如，Tijssen，1993年，《酵素免疫分析實踐和理論》(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)，第15卷(Eds R.H.Burdon和P.H.van Knippenberg，愛思唯爾(Elsevier)出版，阿姆斯特丹)；Zola，1987年，《單株抗體：技術手冊》(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，頁次147-158(CRC出版公司)；Jalkanen等人，1985年，細胞生物學期刊(J.Cell.Biol.)，101：976-985；Jalkanen等人，1987年，細胞生物學期刊，105：3087-3096)提供了針對在樣品中GITR的存在的偵測。GITR的偵測能在體內或體外中被執行。
本文所提供的診斷應用包括抗原結合蛋白的使用以偵測GITR的表現和配體對GITR的結合。在GITR的存在的偵測中有用的方法實例包括免疫測定(immunoassay)，諸如連結酶免疫吸收測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和放射性免疫測定(radioimmunoassay，RIA)。
對於診斷應用，抗原結合蛋白通常將以可偵測的標記群體標記。合適的標記群體包括，但不限於，以下：放射性同位素或放射性核種(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如：FITC，鹼性蕊香紅、鑭系磷光體(lanthanide phosphor))、酵素基團(例如，山葵過氧化氫、β半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團、或藉由二級報導者辨識的預定多肽表位(例如，白胺酸拉鏈對序列、二級抗體的結合位置、金屬結合結構域、表位標籤)。在某些實施例中，標記群體是透過各種長度的間隔 物臂耦合至抗原結合蛋白以減低潛在的立體阻礙。用於標記蛋白的各種方法是所屬技術領域已知的，並可被使用。
在另一個態樣中，抗原結合蛋白可被使用於鑑定表現GITR的一個細胞或多個細胞。在特定的實施例中，抗原結合蛋白以標記群體標記，並偵測標記之抗原結合蛋白至GITR的結合。在進一步的特定實施例中，在體內偵測抗原結合蛋白對GITR的結合。在進一步的特定實施例中，使用所屬技術領域中已知的技術分離並測量GITR抗原結合蛋白。參閱，例如，Harlow和Lane，1988年，《抗體：實驗室手冊》，紐約：冷泉港(1991年編著且定期補充)；John E.Coligan，編，1993年，《在免疫學當前協議》紐約：約翰威立出版社(Wiley & Sons)。
在另一個實施例中，提供了用於偵測與本文提供的抗原結合蛋白競爭結合至GITR之測試分子的存在的方法。此種測定法的實例將涉及偵測在測試分子的存在或不存在下含有GITR的量的溶液內，游離抗原結合蛋白的量。游離抗原結合蛋白(即，不結合於GITR之抗原結合蛋白)的量的增加，將指明測試分子能夠與抗原結合蛋白競爭GITR結合。在一個實施例中，抗原結合蛋白是用標記群體來標記。或者，在抗原結合蛋白的存在和不存在下標記測試分子，並監測游離測試分子的量。測定競爭的多種其他方法是所屬技術領域已知的；方法也提供在以下的實例中。
VII. 藥學上製劑與給藥
包含GITR抗原結合蛋白的藥學組成物也被提供，且可用於任何本文中揭露的預防和治療方法中。在一個實施例中，也提供治療有效量的一個或複數個抗原結合蛋白和藥學上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑，防腐劑、及/或佐劑。可接受的製劑材料在所採用的劑量和濃度對接受者是無毒的。藥學組成物可被製劑成液體、冷凍或低壓冷凍的組成物。
在特定實施例中，藥學組成物可含有用於修飾、維持或保藏，例如：pH值、滲透性、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性，溶解或釋放速率、組成物的吸附或穿透的製劑材料。在這樣的實施例中，合適的製劑材料包括但不限於，胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸)；抗微生物劑(antimicrobial)；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉(sodium sulfite)或亞硫酸氫鈉(sodium hydrogen-sulfite))；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽(bicarbonate)、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機酸)；增積劑(bulking agent)(如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(如乙二胺四醋酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA))；錯合劑(complexing agent)(諸如咖啡因、聚乙烯氫吡咯酮(polyvinylpyrrolidone)、β-環糊精(beta-cyclodextrin)或羥丙基-β-環糊精(hydroxypropyl-beta-cyclodextrin))；填料；單醣、雙醣和其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；呈色劑、矯味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(如聚乙烯氫吡咯酮)；低分子量多肽；形成鹽的相對離子(諸如鈉)；防腐劑(如羥基氯苯胺(benzalkonium chloride)、苯甲酸(benzoic acid)、柳酸、乙汞硫柳酸鈉(thimerosal)、苯乙醇(phenethyl alcohol)，對羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥苄酸丙酯(propylparaben)、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸(sorbic acid)或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或潤濕劑(諸如Pluronic®、PEG、山梨糖醇酯(sorbitan ester)、聚山梨糖醇酯像是聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯、氚核(triton)、參(羥甲)胺基甲烷(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、四丁酚醇(tyloxapal))；穩定性強化劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力強化劑(諸如鹼金屬鹵化物、較佳地氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇山梨糖醇)；遞送載具；稀釋劑；賦形劑及/或藥學佐劑。《REMINGTON的藥學科學》(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)，18版，(A.R.Genrmo，編)，1990年，Mack出版公司提供可併入藥學組成物中的合適試劑之其他詳細訊息和選項。
在特定實施例中，最佳藥學組成物將由所屬領域技術人員取決於例如，給藥的預定途徑、遞送形式和所需劑量來確定。參見，例如，《REMINGTON的藥學科學》，同上。在特定實施例中，此類組成物可影響物理狀態、穩定性、體內釋放速率和所揭露的抗原結合蛋白的體內清除率的速度。在特定實施例中，在藥學組成物中的主要載具或載體可為水性或非水性的性質。舉例來說，合適的載具或載體可為注射用水或生理食鹽水溶液。在特定實施例中，GITR抗原結合蛋白組成物可為了貯存而藉由以冷凍乾燥餅(lyophilized cake)或水溶液的形式混和具有所需純度之所選之組合物與選擇性配方劑(formulation agent)(《REMINGTON的藥學科學》，同上)製備。更甚，在特定實施例中，GITR抗原結合蛋白可使用適當的賦形劑，如蔗糖，來製劑成低壓冷凍乾燥物。
如上所討論的，一些實施例提供組成物，特別是藥學組成物，其包含，除了GITR抗原結合蛋白以外，還有一種或多種賦形劑，像是那些在本節和本文別處的說明性描述的。賦形劑可被使用於本發明中，在這方面，以各種各樣的目的，諸如調整製劑的物理、化學、或生物特性，諸如黏度、以增進效率和或以對抗由於，例如，發生在製造、運輸、貯存、使用前製備、給藥、以其後的過程中發生的壓力所導致的降解而穩定GITR抗原結合蛋白的製劑。
在一些實施例中，例如，游離胺基酸可被使用在GITR抗原結合蛋白製劑中作為增積劑、穩定劑、和抗氧化劑。作為一個實例，離胺酸、脯胺酸、絲胺酸和丙胺酸可在製劑中被用於穩定蛋白質。甘胺酸在冷凍乾燥中是有用的以確保正確的餅的結構和特性。精胺酸可為有用的，以在液體和冷凍乾燥製劑兩者中抑制蛋白質聚集。甲硫胺酸是有用於作為抗氧化劑。
某些組成物包括多元醇。多元醇包括糖，例如：甘露糖醇、蔗糖和山梨糖醇及多元醇諸如，例如，甘油和丙二醇，以及，為了本文討論的目的，聚乙二醇(PEG)和相關物質。多元醇是親液(kosmotropic)。它們在液體與低壓冷凍乾燥製劑兩者中，是有用的穩定劑以保護蛋白質免於物理和化學降解過程。多元醇也是有用於調節製劑的張力。
某些組成物包括甘露糖醇作為穩定劑。它通常與冷凍乾燥保護劑一起使用，例如：蔗糖。山梨糖醇和蔗糖是有用於調節張力和作為穩定劑以保護抵抗在製造過程中傳輸或半製品(bulk product)的製備中的凍融(freeze-thaw)壓力。PEG是有用於穩定蛋白質以及作為低溫保護劑(cryoprotectant)在這方面可被使用在本發明中。
界面活性劑也可被包括在一些GITR抗原結合蛋白的製劑中。蛋白質分子可易吸附在表面上，且變性並隨後聚集在氣-液、固-液和液-液界面。這些影響通常與蛋白質濃度成反比延展。這些有害的相互作用通常與蛋白質濃度成反比延展，並且典型地藉由諸如於產品的運輸和搬運過程中所產生的物理攪動而加劇。界面活性劑常規地是用於預防、最小化或降低這種表面的吸附。界面活性劑還通常用於控制蛋白質的構型穩定性。合適的界面活性劑包括聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80、去水山梨醇聚乙氧基化物(polyethoxylate)的其他脂肪酸酯和泊洛沙姆188(poloxamer 188)。
在一些實施例中，一種或多種抗氧化劑被包括在GITR抗原結合蛋白製劑中。抗氧化劑的賦形劑可被使用於防止蛋白質的氧化降解。還原劑、去氧劑(oxygen scavenger)/自由基捕捉劑(free-radical scavenger)、以及螯合劑在這方面是有用的抗氧化劑。抗氧化劑典型地是水溶性的，並且於產品的整個保存期限期間維持其活性。EDTA是可被包含在製劑中的另一個有用的抗氧化劑。
製劑可包括金屬離子，其為蛋白輔助因子且其對形成蛋白質配位錯合物是必要的。金屬離子也可抑制某些降解蛋白質的過程。舉例來說，鎂離子(10-120mM)能被使用於抑制天門冬胺酸對異天門冬胺酸的異構化作用。
一種或多種防腐劑可被包括在GITR抗原結合蛋白的某些製劑中。當發展涉及不只一個來自相同容器之萃取物的多劑量非經口製劑時，防腐劑是必要的。它們的主要功能是抑制微生物生長，並於藥物產品的整個保存期限或使用的期間確保產物無菌性質。常使用的防腐劑包括苯甲醇(benzyl alcohol)、苯酚和間甲酚(m-cresol)。
製劑成分以對給藥的位置是可接受的濃度優選的遞送。在特定實施例中，緩衝液是用於維持組成物在生理pH值或在稍低的pH值，典型地為從大約5至大約8的pH範圍內。
藥學組成物可被選擇用於非經口遞送。可替代地，組成物可被選擇用於吸入或用於透過消化道遞送，像是口服。此種藥學上可接受組成物的製備是在所屬技術領域的範圍內。
當考慮非經口給藥時，治療組成物可被提供在無熱原(pyrogen-free)、非經口地可接受的水溶液的形式，其包括想要的GITR抗原結合蛋白在藥學上可接受載具中。用於非經口注射的特定合適載具為無菌蒸餾水，其中GITR抗原結合蛋白被配製成無菌的、等滲的溶液，適當地保存。在特定實施例中，製備可涉及所需的分子與試劑，像是可注射微球、生物易侵蝕的(bio-erodible)顆粒、聚合的化合物(諸如聚乳酸(polylactic acid)或聚乙醇酸(polyglycolic acid))、珠粒或脂質體的製劑，其可提供可透過持續性注射來遞送之產品的控制或持續的釋放。在特定實施例中，玻尿酸(hyaluronic acid)也可被使用，其具有在循環中促進持續期間的效果。在特定實施例中，可植入的藥物遞送裝置可被用於引介想要的抗原結合蛋白。
某些藥學組成物被配製用於吸入。在一些實施例中，GITR抗原結合蛋白被配製為乾燥的可吸入粉末。在特異實施例中，GITR抗原結合蛋白吸入溶液也可與推進劑一起配製以用於氣化噴霧劑遞送。在特定實施例中，溶液可以被噴霧化。肺部給藥和製劑的方法因而進一步被描述在國際專利申請號PCT/US94/001875，其藉由引用的方式併入，並描述化學修飾蛋白質的肺部遞送。
某些製劑可口服地給藥。被以這種方式給藥的GITR抗原結合蛋白可與或不與平素被使用在固體劑量型式，像是錠或是膠囊的化合物中的載體一起配製。在某些實施例中，膠囊可設計為在胃腸道中，當生體可用率最大化且系統前降解為最小化的時候，在該點釋放製劑的活性部分。可包括其他藥劑以便於GITR抗原結合蛋白的吸收。也可採用稀釋劑、矯味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠破碎劑和黏合劑。
一些藥學組成物包含有效份量的一種或複數種GITR抗原結合蛋白於具有適合錠的製程的無毒性賦形劑的混合物裡。藉由溶解錠於無菌水中，或另一種合適的載具中，溶液可以單位劑量形式製備。合適的賦形劑包括，但不限於，惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或重碳酸鈉(bicarbonate)、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
其它的藥學組成物將對所屬領域技術人員是明顯的，包括涉及GITR結合蛋白在持續或受控制遞送製劑的製劑。用於配製多種其他持續或受控制遞送裝置的工具，諸如脂質體載體、生物易侵蝕的微粒子或多孔珠子以及沉積注射，也是所屬領域技術人員所熟知的。參閱，例如，國際專利申請號PCT/US93/00829，其藉由引用被併入且描述用於藥學組成物的遞送的受控制的多孔聚合微粒子的釋放。緩釋製劑(sustained-release preparation)可包括半透性聚合物基質於成形製品的形式中，例如：膜、或微膠囊。緩釋基質可包括聚酯、 水凝膠、聚乳酸(如揭露於美國專利號3,773,919和歐洲專利申請公開號EP 058481中，其每一個藉由引用而併入)、L-麩胺酸和γ-乙基-L-麩胺酸鹽(gamma ethyl-L-glutamate)的共聚物(Sidman等人，1983年，生物聚合物期刊(Biopolymers)2：547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(poly (2-hydroxyethyl-inethacrylate))(Langer等人，1981年，生物醫學材料研究期刊(J.Biomed.Mater.Res.)，15：167-277，以及Langer，1982年，化學技術期刊(Chem.Tech.)，12：98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)(Langer等人，1981年，同上)或聚-D(-)-3-羥丁酸(poly-D(-)-3-hydroxybutyric acid)(歐洲專利申請公開號EP 133988)。緩釋組成物也可包括可藉由任何所屬領域中已知的幾種方法來製備的脂質體。參閱，例如：Eppstein等人，1985年，美國國家科學院論文集，82：3688-3692；歐洲專利申請公開號EP036,676；EP088,046和EP143,949。
用於體內給藥的藥學組成物典型地被提供為無菌製劑。滅菌可藉由通過無菌過濾膜過濾來實現。當組成物被冷凍乾燥時，使用此方法的滅菌可冷凍乾燥以及復原之前或之後擇一進行。用於非經口給藥的組成物可被貯存在冷凍乾燥的形式中或在溶液中。非經口組成物通常置於具有無菌存取孔(sterile access port)的容器中，例如，靜脈注射溶液袋或具有以皮下注射針頭可刺穿的塞子的小瓶。
一旦藥學組成物被配製，它可被貯存在無菌小瓶中作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體，或作為脫水的或冷凍乾燥的粉末。這樣的製劑可以被貯存在準備使用的形式或在給藥之前被復原(即，冷凍乾燥)的形式中之任一。用於產生單一劑量給藥單位的套組也被提供。某些套組包含具有乾燥蛋白質的第一容器和具有水性製劑的第二容器。在某些實施例中，含有單一和多個空腔預填充的注射器(例如：液體注射器和里昂注射器(lyosyringe))的套組被提供。採用之含GITR抗原結合蛋白的藥學組成物的治療有效量，將取決於，例如， 治療內容和客體(objective)。所屬領域技術人員將理解的是，治療的適當劑量的量將會取決於，部分地，根據遞送的分子、所使用的GITR抗原結合蛋白的指示、給藥途徑、以及病患的尺寸(體重、體表面或器官尺寸)及/或條件(年齡和一般健康狀況)而發生變化。在某些實施例中，臨床醫生可滴定劑量並修改給藥途徑以獲得最佳治療效果。
在特定製劑中，抗原結合蛋白具有至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml的濃度。在一個實施例中，藥學組成物包含抗原結合蛋白、緩衝液以及聚山梨糖醇酯。在其他實施例中，藥學組成物包含抗原結合蛋白、緩衝液、蔗糖和聚山梨糖醇酯。藥學組成物的一個實例是含有50-150mg/ml的抗原結合蛋白、5-20mM醋酸鈉、5-10% w/v蔗糖、以及0.002-0.04% w/v的聚山梨糖醇酯之藥學組成物。其他藥學組成物含有50-100mg/ml的抗原結合蛋白、5-20mM醋酸鈉、5-10% w/v蔗糖、和0.002-0.008% w/v聚山梨糖醇酯。一些組成物，例如，在9-11mM醋酸鈉緩衝液內包含65-75mg/ml的抗原結合蛋白、8-10% w/v蔗糖、以及0.009-0.011% w/v的聚山梨糖醇酯。某些這樣的製劑的pH值在4.5-6的範圍內。其它製劑具有4.9-5.5的pH值(例如，5.0、5.2或5.4的pH值)。
劑量頻率將取決於在使用的製劑內特定GITR抗原結合蛋白的藥物動力學參數。典型地，臨床醫師給藥該組成物直到劑量達到實現期望的效果。組成物因此隨著時間的推移可作為單一劑量、或作為二或更多種劑量的給藥(其可或可不包含相同量的所需分子)，或作為透過植入裝置或導管來連續滴注。合適的劑量可通過合適的劑量-反應數據的使用來確定。在特定實施例中，抗原結合蛋白可被給藥於病患整個延長的時間週期。在特定實施例中，抗原結合蛋白每兩週、每月、每兩月、每三個月、每四個月、每五個月、或每六個月地配給劑量。
藥學組成物的給藥途徑是根據已知的方法，例如：口服、透過靜脈內注射、腹膜內的、大腦內的(內實質的(intra-parenchymal))、腦室內(intracerebroventricular)、肌內的、眼內、動脈內、門靜脈內(intraportal)、或病灶內(intralesional)途徑；藉由緩釋系統或藉由植入裝置。在某些實施例中，組成物可藉由彈丸注射(bolus injection)或連續地滴注，或藉由植入裝置來給藥。
組成物也可透過在其上所希望的分子已被吸收或被封裝之膜、海綿或其它合適材料的植入局部地給藥。在某些實施例中，其中植入裝置被使用時，裝置可被植入到任何合適的組織或器官，且希望分子的遞送可經由擴散、定時釋放彈丸、或連續的給藥。
在某些實施例中，組成物是每3週地藉由靜脈輸液(IV infusion)，給藥12週的初始週期。在其他實施例中，組成物每2-4週一次地藉由靜脈輸液給藥12週的初始週期。
也可期望的是體外使用根據本揭露之GITR抗原結合蛋白的藥學組成物。在這種情況下，已經從病患移除的細胞、組織或器官被暴露於GITR抗原結合蛋白藥學組成物，其後該細胞、組織及/或器官被隨後植入回病患中。
實例
下面的實施例，包括進行的實驗和取得的成果，僅為說明的目的提供，且不應當被解釋為限制所附申請專利範圍的範疇。
實例1
測定
GITR結合測定
GITR結合測定1-未標記的抗體：初級人類末梢血液T細胞在抗人類CD3(選殖株OKT3)結合的平板培養基的存在下，在生長培養基中在37℃培養48-72小時，直到上調GITR表現。收集細胞並洗滌，然後與抗人類GITR抗體或人類IgG1同型控制抗體的滴定(titration)培養在4℃。洗滌後，細胞在4℃用螢光染料共軛的抗人類CD4和抗人類CD25抗體染色，以鑑定活化的CD4+作用T細胞，並且用螢光染料共軛的抗-huIgG以偵測結合的抗-人類GITR抗體。結合至CD25+CD4+細胞的抗-人類GITR抗體的平均螢光強度藉由流動式細胞測量術來測定。使用GraphPad Prism®軟體來計算EC50s的結合曲線。
GITR結合測定2-標記的抗體：初級人類末梢血液T細胞在抗人類CD3(選殖株OKT3)結合的平板培養基的存在下，在生長培養基中在37℃培養48-72小時，直到上調GITR表現。收集細胞並洗滌，然後，與螢光染料共軛的抗人類GITR抗體或螢光染料共軛的人類IgG1同型控制抗體，以及螢光染料共軛的抗人類CD4和抗人類CD25抗體的滴定培養在4℃，以鑑定活化的CD4+作用T細胞。結合至CD25+CD4+細胞的抗-人類GITR抗體的平均螢光強度藉由流動式細胞測量術來決定。使用GraphPad Prism®軟體來計算EC50s的結合曲線。
T細胞活化作用測定
培養板結合基測定(Plate bound assays)：這個測定被設計用以檢測抗人類GITR單株抗體在TCR刺激的存在下活化不論是人類或食蟹獼猴末梢血液T細胞的能力。高結合的96-孔盤以1ug/mL抗-CD3(人類：選殖株OKT3；食蟹獼猴：選殖株SP34-2)以及0.3ug/mL抗人類IgG來塗層。抗人類GITR單株抗體或人類IgG1同型控制抗體的滴定被加至孔盤中且在37℃中培養30分鐘以允許被與培養板結合之抗人類IgG捕捉。此捕捉使抗體能交叉連接(cross-linking)，其，如以下較詳細的描述，對抗體活性是重要的。人類或食蟹獼猴T細胞被加至孔盤且培 養板在37℃中培養總共96小時。收集培養基上清液並藉由ELISA測定IFNg作為抗人類GITR抗體依賴T細胞活化作用的測量。細胞以1uCi/孔盤3H脈衝激發(pulsed)培養的最後18小時以評估抗人類GITR抗體依賴細胞增殖。
實例2
全人GITR單株抗體的製備
免疫作用及效價(titer)分析
對GITR的抗體(SEQ ID NO：1)，被提出在XenoMouse®動物(Abgenix，Fremont，加州)的多種不同品系裡，其為含有人類免疫球蛋白基因的小鼠，以及不同的免疫接種策略。不同XenoMouse®動物的三次收成被使用以產生對人類GITR的抗體。第一次收成包括XenoMouse®品系XMG2-K的小鼠，其產生全人IgG2κ抗體，以及包括XenoMouse®品系XMG4-KL的小鼠，其產生全人IgG4κ和IgG4λ抗體。第二次收成包括XenoMouse®品系XMG2-K的小鼠，其產生全人IgG2κ抗體，以及包括XenoMouse®品系XMG1-KL的小鼠，其產生全人IgG1κ和IgG1λ抗體。第三次收成僅包括XenoMouse®品系XMG4-KL的小鼠，其產生全人IgG4κ和IgG4λ抗體。收成1小鼠以CHO細胞瞬時地過表現人類GITR來免疫化。收成2小鼠以人類GITR-Fc融合蛋白來免疫化。收成3小鼠以編碼人類GITR分子的DNA表現媒介體來免疫化。
收成1小鼠以抗原注射一週兩次，超過5週時間週期，透過不論是涉及交替的IP增效，隨後在尾巴的基部皮下增效的流程，或是所有增效透過皮下注射的遞送的流程。第一次增效是總共4百萬轉染的細胞以及所有後續增效都以2百萬轉染的細胞進行，以不論為明礬或明礬/CpG作為佐劑。最後增效沒有任何其他的佐劑，且細胞直接在PBS裡免疫化。來自收成2的小鼠以透過皮下注射遞 送的10μg的抗原來初始免疫化，且所有隨後的增效用5μg的劑量來執行。皮下注射與明礬(磷酸鋁)和寡CpG混和，一週兩次，持續5週。最後的增效沒有任何額外的佐劑，且蛋白質直接在PBS裡被免疫化。收成3小鼠以塗層有著編碼GITR、鼠類GM-CSF和CpG的DNA的金色顆粒來免疫化。小鼠透過腹部免疫接種，每週兩次，總共5週。最終增效是用2百萬CHO細胞在PBS中瞬時表現GITR來進行。
使用以滴定XenoMouse®動物的流程如下：HEK293細胞被以編碼人類GITR的cDNA基因建構瞬時轉染，或者是如每個製造商建議的使用293fectin(Invitrogen公司)的空媒介體控制組(模擬)。在24小時後，模擬轉染的細胞用CFDA，SE(Invitrogen)標記，然後以1：1比值與GITR轉染的細胞混合。來自免疫化動物的XenoMouse®血清於FACS緩衝液(PBS中含2%FBS)中被稀釋至1：100，並加至細胞混合物1小時並置於冰上。在5ug/mL的與Cy5二級共軛的山羊抗人類IgG Fc的添加前，將細胞洗滌兩次，以FACS緩衝液移除未結合的抗體。 細胞用FACS緩衝液洗滌額外時間以除去未結合的二級抗體，然後在細胞上的螢光訊號是藉由在BD FACSCaliburTM儀器上的FACS分析來測定。選定收成相對於模擬-轉染細胞有著GITR-轉染細胞的最高幾何平均值訊號的動物。這包括收成1(3 XMG2-K和3 XMG4-KL)的6隻動物、收成2(2 XMG1-KL和4 XMG2-K)的6隻動物、以及收成3(XMG4-KL)的20隻動物。
淋巴球的復原、B細胞分離、融合以及融合瘤的產生
挑選的免疫化小鼠以頸椎脫位術(cervical dislocation)犧牲且從各個定群收成並匯集排乾水(draining)的淋巴結和脾的組織。B細胞從淋巴組織分離，且細胞被懸浮在DMEM裡。計數細胞，且緩慢地添加每1億的淋巴球，0.9ml DMEM以重新懸浮細胞團塊。
淋巴球與非分泌骨髓瘤以1：4的比值混合。細胞混合物以離心400×g 4分鐘小心地沉澱。在上清液的澄清之後，使用1ml吸量管小心地混合細胞。預熱來自西格馬(型號P7306)(每百萬顆B細胞1ml)的PEG/DMSO溶液緩慢地添加並小心攪拌超過1分鐘，隨後混合1分鐘。預熱的IDMEM(每百萬顆B細胞2ml)(DMEM無麩醯胺酸、L-麩醯胺酸、青黴素/鏈黴素、MEM非必需胺基酸(皆來自Invitrogen))，接著於2分鐘期間加入並小心地攪拌。最終預熱的IDMEM(每百萬顆B細胞8ml)於3分鐘期間加入。
融合的細胞旋轉沉澱(spun down)400×g 6分鐘且重新懸浮在每百萬顆B細胞20ml選擇的培養基((DMEM(Invitrogen)、15% FBS(Hyclone)、與L-麩醯胺酸、青黴素/鏈黴素、MEM非必需胺基酸、丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate)、2-巰乙醇(2-Mercaptoethanol)(皆來自Invitrogen)、HA-氮絲胺酸次黃嘌呤(Azaserine Hypoxanthine)以及OPI(草醯乙酸鹽(oxaloacetate)、丙酮酸鹽、牛胰島素)(兩者皆來自西格瑪)以及IL-6(Boehringer Mannheim))中。細胞在37℃培養20-30分鐘接著在200ml選擇的培養基中重新懸浮，並於96孔盤鍍敷前，在T175角瓶(flask)中3-4天，以產生生產GITR抗體的融合瘤。
實例3
GITR抗體的初始選擇
如在實例2中之描述所獲得的GITR抗體接著受到多種初步篩選以鑑定具有想要的結合和功能活性的組合物的潛在候選物。抗體被初始篩選他們對結合人類GITR的能力。收成1、收成2、收成3分別具有260個、108個以及2119個以FMAT或FACS鑑定的抗原特異性抗體，總共2567個GITR結合抗體。這些抗體接著進一步被測試以鑑定那些有著想要的功能活性，包括活化T細胞和與食蟹獼猴GITR交互反應的能力。
為了測定其活化T細胞的能力，抗GITR抗體被測試他們遞送共刺激訊號至T細胞，與透過抗-CD3之TCR訊號傳遞一起，的能力。T細胞活化作用被IFN-γ的分泌作用及/或增殖作用來測量。第一次兩個收成是抗原特異性融合瘤的多株，以使得功能性測定具有或不具有外生性的交互連接物在溶液中地運作以得知是否抗體可遞送生物性訊號而沒有叢簇。第三次收成選殖地鍍敷，以使得該測定可以在每個孔盤中低濃度的抗人類IgG Fc捕捉抗體地運作以為了生物測定篩選，有效地歸一化在每個孔盤中的抗原特異性抗體。其測定的是抗體的交互連接對於所有FcgR依賴IFNg分泌作用是必需的。此外，這個抗體培養板的複製性允許活性抗體的大培養板的序列分析以在主導選擇裡輔助。抗體也被測試他們在已經以抗CD3預先刺激之不論是初級食蟹獼猴T細胞(收成1和2)上或在HSC-F細胞株(收成3)上，結合至食蟹獼猴GITR的能力。這些結合和功能測定的其他細節如下。
初級篩選
結合至野生型GITR抗體的初級篩選被執行。初始和確認的結合篩選被FMAT執行在所有收成上。用於初級篩選的普通流程如下：根據製造商建議的流程使用293Fection篩選的日子之前，HEK293細胞被瞬時地以人類GITR轉染24小時。被測試抗GITR抗體(20ul/孔盤)的存在的耗竭的(exhausted)的融合瘤上清液被添加至96孔盤平板的每個孔盤之中。接著，以人類GITR轉染的4000個細胞以及12000模擬轉染的細胞被添加40μL至每個孔盤中。二級抗體(Gt抗-HuIgG Fc Cy5(Jackson型號：109-175-098))接著被添加40μL至含有細胞和融合瘤上清液的孔盤中，如此一來二級抗體的最終濃度為1μg/mL。樣品在室溫下培養3小時，然後以FMAT8200儀器讀取。Mo抗GITR/TNFSF18抗體(R & D型號：MAB689)被以1：2滴定，從10ug/mL作為在測 定中結合的陽性控制組。這種抗體的結合用以下的二級抗體(GT抗MoIgG Fc Cy5(Jackson型號：115-175-071))來執行。
功能性測定
T細胞活化作用測定如在實例1中描述的進行。
食蟹獼猴交互反應性
為了瞭解是否抗GITR抗體能夠結合至食蟹獼猴GITR，針對抗體測試他們結合至在初級T細胞上或食蟹獼猴T細胞株HSC-F之GITR的能力，其係在體外培養刺激後以誘導GITR表現的能力。簡言之，食蟹獼猴末梢血液單核細胞被Percoll梯度分離且與1ug/mL抗-CD3(FN-18(Abcam))於含有10% FBS的RPMI內培養4天。HSC-F細胞與1ug/mL抗-CD3(SP-34(BD))於含有10% FCS的RPMI內被刺激1天。T細胞與含有抗GITR抗體的耗竭的融合瘤上清液在冰上初始地培養2小時。對於初級T細胞，樣品接著被洗滌以移除未結合的抗體且以含有山羊抗人類IgG Fc Cy5(5μg/mL)、抗-CD4 FITC(OKT4(eBioscience))、抗-CD25 PE(BC96)以及5μg/mL 7-AAD的雜燴在冰上染色1小時。對於HSC-F細胞株，樣品被洗滌以移除未結合的抗體，且接著以含有山羊抗人類IgG Fc Cy5(5μg/mL)、抗-CD3 FITC(SP-34(BD))、抗-CD25 PE(BC96)以及5μg/mL 7-AAD的雜燴在冰上染色1小時。樣品接著被洗滌以移除未結合的抗體。在兩種情況下，所述結合被FACS分析藉由在BD FACSCalibur儀器上評估。
篩選結果
基於這些描述測定的結果，多種融合瘤株被鑑定作為產生與GITR有著想要的交互作用的抗體。有限稀釋被使用以從每個株分離選殖株的可管理 號碼。選殖株被指定融合瘤株號碼(例如：9H6)以及選殖株號碼(9H6.1)。一般而言，在特定的株的不同的選殖株之間，沒有被本文描述的功能性測定偵測到的差異。分離的選殖株每個在融合瘤培養基的50-100ml中延展且允許生長至耗竭(即，少於大約10%細胞存活率)。對這些培養的上清液中GITR的抗體濃度和效力藉由ELISA測定且藉由體外功能性測試，如本文描述的。基於結合和功能性測定結果，大約挑選260個抗體用於進一步分析以鑑定具有最佳活性組合的主導抗體。
實例4
來自融合瘤的人類抗體的生產
抗體使用50ml耗竭上清液從每個融合瘤產生，且接著以蛋白質A層析法來純化。融合瘤株生長在T75角瓶內於20ml(Integra Media)的培養基中。當融合瘤近乎融合在T75角瓶中時，其被轉移至Integra角瓶((Integra Biosciences，Integra CL1000，型號：90 005)中。Integra角瓶是細胞培養角瓶，其被膜區分為兩個室，小室和大室。每ml 1×106細胞的最小細胞密度，體積20-30ml的融合瘤細胞被放置於Integra角瓶的小室於Integra培養基內。Integra培養基單獨(1L)被置於Integra角瓶的大室內。分開兩個室的膜對小分子量營養物是可滲透的，但對融合瘤細胞和對那些細胞生產的抗體是不可滲透的。如此，融合瘤細胞和這些融合瘤細胞生產的抗體被滯留在小室裡。
在一週後，培養基被從Integra角瓶的兩個室中移除且以新鮮Integra培養基替換。來自小室所收集的培養基被分開地保存。在生長的第二週之後，來自小室的培養基再度被收集。針對每個融合瘤株，來自第一週所收集的培養基與來自第二週所收集的培養基結合。來自融合瘤株的最後收集的培養基樣品被旋轉(spun)以移除細胞和殘渣(15分鐘於3000rpm)，並且所得的上清液被 過濾(0.22μm)。澄清的條件培養基被裝填在蛋白質A-Sepharose管柱上。選擇性地，培養基可首先被濃縮且裝填在蛋白質A Sepharose管柱上。非特異性結合藉由大量的PBS洗滌而移除。在蛋白質A Sepharose管柱上的結合的抗體蛋白質被標準酸性的抗體從蛋白質A管柱(像是50mM檸檬酸鹽，pH 3.0)溶析。在蛋白質A Sepharose池內聚集的抗體蛋白藉由粒徑篩析層析法或在陽離子交換樹脂，像是Q Sepharose樹脂上之結合離子交換層析法移除。抗體以25個管柱體積之10mM-500mM的NaCl梯度溶析。
來自轉染的細胞的重組抗GITR人類抗體的生產
HEK293細胞(用於瞬時表現)和CHO細胞(利用於穩定的表現)被以編碼重鏈和輕鏈的質體轉染。來自轉染細胞的條件培養基被收成且藉由移除細胞和細胞殘渣來澄清。澄清的條件培養基被裝填在蛋白質A-Sepharose管柱上。選擇性地，培養基可首先被濃縮且裝填在蛋白質A-Sepharose管柱。非特異性結合藉由大量的PBS洗滌移除。在蛋白質A Sepharose管柱上的結合的抗體蛋白質從被標準酸性的抗體蛋白質A管柱(像是50mM檸檬酸鹽，pH 3.0)溶析。在蛋白質A Sepharose池內聚集的抗體蛋白藉由粒徑篩析層析法或在陽離子交換樹脂，像是Q Sepharose樹脂上之結合離子交換層析法移除。
實例5
GITR抗體的序列分析
用於上述大約260個抗體的輕鏈和重鏈的核酸序列接著以桑格(雙去氧)核酸定序(Sanger(dideoxy)nucleotide sequencing)。胺基酸序列接著推導出核酸序列。
一旦抗體被定序，抗體接著以數個不同序列和功能準則為基礎分析以進一步限制保證進一步調查的抗體數目。舉例來說，為了胺基酸或胺基酸的組合，其可能受到氧化作用、去胺作用、異構化作用、酸水解或具有造成聚集的傾向，分析序列。排除預料會是有問題的序列。進一步選擇是基於從如描述在實例3中所獲得的結合、活化作用和交互反應作用數據。基於所有這些準則的分析，總共19個親代抗體被挑選用於進一步分析和修飾。六個CDR序列的胺基酸序列，這些親代抗體的每一個的可變域(重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)以及全長重鏈(HC)以及全長輕鏈(LC)藉由他們各自的序列號碼被總結於表1。親代序列的比對被提供於第8A圖、第8B圖、第9A圖和第9B圖。
實例6
基於功能性和生物物理特質的親代抗體的選擇
為了告知用於製造合適主導抗體的額外選擇的決策過程，所挑選的19個親代抗體就多種生物物理特質和額外的功能性分析被進一步分析。生物物理分析包括表現效價、單體形式的純度相對於聚集，如藉由示差掃描卡計(differential scanning calorimeter，DSC)測量的穩定性、以及在攪拌下聚集的傾向(聚集穩定性)。額外的功能性分析包括測定GITR結合親和力和活化T細胞的能力。在分析的早期產生五個親代抗體的改造變異型(44C1、45A8、49D9、49E2以及48A9)，使受到完整分析的總抗體數目為23個。
人類抗體濃度藉由對在ForteBio Octet(儀器)上的蛋白質A感測器的結合速率決定來獲得。抗體上清液被允許結合至預濕的蛋白質A感測器120秒，於30℃，在其點計算該初始結合速率。這個速率接著相比於純化的標準品且匯報計算的濃度。預設的「基本定量與再生」流程被用於ForteBio與PBS、pH 7.4與0.1% BSA、0.02% Tween 20、0.05%疊氮化鈉(sodium azide)作為中和作用緩衝液以及10mM甘胺酸、150mM氯化鈉pH 2.0作為再生緩衝液。
示差掃描卡計(DSC)實驗在MicroCal VP-Capillary DSC上完成。在每個實驗裡，蛋白質濃度是大約0.5mg/mL於10mM醋酸鈉中、9%蔗糖於pH 5。
所有樣品皆以60℃/小時的加熱速率從20℃加熱至95℃。當分子的50%是未折疊時，決定熱轉變中點(thermal transition midpoint，Tm)。
聚集穩定性排名使用先前建立的程序被決定以基於攪拌和熱壓力排序候選者(Chen,S.，等人(2010年)，蛋白質科學期刊(Protein Sci.)19：1191-12042，以及Woodward,J.等人(2013年)，分析化學期刊(Anal.Chem.)85：6429-6436.)。
細胞結合測定和監測IFNg分泌支T細胞活化作用測定，如描述於實例1地執行。
以原始親代抗體進行的這些各種分析的結果被總結在以下表5內。
基於獲得的結果的分析，親代抗體的子集，抗體5H7、7A10、9H6、33C9以及41G5，被挑選用於進一步評估和發展。
實例7
親代GITR抗體的子集的(基因)工程
五個挑選的親代抗體的序列被進一步分析以鑑定可能負面地影響活性、穩定性、或提出免疫原性危險的殘基。相對於這後者，為了結合HLA類型II分子的潛力，分析序列，如同潛在的抗體/HLA複合物的形成可驅動T淋巴球-依賴B細胞抗體反應。五個挑選的親代抗體的數個改造變異型被後續地製備且測試以鑑定有著增進的生物物理及/或功能性特質的抗體。
五個挑選的親代抗體的改造變異型的分析結果被總結在表6。具有活性和表現量超過特定閾值的這些自表6選擇的變異型的CDRs、可變域以及用於全長輕鏈和重鏈的序列被總結在表1。改造抗體的可變域的比對提供於第10A圖、第10B圖、第11A圖和第11B圖中。
表6：挑選的親代GITR抗體改造版本的表現和生物物理參數
形成在改造的變異型上收集的數據的分析，5個變異型(9H6v3、7A10v1、5H7v2、41G5v2、33C9v2)被挑選用做進一步生物物理和功能性分析且規模擴大生產。規模擴大生產之後的抗體之生物物理參數分析的總結被提供在表7；用於挑選的變異型的功能性數據被總結在表8。
實例8
挑選的GITR抗體與GITRL競爭
一些挑選的GITR抗體在一組交互競爭作用測定內測試以判定是否他們與GITRL競爭以結合至GITR。
在這組實驗裡，在該組實驗中，Falcon®100mm培養皿(BD Facoln #353003)以5ml的10ug/ml小鼠抗-人類CD3抗體OKT3(eBioscience #16-0037-85)在室溫下塗層4小時。然後培養皿用PBS洗滌兩次。人類泛T細胞使用泛T細胞分離套組II(Pan T cell Isolation Kit II)(Miltenyi#130-091-156)從PBMCs分離。在完全培養基(PRMI1640，加10%FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸鈉、β-巰乙醇)內的五千萬個泛T細胞被接種在預先塗層CD3的培養皿裡並且在5% CO2培養箱中在37℃下培養4天以刺激T細胞增加GITR表現。
在第4天，泛T細胞被收成且以小鼠抗-人類CD4 PerCP5.5(BD Biosciences #560650)、小鼠抗-人類CD8(BD Biosciences # 555634)、以及小鼠-抗人類CD25 APC(Miltenyi #130-092-858)在4℃於染色緩衝液(2% FBS，0.05% NaN3於PBS內)中染色30分鐘以鑑定兩個不同之作用細胞族群：活化的CD4(CD25+CD4+)以及活化的CD8(CD25+CD8+)細胞。接著細胞以染色緩衝液洗滌兩次且U底平板培養基(U-bottom plate)內之每個孔盤接種0.5x106個細胞用於競爭結合。
為了評估是否抗人類GITR抗體阻斷GITR配體(GITR-L，RD#694-GL-CF)結合，來自2-64nM(選殖株9H6、5H7、41G5)之非共軛的抗人類GITR抗體的滴定被與泛T細胞在4℃下於染色緩衝液裡培養10分鐘。不洗滌，添加人類GITR-L的4nM並在4℃培養又30分鐘。接著細胞用染色緩衝液洗滌兩次，且與抗-his PE(Miltenyi #130-092-691)在染色緩衝液內，於4℃下培養30分鐘。接著細胞以染色緩衝液洗滌兩次，並與在PBS內之2%聚甲醛(paraformaldehyde)混合，用於流動式細胞測量術分析。這個實驗的結果顯示在第1A圖和第1B圖。
為了評估是否GITR-L阻斷抗人類GITR抗體結合，來自2-64nM的非共軛的人類GITR-L的滴定與泛T細胞培養在4℃於染色緩衝液內10分鐘。不洗滌，添加4nM的抗-人類GITR抗體(選殖株9H6、5H7、41G5)並在4℃培養又30分鐘。細胞以染色緩衝液洗滌兩次，且與抗人類Fc PE(Jackson ImmunoRessearch #109-116-170)在染色緩衝液內，4℃下培養30分鐘。細胞接著以染色緩衝液洗滌兩次且與在PBS內之2%聚甲醛(paraformaldehyde)混合，用於流動式細胞測量術分析。第1C圖和第1D圖顯示本研究的結果。
如從第1A圖和第1B圖可看到的，測試的抗GITR抗體的每個能夠阻斷GITRL結合至CD4+和CD8+細胞兩者。同樣地，第1C圖和第1D圖證實GITRL能阻斷測試的GITR抗體的每個結合CD4+和CD8+細胞。總結地，這些結果說明GITR抗體和GITRL彼此交互競爭對GITR之結合。
實例9
避免調控T細胞誘導的抑制
測試來自挑選的主導GITR抗體的抗體被以決定是否這樣的抗體具有避免作用T細胞活性的調控T細胞抑制的渴望活性。在這類的實驗中，抗體初始地共軛至Dynabeads如下。三百微克的GITR抗體選殖株9H6v3和人類IgG1同型控制組被共軛至15mg的Dynabeads M-270 Epoxy(Invitrogen #143.01)，根據Dynabeads抗體耦合套組(Dynabeads Antibody Coupling Kit)(Invitrogen Cat # 413.11D)使用者手冊的指示。簡言之，0.3mg的抗體與15mg的珠子在0.75ml的C1緩衝液加上0.75ml的C2緩衝液中，於37℃搖動整夜培養。次日，珠子以1.2ml的HB、LB和SB緩衝液，根據手冊依序地洗滌。耦合之後，珠子被計算且貯存在2x108珠子/ml下在4℃下有著0.02% NaN3的SB緩衝液內。
人類CD4 T細胞使用人類CD4+T細胞分離套組(Miltenyi #130-096)來分離。Treg細胞使用人類CD25微珠II(Miltenyi #130-092-983)跟隨著製造商的指令被進一步濃化。消耗CD4T細胞的CD25在抑制測定裡被使用作為T響應者。Treg抑制檢查者(inspector)(如被稱為T細胞活化作用珠子，Miltenyi # 130-092-909)，其為與抗人類CD2、CD3和CD28抗體共軛的珠子，被使用在該測定內活化T細胞。在96-孔盤平板培養基上，5萬個Treg和T響應者的每個被播種/孔盤，且與同等數目的T細胞活化作用珠子與GITR抗體珠子的滴定培養5天。細胞以3H的1uCi脈衝激發最後16個小時，且收成用於3H計數。
第2圖顯示個別實驗的結果演示GITR拮抗劑抗體9H6v3可緩解作用T細胞活性的Treg抑制的活性。
實例10
抗體造成在循環調控T細胞內降低
除了描述在實例9內的體外研究演示T細胞抑制的禁止，執行相關體內實驗以決定是否本文提供的特定抗體能夠降低在人源化NSG小鼠模型內的循環調控T細胞。
在此實驗裡，新生兒NSG小鼠藉由眼眶後(retro orbital)注射移植CD34+胎肝細胞。於16週週期期間，動物發展出包括CD4+及CD8+作用T細胞和調控T細胞多樣人類免疫細胞(抗體)集庫。單一i.p.劑量的25mg/kg抗-人類GITR抗體(9H6v3、5H7v2以及41G5v2)或人類IgG1同型控制組被給予且表現調控T細胞標記物FoxP3的循環人類CD4+ T細胞的百分比藉由流動式細胞測量術在用劑後第4天測定。
如在第3圖所示，分開給藥抗體9H6v3、5H7v2以及41G5v2的每個至人源化小鼠模型，導致相對於控制組，在調控T細胞的循環量內的降低。這樣的活性在誘導或強化免疫反應中是有用的。
實例11
透過FcγR結合之GITR抗體叢簇
幾個主導親代抗體在體外被測試以評估Fcγ受體(FcγR)的能力，特別是，Fcγ-RIIa以及Fcγ-RIIIa，以在TCR刺激的存在下媒介人類末梢血液T細胞的活化作用。
為了執行這些實驗，293T細胞被改造以表現不論是人類Fcγ-RIIa或Fcγ-RIIIa。Fcγ-R-表現的293T細胞被聚甲醛固定且與人類末梢血液CD4+ T細胞以一比一的比值接種在96孔盤平板培養基上。抗-huCD3塗層的珠子被添加至該培養基內以提供TCR刺激。抗人類GITR單株抗體或人類IgG1同型控制抗體的滴定被添加至該孔盤中且培養基在37℃培養總共96個小時。細胞以1uCi/孔盤3H被脈衝激發培養的最後18小時以評估抗人類GITR抗體依賴細胞增殖。
如顯示在第4A圖內，FcγRIIa被發現可叢簇每個主導抗體以活化初級人類T細胞。同樣地，FcγRIIIa也被發現具有叢簇活性(第4B圖)。在每個圖中的圖表代表三份孔盤的平均±StdDev且是來自5個人類捐贈者的5個實驗的代表性的。這些結果演示Fcγ受體可提供對於抗人類GITR抗體媒介的T細胞的活化作用所需的交互連接。攜帶FcgR的細胞提供用於透過GITR訊號傳遞所需要的叢簇GITR Abs。結合至GITR Abs的Fcg受體也是ADCC需要的。這些結果對抗體活性背後的生物學具有重要意義。抗體對GITR的結合不足以活化GITR。在這個例子中無如演示般地結合至Fc受體，因為除非其被聚集，否則抗體將觸發GITR訊號傳遞。
實例12
GITR抗體對人類T細胞子集的差別結合
所獲得的某些親代抗體被測試他們結合人類T細胞的不同子集的能力，以及與描述在WO 06/105021中的抗體6C8比較。
為了進行這些實驗，Falcon100mm培養皿(BD Facoln #353003)以5ml的10ug/ml小鼠抗-人類CD3抗體OKT3(eBioscience #16-0037-85)在室溫下塗層4小時。然後培養皿用PBS洗滌兩次。人類泛T細胞使用泛T細胞分離套組II(Miltenyi#130-091-156)從PBMCs分離。在完全培養基(PRMI1640，加10%FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸鈉、β-巰乙醇)內的五千萬個泛T細胞被接種在預先塗層的培養皿裡並且在5% CO2培養箱中在37℃下培養4天。
在第4天，泛T細胞被收成且以小鼠抗-人類CD4 PerCP5.5(BD Biosciences #560650)、小鼠抗-人類CD8(BD Biosciences # 555634)、以及小鼠-抗人類CD25 APC(Miltenyi #130-092-858)在4℃於染色緩衝液中(2% FBS，0.05% NaN3於PBS內)中染色30分鐘。接著細胞以染色緩衝液洗滌兩次且每個孔盤0.5x106個細胞地接種於U底平板培養基(U-bottom plate)中。
三的份抗人類GITR抗體(選殖株9H6、5H7、41G5)，以及抗體6C8，來自2-64nM與泛T細胞在4℃於染色緩衝液內培養30分鐘。接著細胞以染色緩衝液洗滌兩次，且與抗人類Fc PE(Jackson ImmuneRessearch #109-116-170)在染色緩衝液內，於4℃培養30分鐘。細胞以染色緩衝液被依序地洗滌兩次且以PBS內之2%聚甲醛固定，用於流動式細胞測量術分析。
以GITRL執行相似的實驗。
GITR Ab結合的結果被總結在第5A圖-第5D圖中。與GITRL相應的結果顯示在第6圖內。如同從這些圖中可以看到的，如本文所揭露的抗體5H7 及9H6，以及6C8，每個結合CD4+CD25+T細胞(第5A圖)，以及也結合CD8+CD25+T細胞(第5C圖)。然而，而6C8可結合CD8+CD25-T細胞，而5H7和9H6就算有也僅以非常低量結合(第5D圖)。沒有抗體被測試到結合CD4+CD25-T細胞(第5B圖)。如此，5H7以及9H6在T細胞結合和對不同人類T細胞子集之差別結合中顯示相似選擇性。
如在第6圖中說明的，GITRL也顯示對人類T細胞子集的差別結合。像抗體5H7和9H6，其可結合CD4+CD25+ T細胞和CD8+CD25+ T細胞，但也相似於5H7和9H6，以顯著地較低之親和力結合對CD4+CD25- T細胞和CD8+CD25- T細胞。如此，5H7和9H6展現的結合中之選擇性是相似於在GITRL，天然的配體，所觀察到的。
實例13
GITR抗體進入人類CD4細胞的內化
執行一組實驗以決定幾個親代抗體是否可被人類CD4細胞內化。為了對照，也測試如描述在WO 06/105021中的抗體6C8。
試驗藉由以5ml的10ug/ml小鼠抗-人類CD3抗體OKT3(eBioscience #16-0037-85)在室溫下塗層4小時的Falcon 100mm培養皿(BD Facoln #35300)起始。接著培養皿用PBS洗滌兩次。人類CD4+T細胞使用CD4+ T細胞分離套組II(CD4+ T cell Isolation Kit)(Miltenyi Biotec,#130-096-533)從PBMCs分離。在完全培養基(PRMI1640，加10%FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸鈉、β-巰乙醇)內的五千萬個泛T細胞被接種在預先塗層的培養皿裡並且在5% CO2培養箱中，在37℃下培養4天。
在第4天，CD4+ T細胞被收成且每個孔盤0.5x106個細胞地接種於96孔盤U底平板培養基中。CD4+ T細胞與在10ug/ml之共軛抗-人類GITR抗體的 Alexa-488或Alexa-647在完全培養基中，於4℃培養30分鐘。接著細胞以完全培養基被洗滌兩次且在5% CO2培養箱中在37℃下培養0、1、2、4及24小時。在培養終止時，細胞被收集。在每個孔盤中的細胞被均等地分成兩個孔盤。在一個孔盤中之細胞以150μl酸性緩衝液(10%FBS、0.5M NaCl、0.2M醋酸、pH 2.5)，於4℃培養5分鐘，然而在其他孔盤中的細胞以完全培養基培養。在培養終止時，兩個孔盤以完全培養基洗滌三次並且用抗-人類CD25 APC(Miltenyi Biotec，#130-092-858)或抗-人類CD25PE(Miltenyi Biotec,#130-091-024)在染色緩衝液中，4℃下染色30分鐘。細胞接著洗滌兩次，並以在PBS中2%聚甲醛固定，用於FACS calibur分析。
在第7圖中的結果顯示本文所揭露的抗體9H6、5H7、以及41G5，在24小時週期內，皆被內化至人類CD4細胞。相比之下，抗體6C8被內化至顯著地較低程度。
實例14
醣苷化的抗原結合蛋白的強化活性
GITR抗體的醣苷化狀態的重要性在測定中被評估，在其測定中Fcγ受體提供於CD4+ T細胞上GITR訊號傳遞必要的叢簇。代表性的天然IgG1 GITR抗體在位置297，天門冬醯胺酸被改造至麩醯胺酸的取代，其消除對將Fc結合至Fcγ受體而言為關鍵的N-連接的醣苷化位點。測試天然和無醣苷化變異型中，他們介導CD4+ T細胞活性的能力，與藉由不論是以Fcγ-RIIa或Fcγ-RIIIa所提供的GITR抗體叢簇。簡言之，293T細胞被改造以表現人類Fcγ-RIIa或人類Fcγ-RIIIa中之任一。Fcγ-R-表現之293T細胞以聚甲醛固定，並與人類末梢血液CD4+ T細胞以一比一的比值接種於96孔盤中。抗-huCD3-塗層的珠子被添加至培養基以提供TCR刺激。天然IgG1變異型和無醣苷化IgG1變異型抗-人類GITR抗體 或人類IgG1同型控制組抗體的滴定被加至該孔盤中，且該培養基在37℃下培養共96小時。細胞以1uCi/孔盤3H脈衝激發培養的最後18小時，來評估抗-人類GITR抗體依賴細胞增殖。如在第12A圖和第12B圖中所看到的，Fcγ-RIIa和Fcγ-RIIIa兩者皆能夠叢簇天然IgG1 GITR抗體並且驅動作用T細胞的增殖。與此相比，無醣苷化抗體沒有顯示出任何活性，由於其無法結合且無法藉由FcγRs叢簇。在體內，Fcγ受體提供對於抗-人類GITR抗體介導的T細胞活性所需的叢簇活性，因此，GITR抗體的醣苷化狀態是重要因素。
實例15
藥物動力學和藥效動力學分析
抗體9H6和5H7的單一劑量藥物動力學和藥效動力學(PK/PD)特徵在未使用過藥物之雄性食蟹獼猴(naïve male cynomolgus monkey)中評估，以兩個候選抗體在1.0和10mg/kg藉由彈丸式靜脈注射給藥為測試。抗體9H6在劑量1.0和10mg/kg分別展現181小時(7.55天)以及166小時(6.92天)的平均半衰期。抗體5H7在劑量1.0和10mg/kg分別展現1301小時(12.6天)以及222小時(9.23天)的平均半衰期。兩種候選者與暴露的劑量比例展現線性PK，如於濃度相比於時間曲線(AUC)下的面積所測量的。
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【序列表】
目前的申請含有已經以電子版ASCII格式遞交的序列表，且因而其全部內容藉由參考併入本文。所述的ASCII複本中文本，創於2014年12月27日，命名為「SGTWI-A14030_Sequence List(Chinese)_F.txt」且檔案大小為1,130k bytes。
<110> 美國安進公司(AMGEN INC.)
<120> GITR抗原結合蛋白
<130> A-1856
<150> 61/872,125
<151> 2013-08-30
<150> 62/031,036
<151> 2014-07-30
<160> 450
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 2
<210> 3
<211> 228
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 3
<210> 4
<211> 177
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<400> 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 115
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<212> DNA
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<220>
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<400> 116
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 225
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<211> 215
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<211> 215
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<211> 447
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 397
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 398
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 399
<210> 400
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 401
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 402
<210> 403
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 403
<210> 404
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 404
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 405
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 406
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 407
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 408
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 409
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 411
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 412
<210> 413
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 413
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<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 414
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<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 416
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<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 417
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 419
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 420
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 421
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 423
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 424
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<220>
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<400> 425
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 428
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 429
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 431
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 432
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 433
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<400> 434
<210> 435
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<400> 435
<210> 436
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ser or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> His or Tyr
<400> 436
<210> 437
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Glu,Val,Ala or Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Lys or Arg
<400> 437
<210> 438
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Gln,Leu,Glu or Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Gly,Arg or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Lys,Tyr,Leu,Phe or Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Tyr or Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Tyr or Ser
<400> 438
<210> 439
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Gly or Val
<400> 439
<210> 440
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ala or Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ala or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ser or Thr
<400> 440
<210> 441
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Leu or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> His or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asn or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser,Asn or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Trp,Leu or Ile
<400> 441
<210> 442
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 442
<210> 443
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 443
<210> 444
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 444
<210> 445
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 445
<210> 446
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 446
<210> 447
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 447
<210> 448
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<400> 448
<210> 449
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成胜肽
<400> 449
<210> 450
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的六個His標籤
<400> 450

Claims (44)

  1. 一種抗原結合蛋白，其包含：(a)分別為重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的CDRH3及CDRL3，其中重鏈可變域與輕鏈可變域係為選自如表示在表1的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59之任一個的相同抗原結合蛋白的一部分；(b)含有CDRH1、CDRH2以及CDRH3的變異型重鏈可變域，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3的一或多個，相對於選自囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗原結合蛋白之重鏈可變域的相應CDRH1、CDRH2以及CDRH3，在序列上相異，其前提是相對於重鏈可變域序列的相應互補性決定區(CDRs)而言，變異型重鏈可變域的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的序列差異集體總和不超過1、2、3、4或5個胺基酸；(c)含有CDRL1、CDRL2以及CDRL3的變異型輕鏈可變域，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3的一或多個，相對於選自囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗原結合蛋白之輕鏈可變域的相應CDRL1、CDRL2以及CDRL3，在序列上相異，其前提是相對於輕鏈可變域序列的相應互補性決定區(CDRs)，變異型輕鏈可變域的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的序列差異集體總和不超過1、2、3、4或5個胺基酸；(d)(b)的變異型重鏈可變域以及(c)的變異型輕鏈可變域，前提是變異型重鏈可變域以及變異型輕鏈可變域，分別為，如表 1中指定的相同抗原結合蛋白的重鏈可變域及輕鏈可變域的變異型；(e)含有CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重鏈可變域，其中CDRH1包含序列X1YGMX2(SEQ ID NO：436)，其中X1是S或N；且X2是H或Y；CDRH2包含序列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(SEQ ID NO：437)，其中X1是E、V、A、P；且X2是K或R；CDRH3包含序列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(SEQ ID NO：438)，其中X1是Q、L、E或R；X2是G、R、或S；X3是K、Y、L、F、或R；以及X4是Y或D；且X5是Y或S；(f)含有CDRL1、CDRL2以及CDRL3的輕鏈可變域，其中CDRL1包含序列RASQX1IRNDLG(SEQ ID NO：439)，其中X1是G或V；CDRL2包含序列X1X2SX3LQS(SEQ ID NO：440)，其中X1是A或D；X2是A或T；且X3是S或T；CDRL3包含序列X1QX2X3X4YPX5T(SEQ ID NO：441)，其中X1是L或Q；X2是H或L；X3是N或H；X4是S、N或T，且X5是W、L或I；(g)(e)的重鏈可變域和(f)的輕鏈可變域；(h)CDRH1、CDRH2以及CDRH3，每個來自如表1中指定的囊括Ab1至Ab59的抗原結合蛋白的相同之重鏈可變域； (i)CDRL1、CDRL2以及CDRL3，每個來自如表1中指定的囊括Ab1至Ab59的抗原結合蛋白的相同之輕鏈可變域；(j)(h)的CDRH1、CDRH2以及CDRH3以及(i)的CDRL1、CDRL2以及CDRL3，其中重鏈可變域與輕鏈可變域是來自相同的抗原結合蛋白；(k)重鏈可變域，其係為至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的胺基酸序列相同於如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的重鏈可變域序列；(l)輕鏈可變域，其係為至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的胺基酸序列相同於如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的輕鏈可變域序列；(m)(k)的重鏈可變域及(l)的輕鏈可變域，其中重鏈可變域及輕鏈可變域是來自如表1中指定的相同之抗原結合蛋白；(n)重鏈可變域，含有如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任何一個的重鏈可變域的胺基酸序列；(o)輕鏈可變域，含有如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任何一個的輕鏈可變域的胺基酸序列；(p)(n)的重鏈可變域以及(o)的輕鏈可變域，其中重鏈可變域以及輕鏈可變域是來自如表1中指定的相同之抗原結合蛋白；(q)全長重鏈(HC)，至少90%、95%、97%或99%胺基酸序列相同於如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任何一個的全長重鏈序列； (r)全長輕鏈(LC)，至少90%、95%、97%或99%胺基酸序列相同於如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任何一個的全長輕鏈序列；(s)(q)的全長重鏈以及(r)的全長輕鏈，其中全長重鏈和全長輕鏈是來自於表1中指定的相同抗原結合蛋白；(t)全長重鏈，其包含如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的全長重鏈的該胺基酸序列；(u)全長輕鏈，其包含如表1中指定的囊括抗原結合蛋白Ab1至Ab59的任一個的全長輕鏈的該胺基酸序列；或者(v)(t)的全長重鏈和(u)的全長輕鏈，其中全長重鏈以及全長輕鏈可來自於如表1中指定的相同抗原結合蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3，且其中CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3的一個或更多，相對於選自囊括Ab1至Ab59的群體的任何單一抗體的相應CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3，在序列上相異，前提是在互補性決定區內的序列差異集體總和不超過1、2、3、4或5個胺基酸。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3，且其中：(a)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：11、CDRL3包含SEQ ID NO：19、CDRH1包含SEQ ID NO： 31、CDRH2包含SEQ ID NO：36以及CDRH3包含SEQ ID NO：47；(b)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：18、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：40以及CDRH3包含SEQ ID NO：52；(c)CDRL1包含SEQ ID NO：10、CDRL2包含SEQ ID NO：17、CDRL3包含SEQ ID NO：28、CDRH1包含SEQ ID NO：35、CDRH2包含SEQ ID NO：45以及CDRH3包含SEQ ID NO：62；(d)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：29、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：37以及CDRH3包含SEQ ID NO：58；(e)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：14、CDRL3包含SEQ ID NO：30、CDRH1包含SEQ ID NO：3、CDRH2包含SEQ ID NO：36以及CDRH3包含SEQ ID NO：63；(f)CDRL1包含SEQ ID NO：10、CDRL2包含SEQ ID NO：17、CDRL3包含SEQ ID NO：28、CDRH1包含SEQ ID NO：35、CDRH2包含SEQ ID NO：45以及CDRH3包含SEQ ID NO：76；(g)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：29、CDRH1包含SEQ ID NO： 31、CDRH2包含SEQ ID NO：37以及CDRH3包含SEQ ID NO：58；(h)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：14、CDRL3包含SEQ ID NO：30、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：71以及CDRH3包含SEQ ID NO：63；或(i)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：11、CDRL3包含SEQ ID NO：19、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：71以及CDRH3包含SEQ ID NO：47；(j)CDRL1包含SEQ ID NO：5、CDRL2包含SEQ ID NO：12、CDRL3包含SEQ ID NO：18、CDRH1包含SEQ ID NO：31、CDRH2包含SEQ ID NO：73以及CDRH3包含SEQ ID NO：52。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含輕鏈可變域與重鏈可變域，且其中：(a)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：119，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：138；(b)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：124，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：143；(c)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：134，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：153；(d)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：135，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：154；(e)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：136，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：155；(f)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：242，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：282；(g)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：255，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：295；(h)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：262，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：302；(i)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：267，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：307；(j)輕鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：272，且重鏈可變域的胺基酸序列是至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：312。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包括輕鏈可變域和重鏈可變域，且其中：(a)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：119且重鏈可變域包含SEQ ID NO：138；(b)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：124且重鏈可變域包含SEQ ID NO：143；(c)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：134且重鏈可變域包含SEQ ID NO：153；(d)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：135且重鏈可變域包含SEQ ID NO：154；(e)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：136且重鏈可變域包含SEQ ID NO：155；(f)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：242且重鏈可變域包含SEQ ID NO：282；(g)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：255且重鏈可變域包含SEQ ID NO：295；(h)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：262且重鏈可變域包含SEQ ID NO：302；(i)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：267且重鏈可變域包含SEQ ID NO：307；(j)輕鏈可變域包含SEQ ID NO：272且重鏈可變域包含SEQ ID NO：312。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含輕鏈(LC)和重鏈(HC)，其中：(a)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：317且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：336；(b)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：322且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：341；(c)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：332且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：351；(d)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：333且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：352； (e)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：334且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：353；(f)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：360且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：400；(g)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：373且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：413；(h)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：380且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：420；(i)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：385且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：425；(j)輕鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：390且重鏈是在胺基酸序列上至少90%、95%、97%或99%相同於SEQ ID NO：430。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含輕鏈和重鏈，且其中：(a)輕鏈包含SEQ ID NO：317且重鏈包含SEQ ID NO：336；(b)輕鏈包含SEQ ID NO：322且重鏈包含SEQ ID NO：341；(c)輕鏈包含SEQ ID NO：332且重鏈包含SEQ ID NO：351； (d)輕鏈包含SEQ ID NO：333且重鏈包含SEQ ID NO：352；(e)輕鏈包含SEQ ID NO：334且重鏈包含SEQ ID NO：353；(f)輕鏈包含SEQ ID NO：360且重鏈包含SEQ ID NO：400；(g)輕鏈包含SEQ ID NO：373且重鏈包含SEQ ID NO：413；(h)輕鏈包含SEQ ID NO：380且重鏈包含SEQ ID NO：420；(i)輕鏈包含SEQ ID NO：385且重鏈包含SEQ ID NO：425；(j)輕鏈包含SEQ ID NO：390且重鏈包含SEQ ID NO：430。
  8. 一種抗原結合蛋白，其係作為與一參考抗原結合蛋白競爭對人類GITR的結合之抗原結合蛋白，其中該參考抗原結合蛋白是如申請專利範圍第5項所述的抗原結合蛋白。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白與該參考抗原結合蛋白交互競爭對人類GITR之結合。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白具有下列特徵的一個或多個：(a)為單株抗體；(b)為人類抗體、人源化抗體、或嵌合抗體；(c)為多特異性抗體；(d)為IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4類型的；(e)為抗原結合抗體片段；(f)為Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、或Fv片段；(g)為雙體、單鏈抗體、域抗體、或奈米抗體； (h)是被標記的。
  11. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白是全人抗體。
  12. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其促效人類GITR的活性。
  13. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其具有下列活性的一個或多個：(a)與GITRL交互競爭對GITR的結合；(b)可被內化進入人類CD4細胞；(c)禁止調控T細胞的抑制；(d)降低循環調控T細胞；(e)活化作用T細胞；(f)在人類血清裡具有至少6、7、9或12天的半衰期。
  14. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其為全人IgG1抗體。
  15. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其能夠結合Fcγ受體(FcγR)。
  16. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其能夠結合Fcγ受體(FcγR)，從而形成抗體結合蛋白的叢簇。
  17. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白結合人類GITR。
  18. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白具有下列特性的一個或多個：(a)以小於10nM的KD結合至SEQ ID NO：1的人類GITR多肽；(b)以小於500nM的KD結合至SEQ ID NO：2的食蟹獼猴GITR多肽。
  19. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白是促效人類GITR的IgG1類型的全人單株抗體。
  20. 如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白，其以KD 10nM結合SEQ ID NO：1的人類GITR以及以KD 500nM結合SEQ ID NO：2的食蟹獼猴GITR。
  21. 一種核酸，其編碼：(a)如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白的輕鏈可變域、重鏈可變域或其兩者；或是(b)如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白的輕鏈或重鏈或其兩者。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之核酸，其中：(a)輕鏈可變域核酸和重鏈可變域核酸分別包含如闡述於選自如表4中指定的囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗體之輕鏈可變域核苷酸序列以及重鏈可變域核苷酸序列；(b)輕鏈核酸或重鏈核酸分別包含，如闡述選自如表4中指定的 囊括Ab1至Ab59的群體之任何單一抗體之輕鏈核苷酸序列和重鏈核苷酸序列。
  23. 一種媒介體，其包含如申請專利範圍第21項或第22項所述之核酸。
  24. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第21項或第22項所述之核酸或如申請專利範圍第23項所述之媒介體。
  25. 一種製造如前述申請專利範圍中之任一項所述之抗原結合蛋白的方法，該方法包含培養如申請專利範圍第24項所述之細胞在允許該抗原結合蛋白表現之條件下，以及選擇性地從一培養基分離該抗原結合蛋白。
  26. 一種藥學組成物，包含至少一個如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白以及藥學上可接受之一體或一稀釋劑。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之藥學組成物，進一步包含由一免疫反應促進劑、一抗血管生成劑、和一化學治療劑組成的群體中挑選的一添加活性成分。
  28. 如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白或如申請專利範圍第26項或第27項所述之藥學組成物，其被用於治療上。
  29. 如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白，或如申請專利範圍第26項或第27項所述之藥學組成物，其被用於在一主體內誘導或增進一免疫反應的方法的用途，該方法包含施以該抗原結合蛋白至該主體。
  30. 一種在一主體內誘導或增進一免疫反應的方法，該方法包含施以一主體對誘導或增進免疫反應有效之量之如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白或如申請專利範圍第26項或第27項所述之藥學組成物。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中免疫反應係產生以針對一腫瘤抗原。
  32. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中免疫反應係產生以針對一傳染媒介物。
  33. 如申請專利範圍第30項至第32項中之任一項所述之方法，其中該抗原結合蛋白是以足以在該主體內達成下列一個或多個的量被施予：(a)降低調控T細胞對作用T細胞的活性的抑制；(b)減少循環調控T細胞的量；(c)作用T細胞的活化；(d)誘導或增進作用T細胞增殖；(e)抑制腫瘤生長；以及(f)誘導腫瘤退化。
  34. 一種在具有癌症的一主體內治療一癌症的方法，該方法包含施以該主體有效量之如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白或是如申請專利範圍第26項或第27項所述之藥學組成物。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該癌症是實體癌 症。
  36. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該癌症是血液的癌症。
  37. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該癌症是黑色素癌、肺癌、頭頸部癌、腎細胞癌、或直腸癌。
  38. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該癌症是非小細胞肺癌、頭頸部的鱗狀細胞癌或膀胱癌。
  39. 一種用於在具有一癌症的一主體內抑制轉移癌的方法，該方法包含施以該主體有效量之如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白或是如申請專利範圍第26項或第27項所述之藥學組成物。
  40. 如申請專利範圍第30項至第39項中任一項所述之方法，其中該方法進一步包括下列之一個或多個：(a)施以化學療法；(b)施以放射治療；(c)施以一或多個其他治療劑。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該其他治療劑是一免疫刺激劑。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中該免疫刺激劑是從由T-VEC、PD1拮抗劑、PDL1拮抗劑、CTLA-4拮抗劑以及BiTE所組成的群體中挑選。
  43. 如申請專利範圍第40項所述之方法，其中化學療法、放射治 療、或治療劑是在該抗原結合蛋白之前、同時或之後施予。
  44. 一種治療具有感染的一主體的方法，該方法包含施以對治療感染有效之量之如申請專利範圍第1項至第20項中之任一項所述之抗原結合蛋白，或是如申請專利範圍第26項或第27項所述之藥學組成物。
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