NL8401048A - Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten. - Google Patents

Description

* . rife Λ *

A

Werkwijze voor het.inbouwen van vreemd DNA in het genoom van eenzaadlobbige planten.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het inbouwen van vreemd DNA in het genoom van planten door de planten te infecteren of planteprotoplasten te incuberen met Agrobacterium bacteriën, die één of meer Ti (tumor-inducerende)-5 plasmiden bevatten.

De bacteriën Agrobacterium tumefaclens en Agrobacterium rhizogenes zijn van nature in staat plantecellen genetisch te manipuleren. De bacteriën hechten aan aan de plantecelwand en brengen vervolgens via een nog onopgehelderd 10 proces een «tuk DNA binnen in de plantecel. Dit stuk DNA

(het T-DNA) maakt als T-regio in de bacterie deel uit van een groot (120 - 150 Mdal.) plasmide, dat ingeval van A.tumefaciens Ti-plasmide en ingeval van A,rhizogenes Ri-plasmide wordt genoemd. Het T-DNA wordt geïntegreerd in het kemgenoom van 15 de plantecel (Thomashow, M.F., et al. (1980). Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 77: 6448 - 6452}. Genen gelegen in het T-DNA komen daar tot expressie en zorgen ervoor, dat de plantecel zich gaat gedragen als een tumorcel (Ooms, G., et. al (1981). Gene 14: 33 - 50). Intussen zijn methoden ontwikkeld om willekeurig 20 welk DNA zodanig te koppelen aan de T-regio, dat dit vervolgens tegelijk met T-regio d.m.v. A.tumefaciens kan worden geïntroduceerd in de plantecel (Hille, J., et.al. (1983). J.Bacteriol.

154: 693 - 701 en Hoekema, A. et al. (1983). Nature 303: 179 - 180). Uit de T-regio kunnen de cncagenen worden verwijderd 25 (Hille, J., et al. (1983). Plant Mol. Biol. 2: 155 - 163 en

Zambryski, P., et al. (1983). EMBO J. 2: 2143 - 2150).

Dit resulteert in vectoren, die nog wel door het A.tumefaciens 8401048 - 2 - systeem worden overgedragen naar de plantecel, maar die niet langer oncogeen zijn (Hille, J., et al- (1983). Plant Mol.

Biol» 2: 155 - 163 en Zambryski, P., et al. (1983). EMBO J. 2: 2143 - 2150). Plantecellen getransformeerd met deze "getemde” 5 vectoren kunnen regenereren tot planten met nieuwe eigenschap pen (gecodeerd door de in de T-regio ingevoerde genen (Zambryski, P-, et al. (1983). EMBO J. 2: 2143 - 2150).

Volgens literatuurgegevens kan het Ti-plasmide als vector alleen gebruikt worden voor tweezaadlobbige planten, 10 aangezien alleen tweezaadlobbige planten op A.tumefaciens reageren met tumorvorming (Lippincott, J.A. & Lippincott, B.B. (1975). Ann.. Rev. Microbiol. 29: 377 - 407).

Het feit, dat de celwand van eenzaadlobbige (monocotyle) planten verschilt van die van tweezaadlobbigen zou hier debet aan zijn 15 (Lippincott, J.A. & Lippincott, B.B. (1980). In: "Bacterial

Adherence in Receptors and Recognition" (E.H. Beachley, ed.) pp. 377 - 396 en Rao, S.S», et al„ (1982). Physiol. Plant. 56: 374 - 380). De heersende opvatting is derhalve, dat het Ti- . plasmide niet geschikt zou zijn als vector voor de genetische 20 manipulatie- van eenzaadlobbige planten (Flavell, R. & Mathias, R.

(1984). Nature 307: 108 - 109). Onder de monocotylen bevinden zich echter uiterst belangrijke land- en tuinbouwgewassen, zoals de granen en bolgewassen als tulp, narcis en lelie. Het hieronder beschreven uitgevoerde onderzoek werd gedaan om te 25 zien of de heersende opinie omtrent het afwezig zijn van mogelijkheden om het Ti-plasmide te gebruiken als vector voor monocotylen wel juist was. In dit onderzoek werden verschillende soorten monocotyle planten geïnfecteerd met A.tumefaciens stammen, die of verschillende typen Ti- of Ri-plasmiden 30 afzonderlijk bezaten of een combinatie van dergelijke plasmiden herbergden. Uit de experimenten bleek verrassenderwijze, dat cellen van monocotyle planten wel degelijk getransformeerd werden door A.tumefaciens. Daarmee werd nu voor het eerst aangetoond dat het Ti-plasmide (of daarvan afgeleide plamiden) 35. geschikt is voor de genetische manipulatie van monocotyle planten.

8401048 - 3 -

Experiment!

In het T-DNA liggen naast one-genen, die zorgen voor fytohormoon synthese (Ooms, G., et al» (1981). Gene 14: 5 33 - 50 en Garfinkel, D.J., et al. (1981). Cell 27: 143 - 153), ook genen, die coderen voor enzymen die zorgdragen voor de biosynthese van "opines". Deze laatste zijn tumorspecifieke aminozuurderivaten zoals octopine en nopaline (Tempé, J. &

Goldman, A. (1982). In: "Molecular Biology of Plant Tumors".

10 (G. Kahl & J. Schell, eds.), pp. 427 - 449).

Opines komen niet voor in normale plantecellen en kunnen dus beschouwd worden als specifieke indicators voor opname en expressie van T-DNA in de plantecel, zelfs indien er géén sprake zou zijn van transformatie die leidt tot vorming van 15 tumorcellen. Er zijn verschillende typen T-DNA, die genen dragen voor enzymen, die zorgen voor de biosynthese van verschillende opines. De meest bekende zijn de octopine en respectievelijk nopaline T-DNAs.

Een groot aantal proeven werd nu uitgevoerd 20 waarin monocotyle planten uit de familie Liliaceae ^τητ-ηηΉγ-Κητη capense) en de familie Amaryllidaceae (Narcissus cv. Paperwhite) werden verwond en vervolgens geïnfecteerd met verschillende A.tumefaciens stammen. De gebruikte stammen waren: LBA288 (avirulenty géén Ti-plasmide), LBA1010 (bevat een octopine 25 Ti-plasmide), LBA2318 (bevat een nopaline Ti-plasmide), LBA1020 (bevat een Ri-plasmide), LBA2347 (bevat een nopaline

Ti-plasmide + Ri-plasmide), LBA1516 (bevat een octopine

Ti-plasmide met een Vir-mutatie ,* avirulent). Na een aantal weken werd plantemateriaal uit de infectieplaats verwijderd 30 en geanalyseerd op opines (Otten, L.A.B.M. & Schilperoort, R.A. (1978). Biochim. Biophys. Acta 527: 497 - 500).

Het dient opgemerkt te worden, dat na infectie met virulente stammen vaak een lichte verdikking rond de wondplaats te zien was. Dikke tumoren werden niet gevormd, in het geval van 35 infectie met avirulente stammen werd in het geheel geen 8401048

Claims (6)

1. Werkwijze voor het inhouwen van vreemd DNA in het genoom van planten door de planten te infecteren of planteprotoplasten te incuberen met Agrobacterium bacteriën, die één of meer Ti (tumor-inducerende)-plasmiden bevatten, 5 met het kenmerk, dat men éénzaadlobbige planten infecteert 0f éénzaadlobbige planteprotoplassen incubeert met Agrobacterium bacteriën, waarin het Ti (tumor-inducerende)-plasmide een stabiel coïntegraat plasmide is uit een plasmide R772 en een plasmide pTiBB met vreemd DNA ingebouwd in het T-gebied. van 10 de Ti-component van het coïntegraat plasmide.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Agrobacterium bacteriën, worden gebruikt, welke ten minste één plasmide, dat het Vir-gebied van een Ti 15 (tumor-inducerend)-plasmide maar geen T-gebied heeft, en ten minste één ander plasmide, dat een T-gebied met daarin ingebouwd vreemd DNA maar geen Vir-gebied heeft, bevatten.

3. Eenzaadlobbige planten en plantecellen 20 verkregen nadat onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 1 of 2 de genetische eigenschappen van de oorspronkelijke planten c.q. plantecellen zijn gewijzigd.

4. Werkwijze voor de bereiding van chemische 25 en/of farmaceutische produkten, met het kenmerk, dat onder toe passing van de werkwijze volgens -'conclüsie. l of 2 verkregen cellen worden gekweekt en de gewenste stof wordt geïsoleerd. 1 8401048

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het ken merk, dat het kweken door middel van fermentatie en eventueel daarop volgende immobilisatie wordt uitgevoerd. - 4 - * verdikking geconstateerd. Plantemateriaal geïsoleerd uit niet-verwonde of verwonde, maar niet-geinfecteerde monocotyle planten, bleek noch octopine noch nopaline te bevatten. Opines werden ook 5 niet ontdekt in plantemateriaal dat geïsoleerd werd uit planten die geïnfecteerd waren met de avirulente stammen LBA288 of LBA1516. Daarentegen bleken plantecellen die verkregen waren uit wondvlakken, die geïnfecteerd waren met virulente A.tumefaciens stammen vrijwel steeds opines te bevatten.

10 Na infectie met een stam met een octopine Ti-plasmide (LBAlQlO) bleek octopine aanwezig te zijn, terwijl na infectie met stammen met een nopaline Ti-plasmide (LBA2318, LBA2347) nopaline aanwezig bleek te zijn. De resultaten verkregen met stam LBA2347 leverden het meest reproduceerbaar positieve IS resultaten op. Al deze gegevens tezamen leveren het bewijs dat A.tumefaciens in staat is T-DNA over te dragen naar monocotyle plantecellen, en verder dat T-DNA genen (in elk geval die voor de enzymen betrokken bij de biosynthese van opines) tot expressie komen in monocotyle plantecellen. Er kan 20 derhalve geconcludeerd worden dat het Ti-plasmide geschikt is ais vector voor monocotyle plantecellen. Verder kan de conclusie getrokken worden dat de regulator-gebieden, die zorgen voor het tot expressie komen van de opine synthase genen functioneel en derhalve geschikt zijn om als bouwstenen te dienen voor het 25 maken van chimaere genen, die tot expressie moeten worden gebracht in monocotyle plantecellen De uitvinding betreft derhalve een werkwijze als in de aanhef genoemd, die daardoor is gekenmerkt, dat of 30 men éénzaadlobbige planten infecteert éénzaadlobbige plante— protoplassen incubeert met Agrobacterium bacteriën,, waarin, het Ti(tumor-inducerende)-plasmide een stabiel coïntegraat plasmide is uit een plasmide R772 en een plasmide pTiBö met vreemd DNA ingebouwd in het T-gebied van de Ti-component van 35 het coïntegraat plasmide 84 0 1 0 4 ff - 5 - *. ·*0 Bij voorkeur maakt men gebruik van Agrobacterium bacteriën, welke ten minste één plasmide, dat het Vir-gebied van een Ti (tumor-inducerend)-plasmide maar geen T-gebied heeft-, en ten minste één ander plasmide, dat een 5 T-gebied met daarin ingebouwd vreemd DNA maar geen Vir-gebied heeft, bevatten. Voor de Agrobacterium bacteriën, die geschikt zijn voor de werkwijze volgens, de uitvinding alsmede voor de wijze waarop deze bacteriën kunnen worden verkregen zijn al 10 rechten gevraagd in de niet-voorgepubliceerde Europese octrooiaanvrage 84200239.6. Voor het tot expressie brengen van vreemde genen in monocotyle plantecellen kan men gebruik maken van de regulatorgebieden van T DNA-genen,· in het bijzonder de genen 15 voor octopine synthase en nopaline synthase. 84 0 1 0 4 8 Λ V'—setZ - 7 - »

6. Werkwijze volgens conclusies 1 of 2, met het kenmerk, dat de regulatorgebieden gelegen v<5<5r en achter de eiwitcoderende gebieden van T DNA-genen in het bijzonder, de genen voor octopine synthase en nopaline synthase 5 voor het tot expressie brengen van vreemde genen in monocotyle plantecellen gebruikt worden. 8401040