MX2012012370A - Combinaciones que incluyen proteinas cry34ab/35ab y cry6aa para prevenir el desarrollo de resistencia en gusanos de la raiz de maiz (diabrotica spp.). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere en parte a Cry34Ab/35Ab en combinación con Cry6Aa; la presente invención se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que las combinaciones de Cry34Ab/Cry35Ab y Cry6Aa son útiles para prevenir que una población de gusanos de la raíz del maíz (Diabrotica spp.) desarrolle resistencia (a cada sistema de proteína insecticida); incluidas en la presente invención se encuentran las plantas que producen estas proteínas insecticidas Cry, las cuales son útiles para disminuir la preocupación de que una población de gusanos de la raíz del maíz pudiera desarrollarse y fuera resistente a cualquiera de estos sistemas de proteínas insecticidas; las plantas (y el acreaje plantado con tales plantas) que producen estos dos sistemas de proteínas insecticidas se incluyen dentro del alcance de la presente invención; el tema de la invención también se refiere en parte a combinaciones de proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry3Aa (de apilamiento triple) con una proteína Cry6Aa; las plantas transgénicas, incluyendo maíz, que comprenden un gen cry6Aa, genes cry34Ab/35Ab y un gen cry3Aa están incluidas en el alcance de la presente invención; por lo tanto, tales modalidades apuntan a gusanos de la raíz del maíz con tres modos de acción.

Description

COMBINACIONES QUE INCLUYEN PROTEÍNAS CRY34AB/35AB Y CRY6AA PARA PREVENIR EL DESARROLLO DE RESISTENCIA EN GUSANOS DE LA RAÍZ DE MAÍZ (DIABROTICA SPP.) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los hombres cultivan el maíz para la alimentación y aplicaciones de energía. El maíz es un cultivo importante. Es una fuente importante de alimentos, productos alimenticios y alimento para animales en muchas partes del mundo. Los insectos comen y dañan las plantas y de este modo socavan los esfuerzos realizados por el hombre. Miles de millones de dólares se gastan cada año para controlar las plagas de insectos y miles de millones adicionales se pierden por el daño que causan.

El daño causado por las plagas de insectos es uno de los factores principales de la pérdida de los cultivos de maíz mundiales, a pesar del uso de medidas preventivas, como los pesticidas químicos. En función de esto, la resistencia a los insectos ha sido genéticamente diseñada en los cultivos como en el maíz a los fines de controlar el daño provocado por los insectos y reducir la necesidad de pesticidas químicos tradicionales.

Más de 4046856.42 hectáreas de maíz de los Estados Unidos están infectadas con el complejo de especie de gusano de la raíz del maíz. El complejo de la especie de gusano de la raíz del maíz incluye el gusano de la raíz del maíz del norte (Diabrotica barben), el gusano de la raíz del maíz del sur (D. undecimpunctata howardi), y el gusano de la raíz del maíz del oeste (D. virgifera virgifera). (Otras especies incluyen Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño), y el complejo de gusano de la raíz del maíz brasileño {Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa).) Las larvas que habitan en el suelo de estas especies Diabrotica se alimentan en la raíz de la planta de maíz, lo que provoca que permanezcan allí. Su permanencia finalmente reduce el rendimiento del maíz y generalmente da por resultado la muerte de la planta. Al alimentarse de barbas del maíz, los escarabajos adultos reducen la polinización y, por lo tanto, afectan en detrimento el rendimiento del maíz por planta. Asimismo, los adultos y las larvas del género Diabrotica atacan los cultivos cucurbitáceos (pepinos, melones, calabazas, etc.) y muchos vegetales y cultivos de campo en la producción comercial así como aquellos que se cultivan en los jardines de los hogares.

Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido herramientas primarias utilizadas para controlar las plagas de insectos, pero los insecticidas biológicos, como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han cumplido un papel importante en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticida de Bt ha revolucionado la agricultura moderna y aumentado la importancia y valor de las proteínas insecticidas y sus genes.

Las proteínas de cristal insecticida de algunas cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.) son muy conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Hofte et al., Microbial Reviews, Vol. 53, N 0 2, p. 242-255 (1989). Estas proteínas generalmente se producen mediante bacterias como aproximadamente 130 kDa protoxinas que luego se escinden mediante proteasas en el intestino medio del insecto, luego de la ingestión por el insecto, para proporcionar a penas 60 kDa toxina núcleo. Estas proteínas son conocidas como proteínas cristal porque pueden observarse inclusiones cristalinas distintivas con esporas en algunas cepas de B.t. Estas inclusiones cristalinas están generalmente compuestas de varias proteínas distintivas.

Un grupo de genes que se han utilizado para la producción de cultivos transgénicos resistentes a insectos son las delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (B.t.). Las endotoxinas delta se han expresado exitosamente en plantas de cultivo como algodón, papas, arroz, girasol, así como maíz, y han demostrado proporcionar un control excelente respecto de las plagas de insectos. (Perlak, F. J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F. J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321 ; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 1 1 : 1151-1 155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1 101-1 104; PCT publicación número WO 01/13731 ; y Bing J W et al. (2000) Efficacy of CryI F Transgenic Maize, 14.° Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Coló.) Varias proteínas de Bt se han utilizado para crear plantas transgénicas resistentes a insectos que se han registrado de manera exitosa y comercializado hasta la fecha. Estas incluyen CryIAb, CryIAc, CryI F, Cry1A.105, Cry2Ab, Cry3Aa, Cry3Bb, y Cry34/35Ab en maíz, CryIAc y Cry2Ab en algodón, y Cry3A en papa.

Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una sola proteína salvo en casos donde se desea el espectro insecticida combinado de 2 proteínas (por ejemplo, CryIAb y Cry3Bb en maíz combinado para proporcionar resistencia a las plagas de lepidoptera y gusanos de la raíz, respectivamente) o donde la acción independiente de las proteínas las torna útiles como una herramienta para retrasar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo, CryIAc y Cry2Ab en algodón combinado para proporcionar manejo de resistencia al gusano tabacalero).

Algunas cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos que han levado a un rápida y amplia adopción de esta tecnología también ha causado la preocupación de que las poblaciones de plagas desarrollarán resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Varias estrategias se han sugerido para preservar la utilidad de las características de resistencia a insectos basadas en Bt que incluyen en despligue de proteínas a una alta dosis en combinación con refugio, y alternancia con, o despliegue conjunto de, diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).

Las proteínas seleccionadas para el uso en la pila del Manejo de resistencia a insectos (IRM) deben ser activas de manera que la resistencia desarrollada a una proteína no confiere resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de plaga seleccionada para la resistencia a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", uno concluiría que no hay resistencia cruzada y que una combinación de Proteína A y Proteína B sería efectiva para retrasar la resistencia a la Proteína A sola.

En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, las evaluaciones pueden hacerse en base a otras características que se presume que están relacionadas con el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la utilidad de la unión mediada por receptor en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no presenten resistencia cruzada (van Mellaert et al. 1999). El pronosticador clave es la falta de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por receptores en una especie de insecto sensible.

En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, luego si ese receptor muta en ese insecto de manera que una de las toxinas no se una más a aquel receptor y, por ende, no es más insecticida respecto del insecto, puede ser el caso de que también el insecto también sea resistente a la segunda toxina (que se une competitivamente al mismo receptor). Es decir, se dice que el insecto es resistente en forma cruzada a ambas toxinas de Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser un indicio que el insecto no sería simultáneamente resistente a aquellas dos toxinas.

Un sistema de proteínas insecticidas relativamente nuevo se descubrió en Bacillus thuringiensis como se describe en WO 97/40162. Este sistema comprende dos proteínas - una de aproximadamente 14-15 kDa y las otras dos de aproximadamente 44-45 kDa. Véase también Patente de los Estados Unidos N.° 6,083,499 y 6,127,180. Estas proteínas ahora han sido asignadas a sus propias clases, y por consiguiente recibieron las designaciones Cry de Cry34 y Cry35, respectivamente. Véase Crickmore et al. sitio web (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Muchas otras proteínas relacionadas de este tipo de sistema no se han descrito. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6,372,480; WO 01/14417; y WO 00/66742. Los genes optimizados de plantas que codifican dichas proteínas, en donde los genes están diseñados para utilizar codones para la expresión optimizada en plantas, también se han descrito. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6,218,188.

El modo exacto de acción del sistema Cry34/35 aún tiene que determinarse, pero parece formar poros en las membranas de las células del intestino del insecto. Véase Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 Gulio 2001); Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004). Los mecanismos exactos de acción aún no son claros a pesar de las coordenadas atómicas 3D y las estructuras de cristal que se conocen para una proteína de Cry34 y una Cry35. Véase Patente de los Estados Unidos N.° 7,524,810 y 7,309,785. Por ejemplo, no es claro si una o ambas de estas proteínas unen un tipo típico de receptor, como una fosfatasa alcalina o una aminopeptidasa.

Asimismo, debido a que hay diferentes mecanismos por los que un insecto puede desarrollar resistencia a la proteína Cry (como, mediante glicosilación alterada del receptor [véase Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 5711-5717], mediante eliminación de la proteína del receptor [véase Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842], mediante mutación del receptor, u otros mecanismos [véase Heckel et al., J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197]), fue imposible predecir a priori si habría resistencia cruzada entre Cry34/35 y otras proteínas Cry. Lefko et al. explica un fenómeno de resistencia complejo en el gusano de raíz. J. Appl. Entomol. 132 (2008) 189-204.

Predecir la unión competitiva para el sistema Cry34/35 es además complicado por el hecho de que dos proteínas están involucradas en el sistema binario Cry34/35. Nuevamente, no es claro si estas proteínas unen efectivamente el intestino de insecto /células de intestino y cómo lo hacen, y si interactúan o se unen entre sí y cómo lo hacen.

Otras opciones para controlar coleóptera incluyen toxinas Cry3Bb, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33 con ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901 , TIC1201 , ET29 con TIC810, ET70, ET76 con ET80, TIC851 , y otras. Los enfoques ARNi también se han propuesto. Véase, por ejemplo, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, n.° 11 (Nov. 2007) p. 1322-1326.

Meihls et al. sugiere el uso de refugios para el manejo de resistencia en el gusano de raíz de maíz. PNAS (2008) vol. 105, N.° 49, 19177-19182.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en parte con Cry34Ab/35Ab en combinación con Cry6Aa. La presente invención se relaciona en parte con el sorprendente descubrimiento que Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa son útiles para prevenir el desarrollo de resistencia (a cualquier sistema de proteína insecticida solo) por una población de gusano de raíz de maíz {Diabrotica spp.). Un experto en la técnica reconocerá con el beneficio de la presente descripción, plantas que producen estas proteínas Cry insecticidas serán útiles para mitigar la preocupación de que podría desarrollarse una población de gusano de raíz de maíz que sería resistente a cualquiera de estos sistemas de proteína solos.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento que los componentes de estos sistemas de proteína Cry no compiten entre sí para la unión de receptores del intestino del gusano de raíz del maíz.

La presente invención también se relaciona en parte con pilas triples o "pirámides" de tres (o más) sistemas de toxina, con Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa como el par base. Por lo tanto, las plantas (y superficie en hectáreas cultivadas con dichas plantas) que producen estos dos sistemas de proteína insecticidas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1 B. Unión de 125l-Cry35Ab1 (figura 1A) y 125l-Cry6Aa1 (figura 1 B) como una función de entrada de toxinas Cry radiomarcadas a BBMV preparadas de larvas del gusano de raíz del maíz del oeste. Unión específica = unión total - unión no específica, barra de error=SEM (error estándar de promedio).

Figura 2. Unión de 125l-Cry35Ab1 a BBMV preparada de larvas de gusano de la raíz del maíz del oeste en diferentes concentraciones de competidor no marcado (log 0.1—1.0. log 1=0, log 10=1.0, log100=2.0, log1000=3.0).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 : Secuencia de proteína Cry35Ab1 nativa de longitud completa.

SEQ ID NO: 2: Secuencia de proteína de núcleo de Cry35Ab1 , quimotripsina truncada.

SEQ ID NO: 3: Secuencia de proteína Cry34Ab1 nativa de longitud completa.

SEQ ID NO: 4: Secuencia de proteína Cry6Aa1 nativa de longitud completa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las secuencias para la proteína Cry34Ab/35Ab pueden obtenerse de aislado de Bacillus thruingiensis PS149B1 , por ejemplo. Para otros genes, secuencias de proteína y aislados de origen para usarlos de acuerdo con la presente invención, véase, por ejemplo, el sitio de la red de Crickmore et al. (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html).

La presente invención incluye el uso de proteínas insecticidas Cry34Ab/35Ab en combinación con una toxina Cry6Aa para proteger al maíz del daño y la pérdida de rendimiento provocada por la alimentación del gusano de raíz del maíz por poblaciones de gusano de raíz del maíz que pueden desarrollar resistencia a cualquiera de estos sistemas de proteína Cry solos (sin el otro).

La presente invención además explica una pila de Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) para evitar el desarrollo de resistencia por un gusano de la raíz del maíz a Cry6Aa y/o Cry34Ab/35Ab.

La presente invención proporciona composiciones para controlar las plagas de gusanos de raíz del maíz que comprenden células que producen una proteína de toxina Cry6Aa y un sistema de toxina Cry34Ab/35Ab.

La invención además comprende un huésped transformado para producir una proteína Cry6Aa y una toxina binaria Cry34Ab/35Ab, en donde dicho huésped es un microorganismo o célula vegetal.

Además se busca que la invención proporcione un método de control de las plagas de gusano de raíz que comprende poner en contacto dichas plagas o el ambiente de dichas plagas con una cantidad efectiva de una composición que contiene una proteína Cry6Aa y además contienen una toxina binaria Cry34Ab/35Ab.

Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen que se puede expresar en plantas que codifica una toxina binaria Cry34Ab/35Ab y un gen que se puede expresar en planta que codifica una proteína Cry6Aa, y semilla de dicha planta.

Otra modalidad de la invención comprende una planta de maíz en donde el gen que se puede expresar en plantas que codifica una toxina binaria Cry34Ab/35Ab y un gen que se puede expresar en planta que codifica una proteína Cry6Aa se ha introgresado en dicha planta de maíz, y semilla de dicha planta.

Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión de receptor competitivos utilizando proteína toxina núcleo Cry35Ab radiomarcada muestran que la proteína toxina núcleo Cry6Aa no compite por la unión en las muestras de tejido de insecto CRW a las que se une Cry35Ab. Véase Figura 2. Los resultados indican que la combinación de Cry6Aa y Cry34Ab/35Ab es un medio efectivo para mitigar el desarrollo de resistencia en la poblaciones de CRW a cualquier sistema de proteína solo.

Por ende, en parte en base a los datos descritos anteriormente y en otras partes en la presente, las proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa pueden utilizarse para producir combinaciones IRM para la prevención o mitigación del desarrollo de resistencia por CRW. Por ejemplo, otras proteínas pueden agregarse a esta combinación para expandir el espectro de control de insectos. El presente par/combinación también puede utilizarse en algunas "pilas triples" o "pirámides" preferidas en combinación con incluso otra proteína para controlar los gusanos de raíz, como Cry3Ba y/o Cry3Aa. Incluso otra opción es ARNi contra gusanos de raíz. Véase, por ejemplo, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, n.° 1 1 (Nov. 2007) p. 1322-1326. Por lo tanto la presente combinación proporciona múltiples formas de acción contra un gusano de raíz.

A la luz de la descripción de USSN 61/327,240 (presentada el 23 de abril de 2010) relativa a las combinaciones de las proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry3Aa, USSN 61/476,005 (presentada el 15 de abril de 201 1) relativa a combinaciones de las proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry3Ba, y USSN 61/477,447 (presentada el 20 de abril de 201 1 ) relativa a combinaciones de Cry3Aa y Cry6Aa, algunas "pilas triples" preferidas de la presente invención incluyen una proteína Cry6Aa combinada con proteínas Cry34Ab/35Ab y Cry3Aa y/o Cry3Ba. Las plantas transgénicas, con inclusión de maíz, que comprende un gen cry6Aa, genes cry34Ab/35Ab y un gen cry3Aa y/o Cry3Ba se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Por lo tanto, dichas modalidades se dirigen al insecto con al menos tres modos de acción. Asimismo, en función de estos datos y explicaciones, uno podría sustituir Cry3Ba o Cry3Aa en lugar de Cy6Aa ejemplificada en la presente con el par de combinación base con Cry34A/35A.

Las opciones de despliegue de la presente invención incluyen el uso de proteínas Cry6Aa y Cry34Ab/35Ab en regiones de cultivo del maíz donde Diabrotica spp. son problemáticas. Otra opción de despliegue sería utilizar una o ambas proteínas Cry6Aa y Cry34Ab/35Ab en combinación con otras características.

Una persona experta en la técnica apreciará que las toxinas de Bt, incluso dentro de una cierta clase, como Cry6Aa y Cry34Ab/35Ab pueden variar en cierta medida.

Genes y toxinas El término "aislado" se refiere a un polinucleótido en una construcción no natural, o a una proteína en un estado purificado o por lo menos no natural. Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no sólo las secuencias de longitud completa descritas pero también fragmentos de las secuencias, variantes, mutantes, y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas específicamente las ejemplificadas en la presente. Como se utiliza en la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de genes hacen referencia a secuencias de nucleótido que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Como se utiliza en la presente, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas blanco que las toxinas reivindicadas. Lo mismo se aplica a Cry3's si se utiliza en pilas triples de acuerdo con la presente invención. Los dominios/subdominios de estas proteínas pueden intercambiarse para formar proteínas quiméricas. Véase, por ejemplo,. Patente de los Estados Unidos N.° 7,309,785 y 7,524,810 en relación con las proteínas Cry34/35. La patente 785 también explica proteínas Cry35 truncadas. Las toxinas truncadas también se ejemplifican en la presente.

Como se utiliza en la presente, los límites representan aproximadamente 95% (Cry6Aa's y Cry34Ab's y Cry35Ab's), 78% (Cry6A's y Cry34A's y Cry35A's), y 45% (Cry6's y Cry 34's y Cry 35's) de identidad de secuencia, según "Revisión of the Nomenciature for the Bacillus thunngiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Lo mismo se aplica a Cry3's si se utiliza en pilas triples, por ejemplo, de acuerdo con la presente invención.

Debe ser evidente para una persona experta en la técnica que los genes que codifican las toxinas activas pueden identificarse y obtenerse a través de varios medios. Los genes específicos o porciones de genes ejemplificados en la presente pueden obtenerse de aislados depositados en un depósito de cultivos. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, pueden también construirse sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden fácilmente construirse utilizando técnicas estándar para hacer mutaciones de punto.

Asimismo, fragmentos de estos genes pueden elaborarse utilizando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el comercio de acuerdo con los procedimientos estándar. Por ejemplo, las enzimas como Bal31 o mutagénesis dirigida a sitio pueden utilizarse para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también pueden obtenerse utilizando una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas pueden utilizarse para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteína.

Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la presente invención. Asimismo, debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes pueden codificar las secuencias de aminoácido descritas en la presente. Una persona capacitada en la técnica bien puede crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas o esencialmente las mismas toxinas. Las secuencias de ADN variante están dentro del alcance de la presente invención. Como se utiliza en la presente, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen inserciones, adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos que afectan en forma relevante la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican las proteínas que retienen actividad pesticida también se incluyen en esta definición.

Otro método para identificar los genes que codifican las porciones de gen y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención es a través del uso de sondas de oligonucleótido. Estas sondas son secuencias de nucleótido detectables. Estas secuencias puede detectarse mediante un rótulo adecuado o pueden hacerse inherentemente fluorescentes como se describe en la Solicitud Internacional N.° WO93/16094. Como bien se sabe en la técnica, si la molécula de sonada y muestra de ácido nucleico se hibridan mediante la formación de un enlace fuerte entres dos moléculas, puede asumirse de manera razonable que la sonda y la muestra tienen una homología sustancial. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo en condiciones rigurosas mediante técnicas muy conocidas en el área, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., p. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sal y combinaciones de temperatura son las siguientes (en orden de mayor rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 65° C. Detección de sonda proporciona un medio para determinar en un a manera conocida si ha ocurrido hibridación. Dicho análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes que codifican toxina de la presente invención. Los segmentos de nucleótido que se utilizan como sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias de nucleótido pueden también utilizarse como cebadores PCR para amplificar genes de la presente invención.

Toxinas variantes.

Ciertas toxinas de la presente invención se han específicamente ejemplificado en la presente. Dado que estas toxinas son simplemente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debe ser fácilmente evidente que la presente invención comprende variante o toxinas equivalentes (y secuencias de nucleótido que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida o similar de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácido con una toxina ejemplificada. La identidad de aminoácido generalmente será mayor a 75%, o preferentemente mayor a 85%, preferentemente mayor a 90%, preferentemente mayor a 95%, preferentemente mayor a 96%, preferentemente mayor a 97%, preferentemente mayor a 98%, o preferentemente mayor a 99% en algunas modalidades. La identidad de aminoácido generalmente será la mayor en las regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional que finalmente es responsable de la actividad biológica. En este aspecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones de aminoácido conservadoras que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden clasificarse en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos, y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido del mismo tipo se encuentran dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no afecte en forma relevante la actividad biológica del compuesto. El cuadro 1 proporciona una lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 1 En algunos casos, las sustituciones no conservadoras también pueden realizarse. El factor crítico es que estas sustituciones no deben detractarse en forma significativa de la actividad biológica de la toxina.

Huéspedes recombinantes.

Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes de vegetales o microbianos. La expresión de los genes de toxina da por resultado, en forma directa e indirecta, en la producción intracelular y mantenimiento de pesticida. La transferencia conjugal y transferencia recombinante pueden utilizarse para crear una cepa de Bt que expresa ambas toxinas de la presente invención. Otros organismos huésped también pueden transformarse con uno o ambos de los genes de toxina y luego utilizarse para alcanzar el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse en el sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. En forma alternativa, el microbio que habita en el gen de toxina puede tratarse en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, luego puede aplicarse al ambiente de las plaga blanco. Las células vegetales no-regenerables/no-totipotentes de una planta de la presente invención (que comprende por lo menos uno de los presentes genes IRM) están incluidas en la presente invención.

Transformación de planta.

Una modalidad preferida de la presente invención es la transformación de las plantas con genes que codifican la proteína insecticida objeto o sus variantes. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por una plaga blanco de insectos por medio de la presencia de cantidades de control de la proteína insecticida objeto o sus variantes en las células de la planta transformada. Mediante la incorporación de material genético que codifica las propiedades insecticidas de las toxinas insecticidas de B.t. en un genoma de una planta comida por una plaga de insectos particular, el adulto o la larva morirían luego de consumir la planta alimento. Varios miembros de las clasificaciones de monocotiledóneas o dicotiledóneas se han transformado. Los cultivos agronómicos transgénicos así como las frutas y vegetales son de interés comercial. Dichos cultivos incluyen, a título ilustrativo, maíz, arroz, soja, cañóla, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, maníes, tomates, papas, y similares. Existen varias técnicas para introducir material genético foráneo en células vegetales, y para obtener plantas que de manera estable mantengan y expresen el gen introducido. Dichas técnicas incluyen la aceleración de material genético recubierto en micropartículas directamente en las células (Patente de los Estados Unidos N.° 4945050 y Patente de los Estados Unidos N.° 5141 131 ). Las plantas pueden transformarse utilizando tecnología Agrobacterium, véase Patente de los Estados Unidos N.° 5177010, Patente de los Estados Unidos N.° 5104310, Solicitud de Patente Europea N.° 0131624B1 , Solicitud de Patente Europea N.° 120516, Solicitud de Patente Europea N.° 159418B1 , Solicitud de Patente Europea N.° 1761 12, Patente de los Estados Unidos N.° 5149645, Patente de los Estados Unidos N.° 5469976, Patente de los Estados Unidos N.° 5464763, Patente de los Estados Unidos N.° 4940838, Patente de los Estados Unidos N.° 4693976, Solicitud de Patente Europea N.° 116718, Solicitud de Patente Europea N.° 290799, Solicitud de Patente Europea N.° 320500, Solicitud de Patente Europea N.° 604662, Solicitud de Patente Europea N.° 627752, Solicitud de Patente Europea N.° 0267159, Solicitud de Patente Europea N.° 0292435, Patente de los Estados Unidos N.° 5231019, Patente de los Estados Unidos N.° 5463174, Patente de los Estados Unidos N.° 4762785, Patente de los Estados Unidos N.° 5004863, y Patente de los Estados Unidos N.° 5159135. Otra tecnología de transformación incluye tecnología WHISKERS™, véase Patente de los Estados Unidos N.° 5302523 y Patente de los Estados Unidos N.° 5464765. La tecnología de electroporación también se ha utilizado para transformar plantas, véase WO 87/06614, Patente de los Estados Unidos N.° 5472869, Patente de los Estados Unidos N.° 5384253, WO 9209696, y WO 9321335. Todas estas publicaciones y patentes de transformación se incorporan a la presente a modo de referencia. Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes foráneos también puede variar. Dicho tejido incluiría pero no se limitaría a tejido embriogénico, tejido calloso tipo I y II, hipocótilo, meristema y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden transformarse durante la desdiferenciación utilizando técnicas adecuadas dentro de la experiencia en la técnica.

Los genes que codifican cualquiera de las toxinas objeto pueden insertarse en las células vegetales utilizando una variedad de técnicas que son muy conocidas en la técnica como se describió anteriormente. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un marcador que permite la selección de las células microbianas transformadas y un sistema de replicación funcional en Escheríchia coli están disponibles para la preparación y modificación de genes foráneos para la inserción en plantas superiores. Dichas manipulaciones pueden incluir, por ejemplo, la inserción de mutaciones, truncamientos, adiciones, o sustituciones como se desee para el uso propuesto. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la proteína Cry o variantes pueden insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para a transformación de células de E. coli, las células de los cuales se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se extraen y se lisan de manera que cantidades que se puedan trabajar del plásmido se recuperen. El análisis de secuencia, análisis de fragmento de restricción, electroforesis, y otros métodos biológicos bioquímico-moleculares son generalmente llevados a cabo como métodos de análisis. Luego de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede escindirse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de ADN manipulada puede clonarse en el mismo u otros plásmidos.

El uso de vectores que contienen T-ADN para la transformación de células vegetales se ha investigado de manera intensiva y se ha descrito bastante en EP 120516; Lee y Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), y An et al. (1985), y está bien establecido en el campo.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable a lo largo de las posteriores generaciones. El vector utilizado para transformar la célula vegetal normalmente contiene un marcador seleccionable que codifica una proteína que confiere a las células de vegetales transformadas resistencia a un herbicida o un antibiótico, como bialaphos, kanamicina, G418, bleomicina, o higromicina, ínter alia. El gen marcador seleccionable empleado de manera individual debería permitir, por consiguiente, la selección de células transformadas mientras que el crecimiento de células que no contienen el ADN insertado se suprime mediante el compuesto selectivo.

Un gran número de técnicas se encuentran disponibles para insertar ADN en una célula vegetal huésped. Dichas técnicas incluyen la transformación con T-ADN proporcionado mediante Agrobacteríum tumefaciens o Agrobacteríum rhizogenes como el agente de transformación. Asimismo, la fusión de protoplástos de plantas con liposomas que contienen el ADN a administrarse, inyección directa de ADN, transformación biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como otros métodos posibles, pueden emplearse.

En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas se transformarán con genes en donde el uso de codón de la proteína que codifica la región se ha optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5380831 , que se incorpora a la presente a modo de referencia. Además, en forma ventajosa, se utilizarán las platas que codifican una toxina truncada. La toxina truncada generalmente codificará aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Los métodos para crear genes B.t sintético para el uso en plantas son conocidos en la técnica (Stewart, 2007).

A pesar de la técnica de transformación, el gen preferentemente se incorpora en un vector de transferencia de gen adaptado para expresar los genes de toxina insecticida de B.t y variantes en la célula vegetal mediante la inclusión en el vector de un promotor vegetal. Además de los promotores vegetales, los promotores de una variedad de fuentes pueden utilizarse en forma eficiente en células vegetales para expresar genes foráneos. Por ejemplo, uno puede utilizar promotores de origen bacterial, como el promotor octopina sintasa, el promotor nopalina sintasa, y el promotor manopina sintasa. En algunas modalidades preferidas pueden usar promotores que no sean de Bacillus-thuringiensis. Los promotores de origen de virus vegetal pueden utilizarse, por ejemplo los promotores 35S y 19S del Virus Mosaico del Coliflor, un promotor del Virus Mosaico de las Nervaduras de la Mandioca, y similares. Los promotores de plantas incluyen, a título ilustrativo, ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RUBP) subunidad pequeña de carboxilasa (ssu), promotor beta-conglicinina, promotor faseolin, promotor ADH (alcohol dehidrogenasa), promotores de shock de calor, promotor ADF (factor de despolimerización de actina), promotor de ubiquitina, promotor de actina, y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de secuencia potenciadores que pueden mejorar la eficiencia de transcripción. Los potenciadores típicos incluyen, a título ilustrativo, ADH1-intrón 1 y ADH1-intrón 6. Pueden utilizarse promotores constitutivos. Los promotores constitutivos dirigen la expresión de gen continua en casi todos los tipos de células y en casi todos los momentos (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejido son responsables de la expresión de genes en células específicas o tipos de tejidos, como hojas o semillas (por ejemplo, promotores de zeina, oleosina, napina, ACP (Proteína Portadora de Acilo)), y estos promotores también pueden utilizarse. También pueden utilizarse promotores que sean activos durante cierta etapa del desarrollo de las plantas así como activos en órganos y tejidos vegetales específicos. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, a título ilustrativo, promotores que no sean específicos de la raíz, específicos del polen, específicos del embrión, específicos de las barbas del algodón, específicos de la fibra del algodón, específicos del endoesperma de la semilla, específicos de floema, y similares.

En ciertas circunstancias puede ser conveniente utilizar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, como: estímulo físico (por ejemplo, genes de shock de calor); liviano (por ejemplo, RUBP carboxilasa); hormona (por ejemplo, glucocorticoide); antibiótico (por ejemplo, tetraciclina); metabolitos; y estrés (por ejemplo, sequía). Otros elementos de traducción y transcripción convenientes que funcionan en plantas pueden utilizarse, como secuencias líderes no traducidas 5', secuencias de terminación de transcripción de ARN y secuencias señal de adición de poli-adenilato. Diversos vectores de transferencia de genes específicos de plantas son conocidos en la técnica.

Los cultivos transgénicos que contienen características de resistencia a insectos (IR, por sus siglas en inglés) prevalecen en las plantas de maíz y algodón a lo largo de los Estados Unidos, y el uso de estas características se expande de manera global. Los cultivos transgénicos comerciales que combinan características de IR y tolerancia a herbicida (HT, por sus siglas en inglés) han sido desarrollados por varias empresas cerealeras. Estos incluyen combinaciones de características IR conferidas por las proteínas insecticidas de B.t. y características de HT, como la tolerancia a inhibidores de Acetolactato Sintasa (ALS), como sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina, sulfonanilidas, y similares, inhibidores de Glutamina Sintetasa (GS), como bialaphos, glufosinato, y similares, inhibidores de 4-HidroxiFenilPiruvato Dioxigenasa (HPPD), como mesotriona, isoxaflutol, y similares, inhibidores de 5-EnolPiruvilShikimato-3-Fosfato Sintasa (EPSPS), como glifosato y similares, e inhibidores de Acetil-Coenzima A Carboxilasa (ACCase), como haloxifop, quizalofop, diclofop, y similares. Otros ejemplos son conocidos en los que las proteínas proporcionadas transgénicamente proporcionan tolerancia de la planta a clases químicas de herbicida, como gerbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de piridiloxiacetatos auxina (véase WO 2007/053482 A2), o herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de ariloxifenoxipropionatos (véase WO 2005107437 A2, A3). La capacidad de controlar diversos problemas de plagas a través de las características de IR es un concepto del producto comercial valioso, y la conveniencia de este concepto de producto aumenta su las características de control de insecto y características de control de malezas se combinan en la misma planta. Además, puede obtenerse valor mejorado a través de combinaciones de plantas solar de características de IR proporcionadas por la proteína insecticida de B.t, como la de la presente invención, con una o más características HT adicionales, como aquellas mencionadas anteriormente, más uno o más características agregadas adicionales (por ejemplo, otra resistencia a insectos conferida por B.t. -derivadas de otras proteínas insecticidas, resistencia a insectos conferida por mecanismos, como ARNi y similares, resistencia de nematodo, resistencia a enfermedad, tolerancia a estrés, utilización de nitrógeno mejorada, y similares), o característica de resultados (por ejemplo, alto contenido de aceite, composición de aceite saludable, mejora nutricional, y similares). Dichas combinaciones pueden obtenerse ya sea a través del mejoramiento convencional (pila de mejoramiento) o en forma conjunta como un suceso de transformación novedoso que implica la introducción simultánea de múltiples genes (pila molecular). Los beneficios incluyen la capacidad de manejar plagas de insectos y control mejorado de malezas en una planta de cultivo que proporciona beneficios secundarios para el productor y/o consumidor. Por lo tanto, la presente invención puede utilizarse en combinación con otras características para proporcionar un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar en una forma flexible y efectiva en términos de costos una diversidad de cuestiones agronómicas.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden forma células de germen que transmite la o las características transformadas a las plantas de progenie.

Dichas plantas pueden cultivarse de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas se transformarán con genes en donde el uso de codón se ha optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5,380,831.

Además, los métodos para crear genes de Bt sintéticos para el uso en plantas son conocidos en la técnica (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitante de planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen que se puede expresar en una planta que codifica una proteína Cry6Aa, y además comprende un segundo grupos de genes que se pueden expresar en plantas que codifican proteínas Cry34Ab/35Ab.

La transferencia (o introgresión) de la o las características determinadas por Cry6Aa y Cry34Ab/35Ab en líneas de maíz endogámicas pueden lograse mediante el mejoramiento de selección recurrente, por ejemplo, retrocruzamiento. En este caso, un padre recurrente deseado primero se cruza con un donante endogámico (el padre no recurrente) que porta el gen o genes adecuado para las características determinadas por Cry. La progenie de este cruzamiento luego se retrocruzan con el padre recurrente luego de la selección en la progenie resultante para la o las características deseadas a transferirse del padre no recurrente. Luego de tres, preferentemente cuatro, más preferentemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con el padre recurrente con la selección de la o las características deseadas, la progenie será heterocigota para el locus que controla la o las características a transferirse, pero será como el padre recurrente para la mayoría o casi todos los otros genes (véase, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4ta Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).

Estrategias de Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) Roush et al., por ejemplo, describe dos estrategias de toxina, también llamadas "pirámides" o "pilas," para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

En su sitio web, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos [United States Environmental Protection Agency] (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proporcionar refugios no transgénicos (es decir, no-B.t.) (un bloque de cultivos no Bt / maíz) para el uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína Bt activa contra pestes blanco.

"Los requisitos estructurados específicos para los productos de maíz de Bt (CryIAb o CryI F) protegidos del barrenador del maíz son los siguientes: Refugios estructurados: 20% refugio de maíz de Bt no-Lepidoptera Bt en la zona productora de maíz; 50% refugio de Bt no-Lepidoptera Bt en la zona productora de maíz; Bloques Interno (es decir, dentro del campo de Bt) Externo (es decir, campos separados dentro ½ milla (1 km) (1/4 milla si es posible) del campo de Bt para maximizar el cruzamiento aleatorio Fajas dentro del campo Las fajas debe tener al menos 4 hileras de ancho (preferentemente 6 hileras) para reducir los efectos del movimiento de larvas" Además, las Asociación del Cultivadores de Maíz nacional, en su sitio web: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) también proporciona lineamientos similares en relación con los requisitos del refugio. Por ejemplo: "Requisitos del IRM al Barrenador del Maíz: - Plantar al menos 20% de sus hectáreas de maíz para refugiar híbridos -En regiones productoras de algodón, el refugio debe ser al menos 50%.

-Debe plantarse dentro de ½ milla (1 km) de los híbridos de refugio.

-El refugio puede plantarse como fajas dentro del campo de Bt, las fajas de refugio deben tener al menos 4 hileras de ancho.

-El refugio puede tratarse con pesticidas convencionales solo si se alcanzan los umbrales económicos para el insecto blanco.

- Insecticidas que se pueden rociar basados en Bt no pueden utilizarse en el maíz de refugio.

-El refugio adecuado debe plantarse en cada granja con maíz de Bt".

Como lo estableció Roush et al. (en las páginas 1780 y 1784 columna derecha, por ejemplo), las pilas o pirámides de dos proteínas diferentes cada una efectiva contra las plagas blanco y con poca o ninguna resistencia cruzada puede permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para una estructura exitosa, un tamaño de refugio de menos de refugio de 10%, puede proporcionar manejo de resistencia comparable a aproximadamente 50% de refugio para una sola característica (no piramidal). Para los productos de maíz Bt en forma de pirámide actualmente disponibles, la Agencia de Protección Ambiental requiere que se plante significativamente menos (generalmente 5%) de refugio estructurado de maíz no Bt que para productos de una sola característica (generalmente 20%).

Hay diversas maneras de proporcionar efectos de IRM de un refugio, con inclusión de varios patrones de plantación geométricos en los campos (como se mencionó anteriormente) y mezclas de semillas en sacos, como lo explica en mayor detalle Roush et al. (supra), y Patente de los Estados Unidos N.° 6,551 ,962.

Los porcentajes anteriores, o relaciones de refugio similares, pueden utilizarse para las presente pirámides o pilas dobles o triples.

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisorias, y publicaciones mencionadas o citadas en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad en la medida en que no sean incongruentes con las enseñanzas explícitas de la presente memoria descriptiva.

Los siguientes son ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de solvente son por volumen salvo que se indique de otro modo. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

Salvo que se implique o indique específicamente, los términos "un", "una", "el/la" significan "al menos uno/a" en la presente.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de plásmidos de expresión que codifican toxinas de longitud completa de Crv34Ab1. Crv35Ab1 v Crv6Aa1 Se utilizaron métodos de clonación estándar en la construcción de plásmidos de expresión Pseudomonas fluorescens {Pf) diseñados para producir proteínas de longitud completa Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry6Aa1 , respectivamente. Se utilizaron las endonucleasas de restricción de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) para la digestión del ADN y se utilizó Ligasa de T4 ADN de Invitrogen para la ligación del ADN. Las preparaciones de plásmidos se realizaron mediante el Plasmid Mini kit (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se purificaron fragmentos de ADN mediante el cartucho Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA) luego de la electroforesis en gel de agarosa Tris-acetato. La estrategia de clonación básica implicó la subclonación de las secuencias codificadoras (CDS) de las proteínas Cry de longitud completa en pMYC1803 para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en pDOW1169 para Cry6Aa1 en los sitios de restricción Spel y Xhol (o Salí que es compatible con Xhol) respectivamente, por los cuales se colocaron bajo el control de expresión del promotor de Ptac y el terminador de rrnBT1T2 o rrnBT2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl), respectivamente. pMYC1803 es un plásmido de número de copia medio con el origen de replicación RSF1010, un gen resistente a la tetraciclina, y un sitio de unión a ribosomas en forma precedente a los sitios de reconocimiento de enzimas en los cuales pueden introducirse fragmentos de ADN que contienen regiones codificadoras de proteínas (Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080193974).

Los plásmidos de expresión para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 se transformaron mediante electroporación en una cepa P. fluorescens MB214, se recuperó en medio de hidrolisato SOC-Soy, y se colocó en placas en medio de caldo lisogénico (LB) con 20 pg/ml de tetraciclina. El vector de expresión pDOW1 169 es similar a pMYC1803 pero pDOW1169 porta el gen pyrF que codifica al uracilo, el cual se utiliza como marcador para identificar transformantes cuando se utiliza una cepa auxotrófica de uracilo P. fluorescens (como DPf10) para la transformación en una placa de medio mínimo M9 que no contenía uracilo (Schneider et al. 2005). Los detalles acerca de las manipulaciones microbiológicas se encuentran disponibles en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20060008877, Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080193974, y Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 20080058262, que se incluyen en la presente a modo de referencia. Las colonias se revisaron en forma adicional mediante la digestión de restricción del ADN del plásmido miniprep. El ADN del plásmido de los clones seleccionados que contienen injertos se secuenció mediante el contrato con un vendedor de secuenciamiento comercial como eurofins MWG Operon (Huntsville, AL). Los datos de secuencias se recopilaron y analizaron con el software Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).

EJEMPLO 2 Crecimiento y expresión Los análisis del crecimiento y la expresión en la producción en matraces de agitación de toxinas de Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry6Aa1 para la caracterización con la inclusión de unión al receptor de Bt y bioensayo de insectos se obtuvieron mediante cepas P. fluorescens cultivadas en matraces de agitación que albergan constructos de expresión (por ejemplo, clon pMYC2593 para Cry34Ab1 , pMYC3122 para Cry35Ab1 , y pDAB102018 para Cry6Aa1). El cultivo de semillas para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 cultivado en medio P. fluorescens durante la noche, que se suplemento con 20 pg/ml de tetraciclina se utilizó para inocular 200 mL del mismo medio con 20 Mg/ml de tetraciclina. Sin embargo, el cultivo de semillas para Cry6Aa1 se cultivó en caldo mínimo M9 durante la noche y se utiliza para inocular 200 mL del medio P. fluorescens sin antibiótico. Las expresiones de las toxinas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry6Aa1 mediante el promotor Rae se incluyeron mediante la adición de isopropil- -D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) luego de una incubación inicial de 24 horas a 28-30°C con una agitación a 300 rpm. Se tomaron muestras de los cultivos en el momento de la inducción y en varios momentos luego de la inducción. La densidad de las células se midió mediante la densidad óptica a 600 nm (OD6oo)- EJEMPLO 3 Fraccionamiento de células v análisis SDS-PAGE de las muestras de los matraces de agitación En cada momento en que se tomó una muestra, se ajustó la densidad celular a OD6oo = 20 y alícuotas de 1-mL se centrifugan a 14,000 x g durante cinco minutos. Las pellas celulares se congelaron a -80°C. Se generaron fracciones solubles y no solubles de las muestras de pellas celulares mediante la utilización de EasyLyse™ Solución de Extracción de Proteína Bacterial (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Cada pella celular se resuspendió en 1 mL de solución EasyLyse™ y se diluyó en forma adicional 1 :4 en regulador de pH de lisis y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lisato se centrifugó a 14,000 rpm durante 20 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante como la fracción soluble. La pella (la fracción no soluble) luego se resuspendió en un volumen igual de solución salina de regulador de pH de fosfato (PBS; 1 1.9 mM Na2HP04, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH7.4). Las muestras se mezclaron a 3:1 con 4X Laemmli de regulador de pH de muestra con ß-mercaptoetanol y se hirvieron durante 5 minutos en forma previa a la carga sobre NuPAGE Novex 4-20% Bis-Tris gels (Invitrogen, Carlsbad, CA). La electroforesis se realizó en el regulador de pH NuPAGE MOPS recomendado. Los geles se colorearon con el SirnplyBlue™ Safe Stain de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen) y se visualizaron mediante el sistema de imágenes Typhoon (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).

EJEMPLO 4 Preparación del cuerpo de inclusión Las preparaciones del cuerpo de inclusión de la proteína Cry (IB) se realizaron de las fermentaciones de P. fluorescens que produjeron la proteína insecticida de B.t. no soluble, tal como lo demostró SDS-PAGE y MALDI-MS (Desorción/Ionización Asistida por Láser de Matriz/Espectrometría de Masa). Las pellas celulares P. fluorescens creadas de las 48 horas posteriores a la inducción se descongelaron en un baño de agua de 37°C. Las células se resuspendieron a 25% p/v en regulador de pH de lisis (50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCI, 20 mM EDTA de sal de disodio (Ácido Etilendiaminetetraacético), 1% Tritón X-100, y 5 mM Ditiotreitol (DTT); se agregaron 5 mL/L de cóctel inhibidor de la proteasa bacteriana (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) justo antes de la utilización sólo para Cry34Ab1 y Cry35Ab1. Las células se resuspendieron mediante un homogeneizador en la configuración más baja (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Se añadieron veinticinco mg de lisozima (Sigma L7651 , de huevo blanco de gallina) a la suspensión celular mediante la mezcla con una espátula metálica, y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió sobre hielo durante 15 minutos, luego se sometió a sonicación mediante un Branson Sonifier 250 (sesiones de dos 1- minuto, a 50% del ciclo de trabajo, 30% de producción). La lisis celular se controló mediante microscopía. Se añadieron 25 mg adicionales de lisozima de ser necesario, y se repitieron la incubación y la sonicación. Cuando se confirmó la lisis celular mediante microscopía, el lisato se centrifugó a 11 ,500 x g durante 25 minutos (4°C) para formar la pella del IB, y se descartó el sobrenadante. La pella del IB se resuspendió con 100 mL de regulador de pH de lisis, se homogeneizó con la batidora de mano y se centrifugó tal como se realizó con anterioridad. La pella del IB se lavó en forma repetida mediante la resuspensión (en 50 mL de regulador de pH de lisis), homogenización, sonicación, y centrifugación hasta que el sobrenadante se volvió incoloro y la pella del IB se volvió firme y de color blancuzco. Para el lavado final, la pella del IB se resuspendió en agua destilada estéril filtrada (0.22 pm) con 2 mM EDTA, y se centrifugó. La pella final se resuspendió en agua destilada estéril filtrada con 2 mM EDTA, y se almacenó en 1 mL de alícuotas a -80°C.

EJEMPLO 5 Análisis SDS-PAGE y cuantificación El análisis SDS-PAGE y la cuantificación de la proteína en las preparaciones de IB se realizaron mediante el descongelamiento de 1 mL de alícuota de la pella del IB y la disolución de 1:20 con agua destilada estéril filtrada. La muestra diluida luego se hirvió con 4X de regulador de pH de muestra reductor [250 mM Tris, pH6.8, 40% glicerol (v/v), 0.4% Azul de Bromofenol (p/v), 8% SDS (p/v) y 8% ß-Mercapto-etanol (v/v)] y se cargó sobre una Novex® 4-20% Tris-Glicina, 12+2 pocilio gel (Invitrogen) procesado con 1X Tris/Glicina/regulador de pH SDS (Invitrogen). El gel se procesó durante aproximadamente 60 min a 200 voltios, luego se coloreó y se descoloreó mediante el seguimiento de los procedimientos SirnplyBlue™ Safe Stain (Invitrogen). La cuantificación de las bandas blanco se realizó mediante la comparación de los valores densitométricos para las bandas con las muestras de Albúmina de Suero Bovino (BSA) procesadas en el mismo gel para producir una curva estándar mediante la utilización del software Bio-Rad Quantity One.

EJEMPLO 6 Solubilización de los cuerpos de inclusión Se centrifugaron diez mL de suspensiones de cuerpos de inclusión de clones P. fluorescens R1253, MR1636 yDPf 13032 (con 50-70 mg/mL de proteínas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry6Aa1 respectivamente) en la configuración más alta de una centrifugadora Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14,000 x g) para granular las inclusiones. El sobrenadante del regulador de pH de almacenamiento se extrajo y se reemplazó con 25 mL de regulador de pH de acetato de sodio 100 mM, pH 3.0, para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 , y regulador de pH 50 mM CAPS [ácido 3-(ciclohexamino)1-propanesulfónico], pH10.5, para Cry6Aa1 , en un tubo cónico de 50 mL respectivamente. Las inclusiones se resuspendieron mediante una pipeta y se agitaron para mezclar minuciosamente. Los tubos se colocaron en una plataforma que se mecía suavemente a 4°C durante la noche para extraer las proteínas Cry34Ab1 , Cry35Ab1 y Cry6Aa1 de longitud completa. Los extractos se centrifugaron a 30,000 x g durante 30 min a 4°C, y se almacenaron los sobrenadantes resultantes que contenían las proteínas Cry solubilizadas de longitud completa.

EJEMPLO 7 Truncamiento de la protoxina de longitud completa La Cry35Ab1 de longitud completa se truncó o digirió con quimotripsina para obtener su núcleo de quimotripsina que es una forma activa de la proteína Cry. Específicamente, la Cry35Ab1 solubilizada de longitud completa se incubó con quimotripsina (páncreas bovino) (Sigma, St. MO) a (50:1 = proteína Cry: enzima, p/p) en 100 mM regulador de pH de acetato de sodio, pH3.0, a 4°C con agitación suave durante 2-3 días. La activación o truncamiento completo se confirmó mediante el análisis SDS-PAGE. La masa molecular de la Cry35Ab1 de longitud completa fue «44 kDa, y el núcleo de quimotripsina fue «40 kDa, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la longitud completa y del núcleo de quimotripsina se proveen como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Ni el núcleo de quimotripsina ni el de tripsina están disponibles para Cry34Ab1 , y también CryAal Es significativamente más activo para atacar gusanos de la raíz de insectos que el núcleo de quimotripsina o tripsina. Por lo tanto, la Cy34Ab1 y Cry6Aa de longitud completa se utilizaron para los ensayos de unión. La secuencias de aminoácidos de Cy34Ab1 y Cry6Aa de longitud completa se provee como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

EJEMPLO 8 Purificación de las toxinas Crv La Cry35Ab1 quimotripsinisada y Cry6Aa1 de longitud completa se purificaron utilizando un sistema de cromatografía de intercambio de iones. Específicamente, la reacción de digestión de Cry35Ab1 se centrifugó a 30,000 x g durante 30 min a 4°C y luego se continuo con el pasa a través de un filtro de 0.22 µ?t? para eliminar lípidos y todas las otras partículas, y la solución resultante se concentró 5 veces utilizando un dispositivo de centrifugación de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 (10,000 Límite de Peso Molecular; Millipore). Los reguladores de pH de muestra luego se cambiaron a 20 mM de regulador de pH de acetato de sodio, pH 3.5, para Cry34Ab1 y Cry35Ab1 utilizando columnas PD-10 desechables (GE Healthcare, Piscataway, NJ) o diálisis. Luego se purificaron más utilizando ATKA Explorer (Amersham Biosciences). Para Cry35Ab1 , el regulador de pH A fue 20 mM de regulador de pH de acetato de sodio, pH 3.5, y el regulador de pH B fue regulador de pH A + 1 M NaCI, pH 3.5, mientras que pasa Cry6Aa1 el regulador de pH A fue 50mM CAPS, pH 10.5 y el regulador de pH B fue 50 mM CAPS, pH 10.5, 1 M NaCI. Se utilizó una columna HiTrap SP (5 mi) (GE) para Cry35Ab1 truncada. Luego de que la columna se equilibró completamente utilizando el regulador de pH A, la solución Cry35Ab1 se inyectó en la columna a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La elución se llevó a cabo utilizando el gradiente 0-100% del regulador de pH B a 5 ml/min con 1 ml/fracción.

Para Cry6Aa1 de longitud completa, se utilizó una columna Capto Q, 5 mi (5 mi) (GE) y todos los otros procedimientos fueron similares a los aplicados para Cry35Ab1. Luego del análisis SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas para selección más fracciones que contienen la proteína blanco de mejor calidad, se agruparon dichas fracciones. El regulador de pH se cambió para el núcleo de quimotripsina de Cry35Ab1 purificada con 20 mM Bist-Tris, pH 6.0, como se describió anteriormente. Para Cry6Aa1 purificada, la sal se eliminó a través de diálisis contra 10mM CAPS, pH 10.5. Las muestras se retiraron a 4°C para un posterior ensayo de unión luego de cuantificarse utilizando análisis SDS-PAGE y sistema de imagen Typhoon (GE) con BSA como un estándar. Cry34Ab1 ya era puro luego de solubilizarse en el regulador de pH ácido según lo determinado por el análisis SDS-PAGE, y por lo tanto sin más purificación.

EJEMPLO 9 Preparaciones de BBMV Las preparaciones de vesículas de membrana en borde de cepillo (BBMV) de intestino medio de insecto se han utilizado ampliamente para los ensayos de unión del receptor de la toxina Cry. Las preparaciones de BBMV utilizadas en la presente invención se prepararon de intestinos medios aislados de insectos de tercer estadio de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) mediante el método descrito por Wolferberger et al. (1987). Se utilizó leucina aminopeptidasa como un marcador de las proteínas de la membrana en la preparación, y las actividades de aminopeptidasa de leucina del homogenato crudo y la preparación de BBMV se determinaron tal como se describió en forma previa. (Li et al. 2004a). La concentración de proteínas de la preparación de BBMV se midió mediante el método Bradford (1976).

EJEMPLO 10 Marcado 125l Cry34Ab1 de longitud completa purificada, Cry35Ab1 quimotripsinisada y la Cry6Aa1 de longitud completa se marcaron mediante 125l para los ensayos de unión de saturación y competitividad. A fin de garantizar que el radio-marcado no anule la actividad biológica de las toxinas de Cry, se llevó a cabo la yodación fría mediante Nal y de acuerdo a las instrucciones de Pierce® lodination Beads (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, Rockford IL). Los resultados del bioensayo indicaron que tanto el núcleo de Cry35Ab1 como la Cry6Aa1 de longitud completa permanecieron activos contra la larva de la raíz del maíz del oeste, pero la yodinación inactivo Cry34Ab1. Como se esperaba, 125l-Cry34Ab1 no se unió específicamente a BBMV de insecto, y por lo tanto Cry34Ab1 requiere otro método de marcado para evaluar la unión del receptor de membrana. 25l-Cry35Ab1 y 25l-Cry6Aa1 se obtuvieron con Pierce® lodination Beads (Pierce) y Na125l. Zeba™ Desalt Spin Columns (Pierce) se utilizaron para extraer el Na125l no incorporado o libre, de la proteína yodada. Las radioactividades específicas de las proteínas Cry yodadas fueron desde 1 - 5 uCi/ug. Se realizaron múltiples lotes de ensayos de marcado y de unión.

EJEMPLO 11 Ensayos de unión de saturación Los ensayos de unión de saturación se realizaron mediante la utilización de toxinas Cry marcadas 125l tal como se describió en forma previa (Li et al. 2004b). A fin de determinar la unión específica y estimar la afinidad de unión (constante de disociación, Kd) y la concentración del sitio de unión (la cantidad máxima de toxina unida específicamente a una cantidad determinada de BBMV, Bmax) de Cry35Ab1 y Cry6Aa1 a la BB V del insecto, se incubaron una serie de concentraciones crecientes de 125l-Cry35Ab1 o 125l-Cry35Ab1 con una concentración determinada (0.1 mg/ml) de la BBMV del insecto respectivamente, en 150 ul de 20 mM Bis-Tris, pH 6.0, 150 mM KCI, complementado con 0.1% BSA a temperatura ambiente durante 60 min con una agitación suave. La toxina unida a BBMV se separó de las toxinas libres en la suspensión por medio de la centrifugación a 20,000 x g a temperatura ambiente durante 8 min. La pella se lavó dos veces con 900 ul del mismo regulador de pH helado con 0.1% BSA. La radio-actividad restante en la pella se midió con un contador COBRAII Auto-Gamma (Packard, una empresa de Canberra) y consideró la unión total.

Otra serie de reacciones de unión se estableció de lado a lado, y un exceso de 500 - 1,000 veces de la toxina sin marcar correspondiente se incluyó en cada una de las reacciones de unión para ocupar totalmente todos los sitios de unión específicos en la BBMV, que se utilizó para determinar la unión no específica. La unión específica se estimó mediante la sustracción de la unión no específica de la unión total. Los valores Kd y Bmax de estas toxinas se estimaron mediante la utilización del número de moléculas de la toxina (pmol) específicamente unido a la proteína de BBMV por microgramo contra las concentraciones de la toxina marcada utilizada mediante la operación de GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). Las gráficas se realizaron con los programas Microsoft Excel o GraphPad Prism. Los experimentos se reprodujeron al menos tres veces. Estos experimentos de unión demostraron que tanto 125l-Cry35Ab1 como 125l-Cry6Aa1 fueron capaces de unirse en forma específica a la BBMV (Figuras 1A y 1 B). 125l-Cry35Ab1 y 125l-Cry6Aa1 tuvieron una afinidad de unión de Kd=11.66 ±11.35, 7.99 ± 4.89 (nM), respectivamente y una concentración del sitio de unión de Bmax=5.19 ± 3.02 pmol/mg, 2.71 ± 0.90 (pmol,/mg BBMV), respectivamente.

EJEMPLO 12 Ensayos de unión de competitividad Se realizaron ensayos de unión de competitividad adicionales para determinar si Cry35Ab1 y la Cry6Aa1 comparten el mismo grupo de receptores. Para los ensayos de unión de competitividad homólogos de Cry35Ab1 , primero se mezclaron cantidades crecientes (0 - 5,000 nM) de Cry35Ab1 sin marcar con Cry35Ab1 marcado con 5 nM, y luego se incubaron con una concentración determinada (0.1 mg/ml) de BBMV a temperatura ambiente durante 60 min, respectivamente. Los porcentajes de 125l-Cry35Ab1 unida con BBMV se determinaron para cada una de las reacciones en comparación con la unión específica inicial en ausencia de un competidor sin marcar. Se realizaron ensayos de unión de competitividad heterólogos entre 125l-Cry35Ab1 y Cry6Aa1 sin marcar para identificar si comparten el mismo grupo de receptor(es). Esto se obtuvo mediante el aumento de Cry6Aa1 sin marcar como un competidor introducido en las reacciones para competir por el/los receptor/es putativo/s en la BBMV con la Cry35Ab1 marcada. El experimento se reprodujo al menos tres veces.

Los resultados del experimento demostraron que Cry35Ab1 fue capaz de desplazarse aproximadamente un 50% cuando la concentración molar aumentó a aproximadamente 100 nM (un exceso de 20 veces en comparación con 5 nM 125l-Cry35Ab1). El 50% restante se consideró como unión no específica que no fue capaz de desplazarse en base al resultado de unión de saturación descrito en otro sitio y la definición de unión no específica, y por lo tanto, la unión no específica se sustrajo y no se mostró aquí. Esto sugiere que la unión específica fue desplazado completamente por Cry35Ab1 sin marcar con un exceso de 20 veces (Figura 2). Sin embargo, Cry6Aa1 no fue capaz de desplazar a 125l-Cry35Ab1. Estos datos indican que Cry35Ab1 no comparte un receptor con Cry6Aa1. Si Cry34Ab1 y Cry6Aa1 comparten o no un receptor están pendiente de prueba utilizando Cry34Ab1 para competir por la unión con Cry6Aa radiomarcada o Cry6Aa1 no marcada para competir por la unión con Cry34Ab1 marcada con otro método de marcado.

Referencias Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254.

Li, H., Oppert, B., Higgins, R.A., Huang, F., Zhu, K.Y., Buschman, L.L., 2004a. Comparative analysis of proteinase activities of Bacillus thuringiensis-resistant and -susceptible Ostrínia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 34, 753-762.

Li, H., Oppert, B., González-Cabrera, J., Ferré, J., Higgins, R.A., Buschman, L.L. y Zhu, K.Y. and Huang, F. 2004b. Binding analysis of CryIAb and CryIAc with membrane vesicles from Bacillus thuringiensis-res stan\ and -susceptible Ostrínia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 52-57.

Schneider, J.C. Jenings AF, Mun DM, McGovern PM, Chew LC. 2005. Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation. Biotechnology Progress 21 , 343-348.

Wolfersberger, M.G., Luthy, P., Maurer, A., Parenti, P., Sacchi, F., Giordana, B., Hanozet, G.M., 1987. Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the cabbage butterfly (Pieris brassicae). Comp. Biochem. Physiol. 86A, 301-308.

Patente de los Estados Unidos N.° 20080193974. 2008. SECUENCIAS LÍDERES BACTERIALES PARA MAYOR EXPRESIÓN. (BACTERIAL LEADER SEQUENCES FOR INCREASED EXPRESSION) Patente de los Estados Unidos N.° 20060008877, 2006. Sistemas de expresión con secreción de sistema sec. (Expression systems with sec-system secretion).

Patente de los Estados Unidos N.° 20080058262, 2008. Optimización rPA (rPA optimization).

Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una planta transgénica que produce una proteína Cry34, una proteína Cry35, y una proteína insecticida Cry6A.

2.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta también produce una cuarta proteína insecticida seleccionada del grupo que consta de Cry3B, y Cry3A.

3.- La semilla de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha semilla comprende dicho ADN.

4. - Un campo de plantas que comprende una pluralidad de plantas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

5. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho campo también comprende plantas de refugio no Bt, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos de 40% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

6. - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 30% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

7. - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

8. - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

9. - El campo de plantas de conformidad con las reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 5% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

10. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho campo carece de plantas de refugio.

11. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están en bloques o en fajas.

12. - Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 3, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos de 40% de todas las semillas en la mezcla.

13. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 30% de todas las semillas en la mezcla.

14. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 20% de todas las semillas en la mezcla.

15. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 10% de todas las semillas en la mezcla.

16.- La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 5% de todas las semillas en la mezcla.

17.- Un contenedor o saco de semillas que comprende una pluralidad de semillas de la reivindicación 3, dicho contenedor o saco tiene cero semillas de refugio.

18. - Un método de manejo de desarrollo de la resistencia a una proteína Cry por un insecto, dicho método comprende plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5 ó 10.

19. - El campo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-11 , caracterizado además porque dichas plantas ocupan más de 10 acres (4.04 hectáreas).

20. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.

21. - Una célula vegetal de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha proteína Cry35 es al menos 95% idéntica con una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, dicha proteína insecticida Cry6A es al menos 95% idéntica con SEQ ID NO:4, y dicha proteína Cry34 es al menos 95% idéntica con SEQ ID NO:3.

22. - La planta de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 1-2, caracterizada además porque dicha proteína Cry35 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, dicha proteína insecticida Cry6A comprende SEQ ID NO:4, y dicha proteína Cry34 comprende SEQ ID NO:3.

23.- Un método de producción de la célula vegetal de la reivindicación 21.

24. Un método de controlar el insecto de gusano de la raíz al poner en contacto dicho insecto con una proteína Cry34, una proteína Cry35, y una proteína insecticida Cry6A.

25.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34A, dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35A, y dicha proteína Cry6A es una proteína Cry6Aa.

26. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34Aa y dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35Aa.

27. - La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha proteína Cry3A es una proteína Cry3Aa y dicha proteína Cry3B es una proteína Cry3Ba.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34A, dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35A, y dicha proteína Cry6A es una proteína Cry6Aa.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha proteína Cry34 es una proteína Cry34Aa y dicha proteína Cry35 es una proteína Cry35Aa.