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MX2012012368A - Combinaciones que incluyen proteinas cry34ab/35ab y cry3aa para prevenir el desarrollo de resistencia en gusanos de la raiz de maiz (diabrotica spp.). - Google Patents

Combinaciones que incluyen proteinas cry34ab/35ab y cry3aa para prevenir el desarrollo de resistencia en gusanos de la raiz de maiz (diabrotica spp.).

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Publication number
MX2012012368A
MX2012012368A MX2012012368A MX2012012368A MX2012012368A MX 2012012368 A MX2012012368 A MX 2012012368A MX 2012012368 A MX2012012368 A MX 2012012368A MX 2012012368 A MX2012012368 A MX 2012012368A MX 2012012368 A MX2012012368 A MX 2012012368A
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MX
Mexico
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protein
plants
plant
refuge
further characterized
Prior art date
Application number
MX2012012368A
Other languages
English (en)
Inventor
Monica Britt Olson
Thomas Meade
Timothy D Hey
Aaron T Woosley
Kenneth E Narva
Kristin J Fencil
Huarong Li
Original Assignee
Dow Agrosciences Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Agrosciences Llc filed Critical Dow Agrosciences Llc
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Abstract

La presente invención se refiere en parte a Cry34Ab/35Ab en combinación con Cry3Aa; la presente invención se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que las combinaciones de Cry34Ab/Cry35Ab y Cry3Aa son útiles para prevenir el desarrollo de resistencia (a cualquier sistema de proteínas insecticidas solo) por parte de una población de gusanos de la raíz del maíz (Diabrotica spp.); como podrá reconocer un experto en la técnica con el beneficio de esta descripción, las plantas de maíz que producen estas proteínas Cry insecticidas serán útiles para mitigar la preocupación de que se pudiera desarrollar una población de gusanos de la raíz del maíz que sea resistente a cualquiera de estos sistemas de proteínas insecticidas solos; las plantas (y las hectáreas plantadas con dichas plantas) que producen estos dos sistemas de proteínas insecticidas están incluidas en el alcance de la presente invención.

Description

COMBINACIONES QUE INCLUYEN PROTEÍNAS CRY34AB/35AB Y CRY3AA PARA PREVENIR EL DESARROLLO DE RESISTENCIA EN GUSANOS DE LA RAÍZ DE MAÍZ (DIABROTICA SPP) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los hombres cultivan el maíz para la alimentación y aplicaciones de energía. El maíz es un cultivo importante. Es una fuente importante de alimentos, productos alimenticios y alimento para animales en muchas partes del mundo. Los insectos comen y dañan las plantas y de este modo socavan los esfuerzos realizados por el hombre. Miles de millones de dólares se gastan cada año para controlar las plagas de insectos y miles de millones adicionales se pierden por el daño que causan.
El daño causado por las plagas de insectos es uno de los factores principales de la pérdida mundial de los cultivos de maíz, a pesar del uso de medidas preventivas, como los pesticidas químicos. En función de esto, la resistencia a los insectos ha sido genéticamente diseñada en los cultivos como en el maíz a fin de controlar el daño provocado por los insectos y reducir la necesidad de pesticidas químicos tradicionales.
Más de 4046856.42 hectáreas de maíz de los Estados Unidos están infectados con el complejo de especie de gusano de la raíz del maíz cada año. El complejo de la especie de gusano de la raíz del maíz incluye el gusano de la raíz del maíz del norte (Diabrotica barben), el gusano de la raíz del maíz del sur (D. undecimpunctata howardi), y el gusano de la raíz del maíz del oeste (D. virgifera virgifera). Otras especies incluyen Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño), y el complejo de gusano de la raíz del maíz brasileño (Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa).) Las larvas que habitan en el suelo de estas especies Diabrotica se alimentan en la raíz de la planta de maíz, lo que provoca que permanezcan allí. Su permanencia finalmente reduce el rendimiento del maíz y generalmente da por resultado la muerte de la planta. Al alimentarse de barbas del maíz, los escarabajos adultos reducen la polinización y, por lo tanto, afectan de manera perjudicial el rendimiento del maíz por planta. Asimismo, los adultos y las larvas del género Diabrotica atacan los cultivos cucurbitáceos (pepinos, melones, calabazas, etc.) y muchos vegetales y cultivos de campo en la producción comercial así como aquellos que se cultivan en los jardines de los hogares.
Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido herramientas primarias utilizadas para controlar las plagas de insectos, pero los insecticidas biológicos, como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Sf), han jugado un papel importante en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticida de Bt ha revolucionado la agricultura moderna y aumentado la importancia y valor de las proteínas insecticidas y sus genes.
Las proteínas de cristal insecticida de algunas cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.) son muy conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Hofte et al., Microbial Reviews, Vol. 53, N.° 2, p. 242-255 (1989). Estas proteínas generalmente se producen mediante bacterias como aproximadamente 130 kDa protoxinas que luego se escinden mediante proteasas en el intestino medio del insecto, luego de la ingestión por el insecto, para proporcionar a penas 60 kDa toxina núcleo. Estas proteínas son conocidas como proteínas cristal porque pueden observarse inclusiones cristalinas distintivas con esporas en algunas cepas de B.t. Estas inclusiones cristalinas están generalmente compuestas de varias proteínas distintivas.
Un grupo de genes que se han utilizado para la producción de cultivos transgénicos resistentes a insectos son las delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (B.t.). Las delta-endotoxinas se han expresado exitosamente en plantas de cultivo como algodón, papas, arroz, girasol, así como maíz, y han demostrado proporcionar un control excelente respecto de las plagas de insectos. (Perlak, F. J et al. (1990) Bio Technology 8, 939-943; Perlak, F. J. et al. (1993) Plant Mol. Bíol. 22: 313-321 ; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 1 1 : 1151-1 155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1 101-1 104; PCT publicación número WO 01/13731 ; y Bing J W et al. (2000) Efficacy of CryI F Transgenic Maize, 14.th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Coló.) Varias proteínas de Bt se han utilizado para crear plantas transgénicas resistentes a insectos que se han registrado de manera exitosa y comercializado hasta la fecha. Estas incluyen CryIAb, CryIAc, CryI F, Cry3Aa y Cry3Bb en maíz, CryIAc y Cry2Ab en algodón, y Cry3A en papa. También existe SMART STAX en maíz, que comprende CryIA y Cry 2Ab.
Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una sola proteína salvo en casos donde se desea el espectro insecticida combinado de 2 proteínas (por ejemplo, CryIAb y Cry3Bb en maíz combinado para proporcionar resistencia a las plagas de lepidoptera y gusanos de la raíz, respectivamente) o donde la acción independiente de las proteínas las torna útiles como una herramienta para retrasar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo, CryIAc y Cry2Ab en algodón combinado para proporcionar manejo de resistencia al gusano tabacalero).
Algunas cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos que han llevado a un rápida y amplia adopción de esta tecnología también ha causado la preocupación de que las poblaciones de plagas desarrollarán resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Varias estrategias se han sugerido para preservar la utilidad de las características de resistencia a insectos basadas en Bt que incluyen el despliegue de proteínas a una alta dosis en combinación con refugio, y alternancia con, o despliegue conjunto de, diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).
Las proteínas seleccionadas para el uso en la estructura del Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) deben ser activas de manera que la resistencia desarrollada a una proteína no confiere resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de plaga seleccionada para la resistencia a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", uno concluiría que no hay resistencia cruzada y que una combinación de Proteína A y Proteína B sería efectiva para retrasar la resistencia a la Proteína A sola.
En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, las evaluaciones pueden hacerse en base a otras características que se presume que están relacionadas con el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la utilidad de la unión mediada por receptor en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no presenten resistencia cruzada (van Mellaert et al. 1999). El pronosticador clave de la falta de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por receptores en una especie de insecto sensible.
En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, luego si ese receptor muta en ese insecto de manera que una de las toxinas no se una más a aquel receptor y, por ende, no es más insecticida respecto del insecto, puede ser el caso de que el insecto también sea resistente a la segunda toxina (que se une competitivamente al mismo receptor). Es decir, se dice que el insecto es resistente en forma cruzada a ambas toxinas de Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser un indicio de que el insecto no sería simultáneamente resistente a aquellas dos toxinas.
Un sistema de proteínas insecticidas relativamente nuevo se descubrió en Bacillus thuringiensis como se describe en WO 97/40162. Este sistema comprende dos proteínas - una de aproximadamente 15 kDa y la otra de aproximadamente 45 kDa. Véase también Patente de los Estados Unidos N.° 6,083,499 y 6,127,180. Estas proteínas ahora han sido asignadas a sus propias clases, y por consiguiente recibieron las designaciones Cry de Cry34 y Cry35, respectivamente. Véase Crickmore et al. sitio web (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Muchas otras proteínas relacionadas de este tipo de sistema no se han descrito. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6,372,480; WO 01/14417; y WO 00/66742. Los genes optimizados de plantas que codifican dichas proteínas, en donde los genes están diseñados para utilizar codones para la expresión optimizada en plantas, también se han descrito. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6,218,188.
El modo exacto de acción del sistema Cry34/35 aún tiene que determinarse, pero parece formar poros en las membranas de las células del intestino del insecto. Véase Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001); Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004). Los mecanismos exactos de acción aún no son claros a pesar de las coordenadas atómicas 3D y las estructuras de cristal que se conocen para una proteína de Cry34 y una Cry35. Véase Patente de los Estados Unidos N ° 7,524,810 y 7,309,785. Por ejemplo, no es claro si una o ambas de estas proteínas unen un tipo típico de receptor, como una fosfatasa alcalina o una aminopeptidasa.
Asimismo, debido a que hay diferentes mecanismos por los que un insecto puede desarrollar resistencia a la proteína Cry (como, mediante glicosilación alterada del receptor [véase Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 571 1-5717], mediante eliminación de la proteína del receptor [véase Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842], mediante mutación del receptor, u otros mecanismos [véase Heckel et al., J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197]), fue imposible predecir a priori si habría resistencia cruzada entre Cry34/35 y otras proteínas Cry. Predecir la unión competitiva para el sistema Cry34/35 es además complicado por el hecho de que dos proteínas están involucradas en el sistema binario Cry34/35. Nuevamente, no es claro si estas proteínas unen efectivamente el intestino de insecto /células de intestino y cómo lo hacen, y si interactúan o se unen entre sí y cómo lo hacen.
Otras opciones para controlar coleóptera incluyen toxinas Cry3Bb, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33 con ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901 , TIC1201 , ET29 con TIC810, ET70, ET76 con ET80, TIC851 , y otras. Los enfoques ARNi también se han propuesto. Véase, por ejemplo, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, n.° 1 1 (Nov. 2007) p. 1322-1326.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en parte con Cry34Ab/35Ab en combinación con Cry3Aa. La presente invención se relaciona en parte con el sorprendente descubrimiento que Cry34Ab/Cry35Ab y Cry3Aa son útiles para prevenir el desarrollo de resistencia (a cualquier sistema de proteína insecticida solo) por una población de gusano de raíz de maíz (Diabrotica spp.). Un experto en la técnica reconocerá con el beneficio de la presente descripción, que plantas que producen estas proteínas Cry insecticidas serán útiles para mitigar la preocupación de que podría desarrollarse una población de gusano de raíz de maíz que sería resistente a cualquiera de estos sistemas de proteína insecticida solos.
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento que los componentes de estos sistemas de proteína Cry no compiten entre sí para la unión de receptores del intestino del gusano de raíz del maíz.
La presente invención también se relaciona en parte con pilas triples o "pirámides" de tres (o más) sistemas de toxina, con Cry34Ab/Cry35Ab y Cry3Aa como el par base. Por lo tanto, las plantas (y superficie en hectáreas cultivadas con dichas plantas) que producen estos dos sistemas de proteína insecticidas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La descripción detalla de los dibujos se refiere en particular a las figuras adjuntas en las que: Figuras 1A-1 B. Unión de 25l-Cry35Ab1 (Figura 1A) y 125l-Cry3Aa (Figura 1 B) como una función de toxinas de Cry radiomarcadas de entrada a BBMV preparado de larvas de gusano de la raíz del maíz oeste. Unión específica =unión total — unión no específica, barra de error=SEM (error estándar de promedio).
Los experimentos de unión demostraron que ambos 125l-Cry35Ab1 y 125l-Cry3Aa pudieron unirse específicamente a BBMV (Figura 1A y 1 B). 125l-Cry35Ab1 y 125l-Cry3Aa tenían afinidad de unión Kd=2.31±1.26, 24.0±9.7 (nM), respectivamente, y una concentración de sitio de unión Bmax=31.69±6.38, 146.3±39.9 (pmole/ug BBMV), respectivamente.
Figura 2. Unión de 125l-Cry3Aa a BBMV preparado de larvas del gusano de la raíz del maíz oeste en diferentes concentraciones de competidor no marcado. Las barras de error para la unión de competitividad homologa representan la desviación estándar, y las barras de error para la competitividad heteróloga no se muestran.
Los resultados experimentales demostraron que Cry3Aa era capaz de desplazarse completamente cuando la concentración molar aumentó a 500 nM (100 veces de exceso 125l-Cry3Aa) (Figura 2). Sin embargo, ya sea Cry35Ab1 solo o la mezcla de Cry35Ab1 +Cry34Ab1 (1 :3) no pudo desplazar a 125l-Cry3Aa. Estos datos indicaron que Cry35Ab1 solo o Cry35Ab1 +Cry34Ab1 (1 :3) no comparte un receptor con Cry3Aa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1 : secuencia de proteína Cry3Aa nativa, longitud completa SEQ ID NO:2: Secuencia de proteína núcleo Cry3Aa tripsina truncada SEQ ID NO:3: Secuencia de proteína Cry34Ab1 nativa, longitud completa SEQ ID NO:4: Secuencia de proteína Cry35Ab1 nativa, de longitud completa SEQ ID NO:5: Secuencia de proteína núcleo Cry35Ab1 quimotripsina truncada SEQ ID NO:6: ADN de cry34Ab SEQ ID NO:7: ADN de cry35Ab SEQ ID NO:8: ADN de cry3Aa DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las secuencias para las proteína Cry34Ab/Cry35Ab pueden obtenerse del aislado de Bacillus thruingiensis PS149B1 , por ejemplo. Para otros genes, las secuencias de proteínas y aislados fuente para usarse de acuerdo con la invención en cuestión, véase Crickmore et al. sitio web (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/ Bt/intro.html), por ejemplo.
La presente invención incluye el uso de proteínas insecticidas Cry34Ab/35Ab en combinación con una toxina de Cry3Aa para proteger al maíz del daño y la pérdida de rendimiento provocada por la alimentación del gusano de raíz del maíz por poblaciones de gusano de raíz del maíz que pueden desarrollar resistencia a cualquiera de estos sistemas de proteína Cry solos (sin el otro).
La presente invención además explica una estructura de Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) para evitar el desarrollo de resistencia por un gusano de la raíz del maíz a Cry3Aa y/o Cry34 Ab/35Ab.
La presente invención proporciona composiciones para controlar las plagas de gusanos de raíz que comprenden células que producen una proteína de toxina Cry3Aa y un sistema de toxina Cry34Ab/35Ab.
La invención además comprende un huésped transformado para producir una proteína Cry3Aa y una toxina binaria Cry34Ab/35Ab, en donde dicho huésped es un microorganismo o célula vegetal.
Además se busca que la invención proporcione un método de control de las plagas de gusano de raíz que comprende poner en contacto dichas plagas o el ambiente de dichas plagas con una cantidad efectiva de una composición que contiene una proteína Cry3Aa y además contiene una toxina binaria Cry34Ab/35Ab.
Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen que se puede expresar en plantas que codifica una toxina binaria Cry34Ab/35Ab y un gen que se puede expresar en planta que codifica una proteína Cry3Aa, y semilla de dicha planta.
Otra modalidad de la invención comprende una planta de maíz en donde el gen que se puede expresar en plantas que codifica una toxina binaria Cry34Ab/35Ab y un gen que se puede expresar en planta que codifica una proteína Cry3Aa se ha introgresado en dicha planta de maíz, y semilla de dicha planta.
Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión de receptor competitivos utilizando proteína toxina núcleo Cry35Ab radiomarcada muestran que la proteína toxina núcleo Cry3Aa no compite por la unión en las muestras de tejido de insecto CRW a las que se une Cry35Ab. Véase Figura 2. Los resultados indican que la combinación de Cry3Aa y proteínas Cry34Ab/35Ab es un medio efectivo para mitigar el desarrollo de resistencia en las poblaciones de CRW a cualquier sistema de proteína solo.
Por ende, en parte en base a los datos descritos anteriormente y en otras partes en la presente, las proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry3Aa pueden utilizarse para producir combinaciones IRM para la prevención o mitigación del desarrollo de resistencia por CRW. Por ejemplo, otras proteínas pueden agregarse a esta combinación para expandir el espectro de control de insectos. El presente par/combinación también puede utilizarse en algunas "pilas triples" o "pirámides" preferidas en combinación con incluso otra proteína para controlar los gusanos de raíz, como Cry3Ba y/o Cry6Aa. Incluso otra opción es ARNi contra gusanos de raíz. Véase, por ejemplo, Baum ef al., Nature Biotechnology, vol. 25, n.° 1 1 (Nov. 2007) pp. 1322-1326. Asimismo, en vista de los datos y explicaciones presentadas en la presente, uno podría sustituir Cry3Ba y/o Cry6Aa en lugar de Cry3Aa ejemplificada en la presente como el par de combinación base con Cry34A/35A. De este modo, las combinaciones en cuestión proporcionan múltiples modos de acción contra gusanos de la raíz.
Las opciones de despliegue de la presente invención incluyen el uso de proteínas Cry3Aa y Cry34Ab/35Ab en regiones de cultivo del maíz donde Diabrotica spp. son problemáticas. Otra opción de despliegue sería utilizar una o ambas proteínas Cry3Aa y Cry34Ab/35Ab en combinación con otras características.
En vista de la descripción de USSN 61/388,273 (presentada el 30 de septiembre de 2010) con respecto a las combinaciones de proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa, USSN 61/476,005 (presentada el 15 de abril de 2011) con respecto a las combinaciones de las proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry3Ba, y USSN 61/477,447 (presentada el 20 de abril del 2011) con respecto a las combinaciones de Cry3Aa y Cry6Aa, algunas "pilas triples" preferidas o "múltiples modos de pilas de acción " de la presente invención incluyen una proteína Cry3Aa combinada con proteínas Cry34Ab/35Ab, junto con una proteína Cry6Aa y/o una proteína Cry3Ba. Las plantas transgénicas, incluyendo maíz, que comprenden un gen cry3Ba, genes cry34Ab/35Ab, y un tercer o cuarto sistema de toxina (por ejemplo, gen(es) cry3Aa y/o cry6Aa se incluyen dentro del alcance de la presente invención. De este modo, dichas modalidades dirigen el insecto con por lo menos tres modos de acción.
Una persona experta en la técnica apreciará que las toxinas de Bt, incluso dentro de una cierta clase, como Cry3Aa y Cry34Ab/35Ab pueden variar en cierta medida.
Genes y toxinas. El término "aislado" se refiere a un polinucleótido en un constructor que no está presente naturalmente o a una proteína en un estado purificado o de otra forma que no está presente naturalmente. Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no solo las secuencias de longitud completa descritas sino también fragmentos de las secuencias, variantes, mutantes, y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas específicamente las ejemplificadas en la presente. Como se utiliza en la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de genes hacen referencia a secuencias de nucleótido que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Como se utiliza en la presente, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas blanco que las toxinas reclamadas. Los dominios/subdominios de estas proteínas pueden intercambiarse para formar proteínas quiméricas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 7,309,785 y 7,524,810. La patente '785 también explica proteínas Cry35 truncadas. Las toxinas truncadas también se ejemplifican en la presente.
Como se utiliza en la presente, los límites representan aproximadamente 95% (Cry3Aa's y Cry34Ab's y Cry35Ab's), 78% (Cry 3A's y Cry34Ab's y Cry35Ab's), y 45% (Cry 3's y Cry34's y Cry35's) de identidad de secuencia, según "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuríngiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Lo mismo aplica para Cry6's si se utiliza en pilas triples, por ejemplo de acuerdo con la presente invención.
Debe ser evidente para una persona experta en la técnica que los genes que codifican las toxinas activas pueden identificarse y obtenerse a través de varios medios. Los genes específicos o porciones de genes ejemplificados en la presente pueden obtenerse de aislados depositados en un depósito de cultivos. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, pueden también construirse sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden fácilmente construirse utilizando técnicas estándar para hacer mutaciones de punto. Asimismo, fragmentos de estos genes pueden elaborarse utilizando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el comercio de acuerdo con los procedimientos estándar. Por ejemplo, las enzimas como Bal31 o mutagénesis dirigida a sitio pueden utilizarse para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también pueden obtenerse utilizando una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas pueden utilizarse para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteína.
Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la presente invención. Asimismo, debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes pueden codificar las secuencias de aminoácido descritas en la presente. Una persona capacitada en la técnica bien puede crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas o esencialmente las mismas toxinas. Las secuencias de ADN variante están dentro del alcance de la presente invención. Como se utiliza en la presente, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen inserciones, adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos que no afectan en forma relevante la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican las proteínas que retienen actividad pesticida también se incluyen en esta definición.
Otro método para identificar los genes que codifican las porciones de gen y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención es a través del uso de sondas de oligonucleótido. Estas sondas son secuencias de nucleótido detectables. Estas secuencias puede detectarse mediante un rótulo adecuado o pueden hacerse inherentemente fluorescentes como se describe en la Solicitud Internacional N.° WO93/16094. Como bien se sabe en la técnica, si la molécula de sonda y muestra de ácido nucleico se hibridan mediante la formación de un enlace fuerte entres dos moléculas, puede asumirse de manera razonable que la sonda y la muestra tienen una homología sustancial. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo en condiciones rigurosas mediante técnicas muy conocidas en el técnica, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., p. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sal y combinaciones de temperatura son las siguientes (en orden de mayor rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 65° C. La detección de la sonda proporciona un medio para determinar en una manera conocida si ha ocurrido hibridación. Dicho análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes que codifican toxina de la presente invención. Los segmentos de nucleótido que se utilizan como sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias de nucleótido pueden también utilizarse como cebadores PCR para amplificar genes de la presente invención.
Toxinas variantes. Ciertas toxinas de la presente invención se han ejemplificado específicamente en la presente. Dado que estas toxinas son simplemente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debe ser fácilmente evidente que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótido que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida o similar de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácido con una toxina ejemplificada. La identidad de aminoácido generalmente será mayor a 75%, o preferentemente mayor a 85%, preferentemente mayor a 90%, preferentemente mayor a 95%, preferentemente mayor a 96%, preferentemente mayor a 97%, preferentemente mayor a 98%, o preferentemente mayor a 99% en algunas modalidades. La identidad de aminoácido generalmente será la mayor en las regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional que finalmente es responsable de la actividad biológica. En este aspecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones de aminoácido conservadoras que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden colocarse en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos, y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido del mismo tipo se encuentran dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no afecte en forma relevante la actividad biológica del compuesto. El cuadro 1 proporciona una lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.
CUADRO 1 En algunos casos, las sustituciones no conservadoras también pueden realizarse. El factor crítico es que estas sustituciones no deben detractarse en forma significativa de la actividad biológica de la toxina.
Huéspedes recombinantes. Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes de vegetales o microbianos. La expresión de los genes de toxina da por resultado, en forma directa e indirecta, en la producción intracelular y mantenimiento de pesticida. La transferencia conjugal y transferencia recombinante pueden utilizarse para crear una cepa de Bt que expresa ambas toxinas de la presente invención. Otros organismos huésped también pueden transformarse con uno o ambos de los genes de toxina y luego utilizarse para alcanzar el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse en el sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. En forma alternativa, el microbio que habita en el gen de toxina puede tratarse en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, luego puede aplicarse al ambiente de las plaga blanco. Las células vegetales no regenerables/no totipotenciales de una planta de la presente invención (que comprenden por lo menos uno de lo genes de IRM en cuestión) se incluyen dentro de la presente invención.
Transformación de planta. Una modalidad preferida de la presente invención es la transformación de las plantas con genes que codifican la proteína insecticida en cuestión o sus variantes. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por una plaga blanco de insectos por medio de la presencia de cantidades de control de la proteína insecticida en cuestión o sus variantes en las células de la planta transformada. Mediante la incorporación de material genético que codifica las propiedades insecticidas de las toxinas insecticidas de B.t. en un genoma de una planta comida por una plaga de insectos particular, el adulto o la larva moriría luego de consumir la planta alimento. Varios miembros de las clasificaciones de monocotiledóneas o dicotiledóneas se han transformado. Los cultivos agronómicos transgénicos así como las frutas y vegetales son de interés comercial. Dichos cultivos incluyen, pero no se limitan a, maíz, arroz, soja, cañóla, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, maníes, tomates, papas, y similares. Existen varias técnicas para introducir material genético foráneo en células vegetales, y para obtener plantas que de manera estable mantengan y expresen el gen introducido. Dichas técnicas incluyen la aceleración de material genético recubierto en micropartículas directamente en las células (Patente de los Estados Unidos N.° 4945050 y Patente de los Estados Unidos N.° 5141 131 ). Las plantas pueden transformarse utilizando tecnología Agrobacterium, véase Patente de los Estados Unidos N.° 5177010, Patente de los Estados Unidos N.° 5104310, Solicitud de Patente Europea N.° 0131624B1 , Solicitud de Patente Europea N.° 120516, Solicitud de Patente Europea N.° 159418B1 , Solicitud de Patente Europea N.° 1761 12, Patente de los Estados Unidos N.° 5149645, Patente de los Estados Unidos N.° 5469976, Patente de los Estados Unidos N.° 5464763, Patente de los Estados Unidos N.° 4940838, Patente de los Estados Unidos N.° 4693976, Solicitud de Patente Europea N.° 1 6718, Solicitud de Patente Europea N.° 290799, Solicitud de Patente Europea N.° 320500, Solicitud de Patente Europea N.° 604662, Solicitud de Patente Europea N.° 627752, Solicitud de Patente Europea N.° 0267159, Solicitud de Patente Europea N.° 0292435, Patente de los Estados Unidos N.° 5231019, Patente de los Estados Unidos N.° 5463174, Patente de los Estados Unidos N.° 4762785, Patente de los Estados Unidos N.° 5004863, y Patente de los Estados Unidos N.° 5159135. Otra tecnología de transformación incluye tecnología WHISKERS™, véase Patente de los Estados Unidos N.° 5302523 y Patente de los Estados Unidos N.° 5464765. La tecnología de electroporación también se ha utilizado para transformar plantas, véase WO 87/06614, Patente de los Estados Unidos N.° 5472869, Patente de los Estados Unidos N.° 5384253, WO 9209696, y WO 9321335. Todas estas publicaciones y patentes de transformación se incorporan a la presente a modo de referencia. Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes foráneos también puede variar. Dicho tejido incluiría pero no se limitaría a tejido embriogénico, tejido calloso tipo I y II, hipocótilo, meristema y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden transformarse durante la desdiferenciación utilizando técnicas adecuadas dentro de la experiencia en la técnica.
Los genes que codifican cualquiera de las toxinas en cuestión pueden insertarse en las células vegetales utilizando una variedad de técnicas que son muy conocidas en la técnica como se describió anteriormente. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un marcador que permite la selección de las células microbianas transformadas y un sistema de replicación funcional en Escherichia coli están disponibles para la preparación y modificación de genes foráneos para la inserción en plantas superiores. Dichas manipulaciones pueden incluir, por ejemplo, la inserción de mutaciones, truncamientos, adiciones, o sustituciones como se desee para el uso propuesto. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la proteína Cry o variantes pueden insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para transformación de células de E. coli, las células de los cuales se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se extraen y se lisan de manera que cantidades que se puedan trabajar del plásmido se recuperen. El análisis de secuencia, análisis de fragmento de restricción, electroforesis, y otros métodos biológicos bioquímico-moleculares son generalmente llevados a cabo como métodos de análisis. Luego de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede escindirse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de ADN manipulada puede clonarse en el mismo u otros plásmidos.
El uso de vectores que contienen T-ADN para la transformación de células vegetales se ha investigado de manera intensiva y se ha descrito bastante en EP 120516; Lee y Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), y An et al. (1985), y está bien establecido en el campo.
Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable a lo largo de las posteriores generaciones. El vector utilizado para transformar la célula vegetal normalmente contiene un gen marcador seleccionable que codifica una proteína que confiere a las células de vegetales transformadas resistencia a un herbicida o un antibiótico, como bialaphos, kanamicina, G418, bleomicina, o higromicina, inter alia. El gen marcador seleccionable empleado de manera individual debería permitir, por consiguiente, la selección de células transformadas mientras que el crecimiento de células que no contienen el ADN insertado se suprime mediante el compuesto selectivo.
Un gran número de técnicas se encuentran disponibles para insertar ADN en una célula vegetal huésped. Dichas técnicas incluyen la transformación con T-ADN proporcionado mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como el agente de transformación. Asimismo, la fusión de protoplástos de plantas con liposomas que contienen el ADN a administrarse, inyección directa de ADN, transformación biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporacion, así como otros métodos posibles, pueden emplearse.
En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas se transformarán con genes en donde el uso de codón de la proteína que codifica la región se ha optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5380831 , que se incorpora a la presente a modo de referencia. Además, en forma ventajosa, se utilizarán las platas que codifican una toxina truncada. La toxina truncada generalmente codificará aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Los métodos para crear genes B.t sintético para el uso en plantas son conocidos en la técnica (Stewart, 2007).
A pesar de la técnica de transformación, el gen preferentemente se incorpora en un vector de transferencia de gen adaptado para expresar los genes de toxina insecticida de B.t y variantes en la célula vegetal mediante la inclusión en el vector de un promotor vegetal. Además de los promotores vegetales, los promotores de una variedad de fuentes pueden utilizarse en forma eficiente en células vegetales para expresar genes foráneos. Por ejemplo, uno puede utilizar promotores de origen bacteriano, como el promotor octopina sintasa, el promotor nopalina sintasa, y el promotor manopina sintasa. No se puede utilizar ningún promotor Bacillus-thuringiensis en algunas modalidades preferidas. Los promotores de origen de virus vegetal pueden utilizarse, por ejemplo los promotores 35S y 19S del Virus Mosaico de Coliflor, un promotor del Virus Mosaico de las Nervaduras de la Mandioca, y similares. Los promotores de plantas incluyen, pero no se limitan a, ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RUBP) subunidad pequeña de carboxilasa (ssu), promotor beta-conglicinina, promotor faseolin, promotor ADH (alcohol dehidrogenasa), promotores de shock de calor, promotor ADF (factor de despolimerización de actina), promotor de ubiquitina, promotor de actina, y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de secuencia potenciadores que pueden mejorar la eficiencia de transcripción. Los potenciadores típicos incluyen, pero no se limitan a, ADH1-intrón 1 y ADH1-intrón 6. Pueden utilizarse promotores constitutivos. Los promotores constitutivos dirigen la expresión de gen continua en casi todos los tipos de células y en casi todos los momentos (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejido son responsables de la expresión de genes en células específicas o tipos de tejidos, como hojas o semillas (por ejemplo, promotores de zeina, oleosina, napina, ACP (Proteína Portadora de Acilo), y estos promotores también pueden utilizarse. También pueden utilizarse promotores que sean activos durante cierta etapa del desarrollo de las plantas así como activos en órganos y tejidos vegetales específicos. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores que sean específicos de la raíz, específicos del polen, específicos del embrión, específicos de la barba de maíz, específicos de la fibra del algodón, específicos del endoesperma de la semilla, específicos de floema, y similares.
En ciertas circunstancias puede ser conveniente utilizar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, como: estímulo físico (por ejemplo, genes de shock de calor); liviano (por ejemplo, RUBP carboxilasa); hormona (por ejemplo, glucocorticoide); antibiótico (por ejemplo, tetraciclina); metabolitos; y estrés (por ejemplo, sequía). Otros elementos de traducción y transcripción convenientes que funcionan en plantas pueden utilizarse, como secuencias líderes no traducidas 5', secuencias de terminación de transcripción de ARN y secuencias señal de adición de poli-adenilato. Diversos vectores de transferencia de genes específicos de plantas son conocidos en la técnica.
Los cultivos transgénicos que contienen características de resistencia a insectos (IR, por sus siglas en inglés) prevalecen en las plantas de maíz y algodón a lo largo de Norte América, y el uso de estas características se expande de manera global. Los cultivos transgénicos comerciales que combinan características de IR y tolerancia a herbicida (HT, por sus siglas en inglés) han sido desarrollados por varias empresas cerealeras. Estos incluyen combinaciones de características IR conferidas por las proteínas insecticidas de B.t. y características de HT, como la tolerancia a • inhibidores de Acetolactato Sintasa (ALS), como sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina, sulfonanilidas, y similares, inhibidores de Glutamina Sintetasa (GS), como bialaphos, glufosinato, y similares, inhibidores de 4- HidroxiFenilPiruvato Dioxigenasa (HPPD), como mesotriona, isoxaflutol, y similares, inhibidores de 5-EnolPiruvilShikimato-3-Fosfato Sintasa (EPSPS), como glifosato y similares, e inhibidores de Acetil-Coenzima A Carboxilasa (ACCase), como haloxífop, quizalofop, diclofop, y similares. Otros ejemplos son conocidos en los que las proteínas proporcionadas transgénicamente proporcionan tolerancia de la planta a clases químicas de herbicida, como herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de piridiloxiacetatos auxina (véase WO 2007/053482 A2), o herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de ariloxifenoxipropionatos (véase WO 2005107437 A2, A3). La capacidad de controlar diversos problemas de plagas a través de las características de IR es un concepto del producto comercial valioso, y la conveniencia de este concepto de producto se aumenta si las características de control de insecto y características de control de malezas se combinan en la misma planta. Además, puede obtenerse valor mejorado a través de combinaciones de plantas individual de características de IR proporcionadas por la proteína insecticida de B.t, como la de la presente invención, con una o más características HT adicionales, como aquellas mencionadas anteriormente, más una o más características de entrada adicionales (por ejemplo, otra resistencia a insectos conferida por B.t. -derivadas u otras proteínas insecticidas, resistencia a insectos conferida por mecanismos, como ARNi y similares, resistencia de nematodo, resistencia a enfermedad, tolerancia a estrés, utilización de nitrógeno mejorada, y similares), o característica de resultados (por ejemplo, alto contenido de aceite, composición de aceite saludable, mejora nutricional, y similares). Dichas combinaciones pueden obtenerse ya sea a través del mejoramiento convencional (pila de mejoramiento) o en forma conjunta como un suceso de transformación novedoso que implica la introducción simultánea de múltiples genes (pila molecular). Los beneficios incluyen la capacidad de manejar plagas de insectos y control mejorado de malezas en una planta de cultivo que proporciona beneficios secundarios para el productor y/o consumidor. Por lo tanto, la presente invención puede utilizarse en combinación con otras características para proporcionar un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar en una forma flexible y efectiva en términos de costos una diversidad de cuestiones agronómicas.
Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar células de germen y transmiten la o las características transformadas a las plantas de progenie.
Dichas plantas pueden cultivarse de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas se transformarán con genes en donde el uso de codón se ha optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5,380,831. Además, los métodos para crear genes de Bt sintéticos para el uso en plantas son conocidos en la técnica (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitante de planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen que se puede expresar en una planta que codifica una proteína Cry3Aa, y además comprende un segundo grupos de genes que se pueden expresar en plantas que codifican una proteína Cry34Ab/35Ab.
La transferencia (o introgresión) de la o las características determinadas por Cry3Aa y Cry34Ab/35Ab en líneas de maíz endogámicas pueden lograse mediante el mejoramiento de selección recurrente, por ejemplo, retrocruzamiento. En este caso, un padre recurrente deseado primero se cruza con un donante endogámico (el padre no recurrente) que porta el gen o genes adecuado para las características determinadas por Cry. La progenie de este cruzamiento luego se retrocruzan con el padre recurrente luego de la selección en la progenie resultante para la o las características deseadas a transferirse del padre no recurrente. Luego de tres, preferentemente cuatro, más preferentemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con el padre recurrente con la selección de la o las características deseadas, la progenie será heterocigota para el locus que controla la o las características a transferirse, pero será como el padre recurrente para la mayoría o casi todos los otros genes (véase, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4ta Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).
Estrategias de Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) Roush et al., por ejemplo, describe dos estrategias de toxina, también llamadas "pirámides" o "pilas," para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
En su sitio web, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos [United States Environmental Protection Agency] (epa.gov/oppbppd 1 /biopesticides/pips/bt_corn_ref uge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proporcionar refugios no transgénicos (es decir, no-B.t.) (un bloque de cultivos no Bt / maíz) para el uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína Bt activa contras plagas blanco.
"Los requisitos estructurados específicos para los productos de maíz de Bt (CryIAb o CryI F) protegidos del barrenador del maíz son los siguientes: Refugios estructurados: 20% refugio de maíz de Bt no-Lepidoptera en la zona productora de algodón; 50% refugio de Bt no-Lepidoptera en la zona productora de maíz; Bloques Interno (es decir, dentro del campo de Bt) Externo (es decir, campos separados dentro ½ milla (0.926 km) (1/4 milla (0.463 km) si es posible) del campo de Bt para maximizar el cruzamiento aleatorio) Fajas dentro del campo Las fajas debe tener al menos 4 hileras de ancho (preferentemente 6 hileras) para reducir los efectos del movimiento de larvas" Además, las Asociación del Cultivadores de Maíz Nacional, en su sitio web: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-com) también proporciona lineamientos similares en relación con los requisitos del refugio. Por ejemplo: "Requisitos del IRM al Barrenador del Maíz: - Plantar al menos 20% de sus hectáreas de maíz para refugiar híbridos -En regiones productoras de algodón, el refugio debe ser al menos 50%.
-Debe plantarse dentro de ½ milla (0.926 km) de los híbridos de refugio.
-El refugio puede plantarse como fajas dentro del campo de Bt, las fajas de refugio deben tener al menos 4 hileras de ancho.
-El refugio puede tratarse con pesticidas convencionales solo si se alcanzan los umbrales económicos para el insecto blanco.
- Insecticidas que se pueden rociar basados en Bt no pueden utilizarse en el maíz de refugio.
-El refugio adecuado debe plantarse en cada granja con maíz de Bt".
Como lo estableció Roush et al. (en las páginas 1780 y 1784 columna derecha, por ejemplo), las pilas o pirámides de dos proteínas diferentes cada una efectiva contra las plagas blanco y con poca o ninguna resistencia cruzada puede permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para una pila exitosa, un tamaño de refugio de menos de refugio de 10%, puede proporcionar manejo de resistencia comparable a aproximadamente 50% de refugio para una sola característica (no piramidal). Para los productos de maíz de Bt en forma de pirámide actualmente disponibles, la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos requiere que se plante significativamente menos (generalmente 5%) de refugio estructurado de maíz no Bt que para productos de una sola característica (generalmente 20%).
Hay diversas maneras de proporcionar efectos de IRM de un refugio, incluyendo varios patrones de plantación geométricos en los campos (como se mencionó anteriormente) y mezclas de semillas en sacos, como lo explica en mayor detalle Roush et al. (supra), y Patente de los Estados Unidos N.° 6,551 ,962.
Los porcentajes anteriores, o relaciones de refugio similares, pueden utilizarse para las pirámides o pilas dobles o triples en cuestión.
Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisorias, y publicaciones mencionadas o citadas en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad en la medida en que no sean incongruentes con las enseñanzas explícitas de la presente especificación.
Los siguientes son ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de solvente son por volumen salvo que se indique de otro modo. Todas las temperaturas son en grados Celsius.
Salvo que se implique o indique específicamente, los términos "un", "una", "el/la" significan "al menos uno/a" en la presente.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión y Purificación Construcción de plásmidos de expresión que codifican toxinas de longitud completa de Crv34Ab1 , Cry35Ab1 , y Cry3Aa. Se utilizaron métodos de clonación estándar en la construcción de plásmidos de expresión Pseudomonas fluorescens (Pf) diseñados para producir proteínas Cry de longitud completa Cry34Ab1 , Cry35Ab1 , y Cry3Aa1 , respectivamente. Se utilizaron las endonucleasas de restricción de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) para la digestión del ADN y se utilizó Ligasa de T4 ADN de Invitrogen para la ligación del ADN. Las preparaciones de plásmidos se realizaron mediante el Plasmid Midi kit (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se purificaron fragmentos de ADN mediante el cartucho Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA) luego de la electroforesis en gel de agarosa Tris-acetato. La estrategia de clonación básica implicó la subclonación de las secuencias codificadoras (CDS) de las proteínas Cry de longitud completa Cry34Ab1 , Cry35Ab1 , y Cry3Aa1 , en pMYC1803 en, por ejemplo, los sitios de restricción Spel y Xhol (o Xbal, o Hindlll) respectivamente, por los cuales se colocaron bajo el control de expresión del promotor de Ptac y el terminador de rrnBT1T2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl), respectivamente. pMYC1803 es un plásmido de número de copia medio con el origen de replicación RSF1010, un gen resistente a la tetraciclina, y un sitio de unión a ribosomas en forma precedente a los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en los cuales pueden introducirse fragmentos de ADN que contienen regiones codificadoras de proteínas (Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080193974). El plásmido de expresión se transformó mediante electroporación en una cepa P. fluorescens MB214, se recuperó en medio de hidrolisato SOC-Soy, y se colocó en placas en medio de caldo Luria (LB) con 20 pg/ml de tetraciclina. Los detalles acerca de las manipulaciones microbiológicas se encuentran disponibles en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20060008877, Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080193974, y Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080058262, que se incluyen en la presente a modo de referencia. Las colonias se revisaron mediante la digestión de restricción del ADN del plásmido miniprep. El ADN del plásmido de los clones seleccionados que contienen inserciones se secuenció mediante el contrato con un vendedor de secuenciamiento comercial como MWG Biotech (Huntsville, AL). Los datos de secuencias se recopilaron y analizaron con el software Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
Crecimiento v expresión. Los análisis del crecimiento y la expresión en la producción en matraces de agitación de toxinas de Cry34Ab1 , Cry35Ab1 , y Cry3Aa1 para la caracterización con la inclusión de unión al receptor de Bt y bioensayo de insectos se obtuvieron mediante cepas P. fluorescens cultivadas en matraces de agitación que albergan constructos de expresión (por ejemplo, clon pMYC2593 para Cry34Ab1 y pMYC3122 para Cry35Ab1 , y pMYC1334 para Cry3Aa1). El cultivo de semillas en medio LB que se suplemento con 20 pg/ml de tetraciclina se utilizó para inocular 200 mL del mismo medio con 20 pg/ml de tetraciclina. Las expresiones de las toxinas de Cry34Ab1 , Cry35Ab1 , y Cry3Aa1 mediante el promotor Ptac se indujeron mediante la adición de isopropil- -D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) luego de una incubación inicial de 24 horas a 30°C con agitación. Se tomaron muestras de los cultivos en el momento de la inducción y en varios momentos luego de la inducción. La densidad de las células se midió mediante la densidad óptica a 600 nm (OD600).
Fraccionamiento de células y análisis SDS-PAGE de las muestras de los matraces de agitación. En cada momento en que se tomó una muestra, se ajustó la densidad celular de las muestras a ??e?? = 20 y alícuotas de 1-mL se centrifugaron a 14.000 x g durante cinco minutos. Las pellas celulares se congelaron a -80°C. Se generaron fracciones solubles y no solubles de las muestras de pellas celulares de matraz de agitación mediante la utilización de EasyLyse™ Solución de Extracción de Proteína Bacterial (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Cada pella celular se resuspendió en 1 mL de solución EasyLyse™ y se diluyó en forma adicional 1 :4 en regulador de pH de lisis y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lisato se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante como la fracción soluble. La pella (la fracción no soluble) luego se resuspendió en un volumen igual de solución salina regulada en su pH de fosfato (PBS; 11.9 mM Na2HP04l 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH 7.4). Las muestras se mezclaron a 1 :1 con un regulador de pH de muestra de 2X Laemmli con ß-mercaptoetanol y se hirvieron durante 5 minutos en forma previa a la carga sobre NuPAGE Novex 4-20% Bis-Tris gels (Invitrogen, Carisbad, CA). La electroforesis se realizó en el regulador de pH XT MOPS recomendado. Los geles se colorearon con el SirnplyBlue™ Safe Stain de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen) y se visualizaron mediante el sistema de imágenes Typhoon (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).
Preparación del cuerpo de inclusión. Las preparaciones del cuerpo de inclusión de la proteína Cry (IB) se realizaron en células de las fermentaciones de P. fluorescens que produjeron la proteína insecticida de B.t. no soluble, tal como lo demostró SDS-PAGE y MALDI-MS (Desorción/Ionización Asistida por Láser de Matriz/Espectrometría de Masa). Las pellas de fermentación de P. fluorescens se descongelaron en un baño de agua de 37°C. Las células se resuspendieron a 25% p/v en regulador de pH de lisis (50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCI, 20 mM EDTA de sal de disodio (Ácido Etilendiaminetetraacético), 1 % Tritón X-100, y 5 mM Ditiotreitol (DTT); se agregaron 5 mL/L de cóctel inhibidor de la proteasa bacteriana (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) justo antes de la utilización. Las células se resuspendieron mediante un homogeneizador en la configuración más baja (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Se añadió lisozima (25 mg de Sigma L7651 , de clara de huevo de gallina) a la suspensión celular mediante la mezcla con una espátula metálica, y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió sobre hielo durante 15 minutos, luego se sometió a sonicación mediante un Branson Sonifier 250 (dos sesiones de 1- minuto, a 50% del ciclo de trabajo, 30% de producción). La lisis celular se controló mediante microscopía. Se añadieron 25 mg adicionales de lisozima de ser necesario, y se repitieron la incubación y la sonicación. Cuando se confirmó la lisis celular mediante microscopía, el lisato se centrifugó a 11.500 x g durante 25 minutos (4°C) para formar la pella del IB, y se descartó el sobrenadante. La pella del IB se resuspendió con 100 mL de regulador de pH de lisis, se homogeneizó con la batidora de mano y se centrifugó tal como se realizó con anterioridad. La pella del IB se lavó en forma repetida mediante la resuspensión (en 50 mL de regulador de pH de lisis), homogenización, sonicación, y centrifugación hasta que el sobrenadante se volvió incoloro y la pella del IB se volvió firme y de color blancuzco. Para el lavado final, la pella del IB se resuspendió en agua destilada estéril filtrada (0.22 µ?t?) con 2 mM EDTA, y se centrifugó. La pella final se resuspendió en agua destilada estéril filtrada con 2 mM EDTA, y se almacenó en 1 mL de alícuotas a -80°C.
Análisis SDS-PAGE y cuantificación. El análisis SDS-PAGE y la cuantificación de la proteína en las preparaciones de IB se realizaron mediante el descongelamiento de 1 mL de alícuota de la pella del IB y la disolución de 1 :20 con agua destilada estéril filtrada. La muestra diluida luego se hirvió con 4X de regulador de pH de muestra de reducción [250 mM Tris, pH6.8, 40% glicerol (v/v), 0.4% Azul de Bromofenol (p/v), 8% SDS (p/v) y 8% ß-Mercapto-etanol (v/v)] y se cargó sobre una Novex® 4-20% Tris-Glicina, 12+2 well gel (Invitrogen) procesado con 1X Tris/Glicina/regulador de pH SDS (Invitrogen). El gel se procesó durante aproximadamente 60 min a 200 voltios, luego se coloreó y se descoloreó mediante el seguimiento de los procedimientos SirnplyBlue™ Safe Stain (Invitrogen). La cuantificación de las bandas blanco se realizó mediante la comparación de los valores densitométricos para las bandas con las muestras de Albúmina de Suero Bovino (BSA) procesadas en el mismo gel para producir una curva estándar mediante la utilización del software Bio-Rad Quantity One.
Solubilización de los cuerpos de inclusión. Se centrifugaron diez mL de suspensiones de cuerpos de inclusión de clones P. fluorescens MR1253, MR1636, y MR832 (con 50-70 mg/mL de proteínas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 , y Cry3Aa1 respectivamente) en la configuración más alta de una centrifugadora Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para formar en pellas las inclusiones. El sobrenadante del regulador de pH de almacenamiento se extrajo y se reemplazó con 25 mL de regulador de pH de acetato de sodio 100 mM, pH 3.0, para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 , y 100 mM de regulador de pH de carbonato de sodio, pH 1 1 , para Cry3Aa1 , en un tubo cónico de 50 mL, respectivamente. Las inclusiones se resuspendieron mediante una pipeta y se agitaron para mezclar minuciosamente. Los tubos se colocaron en una plataforma que se mecía suavemente a 4°C durante la noche para extraer las proteínas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 , y Cry3Aa1 de longitud completa. Los extractos se centrifugaron a 30.000 x g durante 30 min a 4°C, y se almacenaron los sobrenadantes resultantes que contenían las proteínas Cry solubilizadas de longitud completa.
Truncamientos de protoxinas de longitud completa. Las Cry35Ab1 y Cry3Aa1 de longitud completa se truncaron o digirieron con quimotripsina o tripsina para obtener su núcleo de quimotripsina o tripsina que son una forma activa de las proteínas. Especialmente, Cry35Ab1 de longitud completa solubilizada se incubó con quimotripsina (páncreas bovino) (Sigma, St. MO) a (50:1 = proteína Cry: enzima, p/p) en el regulador de pH de acetato de sodio de 100 mM , pH 3.0, a 4°C con agitación suave durante 2-3 días, mientras que Cry3Aa1 de longitud completa se incubó con tripsina (páncreas bovino) (Sigma, St. MO) a (20:1 = proteína Cry: enzima, p/p) en 100 mM de regulador de pH de carbonato de sodio, pH11, a temperatura ambiente durante 1-3 horas. La activación completa o truncamiento se confirmó mediante análisis SDS-PAGE. La masa molecular de Cry35Ab1 y Cry3Aa1 de longitud completa fue «44 y «73 kDa, y su núcleo de quimotripsina o tripsina fue «40 y «55 kDa, respectivamente. Las secuencias de aminoácido de núcleo de Cry35Ab quimotripsina se proporciona como SEQ ID NO:5. Las secuencias de aminoácido del núcleo de Cry3Aa tripsina se proporciona como SEQ ID NO:2. Ni el núcleo de quimotripsina o tripsina está disponible para Cry34Ab1; por lo tanto, Cry34Ab1 de longitud completa se utilizó para los ensayos de unión. La secuencia de aminoácido de Cry34Ab1 de longitud completa se proporciona como SEQ ID NO:3.
Purificación de toxinas truncadas. Se purificaron Cry35Ab1 quimotripsinisada y Cry3Aa1 tripsinisada. Específicamente, las reacciones de digestión se centrifugaron a 30.000 x g durante 30 min a 4°C para eliminar lípidos, y el sobrenadante resultante se concentró 5 veces utilizando un dispositivo de filtro de centrifugación de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 (10.000 Límite de Peso Molecular; Millipore). Los reguladores de pH de muestra luego se cambiaron a 20 mM de regulador de pH de acetato de sodio, pH 3.5, para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 , y a 10 mM CAPS [ácido 3-(ciclohexamino)l-propansulfónico], pH 10.5, para Cry3Aa1 , utilizando columnas PD-10 desechables (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Los volúmenes finales se ajustaron a 15 mi utilizando el regulador de pH correspondiente para la purificación con la utilización del sistema de cromatografía líquida ATKA Explorer (Amersham Biosciences). Para Cry35Ab1 , el regulador de pH A fue 20 mM de regulador de pH de acetato de sodio, pH 3.5, y el regulador de pH B fue regulador de pH A + 1 M NaCI, pH 3.5. Se utilizó una columna HiTrap SP (5 mi) (GE). Luego de que la columna se equilibró completamente utilizando el regulador de pH A, la solución Cry35Ab1 se inyectó en la columna a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La elución se llevó a cabo utilizando el gradiente 0-100% del regulador de pH B a 5 ml/min con 1 ml/fracción. Para Cry3Aa1 , el regulador de pH A fue 10 mM regulador de pH CAPS, pH 10.5, y el regulador de pH B fue 10 mM regulador de pH CAPS, pH 10.5 + 1 M NaCI. Se utilizó una columna Capto Q, 5 mi (5 mi) (GE) y todos los otros procedimientos fueron similares a los aplicados para Cry35Ab1. Luego del análisis SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas para selección adicional de fracciones que contienen la proteína blanco de mejor calidad, se agruparon dichas fracciones. El regulador de pH se cambió para el núcleo de quimotripsina de Cry35Ab1 purificada con 20 mM Bist-Tris, pH 6.0, como se describió anteriormente. Para el núcleo de tripsina de Cry3Aa1 purificado, la sal se eliminó utilizando columnas PD-10 desechables (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Las muestras se retiraron a 4°C para un posterior ensayo de unión luego de cuantificarse utilizando análisis SDS-PAGE y sistema de imagen Typhoon (GE) con BSA como un estándar.
EJEMPLO 2 Ensayos de Unión Preparaciones de BBMV. Las preparaciones de vesículas de membrana en borde de cepillo (BBMV) de intestino medio de insecto se han utilizado ampliamente para los ensayos de unión del receptor de la toxina Cry. Las preparaciones de BBMV utilizadas en la invención se prepararon de intestinos medios aislados de insectos de tercer estadio de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) mediante el método descrito por Wolferberger et al. (1987). Se utilizó leucina aminopeptidasa como un marcador de las proteínas de la membrana en la preparación y las actividades de leucina aminopeptidasa del homogenato crudo y la preparación de BBMV se determinaron tal como se describió en forma previa (Li et al. 2004a). La concentración de proteínas de la preparación de BBMV se midió mediante el método Bradford (1976).
Marcado 125l. Cry34Ab1 de longitud completa purificada, Cry35Ab1 quimotripsinisada, y Cry3Aa tripsinisada se marcaron mediante 125l para los ensayos de unión homólogos y de competitividad. A fin de garantizar que el radio-marcado no anule la actividad biológica de las toxinas de Cry, se llevó a cabo la yodación fría mediante Nal y de acuerdo a las instrucciones de Pierce® lodination Beads (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, Rockford IL). Los resultados del bioensayo indicaron que el núcleo de quimotripsina de Cry35Ab1 yodinado permaneció activo contra la larva de la raíz del maíz oeste, pero la yodinación inactivo Cry34Ab1. 25l-Cry34Ab1 radiomarcado no se unieron específicamente al BBMW de insecto, y Cry34Ab1 requiere otro método de marcado para evaluar la unión del receptor a membrana. El bioensayo utilizando núcleo de tripsina de Cry3Aa yodado frío está en curso y el resultado estará disponible en una o dos semanas. 125l-Cry35Ab1 y 125l-Cry3Aa1 radiomarcadas se obtuvieron con Pierce® lodination Beads (Pierce) y Na125l. Zeba™ Desalt Spin Columns (Pierce) se utilizaron para extraer el Na125l no incorporado o libre, de la proteína yodada. Las radioactividades específicas de las proteínas Cry yodadas fueron desde 1—5 uCi/ug. Se realizaron múltiples lotes de ensayos de marcado y de unión.
Ensayos de unión específica. Los ensayos de unión específica se realizaron mediante la utilización de toxinas de Cry marcadas 125l tal como se describió en forma previa (Li et al. 2004b). A fin de determinar la unión específica y estimar la afinidad de unión (constante de disociación, Kd) y la concentración del sitio de unión (Bmax) de Cry35Ab1 y Cry3Aa a la BBMV del insecto, se incubaron una serie de concentraciones crecientes de 125l- Cry35Ab1 o 125l-Cry35Aa con una concentración determinada (0.05 mg/ml) de la BBMV del insecto respectivamente, en 150 ul de 20 mM Bis-Tris, pH 6.0, 136.9 mM NaCI, 2.7 mM KCI, complementado con 0.1% BSA a temperatura ambiente durante 60 min con una agitación suave. La toxina unida a BBMV se separó de las toxinas libres en la suspensión por medio de la centrifugación a 20.000 x g a temperatura ambiente durante 8 min. La pella se lavó dos veces con 900 ul del mismo regulador de pH helado con 0.1% BSA. La radioactividad restante en la pella se midió con un contador COBRAN Auto-Gamma (Packard, una empresa de Canberra) y consideró la unión total. Otra serie de reacciones de unión se estableció de lado a lado, y un exceso de 500—1.000 veces de la toxina sin marcar correspondiente se incluyó en cada una de las reacciones de unión para ocupar totalmente todos los sitios de unión específicos en la BBMV, que se utilizó para determinar la unión no específica. La unión específica se estimó mediante la sustracción de la unión no específica de la unión total. Los valores Kd y Bmax de estas toxinas se estimaron mediante la utilización de unión específica contra las concentraciones de la toxina marcada utilizada mediante la operación de GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). Las tablas se realizaron con los programas Microsoft Excel o GraphPad Prism. Los experimentos se reprodujeron al menos tres veces. Estos experimentos de unión demostraron que tanto 125l-Cry35Ab1 como 125l-Cry3Aa fueron capaces de unirse en forma específica a la BBMV (Figura 1A y 1 B). 125l-Cry35Ab1 y 125l-Cry3Aa tuvieron una afinidad de unión de Kd=2.31 ± 1.26, 24 ± 9.7 (nM) respectivamente, y una concentración del sitio de unión de Bmax=31.69 ± 6.38, 146.3 ± 39.9 (pmol/mg BBMV), respectivamente.
Ensayos de unión de competitividad. Se realizaron ensayos de unión de competitividad adicionales para determinar si Cry35Ab1 y Cry3Aa comparten un mismo grupo de receptores. Para los ensayos de unión de competitividad homólogos de Cry3Aa, primero se mezclaron cantidades crecientes (0—5.000 nM) de Cry3Aa sin marcar con 5 nM de Cry3Aa marcado, y luego se incubaron con una concentración determinada (0.05 mg/ml) de BBMV a temperatura ambiente durante 60 min, respectivamente. Los porcentajes de 125l-Cry3Aa unida con BBMV se determinaron para cada una de las reacciones en comparación con la unión específica inicial en ausencia de un competidor sin marcar. Se realizaron ensayos de unión de competitividad heterólogos entre 125l-Cry3Aa y Cry35Ab1 sin marcar solo o Cry35Ab1 + Cry34Ab1 sin marcar (relación molar 1 :3) también se llevaron a cabo respectivamente para identificar si comparten el mismo grupo de receptor(es). Esto se obtuvo mediante el aumento de la cantidad de Cry35Ab1 sin marcar solo o mezcla de Cry35Ab1 + Cry34Ab1 como uno o dos competidores incluidos en las reacciones para competir por el/los receptor/es putativo/s en la BBMV con la Cry3Aa marcada. Los experimentos se reprodujeron al menos tres veces. Los resultados del experimento demostraron que Cry3Aa fue capaz de desplazarse completamente cuando la concentración molar aumentó a 500 nM (100 veces en exceso 125l-Cry3Aa) (Figura 2). Sin embargo, ya sea Cry35Ab1 solo o la mezcla de Cry35Ab1 + Cry34Ab1 (1 :3) no fue capaz de desplazar a 125l-Cry3Aa. Estos datos indican que Cry35Ab1 solo o Cry35Ab1+ Cry34Ab1 (1 :3) no comparte un receptor con Cry3Aa.
Referencias Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254.
Li, H., Oppert, B., Higgins, RA, Huang, F., Zhu, K.Y., Buschman, L.L., 2004a. Comparative analysis of proteinase activities of Bacillus thuríngiensis-res siani and -susceptible Ostrínia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 34, 753-762.
Li, H., Oppert, B., González-Cabrera, J., Ferré, J., Higgins, R.A., Buschman, L.L. and Zhu, K.Y. and Huang, F. 2004b. Binding analysis of CryIAb and CryIAc with membrane vesicles from Bacillus thuringiensis-resistant and -susceptible Ostrínia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 52-57.
Wolfersberger, M.G., Luthy, P., Maurer, A., Parenti, P., Sacchi, F., Giordana, B., Hanozet, G.M., 1987. Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the cabbage butterfly (Pierís brassicae). Comp. Biochem. Physiol. 86A, 301-308.
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080193974. 2008. SECUENCIAS LÍDERES BACTERIALES PARA MAYOR EXPRESIÓN. (BACTERIAL LEADER SEQUENCES FOR INCREASED EXPRESSION) Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20060008877, 2006. Sistemas de expresión con secreción de sistema sec. (Expression systems with sec-system secretion).
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080058262, 2008. Optimización rPA (rPA optimization)

Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una planta transgénica que produce una proteína Cry34, una proteína Cry35, y una proteína insecticida Cry3A.
2.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta además produce una cuarta proteína insecticida seleccionada del grupo que consta de Cry3B, y Cry6A.
3.- Una semilla de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha semilla comprende dicho ADN.
4. - Un campo de plantas que comprende una pluralidad de plantas de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
5. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho campo además comprende plantas de refugio no Bt, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos de 40% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
6. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 30% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
7. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque donde dichas plantas de refugio comprenden menos de 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
8. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
9. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 5% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.
10. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho campo carece de plantas de refugio.
11. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están en bloques o en fajas.
12. - Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 3, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos de 40% de todas las semillas en la mezcla.
13. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 30% de todas las semillas en la mezcla.
14. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 20% de todas las semillas en la mezcla.
15. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 10% de todas las semillas en la mezcla.
16.- La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 5% de todas las semillas en la mezcla.
17.- Un contenedor o saco de semillas que comprende una pluralidad de semillas de la reivindicación 3, dicho contenedor o saco tiene cero semilla de refugio.
18. - Un método de manejo de desarrollo de la resistencia a una proteína Cry por un insecto, dicho método comprende plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5 ó 10.
19. - Un campo de cualquiera de las reivindicaciones 5-11 , en donde dichas plantas ocupan más de 10 acres (4.04 hectáreas).
20. - Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha planta es una planta de maíz.
21.- Una célula vegetal de una planta cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha proteína Cry35 es al menos 95% idéntica con una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, dicha proteína insecticida Cry3A es al menos 95% idéntica con una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, y dicha proteína Cry34 es al menos 95% idéntica con SEQ ID NO:3.
22.- Una planta de cualquiera de la reivindicaciones 1-2, en donde dicha proteína Cry35 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, dicha proteína insecticida Cry3A comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, y dicha proteína Cry34A comprende SEQ ID NO:3.
23. - Un método de producción de la célula vegetal de la reivindicación 21.
24. - Un método de controlar el insecto de gusano de la raíz al poner en contacto dicho insecto con una proteína Cry34, una proteína Cry35, y una proteína insecticida Cry3A.
25. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34A, dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35A, y dicha proteína Cry3A es una proteína Cry3Aa.
26. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34Ab y dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35Ab.
27. - La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha proteína Cry3B es una proteína Cry3Ba y dicha proteína Cry6A es una proteína Cry6Aa.
28. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34A, dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35A, y dicha proteína Cry3A es una proteína Cry3Aa.
29. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34Ab y dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35Ab.
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