MX2011001990A

MX2011001990A - Composiciones mejoradas de celulas y metodos para preparar las mismas.

Info

Publication number: MX2011001990A
Application number: MX2011001990A
Authority: MX
Inventors: Andy Zeitlin; Gregory Russotti; Shuyang He; Ajai Pal; Hong J Chen; Thomas Brieva; Ryan Shorr; Brian Murphy
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Priority date: 2008-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2011-03-29
Also published as: KR20170023194A; ZA201101210B; EP3539380A3; US20190261623A1; IL252119B; IL211272A0; CA2734236A1; IL252119A0; IL267138B2; RU2018121514A; MX339624B; AU2009283216B2; EP3172963B1; KR20240052847A; DK2330889T3; CN102186338A; KR20230080502A; KR20180049231A; US10104880B2; AU2013203191B2

Abstract

Se proporciona aquí métodos mejorados para la formulación de composiciones que comprenden células madre placentarias, y composiciones y formulaciones celulares mejoradas producidas mediante los mismos.

Description

COMPOSICIONES MEJORADAS DE CÉLULAS Y MÉTODOS PARA PREPARAR LAS MISMAS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN Aquí se proporcionan composiciones mejoradas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden células, por ejemplo, células madre y células placentarias , tales como células placentarias multipotentes humanas, por ejemplo, las células placentarias multipotentes descritas en la sección 5.3, o célula aisladas de perfusado de placenta, por ejemplo, células nucleadas totales aisladas de perfusado de placenta, y métodos mejorados para preparar las composiciones 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las composiciones celulares, por ejemplo, composiciones de células madre, se han vuelto una terapia atractiva para un número de deficiencias fisiológicas, por ejemplo, reemplazo de medula ósea. Existe una necesidad en cuanto a formulaciones mejoradas de células, por ejemplo, células madre que, se deben administrar a los individuos en necesidad de tales composiciones . 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Aqui se proporcionan métodos mejorados para preparar composiciones que comprenden células, por ejemplo, células placentarias aisladas, tales como células madre placentareias, células placentarias multipotentes, células placentarias que pueden ser expandidas y que tienen el potencial de diferenciarse en al menos dos tipos diferentes de células, por ejemplo, tipos de células osteogenicas y condrogénicas , o células aisladas de perfusado de placenta, por ejemplo, células nucleadas totales aisladas de perfusado de placenta, y las composiciones que comprenden tales células, por ejemplo, que son adecuadas para la administración a un individuo. Los métodos mejoradps usan pasos específicos y composiciones especificas para el tratamiento de pre-crioconservación, y la descongelación de las células. En ciertas modalidades, los métodos mejorados reducen o eliminan la aglomeración de las células criopreservadas , posteriormente a la descongelación. En las modalidades preferidas, las composiciones mejoradas comprenden células placentarias multipotentes.

En una modalidad, aquí se proporciona un método para preparar composiciones, el cual comprende: (a) poner en contacto las células con una solución que comprenden dextrano y albúmina de suero humano (HSA) para formar una solución que contiene las células; (b) filtrar la solución que contiene las células para formar una solución filtrada que contiene las células; (c) opcionalmente, diluir la solución filtrada que contiene las células a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro con una primera solución de dilución que comprende dextrano; y (d) opcionalmente, diluir la solución filtrada que contiene las células con una segunda solución de dilución que comprende dextrano. En algunas modalidades, el paso (c) se lleva a cabo cuando la solución filtrada que comprende las células en (b) comprende más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro, en donde dicho paso de dilución (c) es a aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En modalidades particulares, el paso (c) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (b) comprede más de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro, en donde dicho paso de dilución (c) es a aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En algunas modalidades, el paso (c) se lleva a cabo cuando la solución filtrada que contiene las células en (b) comprende más de aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (c) es aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro. En una modalidad específica, la solución que comprende dextrano del paso (d) no comprende albúmina de suero humano. En una modalidad específica, las células de la composición filtrada que contiene las células se criopresrvan antes del paso (d) . En ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10+3xl06 células por mililitro enseguida del paso (a), la filtración es opcional. En ciertas modalidades, si el número de células es menor que 7.5xl06 células por mililitro enseguida del paso (a), la filtración es opcional.

En algunas modalidades, dicho dextrano en dicha primera solución o en dicha segunda solución de dilución es dextrano al 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75% 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10%. En algunas modalidades, dicho dextrano en dicha primera solución de o dicha segunda solución de dilución es aproximadamente dextrano al 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%. El dextrano en la primera solución o la segunda solución de dilución puede ser dextrano de cualquier peso molecular, por ejemplo, dextrano que tenga un peso molecular desde aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 1450 kDa, aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 125 kDa, aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa, apropx 1 kDa a aproximadamente 75 kDa, aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 50 kDa. 0 aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 25 kDa. En algunas modalidades, el dextrano en la primera solución de dilución o la segunda solución de dilución tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 60 kDa a aproximadamente 80 kDa. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicxha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 1. En otra modalidad especifica, dicho dxtrano en dicha primera solución de dilución y dicha segunda solución de dilución ex dextrano 1. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 70. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución y dicho dextrano en dicha segunda solución de dilución es dextrano 70. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución y dicha solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución y dicha segunda solución de dilución es dextrano al 2.5% a 10%. En algunas modalidades, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución o dicha segunda dilución es dextrano 40 a aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10%. En algunas modalidades, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 40 a aproximadamente 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es dextrano 40 al 5.0%. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es dextrano 40 al 5.5%. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solución de dilución es dextrano 40 al 10%.

En otras modalidades, dicha primera y/o segunda soluciones de dilución pueden comprender un polisacárido además de o que no es, es decir, en lugar de, dextrano. Por ejemplo, en algunas modalidades, dichas primera y/o segunda soluciones de dilución comprenden maltodextrano (por ejemplo, maltodextrina a aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10%), trehalosa (por ejemplo, trehalosa a aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10%) o hetaalmidon (por ejemplo, hetaalmidon a aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%,. 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10%) . En otras modalidades, dicha primera y/o segunda soluciones de dilución comprnden sacarosa (por ejemplo, sacarosa a aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10%), heparina (por ejemplo, 55 unidades USP de heparina/mL) , o glicógeno (por ejemplo, glicógeno a aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.294, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10%) . En una modalidad particular, dicha primetra y/o segunda soluciones de dilución comprenden maltodextrano además de o que no es, es decir, en lugar de, dextrano. En otra modalidad particular, dicha primera y/o segunda soluciones de dilución comprenden trehalosa además de o que no es, es decir, en lugar de, dextrano. En otra modalidad particular, dichas primera y/o segunda soluciones de dilución comprenden hetaalmidon además de o que no es, es decir, en lugar del dextrano.

En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es HSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o 17%. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es HSA a aproximadamente 4 a 10%. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es HSA a aproximadamente 3-125%. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es HSA a aproximadamente 5%. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que ncomprende HSA es HSA a aproximadamente 10%. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es HSA a aproximadamente 16.875%. En otra modalidad especifiva, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es HSA a aproximadamente 1 a 17%. En otra modalidad especiofica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es HSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o 17%. En otra modalidad especificam, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es HSA a aproximadamente 4 a 10%. En otra modalidad especifica dicha HSA en dicha solución de dilución es HSA a aproximadamente 3.125%. En otra modalidad especificva, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es HSA a aproximadamente 5%. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es HSA a aproximadamente 10%. En otra modalidad específica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es HSA a aproximadamente 16.875%.

En otras modalidades, 1 albúmina de suero de bovino (BSA) , por ejemplo, BSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) . O suero de bovino fetal (FBS) (por ejemplo FBS a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) se pueden usar además o en lugar de, es decir, en lugar de la HSA en dicha solución. En algunas modalidades, la proporción de HSA a dextrano, por ejemplo dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solución está entre aproximadamente 6:1 de HSA: dextrano a aproximadamente 1:2.6 de HSA: dextrano . En algunas modalidades, la proporción de HSA a dextrano es de aproximadamente 6:1, 5.5:1, 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2.0:1, 1.5:1, 1:1, 1:1.5, 1:2 o 1:2.6 de HS : dextrano . En algunas modalidades, la relación de HSA a dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solución es aproximadamente 3.13% de HSA/8.25% de dextrano. En algunas modalidades, la relación de HSA a dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solución es aproximadamente 16.88% de HSA/2.75% de dextrano. En modalidades particulares, la relación de HSA a dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70 en la primera solución es de aproximadamente 10% de HSA/5.5% de3 dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70.

En otra modalidad especifica, dicha solución en el paso (a) o la solución que contiene lase células comprende un crioprotector . En una modalidad más especiufica, dicho crioprotector es dimetilsulfóxido (DMSO) . En una modalidad particular, la solución mencionada en el paso (a) comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2.5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2.5% a aproximdamente 10%, aproximadamente 5% a aproximdamente 15%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, o aproximadamente 10% a aproximadamente 15% de DMSO. En una modalidad particular, la solución mencionada en el paso (a) comprende aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de DMSO. En una modalidad particular, la solución mencionada en el paso (a) comprende aproximadamente 5% de DMSO. En otra modalidad especifica, dicha primera solución de dilución comprende además un crioprotector . En una modalidad más especifica, dicho crioprotector es dimetilsulfóxido (DMSO) . En una modalidad particvular, dicha primera slucion comprende además aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2.5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2.5% a aproximadamente 10%, aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o aproximadamente 10% a aproximadamente 15% de DMSO. En una modalidad particular, dicha solución de dilución comprende además aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de DMSO. En una modalidad particular dicha primera solución de dilución comprende además aproximadamente 5% de DMSO.

En una modalidad especifica, dicha pruimera solución de dilución comprende aproximadamente 5.5% de dextrano 40, aproximadamente 10% de HSA, y aproximadamente 5% de DMSO.

En una modalidad particular, dicho método produce una composición que comprende células y aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70. En otra modalidad particular, dicho método produce una composición que comprende células T aproximadamente 7.5% se aproximadamente 9% de dexhtrano, por ejemplo, dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho método produce una composición que comprende aproximadamente 1.5 x 106 células por mililitro a aproximadamente 3.75 x 106 células por mililitro. En otra modalidad especificva, dicho método produce una composición que comprende aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro a aproximadamente 5.0 ± 1.5 x 106 células por mililitro. En otraas modalidades especificas, el método produce una composición que comprende entre aproximadamente 1.0 x 106 células por mililitro y 1.5 x 106 células por mililitro, por ejemplo, entre aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro y 15 x 106 células por mililitro, por ejplo, entre aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro y aproximadamente 15 x 106 célula sport mililitro. En otra modalidad especofoca, dicho método produce una composición que comprende desde aproximadamente 1% de HSA a aproximadamente 15% de HSA. En otra modalidad especifica, diucho método produce una composición que comprende dede aproximadamente 1% de HSA a aproximadamente 10% de HSA.

Aquí se prtoporciona además un método para preparar una composición, que comprende: (a) filtrar una pluralidad de células en una solución que comprende 5.5% de dextrano 40 y 10'% de HSA a través de un filtro de 70 µ?-150 µ? para formar una solución filtrada que contiene las células; (b) opcionalmente diluir la solución filtrada que contiene las células, con dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x ??6, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro; (c) crioconservar las células; (d) descongelar las células; y (de) diluir la solución filtrada que contiene las células con dextrano 40 al 10% para producir dicha composición. En algunas modalidades, el paso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es a aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, si la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende menos que aproximadamente 15 x 106 células por mililitro, la filtración es opcional. En algunas modalidades, el paso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es a aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En ciertas modalidades, si la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende menores que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En algunas modalidades, el paso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más que aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es a aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro. En ciertas modalidades, si la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende menos que aproximadamente .5xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En algunas modalidades, el paso (e) comprende diluir la solución filtrada que contiene las células 1:1 a 1:5 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En algunas modalidades, el paso (e) comprende diluir la solución filtrada que contiene las células 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En una modalidad más específica, la solución que contiene las células del paso (a) comprende adicionalmente un crioprotector , por ejemplo, DMSO, por ejemplo, aproximadamente 2% a aproximadamente 15% de DMSO. En una modalidad particular, al solución mencionada en el paso (a) comprende adicionalmente aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de DMSO. En una modalidad particular, la solución mencionada en el paso (a) comprende adicionalmente aproximadamente 5% de DMSO. En una modalidad preferida, el filtro en el paso (a) es un filtro de 70 µ? a 100 µ?.

En otra modalidad, aquí se proporciona un método para preparar una composición que comprende: (a) someter a centrifugación una pluralidad de células para recolectar las células; (b) volver a suspender las células en dextrano 40 al 5.5%; (c) someter a centrifugación las células para recolectar las células; (d) volver se suspender las células en una solución de dextrano 40 al 5.5% que comprende 10% de HSA para producir una solución que contiene las células; (e) filtrar la solución que contiene las células a través de un filtro de 40 µ? a 150 µ? para producir una solución filtrada que contiene las células; (f) opcionalmente dluir la solución filtrada que contiene las células en dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10%, y crioiprotector , por ejemplo DMSO, por ejemplo DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 50xl06, 1 a 40xl06, 1 a 30x10s, 1 a 20xl06, 1 a 15xl06, o l a lOxlO6 células por mililitro; (g) crioconservar las células;: (h) descongelar las células; e (i) diluir las solución que ciontoiene las células 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10% para producir dicha composición. En algunas modalidades, el paso (f) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (e) comprende más que aproximadamente 15xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (f) es a aproximadamente 15x10 células por mililitro. En modalidades particulares, el paso (f) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (e) comprende más que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (f) es a aproximadamente 10±3xl06 . células por mililitro. En algunas modalidades, el paso (e) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (e) comprende más que aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (f) es a aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro. En ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro enseguida del paso (d) , la filtración es opcional. En ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro enseguida del paso (d) , la filtración es opcional. En una modalidad particular, si la resuspensión mencionada en el paso (d) resultara en una solución que contiene las células, que comprende menos que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la solución mencionada en el paso (d) comprende un crioprotector , por ejemplo DMSO, por ejemplo, aproximadamente 2% a aproximadamente 15% de DMSO, no se realiza en paso (f) . En una modalidad preferida, el filtro en el paso (e) es un filtro de 70µ? a 100 µ?.

También se proporciona aquí un método para preparar una composición, que comprende: (a) filtrar una solución que comprende células placentarias aisladas, 5.5% de dextrano 40 y 10% de albúmina de suero de humano (HSA) con un filtro que elimina los agregados visibles de células para producir una solución que contiene las células placentarias aisladas con una cantidad de una solución que contiene 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA y 5% de dimetilsulfoxido (DMSO) suficiente para llevar dicha solución filtrada que contiene las células placentarias aisladas, a aproximadamente 1 a 50xl06, 1 a 40xl06, 1 a 30xl06, 1 a 20xl06p 1 a 15xl06, o l a lOxlO6 células por mililitro; y (c) diluir dicha solución filtrada que contiene las células placentarias aisladas con dextrano 40 al 10%, para produciré dicha composición. En algunas modalidades, el paos (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más quer aproximadamente 15 x 106 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (c) es a aproximadamente 15xl06 células por mililitro. En modalidades particulares, el paso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En algunas modalidades, el paso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más que aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es a aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro. En algunas modalidades, el paso (c) comprende diluir dicha solución filtrada que contiene las células placentarias aisladas con 10% de dextrano 40 a una relación de aproximadamente 1:1 a aproximadamente - 1:11 de solución que contiene las células placentarias aisladas : dextrano 40 (v/v) . en algunas modalidades, el paso (c) comprende diluir dicha solución filtrada que contiene las células placentarias aisladas con 10% de dextrano 40 a una proporción de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:5 de solución que contiene las células placentarias aisñladas : dextrano 40 (y/v) . en ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En ciertas modalidades, si el número de células enseguda derl paso (a) es menos que aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En una modalidad especifica dicho filtro es un filto de 70 µ?. En ortra modalidad especifica, dicho filtro es un filtro de 100 µ?. En otra modalidad específica, el filtro en el paso (a) es un filtro de 70 µ? a 100 µ .

En una modalidad específica de cualquiera de los métodos anteriores, la composición es una composición farmacéutica.

En otra modalidad específica de cualquiera de los métodos anteriores, el método comprende además concentrar la composición de células resultante a aproximadamente 5xl06 células por mililitro a lxlO6 células por mililitro. Tal composición es útil, por ejemplo, para adfministracion subcutánea de la composición a un individuo en necesidad de la misma.

En otro aspecto, aquí se proporcionan composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden células, por ejemplo, células madre, célula placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias o células placentarias multipotentes . En ciertas modalidades, las composiciones se preparan mediante cualquiera de los métodos descritos aquí. En una modalidad, aquí se proporciona una composición, por ejemplo, una solución, que comprende una pluralidad de células, por ejemplo, células madre, células placentarias aislada, por ejemplo, células madre placentarias o células placentarias multipotentes, en donde dicha composición comprende entre aproximadamente 1.0±3xl06 células por mililitro a aproximadamente 5.0±1.5xl06 células por mililitro, y en donde dicha composición no comprende agregados visibles de células (es decir, no comprende agregados grandes de células), o substancialmente sin tales agregados visibles. En ciertas otras modalidades, la composición comprende entre aproximadamente l.OxlO6 células por mililitro y 15xl06 células por mililitro, por ejemplo, entre aproximadamente 76.5xl06 células por mililitro y aproximadamente 15xl06 células por mililitro. En ciertas otras modalidades, la composición comprende menos de aproximadamente 20xl06 células por mililitro .

En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70. En una modalidad específica, dicha composición comprende aproximadamente 7.5% a aproximadamente 9% de dextrano 40. En una modalidad específica, dicha composición comprende aproximadamente 5.5% de dextrano.

En otras modalidades, dicha composición comprende un polisacárido además de o que no es, es decir, en lugar de dextrano. En ciertas modalidades, el polisacárido es un polímero de glucosa que no comprende sub-unidades de sacárido no glucósidos. En otras modalidades, dicha composición comprende maltodextrina (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de maltodextrina), trehalosa (por ejemplo, a aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de trehalosa) . 0 hetaalmidon (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de hetaalmidon) . En otras modalidades, dicha composición comprende sacarosa (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75% o 10% de sacarosa), heparina (por ejemplo, 55USP/ml de heparina) , o glicógeno (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de glicógeno) . En una modalidad particular, dicha composición comprende maltodextrano, además de o que no es, es decir, en lugar de, dextrano. En otra modalidad particular, dicha composición comprende trehalosa además de o que no es, dextrano. En otra modalidad particular, dicha composición comprende hetaalmidon además de, o que no es dextrano .

En otra modalidad especifica, dicha composición comprende aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, o aproximadamente 17% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 3.125% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 5% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 10% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 16.875% de HSA.

En otras modalidades, dicha composición comprende albúmina de suero de bovino (BSA) (por ejemplo, aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de BSA ) o suero de bovino fetal ( FBS ) (por ejemplo, aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de FBS ) además de o en lugar de HSA .

En algunas modalidades, dicha composición comprende un crioprotector, por ejemplo, DMSO , por ejemplo, aproximadamente 1% a aproximadamente 15% de DMSO. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 5% de DMSO. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o aproximadamente 10% a aproximadamente 15% de DMSO. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de DMSO. En una modalidad particular, la composición comprende aproximadamente 5% de DMSO.

En una modalidad específica, dichas células han sido crioconservadas y descongeladas. En otra modalidad especifica, dichas células han sido filtradas a través de un filtro de 70 µ? a 100 µ?. En otra modalidad específica, dicha composición no comprende agregados visibles de células. En otra modalidad, específica, dicha composición comprende menos que aproximadamente 200 agregados de células por 106 células, en donde dichos agregados de células son visibles solo bajo un microscopio, por ejemplo, un microscopio óptico. En otra modalidad especificvas , dicha composición comprende menos que aproximadamente 150 agregados células por 106 células, en donde dichos agregados celulares son visiobles solo bajo un microscopio, por ejemplo, un microscopio óptico. En otra modalidad especifica, dicha composición comprende menos que aproximadamente 100 agregados celulares por 106 células, en donde duchos agregados celulares son visibles solo bajo un microscopio, por ejemplo, un microscopio óptico.

En una modalidad especifica de cualquiera de los métodos o las composiciones descritos aqui, las células son células madre, por ejemplo, células madre aisladas de una placenta humana de postparto que ha sido drenada de sangre. En ciertas modalidades, tales células han sido expandidas. En otra modalidad especifica de cualquiera de las modalidades anteriores, las células son células adherentes, es decir, células que se adhieren a la superficie de cultivo de tejidos, por ejemplo, plástico de cultivo de tejidos (ya sea no revestido o revestido por ejemplo con, fibronectina , laminina, o las similares) . Los ejemplos de células adherentes incluyen por ejemplo, células madre placentarias aderentes, como se describe aqui, células madre mesenquimales derivadas de medula ósea, fibrioblastos , o las similares. En otra modalidad, las células son células humanas.

En otra modalidad, dichas células son células obtenidas de (por ejemplo, aisladas de) perfusado de placenta. En una modalidad más especifica, dichas células son células nucleadas, por ejemplo, células nucleadas totales, obtenidas de perfusado de placenta. En ciertas modalidades, las placentas de las cuales las células madre placentarias se obtienen por perfusión, se drenan de sangre y se someten a perfusión para extraer la sangre residual antes de la perfusión para recolectar las células placentarias nucleadas totales. Enciertas otras modalidades, las placentas de las cuales se obtienen las células madre placentarias, nucleadas totales por perfusión, se drenan de sangre pero no se someten a perfusión para extraer la sangre residual antes de la perfusión para recolectar las células placentarias, nucleadas totales. En ciertas otras modalidades, las placentas de las cuales se obtienen por perfusión las células placentarias nucleadas totales no se drenan de la sangre ni se someten a perfusión para extraer la sangre residual antes de la perfusión para recolectar las células placentarias nucleadas totales .

En otra modalidad especifica del método, dichas células son células madre. En modalidades más especificas, las células madres son células madre adultas, células madre somáticas, células madre embrionarias, células embrionarias germinales, células madre del cordón umbilical. Células madre del fluido amniótico, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, célula madre mesenquimales derivadas de la sangre del cordón, células madre mesenquimales derivadas de la sangre periférica, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo o células madre mesenquimales derivadas del periostio. En otra modalidad, dichas células son células asesinas naturales.

En otra modalidad especifica, dichas células son células placentarias aisladas. En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son células . madre placentarias aisladas. En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas son células placentarias multipotentes aisladas.

En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son células madre placentarias aisladas. En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas son células placentarias multipotentes aisladas. En una modalidad especifica, las celuilas placentarias aisladas son CD34~, CD10+, y CD105+ cuando se detecta por citometria de flujo. En una modalidad más especifica, las células placentarias CD34+, CD10+, CD105+ aisladas son células madre placentarias. En otra modalidad, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+, son células placentarias multipotentes. En otra modalidad especifica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas tienen el potencial para diferenciarse en células de un fenotipo neural, células de un fenotipo osteogénico, o células de un fenotipo condrogénico . En una modalidad más especifica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD200+. En otra modalidad más específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45", como se detectaq por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45", como se detecta por citometría de flujo. En una modalidad más específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45", como se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ y CD45", como se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ , CD90+, CD45" son adicionalmente células CD80- y CD86", como se detecta por citometría de flujo.

En una modalidad más específica, las células CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente uno o más de CD29+, CD38", CD44+, CD54+ , CD80", CD86", SH3+ o SH4+ . En otra modalidad más específica, las células son adicionalmente CD44+. Enm una modalidad específica de cualquiera de las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas anteriores, las células son adicionalmente uno o más de CD117", CD133", KDR" ( VEGFR2 ) , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", y/o Ligando de Muerte programada 1 (PDL1) +.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+ ; CD200+ y 0CT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embriodes en una población de células placentarias que comprende dichas células placentarias cuando dicha población de cultiva bajo las condiciones que permitan la formación de cuerpos similares a embrioides; o 0CT-4+, y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una ploblacion de celuila splacentarias que comprende las células placentarias aisladas cuando dicha población se cultiva bajo las condiciones que permitan la formación de cuerpos similares a embrioides; o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad especifica, dichas células placentarias CD200+, HLA-G+ son CD34", CD38", CD45", CD73+, y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias CD73+, CD105+, CD200+ son CD34", CD38", CD45", y HLA-G+ . En otra modalidad especifica, dcihas células placentarias CD200+, 0CT-4+ son CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+, y HLA-G+. En otra modalidad especifica dichas células placentarias CD73+, CD105+, y HLA-G+ son CD34", CD45~, OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad espoecifica, dichas células placentarias CD73+ y CD105+ son 0CT-4+, CD34", CD38", y CD45". En otra modalidad especifica, dichas células placentarias son CD73+, CD105+, CD200+, CD34", y CD45~.

En ciertas modalidades, las células placentarias son uno o más de CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+ , CD45", CD54+, CD80", CD86", CD90+, CD117", CD133", CD200+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3", SSEA4", 0CT-4+ , MHC-I+ , KDR" (VEGFR2), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR, PDL1+, o ABC-p+, en donde ABC-p+ es una proteína de transporte de ABC especifica de la placenta (conocida también cono proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a la mitoxantrona (MXR) ) . En una modalidades wespecifica, las células placentarias aisladas son CD10+, cd20, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+ , SH3+, SH4+, SSEA3", SSEA4", y OCT-4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45", CD54+, SH2+ , SH3+, y SH4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45", CD54+, SH2+ , SH3+, SH4 +, y 0CT-4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, HLA-1+, SH2+, SH3+, SH4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son SH2+, SH3+, y OCT-4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4". En una modalidad específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4" son adicionalmente CD10+, CD29+, CD34", CD44+ , CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4 + . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son OCT-4+ y dd34, y ya sea SH3+ o SH4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD34" y ya sea CD10+ , CD29+, CD44 + , CD54+, CD90+, o 0CT-4+. En ciertas modalidades las células placentarias aisladas son CD10+, CD34", CD105+ y CD200+.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento descritos aquí son uno o más de CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54+/ICAM", CD62-E", CD62-L", CD62-P", CD80~, CD86", CD103", CD104", CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinainferior, CD184 /CXCR4", p2-microglobulinainferior , MHC-II~, HLA-Ginferior, y/o PDLlinferior . En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD29 y CD54 . En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas son al menos CD44+ y CD106+. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas son al menos CD29+.

En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente "*de células madre mesenquimales derivadas de medula ósea, en donde dichos uno o más genes son uno o más de ACTG2, ADARB1, A IG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4 , DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2 , F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRCSB, ICAM1, IER3, IGFBP7 , ILlA, IL6, IL18, KRT18 , KR 8 , LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1 , PCDH7 , PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5 , SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A, y en donde dichas células madre mesenquimales derivadas de médula ósea han experimentado un número de episodios en cultivo, equivalentes al nmumero de episodios que han experimentado dichas células placentarias aisladas. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas expresan dichos uno o más genes cuando se cultivan por aproximadamente 3 a aproximadamente 35 duplicaciones de la población en un medio que comprende 60% de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)-LG (preferiblemente de Gibco) y 40% de MCDB-201 (preferiblemente de Sigma) ; 2% de suero de becerro fetal (preferiblemente de Hyclone Labs.); lx se insulina-transferrina-selenio (ITS) ; IX de ácido linoleico, albúmina de suero de bobino (LA-BSA) ; dexametasona 10"9 M (preferiblemente de sigma; ácido ascórbico 2-fosfato 10~4 M (preferiblemente de Sigma; 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (preferiblemente de R&D Systems); y factor e4 crecimiento deroivado de las plaquetas (PDGF-BB= 10 ng/mL (preferiblemente de R&D Systems) . En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas expresan dichos uno o más genes cuando se cultivan por desde aproximadamente 3 a aproximadamente 35 duplicaciones de la población en un medio que comprende 60% de DMEM-LG (preferiblemente de Gibco) y 40% de MCDB-201 (prferiblemete de Sigma) ; 2% de suero fetal de becerro (preferiblemente de Hyclone Labs.); lx insulina-transferrina-selenio (ITS); lx ácido linoleico, albúmina de suero de bovino (La-BSA) ; dexametasona 10~9 M (preferiblemnte de Sigma) ; ácido ascórbico 2-fosfato 10~4 M (preferiblemente de Sigma) , 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (preferiblemente de R&D Systems) ; y 10 ng/mL de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-BB) (preferiblemente de R&D Systems) .

En otra modalidad especifica, dichas células madre placentarias expresan el factor neurotrófico derivado de la linea celular glial de los factores de crecimiento neurotroficos (GDNF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , factor de crecimiento placentario (PGF) y factor de crecimiento endotelial (VEGF) .

En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 50% de las células de la cual, son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 70% de las células de la cual son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 80% de las células de la cual son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 90% de las células de la cual, son dichas células placentarias aisladas. En ciertas otras modalidades, las células placentarias en dicha población están susbvatncialmente librs de células qure ' tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células placentarias en dicha población tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal. En ciertas otras modalidades, la población de células que comprende dichas células placentarias está sustacialmente libre de células que tienen un genotipo materno, por ejemplo, al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal.

Een ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son células placentarias CD34+, por ejemplo, células placentarias hematopoyéticas . Tales células se pueden obtenmer del tejido placentario, por ejemplo, de una placenta que ha sido drenada de la sangre del cordón y perfundida para extraer la sangre residual. En ciertas modalidades, las células placentarias CD34+ son CD38+. En ciertas modalidades, las células placentarias CD34+ son CD38". En ciertas otras modalidades, las células placentarias CD34+ son CD45+. En una modalidad especifica, las células placentarias son CD34+, CD38" y CD45+.

En cualquiera de las modalidades anteriores de las células placentarias aisladas, las células placentarias aisladas por lo general no se diferencian durante el cultivo el medio de crecimiento, es decir, el medio formulado para promover la proliferación, por ejemplo, durante la proliferación en el medio de crecimiento. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no requieren una capa alimentradora con el fin de proliferar. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no se diferencian en el cultivo como resultado del cultivo en ausencia de una capa de células alimentadoras .

En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se obtienen por perfusión de una placenta post parto que ha sido drenada de la sangre y perfundida para extraer la sangre residual; drenada de sangre pero no perfundida para extraer la sangre residual; o ni drenada de la sangre ni perfundida para extraer la sangre residual. En otra modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas se obtienen por la desintegración física y/o enzimatica del tejido placentarios .

En ciertas modalidades del método anterior, las células placentarias aisladas se filtan y se criopreservan como parte de la construcción de un banco de células placentarias. Por ejemplo, las células placentarias aisladas se aislan de una placenta, o del tejido placentario, y después del cultivo se vuelven a suspender en una solución que comprende, por ejemplo, dextrano, por ejemplo, dextrano 40, por ejemplo, 5.5% de dextrano 40. En modalidades más especificas, la solución comprende adicionalmente HSA y/o DMSO, en preparación para la crioconservación . Las células placentarias aisladas criopreservadas en el banco, se descongelan y se diluyen, según sea neceario, por ejemplo con una solución que comprende 10% de dextrano 40 como se describe aquí. En ciertas modalidades del método, el método de filtración y dilución descritos aquí no son parte del aislamiento inicial de las células placentarias aisladas.

En ciertas modalidades, dichas células placentarias aisladas se obtienen por perfusión de una placenta post parto que ha sido drenada de la sangre y perfundida para extraer la sangre residual. En otra modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas se obtienen por desintegración física y/o enzimática del tejido placentario. 4. BREVE DESCRPCION DE LAS FIGURAS La FIG. 1 presenta un diagrama ternario que representa el espacio de solución de la HSA, Dextrano 40 y DMSO y el diseño experimental para evaluar el efecto de la concentración variable de los componentes sobre la viabilidad y la proliferación de las células.

La FIG. 2 preséntalos datos del Ensayo de Retención del Filtro (FRA) para las formulaciones que comprenden diferentes porcentajes de DMSO. Los datos se expresan en píxeles por millón de células cargadas (px/m ) cuando se lee en un analizador de viabilidad de células Vi-Cell. Control del ensayo= solución de dextrano 40 al 100%, con teñido de células, sin células.

La FIG. 3 representa los datos de FRA para las formulaciones de células que comprenden diferentes fracciones en volumen de HSA. Los datos se expresan en pixeles por millón de células cargadas (px/mM) cuando se leen en un analizador de viabilidad de células Vi-Cell. Control del ensayo = solución de dextrano 40 al 100% con teñido de células, sin células.

La FIG. 4 presenta la viabilidad por azul de tripano después de la descongelación, para formulaciones de células que comprenden diferentes porcentajes de DMSO (0-20%) .

La FIG. 5 presenta la recuperación total de las células después de la descongelación como una función de las concentraciones variables de DMSO (0-20%) ., FIG. 6: Reestablecimiento del cultivo como una función de las formulaciones variantes que comprenden diferentes porcentajes de DMSO, cuando se evalúa por el ensayo de MTS (véase la Sección 6.3.1, a continuación) .

La FIG. 7 presenta la viabilidad de las células después de la descongelación de formulaciones de células que comprenden diferentes fracciones en volumen de HSA al 25%.

La FIG. 8 representa la recuperación total de las células después de la desocngelacion como una función de la fracción en volumen de HSA.

La FIG. 9 presenta los datos que evalúan el restablecimiento del cultivo como una función de las diferentes fracciones de HSA, generado a través del uso del Ensayo de Proliferación Celular No Radiactivo, Acuoso, Cell Titer 96® (Promega, Madison Wisconsin) .

FIG. 10: Niveles de inmunosupresion cuando se evalúan por el Ensayo de Reacción de Cuentas o Perlas para las formulacionmes que comprenden diferentes concentraciones de los componentes de la formulación.

FIG. 11: Agregación celular como una función de las densidades variables de células congeladas (1-40 x 105 células/mL) , cuando se determina por el ensayo Figura. Los datos se expresan en pixeles por millón de células cargadas (px/mM) cuando se leen en un analizador de viabilidad Vi-Cell.

FIG. 12. Agregación celular como una función de las densidades de congelación de las células (1-40 millones de células/mL) . Los datos se expresan en pixeles por millón de células cargadas (px/MM) cuando se leen en un analizador de viabiliad de células Vi-Cell.

FIG. 13: Agregación celular como una función de los pesos moleculares variantes de dextrano, cuando se determina por un ensayo FRA. Señal de FRA equivalente a través de dextrano 1,000, 40,000 y 70,000 (es decir, dextrano 1, dextrano 40 y dextrano 70 respectivamente) . Los datos se expresan ewn píxeles por millón de células cargadas (px/M ) . Control del ensayo = solución de dextrano 40 al 100%, con teñido de células, sin células.

La FIG. 14 presenta la viabilidad después de la descongenlación a través de formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 15 presenta la ecuperacion de lea células a través de las formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 16 presenta la expresión de CD105+/CD200+ a través de formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 17 presenta los datos de la reacción de las células a cuentas o perlas Y (BRT) a través de las formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 18 presenta la agregación celular medida por FRA a través de las formulaciones que comprenden diferentes polisacáridos . Control del ensayo = solución de dextrano 40 al 100%, con teñido de células, sin células.

La FIG. 19 presenta la viabilidad después de la descongelación de las células formuladas sin polisacáridos de dextrano 40. Los datos se expresan en pixeles por millón de células cargadas (px/MM) .

FIG. 20: recuperación de células viables como una función de las formulaciones que comprenden diferentes polisacáridos.

La FIG. 21 presenta la expresión de CD105+/CD200+ en las formulaciones de células que comprenden dextrano 40, o maltodextrano, sacarosa, trehalosa, heparina, hetaalmidon, o glicógeno en lugar de dextrano 40.

La FIG. 22 presenta los Datos BTR para el dextrano 40 y seis azuicares/polisacáridos no dextrano 40 diferentes.

La FIG. 23 presenta la agregación células medida por FRA a través de las formulaciones que comprenden 10% de albúmina de suero humano (HSA) , 10% de albúmina de suero de bovino (BSA) o 10% de suero fetal de bovino (FBS) . Control de ensayo = solución de dextrano 40 al 100%, con teñido de células, sin células .

FIG. 24 Viabilidad después de la descongelación celular a través de las formulaciones que comprenden 10% de HSA, 10% de BSA, o 10% de FBS.

La FIG. 25 presenta la recuperación después de la desongelacion a través de las formulaciones que comprenden 10% de HSA, 4% de HSA, 10% de BSA, o 10% de FBS.

La FIG. 26 presenta la identidad celular medida por la expresión de CD105+/CD200+ a través de las formulaciones que comprende 10% de HSA, 4% de HSA, 10% de BSA o 10% de FBS.

La FIG. 27 presenta la expresión de CD34"/CD10+ a través de formulaciones que comprenden 10% de HSA, 10% de BSA o 10% de FBS. 28. la FIG. 28 presenta la funcionalidad celular medida por el ensayo BTR a través de formulaciones que comprenden 10% de HSA, 4% de HSA, 10% de BSA o 10% de FBS.

La FIG. 29 presenta los resultados de agregación celular por FRA para las células madre mesenquimales derivadas de medula ósea (BMMSC) y células asesinas naturales (NK) . Los datos se expresan de pixeles por millón de células cargadas (px/MM) . 5.1. DEFINICIONES Como se usa aquí, el término "aproximadamente" significa, por ejemplo, dentro del 10% de una figura o valor establecido.

Como se usa caqui, "agregados macro de células" soignifica una agregación de células visible sin magnificación, por ejemplo, visible a simple ista, y se refiere en general a una agregación de células mayor que aproximadamente 150 mieras.

Como se usa aquí "agregado de células micro" significa una agregación de células visible solo con magnificación, y se refiere en general a una agregación de celumas menor que aproximadamente 150 mieras.

Como se usa aquí, el término "SH2" se refiere a un antiuerpo que se enlaza a un epitopo en el marcador CD105+. Por lo tanto, las células que se conocen como SH2+ son CD105+.

Como se usa aquí, los términos "SH3" y "SH4" se refieren a anticuerpos que se enlazan a epitopes presentes en el marcador CD73. Por lo tanto, las células que se conocen como SH3+ y/o SH4+ son CD73+.

Como se usa aquí, el término "células aisladas", por ejemplo, "células madre aisladas", significa un tipo de células qe se separa sustancialmente de otros tipos de células del tejido, por ejemplo, la placenta, de la cual se derivan las células, un tipo de células está "aislado" si al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o al menos 99% de las células con las cuales se asocian de manera natural las células, se separa de las células, por ejemplo durante la recolección y/o el cultivo de las células.

Como se usa aquí, "multipotente (s) " cuando se refiere a un tipo de células, significa que las células tienen la habilidad de diferenciarse en alguno, pero no necesariamente todos los tipos de células del cuerpo, o en células que retienen las características de algunos, pero no todos, los tipos de células del cuerpo. En ciertas modalidades, por ejemplo, un tipo de células multipotentes aisladas que tienen la capacidad de diferenciarse en cualquiera de las células que tienen características de células condrogénica y osteogénicas , es un tipo de células multipotentes .

Como se usa aquí, el término "población de células sialadas" significa una población de células que están separadas sustancialmente de otras células de un tejido, por ejemplo, la placenta, del cual se deriva la población de células .

Como se usa aquí, el término "células madre placentarias" se refiere a un tipo de células madre o células progenitoras que se deriva de una placenta de mamífero, independientemente de la morfología, los marcadores de la superficie celular, o el número de conversdiones después de un cultivo primario. Las células madre placentarias no se obtienen, y no se pueden obtener de la sangre, por ejemplo, sangre del cordón umbilical o sangre de la placenta. Los términos "células madre placentarias" y "células placentarias multipotentes" como se usan aquí, no se refieren sin embargo a, y las células madre placentarias y las células placentarias multipotentes no son, trofoblastos , angioblastos , hemangioblastos , células germinales embrionarias, células madre embrionarias, o células obtenidas de la masa celular interna de los blastocitos, células obtenidas de las estrías gonadales embrionarias, por ejemplo, las células germinales embrionarias. Las células se consideran "células madre" si las células muestran atributos de células madre, por ejemplo, un perfil de expresión marcadores o genes asociado con uno o más tipos de células madre; la habilidad para replicarse al menos 10-40 veces en cultivo, la habilidad para diferenciarse en células de uno o más de las tres capas germinales; la carencia de características de células adultas (es decir, diferenciadas) o las similares. Los términos "células madre placentarias" y "células madre derivadas de la placenta" se pueden usar de manera intercambiable. A menos que se indique de otra manera aqui, el término "placentario" incluye el cordón umbilical. Las células madre placentarias descritas aqui en ciertas modalidades, se diferencian in vitro (bajo las condiciones de diferenciación), se diferencian in vivo o ambos.

Como se usa aqui, las células, por ejemplo, las células madre son "positivas" para un marcador particular cuando ese marcador se puede detectar sobre el fondo. Por ejemplo, las células madre placentarias son positivas por ejemplo, para CD73 puesto que el CD73 se puede detectar sobre las células madre placentarias en una cantidad detectablemente mayor que el fondo (en comparación, por ejemplo, con un control isotópico) . Las células también son positivas para un marcador cuando el marcador puede ser usado para distinguir las células de al menos otro tipo de células, o puede ser usado para seleccionar o aislar las células cuando está presente o es expresado por las células, en el contexto de, por ejemplo, la detección mediada por anticuerpos, "positivo" como una indicación de un marcador de la superficie celular que esta presente, significa que el marcador puede ser detectado usando un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado de manera fluorescente, especifico para ese marcador; "positivo" también se refiere a las células que exhiben ese marcador en una cantidad que produce una señal, por ejemplo, en un citómetro, que es detectablemente superior al fondo. Por ejemplo las células son "CD200+" cuando las células se etiquetan de manera detectable con un anticuerpo especifico para CD200, y la señal del anticuerpo es detectablemente mayor que la de un control (por ejemplo, el fondo o un control isotipico) . Por el contrario, "negativo" en el mismo contexto, significa que el marcador de la superficie celular no es detectable usando un anticuerpo especifico para ese marcador en comparación con el fondo. Por ejemplo, un tipo de células es "CD34 " cuando las células no se etiquetan de manera detectable, reproduciblente , con un anticuerpo especifico para CD34" a un grado mayor que un control (por ejemplo, el fondo o un control isotipico) . Los marcadores no detectados, o no detectables, usando los anticuerpos se determina como positivos o negativos en una manera similar, usando un control apropiado (por ejemplo, el fondo o un control isotipico) . Por ejemplo, un tipo o población de células puede ser determinado como 0CT-4+ si la cantidad de ARN de OCT-4 detectada en el ARN del tipo o la población de células es detectablemente mayor que el fondo, cuando se determina, por ejemplo, por un método para detectar el ARN, tal como RT-PCR, transferencia por ranuras, etc. A menos que se indique de otra manera aquí, los marcadores de agrupación o diferenciación ("CD") se detectan usando anticuerpos. Se puede determinar que el OCT-4 esta presente, y que las células son 0CT-4+", si el OCT-4 RNA es detectable usando RT-PCR. 5.2. COMPOSICIONES MEJORADAS QUE COMPRENDEN CÉLULAS y MÉTODOS PARA PREPARAR LAS COMPOSICIONES Aquí se proporciona métodos mejorados para preparar composiciones que comprenden células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, células madre placentarias , y composiciones mejoradas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas producidas con las mismas. Las composiciones, por ejemplo, las composiciones que comprenden células, que se pueden administrar en forma liquida, son mejor toleradas por los receptores cuando, por ejemplo, los agregados de células de particular los agregados de células visibles a simpre vista (es decir, los agregados macro) se eliminan antes de la administración de la composición farmacéutica a un individuo. Los métodos para preparar las composiciones que comprenden células, por ejemplo, células madre, tales como células madre de una placenta pos parto de humano, que ha sido drenada de sangre, células placentarias, como se describen aqui, resultan en composiciones que son substancialmente mejor tolerada cuando se administran a un individuo.

En una modalidad aqui se proporciona un método para preparar una composición que comprende filtrar una solución que comprende células, para producir una solución filtrada que contiene las células; diluir la solición filtrada que contiene las células con una primera solución de dilución a no más de aproximadamente ±3xl06 células por mililitro, por ejemplo, antes de la crioconservacion; y opcionalmemte diluir la solución filtrada que contiene las células con una segunda solución de dilución que comprende dextrano, para producir dicha composición. En otra modalidad, aquí se proporciona un método para preparar una composición, que comprende filtrar una solución que comprende células para producir una solución filtrada que contiene las células; diluir la solución filtrada que contiene las células con una primera solución de dilución a no más de aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro, por ejemplo antes de la crioconservacion; y opcionalmente , diluir la solución filtrada que contiene las células, resultante con una segunda solución de dilución que comprende dextrano para producir dicha composición. En ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional.

En una modalidad especifica, las células son células madre. En una modalidad más específica, las células madre son células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea, o células madre adultas. En un modalidad específica, las célula sin células placentarias aisladas. En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas son células madre placentarias o células placentarias multipotentes . En otra modalidad especifica, las células son células de perfusado de placenta, por ejemplo, células nucleadas de perfusado de placenta. Los métodos para obtener las células de perfusado de placenta se describen en la Sección 5.3.4, a continuación.

En una modalidad especifica, las células se criopreservan entre dicha dilución con una primera solución de dilución y dicha dilución con dicha segunda solución de dilución. En otra modalidad especifica, la primera solución de dilución comprende dextrano y HSA. En otra modalidad esopecifica dicho dextrano en dichas primera solución de dilución es de aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de dextranp. En otra mpod especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 1. En otra modalidad especifica, dicho dextrano em dicha primera solución de .dilución y duicha solución de dilución es dextrano 1. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 70. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución y dicha segunda solución de dilución es dextrano 70. En otra modalidad especifica, el dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextranbo 40. En otra modalidad especifica, el dextrano en dicha primera solución de dilución y dicha segyunda solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad especifican dicho dextrano en dicha primera solución de dilución es aproximadamente 2.5% de dextrano 40 a aproximadamente 10% de dextrano 40. En otra modalidad específi-ca, dicho dextrano 40 en dicha primera solución es aproximadamente 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5% 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% o 10% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es aproximadamente 5.5% de dextrano 40.

En otras modalidades, dicha primera y/o segunda soluciones de dilución pueden comprenden un polisacárido además de o distinto a, es decir, en lugar de, dextrano. En ciertas modalidades el polisacárido es un polímero (de 20 o más subunidades) de glucosa, y no comprende unidades polisacaridas que no sean glucosa. En otras modalidades, dicha primera y dicha segunda soluciones de dilución comprenden uno o más de maltodextrina (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, .4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de maltodextrina), trehalosa (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3 .0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4,0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de trehalosa) , o hetaalmidon (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de hetaalmidon) . En otras modalidades, la primera y/o la segunda soluciones de dilución comprenden uno o más de sacarosa (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de sacarosa) , heparina (por ejemplo, aproximadamente 55 unidades USP/ml de heparina) , o glicógeno (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%. 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.794, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de glicógeno) . En una modalidad particular, dicha primera y segunda soluciones de dilución comprenden maltodextrano además de o distinto a, es decir, en lugar de dextrano. En otra modalidad particular, dicha primera y/o segunda soluciones de dilución comprenden trehalosa además de o distinto a, es decir, en lugar de, dextrano. En otra modalidad particular, dichas primera y .segunda soluciones de dilución comprenden hetaalmidon además de o distinto a, es decirm en lugar de dextrano.

En otra modalidad especifica, dichja HSA en dicha solución que comprende HSA es aproximadamente 1 a 17% de HSA. En otra modalidad especirfica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o aproximadamente 17% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha hssa en dicha solución que comprende HSA es aproximadamente 4 a 10% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es aproximadamente 3.125% de HSA. En otra modalidad espeifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es 5% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es 10% de HSA. En otra modalidad, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es aproximadamente 16.875% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha primera solución de dilución comprende HSA. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es aproximadamente 1 a 17% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es aproximadamente 1%, 2%, 3%,, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o 17% de HSA. En otyra modalidad especifica, dicha HSA en dicha promete solución de dilución es aproximadamente 4 a 10% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es aproximadamente 3.125% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es aproximadamente 5% de HSA. En otra modalidad específica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es aproximadamente 10% de HSA. En otra modalidad específica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es de aproximadamente 16.875% de HSA.

En otras modalidades, la albúmina de suero de bovino (BSA) (por ejemplo, aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%. 12%, 13%, 14% o 15% de BSA) o o suero fetal de bovino (FBS) (por ejemplo, aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%. 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de FBS) se puedne usar además de o en lugar de, es decir, en lugar de la HSA, en dicha solución.

En algunas modalidades, la proporción de HSA a dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solución, está entre aproximadamente 6:1 de HSA: dextrano a aproximadamente 1:2.6 de HSA: dextrano . En algunas modalidades, la proporción de HSA a dextrano es de aproximadamente 6:1, 5.5:1, 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2.0:1, 1.5:1, 1:1, 1:1.5, 1:2 o 1:2.6 de HSA : dextrano . En algunas modalidades, la relación de HSA a dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40, o dextrano 70, en la primera solución es de aproximadamente 3.13% de HSA/8.25% de dextrano. En algunas modalidades, la relación de HSA a dextrano, por ejemplo dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70 en la primera solución es de aproximadamente 16.88% de HSA/2.75% de dextrabno. En modalidades particulares, la proporción de hs a dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la prmera solución es de aproximadamente 10% de hsa/5.5% de dextrano, por ejemplo, dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70.

En otra modalidad especifica, dicha primera solución de dilución comprende además un crioprotector . Én una mo más especifica, dicho crioprotector es dimetilsufoxido (DMSO) . En una modalidad particular, dicha primera solución de dilución comprende además aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2.5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2.5% a aproximadamente 10%,, aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o aproximadamente 10% a aproximadamente 15% de DMSO. En una modalidad particular dicha primera solución solución de dilución comprende además aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de DMSO.

En una modalidad especifica, dicha primera solución de dilución comprende aproximadamente 5.5% de dextrano 40, aproximadamente 10% de HSA, y aproximadamente 5% de DMSO.

En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha segunda solución de dilución es aproximadamente 10% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicha composición que comprende las células comprende aproximadamente 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5% 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% o 10% de dextrano. En otra modalidad especifica, dicha composición que comprende las células comprende aproximadamente 7.5% a aproximadamente 9% de dextrano. En otra modalidad especifica, dichga composición comprende aproximadamente 1.5xl06 células por mililitro a aproximadamente 5.0xl06 células por mililitro. En otra modalidad especifica, dicha composición comprende aproximadamente 1.0+0.3xl06 células por mililitro a aproximadamente 5.0±1.5xl06 células por mililitro. En una modalidad especifica, dicha segunda solución de dilución no comprende HSA.

El dextrano que puede ser usado en los métodos proporcionados aquí puede ser dextrano de peso molecular entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 150 kDa, por ejemplo, 1 kDa (dextrano 1), aproximadamente 40 kDa (dextrano 40) o aproximadamente 70 kDa (dextrano 70) .

En otra modalidad especifica, la solución que comprende las células comprende un crioprotector . Si la solución que comprende las células comprende menos que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, el primer paso de dilicon puede ser omitido, en ciertas modalidades, la solución en la cual se suspenden las células puede comprender un crioconservador , por ejemplo, D SO, por ejemplo, aproximadamente 2% a aproximadamente 15% de DMSO, por ejemplo, aproximadamente 5% de DMSO.

En otra m, od, aquí se proporciona un método para preparar una composición que comprende: (a) filtrar una solución que comprende células, por ejemplo, células placentarias aisladas, poor ejemplo, células madre placentarias, o célula splacenrtarias multipotentes , o células aisladas de pefusado de placenta, por ejkeplb, células nucleadas totales aisladas de perfusado de placenta, dextrano y albúmina de suero humano (HSA) para producir una primera solución filtrada que contiene lase células; (b) opcionalmenmte diluir dicha solución filtada que contiene las células a aproximadamente 1 a 50xl06, 1 a 40xl06, 1 a 30xl06, 1 a 20xl06, 1 a 15xl06, o l a lOxlO6 células por mililitro, con una primera solución de dilución que comprende dextrano; y (c) opcionalmente diluir la solución filtrada qu contiene las células con una segunda solución de dilución que comprende dextrano, pero que no comprende HSA, preparando por ello una composición. En algunas modalidades, el apso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las celñilas en (a) comprende más que aproximadamente 15xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es a aproximadamente 15xl06 células por mililitro. En algunas modalidades, el paso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es a aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En algunas modalidades, en las cuales dicha solución filtrada que contiene las células comprende menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la dilución en el paso (b) se omite y la solución en el paso (a) comprende un crioprotector , por ejemplo DMSO, por ejemplo, aproximadamente 2% a aproximadamente 15% de DMSO. En algunas modalidades, el paso (b) se realiza cuando la solución filtrada que contiene las células en (a) comprende más que aprox 7.5xl06 células por mililitro, en donde dicha dilución en el paso (b) es a aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro. En una modalidad especifica del método, dichas células se crioconservcan antes del paso (c) . En ciertas modalidades, si el número de elulas es menor que eprox 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En una modalidad especifica del método, dichas células se crioconse4rvam antes del paso (c) . En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de diluion o dicha segunda solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución y dicha segunda solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es 5.0% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es 5.5% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende las células es aproximadamente 1% de HSA a aproximadamente 15% de HSA. En otra modalidad específica, dicha primera solución de dilución comprede HSA. En una modalidad más específica dicha HSA en dicha primera solución de dilución es 5% de HSA. En una modalidad más específica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es 10% de HSA. En otra modalidad, dicha primerta solución de dilución comprende además un crioprotectpor . En una modalidad más específica, dicho crioprotector es DMSO, por ejemplo aproximadamente 2% a aproximadamente 154% de DMSO. En otra modalidad específica, dicho dextrano 40 en dicha solución de dilución es 10% de dextrano 40. En otra modalidad específica, dicha solución en el paso (a) comprende un crioprotector.

En un aspecto del método, el número de agregados de células en la composición final que comprende las células ese reduce o se elmina usando filtración, preferiblemeye anytes de la crioprservacion . En ciertas modalidades en las cuales las células en la solución que contiene las células se criopreserva . La solución que contiene las células se filtra antes de la criopreservacion. Por ejemplo, las células, por ejemplo, las células madre placentarias, en solución se pueden hacer pasar a través de un filtro antes de la criopreservacion para eliminar los agregados de células visibles (agregados de células, es decir, agregados de células macro) . En una modalidad, la filtración comprende filtrar la solución que contiene las células a través de un filtro antes de criopreservar dichas células, en donde dicho filtro comprende poros entre aproximadamente 50 µ? y aproximadamente 150 µ? de diámetro (es decir, el filtro es un filtro de aproximadamente 50 µ? a un filtro de aproximadamente 150 µ?) en donde el filtro es adecuado para filtrar soluciones que comprenden células. por ejemplo, el filtro puede ser un filtro que comprende poros entre aproximadamente 50 y aproximadamente 80 µ?, entre aproximadamente 60 µ? y aproximadamente 90 µ?, entre aproximadamente 70 µ? y aproximadamente 100 µ?, entre aproximadamente 80 µ y aproximadamente 110 µ?, entre aproximadamente 90 µ? y aproximadamente 120 µ?, entre aproximadamente 100 µ? y aproximadamente 130 µ?, entre aproximadamente 110 µ? y aproximadamente 140 imM, o entre aproximadamente 120 µ? y aproximadamente 150 µ?, o puede ser un filtro de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 pM. En otra modalidad especificam dicho filtro es un filtro de aproximadamente 70 µ? a un filtro de 100 µ?. En otra modalidad especifica, dicha solución que contiene células se filtra después de la descongelación además de ser filtrada antes de la congelación.

En otra ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10+3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional.

En varias modalidades, el método para preparar una composición que comprende células, por ejemplo, células placentarias aisladas, comprende criopreservar las células a no más que aproximadamente 50 x 106, 40 x 106, 30 x 106, 20 x 106, 15 x 106, 10 x 106, 9 x 106, 8.5 x 106, 8 x 106, 7.5 x 106, 7 x 106, 6.5 x 106, 6 x 106, 5.5 x 106, 5 x 106, 4.5 x 106, 4 x 106, 3.5 x 106, 3 x 106, o 2.5 x 106 células por mililitro. En una modalidad especifica, las células se criopreservan a no más que aproximadamente 10+3X106 células por mililitro. En otra modalidad especifica, las células se criopreservan a no más que aproximadamente 15 x 106, células por mililitro. En otra modalidad especifica, las células se criopreservan a no más que aproximadamente 5 x 106. En otra modalidad especifica, las células se ccriopreservan a aproximadamente 5.0 x 106, a aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro. En otra modalidad específica, las células se criopreservan a aproximadamente 5 x 106, células por mililitro. En otra modalidad especifica, as células se criopresrvan a aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro. En una modalidad específica, las células se criopreservan a aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En otra modalidad específica, dichas células se criopreservan a un número que, cuando dichas células se descongelan y se diluyen a 1:1 a 1:11 (v/v) , por ejemplo, 1 : 1 a 1:5 (v/v) con dextrano 40. Por ejemplo 10% de dextrano 40, resulta en la formación de 2 o menos agregados de células visibles (es decir, agregados de células raacro) por 106. En otra modalidad especifica, diocjas células placentarias aisladas se criopresrvan a un número que, cuando dichas células se congelan y se diluyen 1:1 a 1:11 (v/v) , por ejemplo, 1:1 a 1:5 (v/v) con dextrano 40, por ejelo, 10% de dextrano 40, resulta en la no formación de agregados de células visibles. En otra modalidad especifica, dichas células se criopreservan a un número que, cuando dichas células se descongelan y se diluyen 1:1 a 1:11 (v/v), por ejemplo, 1:1 a 1:5 (v/v), con 10% de dextrano 40, resulta en la formación de menos que aproximadamente 150, 140, 130, 120, 110 o 100 agregados micro por 106 células.

En otra modalidad, aqui se proporciona un método para preparar una composición, por ejemplo, que comprende poner en contacto célula, se por ejemplo células placentarias aisladas, después de la criopreservación, con una solución que comprende dextrano 40, por ejemplo, resuspendiendo las células o diluyendo las células en una solución que comprende dextrano 40. En una modalidad especifica, la solución comprende entre aproximadamente 2.5% de dextrano 40 a aproximadamente 10% de dextrano 40 (p/v) . En modalidades especificas, la solución comprende aproximadamente 5% de dextrano 40 a aproximadamente 10% de dextrano 40 (p/v) . En otra modalidad especifica, la solución es una solución de 5.0% de dextrano o una solución de 10% de dextrano. En otra modalidad especifica, la solución es una solución de 5.5% de dextrano o una solución de 10% de dextrano. En otras modalidades, el dextrano tiene un pero molecular, por ejemplo, un peso molecular promedio, entre aproximadamente 1 kilodalton, y aproximadamente 150 kilodalton. En otras modalidades, el dextrano tiene un peso molecular, por ejemplo, un peso molecular peomedio, entre aproximadamente lkDa a aproximadamente 150 kDa, aproximadamente lkDa a aproximadamente 125 kDa, aproximadamente lkDa a aproximadamente 100 kDa, aproximadamente lkDa a aproximadamente 75 kDa, aproximadamente lkDa a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente lkDa a aproximadamente 25 kDa. En otras modalidades, el dextrano tiene un peso molecular, por ejemplo, un peso molecuilar promedio entre aproximadamente 1 las a aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 60 kDa a aproximadamente 80 kDa. En otras modalidades, la solución comprende entre aproximadamente 2% de dexyrano y aproximadamente 25% de dextrano. En una modalidad especifica, dicha solución no comprende HSA. En otra modalidad especifica, dicha solución tiene una densidad igual a dichas células, por ejemplo, dichas células madre placentarias, por ejemplo, la solución está dentro del 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% o 0.1% de la densidad de las células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, la solución no tiene una densidad igualada a dichas células.

En otra modalidad, el método para preparar una composición que comprende células, por ejemplo dcelula splacentarias aisladas, comprende (a) filtrar una solución que contiene las células que comprende dichas células, antes de la criopreservación; (b) criopreservar las células a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro; (c) descongeklar las células; y (d) diluir las solución que contiene las células aproximadamente 1:1 (p/v) a aproximadamente 1:11 con una solución de dextrano 40. En ciertas modalidades, aproximadamente 15 x 106 células se criopreservan en el paso (b) . En ciertas modalidad, las células se criopreservan en el paso (b) a no más que 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, no más que aproximadamente 10± 3 x 106 células por mililitro se criopreservan en el paso (b) . En otras ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro, la filtración es opcional. En una modalidad más especifica, las células en el paso (b) se criopreservan en una solución que comprende aproximadamente 5% a aproximadamente 10% de dextrano 40 y HSA.

En otra modalidad, el método para preparar una composición comprende los siguientes pasos: (a) filtrar una solución que comprende las células, solución de 5.5% de dextrano 40, y 10% de HSA a través de un filtro de 70 µ? para producir una solución filtrada que contiene las células; (b) diluir las solución filtrada que contiene las células con una solución que comprende 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA, y 5% de DMSO a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro; (d) criopreservar las células en dicha solución filtrada que contiene las células; (e) decongelar las células; y (f) opcionalmente diluir la solución filtrada que contiene las células, con 10% de dextrano 40.

En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (b) no es a más que aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (b) es a no más que aproximadamente 10+3xl06 células por mililitro. En las modalidades en las cuales la solución filtrada que contiene las células comprende menor que aproximadamente 10+3xl06 células/mL, la solución en el paso (a) comprnde un crioprotector , por ejemplo, DMSO, por ejemplo, aproximadamente 1% a aproximadamente 5% de DMSO, y el paso (b) se omite. En otras ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En algunas modalidades, el paso (f) comprende diluir la solución que contiene las células 1:1 a 1:11 v/v con 10% de dextrano 40. En algunas modalidades, el paso (f) comprende diluir la solución filtrada que contiene las células 1:1 a 1:5 (v/v) con 10% de dextrano 40.

En otra modalidad, el método para preparar una composición proporcionada aquí comprende los siguientes pasos: (a) cenrifugar una pluralidad de células para recolectar las células ; (b) resuspender las células en dextrano 40 al 5.5%; (c) centrifugar las células para recolectar las células; (d) r3suspender las células en una solución de dextrano 40 a 5.5% que comprende 10% de HSA para producir una solución que contiene las células; (e) filtrar la solución que contiene las células a través de un filtro de 70 µ para obtener una solución filtrada que contiene las células; (f) diluir la solución filtrada que contiene las células en dextrano 40 al 5.5%, 10% de HSA, y 5% de DMSO, a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro; (g) criopreservar las células en dicha solución filtrada que contiene las células; (h) descongelar las células; e (i) opcionalmente diluir la solución filtrada que contiene las células con 10% de dextrano 40.

En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (f) no es a más de 15xl06 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución en elpaso (f ) no es a - más de aproximadamente 10±3xl06 células/mL. En otras ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células/mL, la filtración es opcional. En las modalidades en las cuales dicha resuspensión en el paso (d) producir una solución que contiene las células que comprende menos que aproximadamente 10±3xl06 células/mL, la solución en el paso (de) comprende un crioprotector, por ejemplo DMSO, por ejemplo, aproximadamente 1% a aproximadamente 5% de DMSO, y el paso (f) se omite. En algunas modalidades, el paso (i) comprende diluir la solución filtrada que contiene las células 1:1 a 1:5 (v/v) con dextrano 40 qal 10%. En algunas modalidades, el paso (i) comprende diluir la solución filtrada que contiene las células 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%.

En una modalidad especifica de cualquiera de los métodos anteriores, el DMSO se elimina sustancialmente de la composición que comprende las células, de modo tal que la concentración final del DMSO en la composición es menor que aproximadamente 2.5%, 2.0%, l.S%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% o aproximadamente 0.1%. La extracción del DMSO se puede lograr por ejemplo, centrifugando las células y resuspendiendo las células en dextrano 40 al 10%. Tales pasos de centrifugación y resuspensión se pueden repetir una o más veces.

En otra modalidad especifica de cualquiera de los métodos anteriores, el método comprende ademads concentrar la composición de células resultante a aproximadamente 5 x 106 cm a 1 x 108 células por mililitro. Tal composición es útil, por ejemplo, para la administración subcutánea de la composición a un individuo en necesidad de la misma.

En otra modalidad especifica de cualquiera de los métodos anteriores, las células son células distintas a células madre placentarias . En modalidades más especificas, por ejemplo, las células pueden ser células madre o células no madre. En modalidades especificas en las cuales las células son células madre, las células madre pueden ser por ejemplo, células madre adultas, células madre somáticas, célula madre embrionarias, células germinales embrionarias, célula madre del cordón umbilical, células madre del fluido amniótico, células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea, células madre mesenquimales derivadas de la sangre del cordón, células madre mesenquimales derivadas de la sangre periférica, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo o células madre derivadas de periostio. En otra modalidad especifica, las células son células asesinas naturales, por ejemplo, células asesinas naturales CD3", CD56+.

En otro aspecto qui se proporcionan coposiciones , por ejemplo, composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades, las composiciones se peparan mediante los métodos anteriores.

En ciertyas modalidades, las composiciones carecen de agregados de células visibles, es decir, agregados de células macro. En ciertas otras modalidades, las composiciones comprenden sustancialmente números reducidos de agregados de células micro (aquellos visibles solo con un microscopio, por ejemplo, unm microscopio óptico) en comparación con las composiciones que no han sido filtradas, por ejemplo, aproximdamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% menos¦ agregados de células micro.

En una modalidad aquí se proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células, por ejemplo, una pluralidad de células placentarias aisladas, o células aisladas de perfusado de placenta, por ejemplo, células nucleadas totales de perfusado de placenta en una solución que comprende 10% de dextrano 40, en donde dicha composición comprende entre aproximdamente 1.0±0.3xl06 células por mililitro a aproximadamente 5.0±1.5xl06 células por mililitro, y en donde dicha composición no comprende agregados de células visibles (es decir, no comprende agregados de células macro) . En algunas modalidades, dicha composición comprende entre aproximadamente 1.5xl06 células por mililitro a aproximadamente 3.75xl06 células por mililitro. En ciertas otras modalidades, la composición comprende entre aproximadamente l.OxlO6 células por mililitro y 15xl06 células por mililitro, por ejemplo, entre aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro y aproximadamente 15xl06 células por mililitro. En ciertas otras modalidades, la composición comprende menor que aproximdamente 20xl06 células por mililitro. En una modalidad especifica, dichas células han sido criopreservadas y descongeladas. En otra modalidad especifica, dichas células han sido filtradas a través de un filtro de 70 µ? a 100 µ?. En otra modalidad especifica, dicha composición no comprende agregados de células macro. En otra modalidad especifica, dicha composición comprende menos que aproximadamente 200 agregadois de células micro por 106 células. En otra modalidad especifica, dicha composición comprende menos que aproximadamente 100 agregados de células micro por 106 células. En otra modalidad especifica, dicha composición comprende menos que 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, o 0.1% de DMSO.

En algunas modalidades, la composición comprende aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de dextrano, por ejemplo dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70. En una modalidad especifica, la composición comprende aproximadamente 7.5% a aproximadamente 9% de dextrano 40. En una modalidad especifica, dicha composición comprende aproximadamete 5.5% de dextrano 40.

En otras modalidades, dicha composición comprende un polisacáridos además de o distinto a, es decir, en lugar de dextrano. En ciertas modalidades, el poliacarido es un polímero de glucosa que o comprende o unidades sacaridas que no son de glucosa. En algunas modalidades, dicha composición comprende maltodextrina (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de maltodextrina), trehalosa (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, %0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75% o 10% de trehalosa), o hetaalmidón (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de hetaalmidón) . En otras modalidades, dicha composición comprende sacarosa (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%, 4.75%, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de sacarosa), heparina (por ejemplo, 55 unidades USP/ml de heparina), o glicógeno (por ejemplo, aproximadamente 2.5%, 2.75%, 3.0%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4.0%, 4.25%, 4.5%~4~.7 94, 5.0%, 5.25%, 5.5%, 5.75%, 6.0%, 6.25%, 6.5%, 6.75%, 7.0%, 7.25%, 7.5%, 7.75%, 8.0%, 8.25%, 8.5%, 8.75%, 9.0%, 9.25%, 9.5%, 9.75%, o 10% de glicógeno) . En una modalidad particular, dicha composición comprende maltodextrano además o distinto a, es decir, en lugar del dextrano. En otra modalidad particular, dicha composición comprende trehalosa además o en lugar de dextrano. En otra modalidad particular, dicha composición comprende trehalosa además de o en lugar del dextrano. En otra modalidad particular, dicha composición comprende hetaalmidón además de o en lugar del dextrano.

Een otra modalidad especifica, dicha composición comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 175 de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, o aproximadamente 17% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 3.125% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 5% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 10% de HSA. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 16.875% de HSA.

En otras modalidades, dicha composición comprende albúmina de suero de bovino (BSA) (por ejemplo aproximadamente, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de BSA) o suero fetal de bovino (FBS) (por ejemplo aproximadamente, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de FBS) de o en lugar de HSA.

En algunas modalidades, la composición comprende un crioprotector , por ejemplo, DMSO, por ejemplo, aproximadamente 1% a aproximadamente 15% de DMSO. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 5% de DMSO. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2.5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 2.5% a aproximadamente 10%, aproximadamente 55 a aproximadamente 15%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o aproximadamente 10% a aproximadamente 15% de DMSO. En algunas modalidades, dicha composición comprende aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de DMSO. En modalidades particulares, la composición comprende aproximadamente 5% de DMSO.

Además aquí se proporcionan composiciones que comprenden células, en donde dichas composicones se producen mediaqnte uno de los método descritos aquí. por ejemplo, en una modalidad, aquí se proporciona una composición que comprende células, en donde dicha composición se produce mediante un método que comprende filtrar una solución que comprende células, para fomar una solución filtrada que contiene las células; diluir la solución filtrada que contiene las células con una primera solución a aproximadamente 1 a 50xl06, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro, por ejemplo, antes de la criopreservación; y diluir la solución filtrada que contiene las células resultantes con una segunda solución de dilución que comprende dextrano pero que no comprende HSA, para producir dicha composición. En ciertas modalidades, dicha dilución es a no más que aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución es a no más que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución es a no más que aproximadamente 7.5xl06 células por mililitro. En ciertas otras modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En una modalidad especifica, las células se criopreservan entre dicha dilución con una primera solución y dicha dilución con dicha segunda solución de dilución. En otra modalidad especifica, la primera solución de dilución comprende detrano y HSA. En otra modalidad específica, el dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segundsa solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad específica, el dextrano en dicha primer solución de dilución y dicha segunda solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad específica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es 5.0% de dextrano 40. En otra modalidad específica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es 5.5% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es 10% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha primera solución de dilución comprende HSA. En una modalidad más especifica, dicha HSA en dicha primera solución de dilución es 10% de HSA. En otra modalidad especifica, dicha primera solución de dilución comprende un crioprotector . En una modalidad más especifica, dicho crioprotector es DIVISO. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solución de dilución es aproximadamente 10% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicha composición que comprende células comprende aproximadamente 7.5% a aproximadamente 9% de dextrano. En otra modalidad especifica dic ha composición que comprende células comprende aproximdamente 1.0±0.3xl06 células por mililitro a aproximadamente 5.0±1.5xl06 células por mililitro. En otra modalidad especifica, dicha composición que comprende células comprende aproximadamente 1.5xl06 células por mililitro a aproximadamente 3.73xl06 células por mililitro .

En otra modalidad, la composición que comprende células se prepara mediante un método que comprende (a) filtrar una solución quecointiene células, que comprende dichas células, antes de la criopreservación, para producir una solución filtrada que contiene las células; (b) criopreservar las células en la solución filtrada que contiene las células a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro; (c) descongelar las células; y (d) diluir la solución filtrada que contiene las células aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:11 (v/v) con una solución de dextrano 40. En ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En una modalidad más especifica, las células en el paso (b) se criopreservan a aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En una modalidad más especifica las células en el paso (b) se criopreservan en una solución que comprende aproximadamente 5% a aproximadamente 10% de dextrano 40 y HSA. En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (de) no es a más que aproximadamente 15xl06 células por mililitro.

En otra modalidad, la composición que comprende las células se preparar mediante un método que comprende: (a) suspender las células en una solución de 5.5 de dextran 40 que comprende 10% de HSA para formar una solución que contiene las células; (b) filtrar la solución que contiene las células a través de un filtro de 70 µ?; (c) diluir la solución que contiene las células con una solución que comprende 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA y 5% de DMSO a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 106 células por mililitro; (d) criopreservar las células; (e) descongelar las células; y (f) diluir las solución que contiene las células 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (b) no es a más que aproximadamente 10±3xl06 células/mL. En otra modalidad, la composición que comprende las células se prepara mediante un método que comprende: (a) centrifugar una pluralidad de células par recolectar las células; (b) resuspender las células en dextrano 40 al 5.5%; (c) centrifugar las células para recolectar las células; (d) resuspender las células en una solución de dextrano 40 al 5.5% que comprende 10% de HSA; (e) filtrar las células a través de un filtro de 70 µ?; (f) diluir las células en dextrano 40 al 5.5%, 10% de HSA y 55 de DMSO a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o l a 10 x 106 células por mililitro (g) criopresrvar las células; (h) descongelar las células; e (i) diluir las elulas 1:1 a 1:11 (v/v) conm dextrano 40 al 10%. En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (f) es a no más de aproximadamente 15xl06 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (f) es a no más que aproximadamente 10±3xl06 células/mL. En otras modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional.

Las composiciones, por ejemplos composiciones farmacéuticas que comprenden células, descritas aquí, pueden comprender cualquier tipo de células de manigero, incluyendo células madre de mamífero y células no madre de mamífero. En algunas modalidades, las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas, que comprenden células, descrita aquí, pueden comprender células placentarias aisladas, por ejemplo, cualquiera de las células placenrtarias descritas aquí (véase, por ejemplo, la Sección 5.3 a continuación) . En una modalidad específica, las células placentarias aisladas son CD34", CD10+ y CD105+ como se detecta por citometría de flujo. En una modalidad más específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas son células madre placentarias. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladasCD34~, CD10+, CD105+ son células placentarias multipotentes . En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ tienen el potencial de difrenciarse en células de fenotipo neural, células de fenotipo osteogénico, o células de un fenotipo condrogénico . En una modalidad más específica, las células placentarias sialadas CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD200+. En otra modalidad más específica las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente CD90+ o CD45 , cuando se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD90+ o CD45 , cuando se detecta por citometría de flujo. En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45 , cuando se detecta por citomatria de flujo. En otra modalidad más especifica, las células CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ y CD45 , cuando se detecta por citometria de flujo. En otra modalidad especifica, las células CD34", CD10+, CD105+, CD200+, CD90+, CD45 son adicionalmente CD80 y CD86 , cuando se detecta por citometria de flujo.

En una modalidad más especifica, las células CD34", CD10+, CD105+, son adicionalmente uno o más de CD29+, CD38 , CD44+, CD80 , CD86 , SH3+ o SH4+. En otra modalidad más especifica las células son adicionalmente CD44+. En una modalidad especifica de cualquiera de las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ anteriores, las células son adicionalmente uno o más de CD117~, CD133~, KDR~ ( VEGFR2~) , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~; y/o Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+.

En ciertas otras modalidades de las composiciones, dichas células placventarias sialadas son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ y 0CT-4+ ; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprenden dichas células placentarias aisladas cuando dicha población se cultiva bajo las condiciones que permitan la formación de cuerpos similares a embrioides; o 0CT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprenden las células placentarias asiladas cuando dicha población se cultiva bajo las condiciones que permitan la formación de cuerpos similares embrioides; o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad espeifica, dichas células CD200+, HLA-G+ son CD34~, CD38~, CD45~, CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células CD73+, CD105+, y CD200+ son CD34", CD45 , y HLA-G+ . En otra modalidad especifica, dichas células CD200+, 0CT-4+ son CD34", CD38~, CD45~, CD73+, CD105+, y HLA-G+. En otra modalidad especifica, dichas células CD73+, CD105+, y HLA-G+ son CD34", CD45~, OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, dichas células OCT-4+ son CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38 , y CD45 . Las células placentarias aisladas que pueden estar contenidas en las composiciones que comprenden las células, descritas aquí, se describen con ma detalle en la Sección 5.3, a continuación.

En otras modalidades especificas de las composiciones proporcionadas aquí, las células son células distintas a las células madre placentarias. En modalidades más especificas, por ejemplo, las células pieden ser célula madre o células no madre, en modalidades más especificas, en las cuales las células son células madre, las células madre pueden ser, por ejemplo, células madre adultas, células madre somáticas, células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre del cordón umbilical, células madre del fluido amniotico, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical, células madre mesenquimales derivadas de la sangre periférica, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo o células madre derivadas del periostio. En otra modalidad especifica, las células madre son células aseinas naturales, por ejemplo, células asesinas naturales CD3 , CD56+. 5.3. CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS Y POBLACIONES DE CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS Las células placentarias multipotentes aisladas útiles en las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí, se pueden obtener de la placenta o de partes de la misma, que se adhieren a un substrato de cultivo de tejidos y tienen características de células multipotentes o células madre. En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas útiles en los métodos descritos aquí, tienen la capacidad de diferenciarse en tipos de células no placentarios . Las células placentarias aisladas útiles en los métodos descritos aquí pueden tener origen fetal o materno (es decir, pueden tener el genotipo del feto o de la madre, respectivamente) . Preferiblemente, las células placentarias aisladas y las poblaciones de células placentarias aisladas son de origen fetal. Como se usa aquí, la frase "de origen fetal" o "de prigen no materno" indica que las células placentarias aisladas o las poblaciones de células placentarias aisladas se obtienen del cordón umbnilical o de las estructuras placentarias ansiadas con el feto, es decir, que toienen el genotipo del feto. Como se usa aquí, la frase "de origen materno" indica que las célula so las poblaciones de células se obtienen de las estructuras placentarias asociadas con la madre, por ejemplo, las cuales tienen el genotipo materno. Las células placentarias aisladas o la población de células que comprende las células placentarias aisladas, pueden comprender células placentarias aisladas que solo son de origen fetal o de origen materno, o pueden comprender una población mezclada de células placentarias aisladas tanto de origen fetal y materno. Las células placentarias aisladas, y las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, pueden ser identificadas y seleccionadas por las características morfológicas, marcadores y de cultivo discutidas a continuación. Las células placentarias aisladas adecuadas para ser usadas en los métodos y las composiciones descritas aquí pueden incluir, por ejemplo, aquellas descritas en la Publicación de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0275362 y la Patente Norteamericana No. 7,468,276, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. 5.3.1. Características Físicas y Morfológicas Las células placentarias aisladas descritas aquí, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivos de células, se adhieren al substrato de cultivo de tejidos, por ejemplo, la superficie del recipiente de cultivo de tejidos (por ejemplo, plástico para cultivo de tejidos) o a una superficie de cultivo de tejidos revestida con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (por ejemplo, nativo o desnaturalizado), gelatina, fibronectinas , ornitina, vibronectina , y proteína de la membrana extracelular (por ejepOlo, MATRIGEL®) , (BD Discovery Labware, Bedford, Mass) . Las células placentarias aisladas en cultivo asumen una apariencia fibroblastoide, estrellada con un numero de procesos citoplasmaticos que se extienden desde el cuerpo central de las células. Las células, sin embargo, son morfológicamente distinguibles de los fibriblastos cultivados bajo las mismas condiciones, ya que las células placentarias aisladas exhiben un mayor número de tales procesos de los que exhiben los fibroblastos. Morfológicamente, las células placentarias aisladas también son distinguibles de las células madre hematopoyéticas, las cuales asumen por lo general una morfología más redondeada o de adoquín en el cultivo . 5.3.2. Marcadores de la Superficie Celular, Moleculares y Genéticos Las células placentarias aisladas, por ejemplo, células multipotentes o células madre, y las poblaciones de células placentarias aisladas, expresan una pluralidad de marcadores que pueden ser usados para identificar y/o aislar las células madre, o las poblaciones de células que comprenden las células madre. Las células placentarias aisladas, y las poblaciones de células placentarias aisladas descritas aquí (es decir, dos o más tipos de células placentarias aisladas) incluyen células y poblaciones de cvelulas que contienen células placentarias obtenidas directamente de la placenta, o de cualquier parte de la misma (por ejemplo, el aminios, el corion, los cotiledones placentarios , y los similares) . Las poblaciones de células placentarias aisladas también incluyen poblaciones de (es decir, dos o más tipos) de células placentarias aisladas en cutivo, y una población en un recipiente, por ejemplo, una bolsa. Las células placentarias aisladas descritas aquí no son trofoblastos , citotrofoblastos , hemangioblastos, células germoinbales embrionarias o células madre embrionarias. Las células placentarias multipotentes que se pueden usar en los métodos y las composiciones descritos aquí, se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0275362, y la Patentes Norteamericanas Nos. 7,945,148 y 7,468,276, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad, y como se describen a continuación .

Las células placentarias aisladas, que se pueden usar en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, expresan en general los marcadores CD73, CD105, CD200, HLA-G y/o OCT-4, y no expresan CD34, CD38, o CD45, y son HLA-DP, CQ y DR . Las células multipotentes aisladas también son en general CD10+, CD29+, CD54 +, CD90+, CD44+ y CD38+ . En ciertas modalidades, las células son uno o más de SSEA3 , SSEA4 o ABC-p+. Las células placentarias aisladas también pueden expresar HLA-ABC (MHC-1) . Estos marcadores pueden ser usados, en cualquier combinación, para identificar las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células madre placentarias aisladas o las células placentarias multipotentes aisladas y para distinguir las células placentarias aisladas de otros tipos de células. Puesto que las células placentarias aisladas pueden expresar CD73 y CD105, estas pueden tener características simuilares a células madre mesenquimales . La carencia de expresión de CD34, CD38 y/o CD45, por ejemplo, identifica las células placentarias aisladas como célula madre no hematopoyéticas .

En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son células madre placentarias aisladas. En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas son células placentarias multipotentes aisladas. En una modalidad, las células placentarias aisladas son CD34 , CD10 y CD105+, cuando se detecta por citometría de flujo. En una modalidad específica, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ son células madre placentarias. En otra modalidad, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ son células placentarias multipotentes . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ tienen el potencial de diferenciarse en células de un fenotipo neural, células de un fenotipo osteogénico, o células de un fenotipo condrogénico . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente CD200+. En otra modalidad especifica, las las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente CD45 o CD90+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente CD45 o CD90+, cuando se detecta por citomatria de flujo. En una modalidad más especifica, las las células placentarias aisladas CD34~, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o Cd45 , cuando se detecta por citometria de flujo. En otra modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34~, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ y CD45 , cuando se detecta por citometria de flujo, es decir, las células son CD34~,' CD10+, CD45~, CD90+, CD105+ y CD200+ . En una modalidad más especifica, dicjas células CD34 , CD10+, CD45 , CD90+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD80~ y CD86 .

En una modalidad especifica, cualquiera de las células CD4 , CD10+, CD105+ descritas anteriormente son adicionalmente uno o más de CD29+, CD38~, CD44+ , CD54+ , SH3+ o SH4+ . En otra modalidad más especifica, as células son adiiconalmente CD44+. En otra modalidad especifica de cualquiera de las células placenterías aisladas CD34 , CD10+, CD105+ anteriores, las células son adicionalmente uno o más de CD117 , CD133 , KDR (VEGFR2~) , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~, y/o PDL1+. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente uno o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38~, CD44+, CD45~, CD54+ , CD62E~, CD62L~, CD62P~, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+ ), CD80", CD86~, CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117~, CD14 /VE-cadherinainferior, CD184/CXCR4~, CD200+ CD133~, 0CT-4+, SSEA3~, SSEA4~, ABC-p+, KDR_ (VEGFR2_) , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR , HLA-G+ o Ligando de Muete Programada 1 (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad más especifica, las células placentarias CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38 , CD44+, CD45~, CD54/ICAM+, CD62E~, CD62L~, CD62P_, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80~, CD86~, CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117~, CD144/VE-caderinainferior, CD18 /CXCR4~, CD200+, CD133~, 0CT-4+, SSEA3~, SSEA4~, ABC-p+, KDR~ (VEGFR2~) , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ,DR , HLA-G+, y Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+.

En otra modalidad, una población de células, que se puede eusar en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, es una población de células que comprende, por ejemplo, es decir enriquecidas por, células placentarias CD34 , CD10 , y CD105+. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10% al menos aproximadamente 20% al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son células placentarias CD34 , CD10+ y CD105+. Preferiblemente, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son células placentarias CD34 , CD10+, y CD105+. Más preferiblemente al nmenos aproximadamente 90%, 95% o 99% de dichas células son células placentarias CD34 , CD10+ y CD105+. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ con adicionalmente CD200+. En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+, CD200+, son adicionalmente CD90+ o CD45 , cuando se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34~, CD10+, CD105+ CD200+ son adicionalmente, CD90+ y CD45 , cuando se detecta por citometría de flujo. En una modalidad más específica, cualquiera de las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ descritas anteriormete, son adicinalmente uno o más de CD29+, CD38 , CD44+, CD54+ , SH3+ o SH4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+, o las células placentarias aisladas CD34 , CD105+, CD200+ son adicionalmente CD44+. En una modalidad específica de cualquiera de las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas CD34 , CD10+, CD105+ anteriors, las células placentarias aisladas son adicionalmente uno o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38~, CD44 + , CD45~, CD62E~, CD62lT, CD62P~, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80 , CD86 , CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117-, CD14 /VE-caderinainferior, CD184/CXCR4~, CD200+, CD133~, 0CT-4+, SSEA3_, SSEA4_, ABC-p+, KDR (VEGFR2 ) , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~, HLA-G+, y Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad más especifica, las células CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38_, CD44+ , CD45_, CD62E~, CD62L~, CD62P~, SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80~, CD86~, CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117~, CD144/VE-caderinainferior, CD18 /CXCR4~, CD200+, CD133~, OCT-4 +, SSEA3~, SSEA4~, ABC-p+, KDR~ (VEGFR2~) , HLA-A, B,C+, HLA-DP, DQ, DR , HLA-G+, y Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+.

En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son uno o más de, CD10+ , CD29+, CD34~, CD38~, CD44 +, CD54 + , CD90+ , SH2+, SH3+, SH4 + , SSEA4_, OCT-4+ , y ABC-p+, en donde dichas células placentarias aisladas se obtienen por desintegración física o enzimática del tejido de la placenta. En una modalidad específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, y ABC-p+. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34 , en donde dichas células placentarias aisladas tienen al menos una de las siguientes características: CD10+, CD29+, CD44+, CD45 , CD54 +, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA4 . En otra modalidad específica, las células placentaria aisladas son OCT-4+, CD34 , CD10+, CD29+, CD44+, CD45~, CD54+ , CD90+, SH3+, SH4 + , SSEA3~, y SSEA4_. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34 , SSEA3+, y SSEA4 . En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34 , y son cualquiera de SH2+ ni SH3+. En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34 , SH2+ y SH3+. En otra modalidad más especifica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34 , SSEA3+, y SSEA4 , y son cualquiera de SH2+ o SH3+. En otra modalidad más especifica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34 , y culquiera de SH2+ o SH3+, y son al menos uno de CD10+, CD29+, CD44 +, CD45 ; CD54+ , CD90+, SSEA3+, o SSEA4~. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas son OCT-4+ , CD34~, CD10+ , CD29+, CD44+, CD45~, CD54 + , CD90+ , SSEA3+, y ssa4, y cualquiera de SH2+ o SH3+.

En una modalidad, las células placentarias aisladas, que se pueden usar en las composiciones y ñlos métodos proporcionados aquí son CD200+ o HLA-G4. En una modalidad espeifica, las células placentarias aisladas son CD200+ y HLA-G+. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas son cd73 y CD105+. En otra modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas son CD34 , CD38 , o CD45 . En otra modalidad espedifica, las células placentarias aisladas son CD34 , CD38 , y CD45 . En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas son CD34 , CD38 , CD45 , cd73, y CD105+. En otra modalidad específica dichas células placentarias aisladas CD200+ o HLA-G+ facilyran la formación de cuerpos similares a embrioides en una pobacion de células placentarias que comprende las células placentarias aisladas, bajo las condiciones que permitan la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas se aislan de las células placentarias que no son células madre o células multipotetes .

En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se aislan de las células madre placentarias que no expresan estos marcadores.

En otra modalidad, una población de células, que se puede eusar en las composiciones y los metoos proprocionadoa aquí, es una población de células que comprende, por ejemplo, es decir, enriquecoidas por células placentarias CD200+, HLA-G+. en varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al mewnos 60% de las células en dicha población de células son células placentarias CD200+, HLA-G+. Preferiblemente al menos aproximadamente 705 de las células en dicha población de células son células placentarias CD200+, HLA-G+. Más preferiblememnte, al menos aproximadamente 90%, 955 o 995 de dichas células son células placentarias CD200+, HLA-G+. en una modalidad especifica, de las poblaciones aisladas, dichas células placentarias también son células CD73+ y CD105+. En otra modalidad especofica dichas células placentarias también son CD34 , CD38 o CD45 . En una modalidad más especifica, dichas células placentarias también son CD34 , CD38 , CD45 , CD73+ y CD105+. En otra modalidad, dichas poblaciones aisladas de células producen uno o más cuerpos similares a embrioides, en otra modalidad especifica, dicha población de células placentarias se aislan de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, dicha población de células placentarias se aislan de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En otra modalidad, las células placentarias, que se pueden usar en las composiciones y los métodos proporcionados aqui, son CD73+, CD105+, CD200+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias son HLA-G+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias son CD34 , CD38 o CD45 . En otra modalidad especifica, duichas células placentarias son CD34 , CD38 y CD45 . En una modalidad más especifica, dichas células placentarias son CD34 , CD38 , c45 y HLA-G+. en otra modalidad especifica, las células placentarias CD73+, CD105+, y CD200+ facilitan formación de uno o más cuerpos similares a embrioides o embriones en una población de dichas células placentarias, cuando la población se cultiva bajo las condiciones que permiten la formación de cuerpos similares embrioides. En otra modalidad, dichas células placentarias se aislan de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad, especifica, dichas células placentarias se aislan de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En otra modalidad, una población de células que se puede usar en las composiciones y los métodos proprocionados aquí, es una población de células que comprende, por ejemplo, es decir, enriquecidas para, células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menosa aproximadamente 50%, o al mmenos aproximadamente 60% de las células en dicha pobnlacion de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de dichas células en deicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En otra modalidad, al menos 90% o 995 de las células en dicha población de las células en dicha población son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En una modalidad espcfica de dichs oblacions, las células placentarias aisladas son HLA-G+. en otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente CD34 , CD38 , o CD45 . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son • adicionalmente CD34 , CD38 y CD45 . En una modalidad más especfifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente CD34 , CD38 , cd456, y HLA-G+. En otra modalidad específica, dicha población de células produce uno o más cuerpos similares aembrioides cuando se cultivan bajo las condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad, dicha población de células placentarias se aisla de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, dicha población de células madre placentarias se aisla de las células placentarias que no expresan estas características.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas que se pueden usar en las composiciones y los métodos de este documento, son CD200+ y OCT-4+. En una modalidad específica, las células placentarias aisladas son CD73+, y CD105+. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas son HLA-G+. en otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son CD34 , CD38 o CD45 . En otra modalidad especfiica, dichas células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+ son CD34~, cd28 y CD45~. En una modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas CD200+ , 0CT-4+ sin CD34~, CD38~, cd45, CD73+, CD105+, y HLA-G+. en otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ facilitan al producción de uno o más cuerpos similares embrioides, por una población de células placentarias que comprende las células aisladas, cuando la población se cultiva bajo las condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides o embriones. En otra modalidad especfiica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ se aislan de las células placentarias que no son células madre. En otro modo especifico, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ se aislan de las células placentarias que no expresan estas características.

En otra modalidad, una población de células que se puede usar en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, es una población de células que comprende, por ejemplo, es decir, enriquecuidas para, las células placentrarias CD200+, OCT-4+. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de leas células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de dichas células son células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+. En otra modalidad, al menos 80%, 90%, 95%, o 99% de las células en dicha población de cfelulas son dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+. En una modalidad especfiica de las poblaciones aisladas, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+ son adicionalmente HLA-G+. En otra modalidad especfoica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son adicionalmente CD34 , CD38 , y CD45 . En una modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+ son adicionalmente CD34~, CD38~, CD45~", CD73+, CD105+, y HLA-G+. en otra modalidad específica, la población de células producor uno o más cuerpos similares a embrioides cuando se cultivan bajo las condiciones que pemiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad espeifica, dicha población se aisla de las células placentarias que no son células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+. En otra modalidad específica, dicha población de células se aisla de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas, utils en las composiciones y los métodos propocionados aquí son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, y HLA-G+ son adicionalmente CD34 , CD38 , o CD45 . En iotra modalidad especificam, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34 , CD38 , y CD45 . En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente 0CT-4+. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD200+. En una modaldiad más específica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34~, CD38~, CD45~, OCT-4+, y CD200+. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ facilitan la formación de cuewrpos similares a embrioides en una población de células plaentarias que comprenden dichas células, ccuando la población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ se aislan de las células plaentarias que no son las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ se aislan de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En iotra modalidad, una población de células, útil en las composciions y los métodos propocionados aqui, es una poblacon de células que comprende, por ejepplo, es decir, enriquecida para, células placentarias aisladas CD73+, CD105+, y HLA-G+. en varias modalidades, al menos aproximadamente 105 al menos aproximadamente 205, al menosa aproximadamente 30%, al menosa aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de elulas son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 90%, 95%, o 99% de las células en dicha población son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En una modalidad especifica de las poblaciones anteriores, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34 , CD38 , o CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+, son adicionalmente CD34 , CD38 , CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente OCT-4+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34~, CD38~, CD45~, OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, dicha población de células se asila de las células placentarias que no son CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aqui, son CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares de embrioides, en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células CD73+, CD105+, cuando dicha población se cultiva bajo las condiciones que permiten la formación de cuerpos similares de embroides. En otra modalidad especifica dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34~, CD38~, o CD45~. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicicionalmente CD34 , CD38 y CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente 0CT-4+. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente OCT-4+, CD34 , CD38~, y CD45 . En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ se aislan de las células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ se aislan de las células placentarias que no expresan estas características .

En otra modalidad, una población de células, útil en las composicones y los métodos poprorcionados aquí, se una población de células que comprende, o ejemplo, que está enriquecida para, células placentarias aisladas que son CD73+, CD105+, y facilita la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células, cuando dicha población se cultiva bajo las condiciones que permitan la formación de cuerpos similares a embrioides. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20_5, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 405, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximdamente 60% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 905, 95% o 995 de las células en dicha población de células son dichas ipoc CD73+, CD105+. En una modalidad especifica de las poblaciones anteriores dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente d34, CD38 , o CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34 , CD38 , y CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente OCT-4+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, son adicionalmente CD200+. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34~, CD38~, CD45~, OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, dicha población se aisla de, las células placentarias que no son dichas células placentarias CD73+, CD105+. En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En otras modalidades, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos proporcionadoa qui, son OCT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células cuando se cultivan bajo las condiciones que permitan la formación de los cuerpos similares a embrioides. En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adiiconalmente CD34 , CD38 , o CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD73+, CD105+, CD200+, CD34~, CD38 y CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ sse aislan de las células placentarias que no son células placentarias 0CT-4+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias OCT-4+ se aislan de las células placentarias que no expresan estas características .

En otra modalidad, una población de células, útil en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, es una población de células que comprende, por ejemplo, que está enriquecida para, células placentarias aisladas que son 0CT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias aisladas que comprende dichaas células cuando dicha población se cultiva bajo las condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al memnos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 405, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas 0CT-4+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas OCT-4+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 805, 90%, o 95% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas OCT-4+. En una modalidad especifica de las poblaciones anteriores, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son adicionalmente CD34 , CD38 , o CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son adicionalmente CD34 , CD38 , y CD45 . En otra modalidad, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra modalidad, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD73+, CD105+, CD200+, CD34 , CD38 , y CD45 . En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla de las células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad específica, dicha población de células se aisla de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son uno o más de CD10+, CD29+, CD34~, CD38 , CD44 + , CD45 , CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3~, SSEA4~, OCT-4 + , MHC-I+, o ABC-p+. en una modalidad específica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34~, CD38~, CD44 +, CD45~, CD54 + , CD90+, SH2+, SH3+, SH4 +, SSEA3 , SSEA4 , y 0CT-4+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD10\ CD29+, CD34~, CD38~, CD45~, CD54+, swh2, SH3+, y SH4+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD29+, CD34_, CD38~, CD45~, CD54+, SH2+ , SH3+, SH4+, y 0CT-4+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34~, CD38~, CD44 +, CD45~, CD54 +, CD90+, HLA-1+ , SH2+, SH3+, SH4+ . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, y ABC-p+. en otra modalidad, las células placentarias aisladas son SH2+, SH3+, SH4+ y 0CT-4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34~, SSEA3~, y SSEA4~. En otra modalidad, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+, CD34 , SSEA3~, y SSEA4~ son adicionalmente CD10+, CD29+, CD44+, CD45 , CD54+, CD90+, SH2+ , SH3+, y SH4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas so 0CT-4+ y CD34 , cualquiera de SH3+ o SH4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD34~, y ya sea CD10+ , CD29+, CD44 + , CD54+ , CD90+, u 0CT-4 + .

En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aquí son células placentarias aisladas CD10+, CD34 , CD105+ y CD200+. En otra modalidad, una población de células útil en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, es una población de células que comprende células placentarias, en donde al menosa aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos a aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de dicha población de célula son células placentarias aisladas CD10+, CD34 , CD105+, CD200+. En una modalidad especifica de las modalidades antewriores, dichas células placentarias son adicionalmente CD90+ y CD45 . En una modalidad especifica dichas células placentarias o la población de células placentarias se aislan de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias o la población de células placentarias se aislan de las células placentarias que no expresan estas características. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas son de origen no materno. En otra modalidad, al mensoa aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de dichas células en dicha población aislada de células placentarias, no son de origen materno.

En otra modalidad específica de dichas células placentarias aisladas o poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, dichas células o la población han sido expandidas, por ejemplo, se hacen pasar al menos aproximadamente, o no más de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces, o proliferadas por al menos, aproximadamente, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones de la población. En otra modalidad especifica de las células placentarias aisladas, o las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, que se describen aquí, dichas células placentarias aisladas son de oruigen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal) .

En otra modalidad, las células placentarias, útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aquí son OCT-4+ . Y facilitan la formación de uno o ma cuerpos similares de a embrioides en una población de dichlas células placentarias aisladas cuando se cultivan bajo las condiciones que poermiten la formación de los cuerpos similares a embrioides. En una modalidad especifica, dichas células placentarias son CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias son CD34 , CD38 o CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias son CD200+. En una modalidad más especifica, dichas co son CD73+, CD105+, CD200+, CD34 , CD38 , y CD45 . En otra modalidad especifica, dichas células se aislan de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias se aislan de las células placentarias que no expresan estas características.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos proprocionados aquí son células placentarias aisladas HLA-A,B,C , CD45 , CD133 , y CD34 . En otra modalidad, una población de células, útil en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, es una población de células que comprende células placentarias aisladas, en dodde al menoa aproximadamente 70%, al menos aproximdamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al meno aproximadamente 95%, al menos aproximdamente 99% de las células en dicha población aislada de células son células placentarias aisladas HLA-A, B, C , CD45 , CD133 , y CD34 . En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas se aisla de las células placentarias que no son HLA-A, B,C , CD45 , CD133 , y CD34 . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no son de origen materno. En otra modalidad especifica, dicha población aislada de células placentarias está substancialmente libre de componentes maternos, por ejemplo, al menos aproximadamente 40%, 45%, 5-0%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población aislada de células placentarias no son de prigen materno.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos de quim son células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45~, CD117 , y CD133 . En otra modalidad, una población de células útil en las composiciones y los métodos proporcionados aquí es una poblaciond de células que comprende células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximdamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45~, CD117~, y CD133~ aisladas. En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas se aisla de células placentarias que no son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad, dichas células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45 , CD117 , y CD133 no son de origen materno, es decir, tienen el genotipo fetal. En otra modalidad, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 6%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas en dicha población de células placentarias no son de origen materno. En otra modalidad especifica dichas células placentarias de la población de células placentarias aisladas se aislan de las células placentarias que no expresan estas características .

En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos prpoporcionados aquí, son células placentarias aisladas CD10+, CD33+, CD44+, CD45 , y CD117 . En otra modalidad, una población de células útil en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, es una población de células que comprende, por ejemplo, enriquecida por, las células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximdamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD10+, CD33+, CD44+, CD45 y CD117 . En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas se aisla de las células placentarias que no son dichas células, en otra modalidad, dichas células placentarias aisladas son de origen no materno, en otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células son de origen no materno. En otra modalidad espefificam dichas células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas se aisla de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiocions y los métodos proporcionados aquí, son células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45 i CD117 . En otra modalidad, una población de célula sutil en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, es una población de células que comprende, por ejemplo, enriquecida por, las células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD45 , y CD117 , en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menosa aproximadamente 99% de las células en dicha población son células placentarias CD10+, CD13+, CD33+, CD45 , y CD117 . En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas se aislan de las células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas son de origen no materno. En otra modalidad, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95% 98% o 99% de dichas células en dicha población de células son de origen no materno. En otra modalidad especifica dichas células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas se aisla de las células placentarias que no expresan estas características.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, son HLA-A, B , C , CD45 , CD34 , y CD133 , y adicionalmente son CD10+, CD13+, CD38~, CD44 +, CD90+, CD105+, cd22 y/o HLA-G+, y/o negativas para CD117. En otra modalidad, una población de células útil en las composiciones y los método proporcionado aquí es una población de células que comprende células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o aproximadamente 99% de las células en dicha población son células placentarias aisladas que son hla-abe, CD45 , CD34 , CD133 , y que son adicionalmente positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativas para CD117. En una modalidad especifica, dichas células placenterías aisladas o la población de células placentarias aisladas se aislan de las poblaciones que no son dichas células. En otra modalidad, dichas células placentarias aisladas no son de origen materno. En otra modalidad, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%,' 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas de en dicha población de células son de origen no materno. En otra modalidad especificam dichas células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas se aislan de las células placentarias que no expresan estos marcadores.

En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, son células placentarias aisladas que son CD200+, y CD10+, cuando se determina por enlazamiento de anticuerpos, y CD117 , cuando se deetmrina tanto por enlazamiento dew anticuerpos y RT-PCR. En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, son células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias y células placentarias multipotentes, que son CD10+, CD29+, CD54+, CD200+, HLA-G+, HLA clase I+ y ß-2-microglobulina . En otra modalidad, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aquí, son células placentarias en donde la expresión de al menos un marcado celular es al menos dos veces mayor que para un tipo de células mesenquimales (por ejemplo, células mesenquimales derivadas de la medula ósea) . En otra modalidad, dichas células placentarias aisladas son de porigen no materno. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas de en dicha población de células son de origen no materno.

En otra modalidad, células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aqui, son células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias, o células placentarias multipotentes , que son uno o más de CD10+, CD29+, CD44 +, CD45~, CD45/ICAM+, CD62-E~, CD62-L~, CD62-P~, CD80~, CD86~, CD103~, CD104~, CD105+, CD106/VCAM+, CD144 /VE-caderinainferior, CD184 /CXCR4~, ß2-microglobulinainferior, MHC-Iinferior, MHC-? , HLA-Ginferior , y/o PDLlinferior . En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD29+ y CD54+ . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD44+ y CD106+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD29+.

En otra modalidad, una población de células, útil en las composiciones y los métodos proporcionados aqui, comprende células placentarias aisladas, y al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población son células placentarias aisladas que son uno o más de CD10+, CD29+, CD44+, CD45~, CD54/ICAM+, CD62-E_, CD62-L", CD62-P~, CD80~, CD86~, CD103~, CD104~, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinainferior, CD184/CXCR4~, p2-microglobulinainferior, MHC-!inferior^ MHC-II~, hlaginferior, y/o PDLlinferior . en una modalidad más especifica, al menos 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 95%, 98% o 99% de las CD45/ICAM+ en dicha población de cfelulas son CCR3, CD105+, CD117~, CD13+, CD54/ICAM+, CD62-E~, CD62-L~, CD62-P~, CD80~, CD86~, CD103~, CD104~, cdql05, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinainferior, CD184/CXCR4~, 2-microglobulinainferior, MHC- Iinferior, MHC-? , HLA-G+, y PDLlinferior .

En ciertas modalidades de las células placentarias aisladas, dichas células placentarias aisladas no se diferencias durante el cultivo en medio de crecimiento, es decir, el medio formulado para promover la proliferación, por ejemplo, durante la proliferación en el medio de crecimiento. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no requieren una capa alimentaria con el fin de proliferar. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no se diferencian durante el cultivo en ausencia de una capa alimentadora, solamente debido a la carencia de una capa de células alimentadoras .

En iotra modalidad, las células, útiles en las composciones y los métodos proporcionadoas aquí, son células placentarias aisladas, en donde una pluralidad de dichas poblaciones son positivas para la aldehido deshidrogenasa (ALDH) , cuando se evalúa por un ensayo de actividad de aldehido deshidrogenasa. Tales ensayos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Bostian y Betts, Biochem. J. , 173,787, (1978)). En una modalidad especifica, dicho ensayo de ALDH usa ALDEFLUOR® (Añdagen, Inc., Ashland, Oregon) ciomo un marcador de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. En una modalidad especifica, dicha pluralidad está entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de las células en dicha población de células. En otra modalidad, aquí se proporciona una población de células del cordón umbilical aisladas, por ejemplo, células del cordón umbilical aisladas, multipotentes , en donde una pluralidad de dichas células del cordón umbilical aisladas son positivas para la aldehido deshidrogenasa, cuando se evalúa por un ensayo de actividad de la aldehido deshidrogenasa que usa ALDEFLUOR® como un indicador de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. En una modalidad especifica, dicha pluralidad está entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de las células en dicha población de células. En otra modalidad, dicha población de células placentarias aisladas o de células del cordón umbilical aisladas muestra al menos tres veces, o al menos cinco veces mayor actividad que una población de células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea que tenga aproximadamente el mismo número de células y cultivada bajo las mismas condiciones.

En otra modalidad especifica de dichas células placentarias aisladas o poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, dichas células o poblaciones han sido expandidas, por ejemplo, se hace pasar al menos, aproximadamente, o no más que, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces, o proliferadas por al menos aproximadamente, o no más que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones de la población. En otra modalidad especifica de las células placentarias aisladas, o las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, que se describen aquí, dichas células placentarias aisladas son de origen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal) .

En una modalidad especifica de cualquiera de as células placentarias aisladas o las poblaciones de células de células placentarias aisladas, el cariotipo de las células, o al menos 95% o aproximadamente 99% de las células en dicha población, es normal. En otra modalidad especifica de cualquiera de las células placentarias o las poblaciones de células anteriores, las células, o las células en la población de células, son de origen no materno.

Las células placentarias aisladas, o las poblaciones de células placentarias aisladas, que contienen alguna de las combinaciones de marcadores anteriores, pueden ser combinadas en cualquier proporción. Dos o más cualquiera de las poblaciones de células placentarias anteriores pueden ser combinadas para formar una población de células placentarias aisladas. O ejemplo, una población de células placentarias aisladas puede comprenden una primera población de células placentarias aisladas definida por una de las combinacions de marcadores descritas anteriormente, y una segunda población de células placentarias aisladas definida por otra de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente, en donde dicha primera y segunda poblaciones se combinan en una proporción de aproximadamente 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, o aproximadamente 99:1. De modo similar, tres, cuatro o más cualquiera de los tipos de células placentarias aisladas o las poblaciones de células placentarias aisladas descritas anterioremente pueden ser combinados .

Las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos propocionados aqui, pueden ser obtenidas, por ejemplo, por la desintegración del tejido de la placenta, con o sin digestión enzimática (véase, la Sección 5.4.3) o perfusión (véase la sección 5.4.4) . Por ejemplo, las poblaciones de células placentarias aisladas puedeen ser producidas de acuerdo con un método que comprende perfundir una placenta de mamífero que ha sido drenada de la sangre del cordón y perfundida para extraer la sangre residual; perfundir dicha placenta con una solución de perfusión; y recolectar duicha solución de perfusión, en donde dicha solución de perfusión después de la perfusión, comprende una población de células placentarias que comprende células placentarias aisladas; y aislar una pluralidad de dichas células placentarias aisladas de dicha población de células. En una modalidad específica, la solución de perfusión se pasa a través tanto de la vena umbilical y las arterias umbilicales y se recolecta después que esta se exuda de la placenta. En otra modalidad especifica, la solución de perfusión se pasa a través de la vena umbilical y se recolecta de las arterias umbilicales, o se pasa a través de las arterias umbilicales y se recolecta de la vena umbilical.

De varias modalidades, las células placentarias aisladas, contendías dentro de una población de células obtenida por perfusión de una placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de dicha población de células placentarias. En otra modalidad específica las células placentarias aisladas recolectadas por perfusión comprenden células fetales y maternas. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas recolectadas por perfusión son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% células fetales.

En otra modalidad especifica, aquí se proporciona una composición que comprende una población de las células placentarias aisladas, como se describe aquí, recolectada por perfusión, en donde dicha composición comprende al menos una porción de la solución de perfusión usada para recolectar las células placentarias aisladas.

Las poblaciones aislasdas de las células placentarias aisladas descritas aqui pueden ser producidas digiriendo el tejido de la placenta con una enzima de desintegración de tejidos para obtener una población de células placentarias que comprende las células, y aislando, o aislando sustancialmente, una pluralidad de las células placentarias del resto de dichas células placentarias. El total, o cualquier parte de, la placenta puede ser diferida para obtener las células placentarias aisladas descritas aqui. En modalidades especificas, por ejemplo, dicho tejido placentario puede ser una placenta completa, una membrana amniótica, el corion, una combinación del amnios y el corion, o una combinación de cualquiera de las anteriores. En otra modalidad especifica, la enzima de desintegracoon de tejidos es tripsina o colagenasa. En varias modalidades, las células placentarias aisladas contenidas dentro de la población de células obtenidas por la digestión de la placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de dicha población de células placentarias.

El perfil genético confirma que las células placentarias aisladas, y las poblaciones de células placentarias aisladas, son distingibles de otras células, por ejemplo, las células madre mesenquimales , o ejemplo, las células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea. Las células placentarias aisladas descritas aquí pueden ser distingudas de, por ejemplo, las células madre mesenquimales sobre la base de la expresión de uno o más genes, al expresión de los cuales es significativamente mayor en las células placentarias aisladas, o en ciertas células- madre del cordón umbilical aisladas, en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea. En patrticular, las células placentarias aisladas, útiles en las composiciones y los métodos propocionados aquí, pueden ser distinguidas de las células madre mesenquimales sobre la base de la expresión de uno o más genes, la expresión de los cuales es significativamente mayor (es decir, al menos dos veces mayor) en las células placentarias aisladas que en un número equivalente de células madre mesenquiomales derivadas de la medula ósea, en donde eol uno o más genes son ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2 , F2RL1, FLJ1078 1, GATA6 , GPR126, GPRCSB, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKI, PCDH7 , PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC 12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, o una combinación de cualquiera de los anteriores, cuando las células se cultivan bajo las condiciones equivalentes. Véase, por ejemplo, la Publicación de la solicitud de Patente Norteamericana No. 2002/0275362, al descripción de la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas expresan dicho uno o más genes cuando se cultivan durante aproximdamente 3 a aproximadamente 35 duplicaciones de la población en un medio que comprende DMEM-LG (Gico) ; 3% de sueso fetal de becerro (Hyclone Labs) ; lx insulina-transferina-selenio (ITS) ; lx ácido linoleico-albumuna de suero de bovino (LA-BSA) ; dexametasona 10"9 M (Sigma) ; ácido ascporbico 2-fosfato 10"4 M (Sigma); 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (R&D Systems) ; y 10 ng/mL de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-BB) (R&D Systems) . En una modalidad especifica, el gen específico de las células placentarias aisladas o especifico de las células del cordón umbilical aisladas es CD200.

Las secuencias espewcificas para estos genes pueden ser entontradas en los números de acceso del GenBank nos. NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIG02), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6) , BC008396 (BCHE) , BC020196 (Cllorf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_O01846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3) , NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2 ) , AY336105 (F2RL1), N _018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6) , BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRCSB) , AF340038 (ICAMI), BC000844 (IER3), BC066339 ( IGFBP7 ) , BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRTS), BC060825 (LIPG) , BC065240 (LRAP) , BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST) , BC068455 (NFE2L3 ) , N _014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 ( RT 1 ) , BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6) , BC001201 (ST6GALNACS) , BC126160 o BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN) , y BC005001 (ZC3H12A) a partir de mnarzo de 2008.

En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas expresan cada uno de ACTG2 , ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B GAL 6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4 DMD, DSC3 , DSG2, ELOVL2 , F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRCSB, HLA-G, ICAMI, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2 , RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNACS , SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesewnquimales derivadas de la médula ósea, cuando las células se cultivan bajo condiciones equivalentes.

En modalidades más especificas, las poblaciones de células placentarias pueden ser seleccionadas al seleccionar las células placentarias que expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un tipo de célula madre mesenquimales derivadas de la medula ósea, en donde dicho uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste de ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE , Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4 , DMD, DSC3 , DSG2 , EL0VL2 , F2RL1 , FLJ10781, GATA6 , GPR126, GPRCSB, HLA-G, ICAMI, IER3, IGFBP7 , ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3 , NUAK1 , PCDH7 , PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNACS, SLC12A8 , TCF21, TGFB2, VT , y ZC3H12A, y en donde dichas células madre derivadas de la medula osea han experimentado un número de pasos en un cultivo equivalente al número de pasos que han experimentado dichas células placentarias . En una modalidad más específica, dicha selección comprende seleccionar las células que expresan ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ1078 1, GATA6 , GPR126, GPRCSB, HLA-G, ICAMI, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18 , KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNI, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNACS, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel detectablemente mayor que las células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea.

La expresión de los genes citados anteriormente puede ser evaluada mediante las técnicas estándar. Por ejemplo, sondas usadas sobre la secuencia del (de los) gen (es) pueden ser seleccionadas y construidas individualmente mediante las técnicas convencionales. Las expresión de los genes puede ser evaluada por ejemplo, en un microarreglo que comprende sondas para uno o más de los genes, por ejemplo, un arreglo U133A 2.0 de Genoma Humano Affymetrix GENECHIP®, o un U133 Plus 2.0 de Genoma Humano Affymetrix GENECHIP® (Santa Clara California) . La expresión de estos genes puede ser evaluada aun si la secuencia para un número de acceso particular al GenBank se enmienda, puesto que se pueden generar sondas especificas para la secuencia enmendada usando técnicas estándar bien conocidas.

El nivel de expresión de estos genes puede ser usado para confirmar la identidad de una población de células placentarias aisladas, para identificar una población de células por comprender al menos una pluralidad de células placentarias aisladas, o las similares. Las poblaciones de células placentarias aisladas, la identidad de las cuales se confirma, pueden ser clónales, por ejemplo, poblaciones de células placentarias aisladas expandidas a partir de una célula aislada individual, o una población mezclada de células madre, por ejemplo, una población de células que comprende solamente células placentarias aisladas que se expanden a partir de múltiples células placentarias aisladas, o una población de células que comprende las células placentarias aisladas, como se describen aqui, y al menos otro tipo de células.

El nivel de expresión de estos genes puede ser usado para seleccionar poblaciones de células placentarias aisladas. Por ejemplo, una población de células, por ejemplo, células expandidas clonalmente, pueden ser seleccionadas si la expresión de uno o más de los genes listados anteriormente es significativamente mayor en una muestra de la población de células que en una población equivalente de células madre mesenquomales . Tal selección puede ser de una población de una pluralidad de poblaciones de células placentarias aisladas, de una pluralidad de poblaciones de células, la indentidad de las cuales no se conoce, etc.

Las células placentarias aisladas pueden ser selecciojnadas sobre la base del nivel de expresión de uno o más de tales genes en comparación con el nivel de expresión en dichos uno o más genes en, por ejemplo, un controld de células madre mesenquimales, por ejemplo, el nivel de expresión en dicho uno o más genes en un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea. En una modalidad, el nivel de expresión de dichos uno o más genes en una muestra que comprende un número equivalente de células madre mesenquimales se usa como un control. En otra modalidad, el control para las células placentarias aisladas evaluadas bajo ciertas condiciones, es un valor numérico que representa el nivel de expresión de dichos uno o más genes en las células madre mesenquimales bajo dichas condiciones.

Las células placentarias aisladas descritas aquí expresan las características anteriores (por ejemplo, combinaciones de marcadores de la superficie celular y/o perfiles de expresión de genes) en el cultivo primario, o durante la proliferación en un medio que comprende, por ejemplo, DME -LG (Gibco) , 2% de suero de bovino fetal (FCS) (Hyclone Laboratories), lx insulina-transferrina, selenio (ITS), lx ácido lenolénico albúmina de suero de bovino (LA-BSA) , dexametasona 10~9 M (Sigma) , ácido ascórbico 2-fosfato 10"4 M (Sigma) , 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (R&D Systems), qlO ng/mL de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-BB) (R&D Systems), y 100U de penicilina/lOOOU estreptomicina.

Las poblaciones aisladas de células placentarias descritas anteriormente, y las poblaciones de células placentarias aisladas en general, pueden comprender al menos, o no más que, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células placentarias aisladas. Las poblacions de células placentarias aisladas útiles en las composiciones y los métodos proporcionados aquí comprenden al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 98%, o 99% de células placentarias aisladas viables, cuando se determina, por ejemplo, por exclusión de azul de tripán. 5.3.3. Crecimiento en Cultivo El crecimiento de las células placentarias aisladas descritas aquí, como para cualquier tipo de células de memifero, depende en parte del medio particular selñeccionado para el cultivo. Bajo las condiciones óptimas, las células placentarias aisladas típicamente se duplican en 3-5 días. Durante el cultivo, las células placentarias aisladas descritas aquí se adhieren a un sustrrato en el cultivo, por ejemplo, la superficie de un recipiente de cultivo de tejidos (por ejemplo, plástico del plato de cultivo de tejidos, plástico revestido con fibronectina , y los similares) y forma una monocapa .

Las poblaciones de células placentarias aisladas descritas aquí, cuando se cultivan bajo las condiciones apropiadas, forman cuerpos similares a embrioides, es decir, racimos de células tridimensionales, que crece encima de la capa de células madre aderentes . Las células dentro de los cuerpos similares a embrioides expresan los marcadores asociados con las células madre muy tempranas, por ejemplo, OCT-4, Nanog, SSEA3, y SSEA . Las células dentro de los cuerpos similares a embrioides típicamente no son adherentes al sustrato de cultivo, como son las células células placentarias aisladas descritas aquí, sino que permanecen unidas a las cewluilas adherentes durante el cultivo. Las células de los cuerpos similares a embrioides dependen de las células placentarias aisladas adherentes para la viabilidad, ya que los cuerpos similares a embrioides no se forman en ausencia de las células placentarias aisladas adherentes, las ICPO adherentes facilitan por lo tanto el crecimiento de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprenden las células placentarias aisladas adherentes. Sin desear estar comprometidos por la teoría, se piensa que las células de los cuerpos similares a embriodes crecen sobre las células placentarias aisladas tanto como las células madre embrionarias crecen sobre una capa alimentadora de células. Las células madre mesnquimales , por ejemplo, las célula madre mesenquimales derivadas de la medula ósea, no desarrollan cuerpos similares a embrioides en el cultivo. 5.3.4. Células Madre Pacentarías Hematopoyéticas En ciertas modaldiades, las células placentarias aisladas son células placentarias CD34+, por ejemplo, células placentarias hematopoyéticas. Tales células CD34+, sin embargo, no están abarcadas por el término "multipotente" como se usa aquí. Tales células se pueden obtener del tejido placentario, o ejemplo de una placenta que ha sido drenada de sangre del cordón y perfundida para extraer la sangre residual. En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas CD34+ son CD38+. En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas CD34+ son CD38+. En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas son CD45+. En una modalidad específica, las células placentarias aisladas son CD34+, CD38+, y CD45+. 5.3.5. Células de Per usado de Placenta En ciertas modalidades, las células de las composiciones proporconadas aquí, formuladas mediante los métodos propocionados aquí, son células obtenidas de perfusado de placenta. Como se usa aquí las "células obtendias de perfusado de placenta" incluyen células nucleadas totales obtenidas de, por ejemplo, aisladas de, perfusado de placenta, un subconjunto de células nucleadas obtenida de perfusado de placenta, o células cultivadas de células obtenidas directamente de perfusado de placenta. El perfusado de placenta puede ser obtenido de una placenta que ha sido drenada de la sange del cordón y perfundida para extraer la sangre residual, antes de la perfusión, para obtener las células placentarias . El perfusado de placenta puede ser obtenido de una placenta que ha sido drenada de la sangre del cordón pero no perfundida par extraer la sangre residual. El perfusado de placenta puede ser obtenido de una placenta que ha sido drenada de la sangre del cordón pero no perdundida para extraer la sangre residual. En las dos ultimas modalidades, las células placentarias, por ejemplo células nucleadas de perfusado de placenta, por ejemplo, células nucleadas totales del persuado de placenta, comprenden células nucleadas de la sangre de la placenta y/o de la sangre del cordón. Los métodos para obtener el perfusado de la placenta, y las células del perfusado de placenta se describen en la Sección 5.4.4, a continuación. 5.4 MÉTODOS PARA OBTENER LAS CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS 5.4.1 Composición de Recolección de Células Madre Aqui se proporcionan además métodos para recolectar y aislar las células placentarias, ppor ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la Sección 5.2 anterior. En general, tales células se obtienen de una placenta de mamífero usando una solución aceptable fisiológicamente, por ejemplo, una composición de recolección de células madre. Una composición de recolección se describe en detalle en la Publicación de Solicitud de la Patente Norteamericana relacionada No. 2007/0190042, titulada "Improved Médium for Collecting Plascental Stem Cell and Preserving Organs".

La composición de recolección de células puede comprender cualquier solución aceptable fisiológicamente adecuada para la recolección y/o el cultivo de células, por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas aquí, por ejemplo, una solución salina (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, solución de Krebs, solución de Krebs modificada, Solución de Tagle, NaCl al 0.9%, etc.), un medio de cultivo (por ejemplo, DMEM, H.DMEM, etc.), y las similares.

La composición de recolección de células puede comprender uno o más componentes que tienden a consrvar las células placentarias aisladas, es decir, evitan que las células placentarias aisladas mueran, o retarda la muerte de las células placentarias aisladas, reducen el número de células placentarias aisladas en una población de cfelulas que mueren, o los similares, desde el momento de la recolección al momento del cultivo. Tales componentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de la apoptosis (por ejemplo, un inibidor de caspasa o un inhibidor de JNK) ; un vasoldilatador (por ejemplo, sulfato de magnesio, un fármaco antihipertensivo, un póptido natriuretico atrial (ANP) , adrenocorticotropina, hormona de liberación de corticotropina, nitroprusiato de sodio, hidralazida, adenosin trifosfato, adenosina, indometacina, o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc. ) , un inhibidor de necrosis (por ejemplo, 2- (lH-indol-3-il) -3-pentilamino-maleimida , pirrolidina, ditiocarbamato, o clonazepam) ; un inibidor de TNA-OÍ, y/o un perfluorocarbono que transporta oxigeno (por ejemplo, bromuro de perfluorooctivo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).

La composición de recolección de células puede comprender uno o más enzimas de degradación de tejidos, por ejemplo, metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, una RNasa, o una DNasa, o las simolatres. Tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, colagenasas Q (por ejemplo, colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispara, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASA, hualuronidasa, y las similares.

La composición de recolección de células puede comprender una cantidad bactericidamente o bacterioestáticamente efectiva de un antibiótico. En ciertas modalidades no limitantes, eol antibiótico es un macrólido (por ejemplo, tobramicina) , una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o . cefadroxil), una claritromicina, una eritromicina , una penicilina (por ejemplo, penicilina V) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina, ciprofloxacina, o norfloxacina ) , una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una modalidad particular, eol antibiótico es activo contra bacterias Gram(+) y/o Gram(-), o ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y las similares .

La composición de recolección de células también puede comprender uno o más de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM) ; D-glucosa (aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM) / iones magnesio (aproximadamente lmM a aproximadamente 50 mM) ; una macromolecula de peso molecular mayor que 20,000 dalton, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y la viabilidad celular (por ejemplo, un coloide de formación natural o sintético, un polisacáridos tal como dextrano o un polietilenglicol presente a aproximadamente 25 g/1 a aproximadamente 100 g/1, o aproximadamente 40 g/1 a aproximadamente 60 g/19; un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, vitamina C o vitamina De presentes a aproximadamente 25 µ? a aproximadamente 100 µ?) ; un agente reductor (por ejemplo, N-acetilcisteina presemnte a aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 5 mM) ; un agente que evita la entrada del calcio hacia las células (por ejemplo, verapamilo presente a aproximadamente 2 µ? a aproximadamente 2.5 µ?) ; nitroglicerina (por ejemplo, aproximadamente 0.05 g/L a aproximadamente 0.2 g/L); un anticoagulamnte, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para ayudar a evitar la coagulación de la sangre residual (por ejemplo, heparina o hirundina presente a una concentración de aproximadamente 1000 unidades/1 a aproximadamente 100,000 unidades/1) ; o un compuesto que contiene amilorida (por ejemplo, amilorida, etil isopropoil amilorida, hexametilen amilorida, dimetil amilorida, o isobutil amilorida presente a aproximadamente 1.0 µ? a aproximadamente 5 µ?) . 5.4.2 Recolección y Manejo de la Placenta En general, las placentas humanas se recuperan poco después de su expulsión después del nacimiento. En una modalidad preferida, la placenta se recupera de un paciente después del consentimiento informado y después que se toma un historial médico completo del paciente y se asocia con la placenta. Preferiblememnte , el historial médico continúa después del alumbramiento. Tal historial médico puede ser usado para coordinar el uso posterior de la placenta o de las células madre recolectadas de la misma. Por ejemplo, las células madre placentarias humanas pueden ser usadas, a la luz del historial médico, para medicida personalizada para el infante asociado con la placenta, o para los padres, hermanos u otros parientes del infante.

Antes de la recuperación de las células placentarias aisladas, se extrae la sangre del cordón umbilical y la sangre de la placenta. En ciertas modalidades, después del alumbramiento, se recupera la sangre del cordón en la placenta. Típicamente se usa una aguja o cánula, con la ayuda de la gravedad, para exsanguinar la placenta (véase, por ejemplo, Anderson, Patente Norteamericana No. 5,372,581; Hessel et al., Patente Norteamericana No. 5,415,665) . La aguja o la cánula usualmente se coloca en la vena umbilical y la placenta puede ser masajeada suavemente para ayudar en el drenado de la sangre del cordón desde la placenta. Tal recuperación de la sangre del cordón puede ser realizada comercialmente, por ejemplo, LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry y Cryocell. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulación adicional para minimizar la alteración del tejido durante la recuperación de la sangre del cordón.

Típicamente, una placenta se transporta desde la sala de partos a otra ubicación, por ejemplo, un laboratorio, para la recuperación de la sangre del cordón y la recolección de las células madre, por ejemplo, mediante perfusión o disociación del tejido. La placenta se transporta preferibelemte en un dispositivo de transporte estéril, aislado térmicamente (que mantiene la temperatura de la placenta entre 20-28°C) , por ejemplo, colocando la placiente, con el cordón umbilical engrapado en el extremo próximo, en una bolsa plástica d cierre a presión, la cual se coloca entonces en un recipiente aislado. En otra modalidad, la placenta se transporta en un equipo de recolección de sangre del cordón substancialmente como se describe en la Patente Norteamericana en tramite no. 7,147,626. Preferiblemente, la placenta se entrega al laboratorio veinticuatro horas enseguida del alumbramiento. En ciertas modalidades, el extremo próximo del cordón umbilical se engrapa, preferiblemente en un intervalo de 4-5 cm (centímetros) de la inserción en el disco placentario antes de la recuperación de la sangre del cordón. En otras modalidades, el extremo próximo del cordón se engrapa después de la recuperación de la sangre del cordón pero antes del procesamiento posterior de la placenta.

La placenta, antes de la recolección de las células, puede ser almacenada bajo condiciones estériles y ya sea a la temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados) . La placenta puede ser almacenada por un periodo de cuatro a veinticuatro horas, hasta cuarenta y ocho horas, o más de cuarenta y ocho horas, antes de perfundir la placenta para extraer toda la sangre residual. En una modalidad, la placvemta se recolecta entre las cerp horas a aproximadamente dos horas después de la expulsión. La placenta se almacena preferiblemente en una solución anticoagulante a una temperatura de 5 a 25°C (centrigrados) . Las soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede ser usada una solución de heparina o warfarina. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante comprende una solución de heparina (or ejemplo, 1% p/p en de solución 1:1000). La placenta exsanguinada se almacena preferiblemente por no más de 36 horas antes que se recolecten las células placentarias .

La placenta de mamífero o parte de la misma, una vez recolectada y preparada en general como se indica anteriormente, puede ser tratada en cualquier manera conocida en la técnica, por ejemplo, puede ser perfundida o desintegrada, por ejemplo, digerida con una o más enzimas de desintegración de tejidos, para obtemner las células placentarias aisladas. 5.4.3 Desintegración Física y Digestión Enzimática del Tejido Placentario En una modalidad, las células madre se recolectran de una placenta de mamífero mediante desintegración física de parte o todo el órgano. Por ejemplo, la placenta o una porción de la misma pueden ser, por ejemplo, trituradas, cortadas, picada, maceradas o los similares. El tejiodo puede ser cultivado entonces para obtener una población de células placentarias aisladas. Típicamente, el tejido pacentarlo se desintegra usando, por ejemplo, en, una composición de recolección de células placentarias (véase, la Sección 5.2 y lo siguiente) .

La placenta puede ser diseccionada en sus cpomponentes antes de la desintegración física y/o la digestión enzimática y la recuperación de las células madre. Las células madre placentarias pueden ser obtenidas de toda o una porción de la membrana amniótica, el corion, el cordón umbilical, los cotiledones placentarios, o cualquier combinación de los mismos, incluyendo de una placenta completa. Preferiblemente, las células placentarias aisladas se obtienen del tejido placentario que comprende el amnios o el corion. Típicamente, las células placentarias aisladas se pueden obtener por desintegración de un bloque pequeño del tejido placentario, por ejemplo, un bloque del tejido pacentarlo que es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 milímetros cúbicos de volumen. Cualquier método de desintegración física puede ser usado, siempre que el método de desintegración deje una pluralidad, más preferiblemente la mayoría, y más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% de las células en dicho órgano, viables, cuando se determina por, por ejemplo, exclusión por azul de tripano.

En geenral las células madre pueden ser recolectadas de una placenta o una porción de la misma, en cualquier momento dentro de aproximadamente los primero tres días después de la expulsión, pero preferiblemente entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas después de la expulsión.

En una modalidad especifica, el tejido desintegración se cultiva en medio de cultivo de tejidos adecuado para la proliferación de las células placentarias aisladas (véase, por ejemplo, la Sección 5.5 a continuación, que describe el cultivo de las células placentarias aisladas) .

En otra modalidad especifica, la placenta aislada se recolecta por desintegración física del tejido de la placenta, en donde la desintegración física incluye digestión enzimática, la cual se puede lograr mediante el uso de una o más enzimas de digestión. La placenta, o una porción de la misma también puede se desintegrada físicamente y digerida con una o más enzimas, y el material resultante se sumerge entonces en, o se mezcla en, una composición de recolección de células .

Una composición de recolección de células preferida comprende una o más enzimas de desintegración de tejidos, por ejemplo, una combinación de una metaloproteasa de matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinación de colagenasa y adipasa. En una modalidad, la digestión enzimática del tejido de la placenta usa una combinación de metaloproteasa de matriz, una proteasa neutra, y una enzima mucolitica, para la digestión de ácido hialurónico, tal como una combinación de colagenasa, adiposa e hialuronidasa o una combinación de LIBERASE (Boehringer Mannheim corp., Indianápolis , Ind.) de hialuronidasa. Otras enzimas que pueden ser usadas para desintegrar el tejido de la placenta incluyen papaina, desoxiribonucleasas, serina proteasas, tales como tripsina, quimotripsina, o elastasa. Las serina proteasas pueden ser inhibidas por la alfa 2 microglobulinas en el suero y por lo tyanto, el medio usado para la digestión usualmente está libre de suero. La EDTA y ADNasa se usan comúnmente en los proOcedimeitnos de digestión por enzimas para aumentar la eficiencia de la recuperación de células. El digerido se diluye preferiblemente para evitar el atrapamiento de las células dentro del digerido viscoso.

Cualquier combinación de enzimas de digestión de tejidos puede ser usada. Las concentraciones típicas para las enzimas de digestión de tejidos incluyen, por ejemplo, 50-200 U/mL para la colagenasa 1 y la colageasa IV, 1-10 U/mL para la dispara, y 10-100 U/mL para la elastasa. Las proteasas pueden ser usadas en combinación, es decir, dos o más proteasas en la misma reacción de digestión, o pueden ser usadas secuencialmente con el fin de liberar las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias y las células placentarias multipotentes . Por ejemplo, en una modalidad, una placenta o parte de la misma, se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa O a aproximadamente 1 a aproximadamente mg/ml por ejemplo, durante 30 minutos, seguido por la digestión con tripsina, a una concentración de aproximadamente 0.25%, por ejemplo durante 10 minutos, a 37°C. Las serina proteasas se usan preferiblemete de forma consecutiva enseguida del uso de otras enzimas.

En otra modalidad, el tejido puede ser desintegrado adicionalmente mediante la adición de un quelador, por ejemplo, ácido etilenglicol bis (2-aminoetil éter ) -N, N, N' N' -tetraacetico (EGTA) o ácido et ilendiamintetracético (EDTA) a la composición de recolección de células, o a una solución en la cual se desintegra y/o se digiere el tejido antes del aislamiento de las células placentarias, con la composición de recolección de células.

Enseguida de la digestión, el digerido se lava, por ejemplo, tres veces con el medio de cultivo, y las células lavadas se siembran en Frascos de cultivo. Las células se aislan entonces mediante adherencia diferencial, y se caracterizan por ejemplo, por la viabilidad, marcadores superficiales, diferenciación, y las similares.

Se apreciara que cuando una placenta completa, o una porción de una placenta que comprende tanto células fetales y maternas (por ejemplo, cuando la porción de la placenta comprende el corion o los cotiledones) las células placentarias recolectadas comprenderán una mezcla de células placentarias , por ejemplo, células madre placentarias o células placentarias multipotentes , derivadas tanto de fuentes fetales y maternas. Cuando una porción de la placenta que no comprende, o que comprende un número despreciable de células maternas (por ejemplo, el amnios), las células placentarias recolectadas comprendenderán casi exclusivamente células placentarias fetales, por ejemplo, células madre placentarias o células placentarias multipotentes fetales.

Las células placentarias pueden ser aisladas del tejido desintegrado mediante tripsinizacion diferencial véase la sección 5.4.5 a continuación) seguido por cultivo en uno o más recipiets en medio de proliferación fresco, seguido opcionalmente por un segundo paso de tripsinizacion. 5.4.4 Perfusión de la Placenta Las células pacentarías, poOr ejemplo, las células madre placentarias o las células multipotentes placentarias, también pueden ser obtenidas por perfusión de la placenta de mamífero. Los métodos para perfundir las placentas de mamífero para obtener células placentarias se describen por ejemplo, en Hariri, Patentes Norteamericanas Nos. 7,045,148 y 7,255,729, y en la Publicación de la Solicitud de Patente relacionada No. 2007/0190042, cada una de las cuales se incorpora aquí en su totalidad .

Las células placentarias pueden ser recolectadas por perfusión, por ejemplo, a través de la vasculatura de la placenta, usando, por ejemplo, una composición de recolección de células como una solución de perfusión. En una modalidad, una placenta de mamífero se perfunde mediante el paso de la solución de perfusión a través de alguna o ambas de la arteria umbilical y la vena umbilical. El flujo de la solución de perfusión a través de la placenta puede ser logardo usando, por ejemplo, flujo por gravedad hacia la placenta. Preferiblemente, la solución de perfusión es forzada a través de la placenta usando una bomba, por ejemplo, una bomba peristáltica. La vena umbilical puede ser, por ejemplo, canulada, por ejemplo, con una cánula de TEFLÓN® o de plástico, es decir, se conecta a un aparato de conexión estéril, tal como una tubería estéril. El aparato de conexión estéril se conecta a un colector de perfusión.

Durante la preparación para la perfusión, la placebta se orinet aprefriblemete (por ejemplo, se suspende) de manera tal que la arteria umbilical y la vena umbilical se ubiquen en el punto más alto de la placenta. La placenta puede ser perfundida por el paso de un fluido de perfusión a través de la vasculatura de la placenta y el tejido circundante. La pacenta también puede ser perfundida por el paso de un fluido de perfusión en la vena umbilical y la recolección de las arterias umbilicales, o el paso de un fluido de perfusión hacia las arterias umbilicales y la recolección desde la vena umbilical .

En una modalidad, por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbiliocal se conectaron simultáneamente, por ejemplo, a una pipeta que se conecta via un conector flexible a un deposito de la solución de perfusión. La solución de perfusión se pasa hacia la vena y la arteria umbilical. La solución de perfusión exuda desde y/o pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos en los tejidos circundantes de la placenta, y se recolecta en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que estaban unidos al útero de la madre durante la gestación. La solución de perfusión también puede ser introducida a través de la abertura del cordón umbilical y se le permite fluir o percolarse por las aberturas en la pared de la placenta, las cuales se interconectan con la pared uterina materna. La células placentarias que se recolectan mediante este método, el cual puede ser conocido como un método de "bandeja", típicamente son una mezcla de células fetales y maternas.

En otra modalidad, la solución de perfusión se pasa a través de las venas umbilicales y se recolecta por la arteria umbilical, o se pasa a través de la arteria umbilical y se recolecta por las venas umbilicales. Las células placentarias recolectadas por este método, el cual puede ser conocido como un método de "circuito cerrado", típicamente son casi excluidamente fetales.

Se apreciará que la perfusión usando el método de bandeja, es decir, mediante el cual el perfusado se recolecta después que esta ha exudado desde el lado materno de la placenta, resulta en una mezcla de células fetales y maternas. Como resultado, las células recolectadas por este método comprenden una población mezclada de células placentarias, por ejemplo, células madre placentarias o células placentarias multipotentes, tanto de oriqen fetal y materno. En contraste, la perfusión solamente a través de la vasculatura de la placenta en el método de circuito cerrado, mediante el cual el fluido de perfusión se pasa a través de uno o más vasos de la placenta y se recolecta solamente a través de los vasos restantes resulta en la recolección de una población de células placentarias casi exclusivamente de origen fetal.

El método de perfusión de circuito cerrado puede, en una modalidad, ser realizado como sigue. Se obtiene una placenta post parto dentro de un periodo de 48 horas desde el nacimiento. El cordón umbilical se engrapa y se corta arriba de la grapa. El cordón umbilical puede ser desechado, o puede ser procesado para rcuperar, por ejemplo, las células madre del cordón umbilical, y/o para procesar la membramna del cordón umbilical para la producción de un biomaterial. La membrana amniótica puede ser retenida durante la perfusión, o puede ser separada del corión, por ejemplo, usando una disección roma con los dedos. Si la membrana amniótica se sepoara del corion antes de la perfusión, esta puede ser por ejemplo, desechada, o procesada, por ejemplo, para obtener células placentarias mediante digestión emzimática, o para producir, por ejemplo, un biomaterial de la membrana amniótica, o ejemplo, el biomaterial describe en la Publicación de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0048796. Después de limpiar la placenta de todos los coágulos sanguíneos visibles y de la sangre residual, por ejemplo, usando gaza estéril, los vasos del cordón umilical se exponen, por ejemplo, cortando parcialmente la membrana del cordón umbilical para exponer una secado transversal el cordón. Los vasos se identifican y se abren, por ejemplo, haciendo avanzar una pinza de caimán a través del corte final de cada vaso. El aparato, por ejemplo, la tubería de plástico conectada a un dispositivo de perfusado o una bomba peristáltica, se inserta entonces en cada una de las arterias. La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para el propósito, por ejemplo, una bomba peristáltica. La tubería de plástico, conectada a un deposito de recolección estéril, por ejemplo, una bolsa de sangre, tal como una bola de recolección de 250 mL, se insrta entonces en la vena de la placenta. Alternativamente, la tubería conectada a la bomba se inerta en la vena de la placenta y los tubos a un depósito o depósitos de recolección se insertan en una o ambas de las arteias de la placenta. La placenta se perfunde entonces con un volumen de solución de perfusión, por ejemplo, aproximadamente 750 mi de solución de perfusión. Las células en el perfundido se recolectan entonces, por ejemplo, mediante centrifugación.

En otra modalidad, la perfusión, por ejemplo, para recolectar las células del perfusado de placenta, se realiza como sigue. Las placentas que contienen la sangre de la placenta se perfunden a través solo de la vasculatura de la placenta bombeando NaCl estéril al 0.95 (por ejemplo, aproximadamente 750 mL) usando, por ejemplo, una bomba peristáltica, y el perfusado resultante se recolecta en una bolsa de recolección. Las células del perfusado se recolectan mediante centrifugación, por ejemplo, a aproximadamente 420 g, seguido por la extracción del sobrenadante en exceso (NaCl, plasma, anticoagulante) . Entonces se agrega el hetaalmidón a las células del perfusado para obtener una dilución al 30%. Las células el perfusado de colocan entonces en un extractor de plasma, por ejemplo, por aproximadamente una hora. Para separar los eritrocitos. El plasma y las células nucleadas resultante se sepoaran de la bolsa de recolección y se colocan otra vez en un extractor de plasma. Las células restantes se resuspenden en albúmina de suero humana al 5% en un volumen final de aproximadamente 20 mL. Se agrega DMSO/PLASMALYTE A® (1:1 v/v) premezclado para obtener un volumen de aproximadamente 24 mi. Las células resultantes se criopreservan . En una modalidad específica de este método, la placenta de la cual se obtiene el perfusado se drena de la sangre del cordón, pero no se perfunde, antes de la perfusión a las células placentarias recolectadas. En otra mo específica, la placenta de la cuales se obtiene el perfusado, se drena de la sangre del cordón, y se perfunde para extraer la sangre residual, antes de la perfusión, para recolectar las células placentarias.

En una modalidad, el extremo próximo del cordón umbilical se engrapa durante la perfusión, y más preferiblemente, se engrapa en un intervalo de 4-5 cm centímetros) desde la inserción del cordón en el disco placentario.

El volumen del líquido de perfusión usado para recolectar las células placentarias puede variar dependiendo del número de células ser recolectadas, el tamaño de la placenta, el número de recolecciones a ser realizadas de una placenta individual, etc. En varias modalidades, el volumen del líquido de perfusión puede ser desde 50 mL, a 4000 mL, 50 mL a 3000 mL, 100 mL a 2000 mL, 250 mL a 2000 mL, 500 mL a 2000 mL, o 750 mL a 2000. mL. Típicamente, la placenta se perfunde con 700-800 mL de líquido de perfusión enseguida de la e sanguinación .

La placenta puede ser perfundida una pluralidad de veces durante el curso de varias horas o varios días, cuando la placenta debe ser perfundida una pluralidad de veces, esta puede ser mantenida o cultivada bajo condiciones asépticas en un contenedor u otro recipiente adecuado, y se perfunde con la composición de recolección de células, o una solución de perfusión estándar (por ejemplo, una solución salina normal tal como solución salina amortiguada con fosfato ("PBS")) con o sin un anticoagulante (por ejemplo, heparina, warfarina sódica, coumarina, bishidroxicoumarina) y/o con o sin un agente antimicrobiano (por ejemplo, ß-mercaptoetanol (0.1 mM) ; antibióticos tales como estreptomicina (por ejemplo, a 40-100 pg7ml) , penicilina (por ejemplo, a 40 U/mL) , anfotericina b (por ejemplo, a 0.5 g/mL) . En una modalidad, una placenta aislada se mantiene o se cultiva por un periodo de tiempo sin recolectar el perfusado, de modo tal que la placenta se mantiene o se cultiva por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o 2 o 3 o más días antes de la perfusión y la recolección del perfundido. La placenta perfundida puede ser mantenida por uno o más veces adicionales, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más horas, y se perfunde una segunda vez con, por ejemplo 700-800 mL de fluido de perfusión. La placenta puede ser perfundida 1, 2, 3, 4 o más veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En una modalidad preferida, la perfusión de la placenta y la recolección de la solución de perfusión, por ejemplo, la composición de recolección de células, se repite hasta que el número de células nucleadas recuperadas cae por abajo de 100 células/mL. Los perfundidos en los diferentes puntos de tiempo pueden ser procesados indivualmente para recuperar las poblaciones de células dependientes del tiempo, por ejemplo, las células madre. Los perfundidos de diferentes puntos de tiempo también pueden ser reunidos. En una modalidad preferida, las células madre se recolectan en un tiempo o tiempos de entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas después de la expulsión.

Prefgeriblemete la perfusión resulta en la recolección de significativamente más células placentarias que el número que se puede obtener de una placenta de mamífero no perfundida con dicha solución, y no tratada de otra mabnera para obtener las células placentarias (por ejemplo, mediante desintegración del tejido, por ejemplo, digestión enzimática. En este contexto "significativamemnte más" significa al menos 105 más. Las perfusión proporciona significatiovamente más células madre placentarias que, por ejemplo, el número de células placentarias que se pueden obtener de medios de cultivo en los cuales la placenta, o una porción de la misma, ha sido cultivada .

Las células placentarias pueden ser aisladas de la placenta por perfusión con una solución que comprende una o más proteasas u otras enzimas de desintegración de tejidos. En una modalidad especifica, una placenta o una porción de la misma (por ejemplo, la membrana amniótica, el amnios y el corion, el lóbulo o de cotilendón de la placenta, el cordón umbilical, o combinaciones de cualquiera de los anteriores) se traen a 25-37 °C, y se incuban de una o más enzima de desintegracxion de tejidos en 200 mL de un medio de cultivo, por 30 minutos. Las células del perfusado se recolectan se llevan a 4°C y se lavan con una mezcla inhibidora fría que comprende EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM, beta-mercaptoetanol 2 mM. Las células placentarias se lavan después de varios minutos con una composición de recolección de células madre frias (por ejemplo a 4°C) . 5.4.5 Aislamirnto , Clasificación, y Caracterización de las Células Madre Placentarias Las velulas madre placentarias, o ejemplo, las células descritas en la Sección 5.3 anterior, ya sea obtenida por perfusión o por desintegración física, por ejemplo, por digestión enzimativa, pueden ser purificadas inicialmete de (es decir, aisladas de) otra células, mediante centrifugación de gradiente de Ficcol. Tal centrifugación puede seguir cualquier protocolo estándar para la velocidad de centrifugación, etc. En una modalidad, o ejemplo, las células recolectadas de la placenta se recuperan del perfusado mediante centrifugación a 5000 x g por 15 minutos a la temperatura ambiente, lo cual separa las células se, o ejemplo, los desechos contaminates y las plaquetas. En otra modalidad, el perfusado de la placenta se concentra a aproximadamente 200 mL, se deposita suavemente en capas sobre Ficoll, y se somete a centrifugación a aproximadamente HOOx g por 20 minutos a 22°C, y la capa de células intermedia de baja densidad se recolecta para el procesamiento posterior.

Las pelotillas de células pueden ser resuspendidas en composición de recolección de células madre fresca, o un medio adecuado para el mantenimiento de las células madre, por ejemplo, medio libre de suero IMDM conteniendo 2 U/mL de heparina y EDTA 2 m (GibcoBRL, NY) . La fracción otal de células mononucleares puede ser aislada, por ejemplo, usando Lylphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante.

Las células placentarias obtenidas por perfusión o digeston pueden, por ejemplo, ser aisladas adicionalmente o inicialmente por tripsinizacion diferencial, usando una solución de tripsina al 0.051 con 0.2% de EDTA (Sigma, St . Louis MO) . La tripsinizacion diferencial es posible puesto que las células placentarias aisladas típicamente se desprenden de las superficies plásticas en un periodo de aproximadamente cinco minutos en tanto que otras poblaciones típicamente requieren más de 20-30 minutos de incubación.

Las células placentarias desprendidas pueden ser recolectadas enseguida de la tripsinizacion y la neutralización con tripsina, usando, por ejemplo, Solución de Neutralización de Tripsina (TNS, Cambrex) . En una modalidad, del aislamiento de células adherentes, alícuotas de, por ejemplo, aproximadamente 5xl06 células se colocan en cada uno de siete frascos T-75, preferiblemente frascos T75 revestidos con fibronectina . En tal modalidad, las células pueden ser cultivados con Medio de Crecimiento de Células Madre Mesenquimales (MSCGM) disponible comercialmente y se colocan en un incubador de cultivo de tejidos (37°C, 5% de CO2) después de 10 a 15 días, las células no adherentes se extraen de los frascos por lavado con PBS. El PBS se reemplaza entonces por MSCGM. Los frascos se examinan preferiblemente, diariamente por la presencia de varios tipos de células adherentes y en particular, por la identificación y la expansión de agrupaciones de células fibroblastoides .

El número y el tipo de las células recolectadas de una placenta de mamífero pueden ser monitoreados, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de la superficie celular, usando técnicas estándar de detección de células, tales como citometría. de flujo, clasificación de células, inmunohistoquímica (por ejemplo, teñido con anticuerpos específicos de los tejidos o específicos de los marcadores de las células) , clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) , clasificación de células activada por magnetismo (MACS) , por examinación de la morfología de las células usando microscopía óptica o confocal, y/o midiendo los cambios en la expresión de los genes usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como PCR y perfilado de la expresión genética. Estas técnicas pueden ser usadas también para identificar las células que son positivas para uno o más marcadores particulares. Por ejemplo, usando anticuerpos para CD34, se puede determinar, usando las técnicas anteriores, si un tipo de células, comprende una cantidad detectable de CD34; si es asi, las células son CD34+. Igualmente, si un tipo de células producen suficiente OCT-4 ARN para ser detectable por RT-PCR, o significativamente más OCT-4 ARN que las células adultas, las células son 0CT-4+. Los anticuerpos para los marcadores de la superficie células (por ejemplo, los marcadores CD tales como CD34) y la secuencia de los genes específicos de las células madre tales como OCT-4, son bien conocidos en la técnica.

Las células placentarias , en particular las células que han sido aisladas por separación en Ficoll, adherencia diferencial, o una combinación de ambas, pueden ser clasificadas usando un clasificador activado por fluorescencia (FACS), la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluyendo células, basado en las propiedades de fluorescencia de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 15 1:150-165). La excitación por láser de las porciones fluorescentes en las partículas individuales resulta en una pequeña carga eléctrica que permite la separación electromagnética de partículas positivas y negativas de una mezcla. En una modalidad, los anticuerpos específicos para los marcadores de la superficie se etiquetan con distintas etiquetas fluorescentes. Las células se procesan a través del clasificador de células, permitiendo la separación de las células con base en su habilidad para enlazarse a los anticuerpos usados. Las partículas clasificadas por FACS pueden ser depositadas directamente en pozos individuales de placas de 96 pozos o de 384 pozos, para facilitar la separación y la clonación.

En un esquema de clasificación, las células de la placenta, por ejemplo, células madre placentarias y células placentarias multipotentes , se clasifican sobre la base de los marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 yo HLA-G. Esto se puede lograr en conexión con los procedimientos para seleccionar las células madre sobre la base de sus propiedades de adherencia en cultivo. Por ejemplo, una selección por adherencia se puede realizar antes o después de la clasificación sobre la base de la expresión de los marcadores. En una modalidad, por ejemplo, las células se clasifican primero sobre la base de su expresión de CD34; las células CD34 se retienen, y las células que son CD200+, HLA-G+, se separan de todas las otras células CD34 . En otra modalidad, las células de la placenta se basan en su expresión de los marcadores CD200 y/o HLA-G, las células que expresan estos marcadores se aislan para su uso posterior. Las células que expresan, por ejemplo, CD200 y/o HLA-G pueden, en una modalidad especifica, ser clasificadas · adicionalmente con base en su expresión de CD73 y/o CD34, CD38, o CD45. Por ejemplo, en una modalidad, las células placentarias se clasifican por su expresión, o carencia de la misma de CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y las células que son CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34~, CD38~ y CD45~ se aislan de las otras células placentarias para uso posterior.

Con respecto a la detección y la clasificación mediada por anticuerpos, de las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o las células placentarias multipotentes , se puede usar cualquier anticuerpos para un marcador particular, en combinación con cualquier fluoróforo u otras etiquetas adecuadas para la detección y la clasificación de células (por ejemplo, clasificación de células activada por fluorescencia) .

Las combinaciones de anticuerpo/fluoróforo para los marcadores específicos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales conjugados a isocianato de fluoresceína (FITC) contra HLA-G (disponibles de Serotec, Raleigh, Carolina del Norte) , CD10 (disponible de BD Immunocytometry Systems, San José, California), CD44 (disponible de BD Biosciences Pharmingen, San José, California) y CD105 (disponible de R&D Systems Inc, Minneapolis, Minnesota), anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117, y CD13 (BD Biosciences Pharmigen) ; anticuerpos monoclonales conjugados a ficoeritritina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 y CD10 (BD Biosciences Pharmigen) ; anticuerpos de estreptavidina y monoclonales conjugados a aloficocianina (APC) contra CD38 (BD Biosciences Pharmigen) ; y biotinilados CD90 (BD Biosciences Pharmigen) . Otros anticuerpos que pueden ser usados incluyen, pero no se limitan a, CD133-APC (Miltenyi ) , KDR-Biotina (CD309, Abcam) , Citoqueratina K-FITC (Sigma o Dako) , HLA ABC-FITC 8BD) , HLA DR, DQ, DP-PE (BD) , ß-2-microglobulina-PE (BD) , CD80-PE(BD) y CD86-APC (BD) .

Otras combinaciones de anticuerpo/etiqueta que pueden ser usados incluyen, pero no se limitan a CD45-PerCP (proteina peridin clorofila); CD44-PE; CD19-PE; CD10-F ( fluoresceina) ; HLA-G-F y 7 -amino-actinomicin-De (7-AAD) ; HLA-ABC-F; y los similares .

Las células placentarias aisladas proporcionadas aquí pueden ser analizadas para CD117 o CD133 usando, por ejemplo, anticuerpos monoclonales conjugados a estreptavidina y biotina conjugada a ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) contra CD117 o CD133; sin embargo, usando este sistema, las células pueden aparecer como positivas para CD117 o CD133, respectivamente, debido a un fondo relativamente alto.

Las células placentarias aisladas descritas aquí pueden ser etiquetadas con un anticuerpo para un marcador único y detectadas/almacenadas. Las células placentarias también pueden ser etiquetadas simultáneamente con múltiple anticuerpos para diferentes marcadores.

En otra modalidad, las perlas magnéticas pueden ser usadas para separar las células. Las células pueden ser clasificadas usando una técnica de clasificación de células activada por magnetismo (MACS), un método para separar las partículas con base en su habilidad para enlazar se a perlas magnéticas (0.5-100 µ?a de diámetro) . Una variedad de modificaciones útiles, se pueden realizar sobre las microesferas magnéticas, incluyendo la adición covalente de un anticuerpo que reconoce específicamente una molécula particular de la superficie de las células o hapteno. Las perlas se mezclan entonces con las células para permitir el enlazamiento . Las células se hacen pasar entonces a través de un campo magnético para separar las células que tienen el marcador específico de la superficie celular. En una modalidad, estas células pueden ser aisladas y re-mezcladas con las perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra los marcadores de la superficie celular adicionales. Las células se pasan otra vez a través de un campo magnético, aislando las células que se adhieren a ambos anticuerpos. Tales células pueden ser diluidas entonces en platos separados, tales como platos de microtit lación para aislamiento clónico.

Las células placentarias aisladas también pueden ser caracterizadas y/o almacenadas con base en la morfología celular y las características de crecimiento. Por ejemplo, las células placentarias aisladas pueden ser caracterizadas por tener, y/o seleccionadas sobre la base, por ejemplo, una apariencia blastoide en cultivo. Las células placentarias aisladas también pueden ser caracterizadas por tener, y/o ser seleccionadas, sobre la base de su habilidad para formar cuerpos similares a embrioides. En una modalidad, por ejemplo, las células placentarias aisladas que son de forma fibroblastoide, expresan CD73 y CD105, y producen uno o más cuerpos similares a embrioides en cultivo a partir de otras células placentarias. En otra modalidad, las células placentarias OCT-4+ que producen uno o más cuerpos similares a embrioides en cultivo, se aislan de las otras células placentarias .

En otra modalidad, las células placentarias aisladas pueden ser identificadas y caracterizadas por un ensayo de unidad de formación de colonias. Los ensayos en unidad de formación de colonias se conocen comúnmente en la técnica, tales como el medio MESENCULT™ (Stem Cell Technologies, Inc, Vancouver, Columbia Británica) .

Las células placentarias aisladas pueden se evaluadas por su viabilidad, el potencial de proliferación, y su longevidad, usando las técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como el ensayo de exclusión de azul de triptano, el ensayo de asimilación de diacetato de fluoresceina , el ensayo de asimilación de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad) ; y el ensayo de asimilación de timidina, el ensayo de proliferación células MTT (para evaluar la proliferación) . La longevidad puede ser determinada por los métodos bien conocidos en la técnica, tales como mediante la determinación del número máximo de duplicaciones de la población en un cultivo extendido.

Las células placentarias aisladas también penden ser separadas de otras células placentarias usando otras técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, el crecimiento selectivo de células deseadas (selección positiva) , la destrucción selectiva de las células no deseadas (selección negativa) ; la separación basada en la capacidad de aglutinación diferencial de las células en la poblaron mezclada como, por ejemplo, con aglutinina de soya; procedimientos de secado por congelación; filtración; centrifugación convencional y de zona; elutriación centrifuga (contra centrifugación) ; separación por gravedad unitaria; distribución a contracorriente; electroforesis ; y las similares. 5.5 CULTIVO DE CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS 5.5.1 Medio de Cultivo Las células placentarias aisladas o poblaciones de las células placentarias aisladas, o las células o el tejido de la placenta del cual se desarrollan las células madre placentarias, pueden ser usadas para iniciar, o sembrar cultivos de células, las células se transfieren por lo general a recipientes estériles de cultivo de tejidos ya sea no revestidos o revestidos con una matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (por ejemplo, nativo o desnaturalizado) , gelatina, fibronectina , ornitina, vitronectina , y proteina de la membrana extracelular (por ejemplo, MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)) .

Las células placentarias aisladas pueden ser cultivadas en cualquier medio, y bajo cualquiera de las condiciones reconocidas en la técnica como aceptables párale cultivo de células, por ejemplo, células madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero. Las células placentarias aisladas pueden ser cultivadas en, por ejemplo, DMEM-LG (Medio Esencial Modificado de Dulbecco, de baja glucosa) /MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) que contiene ITS (insulina-transíerrina-selenio) , LA+BSA (ácido linoleico, albúmina de suero de bovino), dextrosa. Ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, IGF-1, y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (Medio Esencial Modificado de Dulbecco, de alta glucosa) que comprende 1% a 20% de suero de bovino fetal (FBS) ; DMEM-HG que comprende 15$ de FBS; IMDM (medio de Dulbecco modificado, de Iscove) que comprende 10% de FBS, 105 de suero de caballo, de hidrocortisona; M199 que comprende 10% de FBS, EGF, y heparina; OÍ-MEM (medio esencial mínimo) que comprende 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina ; DMEM que comprende 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc.

Otros medios que pueden ser usados para cultivar células placentarias incluyen DMEM (de alta o baja glucosa) , medio basal de Tagle, medio FIO de Ham (FIO) . Medio F-12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado de Iscove, Medio de Crecimiento de Células Madre Mesenquimales (MSCGM) , medio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco) , DMEM/MCDB201 (Sigma), y CELL-GRO FREE.

El medio de cultivo puede ser suplementado con uno o más componentes que incluyen, por ejemplo suero (suero de bovino fetal (FBS), preferiblemente aproximadamente 2-15% (v/v); suero de equino (ES) (caballo); suero humano (HS); beta-mercaptoetanol (BME) , preferiblemente, aproximadamente 0.001% (v/v); uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) , facto de crecimiento básico de los fibroblastos (bFGF) , factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1) , factor inhibidor de leucemia (LIF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , y eritropoyetina (EPO) ; aminoácidos, incluyendo L-valina; yh uno o más agentes antibióticos y/o antimicóticos para controlar la contaminación microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina, y nistatina, ya sea individualmente o en combinación.

Las células placentarias aisladas pueden ser combinadas en las condiciones estándar de cultivo de tejidos, por ejemplo, en platos de cultivos de tejidos o platos de pozos múltiples. Las células placentarias aisladas pueden ser cultivadas también usando un método de gota colgante. En este método, las células placentarias aisladas se suspenden a aproximadamente 1 x 104 células por mL en aproximadamente 5 mL de medio, y una o más gotas del medio se colocan en el interior de la tapa de un recipiente de cultivo de tejidos, por ejemplo una caja de Petri de 100 mL. Las gotas pueden ser, por ejemplo, gotas individuales, o gotas múltiples de, por ejemplo, una pipeta de canales múltiples. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca sobre la parte superior del fondo de la caja, la cual contiene un volumen de liquido, por ejemplo, PBS estéril suficiente para mantener el contenido en humedad en la atmósfera de la caja, y las células madre se cultivan.

En una modalidad, las células placentarias aisladas se cultivan en presencia de un compuesto que actúa para mantener un fenotipo no diferenciado en las células placentarias aisladas. En una modalidad especifica, el compuesto es 3,4-dihidropirimol [ 4 , 5-d] pirimidina sustituida. En una modalidad más especifica, el compuesto es un compuesto que tiene siguiente estructura química El compuesto puede ponerse en contacto con células placentarias aisladas, o una población de células placentarias aisladas, a una concentración de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 10 µ?. 5.5.2 Expansión y Proliferación de Células Placentarias Una vez que las células placentarias aisladas o la población de células placentarias aisladas (por ejemplo, las células placentarias o la población de células placentarias separada de al menos 50% de las células placentarias con las cuales las células madre o la población de células madre se asocian normalmente in vivo) , las células o la población de células pueden ser proliferadas y expandidas in vitro. Por ejemplo, una población de las células placentarias aisladas puede ser cultivada en recipientes de cultivo de tejidos, por ejemplo, cajas, frascos, placas de pozos múltiples, o los similares, por un tiempo suficiente para que las células proliferen a 70-90% de confluencia, es decir, hasta que las células y su progenie ocupen 70-90% del área superficial de cultivo del recipiente de cultivo de tejidos.

Las células placentarias aisladas pueden ser sembradas en recipiente de cultivo a una densidad que permita el crecimiento de las células. Por ejemplo, las células pueden ser sembradas a baja densidad (por ejemplo, a aproximadamente 1,000 a aproximadamente 5,000 células/cm2) a alta densidad (por ejemplo, aproximadamente 50, 000 o más células/cm2) . En una modalidad preferida, las células se cultivan en presencia de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en aire. En algunas modalidades preferidas, las células se cultivan a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en aire, preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de 02 en aire. Las células preferiblemente se cultivan a aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente 37°C. Las células se cultivan preferiblemente en un incubador. El medio de cultivo puede ser estático o agitado, por ejemplo, usando un biorreactor, las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o las células placentarias multipotentes, preferiblemente se cultivan bajo condiciones de bajo estrés oxidativo (por ejemplo, con la adición de glutationa, ácido ascórbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcisteina, o los similares) .

Una vez que se obtiene una confluencia de menos que aproximadamente 100%, por ejemplo, 70%-90%, las células pueden ser transferidas, por ejemplo, las células pueden ser tratadas enzimáticamente , por ejemplo, tripsinizadas usando las técnicas bien conocidas en la técnica, para separarlas de la superficie de cultivo de tejidos. Después de extraer las células usando una pipeta y contando las células, aproximadamente 10,000-100,000 células/cm2, preferiblemente aproximadamente 50,000 células/cm2, se transfieren a un nuevo recipiente de cultivo que contiene medio de cultivo fresco. Típicamente, el nuevo medio es el mismo tipo del cual se extrajeron las células placentarias aisladas. Las células placentarias aisladas pueden ser transferidas al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, o 20 veces o más .

PRODUCCIÓN DE UN BANCO DE CÉLULAS PLACENTARIAS Las células aisladas de las placentas post parto, por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la Sección 5.3, pueden ser cultivadas en un número de formas diferentes para producir un conjunto de lotes, por ejemplo, un conjunto de dosis que se pueden administrar individualmente, de células placentarias aisladas. Tales lotes pueden, por ejemplo, ser obtenidos de las células del perfusado de placenta o de las células del tejido placentario digerido por enzimas. Los conjuntos de lotes de células placentarias, obtenidos de una pluralidad de placentas, pueden ser arreglados en un banco de células placentarias aisladas, por ejemplo, de almacenamiento a largo plazo. En general, las células placentarias adherentes al plástico de cultivo de tejidos se obtienen de un cultivo inicial de material placentario para formar un cultivo seminal, el cual se expande bajo condiciones controladas para formar poblaciones de células de números aproximadamente equivalentes de duplicaciones. Los lotes se derivan preferiblemente del tejido de una única placenta, pero pueden ser derivados del tejido de una pluralidad de placentas.

En una modalidad, los lotes de células placentarias se obtienen como sigue. El tejido placentario se desintegra primero, por ejemplo, mediante maceración, se digiere con una enzima adecuada, por ejemplo, colagenasa (véase la Sección 5.4.3, anterior) . El tejido placentario preferiblemente comprende, por ejemplo, el amnios completo, el corion completo, o ambos, de una placenta única, pero pueden comprender solo una parte ya sea del amnios o del corion. El tejido digerido se cultiva, por ejemplo, por aproximadamente 1-3 semanas, preferiblemente a aproximadamente 2 semanas. Después de la eliminación de las células no adherentes, se recolectan las colonias de alta densidad que se forman, por ejemplo, por tripsinización . Estas células se recolectan y se resuspenden en un volumen conveniente de medio de cultivo, y después se usan para sembrar cultivos de expansión, los cultivos de expansión pueden ser cualquier arreglo se aparatos de cultivo de 'células separados, por ejemplo, un Cell Factory de NUNC , las células pueden ser subdivididas a cualquier grado para sembrar los cultivos de expansión de semillas con, por ejemplo, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 3 x 104 4 x 103 a aproximadamente 1 x 104 células/células madre. Preferiblemente, desde aproximadamente lxlO3 a aproximadamente lxlO4 células/cm2 se usan para sembrar cada expansión de cultivo. El número de cultivos de expansión puede ser mayor o menos en número dependiendo de la o las placentas particulares de las cuales se obtienen las células.

Los cultivos de expansión se cultivan hasta que la densidad de las células en el cultivo alcanza un cierto valor, por ejemplo, aproximadamente lxlO5 células/cm2. Las células pueden ser ya sea recolectadas o criopreservadas en este punto, o se transfieren a nuevos cultivos de expansión como se describe anteriormente. Las células pueden ser transferidas, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 19 o 20 veces antes del uso. Un registro del número acumulativo de duplicaciones de la población se mantiene preferiblemente durante el o los cultivos de expansión. Las células pueden ser expandidas por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones, o hasta 60 duplicaciones. Preferiblemente, sin embargo, el número de duplicaciones de la población, antes de dividir la población de células en dosis individuales, es entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30- Las células pueden ser cultivadas continuamente a través del proceso de expansión, o pueden ser congeladas en uno o más puntos durante la expansión.

Las células a ser usadas para las dosis individuales pueden ser congeladas, por ejemplo, criopreservadas para su uso posterior. Las dosis individuales pueden comprender, por ejemplo, aproximadamente 1 millón a aproximadamente 50 millones de células por mL, y puede comprender entre aproximadamente 106 y aproximadamente 1010 células en total.

En una modalidad por lo tanto, se puede formar un banco de células placentarias mediante un método que comprende: expandir las células placentarias del cultivo primario de una placenta humana post parto para una primera pluralidad de duplicaciones de la población; criopreservar dichas células placentarias para formar un Banco de Células Maestro; expandir una pluralidad de células placentarias del Banco de Células Maestro por una segunda pluralidad de duplicaciones de la población; criopreservar dichas células placentarias para formar un Banco de Células de Trabajo; expandir una pluralidad de células placentarias a partir del Banco de Células de Trabajo por una tercera pluralidad de duplicaciones de la población; y criopreservar dichas células placentarias en dosis individuales, en donde dichas dosis individuales comprenden colectivamente un blanco de células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias del cultivo primario comprenden células placentarias del perfusado de placenta. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias del cultivo primario comprenden células placentarias del tejido placentario digerido. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias del cultivo primario comprenden células placentarias del perfusado de placenta y del tejido placentario digerido. En otra modalidad especifica, todas las dichas placentas en dicho cultivo primario de células placentarias son de la misma placenta. En otra modalidad especifica, el método comprende además el paso de seleccionar las células placentarias CD200+ o células placentarias HLA-G+ o células placentarias CD10+, CD34 , CD105+, CD200+, de dicha pluralidad de dichas células placentarias de dicho Banco de Células de Trabajo para formar dosis individuales. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 104 a aproximadamente 105 células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 105 a aproximadamente 106 células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 106 a aproximadamente 107 células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde 107 a aproximadamente 108 células placentarias. En otra modalidad específica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 10 a aproximadamente 10 células placentarias . En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 109 a aproximadamente 1010 células placentarias .

Los métodos para preparar las composiciones que comprenden células placentarias, por ejemplo, células madre placentarias o células placentarias multipotentes, como se proporcionan aquí, pueden ser integrados en la construcción de un banco de células placentarias, en cualquier paso como se describe anteriormente. En una modalidad, la composición farmacéutica se produce después que se produce el Banco de células Maestro, y durante la producción de uno o más Bancos de Células de Trabajo a partir de dicho Banco de Células Maestro, o durante al expansión de las células placentarias a partir de dichos Bancos de Células de Trabajo. Por ejemplo, las células placentarias pueden ser descongeladas de un Banco de Células de Trabajo y se cultivan por una pluralidad de duplicaciones de la población. En una modalidad, cuando se genera un número deseado de células, o ha tenido lugar un número deseado de duplicaciones, las células placentarias pueden ser recolectadas, por ejemplo, mediante centrifugación, y se resuspenden en una solución que comprende, por ejemplo, dextrano 40. Por ejemplo dextrano 40 al 5.5%. En ciertas modalidades, las células madre placentarias se recolectan una segunda vez y se resuspenden en una solución que comprende dextrano y un criopreservador , por ejemplo una solución de dextrano 40 al 5.5% que comprende 105 de HSA, y 5% de DIVISO, y se criopreservan . Las células placentarias criopreservadas se descongelan por ejemplo, inmediatamente antes del uso, por ejemplo, inmediatamente antes de la producción final de la composición como se describe en la Sección 5.2, anteriormente.

Los métodos anteriores para producir una composciin que comprende células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o las células placentarias multipotentes , pueden ser usados una vez en la producción y/o el uso de un banco de células placentarias, por ejemplo, en cada punto en el cual las células placentarias deben ser criopreservadas, o, por ejemplo, en el punto en el cual las células placentarias se preparan para la administración individual antes de la criopreservación final, y después de la descongelación antes de la administración a un individuo.

En una modalidad preferida, el donador del cual se obtiene la placenta (por ejemplo, la madre), se evalúa por al menos un patógeno. Si la madre resulta positiva para un patógeno evaluado, el lote completo de la placenta se desecha. Tal evaluación se puede realizar en cualquier momento durante la producción de los lotes de células, incluyendo antes o después del establecimiento del cultivo de células inicial o durante el cultivo de expansión. Los patógenos para los cuales se evalúa la presencia pueden incluir, sin limitación, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus de inmunodeficiencia humana (Tipos I y II), citomegalovirus , herpesvirus, y los similares. 5.6 CONSERVACIÓN DE LAS CÉLULAS PLACENTARIAS Las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células placentarias multipotentes aisladas descritas en la Sección 5.2 anterior, pueden ser preservadas, por ejemplo, durante la recolección, es decir, colocadas bajo condiciones que permitan el almacenamiento a largo plazo, o las condiciones que inhiban la muerte celular, por ejemplo, por apoptosis o necrosis, por ejemplo, durante la recolección o antes de la producción de las composiciones descritas aquí, por ejemplo, usando los métodos descritos aquí.

Las células placentarias pueden ser preservadas usando por ejemplo, una composición que comprende un inhibidor de la apoptosis, un inhibidor de la necrosis, y/o un perfluorocarbono que transporta oxígeno, como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0190042, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En una modalidad, un método para preservar una población de células, a ser usadas en las composiciones que comprenden las células presentadas aquí, comprende poner en contacto dicha población de células con una composición de colección de células que comprende un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarbono que transporta oxígeno, en donde dicho inhibidor de apoptosis está presente en una cantidad y por un tiempo suficiente para reducir o evitar la apoptosis en la población de células, cuando se copara con una población de células que no se pone en contacto con el inhibidor de apoptosis. En una modalidad especifica, dicho inhibidor de apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra modalidad especifica, dicho inhibidor de apoptosis es un inhibidor de JNK. En una modalidad más especifica, dicho inhibidor de JNK no moduela la diferenciación o la proliferación de dichas células. En otra modalidad, dicha composición de recolección de células comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono que transporta oxigeno en fases separadas. En otra modalidad, dicha composición de recolección de células comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono que transporta oxigeno en una emulsión. En otra modalidad, la composición de recolección de células comprende adicionalmente un emulgente, por ejemplo, lecitina. En otra modalidad, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono están entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25°C en el momento contactar las células, en otra modalidad más especifica, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono están entre aproximadamente 2°C y 10°C, o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C, en el momento de contactar las células. En otra modalidad más especifica, dicho contacto se lleva a cabo durante el transporte de dicha población de células. En otra modalidad especifica, dicho contacto se realiza durante la congelación y la descongelación de dicha población de células.

Las poblaciones de células placentarias pueden ser conservadas, por ejemplo, mediante un método que comprende poner en contacto dicha población de células con un inhibidor de apoptosis y un compuesto de preservación de órganos, en donde dicho inhibidor de apoptosis está presente en una cantidad y por un tiempo suficiente para reducir o evitar la apoptosis en la población de células, en compararon con una población de células que ?s se pone en contacto con el inhibidor de apoptosis. En una modalidad especifica, el compuesto de preservación de órganos es una solución UW (descrita en la Patente Norteamericana No. 4,798,824; conocida también como ViaSpan, véase también Southard et al, Transplantation 49 (2 ) : 251-257 (1990)) o una solución descrita en Stern et al, Patente Norteamericana No. 5,552,267. En otra modalidad, el compuesto de preservación de órganos es hidroxietil almidón, ácido lactobiónico, rafinosa, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, la composición de recolección de células comprende adicionalmente un perfluorocarbono que transporta oxigeno, ya sea en dos fases o como una emulsión.

En otra modalidad del método, las células madre placentarias se ponen en contacto con una composición de recolección de células que comprende un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarbono que transporta oxigeno, un compuesto de preservación de órganos, o una combinación de los mismos durante al perfusión. En otra modalidad, dichas células se ponen en contacto durante un proceso de desintegración del tejido, por ejemplo, digestión enzimática. En otra modalidad, las células placentarias se ponen en contacto con dicho compuesto de recolección de células después de la recolección por perfusión, o después de la recolección por desintegración del tejido, por ejemplo, digestión enzimática.

Típicamente, durante la recolección, enriquecimiento y aislamiento de las células placentarias, es preferible minimizar o eliminar el estrés de las células debido a la hipoxia y el estrés mecánico. En otra modalidad del método, por lo tanto, las células, o la población de células se expone a' una condición hipóxica durante la recolección, enriquecimiento o el aislamiento por menos de seis horas durante dicha preservación, en donde una condición hipóxica es una concentración de oxígeno que es menor que la concentración de oxígeno normal de la sangre. En una modalidad más específica, dicha población de células se expone a dicha condición hipóxica por menos de dos horas durante dicha preservación. En otra modalidad más específica, dicha población de células se expone a dicha condición hipóxica por menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no se expone a una condición epóxica, durante la recolección, enriquecimiento, o asilamiento. En otra modalidad especifica, dicha población de células no se expone a esfuerzos cortantes durante la recolección, enriquecimiento o el aislamiento.

Las células placentarias pueden ser criopreservadas , en general o en los métodos específicos descritos aquí. En una modalidad, el criopreservador es propilenglicol , por ejemplo, aproximadamente propilenglicol 1.5M. El criopreservador también puede ser, por ejemplo, glicerol, etilenglicol , polifenol (por ejemplo, a aproximadamente 30 a aproximadamente 120 ppm) o los similares. En otras modalidades, el criopreservador es suero fetal de bovino, suero humano, o albúmina de suero humano en combinación con uno o más de D SO, trehalosa, y dextrano. En una modalidad específica, el criopreservados es suero humano, DMSO, y trehalosa, o es suero ¦ fetal de bovino y DMSO. En ciertas modalidades, las células placentarias se criopreservan en medio de criopreservación en recipientes pequeños, por ejemplo, ampolletas. Las células placentarias preferiblemente se enfrían a aproximadamente l°C/min durante la criopreservación. Una temperatura de criopreservación preferida es de aproximadamente -80°C a aproximadamente -180°C, preferiblemente de -125°C a aproximadamente -140°C. Las células criopreservadas pueden ser transferidas a nitrógeno líquido antes de la descongelaron para su uso. En algunas modalidades, por ejemplo, una vez que las ampolletas han alcanzado aproximadamente -90°C, estas se transfieren a un área de almacenamiento de nitrógeno líquido. La criopreservación también se puede realizar usando un congelador de velocidad controlada. Las células criopreservadas preferiblemente se descongelan a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37 °C. 5.7 COMPOSICIÓN QUE CONTIENEN CÉLULAS 5.7.1 Composiciones que Comprenden Células Placentarias Las células placentarias descritas aquí, por ejemplo, en la Sección 5.3 pueden comprender una o más tipos de las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o células placentarias multipotentes , descritas aquí, en donde las células han sido aisladas de una placenta, por ejemplo una placenta humana. En otra modalidad específica, cualquiera de las composiciones anteriores comprende una matriz. En una modalidad más específica, dicha matriz es un andamio tridimensional, en otra modalidad más específica, dicha matriz comprende colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina . En otra modalidad más específica, la matriz es una membrana amniótica o un biomaterial derivado de la membrana amniótica. En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende una proteína de membrana extracelular . En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende un compuesto sintético. En otra modalidad más especifica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra modalidad más especifica, dicho compuesto bioactivo es un facto de crecimiento, citosina, anticuerpo, o una molécula orgánica de menos de 5,000 dalton.

En otra modalidad, una composición útil en las composiciones por ejemplo, las composiciones farmacéuticas, proporcionadas aquí, comprende el medio acondicionado por cualquiera de las células placentarias anteriores, o cualquiera de las poblaciones de células placentarias anteriores. En una modalidad específica cualquiera de tales composiciones comprende un tipo de célula madre que no se deriva de una placenta. En una modalidad más específicas, dichas células madre son células madre embrionarias. En otra modalidad más específica dichas células madre son células madre derivadas de la medula ósea. En otra modalidad más específica, dichas células madre son células madre hematopoyéticas . En otra modalidad más específica, dichas células madre son células madre somáticas. En una modalidad aun más específica, dichas células madre somáticas son células madre neurales, células madre hepáticas, células madre pancreáticas, células madre endoteliales, células madre cardiacas, o células madre musculares. 5.7.1.1 Composiciones Farmacéuticas Las poblaciones de células placentarias aisladas o las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, están contenidas en, o son componentes de, una composición farmacéutica. Las células placentarias aisladas pueden ser preparadas en una forma que se puede administrar fácilmente a un individuo, o ejemplo, las células de perfusado de placenta o las células placentarias aisladas que están contenidas en un recipiente adecuado para uso médico. Tal recipiente puede ser, por ejemplo, jeringas, bolsas estériles de plástico, frascos, botes, y otros recipientes de los cuales se puede surtir fácilmente la población de células madre, o ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre o otras bolsas de plástico aceptables médicamente, adecuadas para la administración intravenosa de un líquido a un receptor. El recipiente en ciertas modalidades, es uno que permite la criopreservación de la población de células placentarias aisladas.

En una modalidad, el recipiente es un recipiente que facilita, o permite, la ejecución de uno o más de los pasos del método descrito aquí, por ejemplo, cuando el método para producir una composición que comprende células comprende, por ejemplo, los pasos de (a) poner en contacto dichas células con una solución que comprende dextrano y albúmina de suero humano (HSA) para producir una solución que contiene células; (b) filtrar la solución; (c) diluir duchas células a aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, 1 a 10 x 106, células por mililitro, con una primera solución de dilución que comprende dextrano; y (d) diluir dichas células con una segunda solución de dilución que comprende dextrano pero que no comprende HSA, las células, o ejemplo, las células placentarias aisladas o las células de perfusado de placenta pueden se colocadas en un recipiente, por ejemplo, entre los pasos (c) y (d) , en donde el recipiente es un recipiente que, por ejemplo, facilitar la criopreservación y/o facilita la administración de las células a un individuo en necsidad de las células, o los similares. En ciertas modalidades, dicha dilución no es a más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución es a no más de aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro. En otras ciertas modalidades, si el número de células es menor que aproximadamente 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional.

Por ejemplo, las células placentarias aisladas pueden ser criopreservadas en, por ejemplo, una bolsa, por ejemplo, una bolsa de sangre o una bolsa similar, y se descongelan y se diluyen finalmente en la misma bolsa. En otra modalidad, en donde el método para producir una composición que comprende células comprende, por ejemplo, (a) centrifugar una pluralidad de células, por ejemplo, células de perfusado de placenta o células placentarias aisladas para recolecta las células; (b) resuspender las células en dextrano 40 al 5.5%; (c) centrifugar las células para recolectar las células; (d) resuspender las células en una solución de dextrano 40 al 5.5% que comprende 10% de HSA; (e) filtrar las células a través de un filtro de 70 µ? a 100 µ?; (f) . diluir las células en dextrano 40 al 5.5%, 10% de HSA, y 55 de DMSO, a no más de aproximadamente 10±3xl05 células/mL (g) criopreservar las células; (h) descongelar las células; e (i) diluir las células 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% para producir dicha composición farmacéutica, colocación de las células en un recipiente que, por ejemplo, facilita la criopreservación y/o la administración de las células a un individuo en necesidad de las mismas se puede ejecutar, por ejemplo, en cualquier paso después del paso (e) . En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (f) es a aproximadamente 1 a 50x10 , 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, 1 a 10 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución en el paso (f) es a no más que aproximadamente 15xl06 células por mililitro. En otras ciertas modalidades, si el número de células es menor que 10±3xl06 células por mililitro, la filtración es opcional. En una modalidad especifica, por ejemplo, las células, por ejemplo, las células placentarias aisladas o las células de perfusado de placenta, pueden ser colocadas en el recipiente después de la filtración, entonces en el recipiente, se diluyen se criopreservan, se descongelan y/o finalmente se diluyen antes de la administración al individuo.

Las células placentarias aisladas en las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas, proporcionadas aquí, pueden comprender células placentarias derivadas de un donador único, o de donadores múltiples. Las células placentarias aisladas pueden ser completamente compatibles con HLA para un individuo pretendido, o parcialmente o completamente incompatibles con la HLA.

Por lo tanto, en una modalidad, las células placentarias aisladas en las composiciones proporcionadas aquí, se administran a un individuo en necesidad de las mismas. En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se administran intramuscularmente, intradermicamente, intraperitonealmente, intra-arterialmente, subcutáneamente, intravenosmente , o intraocularmente . En una modalidad, las células placentarias aisladas en las composiciones proporcionadas aquí se administra a un individuo en necesidad de la misma en la forma de una composición que comprende las células placentarias aisladas en un recipiente. En otra modalidad específica, el recipiente es una bolsa, un frasco o un bote. En una modalidad más específica dicha bolsa es una bolsa estéril de plástico. En una modalidad más específica, dicha bolsa es adecuada para, permite o facilita la administración intravenosa de dichas células placentarias aisladas, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, inyección de bolo, o los similares. La bolsa puede comprenden múltiples cavidades o compartimientos que están interconectados para permitir el mezclado de las células placentarias aisladas y una o más de otras soluciones, o ejemplo, un fármaco, antes, o durante la administración. En otra modalidad especifica, antes de la criopreservacion, la solución que comprende las células placentarias aisladas comprende uno o más compuestos que facilitan la criopreservacion de las células combinadas. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas están contenidas en una solución acuosa aceptable fisiológicamente. En una modalidad más especifica, dicha solución acuosa aceptable fisiológicamente es solución de NaCl al 0.95. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas comprenden células placentarias que son compatibles con HLA para un receptor de dicha población de células, en otra modalidad especifica, dichas células combinadas comprenden células placentarias que son al menos parcialmente incompatibles con HLA para un recipiente de dicha población de células. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias se derivan de una pluralidad de donadores Las células placentarias aisladas en la composición farmacéutica puede ser cualquiera de las células placentarias aisladas descritas aquí. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas descritas aquí son células CD10+, CD34 , CD105+, CD200+, que están contenidas dentro de un recipiente. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas descritas aquí son células CD200+, HLA-G+ que están contenidas en un recipiente. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son células CD73+, CD105+, CD200+ que están contenidas en un recipiente. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son células CD200+, 0CT-4+ que están contenidas en un recipiente. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son células CD73+, CD105+ que están contenidas en un recipiente, en donde dichas células facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides cuando se cultivan con una población de células placentarias bajo las condiciones que permutan la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son células CD73+, CD105+, HLA-G+ que han sido criopreservadas , y están contenidas dentro de un recipiente. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son células OCT-4+ que están contenidas dentro de un recipiente, en donde dichas células facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides cuando se cultivan con una población de células placentarias bajo las condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En una modalidad especifica de cualquiera de las células placentarias anteriores, dicho recipiente es una bolsa.

En varias modalidades especificas, dicho recipiente comprende aproximadamente, o cuando más 1 x 106 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 106 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 107 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 107 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 108 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 108 células placentarios aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 109 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 109 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 1010 células placentarias aisladas o células de perfusado placentario. En otras modalidades, una dosis única de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario pueden comprender, en varias modalidades, aproximadamente al menos, o no más de 1 x 105, 5 X 105, 1 x 106, 5 X 106, 1 x 107, 5 X 107, 1 x 108, 5 X 108, 1 x 109, 5 X 109, 1 x 1010, 5 X 1010, 1 x 1011 o más células placentarias aisladas o células de perfusado placentarias. En otras modalidades, un recipiente o dosis de células placentarias aisladas o células de perfusado placentarios comprende 1 x 105 a 5 x 105 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 105 a 1 x 106 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 106 a 5 x 106 de células placenterías aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 106 a 1 x 107 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 107 a 5 x 107 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 107 a 1 x 108 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 108 a 5 x 108 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 108 a 1 x 109 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 109 a 5 x 109 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 109 a 1 x 1010 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 1 x 1010 a 5 x 1010 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, 5 x 1010 a 1 x 1011 de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario, o más células placentarias aisladas o células de perfusado placentario. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende un número suficiente de células placentarias aisladas o células de perfusado placentario para administrar aproximadamente 2 x 107 a aproximadamente 10 x 107 células por kilogramo de un recipiente .

En otras modalidades específicas de cualquiera de las poblaciones criopreservadas anteriores, dichas células han sido pasadas aproximadamente, al menos, o no más de 5 veces, no más de 10 veces, no más de 15 veces, o no más de 20 veces.

En otra modalidad especifica de cualquiera de las células criopreservadas anteriores, dichas células se han expandido dentro de dicho recipiente- Las composiciones farmacéuticas que comprenden las células madre placentarias descritas aquí pueden comprender cualquiera, o cualquier combinación, de las poblaciones de células placentarias aisladas, o tipos de células placentarias aisladas, descritas en cualquier parte aquí. Las composiciones farmacéuticas pueden comprende células placentarias fetales, maternales o ambas células placentarias fetales y maternales, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias. Las composiciones farmacéuticas provistas aqui pueden comprender adicionalmente células placentarias aisladas obtenidas de un solo individuo o placenta, o de una pluralidad de individuos o placentas.

Las composiciones farmacéuticas provistas aqui comprenden poblaciones de células que comprenden 50% de células viables o más (esto es, al menos 50% de las células en la población son funcionales o vivas) . Preferiblemente, al menos 60% de las células en la población son viables. Más preferiblemente, al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las células en la población en la composición farmacéutica son viables.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende células placentarias aisladas que son substancialmente, o completamente, no maternales en origen, esto es, que tienen el genotipo fetal; por ejemplo, al menos aproximadamente 90%, 95%, 98%, 99% o aproximadamente 100% son no maternales en origen. Por ejemplo, en una modalidad una composición farmacéutica comprende una población de células placentarias aisladas que son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ , Y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilita la formación de uno o más cuerpos similares a embriones en una población de células placentarias que comprende dicha población de células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultivas bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo similar a un embrión; o OCT-4+ y facilita la formación de uno o más cuerpos similares a embriones en una población de células placentarias que comprende dicha población de células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo similar a un embrión o embrioide; o una combinación de lo anterior, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de dichas células placentarias aisladas son no maternales en origne. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un población de células placentarias aisladas que son CD10+, CD105+ y CD34"; CD10+, CD105+, CD200+ y CD34~; CD10+, CD105+, CD200+, CD34" y al menos, uno de CD90+ o CD45"; CD10+, CD90+ , CD105+, CD200+, CD34" y CD45"; CD10+, CD90+, CD105+, CD200+ , CD34" y CD45"; CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ y 0CT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilita la formación de uno o más cuerpos similares a embriones en una población de células placentarias que comprende dichas células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo similar a un embrión; 0CT-4+ y facilita la formación de uno o más cuerpos similares a embriones en una población de células placentarias que comprende dichas células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo similar a un embrión; o uno o más de CD117", CD133", KDR", CD80", CD86", HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~ y/o PDLI+; o una combinación de lo anterior, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de dichas células placentarias aisladas no son de origen maternal. En una modalidad especifica, la composición farmacéutica comprende adicionalmente una célula madre que no se obtiene de una placenta .

Las composiciones farmacéuticas provistas aquí pueden comprender uno o más compuestos que, por ejemplo, facilitan el injerto (por ejemplo, anticuerpos receptores de anti-células T, un inmunosupresor, o similar) ; los estabilizadores tales como albúminas, dextrano 40, gelatina, almidón de hidroxietilo, Plasmalyte, y similares. 5.7.2. Composiciones que comprenden células placentarias hematopoyéticas o células de perfusado placentario.

En ciertas modalidades de las composiciones provistas aquí, las células placentarias aisladas son células madre placentarias CD34+, por ejemplo células placentarias hematopoyéticas o células progenitoras . Tales células se pueden obtener de tejido placentario, por ejemplo, de una placenta que se ha drenado de la sangre de cordón umbilical y perfusado para eliminar la sangre residual. En ciertas modalidades, las células madre placentarias CD34+ son CD38+. En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas CD34+ son CD45+. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD34+, CD38" y CD45+. En ciertas modalidades, las células son células hematopoyéticas. En una modalidad más especifica, las células CD34+ son células hematopoyéticas. En ciertas modalidades, las células CD34* o células hematopoyéticas se obtienen de perfusado placentario. En ciertas modalidades, las células CD34+ o células hematopoyéticas se obtienen de la digestión enzimática o disrupcion física del tejido placentario. Las células CD34+ y células hematopoyéticas se pueden obtener de una sola placenta, o de más de una placenta.

En ciertas modalidades, las células de las composiciones provistas aquí, formuladas por los métodos provistos aquí, son células obtenidas del perfusado placentario. Como se usa aquí, las "células obtenidas del perfusado placentario" incluye las células totales nucleadas obtenidas de, por ejemplo, aisladas de, el perfusado placentario, un subgrupo de células nucleadas obtenidas del perfusado placentario, o células cultivadas o proliferadas de las células obtenidas directamente del perfusado placentario. El perfusado placentario se puede obtener de una placenta que se ha drenado de la sangre del cordón umbilical y perfusado para eliminar la sangre residual, antes de la perfusión para obtener las células placentarias. El perfusado placentario se puede obtener de una placenta que se ha drenado de la sangre del cordón umbilical pero no perfusado ' para eliminar la sangre residual. El perfusado placentario se puede obtener de una placenta que no se ha drenado de la sangre del cordón umbilical ni perfusado para eliminar la sangre residual. En las últimas dos modalidades, las células placentarias, por ejemplo las células nucleadas del perfusado placentario, por ejemplo, las células nucleadas totales del perfusado placentario, comprenden células nucleadas de la sangre placentaria y/o la sangre del cordón umbilical, las células del perfusado placentario se puede obtener de una sola placenta, o de más de una placenta. 5.7.3. Lineas celulares placentarias inmortalizadas Las células placentarias de mamíferos se pueden inmortalizar condicionalmente por la transfección con cualquier vector adecuado que contiene un gen que promueve el crecimiento, esto es, un gen que codifica una proteína que, bajo condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de la célula transfectada tal que la producción y/o actividad de la proteina que promueve el crecimiento es regulable por un factor externo. En una modalidad preferida el gen promotor del crecimiento es un ocogen tal como, pero no limitado a, v-myc, N-myc, cmyc, p53, antigeno T de células SV40 grandes, antigeno T grande de polioma, adenovirus Ela o proteina E7 de virus de papiloma humano.

La regulación externa de la proteina que promueve el crecimiento se puede lograr colocando el gen que promueve el crecimiento bajo el control de un promotor regulable externamente, por ejemplo un promotor de la actividad de la cual se puede controlar por, por ejemplo modificando la temperatura de las células transíectadas o la composición del medio en contacto con las células. En una modalidad, se puede emplear el sistema de expresión de gen ( tet ) -controlada por tetraciclina (ver Gossen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93; 1518-1523, 1996) . En la ausencia de tet, un transactivador controlado por tet (tTA) dentro de este vector activa fuertemente la transcripción de p c v*-i/ un promotor mínimo del citomegalovirus humano fusionado a las secuencias del operador tet. La tTA es una proteína de fusión del represor (tetR) del operón de resistencia tet derivado de transposón 10 de Escherichia coli y el dominio ácido de VP16 del virus de herpes simple. Concentraciones bajas no tóxicas de tet (por ejemplo, 0.01-1.0 g/ml) abóle casi completamente la transactivación por tTA.

En una modalidad, el vector además contiene un gen que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo una proteina que confiere resistencia al fármaco. El gen de resistencia bacteriana a la neomicina (neoR) es un marcador tal que se puede emplear dentro de los presentes métodos. Las células que llevan el neoR se pueden seleccionar por medios conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, tal como la adición de, por ejemplo, 100-200 µg/ml G418 al medio de crecimiento .

La transfección se puede lograr por cualquiera de una variedad de medios conocidos a aquellos con habilidades ordinarias en la técnica que incluye, 'pero no limitado a, infección retroviral. En general, un cultivo celular se puede transfectar por incubación con una mezcla de medio condicionado recolectado de la linea celular productora para el vector y DMEM/F12 que contiene suplementos N2. Por ejemplo, un cultivo celular placentario preparado como se describe arriba se puede infectar después, por ejemplo cinco días in vitro por incubación por aproximadamente 20 horas en un volumen de medio condicionado y dos volúmenes de DMEM/F12 que contiene suplementos N2. Las células transfectadas que portan un marcador seleccionable se puede seleccionar entonces como se describe arriba.

Después de la transfección, los cultivos se hacen pasar sobre una superficie que permite la proliferación, por ejemplo, permite al menos el 30% de las células se dupliquen en un periodo de 34 horas. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, que consiste de plástico con cultivo de tejido revestido con poliornitina (10 pg/ml) y/o laminina (10 g/ml) , un sustrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina . Los cultivos se alimentan cada 3-4 días con medio de crecimiento, que se puede o no suplementar con uno o más factores mejoradores de proliferación. Los factores mejoradores de proliferación se pueden agregar al medio de crecimiento cuando los cultivos son confluentes menos del 50%.

Las lineas celulares placentarias inmortalizadas condicionalmente se pueden hacer pasar usando técnicas estándar, tal como tripsinización, cuando son confluentes al 80-95%. Hasta aproximadamente el pasaje vigésimo, es en algunas modalidades benéfico mantener la selección (mediante, por ejemplo, la adición de G418 para las células que contienen un gen de resistencia a la neomicina) . Las células se pueden congelar también en nitrógeno liquido para un almacenamiento a largo plazo.

Las líneas celulares clónales se pueden aislar de una línea celular placentaria humana inmortalizada condicionalmente preparada como se describe arriba. En general, tales lineas celulares clónales se pueden aislar usando técnicas estándar, tal como por dilución limite o usando anillos de clonación, y expandido. Las lineas celulares clónales en general se alimentan y se hacen pasar como se describió arriba.

Las lineas de células humanas inmortalizadas condicionalmente, que pueden, pero no necesariamente, ser clónales, se pueden inducir generalmente para diferenciar mediante supresión la producción y/o actividad de la proteina promotora del crecimiento bajo condiciones de cultivo que facilitan la diferenciación de un promotor regulable externamente, las condiciones, por ejemplo, la temperatura o composición del medio, se puede modificar para suprimir la transcripción del gen promotor del crecimiento. Para el sistema de expresión de gen controlada por tetraciclina discutida arriba, la diferenciación se puede lograr por la adición de tetraciclina para suprimir la transcripción del gen promotor del crecimiento. En general, 1 g/ml de tetraciclina por 4-5 días es suficiente para iniciar la diferenciación. Para promover además la diferenciación, se pueden incluir agentes adicionales en el medio de crecimiento. 5.7.4. Equipos o kits En otro aspecto, se proporcionan aquí kits o equipos para la producción y/o administración de las composiciones que contienen células placentares aisladas de la presente invención .

En una modalidad, se proporciona aqui un equipo que comprende, en recipientes separados, uno o más de una solución que contiene dextrano, por ejemplo, dextrano 40, una solución que comprende albúmina de suero humano (HSA) , y un ciropreservador . En una modalidad especifica, el equipo comprende una pluralidad de células placentarias aisladas, por ejemplo células placentarias aisladas criopreservadas . En una modalidad especifica, el equipo comprende un recipiente que contiene una solución que comprende 5.5% de dextrano 40 (p/v) y 10% de HSA (p/v) . En otra modalidad específica, el equipo comprende un recipiente que comprende una solución que comprende 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA y 5% de DMSO. En otra modalidad específica, el equipo comprende un recipiente que comprende una solución de 10% de dextrano 40.

En otra modalidad, el equipo comprende un filtro, una pluralidad de filtros, adecuados para filtrar las suspensiones de células. En modalidades específicas, uno o más filtros en el equipo comprende poros entre aproximadamente 50 µ? de diámetro a aproximadamente 150 µ? de diámetro. En más modalidades específicas, el filtro es un filtro de 70 µ?. En otra modalidad específica, el filtro es un filtro de 100 µ?.

En otra modalidad, el equipo comprende uno o más artículos de vidrio o de plástico adecuados para la producción o uso de una de las composiciones descritas aquí. Por ejemplo, el equipo puede comprender, por ejemplo, una bolsa de plástico adecuada para la criopreservación o dilución o sumiistro de una suspensión de células, por ejemplo una suspensión de células placentarias aisladas. En otra modalidad, el equipo comprende (1) una pluralidad de células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, por ejemplo en uno o más viales o ampolletas; (2) artículos de plástico suficientes para cultivar dichas células placentarias aisladas por ejemplo 2-3 pasajes; (3) un recipiente que comprende una solución que comprende 5.5% de dextrano 40 (p/v) y 10% de HSA (p/v) ; (4) un recpiente que comprende una solución que comprende 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA y 5% de DMSO; (5) un recipiente que comprende una solución al 10% de dextrano 40; y (6) uno o más filtros que comprenden poros entre aproximadamente 50 µ? de diámetro a aproximadamente 150 µ de diámetro, en donde los filtros son adecuados parta filtrar soluciones que comprenden células . 6. EJEMPLOS 6.1 EJEMPLO 1 : MÉTODO MEJORADO DE PRODUCCIÓN DE COMPOSICIONES ADMINISTRABLES QUE COMPRENDEN CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS.

Este ejemplo demuestra la formulación de células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+, CD200+ humanas tanto antes como después de la criopreservacion, para producir células placentarias aisladas de alta viabilidad, homogéneas, para la dministración a humanos o animales. La composición resultante comprende células placentarias aisladas que muestran alta viabilidad y sin amontonamientos de células macros durante al menos un periodo de 4 horas postdescongelación. Un estudio en ratones de dosificación aguda demostró que los ratones NOD/SCID toleraron una dosis máxima de al menos 1.5 millones de células por ratón (aproximadamente 75 millones de células por kg suponiendo un peso promedio de 20 gramos) usando la formulación final descrita abajo por administración por infusión intravenosa sin ninguna toxicidad cardiaca o pulmonar (evidenciada por la respiración dificultosa, circulación, y la no coordinación) , y hasta 250 millones de células por kg subcutáneamente, un mejoramiento sobre las formulaciones previas. Mientras que el siguiente ejemplo describe la formulación de células placentarias aisladas que expresan marcadores superficiales particulares, los resultados presentados aquí indican que los métodos y formulaciones se pueden ' usar, y son compatibles con otras células, por ejemplo las células de mamíferos que expresan diferentes marcadores superficiales.

Ensayos de agregados celulares Los agregados celulares se clasificaron como agregados macro celulares o agregados micro celulares. Los agregados macro celulares y los agregados micro celulares se identificaron, si están presentes, de acuerdo con los siguientes procedimientos.

Ensayos de agregados macro celulares Las células se descongelaron en un recipiente en un baño de agua a 37°C hasta solo una pequeña pieza de hielo restante en el recipiente. Las células se extrajeron del recipiente usando una jeringa equipada con una aguja de calibre 16, y las células se surtieron desde el recipiente hacia un tubo cónico de 50 mi. La presencia o ausencia de los agregados macro celulares se evaluaron por inspección visual.

Ensayo de agregados micro celulares Se contaron las células para determinar la concentración celular. Las células se diluyeron entonces a 4 x 106 células/ml con 10% de dextrano 40, y 50 µ? de las células, 40 µ? de dextrano 40 al 10%, y 10 µ? de una solución de cuentas de medidas 40 µ? se agregó a un tubo de microcentrifuga de 1.7 mi. Los contenidos del tubo se mezclaron suavemente. Diez µ? de la muestra mezclada se colocaron en un portaobjetos de vidrio y se cubrieron con una cubierta deslizante. Todos los agregados de micro células que comprenden tres o más células se contaron.

Las células placentarias usadas se obtuvieron inicialmente de un banco de células que contenia poblaciones de células placentarias adherentes, como se describe aquí, que han sufrido 4-6 pasos o pasajes antes de la criopreservación .

Los datos de la comparación in vivo de amortiguadores compatibles por inyección in vivo, usando dos diferentes lineas celulares placentarias aisladas, indicaron que la solución salida amortiguada con fosfato (PBS), Plasmalyte A y Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM) con el suplemento de albúmina de suero humano al 1% (HSA) son todas capaces de mantener una alta viabilidad de células después de 5 horas post-descongelación . La concentración final de células en el amortiguador fue de 25 x 106 células/ml. El Plasmalyte A se seleccionó como promotor de la más alta viabilidad de células de los amortiguadores probados. Como se demuestra en la Tabla 10a y Tabla 10b, la alta viabilidad de mantuvo por muchas horas post-descongelación; además, los fenotipos nominales no se cargaron durante 3 horas post-descongelación. La viabilidad de las células en la formulación postdescongelación no se afectó significativa después del paso de las células a través de una aguja calibre 16. Una determinación de los agregados celulares en estos dos experimentos no fue posible debido al volumen de muestra pequeño usado.

Basado en los datos en la Tabla la y Tabla Ib, la formulación de post-descongelación finalizó como sigue: Las células se descongelaron a 37 °C en un baño de agua e inmediatamente se diluyeron 1:1 (v/v) con amortiguador de descongelación (2.5% de HSA + 5% de Dextrano 40) . Las células se centrifugaron entonces a 400 g durante 5 minutos y se resuspendieron en Plasmalyte A + 1% de HSA.

Tabla la: Viabilidad post-descongelación y fenotipo de células placentarias en Plasmalyte A + 1% de HSA sin una prueba de jeringa/aguja.

Tabla Ib: Viabilidad post-descongelación y fenotipo de células placentarias en Plasmalyte A + 1% de HSA con una prueba de jeringa/aguja.

Estudio de Biodistribución de ratones La formulación de post-descongelación de arriba se aplicó en un estudio de biodistribución piloto de ratones. Los agregados macro celulares se observaron durante la preparación de células post-descongelación, especialmente después de la adición de Plasmalyte. Con esta preparación celular, se observó toxicidad pulmonar aguda a una dosis de 1 millón de células por ratón (alrededor de 20 g) por dos infusiones intravenosas de repetición de 0.5 millones de células cada una. Estas dos observaciones impulsaron investigación adicional de la formulación de células placentarias.

Basado en las observaciones de un estudio de biodistribución piloto de ratones que se indujeron agregados celulares significativos después de la adición de Plasmalyte A, pero no Dextrano 40, Dextrano 40 se usó para este estudio como un medio de dilución, junto con Plasmalyte A, HSA y PBS.

Tabla 2. Los agregados celulares clasificados a 4 horas de post-descongelación . Los números inferiores indican menos agregados .

Las células, previamente congeladas en Plasmalyte A + 10% de HSA + 5% de D SO, se descongelaron en un baño de agua a 37 °C y se diluyó 1:7 con los respectivos amortiguadores. Los datos en la tabla 2 muestran que Dextrano 40 con HSA indujeron los agregados celulares menores entre los medios probados.

Los agregados celulares se observaron inmediatamente post-descongelación en varias formulaciones. La adición de una etapa de filtración, en donde las células post-descongelación se filtraron a través de un filtro de 100 µ?, eliminó los agregados celulares. Los lotes de células placentarias se probaron para el efecto de filtración en combinación con diluyentes específicos. No se formaron agregados macro celulares post-filtración cuando las células se diluyeron 1:1 con 10% de Dextrano 40 por un periodo de 4 horas postdescongelación. Ver las tablas 3a-3c. Además, la viabilidad permanece alta. Se observaron resultados similares a través de muchos lotes diferentes de células placentarias.

Tabla 3a: Agregados macro celulares Tabla 3b. Agregados micro celulares post-filtración en Dextrano 40 Tabla 3c: Viabilidad post-filtración en Dextrano Plasmalyte A Con base en los estudios anteriores, las células placentarias de formulación post-congelación se simplificaron para el siguiente procedimiento: Las células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C durante hasta 3 minutos, luego se filtraron a través de un tamiz de 100 µ?. Las células tamizadas se diluyeron entonces 1:1 (v:v) con 10% de dextrano 40.

Formulación pre-congelación Los agregados celulares también se observaron en la fase de pre-congelación del procesamiento celular. El medio de congelación, la densidad de células congeladas y una etapa de filtración por suspensión se estudiaron para reducir y/o eliminar los agregados celulares antes del congelamiento.

Medio de congelación Con base en el éxito del Dextrano 40 en la formulación post-descongelación, de arriba, El Dextrano 40 se comparó con Plasmalyte como un medio de congelación. Las células del LOTE 3 se congelaron a una concentración de 17 millones de células por mililitro ya sea en Plasmalyte A + 10% de HSA * 5% de DMSO o en 5% de Dextrano 40 + 10% de HSA + 5% de DMSO. La presencia de agregados celulares se evaluó como sigue: Tabla 4a: Comparación de Plasmalyte y Dextrano 40 como medio de congelación - Agregados macro celulares Plasmalyte A Dextrano 40 Agregado macro celular Más que Dextrano 40 Menos que Plasmalyte A Pérdida celular después 20% 3% de la filtración con tamiz 100 µ Tabla 4b : Comparación de Plasmalyte A y Dextrano 40 como medio de congelación - agregados micro celulares Tabla 4 c : Comparación de Plasmalyte A y Dextrano 40 como El uso del Dextrano 40 en estos experimentos resultó en menos agregados macro celulares , menos agregados micro celulares , y más alta viabilidad de células que el uso de Plasmalyte A . En base a estos resultados , el Dextrano 40 se seleccionó como el medio de congelación .

Densidad de células congeladas y Filtración del pre-congelado Para eliminar los agregados macro celulares y minimi zar los agregados micro celulares , se examinaron la dens idad celular y la f iltración del pre-congelado como sigue : Tabla 5a. El efecto de la densidad del congelado de células y la filtración del pre-congelado en la formación de agregados Concentración: células por mililitro Tabla 5b: El efecto de la densidad del congelado de células y la filtración del pre-congelado en la formación de agregados macro celulares No: Sin formación de macro agregados Si: formación de macro agregados Tabla 5c: El efecto de la densidad del congelado de células y la filtración del pre-congelado en los agregados micro celulares (agregados por 106 células) Los resultados mostrados en las Tablas 5b y 5c muestran claramente que la filtración pre-congelación eliminó la formación de agregados macro celulares post-descongelación . Los datos también indica que las muestras con alta concentración de células, por ejemplo 20 x 106 células/ml, tienen más potencial para formar agregados micro celulares post-descongelación. Como resultado, el efecto de la densidad del congelado de células en la formación de agregados celulares se examinó adicionalmente .

Tabla 6a. Efecto de la densidad celular del congelamiento en la formación de agregados celulares Concentración: número de células por mililitro Tabla 6b: Efecto de la densidad celular del congelamiento en la formación de agregados macro celulares : sin formación de agregados macro celulares formación de agregados macro celulares Tabla 6c: El efecto de la densidad celular decongelación en los agregados micro celulares (agregados por 106 células) Los resultados en las Tablas 6b y 6c demuestran gue la densidad del congelado a 7.5 x 106 celulas/ml o menos no induce los agregados macro celulares post-descongelación . Además, las concentraciones de hasta 10 x 106 células/ml, el número de agregados micro celulares es razonablemente bajo, a menos de 200 agregados micro celulares/millón de células.

Basado en los resultados anteriores, se generaron las formulaciones pre-congelación y post-descongelación como sigue. Una formulación de pre-congelación, las células placentarias de cultivos líquidos se centrifugaron a 220 x g durante 5 minutos, y se resuspendieron en 5% de Dextrano 40 a aproximadamente 7.5 x 106 células/ml. Las células se centrifugaron a 400 x g durante 10 minutos, luego se resuspendieron en 6% de Dextrano 40 y 10% de HSA a aproximadamente 7.5 x 106 células/ml. Las células se resus'pendieron y se hicieron pasar a través de un filtro de 70 µ? por gravedad. Las células se filtraron y luego se diluyeron en 5% de Dextrano 40, 10% de HSA y 5% de DIVISO a una 5 concentración de aproximadamente 7.5 x 106 células por mi. Las células diluidas se colocaron en crio-bolsas, se congelaron y se almacenaron bajo nitrógeno en fase de vapor. Para la formulación post-descongelación, las células congeladas se descongelaron en un baño de agua a 37 °C, luego se diluyeron í 10 con 10% de Dextrano 40 a varias proporciones de 1:1 a 1:5 de ' amortiguador : dextrano 40 que contiene células.

Valoración de la formulación de células placentarias 1. Sin formación de agregados de macro células postdescongelación 15 Se produjeron cinco lotes de células placentarias usando el método de formulación anterior (incluyendo LOTE 11 y LOTE 12, descritos abajo). Los agregados macro celulares postdescongelación no se observaron en ninguno de los cinco lotes, y el número de agregados micro celulares permaneció bajo. 20 2. Sin impacto en el fenotipo El fenotipo de las células placentarias no se afectó por la formulación mejorada. Más del 90% de las células en la formulación permanecieron CD10+, CD34", CD105+ y CD200+. 3. Estudios en ratones GLP 25 Se usaron LOTES 12 de células para un estudio de biodistribución de ratones. Las células placentarias se administraron en la formulación anterior como una sola inyección intravenosa y/o repetición en la vena de la cola tanto a ratones machos como a hembras NOD-SCID o machos C57BL/10SgSnAi-Rag2 (tmi) ye (tmi) . Los ratones se sacrificaron a 4, 14, 28 o 47 días post-tratamiento y muestras del pulmón, corazón, ríñones, bazo, glándulas adrenales, médula ósea y cerebro se procesaron y analizaron por Q-PCR para la presencia de la secuencia de ADN hTERT; el hTERT es el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana. A continuación de la administración i.v. se detectó el ADN humano en el ADN total aislado de las muestras de pulmón, cerebro, corazón y/o hígado en los ratones que se sacrificaron a los 4 días después de la administración de la dosis. Los más altos niveles de ADN se detectaron en los pulmones. Los ratones fueron capaces de tolerar 25-100 millones de células por kg de administración por infusión intravenosa sin ninguna toxicidad cardíaca o pulmonar. Las células del LOTE 11 se usaron para un estudio de tumorigenicidad en ratones. Los ratones fueron administrados con hasta 250 millones de células por kg subcutáneamente (SC) sin ningún efecto adverso. 6.2 EJEMPLO 2: COMPOSICIONES MEJORADAS ADMINISTRABLES Este ejemplo demuestra una formulación decélulas placentarias CD34", CD10+, CD105+ y CD200+ adherentes al plástico del cultivo de tejido multipotentes de humano, que aún después de la criopreservación, representan células de alta viabilidad, homogéneas, adecuadas para la administración a humanos o animales. Las células de la formulación exhiben en promedio un decremento de 400 veces en la cantidad de agregados formados, y una Dosis Máxima Tolerada (MTD) mejorada de aproximadamente 3 veces mejoradas sobre una formulación previa en un modelo intravenoso de ratón (no se muestran los datos) . Mientras que el siguiente ejemplo describe la formulación de células placentarias aisladas que expresan marcadores de superficie particulares, los resultados presentados aquí indican que os métodos y formulaciones se pueden usar, y son compatibles con otras células, por ejemplo las células de mamíferos que expresan diferentes marcadores superficiales .

La formulación (designada "Formulación B") comprende células placentarias del fenotipo celular anterior a una concentración de 10 + 3 x 106 células/ml, en una solución que contiene 5.5% (p/v) de dextrano 40, 10% (p/v) de Albúmina de Suero Humano (HSA) , y 5% (v/v) de sulfóxido de dimetilo (DMSO) . El HSA y el Dextrano 40 usados aquí son de grado clínico, DMSO es de grado GMP.

Una formulación basada en Plasmalyte designada "Formulación A" se describe y compara con la Formulación B, una formulación basada en Dextrano 40, en la Tabla 7. Las células se filtraron en suspensión a través de una malla de 70 µp? en la preparación de la Formulación B, pero no se filtraron en la preparación de la Formulación A.

Tabla 7. Composición de Formulación A y Formulación B Se observó una agregación celular significativa cuando se descongeló la Formulación A. Las investigaciones subsecuentes mostraron que un número de parámetros, incluyendo la composición del medio de formulación y la concentración del congelado de las células fueron contribuyentes clave a la agregación celular. Se condujeron estudios de optimización y la Formulación B se diseñó específicamente para reducir o eliminar estos efectos de agregación celular. Además, la filtración de la suspensión celular a través de una malla de 70 µp? como parte del proceso se introdujo para proporcionar mejor control de las suspensiones celulares durante la formulación .

Para cuantificar los agregados celulares en la formulación, se diseñó un ensayo de retención de filtro como una herramienta de desarrollo y se usó para comparar una serie de lotes de composiciones de células placenterías producidos tanto por la Formulación A como por la Formulación B. Esto se volvió particularmente crítico puesto que la agregación celular en la Formulación B se redujo hasta el punto donde no fue discernible de manera confiable a simple vista. Una comparación de muestras múltiples analizadas de los lotes representativos de la Formulación A y la Formulación B se muestra en la Tabla 8. El método cuantifica los agregados celulares pre-teñidos retenidos en un filtro de diferentes muestras por la formación digital de imágenes del filtro, y reporta el área del filtro ("Area Media") cubierta por los agregados. Como se muestra en la tabla 8. La Formulación B tuvo consistentemente menos cobertura de área (agregados) que la Formulación A, con la diferencia en promedio siendo de 400 veces. Los datos también muestran buen control del proceso y reproducibilidad para la Formulación B. Los lotes de composiciones de células placentarias aisladas de las dos formulaciones, usados para los estudios in vivo también se indican en la Tabla 16. El cambio de la Formulación A a la Formulación B mejoró la Dosis Máxima Tolerada (MTD) aproximadamente 3 veces en un modelo de ratón intravenoso in vivo (no se muestran los datos) .

Tabla 8 : Formación de agregados post-descongelación en la Formulación A y la Formulación B Lote Bolsas Filtros Area Desviación CV Formulación media estándar (prueba in vivo (px/MM) indicada por *) 1 2 13 97490 38369 0.39 Formulación A 2 12 98629 33 165 0.34 Formulación A* 1 1 2 63 81 1 .28 Formulación B* 1 2 2 38 12 0.32 Formulación B 1 3 2 1539 573 0.37 Formulación B* 1 4 2 137 43 0.3 1 Formulación B 1 5 3 6 125 162 1 .29 Formulación B 6 3 6 71 57 0.81 Formulación B Palabras clave: "Bolsas" indica el número de bolsas de composiciones celulares aisladas descongeladas y probadas para ese lote; "Filtros" indica el número total de ensayos replicados para ese lote; "área media" indica la cobertura del área media de los filtros para ese lote en unidades de pixeles/millones de células aplicados al filtro; "Desviación estándar" indica la desviación estándar; "CV" = coeficiente de variación. 6.3 EJEMPLO 3: CARACTERIZACIÓN DE LAS COMPOSICIONES MEJORADAS ADMINISTRABLES Este ejemplo proporciona carcaterización adicional de las formulaciones farmacéuticas que comrpenden HSA, dextrano 40 y DMSO. Los métodos usados en uno o más de los experimentos descritos abajo son como sigue: Valoración de la viabilidad celular: Se valoró la viabilidad por un ensayo de exclusión de azul de tripano usando ya sea un hemocitómetro o un analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) . La viabilidad se expresó como un porcentaje de células viables fuera del total e células.

Conteos celulares: Las células se contaron usando ya sea un hemocitómetro o un analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) . Los conteos celulares se expresaron como millones de células por mililitro (MM/ml) .

Agregación celular: Se midió la cantidad de agregación celular usando un Ensayo de Retención de Filtro (FRA), que mide la cantidad de agregación celular tiñendo las células y haciendo pasarlas a través de un filtro de 70 µp?. Los agregados celulares mayores que 70 m no pueden pasar por el filtro y se cuantifican por análisis de imagen usando un analizador d viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) . Los datos se expresaron en pixeles por millones de células cargadas (px/M ) .

Citometria de flujo: Se valoraron las células para los niveles de los marcadores celulares CD10, CD34, CD105 y CD200 por citometria de flujo. Los valores se expresaron como un porcentaje de las células positivas y/o negativas para un marcador particular, o combinación de marcadores.

Inmunosupresión : La actividad de inmunosupresión de las células en la formulación descrita abajo se valoró usando un ensayo de Reacción de células T en Cuentas (BTR) , que mide la capacidad de la células de suprimir una respuesta de las células T a las cuentas antigénicas.

Mientras que los siguientes ejemplos describen la formulación de células placentarias aisladas que expresan marcadores superficiales particulares, los resultados precedentes aquí indican que se pueden usar los métodos y formulaciones, y son compatibles, con otras células, por ejemplo las células de mamíferos que expresan diferentes marcadores superficiales. 6.3.1 CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPORCIONES DE DMSO Y DEXTRANO : HSA Este ejemplo describe el efecto de la variación de las concentraciones de HSA, Dextrano y DMSO, y de la variación de la relación de dextrano a HSA, en la agregación celular, la viabilidad celular y la recuperación y el fenotipo celular y funcionalidad.

Condiciones experimentales El espacio de solución de los tres componentes (HSA, dextrano 40 y DMSO) para la formulación celular se investigó en las condiciones mostradas en el diagrama ternario en la FIG 1. Las condiciones experimentales se escogieron a lo largo de dos ejes: uno que prueba diferentes porcentajes de DMSO mientras que mantiene la relación de Dextrano:HSA constante (ver formulaciones 1-4, abajo), y otro que varió la relación de Dextrano:HSA mientras que mantiene el porcentaje constante de D SO (ver formulaciones 3,5-8 abajo) .

Materiales y Métodos Aproximadamente doce millones de células multipotentes placentarias CD10+, CD34", CD105+, CD200+ criopreservadas se expandieron en Fábricas de células de 10 charolas Nunc™, una para cada formulación de abajo, a aproximadamente 1.2 x 108 células. Las células se cosecharon por incubación durante 10 minutos, a temperatura ambiente con 0.25% de Tripsina/EDTA. Las células disociadas se transfirieron a un tubo de centrífuga de 500 mi que contenia 250 mi de suero de bovino fetal al 2% (FBS) en el medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) . Las células se centrifugaron entonces a 1040 RPM en tubos de 500 mi en una centrífuga Sorvall RC3BP. Las células se resuspendieron en una solución salina al 0.9% /dextrano 40 al 5%. Las células se centrifugaron a 1420 RPM durante 10 minutos y se suspendieron en 10 mi de una de las siguientes ocho formulaciones (relaciones de dextrano :HSA se muestran en unidades de "fracción de volumen de HSA al 25%" (VF HSA) para las formulaciones y 5-8) : Formulación 1: 20% de DMSO, 8.5% de HSA, 4.6% de dextrano 40 Formulación 2: 10% de DMSO, 9.5% de HSA, 5.2% de dextrano 40 Formulación 3: 5% de DMSO, 10% de HSA, 5.5% de dextrano 40 (VF HSA = 0.4) (formulación control) Formulación 4: 0% de DMSO, 10.5% de HSA, 5.8% de dextrano 40 Formulación 5: 5% de DMSO, 0% de HSA, 9.5% de dextrano 40 (VF HSA = 0) Formulación 6: 5% de DMSO, 3.125% de HSA, 8.25% de dextrano 40 (VF HSA = 0.125) Formulación 7: 5% de DMSO, 16.88% de HSA, 2.75% de dextrano 40 (VF HSA = 0.675) Formulación '8: 5% de DMSO, 23.75% de HSA, 0% de dextrano 40 (VF HSA = 0.95) Las formulaciones se prepararon de las siguientes soluciones base: 100% de DMSO (Bioniche Pharma, Belleville, Ontario) , 25% de HSA (Octapharma , Hoboken, New Jersey) y 10% de dextrano 40 en 0.9 % de solución salina (Hospira, Lake Forrest, Illinois) .

Ensayo de Retención de Filtro: Se valoró la agregación celular a través del uso del ensayo de retención del filtro. Las concentraciones de células se ajustaron a aproximadamente 1.2 x 107 ce'lulas/ml antes de la filtración. La carga del filtro (número de células por unidad de área del filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2.4 x 108 células/filtro. Las células se criopreservaron en un congelador con velocidad de control Thermo a -70 °C a una concentración de 7.5 x 106 células/ml. Las células se descongelaron antes del uso, y las muestras se procesaron poco antes del descongelamiento. Una muestra de 100 µ? de la suspensión de células no diluidas se tomó post-descongelación, se diluyó con 900 µ? de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y losconteos celulares se realizaron en duplicado usando un analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) y se reportó como números de pixeles por millón de células (los números más altos de pixeles indican los más altos números de agregados celulares) .

Ensayo de viabilidad celular (Ensayo MTS) : La viabilidad celular se determinó usando un Ensayo de proliferación Celular No Radiactiva CellTiter 96® (Promega, Madison, Wisconsin) . Las células en placas de 96 pozos se combinaron con (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -5- ( 3-carboximetoxifenil ) -2- ( -sulfofenil ) -2H-tetrazolio) (MTS) y metosulfato de fenazina (PMS), un reactivo acoplador de electrones, de acuerdo con las directivas del fabricante. Se determinó la absorbancia a 490 nm del producto de formazán resultante, producido por bioreducción celular de MTS.

Ensayo en placas de pozos Annexin: Lascélulas descongeladas se diluyeron a una concentración de 1 x 105 en una solución de etiquetado Annexin-V (Roche, Cat. No. 11 828 681 001) . Se agregaron 100 µ? de la suspensión celular a una placa de 96 pozos en triplicado y se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente sin exposición a la luz. Después de 15 minutos, tres diferentes posiciones dentro de cada pozo se obtuvieron por imagen bajo luz en campo brillante y fluorescente (longitud de onda de excitación de 488 nm y detección a longitud de onda de 528 nm) . Se usó un programa de 'computo de conteo celular automatizado (Axiovision) para el conteo total de células por imagen. Se determinaron las poblaciones de células apoptóticas/necróticas por conteo de células positivas en Annexin en cada posición (imagen fluorescente) y dividiendo el total de células en cada posición (imagen de campo brillante) . Se determinaron las poblaciones de células apoptóticas/necróticas por condición mediante un promedio de las poblaciones contadas en tres diferentes posiciones del pozo, de 3 pozos.

Resultados Agregación celular A través de la variación de porcentajes de DMSO, por ejemplo 0 a 20 por ciento (formulaciones 1-4), no se observó efecto en la agregación celular, como se muestra en la FIG 2. Todas las condiciones DMSO exhibieron niveles de agregación dentro del rango observado para la formulación de control que comprende 5% de DMSO, 5.5% de dextrano 40 y 10% de HSA. Las concentraciones de HSA y Dextrano también variaron a una concentración constante de 5% de DMSO (FIG. 3), con las condiciones variando desde nada de HSA (fracción en volumen de HSA = 0) y nada de Dextrano (fracción en volumen de HSA = 0.95) . Los valores FRA a través de las fracciones de volumen de 0.125 a 0.95 de HSA al 25% (concentración final 3.125% a 23.75% de HSA, respectivamente) indicó agregación minima. Los niveles observados de agregación en la presencia de HSA fueron iguales a o menores que la formulación de control que comprende 5% de DMSO, 5.5% de Dextrano 40 y 10% de HSA.

Viabilidad y Recuperación de Post-congelación Se midieron las viabilidades de post-descongelación (FIG. 4) y la recuperación de post-descongelación (FIG. 5) a través de diferentes porcentajes de DMSO (0, 5, 10 y 20%) se midieron a través de la exclusión de azul de tripano, usando el contador de células automatizado Vi-Cell, para valorar las capacidades crioprotectoras de cada formulación. La viabilidad post-descongelación fue mayor al 90% con las formulaciones que comprenden 0%, 5% y 10% de DMSO, respectivamente, con un valor máximo observado a 5% de DMSO, mientras que la viabilidad estuvo abajo del 75% con una formulación que comprende 20% de DMSO. El re-establecimiento del cultivo se midió a través del ensayo MTS. Se observó el re-establecimiento del cultivo para un máximo a 5% de DMSO (FIG. 6) .

El perfil de viabilidad a través de las diferentes fracciones de volúmenes del 25% de HSA, es decir, diferentes proporciones de Dextrano-HSA, se muestra en las FIGS 7-9. La viabilidad de post-descongelación, como se determinó por exclusión con azul de Tripano, exhibió valores que varían desde 83.5% hasta 98.5% a través de varias fracciones de volúmenes de HSA (FIG. 7) . Se logró un valor máximo a una fracción de 0.40 de 25% de HSA, es decir 10% de HSA: 5.5% de Dextrano 40. También se calculó la recuperación celular postdescongelación y los valores variaron desde 80% hasta 120%, aunque las muestras que comprende al menos 0.2 fracciones de volumen de 25% de HSA exhibieron valores que van desde 100% a 120% (FIG: 8) . Los datos de re-establecimiento del cultivo como se determina por el ensayo MTS, exhibió un perfil similar a aquel de la viabilidad post-descongelación, con el valor máximo que se presenta a una fracción de 0.125 de 25% de HSA, es decir 3.13% de HSA:8.25% de Dextrano 40 (FIG. 9) .

La viabilidad con tripano no tiene la capacidad de detectar células apoptóticas. Sin embargo el análisis de las distribuciones del tamaño celular pueden indicar los cambios en la salud de las células. Para estimar el porcentaje de las células apoptóticas en las poblaciones de células descongeladas de los congelados de células en la ausencia de DMSO, se realizó un ensayo de Annexin en placas de pozos post-descongelados . Los ensayos estimaron que 51% de los congelados celulares en 0% de DMSO sufrieron apoptóticas cuando en oposición al 15%. de apoptosis cuando se congelan en 5% de DMSO (no se muestran los datos) .

Fenotipo y Funcionalidad La capacidad de mantener el fenotipo de las células CD10+, CD34", CD105+, CD200+ se probó a través de diferentes porcentajes de componentes por citometria de flujo. Las células formuladas en la Formulación 2 (10% de D SO, 9.5% de HSA, 5.2% de dextrano 40), las formulaciones 5 (5% de DMSO, 0% de HSA, 9.5% de dextrano 40), formulación 6 (5% de DMSO, 3.13% de HSA, 8.25% de dextrano 40) y formulación 7 (5% de DMSO, 16.88% de HSA, 2.75% de dextrano 40) mantuvieron este fenotipo aproximadamente asi como la formulación 3 de control, y tuvo valores de DC105+/CD200+ entre 80.3% y 84.5%. Adicionalmente, la expresión CD10+/CD34+ fue >95% para cada formulación. Las condiciones 1, 4 y 8 indicaron un cambio en las características físicas de las células, posiblemente debido a los desechos que afectaron el ensayo de citometria de flujo.

La funcionalidad celular se valoró a través de un ensayo de Reacción de células T con cuentas (BTR) , que mide la capacidad de las células de suprimir una respuesta de las células T a las cuentas antigénicas (FIG. 10) . La formulación 6 (5% de DMSO, 3.13% de HSA, 8.25% de dextrano 40), y la formulación 7 (5% de DMSO, 16.88% de HSA, 2.75% de dextrano 40) tuvieron supresión dentro de 1 desviación estándar de una formulación 3 de control que comprende 5% de DMSO/10% de HSA y 5.5% de dextrano 40). Estas tres muestras tuvieron las más altas viabilidades en azul de tripano y los valores de re-establecimiento de cultivo. Las otras muestras tuvieron bajos niveles de supresión, con una reducción que generalmente se correlaciona con el MTS disminuido.

Conclusiones : Las formulaciones que comprenden concentraciones de DMSO que varias desde 0 hasta 20% exhiben niveles de agregación celular comparables a aquellos observados para una formulación de control que comprende 5% de DMSO, 10% de HSA y 5.5% de dextrano 40. Sin embargo, se redujo la viabilidad celular cuando las célula se criopreservaron en la formulación que comprende 20% de DMSO, y las células congeladas en 0% de DMSO exhibieron apoptosis mejoradas significativamente postdescongelación en relación con las células congeladas en 5% de DMSO. No hubo degradación apreciable del fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+ para las formulaciones que comprende 5% y 10% de DMSO. Asi, los resultados anteriores demostraron que el uso de las formulaciones que comprenden 5-10% de DM;SO es le preferido para mantener la viabilidad post-descongelación .

Con respecto a la variación de la proporción de HSA: dextrano, las formulaciones que comprenden 23.75% de HSA, 0% de dextrano exhibieron alguna reducción en la viabilidad post-descongelación y re-establecimiento del cultivo, mientras que los valores de la viabilidad post-descongelación, la actividad inmunosupresora y de re-establecimiento fueron los más altas para las formulaciones que comprenden las relaciones dextrano:HSA de: (1) 3.13% de HSA a 8.25% de dextrano; (ii) de 10% de HSA a 5.5% de dextrano; y (iii) 16.88% de HSA a 2.75% de dextrano. Entonces estos resultados demuestran que la relación HSA: dextrano de las formulaciones descritas aquí pueden variar dentro de un rango definido sin una apreciable pérdida de viabilidad celular, de recuperación celular después de la descongelación, de degradación del fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+' o de la actividad inmunosupresora , en relación a las formulaciones que comprenden una relación de dextrano: HSA de 10% de HSA y 5.5% de Dextrano 40. Los datos presentados aqui soportan un rango de trabajo de relaciones de HSA: dextrano de al menos entre aproximadamente 6:1 de HSA: dextrano a aproximadamente 1:2.6 HSA: dextrano . 6.3.2 EFECTO DE LA DENSIDAD CELULAR EN CONGELACIÓN Este ejemplo describe los efectos de la concentración celular, por ejemplo, las densidades de la célula en congelación que varían dentro del rango desde 1-40 x 106 células/mL, sobre la viabilidad celular; el fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+ ; la agregación celular; y la funcionalidad inmunosupresora de las células.

Métodos y Materiales Las células madre placentarias CD10+, CD34", CD105+, CD200+ se cultivaron durante 3 días, se cosecharon, centrifugaron, y re-suspendieron en formulación que comprendió DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10% hasta una concentración de aproximadamente 3.5 x 107 células/mL, y se filtraron a través de un filtro de 70 µp?. Las células después del filtro se diluyeron en serie en la formulación anterior para crear muestras de células que comprendieron, en bolsas estériles, las siguientes densidades de las células: 1 x 106 células/mL, 7.5 x 106 células/mL, 15 x 106 células/mL, y 20 x 106 células/mL. Las células se cosecharon separadamente para crear una muestra de células separada que comprendió 4.0 x 107 células/mL. Las células de la muestra de 4.0 x 107 células/mL se re-suspendieron en 5 mL de formulación que comprendió DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10% hasta una concentración de aproximadamente 4.6 x 107 células/mL, se filtraron a través de un filtro de 70 µ??, y se diluyeron a 4.0 x 107 células/mL en una a bolsa de 20 mL utilizando la formulación anterior. Una bolsa de 20 mL de la muestra de 4.0 x 107 células/mL, bolsas de 20 mL duplicadas de las muestras de 1 x 106 células/mL, 7.5 x 106 células/mL, 15 x 106 células/mL, y 20 x 106células/mL, y cinco viales de 280 yL de cada muestra se congelaron en -70 °C utilizando un congelador de velocidad controlada. Estas muestras se J descongelaron más tarde y se analizaron para determinar los efectos de la concentración en congelación sobre varias características celulares, incluyendo (1) conteo celular; (2) viabilidad; (3) fenotipo; (4) agregación celular; y (5) potencia.

Ensayo de Retención del Filtro: La agregación celular se evaluó a través del uso del ensayo de retención del filtro. La concentración celular se ajustó a aproximadamente 1.2 x 107 células/mL antes de la filtración. La carga del filtro (número de células por unidad de área del filtro) se mantuvo constante en aproximadamente 2.4 x 108 células/filtro. Las células se criopreservaron en un congelador de proporción control Thermo a -70°C en una concentración de 7.5 x 106 células/mL. Las células se descongelaron antes del uso, y las muestras se procesaron inmediatamente después de la descongelación. Una muestra de 100 L de la suspensión celular no diluida se tomó después de la descongelación, se diluyó con 900 i de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y los conteos de células se realizaron en duplicado utilizando un analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) y se reportaron como números de pixeles por millón de células (números mayores de pixeles indican números mayores de agregados celulares) .

Resul tados : Conteo de células/viabilidad Una a dos muestras de 1 mL de cada bolsa descongelada se tomaron para los conteos de células viables y determinación de viabilidad utilizando un analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) de acuerdo con instrucciones del fabricante. La viabilidad promedio permaneció constante para todas las condiciones, en aproximadamente 97%. EL conteo de células viables correspondió a la concentración en congelación inicial (vea Tabla 9 debajo) .

Tabla 9: Concentración celular viable de Vi-Cell y viabilidad Fenotipo La habilidad para mantener el fenotipo de las células CD10+, CD34", CD105+, CD200+ se probó a través de las diferentes densidades de la célula mediante citometria de flujo. Como se presenta en la Tabla 10, el fenotipo no cambia entre las diferentes concentraciones en congelación. La expresión de CD200+/CD105+ permaneció alrededor del 86% y la expresión de CD34"/CD10+ permaneció alrededor del 99% para todas las condiciones.

Tabla 10: Expresión de CD200+/CD105+ y CD34"/CD10+ Agregación Celular Réplicas de cada condición se analizaron mediante un Ensayo de Retención del Filtro para determinar el grado de agregación celular en diferentes concentraciones en congelación (FIGURA 11) . Se realizaron duplicados del ensayo para las muestras de 1 x 106 células/mL, 7.5 x 106 células/mL, 15 x 106 células/mL y 20 x 106 células/mL. Una muestra de células se ensayó por duplicado para la muestra de 40 x 106 células/mL. La muestra de 40 x 106 células/mL produjo la mayor señal de agregación celular para todas las densidades celulares probadas. Todas las otras muestras estuvieron en o debajo de la cantidad de agregación observada con una muestra control previamente criopreservada en 7.5 x 106 células/mL en DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10%.

Un ensayo de agregación celular separado, adicional se realizó para probar las células criopreservadas en formulación que comprendió: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10% en 7.5 x 106 células/mL y 20 x 106 células/mL (FIG. 12) . Los datos adicionales mostraron una señal incrementada en 20 x 106 células/mL, indicando que las células congeladas en 20 x 106 células/mL dan resultados variables de agregación celular. Como resultado, las células congeladas en esta concentración o más alta tienen un potencial incrementado para la agregación. Estos datos demuestran que la agregación incrementa con incrementar la concentración celular, y una densidad de la célula en congelación de 20 x 106 células/mL puede mostrar incrementos en la agregación celular con relación a una densidad de la célula en congelación de 7.5 x 106 células/mL. Funcionalidad Un vial de cada condición se utilizó para el análisis de la reacción de leucocitos mixtos (MLR) y de la reacción de células T en cuentas (BTR) para evaluar las propiedades inmunomoduladoras de las células en diversas densidades de la célula en congelación, según se mide mediante la supresión de la proliferación de células T CD4+ y células T CD8+. Los resultados de la MLR indican una depresión en la supresión de CD4 y CD8 en 15 x 106 células/mL y 40 x 106 células/mL, aunque la supresión en 20 x 106 células/mL fue comparable a aquella observada en 1 x 106 células/mL y 7.5 x 106 células/mL. Sin embargo, los resultados de la BTR muestran una reducción en la supresión de CD4 y CD8 en 20 x 106 células/mL y 40 x 106 células/mL .

Tabla 11: Resultados de la MLR y BTR - por ciento de reactividad de las células T en comparación a la reactividad de las células T en la ausencia células madre placentarias.

Conclusiones : Los resultados anteriores demuestran que la viabilidad celular y el fenotipo de CD10+, CD34", CD105+, CD200+ no cambian como una función de la densidad de la célula en congelación. Sin embargo, las células criopreservadas en una densidad de 20 x 106 células/mL demostraron un incremento variable en la agregación celular y una disminución variable en la actividad inmunosupresora , mientras que las células criopreservadas en una densidad de 40 x 106 células/mL exhibieron un incremento consistente en la agregación celular y una disminución consistente en la actividad inmunosupresora. Como tal, mientras que las células se pueden formular en las formulaciones aquí descritas en una densidad de hasta, por ejemplo, 40 x 106 células/mL sin una disminución apreciable en la viabilidad celular o en el número de células que exhiben un fenotipo de CD10+, CD34", CD105+, CD200+, una densidad de la célula en conqelación en el ranqo de 1.0-15 x 106 células/mL es preferible para minimizar la agregación celular tras la descongelación . 6.3.3 EFECTO DEL PESO MOLECULAR DEL DEXTRA O Este Ejemplo describe el efecto de diversos pesos moleculares del dextrano, por ejemplo, dextrano 1 (MW=1000), dextrano 40 (MW=40, 000) y dextrano 70 (MW=70, 000) sobre la agregación celular, la viabilidad, la recuperación, el fenotipo de CD10+, CD34", CD105+, CD200+ y la funcionalidad. Materiales y Métodos Doce millones de células multipotentes placentarias criopreservada CD10+, CD34", CD105+, CD200+ se expandieron en Fábricas de Células de 10 charolas Nunc™, una para cada una de las formulaciones debajo, a aproximadamente 1.2 x 108 células. Las células se cosecharon mediante incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con Tripsina/EDTA al 0.25%. Las células disociadas se transfirieron a un tubo de centrifugadora de 500 mL que contenia 250 mL de suero bovino fetal al 2% (FBS) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) . Las células se centrifugaron entonces a 1040 RP en tubos de 500 mL en una centrifugadora Sorvall RC3BP. Las células se re-suspendieron en una solución de solución salina al 0.9%/dextrano 40 al 5%. Posteriormente se centrifugaron las células a 1420 RPM durante 10 min, y se re-suspendieron en 10 mi. de las siguientes formulaciones: Formulación 1: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5% (Hospira, Lake Forest, Illinois) , HSA al 10% (control) Formulación 2: DMSO al 5%, Dextrano 1 al 5.5% ( Pharmacosmos ) , HSA al 10% Formulación 3: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5% (Pharmacosmos), HSA al 10% Formulación 4: DMSO al 5%, Dextrano 70 al 5.5% (Pharmacosmos), HSA al 10% Ensayo de Retención del Filtro: La agregación celular se evaluó a través del uso de ensayo de retención del filtro. La concentración celular se ajustó a aproximadamente 1.2 x 107 células/mL antes de la filtración. La carga del filtro (número de células por unidad de área del filtro) se mantuvo constante en aproximadamente 2.4 x 108 células/filtro. Las células se criopreservaron en una concentración de 7.5 x 106 células/mL en un congelador de proporción de control Thermo a -70°C. Las células se descongelaron antes del uso, y las muestras se procesaron inmediatamente después de la descongelación. Una muestra de 100 L de la suspensión celular no diluida se tomó después de la descongelación, se diluyó con 900 µL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y los conteos de células se realizaron en duplicado utilizando un analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) .

Resultados : Agregación celular La agregación celular dentro de cada formulación se evaluó utilizando el Ensayo de Retención del Filtro. La Formulación 2 (dextrano 1) , la formulación 3 (dextrano 40) y la formulación 4 (dextrano 70) demostraron tasas de agregación celular equivalentes a, o debajo de, la formulación de control DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5%, y HSA al 10% (FIG 13) .

Viabilidad y Recuperación La viabilidad post descongelación para muestras que comprenden dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70 vario dentro del rango desde 96.0% hasta 97.7% viable (FIG. 14) . De modo semejante, la recuperación post descongelación fue comparable a aquella de la formulación de control, con viabilidades de las células variando dentro del rango desde 92% hasta 109% de la formulación de control (FIG. 15) .

Fenotipo y Funcionalidad La habilidad para mantener el fenotipo de las células CD10+, CD34", CD105+, CD200+ se probó a través de diferentes pesos moleculares del dextrano mediante citometría de flujo, y la capacidad inmunosupresora de las células se probó en un ensayo de BTR. La expresión de CD200+/CD105+ a través de todas las formulaciones probadas varió dentro del rango desde 89.1% hasta 91.6%, y la expresión de CD34"/CD10+ fue > 95% para todas las condiciones (FIG. 16) . Además, la supresión de células T CD4+ y CD8+ a través de los diferentes pesos moleculares del dextrano cayó dentro de 1 desviación estándar de un valor esperado derivado de 4 diferentes réplicas experimentales de una formulación de control estándar que comprende dextrano 40 (FIG. 17) .

Conclusiones : Estos resultados demuestran que el dextrano 1 o el dextrano 70 se pueden sustituir por dextrano 40 en las formulaciones aqui descritas, sin impactar la agregación celular, la viabilidad, la recuperación, el fenotipo o la capacidad inmunosupresora. 6.3.4 EFECTO DE DIFERENTES POLISACARIDOS El Ejemplo describe el efecto de polisacáridos aparte del dextrano 40 en la formulación celular sobre la proliferación y la viabilidad celular.

Materiales y Métodos Doce millones de células multipotentes placentarias criopreservada CD10+, CD34", CD105+, CD200+ se expandieron en Fábricas de Células de 10 charolas Nunc™, una para cada una de las formulaciones debajo, a aproximadamente 1.2 x 108 células. Las células se cosecharon mediante incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con Tripsina/EDTA al 0.25%. Las células disociadas se transfirieron a un tubo de centrifugadora de 500 mL que contenia 250 mL de suero bovino fetal al 2% (FBS) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) . Las células se centrifugaron entonces a 1040 RPM en tubos de 500 mL en una centrifugadora Sorvall RC3BP. Las células se re-suspendieron en una solución de solución salina al 0.9% /dextrano 40 al 5%. Posteriormente se centrifugaron las células a 1420 RPM durante 10 min, y se suspendieron en 10 mL de las siguientes formulaciones: Formulación 1: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10% (Control) Formulación 2: DMSO al 5%, Maltodextrina al 5.5%, HSA al 10% Formulación 3: DMSO al 5%, Sucrosa al 5.5%, HSA al 10% Formulación 4: DMSO al 5%, Trehalosa al 5.5%, HSA al 10% Formulación 5: DMSO al 5%, Heparina 55USP/mL, HSA al 10% Formulación 6: DMSO al 5%, Hetaalmidón al 3.3%, HSA al 10% Formulación 7: DMSO al 5%, Glicógeno al 5.5%, HSA al 10% Ensayo de Retención del Filtro: La agregación celular se evaluó a través del uso del ensayo de retención del filtro. La concentración celular se ajustó a aproximadamente 1.2 x 107 células/mL antes de la filtración. La carga del filtro (número de células por unidad de área del filtro) se mantuvo constante en aproximadamente 2.4 x 108 células/filtro. Las células se criopreservaron en un congelador de proporción de control Thermo a -70°C. Las células se descongelaron antes del uso, y las muestras se procesaron inmediatamente después de la descongelación. Una muestra de 100 iL de la suspensión celular no diluida se tomó después de la descongelación, se diluyó con 900 µ]_, de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y los conteos de células se realizaron en duplicado utilizando un analizador de viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) .

Resul tados : Agregación Celular La agregación celular en cada formulación se evaluó usando el Ensayo de Retención del Filtro. Se determinó que las formulaciones 2-7 produjeron agregación celular equivalente a, o por debajo de, la formulación de control de 5% DMSO, 5.5% de dextrano 40, y 10% de HSA (FIG. 18). La formulación 4, que comprende trehalosa, la formulación 5, que comprende heparina, y la formulación 7 que comprende glicógeno demostraron tasas de agregación por debajo de la formulación de control.

Viabilidad y recuperación Después de la Descongelación Los datos de viabilidad, recuperación de células viables y tamaño de las células después de la descongelación se evaluaron para todas las formulaciones 1-7 para evaluar las capacidades crioprotectoras de las formulaciones . La viabilidad después de la recongelación se evaluó mediante un analizador de viabilidad de células por exclusión de azul de triptano Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) . La viabilidad después de la descongelación varia de 95.2% a 98.6%, con la sacarosa y el glicógeno en el extremo más bajo del rango (FIG. 19) . La formulación de control con dextrano resulta en 985 de viabilidad de las células. La recuperación de células viables después de la descongelación se calculó para entender las pérdidas de células para los procesos de congelación/descongelación, los valores varían de 84% a 115% para los diferentes polisacáridos (FIG. 209) .

Fenotipo y Funcionalidad La habilidad para mantener el fenotipo CD10+, CD34 . CD105+, CD200+ de las células se evaluó para los diferentes polisacáridos por citometría de flujo. Las células formuladas en las formulaciones 2-4 y 6 mantienen este fenotipo aproximadamente tan bien como la formulación de control 1, y fueron 89.4% a 92.9% CD105+/CD200+. La expresión de CD10+/CD34~ fue >955 para cada administración. De las células congeladas en heparina, 85.4% mantuvieron el fenotipo CD105++/CD200+ (FIG. 21) .

La funcionalidad de las células se evaluó a través del ensayo reacción de Células T a Perlas (BTR) , el cual mide 1 habilidad de las células para suprimir la respuesta de las células T a las perlas antigénicas. Las células formuladas en sacarosa exhiben supresión reducida de las células T en comparación con aquella dentro de 1 desviación estándar de un valor esperado de 4 diferentes duplicados experimentales de una formulación de control estándar que comprende dextrano 40 (FIG. 22) . Para los otros polisacáridos , la supresión de células T CD4 y CD8 está dentro de 1 desviación estándar del valor esperado.

Conclusiones Con respecto a la agregación celular, la viabilidad después de la descongelación, la recuperación después de la descongelación y el mantenimiento del fenotipo, el uso de las formulaciones que comprenden maltodextrano, trehalosa, y hetaalmidón resulta en poblaciones de células placentarias que tienen aproximadamente las mismas características como el uso de la formulación de dextrano 40. En si, aunque las formulaciones que comprenden sacarosa, heparina o glicógeno pueden ser usadas para formular las células madre placentarias CD10+, CD34 , CD105+, CD200+, el uso de las formulaciones que comprenden dextrano 40, maltodextrano, trehalosa o hetaalmidón se prefiere. 6.3.5 EFECTO DE LAS PROTEÍNAS ALTERNATIVAS A HSA Este ejemplo demuestra que en una formulaciones de 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA y 55 de DMSO, la concentración de albúmina de suero humano puede ser reducida, y que la HSA puede ser sustituida con albúmina de suero de bovino o suero fetal de bovino.

La formulación 1 (1F) se compone de 5.55 de dextrano 40, 10% de HSA, y 55 de DMSO. Con el fin de estándar el papel de la HSA en Fórmula (I) y entender su impacto sobre las composiciones celulares, se evaluaron formulaciones con proteínas similares a la albúmina de suero humano, es decir, albúmina de suero de bovino (BSA) y suero fetal de bovino (FBS) .

Materiales y Métodos Doce millones de células placentarias multipotentes CD10+, CD34~, CD105+, CD200+ se expandieron en Fabricas de Células de 10 bandejas Nunc™, una por cada una de las formulaciones siguientes, a aproximadamente 1.2xl08 células. Las células se cultivaron por incubación por 10 minutos a la temperatura ambiente con 0.25% de Tripsina/EDTA . Las células disociadas se transfirieron a un tubo de centrifuga de 500 mL conteniendo 250 mL de suero de bovino fetal al 2% (FBS) en Medio de Tagle Modificado de Dulbecco (DMEM) . Las células se sometieron a centrifugación a 1040 RPM en tubos de 500 mL en una centrífuga Sorval RC3BP. Las células se resuspendieron en solución salina al 0.9%/5% de dextrano 40. Las células se sometieron después a centrifugación a 1420 RPM por 10 min, y se suspendieron en 10 mL de las siguientes formulaciones: Formulación 1: 5% DMSO, 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA (control) Formulación 2: 5% de DMSO, 5.5% de dextrano 40, 4% de HSA Formulación 3: 5% .de DMSO, 5.55 de dextrano 40, 10% de BSA Formulación 4; 5% de DMSO, 5.5% de dextrano 40, 10% de FBS Ensayo de Retención del filtro. La agregaron celular se evaluó a través del uso de ensayo de retención del filtro. La concentración de las células se ajustó a aproximadamente 1.2xl07 células/mL, antes de la filtración. L carga del filtro (número de células por área unitaria del filtro) se mantuvo en aproximadamente 2.4xl08 millones de células/filtro. Las células se criopreservaron en un congelador de velocidad controlada Thermo a -70°C. Las células se descongelaron antes del uso, y las muestras se procesaron después de la descongelación. Una muestra de 100 µL de la suspensión de células no diluida se tomó después de la descongelación, se diluyó con 90 µ?, de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y se realizaron conteos celulares por duplicado usando el analizador de viabilidad de células Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton California) .

Resultados Agregación Celular La agregación celular, cuando se mide por el ensayo de Retención del filtro, estaba en o por debajo de 100 pixeles por milímetro cuadrado para todas las condiciones (FIG. 23). Sin embargo, 10% HSA y 105 BSA parecen producir de manera discernible menos agregados que 45 de HSA y 10% de FBS.

Con el fin de entender la capacidad crioprotectora de cada solución, se evaluó la viabilidad, la recuperación y el tamaño de las células después de la congelación a través del uso de exclusión por Azul de Triptano en un analizador de viabilidad de células Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) . La viabilidad después de la descongelación para cada condición estuvo dentro de la variabilidad del ensayo y varia de 95% a 98% de células viables (FIG. 24). De manera similar, la recuperación de células después de la descongelación fue comparable a la del control de 10% de HSA, con valores que varían de 10 se 127% (FIG. 25) .

Fenotipo y Funcionalidad La habilidad para mantener el fenotipo CD10+, CD34 , CD105+, CD200+ de las células se evaluó para las diferentes formulaciones mediante citometría de flujo. (FIGURAS 26 y 27). Las células formuladas en las formulaciones 2-4 mantuvieron este fenotipo aproximadamente tan bien como la formulación de control de 105 de HSA, con' valores que varían desde 88.2% a 93.55 de las células evaluadas. La expresión de CD10+/CD34 fue >955 para cada formulación.

La funcionalidad de las células se midió a través del ensayo de Reacción de las Células T a Perlas. En compararon con las otras condiciones la supresión de las Células T CD4 y CD8 se eleva cuando las células se formularon en FBS con valores que están dentro de 1.5 desviaciones estándar del valor esperado derivado de 4 diferentes réplicas experimentales de una formulación de control estándar que comprende 10% de HSA (FIG. 28). Para todas las condiciones la supresión estuvo dentro de 1 desviación estándar del valor esperado .

Conclusiones : Los resultados anteriores demuestran que 45 de HSA, 105 de BSA a o 10% de FBS pueden ser sustituidas por 10% de HSA sin pérdida apreciable de viabilidad de las células, recuperación de las células después de la descongelaron, degradaron del fenotipo CD10+, CD34~, CD105+, CD200+, o la actividad inmunosupresora . Por lo tanto, un rango de al menos aproximadamente 4% a aproximadamente 10% de HSA, BSA y/o FBS es particularmente adecuado para las formulaciones descritas aqui. 6.3.6 COMPATIBILIDAD CON LOS DIFERENTES TIPOS DE CÉLULAS El ejemplo demuestra que las células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea y las células asesinas naturales pueden ser formuladas en la misma manera como las células placentarias multipotentes . Por lo tanto, este Ejemplo muestra que otras células, además de las células placentarias multipotentes, pueden ser formuladas en la manera presentada aqui .

Métodos y Materiales : Las células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea (BMMSCs) y las células asesinas naturales (NK) se expandieron y se cultivaron usando las siguientes formulaciones : Fl : cultivo de células por 3 días, seguido por recolección y resuspensión de las células en 5% de DMSO, 5.5% de dextrano 40, 10% de ha, filtración de las células a través de un filtro de 70 µ?, y criopreservación de las células a aproximadamente 7.5xl06 células/mL; y F2 : Cultivo de las células por cuatro días, seguido por recolección y resuspensión de las células en Plasmalyte A, comprendiendo 5% de DMSO, y 1'% de HSA.

Las células se congelaron a -70°C usando un congelador de velocidad congelada. Las BMMSCs se criopreservaron en bolsas de 20 mL en la formulación F2 y bolsas de 10 mL en la formulación Fl; y las células NK CD3 , CD56+ se criopreservaron en bolsas de 10 mL en la formulación F2 y en frascos de 1.5 mL en la formulación Fl . Estas muestras se descongelaron después y se analizaron para determinar los efectos de la formulación de congelación sobre las características celulares.

Ensayo de Retención del Filtro. La agregación celular se evaluó a través del uso del ensayo de retención del filtro. La concentración de las células se ajustó a aproximadamente 1.2xl07 células/mL antes de la filtración. La carga del filtro (número de células por área unitaria del filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2.4X10 millones de células/filtro. Las células se criopreservaron en un congelador de velocidad controlada Thermo a -70°C. Las células se descongelaron antes del uso, y las muestras se procesaron poco después de la descongelación. Una muestra de 100 pL de la suspensión de células no diluida se tomo después de la descongelación, se diluyó con 900 µL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y se realizaron conteos celulares por duplicado usando el analizador de viabilidad de células Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) .

Resultados Viabilidad Las muestras después de la descongelación se usaron para determinar la viabilidad de las células congeladas bajo diferentes condiciones, la viabilidad de las células BMMSCs y NK no fue afectada significativamente por las condiciones de congelación .

Fenotipo Los marcadores NK se analizaron para determinar los efectos de las formulaciones Fl y F2 sobre el fenotipo NK (CD3 , CD56+) . Las dos formulaciones usadas no afectan significativamente el porcentaje de células NK que expresan el fenotipo NK. Las B SC también fueron analizadas en cuanto a la expresión de CD10, CD34, CD44, CD45, CD90, CD98, CD105, CD117, CD166, CD200, Pan-citoqueratina, y KDR. La expresión o la falta de expresión de estos marcadores no varia significativamente en las BMSSC formuladas en las formulaciones Fl y F2.

Agregación Celular En el ensayo de Retención del Filtro, se realizaron dos replicados de cada una de las formulaciones de BMMSC, y un replicado del ensayo de las formulaciones de NK. la formulación Fl produjo significativamente menos agregados que la Formulación F2 tanto para las BMMSCs y las células NK; el efecto de la formulación F2, sin embargo, fue más pronunciado para las BMMSCs que para las células NK (FIG. 29) .

Conclusiones Los resultados anteriores demuestran que las células madre mesenquimales derivadas de la medula ósea y las células asesinas naturales pueden ser formuladas exitosamente en 5% de DMSO, 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA, con agregación celular, viabilidad y retención del fenotipo similares a los de las células placentarias multipotentes CD10+, CD34 , CD105+, CD200+ en la misma formulación. Además, para las células placentarias multipotentes, las formulaciones que contienen Plasmalyte, de BMMSCs y células NK muestran tasas significativamente más altas de agregación celular; como tal, se prefieren las formulaciones que contienen dextrano.

Equivalentes : Las composiciones y los métodos descritos aquí, no se deben limitar en su ámbito por las modalidades especificas descritas aquí. De hecho, varias modificaciones de las composiciones y los métodos, además de aquellas descritas aquí, se volverán aparentes para aquellas personas experimentadas en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras anexas. Tales modificaciones tienen la intención de estar dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.

Aquí se citan varias publicaciones, patentes y solicitudes de patente, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una composición que comprende células, caracterizado en que comprende: (a) poner en contacto dichas células con una solución que comprende dextrano y albúmina de suero humano (HSA) para formar una solución que contiene células; (b) filtrar la solución que contiene células; (c) si dicha solución que contiene células comprende mayor que aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro, diluir dichas células a no más que aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro con una primera solución de dilución que comprende dextrano; y (d) opcionalmente diluir la solución que contiene células con una segunda solución de dilución que comprende dextrano pero que no comprende HSA, haciendo por consiguiente una composición que comprende células.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas células son criopreservadas después de la etapa (c) y antes de la etapa (d) .

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 40.

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho dextrano en dicha primera solución de dilución y dicha segunda solución de dilución es dextrano 40.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es dextrano 40 al 5.5%.

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha HSA en dicha solución que comprende HSA es HSA al 10%.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha primera solución de dilución comprende HSA.

8. El método de la reivindicación 7, caracterizado en que dicha HSA en dicha primera solución de dilución es HSA al 10%.

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha primera solución de dilución comprende además un crioprotector .

10. El método de la reivindicación 9, caracterizado en que dicho crioprotector es DMSO.

11. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho dextrano 40 en dicha segunda solución de dilución es dextrano 40 al 10%.

12. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha solución en la etapa (a) comprende un crioprotector.

13. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha composición que comprende células comprende aproximadamente 7.5% a aproximadamente 9% de dextrano.

14. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha composición que comprende células comprende aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 5.0 ± 1.5 x 106 células por mililitro.

15. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas células son células placentarias.

16. El método de la reivindicación 15, caracterizado en que dichas células madre son células placentarias adherentes, humanas, aisladas.

17. Un método para hacer una composición que comprende células, caracterizado en que comprende: (a) suspender una pluralidad de células placentarias adherentes, humanas, aisladas, en una solución de dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10% para formar una solución que contiene células ; (b) filtrar la solución que contiene células a través de un filtro de 70 µ?; (c) diluir la solución que contiene células en dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10%, y D SO al 5% a no más que aproximadamente 10 ± 3 x 106 células/mL; (d) criopreservar las células; (e) descongelar las células; y (f) opcionalmente diluir la solución que contiene células 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% para producir dicha composición que comprende células.

18. Un método para hacer una composición que comprende células, caracterizado en que comprende: (a) centrifugar una pluralidad de células placentarias adherentes, humanas, aisladas, para colectar las células; (b) re-suspender las células en dextrano 40 al 5.5%; (c) centrifugar las células para colectar las células; (d) re-suspender las células en una solución de dextrano 40 al 5.5% que comprende HSA al 10% para formar una solución que contiene células; (e) filtrar la solución que contiene células a través de un filtro de 70 µ? a 100 µ?; (f) diluir la solución que contiene células en dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a no más que aproximadamente 10 ± 3 x 106 células/mL; (g) criopreservar las células; (h) descongelar las células; y (i) opcionalmente diluir la solución que contiene células 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% para producir dicha composición que comprende células.

19. Un método para hacer una composición que comprende células placentarias adherentes, humanas, aisladas, caracterizado en que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de células placentarias adherentes, humanas, aisladas, en una solución que comprende dextrano 40 al 5.5% y albúmina de suero humano al 10% (HSA) para formar una solución que comprende células placentarias adherentes, humanas, aisladas; (b) filtrar dicha solución que comprende células placenterías adherentes, humanas, aisladas, con un filtro que remueve los agregados de células visibles para producir células placentarias adherentes, humanas, aisladas, filtradas; (c) diluir dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas, filtradas con una cantidad de una solución que comprende dextrano 40 al 5.5%, HSA al 10% y dimetilsulfóxido al 5% (DMSO) suficiente para llevar a dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas, filtradas a aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro; y (d) diluir dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas con dextrano 40 al 10% en una proporción de aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:11 células placentarias adherentes, humanas, aisladas : dextrano 40 para producir dicha composición.

20. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho filtro es un filtro de 70 µ?.

21. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho filtro es un filtro de 100 µ?.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 u 8 caracterizado en que dichas células son células placentarias adherentes, humanas, aisladas.

23. El método de la reivindicación 22 caracterizado en que dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas son CD10+, CD34" y CD105+.

24. El método de la reivindicación 23, caracterizado en que dichas células CD10+, CD34" y CD105+ son CD200+.

25. El método de la reivindicación 24, caracterizado en que dichas células CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ son ya sea CD45" o CD90+.

26. El método de la reivindicación 24, caracterizado en que dichas células CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ son CD45" y CD90+.

27. Una composición hecha por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 u 8.

28. Un método para hacer una composición que comprende células placentarias adherentes, humanas, aisladas, caracterizado en que comprende contactar dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas, con una solución que comprende dextrano al 5.5% y HSA al 10%; filtrar las células placentarias adherentes, humanas, aisladas; y diluir dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas, hasta aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro con una solución que comprende dextrano 40 al 10% (peso/volumen) .

29. Una composición que comprende una pluralidad de células placentarias adherentes, humanas, aisladas, en una solución que comprende dextrano 40 al 10%, caracterizada en que dicha composición comprende entre aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 5.0 ± 1.5 x 106 células por mililitro, y en donde dicha composición no comprende macro agregados de células.

30. La composición de la reivindicación 29, caracterizada en que dichas células madre placentarias son células criopreservadas descongeladas.

31. La composición de la reivindicación 29, caracterizada en que dicha composición está contenida dentro de una bolsa.

32. La composición de la reivindicación 29, caracterizada en que dicha composición no comprende macro agregados de células .

33. La composición de la reivindicación 29, caracterizada en que dicha composición comprende menos que aproximadamente 200 micro agregados de células por 106 células.

34. La composición de la reivindicación 29, caracterizada en que dicha composición comprende menos que aproximadamente 150 micro agregados de células por 106 células.

35. La composición de la reivindicación 29, caracterizada en que dicha composición comprende menos que aproximadamente 100 micro agregados de células por 106 células.

36. La composición de la reivindicación 29, caracterizada en que dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas, son CD10+, CD34" y CD105+.

37. La composición de la reivindicación 36, caracterizada en que dichas células CD10+, CD34" y CD105+ son CD200+.

38. La composición de la reivindicación 37, caracterizada en que dichas células CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ son ya sea CD45" o CD90+.

39. La composición de la reivindicación 37, caracterizada en que dichas células CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ son CD45" y CD90+.

40. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 27 y 29-39, caracterizada en que dicha composición es una composición farmacéutica.

41. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 14, caracterizado en que comprende además concentrar la composición que comprende células a aproximadamente 5 x 106 células por mililitro hasta 1 x 108 células por mililitro.

42. El método de la reivindicación 41, caracterizado en que comprende además administrar subcutáneamente la composición que comprende células a un sujeto. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se proporciona aquí métodos mejorados para la formulación de composiciones que comprenden células madre placentarias , y composiciones y formulaciones celulares mejoradas producidas mediante los mismos.