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MX2012012369A - Combinaciones que incluyen proteinas cry34ab/35ab y cry3ba para prevenir el desarrollo de resistencia en gusanos de la raiz de maiz (diabrotica spp.). - Google Patents

Combinaciones que incluyen proteinas cry34ab/35ab y cry3ba para prevenir el desarrollo de resistencia en gusanos de la raiz de maiz (diabrotica spp.).

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Publication number
MX2012012369A
MX2012012369A MX2012012369A MX2012012369A MX2012012369A MX 2012012369 A MX2012012369 A MX 2012012369A MX 2012012369 A MX2012012369 A MX 2012012369A MX 2012012369 A MX2012012369 A MX 2012012369A MX 2012012369 A MX2012012369 A MX 2012012369A
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MX
Mexico
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protein
plants
plant
field
further characterized
Prior art date
Application number
MX2012012369A
Other languages
English (en)
Inventor
Monica Britt Olson
Thomas Meade
Timothy D Hey
Aaron T Woosley
Kenneth E Narva
Kristin J Fencil
Huarong Li
Original Assignee
Dow Agrosciences Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Agrosciences Llc filed Critical Dow Agrosciences Llc
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Abstract

La invención en cuestión se relaciona en parte con Cry34Ab/35Ab en combinación con Cry3Ba; la invención en cuestión se relaciona en parte con el sorprendente descubrimiento que Cry34Ab/Cry35Ab y Cry3Ba son útiles para prevenir el desarrollo de la resistencia (a cualquier sistema de proteína insecticida solo) por una población de gusano de raíz que ataca el maíz (Diabrotica spp.); como un experto en la técnica reconocerá con el beneficio de esta descripción, las plantas que producen estas proteínas Cry insecticidas serán útiles para mitigar la inquietud que se desarrolle una población de gusanos de raíz que ataca el maíz que sea resistente a cualquiera de estos sistemas de proteína insecticida solos; la invención en cuestión es sustentada en parte por el descubrimiento que los componentes de estos sistemas de proteína no compiten entre sí para unirse a receptores del tubo digestivo del gusano de raíz que ataca el maíz; la invención en cuestión también se relaciona en parte con los apilados triples o "pirámides" de tres (o más) sistemas de toxinas, con Cry34Ab/Cry35Ab y Cry3Ba siendo el par de base; así, las plantas (y las parcelas plantadas con tales plantas) que producen esos dos sistemas de proteína insecticida se incluyen dentro del alcance de la invención en cuestión.

Description

COMBINACIONES QUE INCLUYEN PROTEÍNAS CRY34AB/35AB Y CRY3BA PARA PREVENIR EL DESARROLLO DE RESISTENCIA EN GUSANOS DE LA RAIZ DE MAÍZ (DIABROTICA SPP) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los hombres cultivan el maíz para la alimentación y aplicaciones de energía. El maíz es un cultivo importante. Es una fuente importante de alimentos, productos alimenticios y alimento para animales en muchas partes del mundo. Los insectos comen y dañan las plantas y de este modo socavan los esfuerzos realizados por el hombre. Miles de millones de dólares se gastan cada año para controlar las plagas de insectos y miles de millones adicionales se pierden por el daño que causan.
El daño causado por las plagas de insectos es uno de los factores principales de la pérdida mundial de los cultivos de maíz, a pesar del uso de medidas preventivas, como los pesticidas químicos. En función de esto, la resistencia a los insectos ha sido genéticamente diseñada en los cultivos como en el maíz a los fines de controlar el daño provocado por los insectos y reducir la necesidad de pesticidas químicos tradicionales.
Más de 4046856.42 hectáreas de maíz de los Estados Unidos están infectados con el complejo de especie de gusano de la raíz del maíz cada año. El complejo de la especie de gusano de la raíz del maíz incluye el gusano de la raíz del maíz del norte (Diabrotíca barben), el gusano de la raíz del maíz del sur (D. undecimpunctata howardí), y el gusano de la raíz del maíz del oeste (D. virgifera virgifera). (Otras especies incluyen Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño), y el complejo de gusano de la raíz del maíz brasileño {Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa).) Las larvas que habitan en el suelo de estas especies Diabrotica se alimentan en la raíz de la planta de maíz, lo que provoca que permanezcan allí. Su permanencia finalmente reduce el rendimiento del maíz y generalmente da por resultado la muerte de la planta. Al alimentarse de barbas del maíz, los escarabajos adultos reducen la polinización y, por lo tanto, afectan de manera perjuducial el rendimiento del maíz por planta. Asimismo, los adultos y las larvas del género Diabrotica atacan los cultivos cucurbitáceos (pepinos, melones, calabazas, etc.) y muchos vegetales y cultivos de campo en la producción comercial así como aquellos que se cultivan en los jardines de los hogares.
Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido herramientas primarias utilizadas para controlar las plagas de insectos, pero los insecticidas biológicos, como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han cumplido un papel importante en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticida de Bt ha revolucionado la agricultura moderna y aumentado la importancia y valor de las proteínas insecticidas y sus genes.
Las proteínas de cristal insecticida de algunas cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.) son muy conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Hofte et al., Microbial Reviews, Vol. 53, N.° 2, p. 242-255 (1989). Estas proteínas generalmente se producen mediante bacterias como aproximadamente 130 kDa protoxinas que luego se escinden mediante proteasas en el intestino medio del insecto, luego de la ingestión por el insecto, para proporcionar a penas 60 kDa toxina núcleo. Estas proteínas son conocidas como proteínas cristal porque pueden observarse inclusiones cristalinas distintivas con esporas en algunas cepas de B.t. Estas inclusiones cristalinas están generalmente compuestas de varias proteínas distintivas.
Un grupo de genes que se han utilizado para la producción de cultivos transgénicos resistentes a insectos son las delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (B.t.). Las delta-endotoxinas se han expresado exitosamente en plantas de cultivo como algodón, papas, arroz, girasol, así como maíz, y han demostrado proporcionar un control excelente respecto de las plagas de insectos. (Perlak, F. J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F. J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321 ; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11 : 1 151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1 101-1104; PCT publicación número WO 01/13731 ; y Bing J W et al. (2000) Efficacy of CryI F Transgenic Maize, 14.th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Coló.) Varias proteínas de Bt se han utilizado para crear plantas transgénicas resistentes a insectos que se han registrado de manera exitosa y comercializado hasta la fecha. Estas incluyen CrylAb, CryIAc, CryI F, Cry3Aa, y Cry3Bb en maíz, CryIAc y Cry2Ab en algodón, y Cry3A en papa. También existe SMART STAX en maíz, que comprende Cry1A.105 y Cry2Ab.
Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una sola proteína salvo en casos donde se desea el espectro insecticida combinado de 2 proteínas (por ejemplo, CrylAb y Cry3Bb en maíz combinado para proporcionar resistencia a las plagas de lepidoptera y gusanos de la raíz, respectivamente) o donde la acción independiente de las proteínas las torna útiles como una herramienta para retrasar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo, CryIAc y Cry2Ab en algodón combinado para proporcionar manejo de resistencia al gusano tabacalero).
Algunas cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos que han llevado a un rápida y amplia adopción de esta tecnología también ha causado la preocupación de que las poblaciones de plagas desarrollarán resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Varias estrategias se han sugerido para preservar la utilidad de las características de resistencia a insectos basadas en Bt que incluyen el despliegue de proteínas a una alta dosis en combinación con refugio, y alternancia con, o despliegue conjunto de, diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).
Las proteínas seleccionadas para el uso en la estructura del Manejo de Resistencia a Insectos (IRM, por sus siglas en inglés) deben ser activas de manera que la resistencia desarrollada a una proteína no confiere resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de plaga seleccionada para la resistencia a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", uno concluiría que no hay resistencia cruzada y que una combinación de Proteína A y Proteína B sería efectiva para retrasar la resistencia a la Proteína A sola.
En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, las evaluaciones pueden hacerse en base a otras características que se presume están relacionadas con el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la utilidad de la unión mediada por receptor en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no presenten resistencia cruzada (van Mellaert et al. 1999). El pronosticador clave de la falta de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por receptores en una especie de insecto sensible.
En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, luego si ese receptor muta en ese insecto de manera que una de las toxinas no se una más a aquel receptor y, por ende, no es más insecticida respecto del insecto, puede ser el caso de que también el insecto sea resistente a la segunda toxina (que se une competitivamente al mismo receptor). Es decir, se dice que el insecto es resistente en forma cruzada a ambas toxinas de Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser un indicio de que el insecto no sería simultáneamente resistente a aquellas dos toxinas.
Un sistema de proteínas insecticidas relativamente nuevo se descubrió en Bacillus thuringiensis como se describe en WO 97/40162. Este sistema comprende dos proteínas -una de aproximadamente 15 kDa y las otras de aproximadamente 45 kDa. Véase también Patente de los Estados Unidos N.° 6,083,499 y 6,127,180. Estas proteínas ahora han sido asignadas a sus propias clases, y por consiguiente recibieron las designaciones Cry de Cry34 y Cry35, respectivamente. Véase Crickmore et al. sitio web (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Muchas otras proteínas relacionadas de este tipo de sistema no se han descrito. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6,372,480; WO 01/14417; y WO 00/66742. Los genes optimizados de plantas que codifican dichas proteínas, en donde los genes están diseñados para utilizar codones para la expresión optimizada en plantas, también se han descrito. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6,218,188.
El modo exacto de acción del sistema Cry34/35 aún tiene que determinarse, pero parece formar poros en las membranas de las células del intestino del insecto. Véase Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001); Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004). Los mecanismos exactos de acción aún no son claros a pesar de las coordenadas atómicas 3D y las estructuras de cristal que se conocen para una proteína de Cry34 y una Cry35. Véase Patente de los Estados Unidos N.° 7,524,810 y 7,309,785. Por ejemplo, no es claro si una o ambas de estas proteínas unen un tipo típico de receptor, como una fosfatasa alcalina o una aminopeptidasa.
Asimismo, debido a que hay diferentes mecanismos por los que un insecto puede desarrollar resistencia a la proteína Cry (como, mediante glicosilación alterada del receptor [véase Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 5711-5717], mediante eliminación de la proteína del receptor [véase Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842], mediante mutación del receptor, u otros mecanismos [véase Heckel et al., J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197]), fue imposible predecir a príori si habría resistencia cruzada entre Cry34/35 y otras proteínas Cry. Predecir la unión competitiva para el sistema Cry34/35 es además complicado por el hecho de que dos proteínas están involucradas en el sistema binario Cry34/35. Nuevamente, no es claro si estas proteínas unen efectivamente el intestino de insecto /células de intestino y cómo lo hacen, y si interactúan o se unen entre sí y cómo lo hacen.
Otras opciones para controlar coleóptera incluyen las siguientes proteínas: Cry3Bb, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33 con ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901 , TIC1201 , ET29 con TIC810, ET70, ET76 con ET80, TIC851 , y otras. Los enfoques ARNi también se han propuesto. Véase, por ejemplo, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, n.° 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en parte con Cry34Ab/35Ab en combinación con Cry3Ba. La presente invención se relaciona en parte con el sorprendente descubrimiento que Cry34Ab/35Ab y Cry3Ba son útiles para prevenir el desarrollo de resistencia (a cualquier sistema de proteína insecticida solo) por una población de gusano de raíz de maíz (Diabrotica spp.). Un experto en la técnica reconocerá con el beneficio de la presente descripción, plantas que producen estas proteínas Cry insecticidas serán útiles para mitigar la preocupación de que podría desarrollarse una población de gusano de raíz de maíz que sería resistente a cualquiera de estos sistemas de proteína solos.
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los componentes de estos sistemas de proteína Cry no compiten entre sí para la unión de receptores del intestino del gusano de raíz del maíz.
La presente invención también se relaciona en parte con pilas triples o "pirámides" de tres (o más) sistemas de toxina, con Cry34Ab/Cry35Ab y CryBa como el par base. Por lo tanto, las plantas (y superficie en hectáreas cultivadas con dichas plantas) que producen estos dos sistemas de proteína insecticidas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La descripción detallada de los dibujos se refiere particularmente a las figuras adjuntas en las que: Figura 1A. Unión de 125l-Cry35Ab1 como una función de entrada de toxinas Cry radiomarcadas a BBMV preparadas de larvas del gusano de raíz del maíz del oeste. Unión específica =unión total— unión no específica, barra de error=SEM (error estándar de promedio).
Figura 1 B. Unión de 125l-Cry3Ba1 como una función de entrada de toxinas Cry radiomarcadas a BBMV preparadas de larvas del gusano de raíz del maíz del oeste. Unión específica =unión total— unión no específica, barra de error=SEM (error estándar de promedio).
Figura 2. Unión de 125l-Cry35Ab1 a BBMV preparada de larvas de gusano de la raíz del maíz del oeste en diferentes concentraciones de competidor no marcado (log 0.1 =-1.0, log10=1.0, log100=2.0, log1000=3.0).
Figura 3A. Porcentaje de unión de 125l-Cry35Ab1 a BBMV preparado de larvas del gusano de la raíz del maíz del oeste en ausencia de Cry34Ab1.
Figura 3B. Porcentaje de unión de 125l-Cry35Ab1 a BBMV preparado de larvas del gusano de la raíz del maíz del oeste en presencia de Cry34Ab1.
Figura 4. Porcentaje de unión de 125l-Cry3Ba1 a BBMV preparado de larvas del gusano de la raíz del maíz del oeste en presencia de varias concentraciones de diversos competidores no marcados.
BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 : Secuencia de proteína Cry35Ab1 nativa, de longitud completa.
SEQ ID NO: 2: Secuencia de proteína núcleo Cry35Ab1 quimotripsina truncada.
SEQ ID NO: 3: Secuencia de proteína Cry3Ba1 nativa, de longitud completa.
SEQ ID NO: 4: Secuencia de proteína núcleo de tripsina Cry3Ba1.
SEQ ID NO: 5: Secuencia de proteína Cry34Ab1 nativa, de longitud completa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las secuencias para la proteína Cry34Ab/35Ab pueden obtenerse del aislado de Baclllus thruingiensis PS149B1 , por ejemplo. Para otros genes, las secuencias de proteínas y aislados fuente para usarse de acuerdo con la invención en cuestión, véase Crickmore et al. sitio web (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/ Bt/intro.html), por ejemplo.
La presente invención incluye el uso de proteínas insecticidas Cry34Ab/35 Ab en combinación con una toxina Cry3Ba para proteger al maíz del daño y la pérdida de rendimiento provocada por la alimentación del gusano de raíz del maíz por poblaciones del gusano de raíz del maíz que pueden desarrollar resistencia a cualquiera de estos sistemas de proteína Cry solos (sin el otro).
La presente invención además explica pilas de Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) para evitar el desarrollo de resistencia por un gusano de la raíz del maíz a Cry3Ba y/o Cry34Ab/35 Ab.
La presente invención proporciona composiciones para controlar las plagas de gusanos de raíz del maíz que comprenden células que producen una proteína de toxina Cry3Ba y un sistema de toxina de Cry34Ab/35 Ab.
La invención además comprende un huésped transformado para producir una proteína Cry3Ba y toxina binaria Cry34Ab/35 Ab, en donde dicho huésped es un microorganismo o célula vegetal.
Además se busca que la invención proporcione un método de control de las plagas de gusano de raíz que comprende poner en contacto dichas plagas o el ambiente de dichas plagas con una cantidad efectiva de una composición que contiene una proteína Cry3Ba y además contiene una toxina binaria Cry34Ab/35 Ab.
Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen que se puede expresar en plantas que codifica una toxina binaria Cry34Ab/35 Ab y un gen que se puede expresar en planta que codifica una proteína Cry3Ba, y semilla de dicha planta.
Otra modalidad de la invención comprende una planta de maíz en donde el gen que se puede expresar en plantas que codifica una toxina binaria Cry34Ab/35 Ab y un gen que se puede expresar en planta que codifica una proteína Cry3Ba se ha introgresado en dicha planta de maíz, y semilla de dicha planta.
Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión de receptor competitivos utilizando proteína toxina núcleo Cry35Ab radiomarcada muestran que la proteína toxina núcleo Cry3Ba no compite por la unión en las muestras de tejido de insecto CRW a las que se une Cry35Ab. Véase Figura 2. Los resultados indican que la combinación de Cry3Ba y proteínas Cry34Ab/35Ab es un medio efectivo para mitigar el desarrollo de resistencia en las poblaciones de CRW a cualquier sistema de proteína solo.
Por ende, en parte en base a los datos descritos anteriormente y en otras partes en la presente, las proteínas Cry34Ab/35 Ab y Cry3Ba pueden utilizarse para producir combinaciones IRM para la prevención o mitigación del desarrollo de resistencia por CRW. Por ejemplo, otras proteínas pueden agregarse a esta combinación para expandir el espectro de control de insectos. La presente combinación (de Cry34Ab/35 Ab y proteínas Cry3Ba) también puede utilizarse en algunas "pilas triples" o "pirámides" preferidas en combinación con incluso otra proteína para controlar los gusanos de raíz, como Cry3Aa y Cry6Aa; dichas combinaciones adicionales, por ende, proporcionarán múltiples modos de acción contra un gusano de raíz. ARNi contra gusanos de raíz es incluso otra opción. Véase, por ejemplo, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, n.° 1 1 (Nov. 2007) p. 1322-1326.
A la luz de la descripción de USSN 61/327,240 (presentada el 23 de abril de 2010) relativa a las combinaciones de las proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry3Aa, USSN 61/388,273 (presentada el 30 de septiembre de 2010) relativa a combinaciones de proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa, y USSN 61/477,447 (presentada el 20 de septiembre del 2011) con respecto a las combinaciones de proteínas Cry3Aa y Cry6Aa, algunas "pilas triples" o "modos múltiples de pilas de acción" preferidas de la presente invención incluyen una proteína Cry3Ba combinada con proteínas Cry34Ab/35 Ab, junto con una proteína Cry6Aa y/o proteína Cry3Aa. Las plantas transgénicas, con inclusión de maíz, que comprende un gen cry3Ba, genes cry34Ab/35 Ab y un tercer o cuarto sistema de toxina (por ejemplo, genes Cry3Aa y/o cry6Aa) se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Por lo tanto, dichas modalidades se dirigen al insecto con al menos tres modos de acción.
Las opciones de despliegue de la presente invención incluyen el uso de proteínas Cry3Ba y Cry34Ab/35 Ab en regiones de cultivo del maíz donde Diabrotica spp. son problemáticas. Otra opción de despliegue sería utilizar una o ambas proteínas Cry3Ba y Cry34Ab/35 Ab en combinación con otras características.
Una persona experta en la técnica apreciará que las toxinas de Bt, incluso dentro de una cierta clase, como Cry3Ba y Cry34Ab/35 Ab puede variar en cierta medida.
Genes y toxinas El término "aislado" se refiere a un polinucleótido en una construcción que no ocurre naturalmente, o a una proteína en un estado purificado o que de otro modo no ocurre naturalmente. Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no solo las secuencias de longitud completa descritas sino también fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes, y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas específicamente las ejemplificadas en la presente. Como se utiliza en la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de genes hacen referencia a secuencias de nucleótido que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Como se utiliza en la presente, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas blanco que las toxinas reclamadas. Lo mismo se aplica a Cry3's y Cry34/35's, así como Cry6's (si se utilizan en pilas triples/ múltiples) de acuerdo con la presente invención. Los dominios/subdominios de estas proteínas pueden intercambiarse para formar proteínas quiméricas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 7,309,785 y 7,524,810 en relación con las proteínas Cry34/35. La patente '785 también explica proteínas Cry35 truncadas. Las toxinas truncadas también se ejemplifican en la presente.
Como se utiliza en la presente, los límites representan aproximadamente 95% (Cry3Ba's y Cry34Ab's y Cry35Ab's), 78% (Cry3B's y Cry 34A's y Cry35A's), y 45% (Cry6's y Cry 34's y Cry 35's) de identidad de secuencia, según "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Lo mismo se aplica a Cry3A's y/o Cry6's si se utilizan en pilas triples/múltiples, por ejemplo, de acuerdo con la presente invención.
Debe ser evidente para una persona experta en la técnica que los genes que codifican las toxinas activas pueden identificarse y obtenerse a través de varios medios. Los genes específicos o porciones de genes ejemplificados en la presente pueden obtenerse de aislados depositados en un depósito de cultivos. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, pueden también construirse sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden fácilmente construirse utilizando técnicas estándar para hacer mutaciones de punto. Asimismo, fragmentos de estos genes pueden elaborarse utilizando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el comercio de acuerdo con los procedimientos estándar. Por ejemplo, las enzimas como Bal31 o mutagénesis dirigida a sitio pueden utilizarse para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también pueden obtenerse utilizando una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas pueden utilizarse para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteína.
Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pestícida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la presente invención. Asimismo, debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes pueden codificar las secuencias de aminoácido descritas en la presente. Una persona capacitada en la técnica bien puede crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas o esencialmente las mismas toxinas. Las secuencias de ADN variante están dentro del alcance de la presente invención. Como se utiliza en la presente, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen inserciones, adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos que no afectan en forma relevante la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican las proteínas que retienen actividad pesticida también se incluyen en esta definición.
Otro método para identificar los genes que codifican las porciones de gen y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención es a través del uso de sondas de oligonucleótido. Estas sondas son secuencias de nucleótido detectables. Estas secuencias puede detectarse mediante un rótulo adecuado o pueden hacerse inherentemente fluorescentes como se describe en la Solicitud Internacional N.° WO93/16094. Como bien se sabe en la técnica, si la molécula de sonda y muestra de ácido nucleico se hibridan mediante la formación de un enlace fuerte entre dos moléculas, puede asumirse de manera razonable que la sonda y la muestra tienen una homología sustancial. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo en condiciones rigurosas mediante técnicas muy conocidas en el área, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sal y combinaciones de temperatura son las siguientes (en orden de mayor rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 65° C. La detección de sonda proporciona un medio para determinar en un a manera conocida si ha ocurrido hibridación. Dicho análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes que codifican toxina de la presente invención. Los segmentos de nucleótido que se utilizan como sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias de nucleótido pueden también utilizarse como cebadores PCR para amplificar genes de la presente invención.
Toxinas variantes. Ciertas toxinas de la presente invención se han ejemplificado específicamente en la presente. Dado que estas toxinas son simplemente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debe ser fácilmente evidente que la presente invención comprende variante o toxinas equivalentes (y secuencias de nucleótido que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida o similar de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácido con una toxina ejemplificada. La identidad de aminoácido generalmente será mayor a 75%, o preferentemente mayor a 85%, preferentemente mayor a 90%, preferentemente mayor a 95%, preferentemente mayor a 96%, preferentemente mayor a 97%, preferentemente mayor a 98%, o preferentemente mayor a 99% en algunas modalidades. La identidad de aminoácido generalmente será la mayor en las regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional que finalmente es responsable de la actividad biológica. En este aspecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones de aminoácido conservadoras que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden clasificarse en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos, y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido del mismo tipo se encuentran dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no afecte en forma relevante la actividad biológica del compuesto. El cuadro 1 proporciona una lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.
CUADR0 1 Clases de aminoácidos con ejemplos de aminoácidos que pertenecen a En algunos casos, las sustituciones no conservadoras también pueden realizarse. El factor crítico es que estas sustituciones no deben detractarse en forma significativa de la actividad biológica de la toxina.
Huéspedes recombinantes. Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes de vegetales o microbianos. La expresión de los genes de toxina da por resultado, en forma directa e indirecta, en la producción intracelular y mantenimiento de pesticida. La transferencia conjugal y transferencia recombinante pueden utilizarse para crear una cepa de Bt que expresa ambas toxinas de la presente invención. Otros organismos huésped también pueden transformarse con uno o ambos de los genes de toxina luego utilizarse para alcanzar el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse en el sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. En forma alternativa, el microbio que habita en el gen de toxina puede tratarse en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, luego puede aplicarse al ambiente de las plaga blanco. Las células vegetales no regenerables/no totipotenciales de una planta de la presente invención (que comprenden por lo menos uno de lo genes de IRM en cuestión) se incluyen dentro de la presente invención.
Transformación de planta. Una modalidad preferida de la presente invención es la transformación de las plantas con genes que codifican la proteína insecticida objeto o sus variantes. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por una plaga blanco de insectos por medio de la presencia de cantidades de control de la proteína insecticida objeto o sus variantes en las células de la planta transformada. Mediante la incorporación de material genético que codifica las propiedades insecticidas de las toxinas insecticidas de B.t. en un genoma de una planta comida por una plaga de insectos particular, el adulto o la larva morirían luego de consumir la planta alimento. Varios miembros de las clasificaciones de monocotiledóneas o dicotiledóneas se han transformado. Los cultivos agronómicos transgénicos así como las frutas y vegetales son de interés comercial. Dichos cultivos incluyen, pero no se limitan a, maíz, arroz, soja, cañóla, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, maníes, tomates, papas, y similares. Existen varias técnicas para introducir material genético foráneo en células vegetales, y para obtener plantas que de manera estable mantengan y expresen el gen introducido. Dichas técnicas incluyen la aceleración de material genético recubierto en micropartículas directamente en las células (Patente de los Estados Unidos N.° 4,945,050 y Patente de los Estados Unidos N.° 5,141 ,131). Las plantas pueden transformarse utilizando tecnología Agrobacterium, véase Patente de los Estados Unidos N.° 5,177,010, Patente de los Estados Unidos N.° 5,104,310, Solicitud de Patente Europea N.° 0131624B1 , Solicitud de Patente Europea N.° 120516, Solicitud de Patente Europea N.° 159418B1 , Solicitud de Patente Europea N.° 1761 12, Patente de los Estados Unidos N.° 5,149,645, Patente de los Estados Unidos N.° 5,469,976, Patente de los Estados Unidos N.° 5,464,763, Patente de los Estados Unidos N.° 4,940,838, Patente de los Estados Unidos N.° 4,693,976, Solicitud de Patente Europea N.° 116718, Solicitud de Patente Europea N.° 290799, Solicitud de Patente Europea N.° 320500, Solicitud de Patente Europea N.° 604662, Solicitud de Patente Europea N.° 627752, Solicitud de Patente Europea N.° 0267159, Solicitud de Patente Europea N.° 0292435, Patente de los Estados Unidos N.° 5.231.019, Patente de los Estados Unidos N.° 5,463,174, Patente de los Estados Unidos N.° 4,762,785, Patente de los Estados Unidos N.° 5,004,863, y Patente de los Estados Unidos N.° 5,159,135. Otra tecnología de transformación incluye tecnología WHISKERS™, véase Patente de los Estados Unidos N.° 5,302,523 y Patente de los Estados Unidos N.° 5,464,765. La tecnología de electroporación también se ha utilizado para transformar plantas, véase WO 87/06614, Patente de los Estados Unidos N.° 5,472,869, Patente de los Estados Unidos N.° 5,384,253, WO 9209696, y WO 9321335. Todas estas publicaciones y patentes de transformación se incorporan a modo de referencia. Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes foráneos también puede variar. Dicho tejido incluiría pero no se limitaría a tejido embriogénico, tejido calloso tipo I y II, hipocótilo, meristema y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden transformarse durante la desdiferenciación utilizando técnicas adecuadas dentro de la experiencia en la técnica.
Los genes que codifican cualquiera de las toxinas objeto pueden insertarse en las células vegetales utilizando una variedad de técnicas que son muy conocidas en la técnica como se describió anteriormente. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un marcador que permite la selección de las células microbianas transformadas y un sistema de replicación funcional en Escheríchia coli están disponibles para la preparación y modificación de genes foráneos para la inserción en plantas superiores. Dichas manipulaciones pueden incluir, por ejemplo, la inserción de mutaciones, truncamientos, adiciones, o sustituciones como se desee para el uso propuesto. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie 13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la proteína Cry o variantes pueden insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para transformación de células de É. coli, las células de los cuales se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se extraen y se lisan de manera que cantidades que se puedan trabajar del plásmido se recuperen. El análisis de secuencia, análisis de fragmento de restricción, electroforesis, y otros métodos biológicos bioquímico-moleculares son generalmente llevados a cabo como métodos de análisis. Luego de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede escindirse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de ADN manipulada puede clonarse en el mismo u otros plásmidos.
El uso de vectores que contienen T-ADN para la transformación de células vegetales se ha investigado de manera intensiva y se ha descrito bastante en EP 120516; Lee y Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), y An et al. (1985), y está bien establecido en el campo.
Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable a lo largo de las posteriores generaciones. El vector utilizado para transformar la célula vegetal normalmente contiene un gen marcador seleccionable que codifica una proteína que confiere a las células de vegetales transformadas resistencia a un herbicida o un antibiótico, como bialaphos, kanamicina, G418, bleomicina, o higromicina, Inter alia. El gen marcador seleccionable empleado de manera individual debería permitir, por consiguiente, la selección de células transformadas mientras que el crecimiento de células que no contienen el ADN insertado se suprime mediante el compuesto selectivo.
Un gran número de técnicas se encuentran disponibles para insertar ADN en una célula vegetal huésped. Dichas técnicas incluyen la transformación con T-ADN proporcionado mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como el agente de transformación. Asimismo, la fusión de protoplastos de plantas con liposomas que contienen el ADN a administrarse, inyección directa de ADN, transformación biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como otros métodos posibles, pueden emplearse.
En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas se transformarán con genes en donde el uso de codón de la proteína que codifica la región se ha optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5380831 , que se incorpora a la presente a modo de referencia. Además, en forma ventajosa, se utilizarán las platas que codifican una toxina truncada. La toxina truncada generalmente codificará aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Los métodos para crear genes B.t sintético para el uso en plantas son conocidos en la técnica (Stewart, 2007).
A pesar de la técnica de transformación, el gen preferentemente se incorpora en un vector de transferencia de gen adaptado para expresar los genes de toxina insecticida de B.t y variantes en la célula vegetal mediante la inclusión en el vector de un promotor vegetal. Además de los promotores vegetales, los promotores de una variedad de fuentes pueden utilizarse en forma eficiente en células vegetales para expresar genes foráneos. Por ejemplo, uno puede utilizar promotores de origen bacterial, como el promotor octopina sintasa, el promotor nopalina sintasa, y el promotor manopina sintasa. Los promotores de no Bacillus-thuringiensis pueden utilizarse en alguna modalidad preferida. Los promotores de origen de virus vegetal pueden utilizarse, por ejemplo los promotores 35S y 19S del Virus Mosaico del Coliflor, un promotor del Virus Mosaico de las Nervaduras de la Mandioca, y similares. Los promotores de plantas incluyen, pero no se limitan a, ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RUBP) unidad pequeña de carboxilasa (ssu), promotor beta-conglicinina, promotor faseolin, promotor ADH (alcohol dehidrogenasa), promotores de shock de calor, promotor ADF (factor de despolimerización de actina), promotor de ubiquitina, promotor de actina, y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de secuencia potenciadores que pueden mejorar la eficiencia de transcripción. Los potenciadores típicos incluyen, pero no se limitan a, ADH1-intrón 1 y ADH1-intrón 6. Pueden utilizarse promotores constitutivos. Los promotores constitutivos dirigen la expresión de gen continua en casi todos los tipos de células y en casi todos los momentos (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejido son responsables de la expresión de genes en células específicas o tipos de tejidos, como hojas o semillas (por ejemplo, promotores de zeina, oleosina, napina, ACP (Proteína Portadora de Acilo)), y estos promotores también pueden utilizarse. También pueden utilizarse promotores que sean activos durante cierta etapa del desarrollo de las plantas así como activos en órganos y tejidos vegetales específicos. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores que sean específicos de la raíz, específicos del polen, específicos del embrión, específicos de las barbas del maíz, específicos de la fibra del algodón, específicos del endoesperma de la semilla, específicos de floema, y similares.
En ciertas circunstancias puede ser conveniente utilizar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, como: estímulo físico (por ejemplo, genes de shock de calor); liviano (por ejemplo, RUBP carboxilasa); hormona (por ejemplo, glucocorticoide); antibiótico (por ejemplo, tetraciclina); metabolitos; y estrés (por ejemplo, sequía). Otros elementos de traducción y transcripción convenientes que funcionan en plantas pueden utilizarse, como secuencias líderes no traducidas 5', secuencias de terminación de transcripción de ARN y secuencias señal de adición de poli-adenilato. Diversos vectores de transferencia de genes específicos de plantas son conocidos en la técnica.
Los cultivos transgénicos que contienen características de resistencia a insectos (IR, por sus siglas en inglés) prevalecen en las plantas de maíz y algodón a lo largo de Norte América, y el uso de estas características se expande de manera global. Los cultivos transgénicos comerciales que combinan características de IR y tolerancia a herbicida (HT, por sus siglas en inglés) han sido desarrollados por varias empresas cerealeras. Estos incluyen combinaciones de características IR conferidas por las proteínas insecticidas de B.t. y características de HT, como la tolerancia a inhibidores de Acetolactato Sintasa (ALS), como sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina, sulfonanilidas, y similares, inhibidores de Glutamina Sintetasa (GS), como bialaphos, glufosinato, y similares, inhibidores de 4-HidroxiFenilPiruvato Dioxigenasa (HPPD), como mesotriona, isoxaflutol, y similares, inhibidores de 5-EnolPiruvilShikimato-3-Fosfato Sintasa (EPSPS), como glifosato y similares, e inhibidores de Acetil-Coenzima A Carboxilasa (ACCase), como haloxifop, quizalofop, diclofop, y similares. Otros ejemplos son conocidos en los que las proteínas proporcionadas transgénicamente proporcionan tolerancia de la planta a clases químicas de herbicida, como herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de piridiloxiacetatos auxina (véase WO 2007/053482 A2), o herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de ariloxifenoxipropionatos (véase WO 2005107437 A2, A3). La capacidad de controlar diversos problemas de plagas a través de las características de IR es un concepto del producto comercial valioso, y la conveniencia de este concepto de producto aumenta si las características de control de insecto y características de control de malezas se combinan en la misma planta. Además, puede obtenerse valor mejorado a través de combinaciones de plantas solas de características de IR proporcionadas por la proteína insecticida de B.t, como la de la presente invención, con una o más características HT adicionales, como aquellas mencionadas anteriormente, más una o más características agregadas adicionales (por ejemplo, otra resistencia a insectos conferida por B.t. -derivadas u otras proteínas insecticidas, resistencia a insectos conferida por mecanismos, como ARNi y similares, resistencia de nematodo, resistencia a enfermedad, tolerancia a estrés, utilización de nitrógeno mejorada, y similares), o característica de resultados (por ejemplo, alto contenido de aceite, composición de aceite saludable, mejora nutricional, y similares). Dichas combinaciones pueden obtenerse ya sea a través del mejoramiento convencional (pila de mejoramiento) o en forma conjunta como un suceso de transformación novedoso que implica la introducción simultánea de múltiples genes (pila molecular). Los beneficios incluyen la capacidad de manejar plagas de insectos y control mejorado de malezas en una planta de cultivo que proporciona beneficios secundarios para el productor y/o consumidor. Por lo tanto, la presente invención puede utilizarse en combinación con otras características para proporcionar un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar en una forma flexible y efectiva en términos de costos una diversidad de cuestiones agronómicas.
Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar células de germen y transmitir la o las características transformadas a las plantas de progenie.
Dichas plantas pueden cultivarse de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas se transformarán con genes en donde el uso de codón se ha optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5.380.831. Además, los métodos para crear genes de Bt sintéticos para el uso en plantas son conocidos en la técnica (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitante de planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen que se puede expresar en una planta que codifica una proteína Cry3Ba, y además comprende un segundo grupo de genes que se pueden expresar en plantas que codifican proteínas Cry34Ab/35Ab.
La transferencia (o introgresión) de la o las características determinadas por Cry3Ba y Cry34Ab/35Ab en líneas de maíz endogámicas pueden lograse mediante el mejoramiento de selección recurrente, por ejemplo, retrocruzamiento. En este caso, un padre recurrente deseado primero se cruza con un donante endogámico (el padre no recurrente) que porta el gen o genes adecuados para las características determinadas por Cry. La progenie de este cruzamiento luego se retrocruzan con el padre recurrente luego de la selección en la progenie resultante para la o las características deseadas a transferirse del padre no recurrente. Luego de tres, preferentemente cuatro, más preferentemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con el padre recurrente con la selección de la o las características deseadas, la progenie será heterocigota para el locus que controla la o las características que se transfieren, pero será como el padre recurrente para la mayoría o casi todos los otros genes (véase, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4ta Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).
Estrategias de Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) Roush et al., por ejemplo, describe dos estrategias de toxina, también llamadas "pirámides" o "apilamiento," para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
En su sitio web, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos [United States Environmental Protection Agency] (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proporcionar refugios no transgénicos (es decir, no-B.t.) (un bloque de cultivos no Bt / maíz) para el uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína Bt activa contra plagas blanco.
"Los requisitos estructurados específicos para los productos de maíz de Bt (CryIAb o CryI F) protegidos del barrenador del maíz son los siguientes: Refugios estructurados: 20% refugio de maíz de Bt no-Lepidoptera en la zona productora de maíz; 50% refugio de Bt no-Lepidoptera en la zona productora de algodón; Bloques Interno (es decir, dentro del campo de Bt) Externo (es decir, campos separados dentro ½ milla (0.926 km) (1/4 milla (0.463 km) si es posible) del campo de Bt para maximizar el cruzamiento aleatorio Fajas dentro del campo Las fajas debe tener al menos 4 hileras de ancho (preferentemente 6 hileras) para reducir los efectos del movimiento de larvas" Además, las Asociación del Cultivadores de Maíz Nacional, en su sitio web: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) también proporciona lineamientos similares en relación con los requisitos del refugio. Por ejemplo: "Requisitos del IRM al Barrenador del Maíz: - Plantar al menos 20% de sus hectáreas de maíz para refugiar híbridos -En regiones productoras de algodón, el refugio debe ser al menos 50%.
-Debe plantarse dentro de ½ milla (0.926 km) de los híbridos de refugio.
-El refugio puede plantarse como fajas dentro del campo de Bt, las fajas de refugio deben tener al menos 4 hileras de ancho.
-El refugio puede tratarse con pesticidas convencionales solo si se alcanzan los umbrales económicos para el insecto blanco.
- Insecticidas que se pueden rociar basados en Bt no pueden utilizarse en el maíz de refugio.
-El refugio adecuado debe plantarse en cada granja con maíz de Bt".
Como lo estableció Roush et al. (en las páginas 1780 y 1784 columna derecha, por ejemplo), las pilas o pirámides de dos proteínas diferentes cada una efectiva contra las plagas blanco y con poca o ninguna resistencia cruzada puede permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para una estructura exitosa, un tamaño de refugio de menos de refugio de 10%, puede proporcionar manejo de resistencia comparable a aproximadamente 50% de refugio para una sola característica (no piramidal). Para los productos de maíz de Bt en forma de pirámide actualmente disponibles, la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos requiere que se plante significativamente menos (generalmente 5%) de refugio estructurado de maíz no Bt que para productos de una sola característica (generalmente 20%).
Hay diversas maneras de proporcionar efectos de IRM de un refugio, con inclusión de varios patrones de plantación geométricos en los campos (como se mencionó anteriormente) y mezclas de semillas en sacos, como lo explica en mayor detalle Roush et al. (supra), y Patente de los Estados Unidos N.° 6,551 ,962.
Los porcentajes anteriores, o relaciones de refugio similares, pueden utilizarse para las presente pirámides o pilas dobles o triples. Debido a que la presente invención proporciona modos no competitivos múltiples de acción contra un insecto blanco e gusano de raíz, la presente invención proporcionaría "cero refugio", es decir, un campo que carece de plantas de refugio (porque no se requieren). Generalmente se requiere un permiso para los campos transgénicos típico de B.t de más de 10 acres (4.04 hectáreas). Por lo tanto, la presente invención incluye un campo de 10 acres (4.04 hectáreas) o más con "refugio cero" o sin plantas de Bt; los campos de estas dimensiones se les requeriría previamente que tengan un refugio no Bt significativo.
Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisorias, y publicaciones mencionadas o citadas en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad en la medida en que no sean incongruentes con las enseñanzas explícitas de la presente especificación.
Los siguientes son ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de solvente son por volumen salvo que se indique de otro modo. Todas las temperaturas son en grados Celsius.
Salvo que se implique o indique específicamente, los términos "un", "una", "el/la" significan "al menos uno/a" en la presente.
EJEMPLOS EJEMPL0 1 Construcción de plásmidos de expresión que codifican toxinas de longitud completa de Crv34Ab1. Crv35Ab1 v Crv3Ba.
Se utilizaron métodos de clonación estándar en la construcción de plásmidos de expresión Pseudomonas fluorescens (Pr) diseñados para producir proteínas de longitud completa Cry Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry3Ba, respectivamente. Se utilizaron las endonucleasas de restricción de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) para la digestión del ADN y se utilizó Ligasa de T4 ADN de Invitrogen para la ligación del ADN. Las preparaciones de plásmidos se realizaron mediante el Plasmid Midi kit (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se purificaron fragmentos de ADN mediante el cartucho Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA) luego de la electroforesis en gel de agarosa Tris-acetato. La estrategia de clonación básica implicó la subclonación de las secuencias codificadoras (CDS) de las proteínas Cry34Ab1 y Cry35Ab1 de longitud completa en pMYC1803 para los sitios de restricción Spel y Xhol (o Xbaf), y la CDS de una proteína Cry3Ba1 de longitud completa en pMYC1050 en los sitios de restricción Kpnl y Xbal, respectivamente por los cuales se colocaron bajo el control de expresión del promotor de Ptac y el terminador de rrnBT1T2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl), respectivamente. pMYC1803 es un plásmido de número de copia medio con el origen de replicación RSF1010, un gen resistente a la tetraciclina, y un sitio de unión a ribosomas en forma precedente a los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en los cuales pueden introducirse fragmentos de ADN que contienen regiones codificadoras de proteínas (Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2008/0193974). El plásmido de expresión se transformó mediante electroporación en una cepa P. fluorescens MB214, se recuperó en medio de hidrolisato SOC-Soy, y se colocó en placas en medio de caldo lisogénico (LB) con 20 pg/ml de tetraciclina. Los detalles acerca de las manipulaciones microbiológicas se encuentran disponibles en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2006/0008877, Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2008/0193974, y Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2008/0058262, que se incluyen en la presente a modo de referencia. Las colonias se revisaron mediante la digestión de restricción del ADN del plásmido miniprep. El ADN del plásmido de los clones seleccionados que contienen injertos se secuenció mediante el contrato con un vendedor de secuenciamiento comercial como MWG Biotech (Huntsville, AL). Los datos de secuencias se recopilaron y analizaron con el software Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
EJEMPLO 2 Crecimiento y expresión Los análisis del crecimiento y la expresión en la producción en matraces de agitación de toxinas de Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry3Ba1 para la caracterización con la inclusión de unión al receptor de Bt y bioensayo de insectos se obtuvieron mediante cepas P. fluorescens cultivadas en matraces de agitación que albergan constructos de expresión (por ejemplo, clon PMYC2593 para Cry34Ab1 , pMYC3122 para Cry35Ab1 , y pMYC1 177 para Cry3Ba1). El cultivo de semillas cultivado en medio LB que se suplemento con 20 pg/ml de tetraciclina se utilizó para inocular 200 mL del mismo medio con 20 pg/ml de tetraciclina. La expresión de las toxinas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry3Ba1 mediante el promotor Ptac se indujo mediante la adición de isopropil-ß-D-l-tiogalactopiranosida (IPTG) luego de una incubación inicial de 24 horas a 30°C con agitación. Se tomaron muestras de los cultivos en el momento de la inducción y en varios momentos luego de la inducción. La densidad de las células se midió mediante la densidad óptica a 600 nm (OD6oo)- EJEMPLO 3 Fraccionamiento de células v análisis SDS-PAGE de las muestras de los matraces de agitación En cada momento en que se tomó una muestra, se ajustó la densidad celular de las muestras a ??ß?? = 20 y alícuotas de 1-mL se centrifugaron a 14.000 x g durante cinco minutos. Las pellas celulares se congelaron a -80°C. Se generaron fracciones solubles y no solubles de las muestras de pellas celulares de matraz de agitación mediante la utilización de EasyLyse™ Solución de Extracción de Proteína Bacterial (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Cada pella celular se resuspendió en 1 mL de solución EasyLyse™ y se diluyó en forma adicional 1 :4 en regulador de pH de lisis y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lisato se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante como la fracción soluble. La pella (la fracción no soluble) luego se resuspendió en un volumen igual de solución salina regulada en su pH de fosfato (PBS; 1 .9 mM Na2HP04, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH7.4). Las muestras se mezclaron a 1 :1 con 2X Laemmli de regulador de pH de muestra con ß-mercaptoetanol y se hirvieron durante 5 minutos en forma previa a la carga sobre NuPAGE Novex 4-20% Bis-Tris gels (Invitrogen, Carlsbad, CA). La electroforesis se realizó en el regulador de pH XT MOPS recomendado. Los geles se colorearon con el SirnplyBlue™ Safe Stain de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen) y se visualizaron mediante el sistema de imágenes Typhoon (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).
EJEMPLO 4 Preparación del cuerpo de inclusión Las preparaciones del cuerpo de inclusión de la proteína Cry (IB) se realizaron en células de las fermentaciones de P. fluorescens que produjeron la proteína insecticida de B.t. no soluble, tal como lo demostró SDS-PAGE y MALDI-MS (Desorción/Ionización Asistida por Láser de Matriz/Espectrometría de Masa). Las pellas de fermentación P. fluorescens se descongelaron en un baño de agua de 37°C. Las células se resuspendieron a 25% p/v en regulador de pH de lisis [50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCI, 20 mM EDTA de sal de disodio (Ácido Etilendiaminetetraacético), 1 % Tritón X-100, y 5 mM Ditiotreitol (DTT)] y se agregaron 5 mL/L de cóctel inhibidor de la proteasa bacteriana (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) justo antes de la utilización. Las células se resuspendieron mediante un homogeneizador en la configuración más baja (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Se añadió Lisozima (25 mg de Sigma L7651 , de clara de huevo de gallina) a la suspensión celular mediante la mezcla con una espátula metálica, y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió sobre hielo durante 15 minutos, luego se sometió a sonicación mediante un Branson Sonifier 250 (dos sesiones de 1- minuto, a 50% del ciclo de trabajo, 30% de producción). La lisis celular se controló mediante microscopía. Se añadieron 25 mg adicionales de lisozima de ser necesario, y se repitieron la incubación y la sonicación. Cuando se confirmó la lisis celular mediante microscopía, el lisato se centrifugó a 1 1.500 x g durante 25 minutos (4°C) para formar la pella del IB, y se descartó el sobrenadante. La pella del IB se resuspendió con 100 mL de regulador de pH de lisis, se homogeneizó con la batidora de mano y se centrifugó tal como se realizó con anterioridad. La pella del IB se lavó en forma repetida mediante la resuspensión (en 50 mL de regulador de pH de lisis), homogenización, sonicación, y centrifugación hasta que el sobrenadante se volvió incoloro y la pella del IB se volvió firme y de color blancuzco. Para el lavado final, la pella del IB se resuspendió en agua destilada estéril filtrada (0.22 m) con 2 mM EDTA, y se centrifugó. La pella final se resuspendió en agua destilada estéril filtrada con 2 mM EDTA, y se almacenó en 1 mL de alícuotas a -80°C.
EJEMPLO 5 Análisis SDS-PAGE y cuantificación El análisis SDS-PAGE y la cuantificación de la proteína en las preparaciones de IB se realizaron mediante el descongelamiento de 1 mL de alícuota de la pella del IB y la disolución de 1 :20 con agua destilada estéril filtrada. La muestra diluida luego se hirvió con 4X de regulador de pH de muestra reductor [250 mM Tris, pH6.8, 40% glicerol (v/v), 0.4% Azul de Bromofenol (p/v), 8% SDS (p/v) y 8% ß-Mercapto-etanol (v/v)] y se cargó sobre una Novex® 4-20% Tris-Glicina, 12+2 well gel (Invitrogen) procesado con 1X Tris/Glicina/regulador de pH SDS (Invitrogen). El gel se procesó durante aproximadamente 60 min a 200 voltios, luego se coloreó y se descoloreó mediante el seguimiento de los procedimientos SirnplyBlue™ Safe Stain (Invitrogen). La cuantificación de las bandas blanco se realizó mediante la comparación de los valores densitométricos para las bandas contra las muestras de Albúmina de Suero Bovino (BSA) procesadas en el mismo gel para producir una curva estándar mediante la utilización del software Bio-Rad Quantity One®.
EJEMPLO 6 Solubilización de los cuerpos de inclusión Se centrifugaron diez mL de suspensiones de cuerpos de inclusión de clones P. fluorescens MR1253, MR1636 y MR816 (con 50-70 mg/mL de proteínas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry3Ba1 respectivamente) en la configuración más alta de una centrifugadora Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para formar en pellas las inclusiones. El sobrenadante del regulador de pH de almacenamiento se extrajo y se reemplazó con 25 mL de 100 mM de regulador de pH de acetato de sodio, pH 3.0, para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 , y 100 mM de regulador de pH de carbonato de sodio, pH 1 1 , para Cry3Ba1 , en un tubo cónico de 50 mL, respectivamente. Las inclusiones se resuspendieron mediante una pipeta y se agitaron para mezclar minuciosamente. Los tubos se colocaron en una plataforma que se mecía suavemente a 4°C durante la noche para extraer las proteínas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry3Ba1 de longitud completa. Los extractos se centrifugaron a 30.000 x g durante 30 min a 4°C, y se almacenaron los sobrenadantes resultantes (que contenían las proteínas Cry solubilizadas de longitud completa).
EJEMPLO 7 Truncamiento de protoxinas de longitud completa La Cry35Ab1 y Cry3Ba1 de longitud completa se truncaron o digirieron con quimotripsina o tripsina para producir fragmentos de núcleo de quimotripsina o tripsina que son una forma activa de las proteínas. Especialmente, Cry35Ab1 de longitud completa solubilizada se incubó con quimotripsina (páncreas bovino) (Sigma, St. MO) a (50:1 = proteína Cry: enzima, p/p) en el regulador de pH de acetato de sodio de 100 mM , pH 3.0 (Ejemplo 6), a 4°C con agitación suave durante 2-3 días, mientras que Cry3Ba1 de longitud completa se incubó con tripsina (páncreas bovino) (Sigma, St. MO) (a 20:1 = proteína Cry: enzima, p/p) en 100 mM de regulador de pH de carbonato de sodio, pH11 (Ejemplo 6), a temperatura ambiente durante 1-3 horas. El proceso proteolítico completo se confirmó mediante análisis SDS-PAGE. La masa molecular de Cry35Ab1 y Cry3Ba1 de longitud completa fue aproximadamente igual a 44 y aproximadamente igual a 73 kDa, y su núcleo de quimotripsina o tripsina fue aproximadamente igual a 40 y aproximadamente igual a 55 kDa, respectivamente. Las secuencias de aminoácido de longitud completa y de núcleo de quimotripsina de Cry35Ab1 se proporciona como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y las secuencias de aminoácido de longitud completa y núcleo de tripsina de Cry3Ba1 se proporciona como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Ni el núcleo de quimotripsina ni tripsina está disponible para Cry34Ab1 y, por lo tanto, Cry34Ab1 de longitud completa se utilizó para los ensayos de unión. La secuencia de aminoácido de longitud completa de Cry34Ab1 se proporciona como SEQ ID NO: 5.
EJEMPLO 8 Purificación de toxinas truncadas Se purificaron fragmentos del núcleo de Cry35Ab1 quimotripsinisada y Cry3Ba1 tripsinisada. Específicamente, las reacciones de digestión se centrifugaron a 30.000 x g durante 30 min a 4°C para eliminar lípidos, y el sobrenadante resultante se concentró 5 veces utilizando un dispositivo de filtro de centrifugación de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 (10.000 Límite de Peso Molecular; Millipore). Los reguladores de pH de muestra luego se cambiaron a 20 mM de regulador de pH de acetato de sodio, pH 3.5, para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 , y a 10 mM CAPS [ácido 3-(ciclohexamino)l-propansulfónico], pH 10.5, para Cry3Aa1 , utilizando columnas PD-10 desechables (GE Healthcare, Piscataway, NJ) o diálisis. Los volúmenes finales se ajustaron a 15 mi utilizando el regulador de pH correspondiente para la purificación con la utilización del sistema de cromatografía líquida ATKA Explorer (Amersham Biosciences). Para Cry35Ab1 , el regulador de pH A fue 20 mM de regulador de pH de acetato de sodio, pH 3.5, y el regulador de pH B fue regulador de pH A + 1 M NaCI, pH 3.5. Se utilizó una columna HiTrap SP (5 mi) (GE). Luego de que la columna se equilibró completamente utilizando el regulador de pH A, la solución Cry35Ab1 se inyectó en la columna a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La elución se llevó a cabo utilizando el gradiente 0-100% del regulador de pH B a 5 ml/min con 1 ml/fracción. Para Cry3Ba1 , el regulador de pH A fue 10 mM regulador de pH CAPS, pH 10.5, y el regulador de pH B fue 10 mM regulador de pH CAPS, pH 10.5 + 1 M NaCI. Se utilizó una columna Capto Q, 5 mi (5 mi) (GE) y todos los otros procedimientos fueron similares a los aplicados para Cry35Ab1. Luego del análisis SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas para selección más fracciones que contienen la proteína blanco de mejor calidad, se agruparon dichas fracciones. El regulador de pH se cambió para el núcleo de quimotripsina de Cry35Ab1 purificada con 20 mM Bist-Tris, pH 6.0, como se describió anteriormente. Para el núcleo de tripsina de Cry3Ba1 purificado, la sal se eliminó utilizando columnas PD-10 desechables (GE Healthcare, Piscataway, NJ) o diálisis. Las muestras se retiraron a 4°C para un posterior ensayo de unión luego de cuantificarse utilizando análisis SDS-PAGE y sistema de imagen Typhoon (GE) con BSA como un estándar.
EJEMPLO 9 Preparaciones de BBMV Las preparaciones de vesículas de membrana en borde de cepillo (BBMV) de insecto se han utilizado ampliamente para los ensayos de unión del receptor de la toxina Cry. Las preparaciones de BBMV utilizadas en la invención se prepararon de intestinos medios aislados de tercer estadio de la raíz del maíz occidental {Diabrotica virgifera virgifera LeConte) mediante el método descrito por Wolferberger et al. (1987). Se utilizó leucina aminopeptidasa como un marcador de las proteínas de la membrana en la preparación, y las actividades de leucina aminopeptidasa del homogenato crudo y la preparación de BBMV se determinó tal como se describió en forma previa. (Li et al. 2004a). La concentración de proteínas de la preparación de BBMV se midió mediante el método Bradford (1976).
EJEMPLO 10 Marcado 125l Cry34Ab1 de longitud completa purificada, Cry35Ab1 quimotripsinisada, y Cry3Aa tripsinisada se marcaron mediante 125l para los ensayos de unión de saturación y competitividad. A fin de garantizar que el radio-marcado no anule la actividad biológica de las toxinas de Cry, se llevó a cabo la yodación fría mediante Nal de acuerdo a las instrucciones de Pierce® lodination Beads (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, Rockford IL). Los resultados del bioensayo indicaron que el núcleo de quimotripsina de Cry35Ab1 yodinado permaneció activo contra la larva de la raíz del maíz del oeste, pero la yodinación inactivo Cry34Ab1. La unión específica de 125l-Cry34Ab1 radiomarcada al BBMV de insecto no pudo detectarse y, por lo tanto, requiere otro método de marcado para evaluar la unión del receptor de membrana de Cry34Ab1. Debido a que Cry3Ba1 tripsinisada tenía actividad limitada contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y, por lo tanto, se creyó difícil evaluar el cambio de actividad del bioensayo con el gusano de la raíz del maíz utilizando núcleo de tripsina Cry3Ba1 yodada fría. Además, la unión específica de 25l-Cry3Ba1 al BBMV se detectó incluso cuando el nivel era bajo. La yodinación fría de Cry3Ba1 y su ensayo de toxicidad se ignoraron. 125l-Cry35Ab1 y 125l-Cry3Ba1 radiomarcadas se obtuvieron a través de la yodinación con Pierce® lodination Beads (Pierce) y Na 25l. Zeba™ Desalt Spin Columns (Pierce) se utilizaron para eliminar Na125l no incorporado o libre de la proteína yodada. Las radioactividades específicas de las proteínas Cry yodadas variaron desde 1—5 uCi/ug. Se llevaron a cabo múltiples lotes de marcado y ensayos de unión.
EJEMPLO 11 Ensayos de unión de saturación Los ensayos de unión específicos o de saturación se realizaron mediante la utilización de toxinas Cry marcadas 125l tal como se describió en forma previa (Li et al. 2004b). A fin de determinar la unión específica y estimar la afinidad de unión (constante de disociación, Kd) y la concentración del sitio de unión (Bmax) de Cry35Ab1 y Cry3Ba1 a la BBMV del insecto, se incubaron una serie de concentraciones crecientes de 25l-Cry35Ab1 o 25l-Cry3Ba1 con una concentración determinada (0.1 mg/ml) de la BBMV del insecto respectivamente, en 150 ul de 20 mM Bis-Tris, pH 6.0, 150 mM KCI, complementado con 0.1% BSA a temperatura ambiente durante 1 hora con una agitación suave. La toxina unida a BBMV se separó de las toxinas libres en la suspensión por medio de la centrifugación a 20.000 x g a temperatura ambiente durante 8 min. La pella se lavó dos veces con 900 ul del mismo regulador de pH (helado) con 0.1% BSA. La radio-actividad restante en la pella se midió con un contador COBRAN Auto-Gamma (Packard, una empresa de Canberra) y consideró la unión total. Otra serie de reacciones de unión se estableció de lado a lado, y un exceso de 500—1.000 veces de la toxina sin marcar correspondiente se incluyó en cada una de las reacciones de unión para ocupar totalmente todos los sitios de unión específicos en la BBMV, que se utilizó para determinar la unión no específica. La unión específica se estimó mediante la sustracción de la unión no específica de la unión total. Los valores Kd y Bmax de estas toxinas se estimaron mediante la utilización de unión específica contra las concentraciones de la toxina marcada utilizada mediante la operación de GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). Las tablas se realizaron con el software Microsoft Excel o GraphPad Prism.
Los experimentos se reprodujeron al menos cuatro veces y el resultado se presentó en los gráficos de las Figuras 1A (unión de 125l-Cry35Ab1 a BBMV) y la Figura 1 B (unión de 125l-Cry3Ba1 a BBMV). Estos experimentos de unión demostraron que 125l-Cry35Ab1 y 125l-Cry3Ba1 se unieron específicamente a BBMV (Figura 1A y 1 B). 125l-Cry35Ab1 y 25l-Cry3Ba1 tenían una afinidad de unión Kd=11.66±11.44, 7.35±3.81 (nM), respectivamente, y una concentración de sitio de unión Bmax=0.78±0.46, 0.55±0.13 (pmol/mg BBMV), respectivamente.
La unión específica de 125l-Cry35Ab1 se llevó a cabo en presencia de Cry34Ab1 no marcada (1 :50=125l-Cry35Ab1 :Cry34Ab1 , relación molar). Los parámetros de unión (Kd y Bmax) no se obtuvieron porque la unión específica de 125l-Cry35Ab1 no se saturó (Fig.2). Sin embargo, la unión específica de 125l-Cry35Ab1 representó aproximadamente 90% de la unión total en la presencia de Cry34Ab1 no marcada.
EJEMPLO 12 Ensayos de unión de competitividad.
Se realizaron ensayos de unión de competitividad para determinar si Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en forma separada, más la mezcla como una toxina binaria, comparten un mismo grupo de sitios de unión con Cry3Ba1. Para los ensayos de unión de competitividad homólogos de Cry3Ba1 , primero se mezclaron cantidades crecientes (0—2.500 nM) de Cry3Ba1 sin marcar con 5 nM 125l-Cry3Ba1 , y luego se incubaron con BBMV de insecto a 0.1 mg/ml a temperatura ambiente durante 1 hora, respectivamente, para permitirles competir por receptores putativos en la BBMV. En forma similar, la competitividad homologa de Cry35Ab1 se completó con 5 nM 125l-Cry35Ab1 en la ausencia o presencia de Cry34Ab1 no marcada (1 :50 = 125l-Cry35Ab1 :Cry34Ab1 , relación molar), y con el BBMV a 0.03 mg/ml, respectivamente. Los porcentajes de 125l-Cry3Ba1 o 125l-Cry35Ab1 unidas a BBMV se determinaron para cada una de las reacciones según se comparó con la unión total (o específica) inicial en ausencia del competidor no marcado.
Los ensayos de unión de competitividad heteróloga entre 125l-Cry35Ab1 y Cry3Ba1 no marcado se llevaron a cabo en ausencia o presencia de Cry34Ab1 no marcada para identificar si compartían el mismo grupo de sitio o sitios de unión. Esto se alcanzó mediante el aumento de la cantidad Cry3Ba1 no marcada como un competidor para competir por la unión con 125l-Cry35Ab1 sola o 25l-Cry35Ab1+Cry34Ab1 (1 :50=125l-Cry35Ab1 :Cry34Ab1 , relación molar). En forma similar, los ensayos de unión de competitividad heterólogos recíprocos también se llevaron a cabo, lo que se logró por una creciente cantidad de Cry35Ab1 y Cry34Ab1 no marcada en forma separada, o la mezcla Cry35Ab1+Cry34Ab1 (1 :50=Cry35Ab1 :Cry34Ab1, relación molar), como uno o dos competidores incluidos en las reacciones para competir por la unión de Cry3Ba1 marcada respectivamente. Los experimentos se repitieron al menos tres veces y el resultado se gráfico en la Figura 3A (porcentaje de unión de 125l-Cry35Ab sola) y la Figura 3B (porcentaje de unión de 125l-Cry35Ab1 en la presencia de Cry34Ab1).
Los resultados experimentales demostraron que Cry35Ab1 podía competir por la unión específica de 125l-Cry35Ab1 independientemente de la ausencia (Fig. 3A) o presencia (Fig 3B) de Cry34Ab1. Sin embargo, Cry3Ba1 no puedo competir con la unión específica de 125l-Cry35Ab1 en ausencia o presencia de Cry34Ab1. En ensayos de unión de competitividad recíprocos, Cry3Ba también pudo desplazarse sobre 20% de la unión total, lo que refleja que compitió completamente con la unión específica porque la unión específica solo representa una pequeña fracción (véase Fig.lB). Sin embargo, Cry34Ab1 , o Cry35Ab1 solas, o la mezcla de Cry35Ab1+Cry34Ab1 (1 :10) no pudieron desplazar a 125l-Cry3Ba1. Estos datos indicaron que Cry35Ab1 solo o la mezcla de Cry35Ab1+Cry34Ab1 no comparten un sitio de unión de receptor con Cry3Ba1.
Referencias Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254.
Li, H., Oppert, B., Higgins, RA, Huang, F., Zhu, K.Y., Buschman, L.L., 2004a. Comparative analysis of proteinase activities of Bacillus thuríngiensis-res stant and -susceptible Ostrínia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 34, 753-762.
Li, H., Oppert, B., González-Cabrera, J., Ferré, J., Higgins, R.A., Buschman, L.L. and Zhu, K.Y. and Huang, F. 2004b. Binding analysis of CryIAb and CryIAc with membrane vesicles from Bacillus thuringiensis-resistant and -susceptible Ostrínia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 52-57.
Wolfersberger, M.G., Luthy, P., Maurer, A., Parenti, P., Sacchi, F., Giordana, B., Hanozet, G.M., 1987. Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the cabbage butterfly (Pieris brassicae). Comp. Biochem. Physiol. 86A, 301-308.
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080193974. 2008. SECUENCIAS LÍDERES BACTERIALES PARA MAYOR EXPRESIÓN. (BACTERIAL LEADER SEQUENCES FOR INCREASED EXPRESSION) Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20060008877, 2006. Sistemas de expresión con secreción de sistema sec. (Expression systems with sec-system secretion).
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080058262, 2008. Optimización rPA (rPA optimization).

Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una planta transgénica que produce una proteína Cry34, una proteína Cry35, y una proteína insecticida Cry3B.
2.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta además produce una cuarta proteína insecticida seleccionada del grupo que consta de Cry3A y Cry6A.
3.- Una semilla de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha semilla comprende dicho ADN.
4. - Un campo de plantas que comprende una pluralidad de plantas de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
5. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho campo además comprende plantas de refugio no Bt, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos de 40% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
6. - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 30% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
7 - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
8. - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
9. - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 5% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
10. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho campo carece de plantas de refugio.
11. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están en bloques o en fajas.
12. - Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 3, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos de 40% de todas las semillas en la mezcla.
13. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 30% de todas las semillas en la mezcla.
14. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 20% de todas las semillas en la mezcla.
15. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 10% de todas las semillas en la mezcla.
16.- La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 5% de todas las semillas en la mezcla.
17.- Un contenedor o saco de semillas que comprende una pluralidad de semillas de la reivindicación 3, dicho contenedor o saco tiene cero semillas de refugio.
18. - Un método de manejo de desarrollo de la resistencia a una proteína Cry por un insecto, dicho método comprende plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5 ó 10.
19. - Un campo de cualquiera de las reivindicaciones 5-1 1 , en donde dichas plantas ocupan más de 10 acres (4.04 hectáreas).
20. - Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha planta es una planta de maíz.
21.- Una célula vegetal de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha proteína Cry35 es al menos 95% idéntica con una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, dicha proteína insecticida Cry3B es al menos 95% idéntica con una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, y dicha proteína Cry34 es al menos 95% idéntica con SEQ ID NO:5.
22.- Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha proteína Cry35 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, dicha proteína insecticida Cry3B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, y dicha proteína Cry34 comprende SEQ ID NO:5.
23. - Un método de producción de la célula vegetal de la reivindicación 21.
24. - Un método de controlar el insecto de gusano de la raíz al poner en contacto dicho insecto con una proteína Cry34, una proteína Cry35, y una proteína insecticida Cry3B
25. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34A, dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35A, y dicha proteína Cry3B es una proteína Cry3Ba.
26. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34Ab y dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35Ab.
27. - La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha proteína Cry3A es una proteína Cry3Aa y dicha proteína Cry6A es una proteína Cry6Aa.
28. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34A, dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35A, y dicha proteína Cry3B es una proteína Cry3Ba.
29. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34Ab y dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35Ab.
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Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012174271A2 (en) 2011-06-16 2012-12-20 The Regents Of The University Of California Synthetic gene clusters
CN103125516B (zh) * 2011-11-24 2014-12-17 华中农业大学 对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6Aa/Cry55Aa及应用
US10968446B2 (en) 2012-11-01 2021-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
CA2920339C (en) 2013-08-16 2023-10-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
MX359027B (es) 2013-09-13 2018-09-12 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
AR097995A1 (es) * 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
ES2959628T3 (es) 2013-12-20 2024-02-27 Fraunhofer Ges Forschung Moléculas de ácido nucleico RNAPII-140 que confieren resistencia a plagas de coleópteros
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
US10227608B2 (en) 2014-02-07 2019-03-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
BR112016018103B1 (pt) 2014-02-07 2024-01-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polipeptídeo e seu uso, polinucleotídeo, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população, método para inibir o crescimento, método para controlar a infestação, método para obtenção de uma planta ou célula vegetal, construto
JP2017514492A (ja) 2014-05-07 2017-06-08 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 鞘翅目害虫に対する抵抗性を付与するｄｒｅ４核酸分子
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
CN107108705B (zh) 2014-10-16 2021-05-25 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
US10889837B2 (en) 2014-11-24 2021-01-12 Poet Research, Inc. Corn blends that include high oil corn and methods of making one or more biochemicals using high oil corn or corn blends that include high oil corn
RU2740312C2 (ru) 2015-01-15 2021-01-13 Пайониэ Хай-Бред Интернешнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
CN107529763B (zh) 2015-03-11 2021-08-20 先锋国际良种公司 Pip-72的杀昆虫组合及使用方法
CN116333064A (zh) 2015-05-19 2023-06-27 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN107771181A (zh) 2015-06-16 2018-03-06 先锋国际良种公司 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法
BR112018000729B1 (pt) 2015-07-13 2023-02-07 Pivot Bio, Inc Método de aumento de uma quantidade de nitrogênio atmosférico em uma planta de milho em um campo
CN107846897A (zh) * 2015-07-23 2018-03-27 孟山都技术公司 多功能毒素
BR122023016256B8 (pt) 2015-08-06 2024-04-30 Du Pont Polipeptídeo inseticida recombinante, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, método de obtenção de uma planta transgênica ou célula de planta transgênica, composição, proteína de fusão, método para controlar uma praga, método para inibir crescimento ou para exterminar uma população de pragas e uso do polipeptídeo
JP2018529652A (ja) 2015-08-17 2018-10-11 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 操作されたｃｒｙ６ａ殺虫性タンパク質
CN108291219B (zh) 2015-10-05 2023-02-17 麻省理工学院 使用重构nif簇的氮固定
WO2017105987A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN105506081A (zh) * 2015-12-26 2016-04-20 吉林省农业科学院 转基因植物中cry35Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN105483240A (zh) * 2015-12-26 2016-04-13 吉林省农业科学院 转基因植物中cry34Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN109072249B (zh) 2016-04-19 2023-08-18 先锋国际良种公司 具有改善的活性谱的多肽的杀昆虫组合及其用途
EP3960863B1 (en) 2016-05-04 2024-11-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US20190185867A1 (en) 2016-06-16 2019-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
RU2019101793A (ru) 2016-06-24 2020-07-24 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Регуляторные элементы растений и способы их применения
CN109788735A (zh) 2016-07-01 2019-05-21 先锋国际良种公司 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
MX2019008285A (es) 2017-01-12 2019-11-11 Pivot Bio Inc Métodos y composiciones para mejorar atributos de plantas.
WO2018148001A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Pioneer Hi-Bred International Inc Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use
MX388348B (es) 2017-04-03 2025-03-19 Monsanto Technology Llc Proteinas inhibidoras de insectos novedosas
WO2019074598A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. VIRUS-INDUCED GENETIC SILENCING TECHNOLOGY FOR THE CONTROL OF INSECTS IN MAIZE
MX2020004343A (es) 2017-10-25 2021-01-08 Pivot Bio Inc Métodos y composiciones para mejorar microbios modificados que fijan nitrógeno.
MX2020004344A (es) 2017-10-25 2020-10-14 Pivot Bio Inc Objetivos genéticos para el direccionamiento de fijación de nitrógeno para mejorar los rasgos de las plantas.
KR20200123144A (ko) 2018-02-22 2020-10-28 지머젠 인코포레이티드 바실러스가 농축된 게놈 라이브러리를 생성하고 새로운 cry 독소를 동정하기 위한 방법
BR112020017975A2 (pt) 2018-03-02 2020-12-29 Zymergen Inc. Plataforma de descoberta de proteína inseticida e proteínas inseticidas descobertas a partir da mesma
CN115850420A (zh) 2018-03-14 2023-03-28 先锋国际良种公司 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
WO2019178038A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
CA3096516A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
WO2020006064A2 (en) 2018-06-27 2020-01-02 Pivot Bio, Inc. Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes
MX2021000187A (es) 2018-07-11 2021-06-15 Pivot Bio Inc Suministro de nitrógeno dinámico temporal y espacialmente dirigido mediante microbios remodelados.
WO2020190363A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Control of nitrogen fixation in rhizobia that associate with cereals
CN112438198A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 中国农业大学 利用杂交不亲和基因在制备抗虫转基因玉米庇护所中的应用
WO2021221690A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
EP4143293A1 (en) 2020-05-01 2023-03-08 Pivot Bio, Inc. Measurement of nitrogen fixation and incorporation
CA3172322A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Karsten TEMME Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CN111574599B (zh) * 2020-05-18 2022-10-28 福建农林大学 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法
BR112022027035A2 (pt) 2020-07-14 2023-04-11 Pioneer Hi Bred Int Proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas
CN112063748A (zh) * 2020-10-13 2020-12-11 中国农业科学院生物技术研究所 用于检测转基因玉米g1105e-823c的rpa引物探针组合、试剂盒及检测方法
WO2023278804A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Pivot Bio, Inc. Genetically-engineered bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CN115029369B (zh) * 2022-06-01 2023-04-21 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 一种防治松材线虫病的苏云金芽孢杆菌工程菌制备方法与应用

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1558396A (en) * 1923-11-08 1925-10-20 Roehrs Rudolph Lienau Grass-seed container
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
EP0116718B2 (en) 1983-01-13 1996-05-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process
EP0131624B1 (en) 1983-01-17 1992-09-16 Monsanto Company Plasmids for transforming plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
AU7360087A (en) 1986-04-30 1987-11-24 Boyce Thompson Institute For Plant Research Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
EP0267159A3 (de) 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
ES2121803T3 (es) 1987-05-20 1998-12-16 Novartis Ag Plantas de zea mays y plantas transgenicas de zea mays generadas a partir de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
US5753492A (en) * 1987-08-12 1998-05-19 Mycogen Corporation Genes encoding nematode-active toxins from Bacillus thuringiensis strains
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
ES2147551T3 (es) 1990-11-23 2000-09-16 Aventis Cropscience Nv Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas.
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1993016094A2 (en) 1992-02-12 1993-08-19 Chromagen, Inc. Applications of fluorescent n-nucleosides and fluorescent structural analogs of n-nucleosides
JPH07505531A (ja) 1992-04-15 1995-06-22 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ 単子葉植物細胞の形質転換法
DK0604662T3 (da) 1992-07-07 2008-10-20 Japan Tobacco Inc Fremgangsmåde til transformering af monocotyledon
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
DE69404385T2 (de) 1993-06-04 1998-02-19 Cavis Srl Trägheitsschalter zur Ausschaltung der Batterie eines Kraftfahrzeuges
GB9318207D0 (en) * 1993-09-02 1993-10-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6372480B1 (en) 1996-04-19 2002-04-16 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
US6083499A (en) 1996-04-19 2000-07-04 Mycogen Corporation Pesticidal toxins
US5874288A (en) * 1997-07-31 1999-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins with improved activity
US6218188B1 (en) 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
US6060594A (en) * 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6023013A (en) * 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
DE19825333A1 (de) * 1998-06-05 1999-12-09 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Kontrolle von Schadorganismen in Nutzpflanzen
CA2371442A1 (en) 1999-05-04 2000-11-09 Monsanto Technology Llc Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants
US6501009B1 (en) * 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
AR025349A1 (es) 1999-08-23 2002-11-20 Mycogen Corp Metodos para controlar las plagas del gusano gris
CN1338262A (zh) * 2000-08-11 2002-03-06 张泽国 复方乌头膏及其制备方法
US6551962B1 (en) * 2000-10-06 2003-04-22 Monsanto Technology Llc Method for deploying a transgenic refuge
US7230167B2 (en) * 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US20040210964A1 (en) * 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use
EP1613161A1 (en) * 2003-04-04 2006-01-11 Syngenta Limited Improved method of resistance management for transgenic crops
US7309785B1 (en) 2003-10-03 2007-12-18 Dow Agrosciences Llc Modified chimeric Cry35 proteins
US7524810B1 (en) 2003-10-03 2009-04-28 Dow Agrosciences Llc Modified Cry34 proteins
US20050183161A1 (en) * 2003-10-14 2005-08-18 Athenix Corporation AXMI-010, a delta-endotoxin gene and methods for its use
EP1687324B1 (en) 2003-11-21 2012-08-22 Pfenex, Inc. Improved expression systems with sec-system secretion
WO2005094340A2 (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of reducing insect resistant pests in transgenic crops
DK1740039T3 (da) 2004-04-30 2012-08-20 Dow Agrosciences Llc Hidtil ukendte herbicidresistensgener
US7985892B1 (en) * 2004-06-29 2011-07-26 Dow Agrosciences Llc Truncated Cry35 proteins
CA2614353A1 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Hexima Limited Management of plant pathogens
EP1957653A4 (en) * 2005-08-30 2009-12-30 Phyllom Llc TRANSGENIC PLASTIC LAYER RESISTANT TO INSECTS
CA2628263C (en) 2005-10-28 2016-12-13 Dow Agrosciences Llc Aryloxyalkanoate auxin herbicide resistance genes and uses thereof
US8569015B2 (en) 2006-05-30 2013-10-29 Pfenex Inc. RPA optimization
CN200985135Y (zh) * 2006-12-20 2007-12-05 贵州省烟草科学研究所 细粒种子袋
US20100022390A1 (en) * 2006-12-22 2010-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Resistance management strategy
PL2468869T3 (pl) 2007-01-31 2015-08-31 Pfenex Inc Bakteryjna sekwencja wiodąca dla zwiększonej ekspresji
CN103588865B (zh) * 2007-03-28 2016-09-07 先正达参股股份有限公司 杀虫的蛋白质
US20080256669A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-16 Monsanto Company Plants with Multiple Transgenes on a Chromosome
US8486887B2 (en) * 2007-08-10 2013-07-16 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Enhancement of Bacillus thuringiensis Cry protein toxicities to coleopterans, and novel insect cadherin fragments
US20110047646A1 (en) * 2008-05-01 2011-02-24 Juan Ferre Manzanero Armyworm Insect Resistance Management in Transgenic Plants
US20090300980A1 (en) * 2008-05-02 2009-12-10 Dow Agrosciences Llc Corn with transgenic insect protection traits utilized in combination with drought tolerance and/or reduced inputs particularly fertilizer

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