NL8401780A - Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten. - Google Patents

Description

* , ·* - Werkwijze voor het inhouwen van vreemd DNA in het genoom van planten -

Het T-gebied van het Ti(tumor inducerend)- en Ri(root cf wortel inducerend)-plasmide van Agrobacterium wordt van nature overgedragen naar cellen van hogere planten, alwaar dit DNA in het genoom wordt ingebouwd en tot experssie komt. Overdracht 5 van het T-gebied of enig artificieel T-gebied treedt ook op als dit gebied in de bacterie aanwezig is op een apart· plasmide, naast een plasmide dat de essentiële virulentie genen op een Vir-gebied bevat (Het zgn. binaire vector systeem, Ned. octrooiaanvrage nr. 8300698, en tevens als onderdeel genoemd in een Ned.

10 octrooiaanvrage voor genetische manipulatie van monocotylen onder nr. 8401048). De thans beschreven verrassende, nieuwe vinding berust op een uitbreiding van het binaire vector systeem, waarbij een intact T-gebied of artificieel T-gebied als onderdeel van een transposon (Tn 1882) wordt ingebouwd in het chromosoom van 15 Agrobacterium en een Vir-gebied in de bacterie aanwezig is op een helper plasmide. Het T-gebied, ingebouwd in het bacterië-le chromosoom blijkt aldus in een binair systeem efficient naar de plantecel te worden overgedragen, alwaar het in het plante-genoom wordt geïntegreerd en tot expressie komt. Deze uitvinding 20 legt tevens vast dat het binaire systeem ook bruikbaar zal zijn indien het Vir-gebied in het bacteriële chromosoom is ingebouwd en het T-gebied aanwezig is op een plasmide of indien zowel het Vir-gebied als het T-gebied zijn ingebouwd in het bacteriële chromosoom van Agrobacterium. Met deze nieuwe vinding kunnen 8401780 -Ff - 2 - nieuwe procedures worden ontwikkeld voor de genetische manipulatie van dicotyle en monocotyle plantecellen. Nieuwe mogelijkheden voor de incorporatie van vreemd DNA in het genoom van dicotyle zowel als monocotyle plantecellen; Een binair vector systeem 5 te gebruiken in Agrobacterium waarbij- één van de componenten of beide componenten niet meer als los replicon in de bacterie aanwezig is of zijn.

De uitvinding handelt over verbeteringen in Agrobacteri-um/geicSiët voor genetische manipulatie van hogere plantecellen . 10 Een groot plasmide (Ti-plasmide), van nature aanwezig in tumorverwekkende stammen van Agrobacterium tumefaciens is verantwoordelijk voor tumorinductie op dicotyle planten (Van Larebeke et al., Nature (London) 252, 169-170 (1974); Zaenen et al., J. Mol. Biol. 86, 109-127 (1974)). Een specifiek deel van 15 het Ti-plasmide, het T-gebied genaamd, wordt door de bacterie naar de plantecel overgedragen en wordt geïntegreerd in het kern DNA (Chilton et al., Cell 11, 263-271 (1977)). Het geïntegreerde DNA komt tot expressié (Willmitzer et al., Mol. Gen Genet. 182, 255-262 (1981) en deze expressie vormt de moleculaire basis van 20 de planteziekte Crown Gall. Resulterende tumorcellen kunnen , in tegenstelling tot normale plantecellen, gekweekt worden op synthetische media zonder de toevoeging van de plantehormonen auxine en cytokinine UBraun, Proc. Natl. Acad. Sci 44, 344-349 (1958)). De tumorcellen bevatten tevens specifieke verbindingen, 25 opines genoemd, die afwezig zijn in normale cellen en waarvoor de genetische informatie gecodeerd ligt op het overgedragen T-DNA (Bomhoff et al., Mol. Gen. Genet. 145, 177-181 (1976).; Schröder et al., FEBS Lettt. 129, 166-168 (1981)1.

Behalve het T-gebied, dat in de plantecel wordt terug-30 gevonden, bevat het Ti-plasmide een tweede gebied dat essentieel is voor de virulente eigenschappen van de bacterie (Ooms et al., J. Bacteriol. 144, 82-91 (1980); Garfinkel et al., J. Bacteriol. 144, 732-743 (1980)). Dit gebied is nooit in tumorcellen aangetroffen en genetische analyses hebben aangetoond dat mutaties 8401780 - 3 - f ï in dit gebied (leidend tot sterk verzwakte virulente of complete avirulentie) intrans complementeerbaar zijn door wild type genen, aanwezig op cloons of R prime plasmides (Hille et al., Plasmid 7, 107-118 (1982); Klee et al., J. Bacteriol. 150, 327-331 (1982)}.

5 Zeven genetische loei zijn bepaald in dit Vir(virulentie)gebied, genaamd Vir A, B, C, D, E, F en D (Klee et al., J. Bacteriol.

150, 327-331 (19821; Hille et al., Plasmid 7, 107-118 (1982);

Hooykaas et al., in press (1984)).

Het Vir-gebied en het T-gebied kunnen fysisch van elkaar 10 gescheiden worden op twee compatibele plasmides zonder enig negatief effect op het vermogen van agrobacteria het T-gebied of artificieel T-gebied in de plantecel in te bouwen (Hoekema et al.,

Nature (London), 303, 179-180 (1983)) . Een op deze vinding gebaseerd binair vector systeem is bruikbaar voor de genetische 15 manipulatie van plantecellen. (beschreven in Nederlandse octrooiaanvrage nr. 8300698 en de európese aanvrage nr. 842002396, en in de Nederlandse octrooiaanvrage nr. 8401048).

De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van de componenten van het binaire systeem op plasmides 20 geen essentiële voorwaarde is. De componenten (T- of Vir-gebied) kunnen apart of beide in het chromosoom van Agrobacterium geïntegreerd worden zonder enig negatief effect op de overdracht van het T-gebied of artificieel T-gebied naar de plantecel gevolgd door integratie in het plantegenoom. De uitvinding werpt niet 25 alleen een nieuw licht op het moleculair mechanisme dat de bacterie in staat stelt DNA over te dragen naar plantecellen. Zij betekent tevens een duidelijke verruiming van de mogelijkheden die het binaire systeem biedt voor genetische manipulatie van hogere 30 planten.

Met het doel de T-regio van het Ti plasmide op verschillende plaatsen in het genoom van Agrobacterium te inserteren werd in vito het transposon Tn 1882 geconstrueerd waarop het “ Jr 8401780 - 4 - f ï hele T-gebied aanwezig is. Drie restrictieenzym-fragmenten die samen het hele T-gebied omvatten nl: EcoRI fragment 19a, BamHI fragment 17a, en Kpnl fragment 9 werden apart gesubcloneerd en in een driestapselonerlhg gebruikt om het intacte T-gebied, zo-5 als hierna volgend wordt beschreven, te reconstrueren in trans-poson Tn3 (Δ5-65). Dit gebruikte transposon (Kostriken et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci 78, 4041-4045 (1982)) is een afgeleide van Tn3 waarin een EeoRI-site is geïntroduceerd op een plaats die niet essentieel is voor transpositie van het transposon of zijn 10 ampicilline resistentie. Dit transposon werd vervolgens geinserteerd in het E coli vector plasmide pTR262 (Roberts et al., Gene 12, 123-127 (1980)) dat zelf geen EcoRI site bevat. In de unieke EcoRI site van het resulterende plasmide pRAL 3103 werd het EcoRI fragment 19a van pTiB6 gedoneerd.. In de volgende stap werd BamHi I5 fragment 17a , dat gedeeltelijk met EcoRI fragment 19a overlapt , in de natuurlijke BamHi-site geplaatst (positie 13.774 volgens Barker et al., Plant.Mol.Biol.2, 335-350 (1983)). Hiervoor werd eerst het Tn3 afgeleide transposon met daarin EcoRi fragment 19a (Tn 1880) overgezet op pRAL 3102, een plasmide waaruit d.m.v.

20 in vitro deletie de BamHi site was verwijderd.. Plasmide pRAL 3102 werd hiertoe getransformeerd naar een E.coli stam waar pAL 1155 (R 772:: Tn 1880) aanwezig was. De resulterende stam werd als donor gebruikt in een kruising naar een lege E coli stam. Selectie voor mobilisatie van pRAL 3102 door pAL 1155 leverde 2 type transconjuganten. De transconjuganten waarbij Tn 1880 naar pRAL 3102 was gesprongen werden gezuiverd door plasmide DNA te isoleren en dit DNA opnieuw te gebruiken voor transformatie van een lege E.coli stam,selecterend voor de markers van pRAL 3102 en Tn 1880. Aldus werd pRAL 3955 verkregen, waarop hét 30 transposon Tn 1880 is gelegen. In de unieke BamHi site van Tn 1880 op het plasmide pRAL 3955 werd BamHIfragment 17a in de juiste oriëntatie gedoneerd, (zie fig. 1) .Het hieruit resulterende plasmide pRAL 3956 bevat nu de T-gebied genen 3, 6a, 6b en het 84 0 1 7 B 0 ï \ - 5 - rechter deel van gen 4 als een ononderbroken stuk DNA aanwezig op een transposeerbaar element. In de unieke Kpnl site van pRAL 3956 werd vervolgens als laatste het Kpnl fragment 9 gedoneerd in de juiste oriëntatie op de natuurlijke positie (positie 9834).

5 Het aldus verkregen plasmide pRAL 3957 bevat het transposon Tn 1882 dat het intacte T-gebied van het Ti B6 plasmide omvat.

Om na te gaan of Th 1882 inderdaad een functioneel T-gebied bevatte, werden Agrobacterium stammen geconstrueerd die zowel het virulentie plasmide pAL 4404 , als een hiermee compati-10 bel plasmide waarop Tn 1882 gelegen was, bevatten. Hiertoe werd Tn 1882 geinserteerd in plasmide R772. Plasmide R772 werd ingekruist in een E.coli stam die pRAL 3957 bevatte. Doorkruisen naar een lege stam met selectie voor overdracht van de Ap van Tn 1882 geeft 2 soorten transconjuganten. Dit valt te verklaren uit het 15 gegeven dat plasmide R772 met lage frequentie pRAL 3957 gemobiliseerd kan hebben, waarbij ook de andere markers van pRAL in de transconjuganten aanwezig zijn, of Tn 1882 kan door transpositie op R772 zijn terechtgekomen. Aanwezigheid van het transposon op R772 in één van de 2 soorten transconjuganten werd vastgesteld 20 door gelelectroforese van plasmide DNA behandeld met restrictie enzymen. Het R772 plasmide met daarop Tn 1882 werd pAl 1157 genoemd. Het plasmide pAL 1157 werd vervolgens via conjugatie binnengebracht in LBA 4404 (pAL 4404). De tumorigene eigenschappen van LBA 4404 (pAL 4404, pAL 1157) bleken dezelfde als die van de wild 25 type. A.tumefaciens stam LBA 1010 voor alle geteste gastheerplan-ten. Dit resultaat liet zien dat transposon Tn 1882 een normaal functionerend T-gebied bevatte.

Voor de insertie van Tn 1882 in het chromosoom van A. tumefaciens zijn verschillende benaderingen gebruikt. Een eerste 20 benadering omvatte de constructie in E.coli van het plasmide pRAL 3958. Dit plasmide is afgeleid van pRK 2013, een conjugatief plasmide dat niet in A.tumefaciens kan repliceren. Dit betekent 9401780 ? * ' - 6 - dat in. principe pRAL 3958 (pRK 2013:: Tn 1882) gebruikt kan worden als "suicide plasmide" in A.tumefaciens, waarbij Tn 1882 kan achterblijven door transpositie naar het genoom van de Agrobacterium stam, terwijl pRAL 3958 zelf verloren gaat. Met dit doel werd 5 een E.coli stam met pRAL 3958 als donor gebruikt in een kruising met A.tumefaciens stam LBA 288, die geen Ti plasmide bevat.

R

Hoewel de resistentie marker van Tn 1882 (Ap ) goed tot expressie

R

komt in LBA 288 werd geen overdracht van de Ap marker, gevonden. Conjugatieve overdracht van pRAL 3958 binnen Ξ.coli trad op met een frequentie van 30% per recipient. Het voor Agrobacterium gevonden negatieve resultaat geeft aan dat Tn 1882 niet of nauwelijks "springt" in het genoom van A.tumefaciens.We hebben dit probleem omzeild door eerst een genomisch stuk DNA van A.tumefaciens aan te brengen op een "suicide" donor plasmide voor 15 Tn 1882. De strategie omvatte /3 stappen:(zie figuur 2) i) A.tumefaciens genomisch DNA, geïsoleerd uit LBA 288, werd gedoneerd in de E.coli vector pACYC 184. ii) in één van de cloons, namelijk pRAL 3305, werd Tn 1882 geïntroduceerd d.m.v. transpositie in E.coli, iii) het hietbij ontstane plasmide pRAL 20 3959 kan ook niet repliceren in A.tumefaciens en is dus in

Agrobacterium als "suicide" donor te gebruiken voor Tn 1882.

Daartoe werd pRAL 3959 gemobiliseerd naar LBA 288.

De Ap van de Tn 1882 kan nu niet alleen in Agrobacterium achterblijven door eventuele transpositie, maar tevens kan het hele plasmide in het genoom terecht komen door homologe recombina- tle over het gedoneerde A.tumefaciens genomisch DNA fragment.

-7

De mobilisatie naar LBA verliep met een frequentie van 10 per recipient, terwijl (ter controle) mobilisatie van dit plas- -4 mide binnen E.coli optrad met een frequentie van 10 per recipient. Uit deze resultaten blijkt dat pRAL 3959 inderdaad niet kan repliceren in A.tumefaciens. Eén van de Agrobacterium transconjugenten, LBA 1160, werd in detail geanalyseerd teneinde vast te stellen of Tn 1882 inderdaal in het chromosoom van 8401780 - 7 - Λ 'f i

Agrobacterium is ingebouwd.

Het uit Agrobacterium stam ISA 288 gedoneerde stuk genomisch DNA (pRAL 3305} kon namelijk afkomstig zijn geweest van zowel het chromosoom als van het cryptisch plasmide pAt C58 5 dat aanwezig is in LBA 288. Het is daardoor ook mogelijk dat een eventuele recombinatie van pRAL 3959 in LBA 1160 kon zijn opgetreden met zowel het chromosoom als met pAtC58. Stam LBA 1160 werd genetisch gekarakteriseerd ( i en ii) en het DNA van de stam werd geanalyseerd m.b.v. Southern blot hybridisatie (iii) 10 om onderscheid te kunnen maken tussen beide mogelijkheden i} Door random transposon mutagenese werd het cryptisch plasmide pAtC58 van eei selecteerbare marker voorzien. Hiertoe werd het "suicide" plasmide pJB4ji als Tn 5 donor gebruikt voor LBA 288, zoals werd beschreven voor mutagenese van Rhizobium 15 leguminosarum (Berlinger et al., Nature (London), 276, 633-634 (1978}). Via conjugatie experimenten werd aangetoond dat in een aantal gevallen Tn 5 in LBA 288 aanwezig was op een zelfover- draagbaar plasmide. Dit plasmide bleek pAtC58 (overdrachtfrequen--7 tie 10 per recipient). Deze nieuw gevonden eigenschap van 20 pAtC58 om zichzelf te kunnen overdragen werd benut om te bepalen of Tn 1882 in LBA 1160 aanwezig was op pAtC58 of niet. Hiertoe werden ter onderlinge vergelijking LBA 1160 en LBA 1201 (pAtC58::

Tn 5) beide als donor stammen gebruikt in kruisingen met LBA 285. Na selectie op transconjuganten bleek pAtC58::Tn 5 , zoals -7 25 verwacht, overgedragen to worden met een frequentie van 10 per

R

recipient. Geen overdracht van de Ap van Tn 1882 uit LBA 1160 kon echter worden aangetoond. Dit gegeven vormde een sterke aanwijzing voor de veronderstelling dat Tn 1882 in de donor stam LBA 1160 niet aanwezig was op het cryptisch plasmide pAtC58.

33 ii) Plasmiden die niet stabiel in één bacteriecel ge handhaafd kunnen worden zonder dat selectieve druk wordt uitgeoefend, behoren tot eenzelfde incompatibiliteitsklasse (inc.) A fortiori zijn dus plasmides incompatibel met zichzelf. Wanneer 8401780 ί ·

- 8 -R

een Τη 5 gemarkeerd pAtC58 (Km ) geïntroduceerd wordt i,n een A.

£ tumefaciens stam met een Tn 1831 gemarkeerd pAtC58 (Sp ) en er wordt geselecteerd op het binnenkomend plasmide (Km ) dan levert dat

R

verlies op van de Sp marker door imcompatibiliteit, dus verdrijving 5 van het reeds aanwezige plasmide, in het grootste deel van de transconjuganten. LBA 1160 werd derhalve nu gebruikt als recipient in een kruising met LBA 1201 (pAtC58:: Tn5) als donor.

R

Er werd geselecteerd (Km ] op het binnenkomend plasmide pAtC58::Tn5 en in de transconjuganten werd gecontroleerd of de Ap , afkomstig 10 van Tn 1882, verloren was gegaan door incompatibiliteit. Het

R R

bleek nu dat alle Km transconjuganten hun Ap hadden behouden, hetgeen wederom een sterke aanwijzing was dat Tn 1882 niet op pAtC58 gelegen is in LBA 1160.

iii) Definitief bewijs voor de plaats van Tn 1882 in 15 LBA 1160 werd verkregen via Southern blot hybridisatie experimenten waarmee ruwe plasmide preparaten van LBA 288, LBA 1201 en LBA 116o werden geanalyseerd. De ruwe plamside preparaten (geisoleerd vgl. . Casse et al., J. Gen. Microbiol. 113, 229-242 (1979)1 werden in hun componenten gescheiden op agarose gels. De componenten die als 20 banden in de gel aanwezig zijn werden direkt uit de gels overgebracht op nitrocellulose fieters (zgn. blot-procedure) en daarna gehy-bridiseerd met een aantal specifieke radioactief gelabelde DNA probes . Een controle Tn 5-probe hybridiseerde met de zgn. super-coil DNA band van pAtC58:: Tn5, en met de lineaire DNA band, 25 waarin naast afgebroken chromosomaal DNA ook afgebroken pAtC58::

Tn5 DNA aanwezig is, van de blot. Wanneer Tn3 , het uitgangsmateriaal voor Rn 1882 als radioactieve probe werd gebruikt werd géén hybridisatie met pAtC58, dat aanwezig is in LBA 1160, gevonden.

Uit de bovenstaande gegevens hebben wij dan ook kunnen concluderen 30 dat Tn 1882 en daarmee het gehele T-gebied van pTi B6 aanwezig

is in het chromosoom van LBA 1160. Southern blot hybridisaties, die uitgevoerd werden met blots waarop aanwezig was het totaal DNA

8401780 - 9 - /ζ ** f % van LBA 1160, gefragmenteerd met een aantal restrictieenzymen, en waarbij pRAL 3305 en pOTY 8 als gelabelde probes werden gebruikt bevestigden de correcte interne organisatie van het T-gebied van de Tn 1882 insertie in LBA 1160. (structuur als getekend in 5 fig. 3).

De stabiliteit van de insertie van pRAL 3959, waarop Tn 1882 is gelegen, in het chromosoom van DBA 1160 werd nagegaan door de bacteriën gedurende ca. 100 generaties te groeien zonder selectie-druk en te controleren of de resistentiemarkers van pRAL 3959 10 (TcE en ApE) behouden bleven. Geen verlies van markers werd gedetecteerd.

LBA 1160 bevat dus het T-gebied stabiel ingebouwd in het chromosoom. Door nu de oncoteniciteit van de door ons verkregen geheel nieuwe constructie te testen werden de eveneens noodzakelijke virulentiefuncties (Vir-gebied) geïntroduceerd, via R-prime plasmiden (pAL 18118 en pAL 1819] in de stam LBA 1160. Plasmide pAL 1818 bevat de vir genen A,B,C,D,E, en O en pAL 1819 bevat de vir genen A t/m F en O. Na conjugatie van LBA 1160 met stammen die de R-primes bevatten en selectie van transconjuganten ontstonden 20 LBA 1161 Cdit is LBA 1160 (pAL 1818Q en LBA 1162 tdit is LBA 1160 (pAL 1819)1 . Deze stammen en de ouderstammen LBA 1160 zowel als LBA 1818 (pAL 1818) en LBA 1819 (pAL 1819) werden getest op hun tumor-inducerend vermogen op een aantal verschillende soorten planten.

Zowel LBA 1160 als LBA 1818 en 1819 bevatten slechts één van de 25 componenten van het binair systeem en gaven dan ook geen aanleiding' tot tumoren. Echter de LBA 1160 stammen met een virulentie plasmide (de genoemde R-primes) gaven verrassenderwijs aanleiding tot tumorvorming op alle geteste planten. Gedrag en grootte van de tumoren waren geheel overeenkomstig met die van tumoren geïnduceerd ^ door wild type Agrobacterium stammen. Het T-gebied van het Ti plasmide kan dus vanuit het chromosoom van Agrobacterium m.b-v.

Vir-gebied normaal geïntroduceerd worden in het genoom van de hogere plantecel.

8401780 r · - 10 -

De hier beschreven waarnemingen zijn van groot belang voor het leren begrijpen van het mechanisme waarmee Agrobacterium zijn T-gebied overdraagt naar de plantecel. De verrassende vinding dat het T-gebied ook wanneer het aanwezig is in het chromosoom ^ van Agrobacterium normaal wordt overgedragen maakt het zeer onwaarschijnlijk dat, wat vroeger wel werd aangenomen, het gehele Ti plasmide in de plantecel wordt gebracht tijdens de infectie en daar t.b.v. integratie van T-DNA wordt „geprocessed". Mede op grond van deze resultaten postuleren we dan ook dat herkenning en 1 n u excisie van het T-DNA door virulentie genen binnen de bacterie plaatsvindt als een van de vroege stappen in het tumorinductie-proces. De zgn. bordersequenties, die het T-gebied flaneren, zouden hierbij als herkenningssignalen kunnen optreden.

Naast dit fundamenteel wetenschappelijk belang opent 15 deze nieuwe vinding nieuwe wegen voor de genetische manipulatie van hogere plantecellen. De nieuwheid van deze vinding en zijn gebruiksmogelijkheden kan het best worden toegelicht aan de hand van figuur 4. Een T-gebied en het Vir-gebied, die gescheiden op 2 aparte plasmiden, aanwezig zijn, zijn nog steeds in staat om een 20 T-gebied of een artificieel T-gebied (en daarin geinserteerd vreemd DNA) over te dragen naar de plantecel, alwaar het in het genoom wordt geïntegreerd en tot expressie komt. Met behulp van dit zgn.

binaire vector systeem kunnen zowel dicotyle alsmonocotyle plantecellen voorzien worden van nieuw genetisch materiaal (fig.

25 4a). Stammen met alleen het Vir-gebied of alleen een T-gebied op een plasmide (fig. 4b) of in het chromosoom (fig. 4c) geven geen aanleiding tot transformatie van plantecellen. Met de nieuwe vinding is aangetoond dat een T-gebied, geinserteerd in het chromosoom, nog normaal wordt overgedragen naar plantecellen in” 30 een binair systeem waarbij een Vir-gebied op een apart plasmide aanwezig is (fig. 4d) . Door deze verrassende vinding wordt tevens vastgelegd dat indiai Agrobacteria eem T-gebied of een Vir-gebied of beide componenten, niet op extrachromosomale replicons 84 0 1 7 3 0 ¥ £ - 11 - (plasmiden) hebben, zitten, maar geinserteerd in het chromosoom, (situaties als geschetst in fig. 4D,E en Έ) zij toch op efficiënte wijze een T-gebied of artificieel T-gebied in het plantegenoom inbouwen, zodat de claims als neergelegd in de Europese octrooi-

C

aanvragen 842002396 en 8401048 ook van toepassing zijn op deze nieuwe situaties- Dergelijke Agrobacteria kunnen gebruikt worden voor de genetische manipulatie van dicotyle zowel als monocotyle plantecellen (Ned. octrooiaanvrage 8401048)- 8401780 - 12 - TABEL 1

Gebruikte plasmides en bacteriestammen

PLASMIDES RESISTENTIE SPECIFICATIES BRON

MARKERS

pOTY 8 Ap Hirsch pRAL 3101 CmKm pACYC 184 afgeleide bevattend unieke

Kpnl-site deze pu blicatie pRAL 3102 Cm pACYC 184 zender BamHI site " " pRAL 3103 ApTd pTR 262: :Tn 3 (&5-6S) " " pRAL 3305 Tc pACYC 184 met 1600 bp chromosomaal

EcoRi DNA fragment " " pRAL 3910 ApEm pBR325, gedoneerd pTiB6 EcoRI fragment 19a " "

pRAL 3911 Ap pBR313 waarin gedoneerd pTiB6 BamHI

fragment 17a " " pRAL 3921 Cm pRAL 3101, waarin gedoneerd pTiB6 Kpnl fragment 9 " " pRAL 3945 'ApTc pTR262:: Tn 1880 " " pRAL 3955 ApCm pRAL 3102:: Tn 1880 " "

pRAL 3956 ApCm pRAL3955 waarin gedoneerd pTiB6 BamHI

fragment 17a " " pRAL 3957 ApCm pRAL3956 waarin gedoneerd pTiB6 Kpnl fragment 9 " " pRAL 3958 ApKm pRK20l3:: Tn 1882 " " pRAL 3959 ApTc pRAL 3305:: Tn 1882 " " pAL 1155 ApKm R772:: Tn 1880 " " pAL 1157 ApKm R772:: TN 1882 " " R772 Km Hedges pRK 2013 Km Figurski 8401780 - 13 - E.coli stammen relevante Specificatie Bron markers KMBL 1164 Pro Thi vd Putte _ £ HP 3435 Bio Rif Pannekoek 5 A. tumefaciens stammen LBA 285 Spc LBA 288 Rif LBA 1010 RifR pTiB6

10 R

LBA 1160 Rif ApTc. LBA 288; Tn 1882 in het hier be schreven chromosoom.

LBA 1161 RifR ApTc LBA 1160 (pAL 1818)

R

LBA 1162 Rif ApTc LBA 1160 (pAL 1819) LBA 1201 Km pAtC58 :: " " 15 R Tll5‘ LBA 1223 KmSpc LBA 285 (pAtC58:: " "

Tn5) .

LBA 1224 Rif ApKmTc LBA 1160 (pAtC58:: " "

Tn5) .

LBA 1818 pAL 1818 20 LBA 1819 pAL 1819 LBA 4404 RifR pAL 4404 LBA 4434 RifR ApKm LBA 4404 (pAL 1050) LBA 4440 RifR ApKm LBA 4404 (pAL 1157) 8401780

Claims (5)

1. Werkwijze voor het inhouwen van vreemd DNA in het genoom van planten door planten of daarvan genomen explantaten of planteprotoplasten te infecteren of planteprotoplasten te incuberen met Agrobacterium, 5 met het kenmerk, dat Agrobacteriën worden gebruikt, die in hun erfelijk materiaal één of meer T-gebieden en een Vir-gebied afkomstig uit het Ti-plasmide van Agrobacterium bevatten en/of één of meer T-gebieden bestaande uit een kunstmatig T-gebied dat is opgebouwd uit elk gewenst DNA geflankeerd door bolder 10 sequenties, zoals aanwezig in het wild type T-gebied van Agrobacterium of daaraan functioneel analoog zijnde sequenties.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Agrobacteriën worden gebruikt, waarbij één 15 of meer T-gebieden of een Vir-gebied of beide in het bacteriële chromosoom is (zijn) ingebouwd.

3. Agrobacteriën met in hun DNA's zowel een of meer T-gebieden als een Vir-gebied, daardoor gekenmerkt, 20 dat het T-gebied of het Vir-gebied of beide in het bacteriële chromosoom zijn ingebouwd.

4. Werkwijze ter verkrijging van Agrobacteriën volgens conclusie 3, met een T-gebied in het bacteriële 25 chromosoom met het kenmerk, dat men in Escherichia coli bacteriën met een T-gebied in een "vector DNA-molekuul, dat de eigenschap heeft stabiel te integreren in Agrobacterium chromosoom, vreemd DNA inbouwt in het T-DNA waarna meri het aldus gemodificeerde vector DNA-molekuul uit de E. coli bacteriën verwijdert en doet 30 integreren in het Agrobacterium chromosoom. 8401780 Λ V* — /$“- - 2 -

5. Werkwijze volgens conclusie 4, dat het vector DNA-molekuul een plasmide is, dat als zodanig niet kan voortbestaan in Agrobacteriën (een zgn suicide plasmide is) maar wel geïntegreerd in het genoom daarvan en dat na de 5 modificatie met behulp van een van een R-plasmide afgeleid plasmide wordt gemobiliseerd van E. coli-naar Agrobacteriën. « 3401780