JPH07502404A - 幹細胞阻害タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

３２　医薬への使用のための請求項１から２８のいずれが１つに記載の化合物。 ３３　幹細胞保護剤としての使用のための薬剤の製造における請求項１から２８ のいずれ力何つに記載の化合物の使用。 ３４　請求項１から２８のいずれが１つに記載された化合物ど医薬的に許容され うる担体とからなる医薬製剤。 ３５　ニス　セレビシェ中ての請求項２９記載の核酸の発現による請求項１から ２８のいずれが１つに記載の化合物を産生ずる方法。 ３６　ピー、バストリス中での請求項２９記載の核酸の発現による請求項１から ２８のいずれが１つに記載の化合物を産生ずる方法。 ３７　分子についてコードする発現可能な非相同核酸を有するピシャ属、および 好ましくはバストリス種の酵母を培養することからなる幹細胞阻害活性を有する 分子の生産方法。 ３８、多量体タンパク質についてでなく、代りに多量体タンパク質と比較して、 可溶性多量体複合体を形成する傾向が減少された変異体をコートしているＤＮＡ からなるベクターで形質転換もしくは形質移入された発現系細胞における使用か らなり、所望のタンパク質が、通常、生理的イオン強度において可溶性多量体複 合体（°多量体タンパク質°）を形成する系においてタンパク質発現レベルを増 加する方法。 ３９　タンパク質か幹細胞阻害活性を有する請求項３８記載の方法。 明　細　書 幹細胞阻害タンパク質 本発明は、幹細胞増殖の阻害剤の性質を有するタンパク様の化合物に関する。さ らに詳しくは、本発明は工作された幹細胞阻害活性を持つタンパク質分子の変異 体、これらを合作する製剤及び医Ｔ絹成物と例えば癌の治療における化学療法若 しくは放射線療法に対する付加物としてのそれらの用途に関する。 造血系の異なった細胞は、継続的な分裂と分化の過程を経て多能性幹細胞から誘 導される。幹細胞の増殖は、部分的に骨髄マクロフ７−ノにより産生された阻害 分子によって制御されている〔ロー）”（Ｌｏｒｄ）ら、ブリット　ジェイ　ヘ マトル、　（Ｂｒｉｔ、１．　Ｈａｅｍａｊｏｌ、　）３４巻、４月号、１９７ ６年〕。マウスの造血幹細胞阻害剤は、８　ｋＤａのタンパク質、マクロファー ン　インフラマトリ−プロティン−１アルフ了（ＶＩＰ−１α）〔グラハム（Ｇ ｒａｈａｍ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３４４巻、４４２号、１９９０ 年〕であることか示された。幹細胞阻害剤の性質は、細胞周期に特異的な細胞毒 性薬の毒性効果から幹細胞を保護することを含んでいる〔ロート（Ｌｏｒｄ）と ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）、ブラット　セルズ（Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｆｓ）、６巻 、５８１号、１９８０年〕。それゆえ、幹細胞阻害剤は、腫瘍の治療に用いられ ている化学療法もしくは放射線療法の養生法から幹細胞を保護するための因子と して莫大な臨床上の可能性を存している。さらに、幹細胞阻害剤は、乾麻なとの 過増殖性疾患の治療において、単独で若しくは細胞毒性薬と組み合せて、用いら れるであろう。アミノ酸配列の相同性は、ヒトＬＤ７８若しくはＡＣＴ２遺伝子 産物がマウス幹細胞阻害剤のヒト相同体であることを示した（図１ａ）（シャー シ（Ｓｃｈａｌｌ）、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）　３　ｅ、１６５〜１ ８３頁（１９９１年）〕。ヒトＬＤ７８遺伝子産物は、ネズミＭＩＰ−１αの機 能的相同体であることが示されている〔プラグネル　ノーアールノー　ビーツン 　ラボラトリ−サイエンティフィック　レポート（Ｐｒａｇｎｅｌｌ　ＣＲＣＢ ｅａｔｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔ）２ １〜２５ページ、（１９９０年）、ダンロップ（Ｄｕｎｌｏｐ）ら、ブラッド（ Ｂｌｏｏｄ）　７９巻、２２２１〜２２２５頁、（１９９２年）〕。 本発明の成分として、ＬＤ７８とＭ［Ｐ−１αの３次及び４次構造はほとんと同 一であると示された。２つのタンパク質について、側鎖の性質若しくはＴｒｌｌ −５７のビシイニティ（ν１ｃｉｎｉｔｙ）における荷電相互作用におけるもの が唯一の差異である。ＬＤ７８とＭＩＰ−１αは類似の三次構造を存するにもか かわらず、ニア　ニー、ブイ　ディー　（ｎｅａｒ　ｕ、　ｖ、　ｃ、　ｄ）研 究法は、ＡＣＴ２はスペクトルの形と強度によって強調されるように異なる４次 構造を有することを示した。このことは、ＬＤ７８が、ＭＩＰ−１αのヒト相同 体であってＡＣＴ２ではないという強い証拠を与えた。 それらの臨床上の有用性の可能性を制限しているマウスＭ［Ｐ−１αとヒトＬＤ ７８によって分けられた主な問題は、生理的なイオン強度緩衝液中において２５ μｇ　／　ｍｌと同程度に低い濃度で、それらは凝集しやすい傾向を育する、大 きな、可溶性多量体複合体を形成することである。野性ｆｆｉＭＩＰ−１αとＬ Ｄ７８タンパク質分子は、それぞれ分子量７，８６６Ｄａ　、７，７１２Ｄａを 有している。両方のタンパク質について、可溶性多量体複合体は、１００．００ ０Ｄａから２００．０ＯＯＤａ以上の分子量範囲の広い雑多な混合物を示す。多 量体化と凝集の現象の主な結果は、タンパク質の臨床的投与が危うくされること である。凝集と多量体化は、効果を変化させ、組織浸透を障害し、免疫原性を増 強さす。別の重要な欠点は、生産や製剤の際、凝集は、雑多な医薬製剤を生じる 結果となることである。 濁った凝集物は、ｐＨ７，４における生理的なイオン強度緩衝液中で、凍結乾燥 されたＬＤ７８若しくはＭ［Ｐ−１αの純品を再生する際にしばしば観察された 。凝集物は、さらなる分析に先だって、遠心分離によって除去される。可溶性の 再生されたＭＩＰ−１αとＬＤ７Ｂのサイズ排除クロマトグラフィー（比較例３ ）の知見は、大部分のタンパク質が分子量１００．０００〜８００．０００Ｄａ の幅広いピークとして、クロマトグラフすることをを示す。ピークの幅広く尾を 引いた端は、ある範囲でそれぞれのタンパク質に対して高分子量の複合体の存在 を示している。Ｍ［Ｐ−１αのサイズ排除のプロフィールはまた、大きな多量体 との平衡で４量体の集団をも示す。 幹細胞阻害剤（と特にＬＤ７８　）の凝集の問題は当該分野で認識されているか 、その分野での今までの研究は、別に低分子量形の多量体分子を保持するために 非通常的な緩衝系を処方することに向けられていた〔マンテル（Ｍａｎｔｅりら 、エクスブト、ヘマトル、（εｘｐｔ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　）２０巻、３６ ８号、８００頁（１９９２年）、ダンロップ（Ｄｕｎｌｏｐ）ら、ブラッド（Ｂ ｌｏｏｄ）７９巻、２２２１〜２２２５頁（１９９２年）及びグラハム（Ｇｒａ ｈａｍ）とプラグネル（Ｐｒａｇｎｅ　ｌ　ｌ）、ダブ。パイオル、　（Ｄｅｖ 、Ｂｉｏｌ）　１５１巻、３７７〜８１頁（１９９２年））。 このアプローチは、少なくともその分子はｉｎ　ｖｉｖｏ投与においていかなる 緩衝液の成分てあっても、十分に再凝集しつる欠点が少なからずある。 本発明は、根本的に異なる方法において、その問題にアプローチするものである 。ＬＤ７ＢやＭ［Ｐ−１αのような幹細胞阻害剤かとのように凝集するのかのみ ならず、一方では生物学的活性を残しつつ、凝集プロセスのある段階における凝 集あるいは多量体化を阻害しうることを発見した。 ＭＩＰ−１α、ＬＤ７８とＡＣＴ−２は、インターロイキン−８（［Ｌ−８）、 血小板因子４　（ＰＦ−４）および単球化学誘引性および活性化タンパク質（Ｍ ＣＡＦ）を含むタンパク質の走化性サイトカインスーパーファミリーに対して配 列相同性を示す。これらの関連したタンパク質について、生理的イオン強度下で ＩＬ−８は２量体として存在し〔クロール（Ｃ１ｏｒｅ）ら、バイオケミストリ ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２９．１６８９〜１６９６頁（１９９０年’） 　）　、ＰＦ−４は４量体〔ムーアＱｌｏｏｒｅ）ら、バイオヒム、バイオフィ ズ。アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　）３７９巻 、３７９〜３８４頁、１９７５年〕であることが知られている。［Ｌ−８を型板 として構築されたＭＣＡＦのモデル〔グロー不ンポーン（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ ）とクロール（Ｃ１ｏｒｅ）　、プロティンエンジニアリング　４巻２６３〜２ ６９頁（１９９１年）〕は、塩基性の２量体構造から成る。しかし、４量体の１ ２量体への３量体化は、以前には報告されてはいない。 ＭＩＰ−１αとＬＤ７８の高次多量体は、中間体である２量体、４α１体及び１ ２量体（４量体ユニットの３会合物）を経て形成されることか見い出されている 。ゆえに、好ましがらぬ高次多量体化と凝集を阻止するためには、１２量１体の 段階もしくはそれ以下での多量体化を阻止する必要がある。ゆえに、広義におい て、第１の態様においては本発明は、生理的イオン強度において実質的に安定な １２景体以上の多量体を形成する能力のない分子であって、幹細胞阻害（ＳＣＩ ）活性を存するタンパク様の分子を提供する。本発明による分子の分子量は、生 理的なイオン強度において一般に約１００．０ＯＯＤａまたはそれ以下である。 そのような変異体は、少なくとも多量体化の性質に関しては、さらなる処方を必 要とせず、ゆえに、使用の簡易性の面での臨床上の利点と、その相同性かＧＭＰ により役立つので製造上の利点を示すてあろう。また、増加した分子表面領域は 、組織浸透性と効力増大の利点をもたらすことができる。 本発明の好ましい態様は、生理的イオン強度で、４量体以上の安定な多量体形成 能か実質的になく、そのような場合その分子量は一般的には約１６．０００Ｄａ 若しくはそれ以下であろう。本発明のある態様は、全く多量体形成能が実質的に なく、それらの分子量は一般的に約８．００００ａ若しくはそれ以下であり、そ れは、アミノ酸配列を基礎としたＬＤ７８とＭＩＰ−１αの単量体分子の分子量 である。 多量体（若しくは単量体）の実質的に相同な集団を形成する分子か好ましい。 分子及び／若しくは本発明の分子の多量体化の程度は、適切な手段により評価さ れる。電気泳動〔例えばネイティブＰＡＧＥ（ｎａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ））　、 サイズ排除クロマトグラフィーおよび特に、超遠心機沈降係数分析が選択の手段 である。 この明細書中、１つの分子が与えられた次数よりも高度な多量体を形成すること が“実質的に不可能”と述べられるときは、若干の割合の高次多量体は認容でき 、熱力学平衡の根拠から事実上さけられないと解すべきである。この割合におけ る正確な量的限界を説明することは可能てないが、一般に存在する種の１５．１ ０又は５９６以下かその閾値であろう。 “幹細胞阻害活性”　（若しくは”ＳＣ＋活性”）という語は、当該技術におい て知られている。それは、ＭＩＰ−１αおよび／もしくはＬＤ７８によって示さ れる生物学的活性、特に幹細胞の増殖阻害又はより正確には、増殖細胞周期を通 しての幹細胞の動きの阻止に関すると解してもよい。ゆえに本発明によるタンパ ク様分子は、ＭＩＰ−１αおよび／もしくはＬＤ７８の類似体と見なすことかで きる。゛幹細胞”は、一般に示されているように、種々の細胞系列を保持し分裂 している細胞、特に造血体もしくは上皮系の細胞、さらに詳しくは、造血幹細胞 とは、致死性放射された動物に移植された際、自己更新能かあり、造血系細胞の 長期的再増殖をもたらす能力がある細胞である。 幹細胞阻害活性は、実験的には種々の方法において、決定しうる。例えば、活性 のイン　ビトロ（ｉｎ　ｖｉｊｒｏ）アッセイがてきる。そのようなアッセイは 、好ましくは受容体結合アッセイであり、本発明による分子は、マウスの幹細胞 系ＥＤＣＰ細胞混合物（Ａ４細胞）のような適切な受容体源から、適当に検出可 能であるように標識されたＬＤ７８　（もしくはＭ［Ｐ−１α）を置換するそれ らの能力について評価される。そのようなアッセイの詳細は、下記の実施例１６ ４で示される。もし野性型活性の統計的意義のある割合（例えば、増加の優先の 順位で、相当する野性型分子の活性の少なくとも１％、５％、１０％らしくは２ ０％）が所定濃度の製品について観察されれば、幹細胞阻害活性か分子によって 奏されると言うことかできる。受容体結合活性か、野性型と同程度もしくはそれ よりも良いことは、必須ではないが好ましい。 まだ実験的測定のための別のしかし機能的で、依然イン　ビトロ　アッセイであ るか、マウスの１２日５のＣＦｔＪ−３細胞の増殖阻害を測定するアッセイがあ る。分子は、ネズミの骨髄から選別された１２日５のＣＦＵ−３細胞のコロニー 形成阻害能についてアッセイされる。詳細は、以下の文献に見ることかできるロ ード（Ｌｏｒｄ）とスプーナー（Ｓｐｏｏｎｅｒ）、リンフ才力イン　リサーチ （Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　Ｂ　５９　（１９８６年）及び ロードとマーツユＱｌａｒｓｈ）、“ヘマボエシス、ア　プラクティカル　アプ ローチ（Ｈａｅｍａｐｏｉｅｉｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ ）”アイアールエル出版（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、オックスフオード（Ｏｘｆｏ ｒｄ）、１９９２年、テスタ（Ｔｅｓｊａ）とモリネックス（Ｍｏｌｉｎｅｕｘ ）纏、２１頁（ネズミの骨髄細胞選別について）； ヘイワース（）ｌｅｙｗｏｒｔｈ）とスブーナー、“ヘマボエシス、アブラクテ ィカル　アプローチ（Ｈａｅｍａｐｏｉｅｉｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ ｐｒ。 ａｃｈ）、”アイアールエル出版（、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード （Ｏｘｆｏｒｄ）、１９９２年、テスタとモリネックス編、３１頁（一般的な細 胞培養技術について）、と プラグネル（Ｐｒａｇｎｅｌｌ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　７２巻、１９６ 号（４９８８年）（アッセイと条件づけられた培地について）。 そのようなアッセイのより正確な詳細は、下記の実施例１６５に与えられる。こ のアッセイにおいて、コロニー形成を阻害すれば、分子は幹細胞阻害活性を有し ている。阻害か野性型と同程度もしくはそれ以上であることは必須ではないか、 好ましい。 さらに別の機能的な、しかしまだイン　ビトロのアッセイは、国際特許出願（Ｗ Ｏ−Ａ−）第９１０４２７４号、プラグネルらのブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　７２ 巻、１９６〜２０１頁及びロリ？　−（Ｌｏｒｉｍｅｒ）らのロイケミア　リサ ーチ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１４巻、４８１〜４８９頁（１ ９９０年）中に見ることかできる。 別に、もしくは付加的に、イン　ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）活性を評価できる。第 １は、ＣＦＵ−Ｓイン　ビポ　アッセイで、これは候補の幹細胞阻害剤の能力か 、ヒドロキシ尿素又はシトシン　アラビノシト（ａｒａ−Ｃ）のような化学療法 剤の細胞毒効果に対する幹細胞集１　（ＣＦＩＪ−３として測定）を保護するた めに用いられる。適切なアッセイは、ロートらのブラッド（Ｂｌｏｏｄ）７９巻 、２６０５〜２６０９頁（１９９２年）や、またロードによる“ヘモポエシス（ ）Ｉａｅｍｏｐ。 １ｅｓｉｓ）−ア　プラクティカル　アプローチ（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ ｐｐｒ。 ａｃｈ）”　１〜２０頁、アイアールエル出版（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、オック スフォート（Ｏｘｆｏｒｄ）、１９９２年、（テスタとモリネックス編）、１〜 ２０頁と、ｏ−１；とノヨーフィールド（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ）による“セル　 クローンズ・マニュアル　才ブ　マンマリアン　セル　テクニックス（Ｃｅｌｌ 　Ｃ１ｏｎｅｓ：Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ）”　、チャーチル　リビングストーン（Ｃｈｕｒｃｈｉ　ｌ 　ｌいＶｉｎｇＳｔＯｎｅ）　、１９８５年、　〔ボッテン（Ｐｏｔｔｅｎ）と ヘンリー（Ｈｅｎｒｙ）編〕、１３〜２６頁に記載されている。 さらに、別にもしくは付ＩＪＯ的に、ＣＦｔｌ−３集団を間接的に反映するａｒ ａ−Ｃを用いた化学療法後の好中球数の回復を測定するアッセイかある。そのよ うなアッセイは、ダンロップらのブラット（Ｂｆｏｏｄ）、７９巻、２２２１〜 ２２２５頁に記載されている。 いずれかの、もしくは全ての上記アッセイにおいて、負の対照に対して有意な改 善か得られれば（野性型分子に対しての改善か否か）、分子は幹細胞阻害活性を 有するものと見なし得る。 ある好ましい分子は、アッセイの１つ以上もしくは全てにおいて、負の対照に対 してそのような改善を示す。 “生理的なイオン強度”という語は、当該技術においてよく知られている。それ は、一般に約１３７ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣ１）、３ｍＭ塩化カリウム（Ｋ ＣＩ）、及び約１０ｍＭのリン酸塩に等しい。 生理的ｐＨは、約７．４である。 本発明は、生理的なイオン強度とｐＨの条件下において、その各々の盟か、安定 な高次複合体形成能が実質的にない１２ｌ体、４ｌ体、ホモ−２ｌ体や単量体型 におけるＬＤ７８やＭ［Ｐ−１αの類似体の製造を可能とする。類似体は、実質 的に均質の多量体の集団を形成し得、４ｌ体の均質の製品を形成する類似体か好 ましい。 “類似体“の語は、広く機能的な意味において使われている。 しかし、実際問題として、はとんどの類似体は、生物学的活性か実質的に保存さ れていれば、原型分子と高い相同性を有するであろう。原型分子からの変化の性 質が、その数よりもより重要であることか理解されるであろう。しかし、指針と して、アミノ酸しベルては、（選増加優先順位で）少なくとも４０．５０．６０ ．６５．６７もしくは６８残基が原型分子と同しであることがあり得、核酸レベ ルでは、類似体をコードする核酸が、例えばストリンジェント条件（約３５から ６５°Ｃにおいて、約０．９Ｍの塩溶液中のような）下で原型分子をコードする 核酸とハイブリッド化でき、または遺伝子コートの縮退かなければハイブリッド 化するであろう。 多くの本発明のＭ［Ｐ−１αおよびＬＤ７８分子類似体は、再現性よく４ｌ体も しくは４ｌ体単位の３会合物（＋２ｌ体）のいずれかより大きくない安定な４次 構造を形成する。２ｌ体、４ｌ体、１２ｌ体もしくは他の多量体の安定性は、ま さにその分子の環境に依存して変化し得、もし、そうであるならば、それは、好 ましくは生理的イオン強度であって、より好ましくは類似体が臨床投与可能なく 通常水性）製剤でかつ臨床的に許容される量で存在するとき、１２１体以上の多 量体化は実質的に起こりえない（少なくとも起こらない）であろう。臨床的に投 与されうる製剤はしばしば、凍結乾燥されたタンパク質標品から再生される。 好ましくは、１２量体以上の多量体は、生産、製剤および投与の際みられそうな 条件中では実質的におこらないことであろう。 ４量体もしくは１２量体よりも分子量の大きい多量体が存在しないことは、Ｍ［ Ｐ−１αおよびＬＤ７８組換え品もしくは他の類似体の凝集を減少させる。その ような限定された、再現性ある４次構造をもつＶＩＰ−１α及びＬＤ７８類似体 の安定な標品は、生産、製剤及び治療実体への投与において明確な利点を表す。 安定な単量体、２量体、４量体もしくは１２量体の変異体は安定な４次構造の効 力によって、改善された組織浸透の利点、より少ない免疫原性となる可能性、よ り大きい再現性ある効力などのような改良された医薬上の及び薬物動力学的性質 を有するであろう。このアプローチの付加された利点は、これらの表面残基が受 容体活性化に関連し、かつ薬理学を修飾するであろうという事実にある。ゆえに 生物学的に重要な残基の同定は、幹細胞増殖阻害の薬物動力学の改善に使用でき 、低分子量模倣体の設計を導く。安定な単量体、２量体、４量体および１２量体 は、強力な研究手段を提供し、特に、はとんど知られていないＳＣＩに対する受 容体の同定および特徴づけにおいて有用であろう〔オウ（Ｏｈ）ら、ジエイ、イ ムユノル、　（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）’１４７巻、２９７８〜２９８３頁（１ ９９１年）〕。単量体を産生ずるため２量体インターフェイス相互作用を分断す ることは、有用な研究手段を提供するであろう。このアプローチのさらなる利点 は、マウス炎症タンパク質−１β受容体もしくはそのヒトでの相当物とのＬＤ７ ８もしくはＭ［Ｐ−１αとのあらゆる交差反応除去の可能性である。 ＩＪ［Ｐ−１β受容体か活性化されると、これらの分子に対する生体の炎症反応 の主要部を誘導し、治療の際潜在的な好ましくない副作用が表れる。ゆえにこの 反応の除去は、さらなる臨床上の利点を提供する。 多量体化の欠除により与えられた予期せぬ付加的利益は、真核性細胞、例えばサ ツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）やビシャ　パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｊｏｒｉｓ）のような酵母の種 におけるそのような変異体の非常に増大された生産性である。ゆえに、本発明は 付加的には、生理的イオン強度において、望まれるタンパク質が通常生理的イオ ン強度で（可溶性であり得る）多量体複合体（“多量体化タンパク質”）を形成 する系においてタンパク質発現レベルを増加する方法に関し、その方法は、多量 体化タンパク質てはなく代わりに、多量体化タンパク質と比較し、（例えば可溶 性の）多量体複合体を形成する傾向が減少した多量体化タンパク質の変異体をコ ードするＤＮＡからなるベクターを用いて形質転換もしくは形質移入された表現 系細胞における使用からなる。そのような方法は一般的に適用性かあるが、幹細 胞阻害活性を有するタンパク質の生産に対して適用される際には、特に有用性を 持つ。 本発明の作製において包含された研究より、シＤ７８およびＭ［Ｐ−１αは次の 経路にしたがって会合すると思われる。 （以下余白、次頁に続く） Ｍ＋Ｍ＜＝＞Ｄ　；　Ｄ＋Ｄ曽Ｔ；３ＸＴφ１２量体；ｎＸ１２量体＠多量体、 ｎ×多量体→凝集物ここてＭは単量体を表し、Ｄはホモ−２量体そしてＴは４量 体を表す。図ＩＣと１ｄは、この推定がどのようにして得られたのかを示してい る。この提案を支持する状況証拠は、同様の経路を経たＰＦ−４の４量体形成を 示したマヨ（Ｍａｙｏ）とチェノ（Ｃｈｅ口）〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８巻、９４６９〜９４７８頁、（１９８９年）〕からきて いる。 上記にて提案された経路は、不可逆的な多量体の凝集の点までの一連の可逆的な 平衡から成っている。会合機構には、ＳＣＩの大きな多量体（およびゆえに凝集 物）の形成を阻止しつる原則として４つの段階がある。これらの段階のそれぞれ の阻害は、ＳＣ１分子の異なる領域における変異によって影響されつる。 第１に、４量体のさらなる会合は阻害しつる。第２に、５Ｃ１２量体の４量体へ の会合を阻止されれば、さらなる多量体化は阻害されるであろう。第３に、ＳＣ Ｉ単量体は２量体化から阻止されるであろう。第４に、１２量体のより高次の多 量体へのさらなる会合は、阻害されうる。これらの選択のいずれもか、会合事象 を促進および／もしくは安定化に関与する残基を特異的に変異をすることによっ て実行できる。１つのさらなる選択は、会合事象の２つもしくは全てを同時に阻 止する変異の組合せを用いることである。 以下のアミノ酸残基を、修飾することか好ましい・（１）２つの２量体間相互作 用を安定化するのに関与しうるアミノ酸残基、及び （ｉｉ）高次の会合に対する部位として作用できる４量体の外部表面上の表面領 域におけるアミノ酸残基。 ２量体の４量体への会合を安定化する鍵となる残基の個々のもしくは組合せの接 木的変異は、２量体の組換えＳＣ［変異体もしくは類似体分子を生じるであろう 。同様に、多量体への４量体の会合部位における残基の変異は、４量体ＳＣ＋変 異体もしくは類似体分子を生じるであろう。欠失および付加は本発明の範囲内で あるか、アミノ酸修飾は好ましくは置換である。 望ましい効果を生しるための好ましい変異の型は、。 （ｉ）荷電反発〔かつて、単量体インシュリンの生産に成功した：ドッドソン（ Ｄｏｄｓｏｎ）、　プロスペクト　イン　プロティンエンジニアリング　ミーテ ィング　アブストラクト　（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）、４９−５３頁（ １９８９年）〕： （ｉｉ）疎水性から親水性への変化： （ｉｉｉ）中性／疎水性から荷電されたものへ。 会合における疎水性効果に対する寄与を避けるため、タンパク質へのあまり疎水 性の残基を置換しないことが一般に良い。 同様に、タンパク質の２次構造要素を有意に分裂させる変異を避けることが好ま しい。例えば、公知のβ−ブレーカーズ（β−ｂｒｅａｋｅｒｓ）を、β−ンー ト領域に導入しないのが好ましい。 ある盟の変異は、ＳＣＩ分子中に望まれる変化を生じることにおいて最も効果的 である。それらは。 電荷の逆転； 荷電残基から中性へ： 疎水性から親水性へ。 最適な結果を出すために、置換は、分子内の特定部位においてなされるべきてあ ろう。変えられるべき残基は、阻止すべき多量体化のレベルに依存している。 以下の変異にとって好ましい部位についての議論は、図１ｂにその提案された構 造が示されたＬＤ７８で主としてなされている。 図１ｂにおいて、帯状のものはＬＤ７８単量体に対する骨格原子の予測経路を示 す。β−シート鎖１はＰｈｅ　２３がらＴｈｒ　３０（：続き、β−ンート鎖２ はＬｙｓ　３５がらＴｈｒ　４３までを走り、β−シート鎮３はＳｅｒ　４６か らＰｒｏ　５３に続き、Ｃ−末端／＼リックスはＴｒｐ　５７からＡｌａ　６９ に続く。例えば図１ａに示されたアミノ酸配列を用いて、ＭＩＰ利αを含んだ他 のＳＣＩに対して、類似の２次構造要素か推論されよう。 単量体のいくつかの面が、多量体化経路の１つ以上の部分に含まれていることは 明白である。それらの面におりる自己会合の分裂／阻害の範囲ＩＪ、アミノ酸置 換の性質に関係する。 単量体からの２量体形成の阻害は、例えば残基１９（ｌｉｅ）もしくは３９（Ｖ ａｌ）での、ｌもしくはそれ以上の変異によって行われうる。いずれの残基もＡ ｌａに変えられよう。 ２量体からの４量体形成は、β−ソートの鎖１、および、／もしくは順次シート の鎖２と３の間において２量体表面から突出する残基中での変異によって影響さ れる。第１領域の例は、ＬＤ７８のアミノ酸２４〜２９であり、第２領域の例は 、ＬＤ７８のアミノ酸４３〜４７である。特に、［１ｅ２４＞Ａｓｎ、　Ｔｙｒ ２７＞Ａｓｎ、　Ｐｈｅ２８＞Ｇｌｕ、　ＧＩｕ２９＞Ａｒｇ、　Ｌｙｓ４４＞ Ｇｌｕ（特にＡｒｇ４５＞Ｇｉｎ）及びＡｒｇ４５＞Ｇｌｕが好ましい。 ４量体からの１２量体形成は、シートの鎖！中へ鎖Ｎ−末端を形成する残基（こ こでは、２つの変化が好ましい）のいずれかの残基、詳しくは、ＬＤ７８の１６ 〜２１残基、特に１７〜１９もしくは４．１２．２６．４４．４８もしくは６６ 位での上記性質の変異によって阻害もしくは分裂されつる。特に、Ａｌａ４＞Ｇ ｌｕ、　Ｐｈｅ１２＞Ａｓｐ、　Ａｒｇ１７＞Ｓｅｒ。 Ａｓｐ２６＞Ａｌａ（特にＧ１ｎ１８＞Ｇｌｕ）、Ａｒｇ１７＞Ｇｌｕ　（また 、特にＧ１ｎ１８＞Ｇｌｕ）。 Ａｒｇ１７＞Ｇｌｕ（また、特にＧ１ｎ１８＞ＧＬｕ）、　Ａｓｐ２６＞Ａｌａ 、　Ｌｙｓ４４＞Ｓｅｒ、　Ｇ１ｎ４８＞Ｇｌｕ　（特にＰｈｅ２８＞Ｇ　ｌｕ ）およびＧｌｕ６６＞Ｓｅｒが好ましい。 １２量体からのより高次の多量体形成は、ＬＤ７８の１２がら２１位、特に１２ ．１８および２１位、もしくは６５位における変異により阻止もしくは分裂され る。特に、Ｐｈｅ１２＞Ｇｌｎ、　Ｇ１ｎ１８＞Ｇｌｕ、　Ｇ１ｎ２１＞Ｓｅｒ およびＬｅｕ６５＞Ａｌａが好ましい。 一般に本発明の好ましいＬＤ７８類似体は、実質的にＬＤ７８に相当する配列を 包含する分子を含むが、以下のアミノ酸残基の１つもしくはそれ以上での（しか し好ましくは２以上でない）変異を伴う：　５ｅｒ１．　Ｌｅｕ２．　Ａｌａ３ ．　Ａｌａ４．　Ａｓｐ５．　Ｔｈｒ６．　Ａｌａ９．　Ｐｈｅ１２．５ｅｒ１ ３．　Ｔｙｒ１４．５ｅｒ１６．　Ａｒｇ１７．　Ｇ１ｎ１８．　［１ｅ１９． 　Ｐｒｏ２０．　Ｇ１ｎ２１．　Ｐｈｅ２３．　ｌ１ｅ２４．　Ａｓ■ ２６、　Ｔｙｒ２７．　Ｐｈｅ２８．　Ｇ１ｕ２９．５ｅｒ３１．５ｅｒ３２． 　Ｇ１ｎ３３．５ｅｒ３５．　Ｌｙｓ３６．　Ｐｒｏ３７゜Ｇｌｙ３８．　Ｖａ １３９．　［１ｅ４０．　Ｌｅｕ４２．　Ｔｈｒ４３．　Ｌｙｓ４４、Ａｒｇ４ ５．５ｅｒ４６．　Ａｒｇ４７．　Ｇ１ｎ４ｇ、　Ａｓｐ５２．　Ｇ１ｕ５５． 　Ｇｌｕ５６．　Ｇ１ｎ５９．　Ｌｙｓ６０．　Ｔｙｒ６１．　Ｖａ１６２．　 Ａｓｐ６４．　Ｌｅ浮U ５、　Ｌｅｕ６７、　Ｇｌｕ６６、５ｅｒ６８．　ａｎｄ　Ａｌａ６９゜　゛本 発明による好ましいＬＤ７８類似体は、Ｌｙｓ４４＞Ｇｌｕ（と共にＡｒｇ４５ ＞Ｇｌｎ）、　Ａｒｇ４７＞Ｇｌｕ、　Ｐｈｅ２Ｂ）Ｇｌｕ、　Ｐｈｅ２８＞Ｇ ｌｕ（と共にＧＩｎ４８＞Ｇｌｕ）。 Ｐｈｅ２８＞Ｇｌｕ（と共にＡｒｇ４７＞Ｇｌｕ）、　Ａｒｇ１７＞５ｅｒ（と 共にＧＩｎ１８＞Ｇｌｕ）。 Ｐｈｅ１２＞Ａｌａ、　Ｖａ１３９＞Ａｌａ、　［１４０＞Ａｌａ、　Ａｓｐ２ ６＞Ａｌａ（と共にＧｌｕ２９＞Ａｒｇａｎｄ　Ａｒｇ４７＞Ｇｌｕ）を含む。 本発明によるさらに好ましいＬＤ７８類似体は、Ａｒｇ１７＞Ｓｅｒ、　Ｇｌｕ ２９＞Ａｒｇ、　Ｇ１ｎ１８＞Ｇｌｕ、　Ａｓｐ２６＞Ｓｅｒ、　Ｇ１ｎ４８＞ Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ１５＞Ａｌａ、　Ｇ１ｎ２１　＞Ｓｅｒ。 Ｐｈｅ２３＞Ａｌａ、　５ｅｒ３２＞Ａｌａ、　Ａｌａ５１＞Ｓｅｔ、　Ａｌａ ４＞Ｇｌｕ、　Ｐｈｅ１２＞Ａｓｐ、　Ａｓｐ２６＞ＧＩｎ、　Ｌｙｓ３６＞Ｇ ｌｕ、　Ｌｙｓ４４＞Ｇｌｕ、　Ａｒｇ４５＞Ｇｌｕ、　Ｇｌｕ６６＞Ｇｌｎを 含む。 本発明による最も好ましいＬＤ７８類似体は、Ｐｈｅ１２＞Ｇｌｎ、　Ｌｙｓ４ ４＞Ｓｅｒ、Ａｒｇ１７＞Ｇｌｕ（ｗｉｔｈ　Ｇ１ｎ１８＞Ｇｌｕ）および、特 にＡｓｐ２６＞ＡｌａとＧｌｕ６６＞Ｓｅｒを含む。 一般に本発明の好ましいＭ［Ｐ−１α類似体は、実質的にＭ［Ｐ−１αに相当す る配列を包含する分子を含むが、以下のアミノ酸残基の１つもしくはそれ以上で の（しかし好ましくは２つ以上でない）変異を伴う：　Ａｌａｌ、　Ｐｒｏ２． 　Ｔｙｒ３．　Ｇｌｙ４．　Ａｌａ５．　Ａｓｐ６．　Ｔｈｒ７．　Ａｌａｌｏ 、　Ｐｈｅ１３．５ｅｒ１４．　Ｔｙｒ１５．５ｅｒ１６．　Ａｒｇ１７．　Ｌ ｙｓ　１８．　Ｉ　１ｅ１９．　Ｐｒｏ２０．　ＡｒｇQ１゜ Ｐｈｅ２３．　Ｉ　１ｅ２４．　Ａｓｐ２６．　Ｐｈｅ２８．　Ｇｌｕ２９．５ ｅｒ３１．５ｅｒ３２．　Ｇｌｕ３３．５ｅｒ３５．　Ｇ１ｎ３６．　Ｐｒｏ３ ７．　Ｇｌｙ３８．　Ｖａ１３９．　ｌ　１ｅ４０．　Ｌｅｕ４２．　Ｔｈｒ４ ３．　Ｌｙｓ４４．　Ａｒｇ４５．　Ａ唐獅S ６、　Ａｒｇ４７．　Ｇ１ｎ４８．　Ａｓｐ５２．　ＧＩｕ５５．　Ｔｈｒ５６ ．　ＧＩｎ５９．　ＧＩｕ６０．　Ｔｙｒ６１．　［Ｉｅ６Q゜ Ａｓｐ６４．　Ｌｅｕ６５．　Ｇｌｕ６６、　Ｌｅｕ６７、　Ａｓｎ６８　ａｎ ｄ　Ａｌａ６９゜本発明の好ましいＭ［Ｐ−１α類似体は、上記の好ましいＬＤ ７８類似体に相当する。 本発明による分子は、５ｅｒ−１（ＬＤ７８の場合）もしくはＡｌａ−１（ＶＩ Ｐ−１αの場合）の上位のＮ末端延長がないのが好適である。 これは、そのようなＮ末端が延長された分子の型は、幹細胞に存在するＬＤ７ｇ レセプターに結合する能力に関して、弱められたものだからである。そのような 分子は、アミノペプチダーゼによる処理によっても、ＣＦＵ−Ａもしくは育系分 裂誘発アッセイのような機能的イン　ビトロ　アッセイにおける活性種を生しさ せることが可能である。しかし、活性種の薬物動力学上の不確定さの増大と、応 答での変化を増加させるので、幹細胞阻害剤の臨床的応用に対してはそのような 処理によらないことかのぞ才しい。 Ｎ末端が延長された変異体とは対照的に、１位のセリンを持つ完全長型か好まし いが、ｌと７の残基間のＮ末端の欠失する分子は、受容体結合において活性であ る。 本発明によるＳＣＩ類似体は、原則として、存在する（例えば天然の）タンパク 質の化学的修飾および／もしくはオリゴ−もしくはポリペプチド鎖の２つもしく はそれ以上の化学的カップリングを含むいずれの簡便な方法によっても作製され つる。 しかし、より大きな融通性が、連続的にアミノ酸残基を生体内で結合させる組換 えＤＮＡ法の使用により、得られつる。 ゆえに、本発明の第２の観点によれば、上記のタンパク質をコードする核酸か提 供される。本発明の範囲には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。ＤＮＡは 、化学的に合成され、および／もしくは組み換えであってもよい。 変異は、デ　ノボ　ポリヌクレオチド合成、適切に設計されたオリゴヌクレオチ ド　プライマーを用いる特定部位の突然変異生成法もしくは他の簡便な方法のい ずれかによって導入される。 本発明による組換えＤＮＡは、ベクターの型でありもよい。そのベクターは、例 えばプラスミド、コスミド、ファージでもよい。ベクターは、しばしばそれらに よって形質転換された（もしくは形質移入されたここの紐はこの明細書中におい て交換可能に使用されうる）細胞の選択を可能とする、好ましくは、異種のＤＮ Ａを取り込んだベクターを保育する細胞の選択を可能とする１つもしくはそれ以 上の選択可能なマーカーを含むであろう。一般に、適当な翻訳開始および終止シ グナルが存在するであろう。付加的に、もしベクターが発現について意図されて いるならば、発現を生じさせつる十分な転写調節配列が含まれうる。調節配列を 含まないベクターは、クローニングベクターとして有用である。 クローニングベクターは、イー、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）もしくは池のいずれか のその操作を容易にする適切な宿主に対して導入されつる。発現ベクターは、原 核発現に対して適用しつるが、好ましくは、酵母〔サツカロミセス　セレビシェ （Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピシア　パストリス （Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含むかこれに限定されない〕のような微 生物真核細胞もしくは、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような高等な真核細胞内で の発現に対して適用されつる。 本発明の実行は、微生物もしくは細胞型のいずれの特定の系統にも依存せず、制 限もされない。本発明で使用するのに適切なものは、次のこの明細書の教示に従 って、当業者にとって明白であろう。本発明の第３の観点によると、上記のＤＮ Ａで形質移入もしくは形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞はいずれ の適切な源でもよく、真核宿主細胞が好ましく、酵母細胞も選択しつる。 幹細胞阻害剤の生産は、野性型であろうと上記のように変化された型であろうと 、酵母宿主ピシャ　バストリスにおいて行われる際、特に有利であることが見い 出された。ゆえに、本発明の第４の観点によれば、幹細胞阻害剤の活性を有する 分子の生産方法であって、その分子をコードする発現しつる異種の核酸を有する 酵母であって、ピシャ属の酵母、好ましくはバストリス種を培養することからな る方法を提供する。 本発明によるＤＮＡは、イン　ビトロの過程を含む、連続的にヌクレオチドをカ ップリングする、および／もしくはオリゴ−１および／′もしくはポリヌクレオ チドを結合することを含むいずれの簡便な方法（こよっても作り得るが、組換え ＤＮＡ技術が選択の方法である。 本発明のタンパク様化合物が製造されるが、それらは研究手段としても薬として も存用であろう。他の用途も排除されてはいない。第５の観点において、本発明 は、上記タンパク様化合物の薬における使用、特に幹細胞の保護；例えば腫瘍の 治療（放射線治療、化学療法いずれも）への使用を提供する。 ゆえに、本発明は第６の観点において、特に腫瘍治療における幹細胞保護剤とし ての使用への剤の製造への上記のタンパク様化合物の使用を提供する。本発明は 、特に腫瘍治療に伴う幹細胞の保護の方法に用いることができ、その方法は、上 記のタンパク様化合物の存効量を患者へ投与することからなる。この方法は好ま しくはイン　ビボで行われる。又は、その方法は化学療法剤によって白血病細胞 を一掃し、患者への再注入されるエグゾ　ビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）で行うことが できる。 上記タンパク様化合物の製剤それ自体は、本発明の一観点を形成し、活性な化合 物と医薬的に許容される担体とからなる。 活性物質を生物活性および生物学的利用性に導く経口製剤か、原則的には好まし いか、実際上は、本発明の化合物は非経口的に投与されなければならないことも ありうる。非経口的に投与しうる製剤は一般に滅菌され、注射用水、ＰＢＳもし くは生理食塩水のような適切な液体賦形剤に溶解されたｌもしくはそれ以上のタ ンパク様化合物からなる。投与量は、臨床家もしくは医師によって決定しうるち ので、一般に活性な量か導出されるに確実な量であろう。 本発明の化合物は、単独もしくは細胞毒性薬と共に、乾癖もしくは過増殖性の幹 細胞に関係した他の疾患の治療に使用てきる。本発明の化合物の局所的もしくは 経皮的製剤は、非経口的製剤と同様に、本発明のこの観点において有利に使用で きる。 本発明の各々の観点に対する好ましい特徴は、各々の発明の１！克に必要な変更 を加えたものと解されるべきである。 本発明のある好ましい態様は、添付の図面を参照して述べられるであろう。 図１ａは、シＤ７８アミノ酸配列とＭＩＰ−１αとＡＣＴ−２のアミノ酸配列を 説明している。 図１ｂは、ＬＤ７８単量体の構造模型を示している。帯状のものは、シＤ７８単 量体に対する骨格原子の予知された経路を描く。標識された残基は、予知された ２次構造要素を定義する。β−シートの鎖Ｉは、Ｐｈｅ２３からＴｈｒ３０まで 、鎖２はＬｙｓ３５からＴｈｒ４３まて、鎖３は５ｅｒ４６からＰｒｏ５３まて 、そしてＣ末端へリックスはＴｒｐ５７からＡＩａ６９まてである。 図１０は、シＤ７８単量体における推定上の多量体界面を図式的に示す。 図１６は、図ＩＣにおいて示されるＬＤ７Ｂ単量体がとのように２１Ｌ体、４３ １体、１２量体および凝集物を形成するかの提案を示す。 図２は、酵母発現ベクターｐｓｗ　６のプラスミドを説明する。 図３は、近紫外円偏光二色性で測定して、ＬＤ７８とＭ［Ｐ−１αの４次構造か 同一であることを示す。 図４は、近紫外円偏光二色性で測定して、ＡＣＴ２の４次構造かＶＩＰ−１αの それと異なることを示す。 図５は、抗ＭＩＰ−１α抗体を用いたＭ［Ｐ−１α、ＬＤ７８およびＡＣＴ２の ウェスタン　プロットを説明している。その結果は、ＡＣＴ２とてはなく、ＬＤ ７８と抗ＭＩＰ−１α抗体との交差反応を示す。 図６は、比較例４において述べれるように再生されたＭＩＰ−１α、ｔ、、Ｄ７ ８およびＡＣＴ２の代表的なサイズ排除クロマトグラフィーのプロフィールを示 す。また、標準タンパク質の正確な分離を示している分子量標品として用いられ たタンパク質の溶出プロフィールと再構成されたＬＤ７８、ＭＩＰ−１αおよび ＡＣＴ−２について測定した分子量種の表を示す。 図７は、混合された分子量マーカーとＥＧＥｆｉ準とともにクーマノ−染色され たＬＤ７８、ＭＩＰ−１αおよびＡＣＴ−２のネイティブＰＡＧＥ分析を示して いる。ゲルは、３つのタンパク質は全て、天然の条件下て高分′：Ｆ−量多量体 であることを示す。 図８は、種々の緩衝液条件下で、シＤ７８野性型に対する平衡における分析的超 遠心細胞におけるタンパク質溶質の量の分布を示す。 図９は、４量体しＤ７８の近紫外円偏光二色性スペクトルが、限定構造を得るた めに使用された緩衝液条件に独立していることを示す。 図１Ｏは、４１体ＬＤ７８の近紫外円偏光二色性スベク［・ルか、高分子量多量 体形のそれと異なっていることを示す。 図Ｉ＋は、Ｔｒｐ−５７蛍光発光エネルギーの消光か生じることが４ｉ体ではな く、多量体複合体で存在することを示す。この発光エネルギーの消光は、Ｔｒｐ −５７の基部である多量体に対し特有な静電的相互作用の存在による。 図１２は、野性型ＬＤ７８と変異体ｌ０１ＩＩ、５２と混合した分子量マーカー とを用いたクーマシー染色したネイティブＰＡＧＥゲルを示す。そのゲルは、Ｌ Ｄ７８変異体に対して観察される異なる電気泳動移動度を示す〔変異体１０は、 実施例７の対象であり、変異体１１は実施例８の対象、変異体５２は実施例６４ の対象である〕。 図１３は、天然ＬＤ７８．７つの変異体構成体および混合された分子量マーカー を用いたクーマン−ブルー染色したネイティブＰＡＧＥゲルを示しテイル。ゲル ハ、変異体１，２．１０．１５．２６．２９および３０（ソれぞれ実施例１．２ ．７、ＩＬ　１６．１９および２ｏのもの）は、（異なる程度で）より早い電気 泳動移動度を示す野性型とは異なる多量体化の性質を有することを示す。 図１４は、比較のために、野性型しＤ７８と選択された変異体構成体の１５０ｍ Ｍ　ＰＢＳ　Ｉ）Ｉ（７，４中てのサイズ排除クロマトグラフィー（５ＥＣ）の プロフィールを示す。 図１５ａは、ビシャ　パストリス発現ベクターｐ）ＩＩＬＤ４を示す。 図＋５ｂは、因子のプレプロ配列（ｐｒｅｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合した ＥＧＦを含むピンヤ　パストリス発現ベクターｐＬＨＤ　４を示す。 図１６は、ビシャ　パストリス発現ベクターｐＨＩＬＤ１を示す。 図１７は、シＤ７８の直接発現と分泌のために修飾されたｐＬＨｔ１４に基づく ビンヤ　パストリス発現ベクターＰＬＨ２３を示す。 図１８は、最適化されたピシャ　バストリス　ＬＤ７８分泌ベクターｐＬＨ２３ の構成を示す。 図１９は、多１体化状態と受容体結合の間の関係を示す。 図２０は、黒で強調した受容体結合残基を持つ提案されたＬＤ７８４量体のコン ピューターージュネレイテッド（ｃｏｍｐｕｔｏｒ−ｇｅｎｅｒａｆｅｄ）モデ ルを示す。 図２１は、重複している付着端を持つＬＤ７８合成遺伝子（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ３ ４−１３）の構築用の７ニールされたオリ１′ヌクレオチドを示す。 図２２は、重複している付着端を持つＭＩＰ−１α遺伝子（ＳＥＱ　［ＤＮＯ３ ２Ｏ−３１）の横築に用いられるアニールされたオリゴヌクレオチドを示す。 図２３は、重複している付着端を持つ、ＡＣＴ−２遺伝子（ＳＥＱ　ＩＤＮ０Ｓ 　３７−４６）の構築に用いられるアニールされたオリゴヌクレオチドを示す。 図２４は、精製されたマウス幹細胞を用いるイン　ビトロ　コロニー形成におけ る変異体１０の効果を示す。 図２５は、精製されたマウス幹細胞を用いるイン　ビトロ　コロニー形成におけ る変異体８２の効果を示す。 調製１〜１４は、シ０７８、Ｍｌｌ’−１αおよびＡＣＴ−２に対する合成遺伝 子の構成、酵母発現ベクターの開発およびそのそれらのタンパク質製品の生産と 予備的な特徴づけを記載する。 比較例１〜７は、ＬＤ７８、Ｍ［Ｐ−１αおよびＡＣＴ−２の生物物理学的性質 、溶液条件の範囲下でのそれらの分子量の比較、およびＬＤ７８の多量体化の程 度についての分光学的アッセイを記載する。 実施例１−１２４は、ＬＤ７８変異体の設計と構築およびそれらの発現ベクター への取り込みを記載している。実施例１２５は、変化した多量体化の性質を持つ 変異体検出のための簡便なゲル選別を開示する。実施例１２６〜＋５３は特定の 残基での変異の多量体化における効果を記載する。実施例１５４は、すでに述べ られたＬＤ７８の変異体か、それらの多量体化の性質に関して野性型であること を示す。実施例１５５は、ＬＤ７８多量体化における分子面を開示する。 実施例１５６〜１５７は、低下した多量体化を示すＬＤ７８変異体が、野性型Ｌ Ｄ７８よりもニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉｅ）においてより高い 発現レベルを与えるという予想外の観察を開示する。実施例１５８〜１６３は、 改良されたピシャ　パストリス発現ベクターの構築、ＬＤ７８産生株の構築およ び得られた野性型ＬＤ７８の予想外の高い収率を記載し、収率におけるさらなる 増加が、低下した多量体化を示す変異体で観察されることを示す。 実施例１６４は、低下した多量体化を示す変異体が、受容体結合のイン　ビトロ 　モデルにおいて活性であることを示す。実施例１６５は、非多量体化した変異 体が、造血始原細胞（１２日口のＣＦｔｌ−３）の増殖を阻害しうることを示す 。 方法論 記載された遺伝子の製造および発現ベクターの構築のためのそれらのさらなる操 作において用いられる遺伝子工学および遺伝子操作の技術は、当該技術分野にお いてよく知られている。 最近の技術の記載は、エフ、エム、オーズベル（Ｆ、　Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ） ら著、“カレント　プロトコル　イン　モレキュラー　バイオロジー（Ｃｕｒｒ ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　Ｉ Ｌ、　７巻２号、　〔ウィレーーインターサイエンス（Ｗｉ　１ｅｙ−１ｎｔｅ ｒｓｃｉｅｎｃｅ）による出版、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ））やサムプ ルツク（Ｓａｍｂｒｏ。 ｋ）、マリンシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）とマニアトリス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）著、 “モレキュラー　クローニング、ア　ラボラトリ−マニュアル（ＭｏＬｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）”　（第 ２版）（コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ））なとの実験室便覧において、見ることができる。Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１ ３ｍｐ１９およびｐｕｃ＋ｓおよびｐＵｃ１９　ＤＮＡはファルマシア　リミテ ッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、）、（ミツドサマー　ポーレバード（Ｍｉ ｄｓｕｍｍｅｒ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ）、セントラル　ミルトン　ケインズ（Ｃ ｅｎｔｒａｌ　Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ）、ブックス（Ｂｕｃｋｓ）、ＭＫ ９３ＨＰ、イギリス〕から購入された。制限エンドヌクレアーゼは、ノースアム ブリア　バイオケミカルズ　リミテッド（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ　Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）〔サウス　ネルソン　インダストリアル　ニス テート（Ｓｏｕｔｈ　Ｎｅ１ｓｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｓｔａｔｅ）、 クラムリントン（Ｃｒａｍｌ　ｉｎｇｔｏｎ）、ノースアンバーランド（Ｎｏｒ ｔｈｕｍｂｅｒｌａｎｄ）、ＮＥ２９９）ＩＬ、イギリス〕、もしくはニュー　 イングランド　バイオラボラトリーズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ ｓ）　（３２ドーザ−ロード（Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ）。 ベバーリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、ＭＡ　０１９１５〜５５１０、アメリカ〕のい ずれかから購入された。 公開されたＬＤ７８に対するアミノ酸配列は、遺伝子配列を与えるために逆−翻 訳された。そして、コドンの使用は、ニス　セレビシェにおける発現を最大にす るため最適化された。合成遺伝子の５′末端は、酵母連結型因子アルファ（ｙｅ ａｓｔ　ｍａｔｉｎｇ　ｔｙｐｅｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈａ）の最後の５アミノ 酸残基（Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ）に対するコドンを含むよう 設計された。そして、その配列は、５゛末端に旧ｎｄｌｌＩ制限部位、３′末端 にＢａｍＨ［制限部位を含むように修飾された（ＳＥＱ　ＩＤ：１）。 遺伝子配列は、１２個のオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ：４）から（ＳＥＱ 　ＩＤ：１３）に分けられた。それぞれの内部のオリゴヌクレオチドは、相補的 なオリゴヌクレオチドのそれぞれの対のアニーリング後、特有の７塩基付着端か はなれるように設計された。これは、遺伝子構築の際の完璧なオリゴの組合せを 考慮に入れている。図２１は、重複する付着端でアニールされたオリゴヌクレオ リボヌクレオチドは、シアノエチル　ホスホラミディートの化学を用いて、アプ ライド　バイオシステム　３８０Ｂ　遺伝子合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　Ｇｅｎｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）上で合成された 。その方法論は、現在広く用いられ、記載されている〔ポウケージ、ニス、エル 、　（Ｂｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、　Ｌ、）とカルザース。 エム　エイチ、（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　Ｈ，）　、テトラヘドロン　レ ターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　２４巻、２４５頁（１９ ８１年）〕。 遺伝子構築 完全長の遺伝子を作製するため、それぞれのオリゴヌクレオチド　１００ｐ１０ ０ｐか真空乾燥界中で乾燥された。内部ヌクレオチドの５′末端は、後の連結を させるため５′リン酸化物を提供するようにキナーゼ処理された。ｌｏｏｐｍｏ ｌｅの乾燥されたオリゴマーは、２０μｍのキナーゼ緩衝液（７０ｍＭトリス（ Ｔｒｉｓ）　、　ｐＨ７゜６、ｌ０ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣ１ｔ）、Ｉｍ Ｍ　ＡＴＰ、　０．２ｍＭスペルミジン、　０．５ｍＭジチオスレイトール〕に 再懸濁された。 Ｔ４　ポｌ　ヌクレオチド　キナーゼ（２ｔｔ　１．　ＩＯ，０００Ｕ／ｍｌ） が添加され、混合物は３７°Ｃて３０分間インキュベートされた。その後、キナ ーゼは、７０°Ｃて１０分間、熱による不活化かなされた。ただし、構築の際の 鎖状体化を阻止するために、末端オリゴヌクレオチドＢＢ５６１５と８８５６２ ４は、キナーゼ処理されなかった（ＳＥＱ　ＩＤ２） 相補対のオリゴヌクレオチドは、対にてアニールされた（９０°Ｃ１５分の後、 室温へゆっくりと冷却）。そして、６つのアニールされた対はいっしょに混合さ れ、５０°Ｃて５分間加熱され、Ｔ４　ＤＮＡ　リガー七を用いて１４°Ｃて一 夜連結された。そして、連結された完全長の生成物は、２％の低溶融温度アガロ ースゲル上で、電気泳動により、非連結物から分離された。ＬＤ７８遺伝子に相 当するＤＮＡフラグメントは切断され、ゲルから抽出された。 そして精製したフラグメントは、ＨｉｎｄＩ［ＩとＢａｍ旧処理されたｐＵＣ１ ｇプラスミドＩＩＩＮＡに連結された。連結された生成物は、常法により適切な イー　コリ宿主株に形質転換された。用いられた菌株は、以下の遺伝子型を存す るＨＷ８７てあった　ａｙａＤＩ３９△（ａｒａ−１ｅｕ）７６９７Δ（ｌａｃ ｌＰＯ２Ｙ）７４　ｇａＬＩＪ　ｇａｌＫ　ｈｓｄＲｒｐｓＬ　ｓｒｌ　ｒｅｃ Ａ５６゜ この特定の菌株の使用は、決定的なものではなく、いずれの適切な宿主〔例えば 、ＭＣｌ０６１．アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ） から入手可能〕も用いられ得る。 形質転換体は、１．−寒天カルペニシリン　グレート上で選択された。１２個の カルへニジリン耐性コロニーが拾い上げられ、後の分析のためのプラスミドＤＮ Ａを調製するのに用いられた。ユニバーサル配列プライマー〔ユナイテッド　ス ティソ　バイオケミカル　コーポレーション（Ｌｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、（５’　−ＧＴＴＴＴＣ ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’　）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１４）　）を用いた 二重弾準ノデオキシ配列分析か、正しいＩ）ＵＣｌ３−ＬＤ７８クローンを同定 するために用いられた。ｐＵｃ１８−ＬＤ７８ベクターは、発現へフタ−を構築 するためのＬＤ７８遺伝子の源として用いられた。 調製２−ヒトＬＤ７８に対する酵母発現ヘクターの構築発現ヘクターは、ニス　 セレビシェにおける発現の後、細胞外培地にＬＤ７８の分泌をし得るよう設計さ れた。分泌はＬＤ７Ｂの精製と迅速な分析を支持する。酵母連結型因子アルファ からの分泌シグナルは、ＬＤ７８タンパク質の直接的輸送に用いられた。 酵母発現ヘクターｐＳＷ６（ＳＥＱ　）Ｄ　ＮＯ＋５．図２）は、ニス、セレビ シェ　由来の２ミクロンの環に基づいている［ｐＳＷ６は、ナショナル　コレク ション　オブ　インダストリアル　アンドマリン　バクテリア　リミテッド（Ｎ ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ 　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）、２３　セント　マーシ ャー　ドライブ（Ｓｔ、Ｍａｃｈａｒ　Ｄｒｉｖｅ）、　アベルディーン（Ａｂ ｅｒｕｄｅｅｎ）ＡＢ２１ＲＹ、スコツトランド　ユナイテッド　キングトム（ Ｓｃｏｔｌａｎｄ　Ｕｎｉｔｅｄ　ＫｉｎｇｄＯｍ）に、１９９０年１０月２３ 日に受託Ｎｏ、ＮＣＩＭｅ　４０３２６としてニス、セレビシェ種ＢＪ２１６８ で寄託された）。ｐＳＷ６は、イー　コリおよびニス、セレビシェの両方で複製 可能なシャトルベクターであり、両方の微生物に対するＤＮＡ１１製起点、１ｅ ｕ２遺伝子（酵母中でのプラスミド維持に対する選択可能なマーカー）およびイ ー、コリ中でのプラスミド維持の選択に対するアンピシリン耐性遺伝子座を含む （ベクターに対するＤＮＡ配列か決定され、イー、コリ配列は、イー、コリのＣ ｏ１ＥＩに基づく複製単位ｐＡＴ１５３山来である）。完全な配列は、ＳＥＱ　 １０　Ｎ。 １５に与えられている。イー、コリを通じたこのベクターの通過能力は、その遺 （云学的操作や精製の容易性を大いに促進する。 ｐＳＷ６は、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）をコードする遺伝子に対して、枠内融 合されたアルファ因子プレプロペプチドを含む。この融合の発現は、ニス、セレ ビシェＧＡＬ　１−１０プロモーターとニス、セレビシェ　ホスホグリセレート 　キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからのハイブリッドＤＮＡ配列を含む効力あ るガラクトース調節されたプロモーターの制御下にある。 ＥＧＦ遺伝子の転写は、このベクターにおいて、天然の酵母ＰＧＫターミネータ −によって、終結される。ｐＳＷ６中のεＧＦ遺伝子は、制限エンドヌクレアー ゼ旧ｎｄＩ［ＩおよびＢａｍ旧を用いる消化によって取り除かれ得る。これは、 ＥＧＦとアルファ因子プロペプチドのＣ末端から５個のアミノ酸両方をコードす るＤＮＡを取り除く。ゆえに、ｐＳＷ６発現ベクターに挿入されるべき遺伝子は 、ＨｉｎｄＩ［［部位−アルファ因子アダプター遺伝子−〇ａｍＨ［部位なる一 般的な構築を在さなければならない。 Ｈｉｎｄｌ［とＢａｍ旧エンドヌクレアーゼを用いた消化の後、ｐｓＷ６ベクタ ーは、最後の５アミノ酸残基に対するコドンを失ったアルファ因子遺伝子を含む 。ｐｓｗａベクター中でアルファ因子−ＬＤ７８融合遺伝子を構築するために、 調製■のｐＵＣＩ８−　ＬＤ７８ベクターはＨｉｎｄＩ［ＩおよびＢａｍ旧ヌク レアーゼで処理しなければならない。この消化反応の産物は、１％の低ゲル化温 度アガロースゲル上で、電気泳動において分離された。ＬＤ７８遺伝子に相当す るＤＮＡフラグメント（約２３５ｂｐ）は、ゲル基質から取り出され、精製され た。それから、このＤＮＡフラグメントは、ＨｉｎｄＩ［ＩおよびＢａｍ旧処理 されたｐＳＷ６ＤＮＡに連結された（ＥＧＩ入物を欠いたベクターＤＮＡフラグ メントは、この連結のために精製された）。 組換連結生成物は、ＨＷ８フィー、コリ成分に形質転換された。 形質転換体は、Ｌ−寒天アンピシリンプレート上で選択された。 １２個のアンピシリン耐性形質転換体は、プラスミドＤＮＡの標品とＨｉｎｄｌ Ｉ［およびＢａｍ旧を用いた制限酵素エンドヌクレアーゼ分析の後のアガロース ゲル電気泳動によって選別された。正しい電気泳動パターンを持つクローン（ｐ ＳＷ６−ＬＤ７８　）が選択された。このベクターのプラスミド標品が調製され 、プラスミドＤＮＡ上で配列ブライｖ−ＢＢ１３３０（５’　ＡＧＧＡＴＧＧＧ ＧＡＡＡＧＡＧＡＡ−３’　Ｘ５ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）を用いてジデオキシ 配列分析によって構築の完全性か確認された。このプラスミドは、野性型ＬＤ７ ８に対して用いられる発現ベクターである。　。 調製２のｐＳＷ６−ＬＤ７８プラスミドは調製され、以下の遺伝子型を存する酵 母（ニス、セレビシェ）菌株ＭＣ２に電気穿孔された。 Ｄｒｃｌ−４０７ｐｒｂ　ｌ−１１２２，ｈＮ−３，Ｉｇａ２３−１１．ｔｒｐ ｌ　ｕｙａ３−５２ｍａｔｉｎｇ　ｔｙｐｅ　α ＭＣ２系統の使用は、この調製および本発明一般のいずれにおいても決定的なも のでない。遺伝的にＭＣ２とほとんど同一であり、寄託された（調製２参照）、 たとえばＢＪ２＋６８菌株のようないずれの適切な菌株も用いられうる。 ハイオーラット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）便覧（ジーン　パルサー（商標名）形質移入 器具、操作使用法および適用案内、　１０−９０版、パイオーラット　ラボラト リーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、　３３００　レガノ タ　ボーレバード（Ｒｅｇａｔｔａ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ　）　、リッチモント （Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）　、シー１−　（ＣＡ）　９４８０４　ＵＳＡ　）に記載 された方法を用いて、酵母菌株１１１Ｃ２は、ＹＰＤ培地中３０”Ｃで一夜生育 させられる。細胞は、３００Ｏｒ、　ｐ、　ｍで５分間、ベックマン（Ｂｅｃｋ ｍａｎ）　Ｇ５−６ＫＲ遠心機中、遠心分離によって採取され、滅菌水中で洗浄 され、ＩＭのソルビトール中に再懸濁され、種々の量のプラスミドＤＮＡ　（０ ，１μｇ−１μｇ）に対して４０μｌのアリコート中に加えられる。結果として できた混合物は、＋５００ボルトのパルスに５　ｍ５ｅｃの間かけられ、３００ μｌの１Ｍソルビトールに加えられた。その後、電気穿孔された細胞は、アガロ −ルーソルビトール　プレート上にプレート　アウト（ｐｌａｔｅ　ｏｕｔ）さ れ、４−５日間３０°Ｃで生育させられた。 すべての酵母培地は、ジャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）らの“メソッド　イン　イ ースト　ジエネティクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ）”、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、　（１９８６年）に記載されてい るとおりであった。 酵母の発現および精製 ４〜５日後、電気穿孔物（ｅｌｅｃｔｒｏ　ｐｏｒａｔａｎｔｓ）は、収拾され 新鮮な寒天プレート上にまかれた。さらに１〜２日、３０”Ｃての生育後、単独 のコロニーが得られた。そして単独のコロニーは、５ｍｅのＹＰＤ培地に接種す るのに用いられ、その培地は３０°Ｃで一夜生育させられた。その後この５ｍＮ の一夜生育させられた培地は、酵母の窒素源であるロイシンを除いたアミノ酸お よび炭素源として１％ゲルコールを保有する５０ｍ１の０．６７％合成完全培地 を含有する０、５１！の振どうフラスコに接種するのに用いられた。 ２４時間生育後、細胞は、５ＯＲＶＡＬＬ”　ＲＣ３−８遠心機中で、３０００ ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって採取され、１００−の同様な合成完全培地（ 炭素源として１％ガラクトースおよび０．２％グルコースが用いられることを除 いて）に接種することに用いられる。これは、ハイブリットＰＧＫプロモーター から遺伝子発現を誘導する。誘導は、ガラクトース含有培地中で、３０°Ｃで４ ８〜７２時間生育させることによって実行された。 ４８もしくは７２時間後、培養物上清は、細胞を除去するため５ＯＲＶＡＬＬ” 　ＲＣ３−８遠心機で、３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって集められた 。この上清は、調製４に記載された方法により、さらなる分析およびＬＤ７８の 精製に用いられた。 調製４　酵母中の合成遺伝子から発現されたヒトしＤ７８の精製調製３に記載さ れた振どうフラスコからの上溝は、澄明にす□るため、５ＯＲＶＡＬＬ”　ＲＣ ５−８遠心機にて６５００ｒｐｍで１５分間回転された。典型的には、３リツト ルの酵母上清は、ｐＨ８に調整し、３０ｍ１の５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）　 ｐＨ８，０に前もって平衡されたイオン交換樹脂〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）　）が加えられた。 タンパク質は、−夜、４°Ｃでゆっくり攪拌しながら、ひとまとまりに吸着させ られた。その後、樹脂は沈殿させられ、上溝は除去された。樹脂は、直径１．６ ０のカラムに注がれ、５０ｍＭ　トリスｐＨ８，０の１０倍量で洗浄され、タン パク質は、その後、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ　ｈリスｐＨ８，０（典 型的には５０−の総溶出液）中に溶出された。溶出液は、前もってぬらされたス ペクトラボール（ＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ”）透析膜（３０００Ｄａ　カットオフ ）に移され、１回の緩衝液変化を伴い４“Ｃにおいて１０倍量の５０ｍＭ　）リ スｐＨ８，０に対して透析された。試料は、２０％アセトニトリル（最終濃度） に調整し、塩酸でｐＨは３にされた。 タンパク質試料は、２０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦへ ）中、３ｒＩＬｌ／ｎｉｎで前もって平衡された２０−バイダッ’）　（ＶＹＤ ＡＣ”）　Ｃ−１８（１０μ孔サイズ）ノ半調製逆ＩＨＰＬ（Ｊラムに（しオダ イン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）注入ループでバイパスして）直接吸引し、２０から５ ０％アセトニトリル、０．１％ＴＰＡの直線勾配を用いて、４０分を通じて溶出 された。溶出画分は、２２−８０ｎにおける紫外吸収によって検出され、５ＤＳ −ＰＡＧＥファーストゲル（ＰＨＡＳＴＧＥＬ）によって分析された（調製ｌｌ に記載されるように）。純粋なＬＤ７８タンパク質は、４３％アセトニトリル、 ０．１％ＴＦＡ付近で溶出することが見られた。精製されたＬＤ７８は、凍結乾 燥され、−２０°Ｃて保存された。タンパク質の配列は、ＳＥＱ　［ＯＮＯ２と して与えられる。 ＭＩＰ−１αに対する公表されたアミノ酸配列は、遺伝子配列を与えるため逆− 翻訳された。そして、コドンの使用は、ニス。 セレビシェにおける発現を最大にするよう最適化された。５ＥＱＩＤＮＯ７は合 成遺伝子の配列を示し、タンパク質配列はＳＥＱ　１ＯＮ０１８のように与えら れ、遺伝子のアンチセンス鎖はＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ０１９である。 オリゴヌクレオチドが調製ｌのものとは異なることを除いて、ＭＩＰ−１α遺伝 子の構築は、調製１の方法に従った。図２２は、ＶＩＰ−１α遺伝子（ＳＥＱ　 ［Ｄ　ＮＯ２０〜３１）の構築中で用いられたアニールされたオリゴヌクレオチ ドを示す。合成遺伝子は、ｐＵｃ１８ＭＩＰ−１αを作製するためプラスミドｐ Ｕｃ１８にクローン化された。 調製６　マウスＭＩＰ−１αに対する酵母発現ベクターの構築以下に詳述された 変更を除いて、ニス、セレビシェからＭ［Ｐ−１αの分泌を可能とじつるよう設 計された酵母発現ベクターの構築は調製２の方法に従った。 調製５のｐｕｃｔｓ　Ｍ［Ｐ−１αベクターにおけるＶＩＰ−１αの合成遺伝子 は、そのｐＳＷ６発現ベクターへの包含に先んじて処理されなければならない。 これは、合成的ＶＩＰ−１α遺伝子は、ｐＳＷ６ベクターにおけるアルファ因子 遺伝子に対する枠内融合の構築にとって適切な５゛−末端における配列を欠いて いるからである。 アルファ因子プロペプチドのＣ末端におけるアミノ酸をコートするＤＮＡの再横 築のため、およびこれを合成Ｍ［Ｐ−１α遺伝子に対して融合するために、）ｌ ｉｎｄＩ［Ｉ部位およびアルファ因子プロペプチドのＣ末端からＳｅｒ、　Ｌｅ ｕ、　Ａｓｐ、　ＬｙｓおよびＡｒｇをコードするコドンを包含するオリゴヌク レオチド　アダプターＢ８９８５（５゜−ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡ−３ ’　（ＳＥＱ　＋０３２．上端鎖）　、８Ｂ９８６５°−ＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣ Ａ−３°（ＳＥＱ　＋ｌ）　３３．下端鎖）か構築される。組換え遺伝子かＭＩ Ｐ−１αへの枠内α因子プロペプチドを融合コードするようにアルファ因子アダ プターは、合成ＶＩＰ−１αの遺伝子に対して連結される。調製５のｐＵｃ１８ 　ＭＩＰ−１αプラスミドは、初めにＢｓｐＭＩで分裂され、張り出した末端は 、鈍端にされた直線ＤＮＡフラグメントを作製するため、ＤＮＡポリメラーゼＩ を用いて満たされた。直線化されたＤＮＡフラグメントは非切断のプラスミドＤ ＮＡから、１％低ゲル化温度のアガロースゲルマトリックス上で分離され、さら にＨｉｎｄＩ［Ｉて処理された。そして、そのフラグメントは、上述のアルファ 因子アダプターに連結された。ただし、アダプターの二本鎖は連結に先んしてア ニールされた。組換え連結生成物は、イー　コリ　ＨＷ８７のコンピテント細胞 にて形質転換された。アンピシリン耐性形質転換体は、プラスミドＤＮＡの標品 、ＨｉｎｄｌＩ［およびＢａｍ旧を用いた消化物およびアガロースゲル電気泳動 によって分析された。正しい組換えプラスミドは同定された。このベクターの完 全性は、配列プライマーＢＢ３３７６およびＢＢ３３７９を用いたジデオキシ配 列分析により確認された（ＢＢ３３７６およびＢＢ３３７９は共に、ＳＥＱ　Ｉ Ｄ：５に示されている）。 このプラスミドは、酵母発現ベクターの構築のためのＤＮＡ源として用いられた 。その方法は、調製２の方法に従った。手短かに言えば、今やアルファ因子アダ プターを含む修飾されたｐｕＣ１８λ（ＩＰ−１αベクターは、Ｈｉｎｄｌ［お よびＢａｍ旧を用いて消化され、ＭＩＰ−１αＤＮＡフラグメントか精製された 。このフラグメントは、調！８！２中の方法によりＨｉｎｄＩ［ＩおよびＢａｍ 旧処理されたｐｓ〜ｖ６　ＤＮＡに連結された。、調製７の対象であるＭＩＰ− １α発現ベクターは、ｐｓｗ６１１ｔｉｐ−１αと名づけられた。このベクター は、次の発現に用いられた。 調製７　酵母における合成マウスλ１ｔＰ−１αの発現用いられる発現ベクター か、ｐＳＷ６Ｍ［Ｐ−１αてあり、気穿孔法の代りに形質転換か用いられること を除いて、調製３の方法は、マウスＶＩＰ−１α遺伝子の発現に用いられる。形 質転換には、ジャーマン　エフ　（Ｓｈｅｒｍａｎ　Ｆ、）らの方法〔“メソッ ズ　インイースト　ジエ不テイクス０Ｊｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃｓ）　”、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８６）　）が用い られた。 ＵＲ製７に記載された振とうフラスコからの上溝は、澄明にするために、５ＯＲ ＶＡＬＬ”　ＲＣ−５Ｂ遠心機中５００Ｏｒｐｍで遠心分離された。典型的に、 ５リツトルの澄明な上清は、２０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ　（最終濃 度）ニ調整され、ｃ−１８シリ力樹Ｉｌｌｉｒ３０ｇが乾燥粉末として加えられ た。タンパク質は、ゆっくりとした攪拌をしながら、−夜４°Ｃでバッチ吸着さ せた。その後、シリカ樹脂は沈殿させられ、上清は除去された。その後樹脂は、 ２゜５１（直径）のカラムに注がれ、２５％アセトニトル、０．１％ＴＦＡの１ ０倍カラム容量で洗浄され、５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡて溶出され 、３０ｍ１画分が手動で集められた。調製１３に記載されたようにこれらの両分 のアリコートは乾燥され、５ＤＳ−ＰＡＧＥＰＩ（ＡＳＴＧεＬＴＭ（ファルマ シア）により分析された。タンパク質濃度は、路長１ｃｒＱのセル中ての２８０ ｎｍにおける吸収から見積られ、同様の条件下での１■／−タンパク質溶液に対 する吸収１゜３７か計算された。そして溶出された両分は、凍結乾燥された。 さらなる精製のために、乾燥された画分は０．１％ＴＦＡ　（最終濃度）中に再 懸濁させ、４ｆｆＩｇアリコートは、２５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中 て３ｍＪ／ｍｉｎて前もって平衡化させられた２ｏ−ダイナマックス（ＤＹＮＡ ＭＡＸＴＭ）半調製Ｃ−１８逆相カラム（１０μ孔−サイズ）上に負荷された。 Ｍ［Ｐ利αは、５０分を通じた直線２５〜４５％アセトニトリル、０．１％ＴＦ Ａ勾配を用いて溶出された。溶出画分は、２８０ｎｍの紫外吸収によって検出さ れ、手動で集められた。精製されたＶＩＰ川α用、連結乾燥され、−２０″Ｃに て保存された。 調１！９　ヒトＡＣＴ−２に対する合成遺伝子の構築ヒトＡＣＴ−２に対する公 表されたアミノ酸配列は、遺伝子配列を与えるために逆−翻訳された。モしてコ ドンの使用は、ニス。 セレビシェにおける発現を最大限にするように最適化された。 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３４と３６は、合成遺伝子の二本鎖配列を示し、タンパク質 配列は、ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ３５として与えられる。オリゴヌクレオチドが調製 Ｉのものとは異なることを除いて、ＡＣＴ−２遺伝子の構築は、調製ｌの方法に 従った。 調製１０　ヒトＡＣＴ−２に対する酵母発現ベクターの構築ｐＵｃ＋８−ＬＤ７ ８の代りに、ｐＵｃ１８　ＡＣＴ−２からのＡＣＴ−２遺伝子が用いられること を除き、調製２の方法に従う。生成物ＡＣＴ−２発現へフタ−は、ｐＳＷ６　Ａ ＣＴ−２と名付けられた。 調製１１　酵母におけるヒトＡＣＴ−２合成遺伝子の発現ｐＳＷ６　ＡＣＴ−２ ＤＮＡか発現ベクターとして用いられることを除き、調製３の方法に従う。 調製１２　酵母中で合成遺伝子から発現されたヒトＡＣＴ−２の精製調製１１中 に記載された振どうフラスコからの上清は、澄明にするために６５００ｒｐｍで １５分間回転された。典型的には、３リツトルの酵母上清はｐＨ８に調整され、 ５０ｍＭ！・リスｐｉ（８，０中で前もって平衡された３０ｍ１キュー−セファ ０−ス（Ｑ−ＳεＰＨＡＲＯ３ε？Ｍ）か加えられた。タンパク質は、ゆっくり と攪拌しながら、−夜４°Ｃで樹脂にバッチ吸着させた。樹脂は、沈殿させられ 、上清は取り除かれた。樹脂は直径１．６ｃｍのカラムに注がれ、５０ｍＭトリ スｐＨ８，０１０倍量で洗浄され、その後、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ 　トリスｐＨ８，０（典型的には５０ｍ１の総溶出）中溶出された。 その溶出物は、前もってぬらされたスペクトラボール透析膜（３０００ダルトン 　カノトオ））中に移され、１回の緩衝液の変更を伴って、４°Ｃにて１０倍量 の５０ｍＭ　トリスｐＨ８，０に対して透析された。その試料は、５０ｍＭトリ スｐＨ８，０で平衡化された８ｍｌヘバリンーセ’７７　ロース（Ｈｅｐａｒｉ ｎ−３ＥＰＨＡＲＯ３Ｅ”）カラム（１，６ｃｍ直径）に負荷され、カラムは同 様の緩衝液で洗浄された。ＡＣＴ−２は、５０ｎｔｌ　トリス、１Ｍ塩化ナトリ ウムｐｉ（８，０にて溶出された。 そしてその溶出物は、前もってぬらされたスペクトラポール透析Ｍｕ　（３００ ０ダルトン−カットオフ）に移され、１回の緩衝液変更をともなった４°Ｃにお ける１０倍量の０．

【％ＴＦＡに対して透析された。透析後、試料は、２５％ア セトニトリル（最終濃度）に調製した。そして、タンパク質試料は、３ｍｌ／ｍ ｉｎて２０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で、前も って平衡化させられた２０ｍ１バイダックＣ−１８（１０μ孔−サイズ）の半調 製逆相ＨＰＬＣカラムに負荷され、２０から５０％アセトニトリル、０．１％Ｔ ＦＡの直線勾配で、４０分間を通し溶出された。溶出画分は、２８０ｎｍにおけ る紫外吸収によって検出され、手動で集められた。ＡＣＴ−２タンパク質は、４ ３％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ付近で溶出することか見い出された。精製 されたＡＣＴ−２は、凍結乾燥され、−２０°Ｃにて保存された。 調製１３　酵母中で合成遺伝子から発現されたヒトＬＤ７８、ヒトＡＣＴ−２お よびマウスＭＩＰ−１αの同一性および純度の確認９７％以上の純度は、一連の 分析的手順を用いて確がめられた。 乾燥された物の小量の了りコート（比較例２に記載されているように、試料緩衝 液５μｌ中５μｇ）は、製造会社の推奨する試料緩衝液および運転プログラムを 用いる８〜２５％アクリルアミド勾配ファーストゲル（ＰＨＡＳＴＧεし”）　 （ファルマシア）を用いてソディウム　ドデシル　スルフエイト　ポリアクリル アミドゲル電気泳動て分析された。ゲルは、製造会社の推奨する手順により染色 および脱色された。 分析逆相ＨＰＬＣは、Ｉｍ／／ｍｉｎて２ｏ％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ 中、平衡化された２ｍｌバイダックＣ−１８分析逆相カラム（５μ孔−サイズ） を用いて行われた。およそｌＯ〜５０μｇのタンパク質か負荷され、流速１＋ｎ ｌ／ｍｉｎにて２０分を通じて２０〜５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡの 直線勾配を用いて溶出された。 Ｌｃｍの路長およびｌｎｍのバンド輻を用いた２４０−３２０ｎｍの範囲におけ る近紫外吸収分光学が凝集したＳＣＩから起こる濁り（光散乱）が精製された標 品中に存在しないことを確かめるために用いられた。 生成物のＮ端配列および質量から精製されたタンパク質の同一性か確認された。 １％酢酸を含む１：ｌ（体積比）メタノール／水中に溶解した試料５０μｇを用 いて、ブイジー　バイオーキ、−（ＶＧ　８１０−ＱＴＭ）分光計上にてエレク トロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分光学が行われた。いくつかの 場合においては、ＬＤ７８タンパク質の実質的な集団土金属付加物の質量ピーク か観察された。典型的には、カリウムと鋼が示された。大部分の鋼汚染は、分光 計内部の金属系から生じることが見い出されたが、ＬＤ７Ｂタンパク質は注入に おいて大きな電場が適用された時でさえ、この金属イオンを強固に保持すること が示された。会合の強度は、存意な量に対してさらされれば、ＬＤ７８は穏当な 親和性をもってこの２価金属イオンに結合する能力を有することを示している。 Ｎ−末端配列決定は、ワリントンＷＡ３７ＰＢ、ピルシュウッドサイエンス　パ ーク化、ケルビン　クローズ所在のアプライド　バイオシステムズ、リミテッド 製（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｔｄ、Ｋｅｌｖｉｎ　Ｃ１ｏｓ ｅ、Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐａｒｋ　Ｎｏｒｔｈ、Ｗａｒｒｉ ｎｇｔ。 口ＷＡ３７ＰＢ　）アプライド　バイオシステムズ　４７１Ａ　配列決定機（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７１Ａ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を用 いておこなわれた。典型的には、０．１％ＴＦＡ中に溶解された２５０ピコモル のタンパク質は、プレサイクル（ｐｒｅｃｙｃｌｅ）されたバイオブレン（ＢＩ ＯＢＲＥＮＥ”）グラスファイバーディスクに負荷され、自動化された１４サイ クルのエドマン分解にかけられた。全ての手順と配列決定サイクルは、製造会社 により推奨された通りであった。 比較例 ＭＩＰ川α用　ＬＤ７８およびＡＣＴ−２の近および遠紫外円偏光二色性（ｕ、 　ｖ、　ｃ、　ｄ、　）測定は、ジョビンーイボン　ジクログラフＶＩ　（Ｊ。 ｂｉｎ−Ｙｖｏｎ　Ｄｉｃｈｒｏｇｒａｐｈｅ　Ｖｒ）を用いて行なわれた。試 料は、１０ｍＭ酢酸ｐＨ３，２中で再構築され、２４０〜３２０ｎｍからの紫外 吸収走査は、タンパク質凝集物の欠除を確認するために用いられた。 タンパク質濃度は、ＭＩＰ−１αに対し１．３７、ＬＤ７８に対し１．２５、Ａ ＣＴ−２に対し１，５７のＩｃｍの路長を用いた２８０ｎｍにおけるＬｎ＋ｇ／ ｍｌ溶液の吸収に対して計算された値を用いて決定された。平均残基質量は、Ｍ ＩＰ−１α、ＬＤ７８およびＡＣＴ−２に対してそれぞれ１１４．１１３．７． １１３．３と計算された。近紫外円偏光二色性スペクトル（２５０−３２００ｍ ）は、走査速度５　ｎｍ／ｍｉｎ、応答１秒、バンド幅２ｎｍおよび路長１ｃｍ を用いて集められた。遠紫外円偏光二色性スペクトル（１９０〜２５０ｎｍ）は 、走査速度１０ｎｍ／ｍｉｎ、応答１秒、バンド幅２ｎｍおよび路長０．０１ｃ ｍまたはｏ、　Ｏ５Ｃｍのいずれかを用いて集められた。すへてのスペクトルは 計算され、基線を減じられて平均残基モル楕円率〔シータ（θ）〕として表示さ れた。 コンテイン（ＣＯＮＴＩＮＴＭ）プログラム〔プロペンチャー（Ｐｒｏｖｅｎｃ ｈｅｒ）、　コンビュート　ブイズ、コミュ、（Ｃｏｍｐｕｔ、Ｐｈｙｓ、Ｃｏ ｍｍｕｎ、）、　２７巻、　２２９〜２４２頁（１９８２年）、プロペンチャー とブレラフナ−（Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ）　、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ ｉｎｉｓｔｒｙ）　、　２０巻、３３〜３７頁、（１９８１年）〕を用いる、こ れらの配列が関連したタンパク質の遠紫外円偏光二色性の分析は、Ｍ［Ｐ−１α 、シＤ７８およびＡＣＴ−２が１４−１８％のへリックスと高い割合のβ−ソー ト構造を含むことを確認し、これは、［Ｌ−８（クロ１（Ｃ１ｏｒｅ）ら、ジエ イ、パイオル、ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、）　、　２６４巻、１８９０７ 〜１８９＋１頁（１９８９年）〕およびＰＦ−４（エステイ−。 チャールズ（Ｓｔ、　Ｃｈａｒｌｅｓ）ら、ジエイ、パイオル、ケム（Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、ｃｈｅｍ）、　２６４巻、　２０９２〜２０９９頁、　（１９８９年）〕 の公知の二次構造成分と一致している。 ２５０〜３２０ｎｍの波長範囲において、円偏光二色性スペクトルは、ジスルフ ィド結合およびチロシン、トリプトファンおよびより少ない範囲のフェニルアラ ニンのような芳香族グループから生しる〔ストリンクランド（Ｓｔｒｉｃｋｌａ ｎｄ）　、シー、アールンー、クリット、レブ、バイオケム、（Ｃ，Ｒ，Ｃ，Ｃ ｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　２巻、１１３〜１７５頁、（１９７４ 年）〕。近紫外における円偏光二色性のバンドは、しばしば（常にてはないが） 、それらの発色団の吸収バンドと一致する。円偏光二色性のバンドの強度、信号 （正／負）および波長位置は、寄与している側鎖の構造的環境に対し高度に感受 性か高い。近紫外円偏光二色性スペクトルへの寄与の解釈に対する決定的な法則 の傾向は存在しないか、にもかかわらず強度および肩の位置、形および最高点も しくは最低屯は側鎖型を同定するために用いられ得る。例えば、特徴的なチロシ ンのバンドは、しばしば２７６ｎｍと２６８ｎｍに最低中心を持って観察され、 単独のトリプトファンタンパク質においてＣ１０’Ｌ、ハンドは２８８〜２９３ ｎｍに特徴的に観察される。フェニルアラニンは、２５０−２７０ｎｍにおける 円偏光二色性スペクトルにおいて、しばしば肩のようにみえる、微細な構造を生 じる。 ジスルフィド結合は、種々の強度の２５０から３６０ｎｍにまてにおよぶ非常に 広い特徴のない寄与を育する。 ＭＩＰ−１αのＴｙｒ３を除き、ＬＤ７８およびＭＩＰ−１αの配列中チロシン と単独トリプトファン残基は、維持される。ＬＤ７８およびＭＩＰ−１αの近紫 外円偏光二色性スペクトルは、はとんど重ね得る（図３）。２６８０ｍおよび２ ７６ｎｍに最低点中心を持つ２９０ｎｍ以下の強度負の楕円率は、チロシンの特 徴である。２５０から２９０ｎｍ間のスペクトル強度は、チロシン残基と別の芳 香族基の間のカップリングを反映しているであろう。２９０ｎｍ以上で観察され る負の楕円率の広いくぼみは、より高い波長への広い跡を持つ２９６ｎｍにおけ る最低点を示すよう表われる。この形は、トリプトファンハントに対して多少異 常であり、ゆえにそれはジスルフィド結合の寄与を反映しているであろう。デー タは、Ｍ［Ｐ−１αのＴｒｙ３は、スペクトルに寄与していないことを示してい る。 ＩＬ−８とＰＦ−４のＮ末端領域か乱されその上、１ｉｌｌＰ−１αの中のＴｒ ｙ３の円偏光二色性か欠除していると知られている前提は、思いかけないもので はない。 近紫外円偏光二色性スペクトルは、ＬＤ７８およびＭＩＰ−１α中の芳香族アミ ノ酸の環境かほとんど同一であることを示す。これらのデータは、２つの相同体 は、同様の４次構造及び形態を有していることを示している。 ＡＣＴ−２とＭＩＰ−１αの近紫外円偏光二色性の比較は、スペクトルの形およ び強度に明確な差を強調している（図４）。ＡＣＴ−２スペクトルは（保持され た）単独トリプトファン残基−５８からの明確な０−０’Ｌ、ｌ−リブトファン 寄与を併有した低強度の負のチロシン寄与を示す。近紫外円偏光二色性に寄与し そうなタンパク質問の唯一の配列の相違は、ＡＣＴ−２のＴｒｙ２９　（Ｍ［Ｐ −１αのＰｈｅ２８）である。ＡＣｉ２円偏光二色性に対して観察される形と強 度の性質の変化は、チロシンバンドの単なる付加もしくは欠失とは一致しない。 ゆえに、このデータは、Ｍ［Ｐ−１αとしＤ７８のそれと比較し、ＡＣＴ−２の 構造においては、明確な相違があることを示す。これらすべてのタンパク質は、 比較例３に詳述するように同様な多量体化の性質を有する。ゆえにＡＣＴ−２に ついての構造の変異は、異なる４次構造の結果ではない。 各５μｇのＭＩＰ−１α、　ＬＤ７Ｂ、　ＡＣＴ−２およびヒト上皮成長因子（ 標準マーカーとして）か５μｌの試料緩衝液（２５ｍｋｌ　）リスｐＨ６，８， ２，３％トデノル硫酸ナトリウム、５％β−メルカプＩ・エタノール、　１０％ グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）に溶解され、タンパク質を 還元させ変性させるため９０°Ｃて５分間加熱された。溝あたりおよそ１８ｇの タンパク質が、２つの同一な８−２５％（アクリルアミド）ＳＯ３−ＰＡＧＥフ ァーストゲルに負荷された。前染色された低分子量マーカー〔ベセスダ　リサー チ　ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）　）もまたそれぞれのゲル上で移動させた。ゲルは、製造会社推奨の条 件を用い、電気泳動された。電気泳動ののち、１つのゲルは、０．０２％ファー ストゲル　ブルーアール（ＰＨＡＳＴＧＥＬ　ＢＬＵＥ　ＲＴＭ）、３０％メタ ノール、１０９６酢酸で染色され、その後３０％メタノール、１０％酢酸中で脱 色された。２番目のゲルは、ニトロセルロース股間にはさまれ、１００ポルトで ４０分間、２５ｍ）Ｊ　トリス。 Ｌ９２ｍＭグリシン、２０％メタノール転移緩衝液を用いてエレクトロプロット された（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｄ）。ニトロセルロース膜上−１のタンパ ク質の転移の後、膜は、０．５％カゼイン、１５４−塩化ナトリウム、　？、Ｏ ｍｋｌトリスｐＨ７，４，０，０Ｓ％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）阻止緩衝液中に て室温で１時間インキュベートされる。その後、膜は、第１抗体（調製８のタン パク質を用いた免疫後の標準の免疫学的技術により生産されたポリクローナルウ ザキ抗Ｍ［Ｐ−１α）の！対５０００　（体積比）希釈液を用い、阻止緩衝液中 室温で１時間インキュベートされた。阻止緩衝液で５分間で３回洗浄の後、第２ 抗体〔抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート（シグマ）〕は膜とともに１対 １０（１００（体積比）で阻止緩衝液中室温でさらに１時間インキュベートされ た〔シグマ　ケミカル　カンパニー　リミテッド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ’Ｌｔｄ）、フラッジー　ロード（Ｆｒａｎｃｙ　Ｒｏａｄ ）　、プール（Ｐｏｏｌｅ）、ドルセント（Ｄｏｒｓｅｔ　）　８１（１７７Ｂ Ｒ）　、　５分間３回の１５０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水、　ｐＨ７，４（Ｐ ＢＳ）中での洗浄の後、プロットは２５ｍ１の展開溶液（０，０４％３．３′　 −ジアミノベンズアジン４塩酸塩、　ＰＢＳ、　０．０１５％コバルト塩化物、 　０．０１５％アンモニウム　ニッケル　スルフェート、　０．２％過酸化水素 ）中て展開された。展開は、蒸留水を用いた膜の洗浄により停止された。その後 １．膜は乾燥され、撮影された。 免疫プロット〔図５二８〜２５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（還元している）〕は、抗 Ｍ［Ｐ−１αのＡＣＴ−２との交差反応はないが、ＣＤ７８とは強い交差反応が あることを示す。ＭＩＰ−１αとＣＤ７８は同様な抗原決定基と免疫学的プロフ ィールを有するが、ＡＣＴ−２は免疫学的に異なっている。比較例１の構造的デ ータとともに、この証拠は、ＣＤ７８か、マウス！１１１Ｐ−１αのヒト相同体 であることを強く示喫する。 しＤ７８とＶＩＰ−１ａは、それぞれ？７１２Ｄａおよび７８６６Ｄａの理論分 子量をもち糖化されていない。ＡＣＴ−２は、７７０４Ｄａの理論分子量を有す か、しかし、真正な分子は糖化されていると考えられている。サイズｌＪｊ除ク ロマトグラフィー（５ＥＣ）は、ファーストプロティン　リキッド　りロマトグ ラフィー　システム（Ｆａｓ　ｔＰｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈｙ　ｓｙｓｔｅｍ　）　（ファルマシア）に装着されたスーパロ ース１２　（ＳＵＰＥＲＯ３ＥＴＭ）カラムを用いて行なわれた。そのカラムは 、ｌ　ｍｌ／ｍｉｎにおいて１５０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水、　ｐＨ７，４ （シグマ）中、標準としてブルー　デキストラン、アルドラーゼ、ウシ血清アル ブミン、炭酸デヒドラターゼおよびリソソームを用いて検査された。ＭＩＰ−１ α、　ＣＤ７８およびＡＣＴ−２の試料（５０−１００μｇ　）は、０．２ｍｌ の１５０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水、　ｐＨ７，４（シグマ）に溶解させ、Ｉ 　ｍｌ／ｍｉｎの検査された速度で稼働中のカラム上に負荷された。溶出画分は 、２８０１ｍにおける紫外吸収によって検出された。 凍結乾燥された組換えＣＤ７８．　ＭＩＰ−１αおよびＡＣＴ−２のそれぞれの 再構築は、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析された際、主に可溶性多量 体複合体である生成物を産する（図６）。 可溶性多量体は、見掛上、３５０．０ＯＯＤａの領域中で主な重さを持つ１００ ．０００Ｄａから＞　＞　２００．０００Ｄａまでのサイズの範囲である。 カラムは＋８０．０００Ｄａ以上の粒子を排除する。ゆえに、この限界以上の質 量の正確な決定は不可能である。数時間を越すと多量体複合体は、目に見えて沈 殿する不溶性の凝集物を形成しつる。 低分子１種の集団は、３つすべてのタンパク質のＳＥＣプロフィールに観察され る。２０．０００Ｄａ以上の溶出物、また、Ｓ［１Ａ−ＰＡＧＥの結果（比較例 ２に記載された）は安定な４量体を示すという前提を考虜して、これらのタンパ ク質はその配列相同体ＰＦ−４と同様、安定な４量体に会合することが示唆され た。比較例４および５に詳しく記載された結果は、これらの分子の基礎的な４次 構造単位は４量体であることを確かめた。 ＣＤ７８．＾ｔＩＰ−１αおよびＡＣＴ−２の試料はまた、ネイティブポリアク リルアミド　ゲル電気泳動を用いて分析された。５μｇの各タンパク質は、２５ ｍλ（トリスｐＨ６，８，１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノール　 ブルー中で再構築された。試料は、高分子量マーカー〔フローゲン（Ｆｌｏｗｇ ｅｎ））およびヒトＥＧＦ標準とともに負荷され、０．０８２５Ｍ　トリス、０ ．０８０８Ｍホウ酸、０．００３Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，３中、１５分間ｉｏ ｏボルトで５−５０％　グラディポール　ハイリンクス（ＧＲＡＤＩＰＯＲＥ　 ＨＹＬ［ＮＸ”）ネイティブ　ゲル（ｎａｔｉｖｅｇｅｌ）上にて電気泳動され た。ゲルはその後クーマシーブルー染色され、脱色された（比較例２に記載した ように）。 染色されたゲル（図７）は、ヒトＥＧＦ（６，２００ダルトン）標準か天然の条 件下で正しい質量で移動していることを示す。しかし、ＭＩＰ−１α、ＣＤ７８ およびＡＣＴ２は、分子１種の範囲を示す広い不鮮明になっているバンドを有し 、すべてゲルの先端に移動している。低分子量種は観察されなかった。 上記の２つの技術は、溶液中でのＬｌ）７８およびＭ（Ｐ−１αの分子の大きさ のいくつかの量的な見積もりを提供する。しかし、両方の場合において、分子の 平衡集団に影響しつる固体の支持樹脂が存在する（アクリルアミドもしくはセフ ァデックス（５ＥＰＨＡＤＥＸ”））。溶液中の絶対分子量決定の認知された方 法は、分析的超遠心分離における沈降平衡によるものである〔例えば、ヤンティ ス（Ｙｐｈａｎｔｉｓ）（１９６４）もしくはバーディング（Ｈａｒｄｉｎｇ） （１９９２年）参照〕。 タンパク質の溶質の分布は、ベックマン　オブテイマ　ＸＬ−Ａ（ＢＥＣＫ＋１ １ＡＮ　ＯＰＴＩＭＡ”　ＸＬ−Ａ）分析超遠心を用いて、沈降平衡実験の際の 紫外吸収により記録されつる〔例えばモルガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら（１９９２年 ）参照〕。ローターセル中の平衡における分布されたタンパク質分子の集団にお いて、溶液中の最小（タンパク質）質量に対するおおよその値は、セル　メニス カス（Ｍ、（ζ＝Ｏ））から得られ、溶液中の最大（タンパク質）質量はセル基 部（Ｍ、（ζ＝１））から決定される。この技術は、全セルの質量平均分子量（ Ｍ”、）（すなわち、ローターセル中に分布された質量の平均分子量〕を提供す る。この方法において、タンパク質分子の自己会合の性質（もし存在すれば）は 、観察される質量範囲において測定される多分散性から正確に決定されつる。特 徴的に、そのような多分散溶液は、フリース（Ｃｒｅｅｔｈ）とバーディング（ Ｈａｒｄｉｎｇ）　（ジエイ、バイオケム、バイオフィズ、メソッズ（Ｊ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）７巻２５−３４頁（１９ ８２年）〕とクリースとパイン（Ｐａｉｎ）　（ブロック。パイオフィス　＆　 モル、パイオル、（Ｐｒｏｇ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　＆　Ｍｏ１．　Ｂｉ。 １、）１７巻、２１７−２８７頁（１９６７年）〕により詳述された型の分析に おいて、常態化された根本的な置換指漂（ζ）の関数として吸収の対数がプロッ トされたとき、上向きの曲率を示す。溶液中の単一で限定された質量で存在する タンパク質〔すなわち、単一分散（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）集団〕は、Ｌｎ Ａ対この直線プロットを示す。非理想溶液条件は、典型的には、ＬｎＡ対この下 向きの曲率を生じる。多分散性および理想性の効果にとって互いに相殺し、Ｌｎ Ａ対この直線プロットを与えることは可能である〔フリースとベイン、ロック、 ジット、（ｌｏｃ、　ｃｉｔ、）　（１９６７年））。これはデータの解釈の際 に考慮されるべきである。 純粋な野性型ＬＤ７８の沈降平衡の性質は、タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌを 用い、２０°Ｃて９０００．１００００もしくは１２００Ｏｒ、　Ｐ、　ｍでオ ブティ７　ＸＬ−Ａ（ＯＰＴＩＭＡ”χＬ−Ａ）超遠心機を用いて測定し、２７ ８ｎｍにて検出された。単量体の範囲における質量に対して、２０″Ｃにてロー ター速度２８００Ｏｒ、　ｐ、　ｍか必要である。方法論および分析は、モルガ ンら（１９９２年）によって記載された通りである。その結果（図８）は、野性 型ＬＤ７８は溶液中において、およそ１０．０００Ｄａ（Ｍ、（ζ＝０９から２ ５０．０００Ｄａ　（Ｌ（ζ＝ｌ＋：わたる質量のタンパク質量の多分散系集団 として存在することを示した。全セルの質量平均分子量（Ｍ″′ｗ）は１６０． ０００Ｄａであることが見いだされた。 純粋なにｌ［Ｐ−１αは、ローター速度か１５．００Ｏｒ、１１ｍであることを 除き同様の方法にて分析される。この場合において、タンパク質は、Ｍ’、＝３ １０．０ＯＯＤａて２３０．００００ａ（Ｍ、（ζ＝０）から３５０、　ＯＯＯ Ｄａ（Ｍ、（ζ＝１）にわたる集団のタンパク質量の多分散系溶液として存在す ることが示された。 上記の独立した技術からの結果は、低イオン強度の水性緩衝液中ての再構築にお いてＭ［Ｐ−１α、　ＬＤ７８およびＡＣＴ−２が、大きな、可溶性の、異種起 源の、多量体複合体を形成することを確認した。 ０．５に１塩化ナトリウムは、ＭＩＰ−１αの高分子量型の形成を阻止し、培養 培地において、およそ５％の総タンパク質は低分子量型であることが知られてい る〔オー（Ｏｈ）ら（１９９１年）〕。我々の研究は、塩の欠除においては（す なわちネイティブＰＡＧＥ試料緩衝液）、低分子量型は存在しないことを示す。 生理的イオン強度において（１５０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ７，４） 、サイズ排除プロフィールにおいて見られるとおり、低分子量タンノくり種の明 確な集団が存在している。ゆえに、高および低分子量種間に平衡か存在する。こ の平衡は、緩衝液のイオン強度によって影響される一比較例４参照。 ０．５Ｍの塩濃度か、ＭＩＰ−１αの高分子量型の形成を阻止すると主張されて いｔ二〔つｆ）レペ（Ｗｏｌｐｅ）とセラミ（ＣｅｒａｍｉＸ１９８９年）〕。 塩の影響を完全に特徴づけし、また、ＳＣ［多量体の会合経路を説明するために 、ＬＤ７８およびＭＩＰ−１αの分子量は高イオン強度の条件でアッセイされた 。 サイズ排除クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア）に装着さ れたスーパ−ロース１２ＴＭカラムを用いて行われた。カラムは、比較例３に記 載された標準を用いて、１０ｍＭ　ＭＥＳ（ジグ７）　、５００ｍＭ塩化ナトリ ウム、ｐＨ６，５中、１ｍｌ／ｍｉｎで検査された。Ｍ［Ｐ−１ａおよびＬＤ７ ８の試料（１，００μｇ）は、０．２ｍｌの１０ｍＭ　ＭＥＳ（ジグ７）　、５ ００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６，５中に溶解され、検査された１ｍｌ／ｍｉｎの 速度で動作中のカラムに負荷された。 溶出画分は、２８０ｎｍにおいて、紫外吸収によって検出された。 組換えＭＩＰ−１αのこれらの条件下での再構築は、５ＫＤａ付近へテーリング しているおおまかな質量２５ＫＤａの左右相称的なピークを含むＳＥＣ溶出プロ フィールを与える。そのピークの形は、これらの条件下では、タンパク質は、た くさんの質量種において存在していることを示す。その溶出プロフィールは１、 おそらく溶液中ての４量体、２量体および単量体集団の存在を反映している。 ＬＤ７８の分析的超遠心分離は、比較例３に記載されたようなこれらの緩衝液条 件にて行われた。全セルの質量平均分子量は、分子の質量２９±２ＫＤａを有す る単一の集団と計算された。１０ｍＭ　ＭＥＳ、５００ｎ＋Ｍ塩化ナトリウムｐ Ｈ６，４のこれらの条件下、ＬＤ７８は、溶液中で、高および低分子量型の欠除 において明確にされた４量体として存在する（図８）。 これらのデータは、イオン相互作用は、ＬＤ７８の４量体が太きく、不均一な多 量体を形成する会合（こおける鍵となる役割を演（酵母中の合成遺伝子から発現 された）の分子量の特徴づけ比較例３において記載されたネイティブＰＡＧＥ免 疫プロット上で得られた分子質量プロフィールと質量決定の他の方法から生じた データを相関させるため、ネイティブＰＡＧＥ緩衝液中でＳＥＣが行われた。ス ーパーデノ７　ス（ＳｔｌＰＥＲＤＥＸ７５ＴＭ）ＦＰＬＣｍ脂Ｉｔ、バイオラ ド〔ミニブロテ了ン（！、ＩＩＮＩＰＲＯＴＥＡＮ”）１２％アクリルアミド〕 プレーカスト（ｐｒｅ−ｃａｓｔ）ゲルに匹敵する質量分析範囲（３−７０ＫＤ ａ）を存する。ゆえに、このサイズ排除カラムは、できるだけ近くゲル条件を再 現するために用いられた。１００μｇのＬＤ７８は、０．２ｍｌの５０ｍＭ　ト リス、１ＭグリシンｐＨ８，３緩衝液中で再構築され、同様の緩衝液中で平衡化 されたスーパーデックスフ５（商標）上に流速１ｍｌ／ｍｉｎで注入された。溶 出画分は、２８０ｎｍにおいて紫外吸収によって検出された。 ［、Ｄ７ＢのＳＥＣ溶出プロフィールは、おそらく小さな二量体ピークである部 分的にカラムから排除された高分子量（＞　７０ＫＤａ）の主要な左右非相称的 なピークを示した。＋５ＫＤａおよび主要な左右相称的ピークは、単量体質量８ ．０００Ｄａ付近に対応する。高分子量多量体との平衡における単量体ＬＤ７８ の大きな集団の存在は、ＬＤ７８の４次構造か、 （ｉ）この緩衝液系と比較例３との間のｐＨにおけるＯ１９単位の変化 （ｉｉ）遊離アミノ酸グリシンの”有意な濃度の存在のいずれに対しても極端に 感受性が高いことを示す。 これらの緩衝液条件下におけるタンパク質濃度０．５ｍｍ／ｍｌでのＬＤ７８の 沈降平衡の研究（比較例３に記載された方法）は、８．００００ａ　（Ｌ（ζ＝ ０）〕から＞　３００，０００Ｄａ　（（Ｍ、（ζ＝１）〕にわたる質量種の多 分散性集団の存在を示す。 調製１３に記載されるとおり、エレクトロスプレー質量分光は精製されたＬＤ７ Ｂに結合した一価および二価金属イオンの存在を示す。多くの化学的方法は、反 応液中の側鎖グループの修飾を可能とする遊離アミノおよびカルボキシル基に対 する金属イオンのキレートの使用を含む〔ケミストリー　オブ　アミノアンンズ （Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ）、１巻−６章、クリー ガー　パブリッシング　フロリダ（Ｋｒｉｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｆ ｌｏｒｉｄａ）、グリーンスティン（Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ）とウイニッツ（Ｗ ｉｎｉｔｚ）纏（１９６１年）〕。ゆえに、この緩衝液中に存在するグリシンは 、金属イオンに対するキレータ−として作用する。二量体Ｌ０７Ｂのわずかな集 団のみがＳＥＣプロフィール中にて明白であり、４章体種は観察されなかった。 ゆえに、金属イオンは、ＬＤ７８　４章体および２章体単位両方の安定化におい て役割を演じうることが示唆される。 比較例６　−　１０ｍＭ酢酸ｐＨ３，２におけるＬＤ７８　（酵母生合成遺伝子 から発現された）の分子量の特徴づけ幹細胞阻害剤タンパク質ＬＤ７８は、温和 な酸性条件において非常に溶けやすい。サイズ排除クロマトグラフィーは、酸性 条件下では理想的でない。ゆえに、ＬＤ７８の分析的超遠心分離が行われた。１ ０ｍＭ酢酸ｐＨ３，２中、タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌにおいて、３３±３ ＫＤａの単−分散質量種が観測された（図８）。この質量は、４章体の単一分散 集団に匹敵する。 比較的低いイオン強度の酸性条件は、比較例４中に記載された４章体の多量体へ の会合に含まれる静電的相互作用において含まれるＧｌｕおよび／もしくはＡｓ ｐ基を滴定しつる。 比較例７−　酵母中の合成遺伝子から発現されたＬＤ７８タンパク質の多量体化 の状態に対する分光学的アッセイＬ１１１７８は、１０ｍＭ酊酸ｐＨ３，２中お よびｌｏｍＭ　ＭＥＳ、５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６，４中、溶液中では４ 章体として存在する（比較例４と６）。１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４のよう な溶液中、タンパク質は荷電した側鎖間の静電的相互作用により安定化された可 溶性多量体複合体の不均一な集団として存在する（比較例３）。 １０ｍ！Ｊ酢酸ｐＨ３，２およびｌ０ｍＭ　ＭＥＳ、５００ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ６，４中てのＬＤ７８　（比較例１に記載したとおり測定された）の近紫外 円偏光二色性スペクトルは同一である（図９）。このデータは、４章体ＬＤ７８ を生成するために用いられた緩衝液条件は、タンパク質の４次構造に影響を及ぼ さないことを示す。 １５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐｔ（７，４における４章体ＬＤ７８の近紫外円偏光二色 性スペクトルと高分子多量体のそれとの比較（図１０）は、Ｔｒｐ５７の左右非 相称的環境が、２つの状態においては異なることを示す。（円偏光二色性スペク トルの解釈の議論のために比較例１を参照）　。ｌ０ｍＭ酢酸、　ｌ０ｍＭ　Ｍ ＥＳ、　５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６，４および１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ ７，４におけるＬＤ７８の定常状部蛍光放射スペクトルのアッセイ（比較例１に 記載した方法）は、高分子量多量体において、放射強度の消去を生じることを示 す。λ３１．が変化しないという事実は、消光を生ぜしめる構造的変化は起こっ ていないことを示す。トリプトファン残基に近位の静電的相互作用は、蛍光エネ ルギーの放射を消光するであろうことが知られている〔ラコビックツ（１９８３ ））。酸性および塩基性アミノ酸間の安定化相互作用は、４章体が多量体複合体 を形成する会合に対する鍵であることが知られている（比較例４）。Ｔｒｐ−５ ７に対して観察された環境における変化は、空間的に側鎖に密接したイオン相互 作用の形成と完全に一致している。 近紫外円偏光二色性および／もしくは蛍光放射分光は、ＬＤ７８の多量体状聾に 対する感受性の良いアッセイを提供しつる。 実施例 オリゴヌクレオチド　ダイレフテッド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｒ ｅｃｔｅｄ）突然変異および分子クローニングによるＬＤ７８変異体（たとえば Ｇ１ｎ４８＞　Ｇｌｕ）の構築のための戦略は、以下に記載される。突然変異は 、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）らのメソッズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１５４巻３６７−３８２頁の方法に従っ て行われた。宿主菌株および方法は以下に記載された。 イー、コリ菌株 ＲＺ１０３２は、ＤＮＡ代謝の２つの酵素、即ち（ａ）ｄＵＴＰａｓｅ（ｄａｔ ）（その欠損は高濃度の細胞内ｄＵＴＰを生じる）　、（ｂ）ウラシルＮ−グリ コシラーゼ（ｕｎｇ）　（ＤＮＡからの誤うて取り込まれたウラシルの除去に関 与する）を欠くイー、コリ誘導体である〔クンケルら、ロッ先　シフト。（ｌｏ ｃ、　ｃｉｔ、））。適切で選びつる菌株は、パイオーラド　ラボラトリ−、ワ ットフォード（ＷａｔｆｏｒｄＷＤＩ　８ＲＰ）、イギリスから入手可能なＣＪ ２３６である。第１の利益（よ、これらの変異体は特定部位の突然変異において 高頻度の変異体を導くことである。ＲＺ１０３２は、次のような遺伝子型を有す る。 ＨｆｒＫＬ１６ＰＯ／４５　［ＬｙｓＡ９６１−６２）、　ｔｉｕ、ｔＬ、　ｕ ｎｇＬ、　ｔｈｉＬ、　ｒｅｃＡ、　Ｚｂｄ−２７９：　：ＴｎｌＯ，ｓａｐＥ ４４ ＪＭ１０３は、Ｍ１３に基づくベクターを含む操作に対する標準の宿主菌株であ る。ＪＭ１０３の遺伝子型は、Δ　（Ｌαｃ−ｐｒｏ）、　ｔｈｉ、　ｓｕｐε 、　５ｔｒＡ、　ｅｎｄ　Ａ、　５ｂｃＢ１５．　ｈｓｐＲ４，Ｆ’　ｔｒａＤ ３６゜ｐｒｏＡＢ　、　ＬａｃＩｑ、　ＬａｃＺΔＭ１５である。適切な商業的 に入手可能な選びうるイー、コリ菌株は、ノースアンプリア　ノくイオロジカル （Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）から入手可能なＪＭ１０ ９である。 突然変異 突然変異に先んじて、ＬＤ７８遺伝子を適切なベクターに移すことが必要であっ た。 調製２のｐＳＷ６　ＬＤ７８プラスミドＤＮＡが調製され、アリコートは制限酵 素Ｈｉｎｄｌ［［およびＢａｍＨＩ処理された。この消化からの約２３５ｂｐ　 ＤＮＡフラグメントは精製され、ＨｉｎｄＩＩ［およびＢａｍＨ［処理されたイ ー、コリ　バクテリオファージＭ１３　ｍｐ１９　ＤＮＡに連結された。６つの 推定上の組換えプラークからの単Ｉ　ＤＮＡが調製され、コニバーサル　プライ マー〇Ｂ２２　（５’　−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’　（ＳＥ Ｑ　［Ｄ　Ｎｏ　４７））を用いてデオキシ法によって配列決定された。イー、 コリＲＺ１０３２からＭ　１３ｍｐ１９−　ＬＤ７８の単鎖ＤＮＡがｉ＄１ｇさ れ、２２−ｍａｒのオリゴヌクレオチドＢＢ６２９８（５−ＧＣＡＣＡＧＡＣＴ ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴ−３’　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　４８））を用いる クンケルらにより記されたオリゴヌクレオチド　ダイレフテッド突然変異に対す る鋳型として用いられた。要求された変異体（ｐＧＨｃ６００）は、推定上の変 異体プラークから調製された単鎖ＤＮＡのジデオキシ配列分析によって同定され た。プライマーＢＢ２２　（上記参照）は、すべての場合に配列決定プライマー として用いられた。２本鎖復製型（ＲＦ）ＤＮＡは、要求された変異体を保持し ているバクテリオファージから調製された。その後、ＲＦＤＮＡは、）Ｉｉｎｄ ｎ［およびＢａｍＨで消化された。その後、ＬＤ７８Ｇｌｎ４８＞　Ｇｌｕ遺伝 子を保持しているＤＮＡフラグメントは、常法による低ゲル化温度のアガロース ゲル上での電気泳動的分離の後に精製された。このフラグメントは、ＬＤ７８　 Ｇ１ｎ４８＞　Ｇｌｕ遺伝子に対する発現ベクターを作製するため、ＨｉｎｄＩ ［［およびＢａｍ旧処理されたｐＳＷ６　ＤＮＡに連結された。正しいクローン （ｐｓＪＥ５０）の配列は、プラスミドＤＮＡ配列決定によって確かめられた。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 実施例２　−　ＬＤ７８変異体しｙｓ４４＞　Ｇｌｕ　Ａｒｇ４５＞　Ｇｌｕ（ 変異体２）の設計と構築およびＬＤ７８　ＬＹＳ４４＞　Ｇｌｕ　Ａｒｇ４５＞ 　Ｇｌｕ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　Ｌｙｓ４４＞　Ｇｌｕ　Ａｒｇ４５＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載さ れたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。 ３０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド　ＢＢ６２９９　（５°−ＧＡＣＴＴＧＴＣ ＴＣＧＡＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴ−３°（ＳＥＱ　ｔＤ　Ｎｏ　 ４９）は、ＬＤ７Ｂ遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（９Ｇ ＨＣ６０１）が同定された。変異遺伝子は、ｐｓＪＥ５１を作製するために発現 ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に 記載された方法に従って行われた。 実施例３−　ＬＤ７８変異体Ａｌａ９＞　５ｅｒ（変異体３）の設計と構築およ びしＤ７８　Ａｌａ９　＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｌａ９＞　 Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター 中でクローン化された。２２−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドＢＢ６３ＱＯ（５’ 　−ＡＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ０５０））は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ ｐＧＨｃ６０２）か同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ５２を作製するために 発現ベクター中でクローン化された。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法におよびしＤ７８ 　Ｐｈｅ２８＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｐｈｅ２８＞　Ｓｅｒは 、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクロ ーン化された。２５−１１１！ｒのオリゴヌクレオチドＢＢ６３８１　（５’　 −ＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＡＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡ−３°（ ＳＥＱ　１０　Ｎ０５１））は、Ｌ［）７８遺伝子を変異させるために用いられ 、正しいクローン（ｐＧＨｃ６０３）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ５ ３を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパ ク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例５−　ＬＤ７８変異体Ａｒｇ１７＞　５ｅｔ（変異体５）の設計と構築お よびし０７８　Ａｒｇ１７＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｒｇ１７ ＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベク ター中でクローン化された。２５−ｍａｒのオリゴヌクレオチドＢＢ６３０２　 （５’　−ＧＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＴＡＡＧＡ−３’　（Ｓ ＥＱ　［Ｄ　Ｎ０５２）］は、シ０７８遺伝子を変異させるために用いられ、正 しいクローン（ｐＧＨｃ６０４）が同定された。 変異遺伝子は、ｐＳＪＥ５４を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７Ｂタンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行わ れた。 実施例６−　ＬＤ７８変異体Ｐｈｅ２３＞　Ａｓｎ　［１ｅ２４＞　Ｔｈｒ（変 異体６）の設計と構築およびＬＤ７８　Ｐｈｅ２３＞　Ａｓｎ　１ｌｅ２４ンＴ ｈｒ発現ヘクターの１築 ＬＤ７８　Ｐｈｅ２３＞　Ａｓｎ　ｌ１ｅ２４＞丁ｈｒは、実施例１に記載され たように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２７− ｍａｒのオリゴヌクレオチドＢＢ６３０３　（５’　−ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＧ ＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴ−３’　（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ０５３））は、 ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６０５ ）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ５５を作製するために発現べフター中 でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、ｙ４製３に記載され た方法に従って行われた。 実施例７−　ＬＤ７８変異体Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ　（変異体１０）の設計と構 築およびＬＤ７８　Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｓｐ ２６＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現 ベクター中でクローン化された。２５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドＢＢ６６２ ５　（５−ＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧ（Ｇ／Ａ＋ＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡτＴ−３ °（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０５４））は、Ｌ［１７８遺伝子を変異させるために用い られ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６０９）が同定された。 変異遺伝子は、ｐＳＪＥ５９を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法 に従って行われた。 ＬＤ７８　Ｐｈｅ１２　＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され 、ｐＳＷ６　酵母発現ベクター中でクローン化された。２４−ｍｅｒオリゴヌク レオチド　８８６３０１　（５’−ＡＧＧＴＧＴＡＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＣＡＡ ＧＣＧＧ−３’　ＳＥＱ　ＩＤＮ０５５）は、Ｌ　Ｄ　７８遺伝子を変異させる ために用いられ、正しいクローン（、ｐＧ）ｌｃ６１０）が同定された。 変異遺伝子は、ｐｓＪＥ６０を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に 従って行われた。 実施例９−　ＬＤ７８変異体１１ｅ２４＞　Ｔｈｒ（変異体１３）の設計と構築 およびＬＤ７８１１ｅ２４＞　Ｔｈｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８１１ｅ２４＞ 　Ｔｈｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６　酵母発現ベク ター中でクローン化された。２４−ｍａｒオリゴヌクレオチド　ＢＢ６３８２　 （５’−ＡＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＴＧＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＧ− ３″ＳＥＱ　１０　’ＮＯ５６）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いら れ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６１２）が同定された。 変異遺伝子は、ｐＳＪＥ６２を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行わ れた。 実施例１０−　ＬＤ７８変異体１１ｅ４０＞　Ａｒｇ（変異体１４）の設Ｍ１と 構築およびＬＤ７８１１ｅ４０＞　Ａｒｇ発現ベクターの構築ＬＤ７８　［１ｅ ４０　＞　Ａｒｇは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓｗｅ　酵母 発現ベクター中でクローン化された。２４−ｍａｒオリゴヌクレオチド　ＢＢ６ ３８３（５°−ＴＡＧＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴ−３°ＳＥ Ｑ［Ｄ　Ｎｏ　５７）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しい クローン（ｐＧＨｃ６１３）か同定された。 変異遺伝子は、ｐＳＪＥ６３を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行わ れた。 実施例１１−　ＬＤ７８変異体Ａｒｇ４７＞　Ｇｌｕ（変異体１５）の設計と構 築およびＬＤ７８　Ａｒｇ４７ンＧｌｕ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｒｇ４ ７　＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６　酵母発 現ベクター中でクローン化された。３５−ｍａｒオリゴヌクレオチド　ＢＢ６３ ８４　（５’−ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＧＡＧＣＧＣＴＴＡＧＴ−３° ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５８）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正 しいクローン（、ｐＧＨｃ６１４）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ６４ を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク 質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例＋２−　ＬＤ７８変異体Ｌｙｓ６０＞　Ｇｉｎ　Ａｓｐ６４＞　Ａｓｎ　 （変異体４）の設計と構築およびしＤ７８　Ｌ、ｙｓ６０＞　Ｇｌｎ　Ａｓｐ６ ４＞　Ａｓｎ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　Ｌｙｓ６０　＞　Ｇｌｎ　Ａｓｐ６４＞　Ａｓｎは、実施例１に記載 されたように、構築され、ｐＳＷ６　酵母発現ベクター中でクローン化された。 ３５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドＢＢ６３８５　（５°−ＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴ ＴＡＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＡＣＣＣＡＴＴＣ−３°ＳＥＱ　［ＯＮＯ ５９）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧ Ｈｃ６１）か同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ６５を作製するために発現ベ クター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記 載された方法に従って行われた。 しＤ７８　Ｐｈｅ２８　＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され 、ｐｓｗｅ　酵母発現ベクター中でクローン化された。２５−ｍｅｒオリゴヌク レオチド　ＢＢ６３４５　（５’−ＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＴＣＧＴＡＧＴＣ ＡＧＣＡＡ−３’　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　６０）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させ るために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６１６）が同定された。変異遺伝 子は、ｐｓＪＥ６６を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異 体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 ＬＤ７８１１ｅ２４　＞　Ａｓｎは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６　酵母発現ベクター中でクローン化された。２５−ｍａｒオリゴヌクし オチドＢＢ６３８２　（５’−ＡＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡ（Ｇ／Ｃ／Ｔ＞ＴＧＡＡ ＡＴＴＴＴＧＴＧＧ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　５６）は、ＬＤ７８遺伝子を 変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６２３）が同定された。 変異遺伝子は、ｐＳＪＥ７３を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行わ れた。 ＬＤ７８　Ｐｈｅ２８＞　Ｇｌｕ　Ｇ１ｎ４８＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載さ れたように、構築され、ｐｓＷ６　酵母発現ベクター中でクローン化された。２ ７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドＢＢ７０１５　（５°−ＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴ ＴＴＣＴＴＣＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡ−３’　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ６１）は、ＬＤ ７８Ｇｌｎ４８＞　Ｇｌｕ遺伝子（実施例１の１）ＧＨＣ６００）を変異させる ために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６２４）が同定された。変異遺伝子 は、ｐＳＪＥ７４を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体 ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例１６−　ＬＤ７８変異体Ｐｈｅ２８＞　Ｇｌｕ　Ａｒ　４７＞　Ｇｌｕ　 （変異体２６）の設計と構築およびＬＤ７８　Ｐｈｅ２８＞　Ｇｌｕ　Ａｒｇ４ ７＞　Ｇｌｕ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　Ｐｈｅ２８　＞　Ｇｌｕ　Ａｒｇ４７＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載 されたように、構築され、ｐＳＷ６　酵母発現ベクター中でクローン化された。 ２７−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ７０１５　（５−ＴＧＡＧＡＡＧＡＡ ＧＴＴＴＣＴＴＣＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ６１）は、 ＬＤ７８　Ａｒｇ４７＞　Ｇｌｕ遺伝子（実施例１１のｐＧｌ（Ｃ６１４）を変 異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６２５）か同定された。変 異遺伝子は、ｐＳＪＥ７５を作製するために発現ベクター中でクローン化された 。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行２７ ）の設計と構築およびＬＤ７８　Ｇ１ｕ５５＞　Ａｒｇ　Ｇｌｕ５６＞　Ａｒｇ 発現ベクターの構築 ＬＤ７８　ＧＩｕ５５＞　Ａｒｇ　Ｇｌｕ５６＞　Ａｒｇは、実施例１に記載さ れたように、構築され、ｐｓｗｅ　酵母発現ベクター中でクローン化された。２ ７−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９１１２　（５′−ＴＴＧＡＡＣＣＣＡ ＧＣＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＣ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６２）は、Ｌ Ｄ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧ）ｌｃ６２６ ）が同定された。 変異遺伝子は、ｐＳＪＥ７６を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行わ れた。 実施例＋８−　ＬＤ７８変異体Ｇｌｕ２９＞　Ａｒｇ（変異体２８）の設計と構 築およびしＤ７８　Ｇ１ｕ２９＞＾ｒｇ発現ベクターの構築しＤ７８　Ｇｌｕ２ ９＞　Ａｒｇは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベ クター中でクローン化された。２４−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９１０ ９　（５−ＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’　ＳＥＱ 　［Ｄ　ＮＯ６３）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいク ローン（ｐＧＨＣ６２７）が同定された。変異遺伝子は、ｐｓＪＥ５３を作製す るために発現ベクター中でクローン化された。 変異体ＬＤ７Ｂタンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 ＬＤ７８　Ｇ１ｎ１８＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２４−ｍａｒ　オリゴヌクレ オチド　ＢＢ９１１０　（５’　−ＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＧ ＡＧＧＴ３’ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ６４）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために 用いられ、正しいクローン（、ｐＧＨＣ６２８）が同定された。変異遺伝子は、 ｐＳＪＥ７８を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って３０）の設計と構築 およびＬＤ７８　Ａｒｇ１７＞　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ１８＞　Ｇｌｕ発現ベクターの 構築 ＬＤ７８　Ａｒｇ１７＞　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ１８＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載さ れたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。 ３０−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９１１１　（５’　−ＡＴＴＴＴＧＴ ＧＧＡＡＴＴＴＣＡｃＡＡｉ：；ＡｃｃｒｃｒＡＡｃＡ−３゛ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ ｏ　６５）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ ｐＧｌ（Ｃ６２９）か同定された。 変異遺伝子は、ｐｓＪＥ７９を作製するために発現ベクター中てクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行わ れた。 ５ｅｒ−Ａｌａ−ＬＤ７８は、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。３０−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド 　ＢＢ９１０４　（５’　−ＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴ ＴＡＴＣＣＡＡ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　６６）は、シＤ７８遺伝子を変異 させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６３０）が同定された。変異 遺伝子は、ρ５ＪＥ８０を作製するために発現ベクター中てクローン化された。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−３ｅｒｌ＞　Ｐｒｏ　ＬＤ７８（ＬＤ７ＢのＮ末端に Ｌｅｕ、　ＳｅｒおよびＡｌａ残基か付加され、５ｅｒｆがＰｒｏで置換された ）は、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中で クローン化された。３６−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９１０５　（５’ −ＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡ Ａ−３°　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ　６６）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために 用いられ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６３１）が同定された。変異遺伝子は、ｐ ｓＪＥ８１を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７ ８タンパク質の発現は、調！Ｅ！３に記載された方法に従って行われた。 実施例２３−最初の３つのＮ末端アミノ酸が欠失した（Ｎｌ−３１Ｄ７８）ＬＤ ７８変異体（変異体３３）の設計と構築およびＮ１−３　ＬＤ７８発現ベクター の構築 Ｎ１−３　ＬＤ７８は、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓＷ６酵母 発現ベクター中でクローン化された。２４−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ ９＋０６　（５−ＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡ−３’　 ５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　６８）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正 しいクローン（ｐＧＨＣ６３２）か同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪε８２を 作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質 の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例２４−　ＬＤ７８変異体Ａｌａ−Ｓｅｒｆ＞　Ｐｒｏ　ＬＤ７８変異体（ 変異体３４）の設計と構築およびＡｌａ−３ｅｒｆ＞　Ｐｒｏ　ＬＤ７８発現ベ クターの構築 Ａｌａ−３ｅｒｆ＞　Ｐｒｏ　ＬＤ７８（ＬＤ７８のＮ末端にＡｌａ残基が付加 され、Ｓｅｒ　ｌがＰｒｏて置換された）は、実施例１に記載されたように、構 築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。３０−ｍｅｒ　オリ ゴヌクレオチド　８８９１０３　（５−ＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣ ＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６９：ｌは、ＬＤ７８遺伝 子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６３３）が同定され た。変異遺（立子は、ｐＳＪＥ８３を作製するために発現ベクター中でり、ロー ン化された。変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従 って行われた。 実施例２５−　ＬＤ７８変異体Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒｌ＞　Ｐｒｏ　 Ｇ］ｙ３８＞　５ｅｒＳｅｒ４６＞　Ｇｌｙ（変異体３５）の設計と構築および Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−３ｅｒＤ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ３８＞　Ｓｅｒ　５ｅｒ４ ６＞　Ｇｌｙ発現ベクターの構築ＬＤ７８Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒｆ＞ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ３８＞　Ｓｅｒ　５ｅｒ４６＞　Ｇｌｙは、本質的に実施例１ に記載されたように、構築され、ρＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化され た。４８−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９１０８　（５−ＡＣＡＧＡＣＴ ＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＴＧＧＣ ＴＴＧＧＡ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７０）はＬｅｕ−Ｓｅｒ−、Ａ、１ａ− Ｓｅｒｆ＞　ＰｒｏＬＤ７８遺伝子（実施例２２のｐＧｌ（Ｃ６３１）を変異さ せるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６３４）が同定された。変異遺 伝子は、ｐＳＪＥ８４を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変 異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行ｈｒ１５ ＞　Ｐｈｅ　ＬＤ７８変異体（変異体３６）の設計と構築および（Ｎｌ−３）Ｔ ｈｒ１５＞　Ｐｈｅ　ＬＤ７８発現ベクターの構築Ｎト３　Ｔｈｒ１５＞　Ｐｈ ｅ　ＬＤ７８は、本質的に実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵 母発現ベクター中でクローン（ヒされた。２４−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　 ＢＢ９１０７　（５’−ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡ− ３゛ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７１）は、Ｎ１−３　ＬＤ７８遺伝子（実施例２３のｐ ＧＨＣ６３２）を変異させるために用いられ、正しいクローン（１１ＧＨＣ６３ ５）か同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ８５を作製するために発現ベクター 中でクローン化された。変異体ｔ、Ｄ７Ｂタンパク質の発現は、調製３に記載さ れた方法に従って行われた。 ＬＤ７８　Ｇ１ｎ４８＞　Ｓｅｔは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ヘクター・中でクローン化された。２１−ｍｅｒ　オリゴヌク レオチド　ＢＢ９５＋２　（５’〜ＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧ Ｃ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７２）は、Ｌ［］７８遺伝子を変異させるために用 いられ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６７０）か同定された。変異遺伝子は、ｐＲ Ｃ５９／７０を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従つ［、Ｄ７８　Ａｓｐ２ ６＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベ クター中でクローン化された。１８−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４３ ２　（５’−ＣＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡ−３’　ＳεＱＩＤ　ＮＯ ７３）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧ ）ｌｃ６３８）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ８８を作製するために発 現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３ に記載された方法に従って行われた。 ＬＤ７８　Ｐｈｅ１２＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレ オチド　ＢＢ９５ｔ９　［，５’　−ＧＴＧＴＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＣＡＡＧ −３“　５ＥＱＩＤ　ＮＯ７４）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いら れ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６７６）が同定された。変異遺伝子は、Ｉ）０Ｂ ＋２７を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変天体ＬＤ’７８ タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行と構築およびＬＤ７８ 　Ｐｈｅ２８＞　Ａｌａ発現ベクターの構築しＤ７８　Ｐｈｅ２８＞　Ａｌａは 、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓ１’１６酵母発現ヘクター中で クローン化された。１９−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５２７　（５° −ＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＧＴＡＧＴＣＡＧ−３°　５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　７５） は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧ）１ｃ ６８４）か同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢＩ３０を作製するために発現ベク ター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載 された方法に従って行およびＬＤ７８１１ｅ２４＞　Ａｌａ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　［１ｅ２４＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐｓｗ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレ オチド　ＢＢ９４３１　（５’−ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧ −３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　７６）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用 いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６３７）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳ ＪＥ８７を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７１ ３タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従ってしＤ７８１１ｅ４０＞ 　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘクタ ー中でクローン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５３４　 （５’　−ＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＧ−３°５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　 ７７）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用（Ｘられ、正しいクローン（Ｍ １３ＤＢ１０４）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＥ１１４を作製するために 発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製 ３に記載された方法（こ従ってＬＤ７８　Ａｒｇ４７＞　Ｓｅｒは、実施例１に 記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された 。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４３７　（５−ＣＡＣＡＧＡＣＴ ＴＧＡＧＡＣＧＡＧＣＧＣＴ−３°ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ７８）は、ＬＤ７８遺伝 子を変異させるために用し１られ、正しいクローン（ｐＧｔ（Ｃ６４３）が同定 された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１４４を作製するために発現ベクター中でクロー ン化された。変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従 っておよびＬＤ７８　Ｇｌｕ２９＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築しＤ７８　Ｇｌ ｕ２９＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発 現ベクター中でクローン化された。２２−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　８８９ ４３３　（５’　−ＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＡＧＴＡＧＴＣ−３’ＳＥ Ｑ　ｔＤ　８０７９）は、ＬＩ１７Ｂ遺伝子を変異させるために用いられ、正し いクローン（ｐＧＨＣ６３９）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＥ１３５を作 製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の 発現は、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７８　Ｇ１ｎ１８＞　Ｓｅｒは、 実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクロー ン化された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５０６　（５−ＴＴＴ ＧＴＧＧＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧ−３’　ＳＥＱ　１０　ＮＯ８０）は、 ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６６３ ）が同定された。変異遺伝子は、Ｉ）ＲＣ５９／６４を作製するために発現ベク ター中でクローン化された。変異体し０７８タンパク質の発現は、調製３に記載 された方法に従っおよびＬＤ７８　Ａｓｐ５＞　Ａｒｇ発現ベクターの構築ＬＤ ７８　Ａｓｐ５＞　Ａｒｇは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓｗ ｅ酵母発現ベクター中でクローン化された。２３−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド 　ＢＢ１０１９４　（５−ＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＣＧＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧ− ３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　８１）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用い られ、正しいクローン（ｐＧ）ＩＣ５６６）が同定された。変異遺伝子は、実施 例１の方法により発現ベクター中でクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質 の発現は、調製３に記載された方法に従ってと２１間への挿入（変異体４）の設 計と構築およびＬＤ７８　Ａｇ１７＞Ｇｌｕ、　（Ｇｌｎ、　Ｉｌｅ、　Ｐｒｏ ）の残基２０と２１間への挿入発現ベクターの構互 ＬＤ７８　Ａｒｇ１７＞　Ｇｌｕ、　（Ｇｌｎ、　ｌｌｅ、　Ｐｒｏ）の残基２ ０と２１間への挿入か、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母 発現ベクター中でクローン化された。２２−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチドＢＢ１ ．０Ｉ９５　（５°−ＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＴＡＡＧ−３°Ｓ ＥＱ　［Ｄ　ＮＯ８２）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正し いクローン（Ｍ１３ＤＢ１２０）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤ８１３８を 作製するために発現ベクター中でクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質の 発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 ＬＤ７８５ｅｒ４６＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐ ＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２７−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ド　ＢＢＩＯ１９６（５’−ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＧＣＧＣＴＴ ＡＧＴＣ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ８３）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるた めに用いられ、正しいクローン（Ｍ１３Ｄｅ１２１）が同定された。変異遺伝子 は、ｐＤＢＩ４６を作製するために発現ベクター中でクローン化され、変異体Ｌ Ｄ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 ＬＤ７８　Ｐｈｅ２８＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２９−ｍｅｒオリゴヌクレオ チド　ＢＢＩＯ１９７（５’−ＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴ丁ＣＧＧＡＴＣ ＴＴＴＴＡＴＣ−３’　ＳＥＱ　１０　ＮＯ８４）は、シＤ７８遺伝子を変異さ せるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１２２）か同定された。変異 遺伝子は、ｐＤＢ１３９を作製するために発現ベクター中でクローン化され、変 異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 Ｌ；Ｄ７８　Ａｌａ３＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ベクター中てクローン化された。２９−＋＋＋ｅｒ　オリゴヌ クレオチド　ＢＢＩＯ＋９８　（５°−ＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＧ ＧＡＴＣ−３’　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　８ｓ　）は、Ｌ［）７８遺伝子を変異さ せるために用いられ、正しいクローン（ＭＩ３ＤＢ＋２３）が同定された。変異 遺伝子は、実施例１の方法に従って、発現ベクター中でクローン化され、変異体 しＤ７Ｂタンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 ＬＤ７８　Ａｌａ４＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐ ＳＷ６酵母発現ベクター中でクロー・ン化された。２３−ｍｅｒ　オリゴヌクレ オチド　ＢＢ１０１９９　（５°−ＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡ ＡＧＧ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ８６）は、シＤ７８遺伝子を変異させるため に用いられ、正しいクローン（ＭＩ３ＤＢ＋２６）が同定された。変異遺伝子は 、ｐＤＢ１４７を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 ＬＤ７８　Ａｒｇ１７＞　Ｇｌｕ　ＧＩｎ１８＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載さ れたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２２ −ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢＩ０２００　（５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＴ ＴＣＡＧＡＧＧＴＧＴＡＡＧ−３’　ＳＥＱ　［ＯＮｏ　８７　）は、ＬＤ７８ 遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１２４）か同 定された。 変異遺伝子は、ｐＤＢ＋４０を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行わ れた。 およびＬＤ７８　Ｌｅｕ６７＞　Ｇｌｕ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｌｅｕ６ ７）　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、９ＳＷ６酵母発現ベ クター中でクローン化された。２Ｂ−ｍｅｒオリゴヌクレオチド　８８１０２０ １　（５’−ＣＣＴＴＡＴＴＡＧＧＣＡＧＡＴＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧ−３ ゛ＳＥＱ　１０　ＮＯ８８）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、 正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１２５）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢＩ４ １を作製するために発現ベクター中でクローン化され、変異体しＤ７８タンパク 質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 ＬＤ７８５ｅｒ４６＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐ ＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２０−ｍａｒオリゴヌクレオヂ ト　ＢＢ９５３７　（５’　−ＧＡＣＴＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＧＣＴＴＡＧ−３ ’ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　８９）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ 、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢＩ０７）か同定された。変異遺伝子は、ｐＤ８＋ １７を作製するために発現ベクター中でクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパ ク質の発現は、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７８　Ｌｅｕ２＞　Ａｌａ は、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でク ローン化された。＋９−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４９７　（５−Ｇ ＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＴ−３’　ＳＥＱ［Ｄ　ＮＯ９０）は、Ｌ Ｄ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６５４） が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１０２を作製するために発現ベクター中で クローン化され、変異体し０７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法 に従って行われた。 ＬＤ７８　Ａｌａ３＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐ ＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１７−ｍａｒ　オリゴヌクレオ チド　ＢＢ９４９８　（５°−ＧＴＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＣ−３’　Ｓ ＥＱ　［Ｄ　ＮＯ９１）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正し いクローン（ｐＧ）ＩＣ６５５）が同定された。変異遺伝子は、ＰＤＢＩ２３を 作製するために発現ベクター中てクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質 の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 ＬＤ７８　Ａｌａ４＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐ ＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１８−ｍａｒ　オリゴヌクレオ チド　ＢＢ９４９９　（５’−ＧＡＧＴＧＴＣＡＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧ−３’　 ５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　９２）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正 しいクローン（ｐＧＨＣ６５６）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１２４を 作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質 の発現は、調製３に記載された方法に従って行われｔこ。 しＤ７８　Ｌｅｕ６７＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐｓｗ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。２２−ｍｅｒオリゴヌクレオ チド　ＢＢ９５１７　（５°−ＡＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣ −３’　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９３）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用い られ、正しいクローン（ｐＲＣ５Ｂ／７５）か同定された。変異遺伝子は、ｔｌ Ｒｃ５９／７５を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に異体Ｐｒｏ７　 ＞　５ｅｒ（変異体１０３）の設計と構築およびＮ１−６　Ｐｒｏ７＞Ｓｅｒ発 現発現ダクター築 Ｎ］、−６Ｐｒｏ７＞　Ｓｅｒ　ＬＤ７８は、実施例１に記載されたように、構 築され、ｐｓｗｅ酵母発現ベクター中でクローン化された。３４−ｍａｒオリゴ ヌクレオチド　ＢＢ９７８１　（５−ＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＧＧＴＡＧ ＡＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＣ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９４）は、ＬＤ７８ 遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８／１０３）が 同定された。 変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／１０３を作製するために発現ベクター中でクローン 化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従っ て行われた。 しＤ７８　Ｐｈｅ２Ｂ＞　ＴＹｒは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２５−ｍｅｒ　オリゴヌクレ オチド　ＢＢ６３８１　（５’−ＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＡＧ ＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡ−３’　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　５１）は、ＬＤ７８遺伝子 を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６１１）が同定された 。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／１２を作製するために発現ベクター中でクローン 化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従っ て行われた。 ＬＤ７８　Ａｓｐ５＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐ ＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２０−ｍａｒ　オリゴヌクレオ チド　ＢＢ９４３０　（５−ＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’ 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９５）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、 正しいクローン（ｐＧＨＣ６３６）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１３４ を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク 質の発現は、調製３に記載された方法に従って行ＬＤ７８　Ｐｈｅ２３＞　Ａｌ ａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓｗｅ酵母発現ベクター中で クローン化された。＋８−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５２５　（５− ＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧ−３゛５ＥＱＩＤ　ＮＯ９６）は、ＬＤ ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３０Ｂ１１９） が同定された。変異遺伝子は、ρＤＢ１３７を作製するために発現ベクター中で クローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方 法に従って行およびＬＤ７８　Ｌｙｓ４４＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築しＤ７ ８　Ｌｙｓ４４＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド 　ＢＢ９４３５　（５−ＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＡ−３°Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　９７）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正 しいクローン　（ｐＧＨ４１）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪε９１を作 製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７Ｂタンパク質の 発現は、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７８　Ａｒｇ４５＞　Ｓｅｒは、 実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクロー ン化された。１８−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４３６　（５−ＧＴＣ ＴＣＧＡＧＧＡＣＴＴＡＧＴＣＡ−３’　５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　９８）は、ＬＤ７ ８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ４２）が同定 された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／４３を作製するために発現ベクター中でク ローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法 に従って行われた。 実施例５５−　ＬＤ７８変異体Ｇｌｕ５５＞　５ｅｒ（変異体４６）の設計と構 築およびしＤ７８　Ｇｌｕ５５＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｇｌｕ ５５＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓｗｅ酵母発現 ベクター中でクローン化された。２２−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４ ２３　（５’　−ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＧＴＣ−３’ＳＥＱ 　［ＯＮＯ９９）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクロ ーン（ｐＧＨＣ６４５）が同定された。変異遺伝子は、ｐｓＪＥ９５を作製する ために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は 、調製３に記載された方法に従っておよびしＤ７８　ＧＩｕ５６＞　Ｓｅｒ発現 ベクターの構築ＬＤ７８　Ｇｌｕ５６＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたよう に、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２１−ｍｅｒ 　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４２４　（５−ＴＴＴＧＡＡＣＣＣ八ＡＧＡＴＴ ＣＡへＡＴＧ−３’　ＳＥＱ　ｆＤ　ＮＯ１００）は、ＬＤ７８遺伝子を変異さ せるために用いられた。 変異遺伝子は、実施例１の方法に従って発現ベクター中でクローン化され、変異 体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例５７−　ＬＤ７８変異体Ｌｙｓ６０＞　５ｅｒ（変異体４８）の設計と構 築およびＬＤ７８　Ｌｙｓ６０＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｌｙｓ ６０＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現 ベクター中でクローン化された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４ ２５　（５−ＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ１０１）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクロ ーン（ｐＧＨＣ６４７）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ９７を作製する ために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は 、調製３に記載された方法に従ってと構築およびＬＤ７８　Ａｓｐ６４＞　Ｓｅ ｒは、発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｓｐ６４＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載 されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２ ０−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４２７　（５−ＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧ ＧＡＡＧＡＡＡＣＡＴ−３°　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０２）は、ＬＤ７８遺伝子 を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６４９）が同定された 。変異遺伝子は、ｐＳＪＥ９９を作製するために発現ベクター中てクローン化さ れた。変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って異 体（変異体６１）の設計と構築およびＣ６５−６９ＬＤ７８発現ベクターの構築 Ｃ６５〜５９　ＬＤ７８は、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６ 酵母発現ベクター中でクローン化された。１７−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　 ＢＢ９５０３　Ｃ５’−ＣＣＴＴＡＴＴＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣ−３’　ＳＥＱ　 ［Ｄ　ＮＯ＋０３）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいク ローン（Ｍ１３ＤＢ＋１３）か同定された。変異遺伝子は、ｌ］ＤＢ１０３を作 製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の 発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例６０−　ＬＤ７８変異体Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ　Ｇ１ｕ２９＞　Ａｒｇ（ 変異体１０１）の設計と構築およびＬＤ７８　Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ　Ｇｌｕ２ ９＞　Ａｒｇ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ　Ｇｌｕ２９＞　Ａｒｇは、実施例１に記載さ れたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。 ３３−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４４３　［５’　−ＴＴＧＡＧＡＡ ＧＡＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ　１０４）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられた。変異遺伝子 は、ｐＤＢＩ３３を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体 ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例６１−　ＬＤ７８変異体Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ　Ｇ１ｕ２９＞　Ａｒｇ　 Ａｒｇ４７＞　ＧＩＵ（変異体ｌ０２）の設計と構築およびしＤ７８　Ａｓｐ２ ６＞　Ａｌａ　Ｇｌｕ２９＞Ａｒｇ　Ａｒｇ４７＞　Ｇｌｕ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ　ＧＩｕ２９＞　Ａｒｇ　Ａｒｐ４７＞　Ｇｌ ｕは、実施例Ｉに記載されたように、構築され、本質的にｐＳＷ６酵母発現ベク ター中でクローン化された。３３−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４４３ （５’−ＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡ Ａ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ１０４〕は、ＬＤ７８　Ａｒｇ４７＞　Ｇｌｕ　 （遺伝子例１１のｐＧ）ｌｃ６１４）を変異させるために用いられ、正しいクロ ーン（ｐＲＣ５８／Ｉｏ２）が同定された。 変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／＋０２を作製するために発現ベクター中でクローン 化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従っ て行われた。 実施例６２−　ＬＤ７Ｂ変異体Ｌｙｓ３６＞　５ｅｒ（変異体４１）の設計ど横 築およびＬＤ７８　Ｌｙｓ３６＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｌｙｓ ３６＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ρＳＷ６酵母発現 ベクター中でクローン化された。２０−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　８８９４ ３４　（５“−ＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧ、ＡＧＧＡＡＣＡＴＴ−３’　ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ　＋０５）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しい クローン（ｐＧＨｃ６４０）が同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／旧を作 製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の 発現は、調製３に記載された方法に従っおよびＬＤ７８　Ｌｅｕ６５＞　Ａｌａ 発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｌｅｕ６５＞　Ａｌａは、実施例１に記載された ように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。２２−ｍ ｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４２８　（５−ＣＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣ ＧＴＣＡＧＡＡＡＣ−３゜ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋０６）は、ＬＤ７８遺伝子を変 異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨｃ６５０）か同定された。変 異遺伝子は、ｐＳＪε１００を作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従っおよび ＬＤ７８　Ｇｌｕ６６＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｇｌｕ６６＞　 Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘクター 中でクローン化された。２０−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　８８９４２９　（ ５’−ＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＧ−３’　ＳＥＱ　１０　ＮＯ １０７）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐ ＧＨｃ６５１）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪＥｌｏｌを作製するために 発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製 ３に記載された方法に従つしＤ７８　Ａｌａ６９＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載 されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１ ９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４９５　（５゛−ＣＴＴＡＴＴＡＧＧ ＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣ−３’　５ＥＱＩＤ　ＮＯ１０８）は、シＤ７８遺伝子を 変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８１５３）か同定された 。変異遺伝子は、ＰＲＣ５９１５３を作製するために発現ベクター中でクローン 化された。変異体ｔ、０７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従 ってＬＤ７８　Ｓｅｒは、Ｄ　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築さ れ、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１９−ｍｅｒオリゴヌク レオチド　ＢＢ９４９６　（５’　−ＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣ −３’ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　＋０９）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用 いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６５３）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤ Ｂｌｏｌを作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体１、Ｄ７ ８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って１、Ｄ７８　Ｇ１ｎ３ ３＞　Ｓｅｔは、実施例１に記載されたように、横築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘ クター中でクローン化された。２０−ｍａｒ　’オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５ ０９　（５°−ＣＴＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ−３゛ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ１１０）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクロー ン（Ｍ１３ＤＢ１２７）か同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１４３を作製する ために発現ベクター中てクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は 、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７８はＴｙｒ６１＞　ＡＬａは、実施例 １に記載されように、構築され、９ＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化され た。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５１５　（５’−ＧＴＣＡＧＡ ＡＡＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡ−３’　ＳＥＱ［ＯＮｏ　１＋１３は、ＬＤ７８遺 伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢｌ１５）か同定 された。変異遺伝子は、ｐＤＢＩＱ６を作製するために発現ベクター中でクロー ン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従 って行ＬＤ７８５ｅｒ３１＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築さ れ、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌ クレオチド　ＢＢ９５２９　（５’　−ＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴτＣＡ Ａ−３’　ＳＥＱ［Ｉ　ＮＯ１１２〕は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用 いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６８６）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤ Ｂ１３２を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体しＤ７８ タンパク質の発現は、調整３に記載された方法に従ってＬＤ７８５ｅｒ３２＞　 Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、９ＳＷ６酵母発現ベクター 中でクローン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５３０　（ ５°−ＧＡＡＣＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴ−３’　５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　１ １３）は、ＬＤ７Ｂ遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１ ３０Ｂ１０１）が同定された。変異遺伝子は、ｐｏｓｔｌｏを作製するために発 現ベクター中でクローン化された。変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３ に記載された方法に従ってしＤ７８　Ｌｅｕ４２）　Ａｌａは、実施例１に記載 されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２ １−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５３６　（５’　−ＧＣＧＣＴＴＡＧ ＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１１４）は、＜Ｌ［１７ ８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１０６）が 同定された。変異遺伝子は、ｐＤ８１１６を作製するために発現ベクター中でク ローン化された。変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法 に従って行われた。 ＬＤ７８　Ａｓｐ５２＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２２−ｍａｒ　オリゴヌクレ オチド　ＢＢ９４２２　（５−ＣＴＴＣＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＣ −３’ＳＥＱ　［ＯＮＯ＋１５）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いら れ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６４４）が同定された。変異遺伝子は、ｐＳＪε ９４を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タン パク質の発現は、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７８　Ｖａ１６２＞　Ａ ｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中 でクローン化された。２１−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９４２６　（５ −ＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧ−３’　ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋ １６）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧ ＨＣ６４８）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢｌｏｏを作製するために発現 ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に 記載された方法に従って行われた。 実施例７４−　ＬＤ７８変異体５ｅｒ１３＞　Ａｌａ　（変異体６２）の設計と 横しＤ７８５ｅｒ１３＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１７−ｍａｒ　オリゴヌクレ オチド　ＢＢ９５０４　（５−ＧＧＴＧＴＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣ−３’　Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１１７）は、ＬＤ７Ｂ遺伝子を変異させるために用いられ、 正しいクローン（ｐＧＨｃ６６１）が同定された。変異遺伝子は、ｐｓＪＥｌｌ ｌを作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパ ク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行ＬＤ７８　Ｓｅｒ＋６＞　Ａ ｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中 でクローン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５０５　（５ −ＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＴＡＡＧ−３’　ＳＥＱ［Ｄ　ＮＯ１１８） は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６ ６２）が同定された。変異遺伝子は、ｐｓＪＥ１１２を作製するために発現ベク ター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載 された方法に従ってＬＤ７８　Ｐｒ＋２０＞　Ａｌａは、実施例１に記載された ように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２０−ｍ ａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５０７　（５’　−ＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡＧ ＣＡＡＴＴＴＧＴＣ−３”　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１１９）は、ＬＤ７８遺伝子 を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧ）ｌｃ６６４）が同定され た。変異遺伝子は、ｐＤＢ１０４を作製するために発現ベクター中でクローン化 された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って ＬＤ７８５ｅｒ３５＞　Ａｈａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐ ＳＷ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。１Ｂ−ｍａｒ　オリゴヌクレオ チド　ＢＢ９５１０　（５°−ＣＴＧＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＡＧ−３’　 ５ＥＱＩＤ　ＮＯ＋２０）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正 しいクローン（ｐＧＨＣ６６８）か同定された。変異遺伝子は、ｐｓＪＥｌｌｌ を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク 質の発現は、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７８　Ｇ１ｎ５９＞　Ｓｅｒ は、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でク ローン化された。２３−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５１４１：５’　 −ＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＴＣ−３゜ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ １２１：ｌは、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ ＭＩ３０Ｂｌ　１４）か同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１０５を作製するた めに発現ベクター中でクローン化された。変異体Ｉ、Ｄ７８タンパク質の発現は 、調製３に記載された方法に従っしＤ７８５ｅｒ６８＞　Ａｌａは、実施例Ｉに 記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘクター中でクローン化された 。１９−ｍｅｒ　オー　リゴヌクレオチド　ＢＢ９５１８　［５“−ＡＴＴＡＧ ＧＣＡＧＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡ−３’　５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　１２２１は、ＬＤ７ ８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１００）か 同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢＩ０７を作製するために発現ベクター中でク ローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法 に従ってしＤ７８　Ｔｙｒ１４＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構 築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１９−ｍｅｒ　オリ ゴヌクレオチド　ＢＢ９５２０　（５−ＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＡ Ｃ−３’　５ＥＱＩＤ　ＮＯ１２３）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用 いられ、正しいクローン（ＭＩ３ＤＢＩ　１６）か同定された。変異遺伝子は、 ｐＤＢ１０８を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７８　［１ｅ１ ９＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓｔｖｓ酵母発現 ヘクター中でクローン化された。１９−ｍａｒオリゴヌクレオチド　ＢＢ９５２ ２　（５’　−ＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＧ−３°ＳＥＱ　１０　 ＮＯ＋２４）は、ＬＤ７Ｂ遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン （Ｍ１３ＤＢＩ　１７）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢＩ０９を作製する ために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は 、調製３に記載された方法に従って築およびしＤ７８　Ｐｒｏ３７＞　Ａｌａ発 現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｐｒｏ３７＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたよ うに、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。２０−ｍａ ｒ　オリゴヌクレオヂｌ”　ＢＢ９５３ｊ　（５’−ＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＧＣ ＣＴＴＧＧＡＡＣ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　＋２５）は、ＬＤ７８遺伝子を変 異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３Ｄｅ１０２）か同定された。 変異遺伝子は、ｐＤＢｌｌｌを作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異（、ｔＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って 築およびＬＤ７８　Ｇｌｙ３８＞　Ａｌａ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｇｌｙ ３８＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現 ヘクター中でクローン化された。２０−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５ ３２　（５゛−ＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧ−３’　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ＋２６）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクロ ーン（Ｍ１３ＤＢ１０３）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１１２を作製す るために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現 は、調製３に記載された方法に従って築およびＬＤ７８　Ｖａ１３９＞　Ａｌａ 発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｖａ１３９＞　Ａｌａは、実施例１に記載された ように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。ｌｉｔ− ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５３３　（５−ＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＣ ＣＴＧＧＣＴ−３゛５ＥＱＩＤ　ＮＯ１２７）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させる ために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１１８）か同定された。変異遺伝 子は、ｐＤＢＩ＋３を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異 体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行およびＬＤ ７８　Ｔｈｒ６＞　Ａｌａ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｔｈｒ６＞　Ａｌａは 、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクロ ーン化された。１７−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５００　（５’−Ｇ ＧＴＴＧＧＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１２８）は、 ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８１５ ｇ）が同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９１５８を作製するために発現ベク ター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載 された方法に従って行われた。 実施例８６−　ＬＤ７８を異体Ｇ１ｎ２１＞　Ｓｅｒ　（変異体８１）の設計と 慎しＤ７８　Ｇ１ｎ２１〉Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。２２−ｍｅｒオリゴヌクレオ チド　ＢＢ９５２３　（５’　−ＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＴ Ｇ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１２９〕は、Ｌｌ）７１１遺伝子を変異させる ために用いられ、正しいクローン（＋、１１３ＤＢ＋　１８）か同定された。変 異遺（五子は、ｐＤＢ１３６を作製するために発現へフタ−中でクローン化され た。 変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法にＬＤ７８　Ｔｈ ｒ４３　＞　Ａｅｒは、実施例日二記載されたように、構築され、ｐｓｗ６酵母 発現ヘクター中でクローン化された。１７−ｍａｒオリゴヌクレオチド　ＢＢ９ ５１１　（５°−ＧＣＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡ−３°５ＥＱｔＤ　Ｎｏ 　１３０：ｌは、ＵＤ７Ｂ遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン （ｐＧＨＣ６６９’）か同定された。変異遺伝子は、Ｉ）ＲＣ５９／６９を作製 するために発現ベクター中てクローン化された。変異体［、Ｄ７８タンパク質の 発現は、調製３に記載された方法に従ってＬＤ７Ｂ　Ｐｒｏ？＞　Ａｌａは、実 施例１に記載されたように、ＩｊＩ築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクロ ーン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５０１　［５°−Ｃ ＡＡＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧ−３’　５ＥＱＩｔ）　Ｎｏ　１３１） は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６ ５８）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１２５を作製するためｉこ発現ベク ター中でクローン化された。変異体１、ｔ）７Ｂタンパク質の発現は、調製３に 記載された方法に従って行およびし０７８　Ｔｈｒ８＞　Ａｌａ発現ベクターの 横築ＬＤ７８　Ｔｈｒ８＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され 、ｐｓ＼ｖ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。１８−ｍｅｒ　オリゴヌ クレオチド　ＢＢ９５０２　（５゛−ＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＣ− ３’　ＳＥＱ［Ｄ　ＮＯ１３２］は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いら れ、正しいクローン（ｐＲＣ５８／６０）か同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ ５９／６０を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７ ８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従つＬＤ７８　Ｔｙｒ２７＞ 　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクタ ー中でクローン化された。１８−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５０８　 （５’−ＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＧＴＣＡＧＣＡ−３’　ＳＥＱ［Ｄ　ＮＯ１３ ３）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧ１ ４ｃ６６５）か同定された。変異遺伝子は、ｐＯＢ１２６を作製するために発現 ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調！２３ に記載された方法に従って構築およびしＤ７８　Ｐｒｏ５３＞　Ａｌａ発現ベク ターの構築ＬＤ７８　Ｐｒｏ５３＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、 構築され、ρＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２０−ｍｅｒ　オ リゴヌクレオチド　ＢＢ９５１３　（５’−ＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＣＡ ＧＣＡＣ−３”　ＳＥｏ　１０　ＮＯ１３４）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させる ために用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８／７１　）が同定された。変異遺 伝子は、ｐＲＣ５９／７１を作製するために発現ベクター中でクローン化された 。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 実施例９２−　ＬＤ７８変異体５ｅｒ６３＞　Ａｌａ　（変異体７４）の設計と 構築およびＬＤ７８５ｅｒ６３＞　Ａｌａ発現ベクターの構築ＬＤ７８５ｅｒ６ ３＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベ クター中でクローン化された。１８−ｍｅ’ｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５ １６　（５’−ＣＡＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴ−３’　５ＥＱＩＤ　Ｎ Ｏ＋３５）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ ｐＧ）ＩＣ６７４）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢＩ４５を作製するため に発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調 ！！３に記載された方法に従って構築およびしＤ７８　Ｔｈｒ１５＞　Ａｌａ発 現ベクターの構築しＤ７８　Ｔｈｒ１５＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたよ うに、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１７−ｍａ ｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５２１　Ｃ３−ＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＡＡ ＧＡＧ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ　１３６）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させる ために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６７８）が同定された。変異遺伝子 は、ｐＤＢ１２８を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体 し０７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例９４−　ＬＤ７８変異体Ａｓｎ２２＞　Ｓｅｒ　（変異体８２）の設計と 構築およびＬＤ７８　Ａｓｎ２２＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｓ ｎ２２＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発 現ベクター中でクローン化された。１８−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９ ５２４　（５’　−ＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＧＡＡ−３°ＳＥＱ［Ｄ　 ＮＯ＋３７）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン （ｐＧＨｃ６８１）同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１２９を作製するために 発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製 ３に記載された方法に従って行われた。 実施例９５−　ＬＤ７８変異体Ａｌａ２５＞　Ｓｅｒ　（変異体８４）の設計と 構築およびＬＤ７８　ＡＩａ２５＞　Ｓｅｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｌ ａ２５＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発 現ベクター中でクローン化された。１７−ｍｅｒ　オＩＪ　コヌ’）　しｔｆ　 ト８８９５２６　（５−ＧＴＡＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴ−３’　ＳＥＱ　 ［Ｄ　Ｎｏ　＋３８）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しい クローン（ｐＲＣ５８／８４）か同定された。変異遺伝子は、ｐＲｃ５９／８４ を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体しＤ７８タンパク 質の発現は、調製３に記載された方法に従って築およびＬＤ７８　Ｔｈｒ３０＞ 　ＡＬａ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｔｈｒ３０＞　Ａｌａは、実施例１に記 載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘクター中てクローン化された。 １８−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５２８　（５−ＧＡＧＡＡＧＡＡＧ ＣＴＴＣＡＡＡＧＴ−３’　５ＥＱＩＤ　ＮＯ＋３９）は、ＬＤ７８遺伝子を変 異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＧＨＣ６８５）か同定された。変 異遺伝子は、ｐＤＢ１３１を　作製するために発現ベクター中でクローン化され た。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調！！３に記載された方法に従って築 およびＬＤ７８　Ｐｈｅ４１＞　Ａｌａ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｐｈｅ４ １＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘ クター中てクローン化された。２０−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５３ ５　［５−ＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＡＣＡＣ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　 ＮＯ１４０）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン １ＪＩ３ＤＢＩ０５）か同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１１５を作製するた めに発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、 調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例９Ｂ−ＬＤ７Ｂ変異体Ｖａ１４９＞　Ａｌａ　（変異体９６）の設計と構 築およびしＤ７８　Ｖａ１４９　＞　Ａｌａ発現ベクターの横策ＬＤ７８　Ｖａ １４９　＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母 発現ベクター中でクローン化された。２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド　ＢＢ９ ５３８　（５−ＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣＴＣＧ−３“ＳＥＱ　ｔｉ ｌｌ　Ｎｏ　＋４１３は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しい クローン（Ｍ１３ＤＢ１０８）か同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ１１８を作 製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体しＤ７８タンパク質の 発現は、調製３に記載された方法に従っ築およびしＤ７８　Ａｌａ５１＞　Ｓｅ ｒ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｌａ５１＞　Ｓｅｒは、実施例１に記載され たように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ヘクター中でクローン化された。１７− ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５３９　（５−ＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡ ＧＡＣＴＴ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ１４２）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させ るために用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１０９）が同定された。変異遺 伝子は、ｐＤＢｌ１９を作製するために発現ベクター中てクローン化された。変 異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行構築およ びＬＤ７８５ｅｒ５４＞　Ａｌａ発現ベクターの構築ＬＤ７８５ｅｒ５４＞　Ａ ｌａは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中 でクローン化された。１９−ｍｅｒ　オリボヌクレオチド　ＢＢ９Ｓ４Ｑ　（５ −ＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧ−３’　５ＥＱＩＤ　Ｎｏ　１４３ ）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ＭＩ３０ Ｂ１１０）が同定された。変異遺伝子は、ρＤＢＩ２０を作製するために発現ベ クター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調！２３に 記載された方法に従って構築およびしＤ７８　Ｔｒｐ５７ンＡｌａ発現ベクター の構築ＬＤ７８　Ｔｒｐ５７＞　Ａｌａは、実施例１に記載されたように、構築 され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２０−ｍａｒ　オリゴ ヌクレオチｌ’　ＢＢ９５４１　（５−ＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴ ＣＡ−３’　ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋４４）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるため に用いられ、正しいクローンＱｌ１３ＤＢ＋　１１）が同定された。変異遺伝子 は、ｐｐＢ１２１を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体 ＬＤ７８タンパク質の発現は、ＯＩ製３に記載された方法に従つと構築およびＬ Ｄ７８　Ｖａ１５８＞　Ａｌａ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｖａ１５８＞　Ａ ｌａは、実施例Ｉに記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中 でクローン化された。２２−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ９５４２　（５ ’−ＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＴＴＣＴＴＣ−３’ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ＋４５］は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（Ｍ Ｉ３ＤＢ１３２）が同定された。変異遺伝子は、ｐ［１Ｂ１２２を作製するため に発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調 製３に記載された方法に従っ構築およびＬＤ７８　Ｔｒｐ５７＞　Ｌｅｕ発現ベ クターの構築ＬＤ７８　Ｔｒｐ５７＞　Ｌｅｕは、実施例１に記載されたように 、構築され、ｐｓｗａ酵母発現ベクター中でクローン化された。２１−ｍｅｒ　 オリゴヌクレオチド　ＢＢ１０３７４　（５−ＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡＴＴＣ ＴＴＣＡＧＡ−３’ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１４６）は、ＬＤ７Ｂ遺伝子を変異さ せるために用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８／１１２）が同定された。変 異遺伝子は、ｐＲＣ５９／＋１２を作製するために発現ベクター中でクローン化 された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って 行われた。　４ 実施例１０４−　ＬＤ７８変異体Ｌｙｓ６０＞　Ａｓｐ　（変異体１１３）の設 計と構築およびＬＤ７８　Ｌｙｓ６０＞　Ａｓｐ発現ベクターの構築しく１７８ 　Ｌｙｓ６Ｑ＞　Ａｓｐは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓｗｅ 酵母発現ベクター中でクローン化された。２ｔ−ｍｅ’ｒ　オリゴヌクレオチド 　ＢＢ１０３７５　（５−ＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＡＴＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１４７）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ 、正しいクローン（ｐＲＣ５８／　１１３）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤ Ｂ＋４２を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体しＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 実施例！０５−　ＬＤ７８変異体Ｔｙｒ６１＞　Ａｓｐ　（変異体＋１４）の設 計と横築およびＬＤ７８　Ｔｙｒ６１＞　Ａｓｐ発現ベクターの構築ＬＤ７８　 Ｔｙｒ６１＞　Ａｓｐは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵 母発現ヘクター中でクローン化された。＋９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　８ Ｂ＋０３７６　（５’　−ＧＴＣＡＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴτＴＴＧＡ−３°　Ｓ ＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ　＋４８）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、 正しいクローン（ｐＲＣ５８／＋　１４）か同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ ５９／ｌｌ−１を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体Ｌ Ｄ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法と構築およびＬＤ７８　Ｐ ｈｅｉ２＞　Ａｓｐ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｐｈｅ１２＞　Ａｓｐは、実 施例１に記載されたように、Ｉｋ築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクロー ン化された。＋９−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　８Ｂ＋０３７７　（５−ＧＴ ＧＴＡＡＧＡＡＴＣＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１４９）は、 ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８／］ 　１５）か同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／Ｉ　１５を作製するために 発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製 ３に記載された方法構築およびＬＤ７８　Ｔｈｒ８＞　Ｇｌｕ発現ベクターの構 築ＬＤ７８　Ｔｈｒ８＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、 ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２３−ｍａｒ　オリゴヌクレ オチド　８Ｂ＋＋２３５　（５−ＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴ ＧＴ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　＋５０）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるた めに用いられた。変異遺伝子は、実施例■の方法に従って発現ベクター中てクロ ーン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、ｖ４１Ｒ３に記載された方法 に従って行われた。 実施例＋０８−　ＬＤ７８変異体５ｅｒ６８＞　Ｇｌｕ　（変異体１１７）の設 計と構築およびＬＤ７８５ｅｒ６８＞　Ｇｌｕ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ｓ ｅｒは、実施例１に記載されたように、構築され、Ｉ）ＳＷ６酵母発現ベクター 中でクローン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　８Ｂ＋０３７９　 （５−ＡＴＴＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡ−３°ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ０１５ １〕は、ｔ、Ｄ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ｐＲ Ｃ５８／ｌ　１７）か同定された。変異遺伝子は、実施例１の方法に従って、発 現ベクター中でクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に 記載された方法に従って行われた。 実施例１０９−　ＬＤ７８変異体Ｌｅｕ６７＞　Ａｓｐ　（変異体１１８）の設 計と構築およびしＤ７８　Ｌｅｕ６７　＞　Ａｓｐ発現ベクターの構築ＬＤ７８ 　Ｌｅｕ６７＞　Ａｓｐは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６ 酵母発現ベクター中でクローン化された。２２−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　 ＢＢ＋０３８０　（５−ＡＴＴＡＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣ−３’ 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ＋５２　）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いら れ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１３０）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤＢ Ｉ４８を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７Ｂタ ンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例＋１０−　ＬＤ７１３変異体Ａｓｐ６４＞　Ａｒｇ　（変異体１１９）の 設計と構築およびＬＤ７８　Ａｓｐ６４＞　Ａｒｇ発現ベクターの構築ＬＤ７８ 　Ａｓｐ６４＞＾ｒｇは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐｓＷ６酵 母発現ベクター中でクローン化された。２０−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　８ ８１０３８１　（５’　−ＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＣＡＴ−３’Ｓ ＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ　１５３）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、 正しいクローン（ｐＧＨＣ５６９）が同定された。変異遺伝子は、実施例１の方 法に従って発現ベクター中でクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質の発現 は、調製３に記載された方法に従ってと構築およびＬＤ７８５ｅｒ３１＞　Ｇｌ υ発現ベクターの構築ＬＤ７８５ｅｒ３１＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載された ように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。１９−ｍ ａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ１０３８２　（５−ＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡ ＧＴＴＴＣＡＡ−３’　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　１５４）は、ＬＤ７８遺伝子を変 異させるために用いられた。 変異遺伝子は、実施例１の方法に従って発現ベクター中でクローン化され、変異 体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例＋１２−　ＬＤ７８変異体［１ｅ４０＞　Ａｓｎ　（変異体＋２１）の設 計と構築およびしＤ７８　［１ｅ４０＞　Ａｓｎ発現ベクターの構築ＬＤ７８　 ［１ｅ４０＞　Ａｓｎは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵 母発現ベクター中でクローン化された。１９−ａｎｅｒ　オリゴヌクレオチド　 ＢＢＩ０３８３　（５−ＧＴＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＣＡＣＣＴＧ−３’　ＳＥ Ｑ　［Ｄ　ＮＯ１５５３は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正し いクローン（ｐＲＣ５８／１２１）が同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／ ＋２１を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体ＬＤ７Ｂタンパク質の発現は、ｌｌｌ製３に記載された方法に従って行わ れた。 実施例１１３−　ＬＤ７Ｂ変異体しｅｕ４２＞　Ａｓｎ　（変異体１２２）の設 計と構築およびＬＤ７８　Ｌｅｕ４２＞　Ａｓｎ発現ベクターの構築し０７８　 Ｌｅｕ４２＞　Ａｓｎは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵 母発現ベクター中でクローン化された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　Ｂ Ｂ１０９６４　（５’　−ＧＣＧＣＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１５６）は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、 正しいクローン（ｐＧＨｃ５６８）が同定された。変異遺伝子は、実施例１の方 法に従って発現ベクター中でクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質の発現 は、調製３に記載された方法に従って打体１２３）の設計と構築およびＬＤ７８ 　ＣｙｓｌＯ，Ｃｙｓｌｌ　＞　Ｃｙｓ−ＧｌローＣｙｓ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　ＣｙｓｌＯ，Ｃｙｓｌｌ　＞　Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓは、実施例１ に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化され た。２７−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ１０３８５　［５’　−ＧＴＡＡ ＧＡＧＡＡＡＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＴＧＧ−３’　ＳＥＱ　（Ｄ　Ｎｏ 　１５７］は、シＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ ｐＲＣ５８／１２３）が同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／１２３を作製 するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発 現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例１１５−　ＬＤ７８変異体Ｇ１ｕ５５＞　Ｇｉｎ、Ｇ１ｕ５６＞　Ｇｉｎ 　（変異体１２４）の設計と構築およびＬＤ７８　ＧＩｕ５５＞　Ｇｌｎ、Ｇｌ ｕ５６＞　Ｇｌｎ発現ベクターの構築 ＬＤ７８　Ｇｌｕ５５＞　Ｇｌｎ、ＧＬｕ５６＞　Ｇｉｎは、実施例１に記載さ れたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。 ２４−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ＋０３８６　Ｇ３−ＴＴＧＡＡＣＣＣ ＡＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＣ−３°ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ　１５８）は、Ｌ Ｄ７８遺伝子を変異させるために用いられた。変異遺伝子は、実施例１の方法に 従って、発現ベクター中でクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は 、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例！１６−　ＬＤ７８変異体Ａｓｐ２６＞　Ｇ１口（変異体１２５）の設計 と構築およびＬＤ７８八５ｐ２６＞　Ｇｉｎ発現ベクターの構築ＬＤ７８　Ａｓ ｐ２６＞　Ｇｌｎは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発 現ベクター中でクローン化された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢＩ ０５２９　（５°−ＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧ−３’ＳＥＱ 　ＩＤＮ０１５９〕は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいク ローン（ｐＲＣ５８／１２５）が同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／１２ ５を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 実施例＋１７−　ＬＤ７８変異体Ｌｙｓ３６＞　Ｇｌｕ　（変異体１２６）の設 計と構築およびＬＤ７８　Ｌｙｓ３６＞　Ｇｌｕ発現ベクターの構築しＤ７８　 Ｌｙｓ３６＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、ρＳＷ６酵 母発現ベクター中でクローン化された。２６−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　Ｂ Ｂ１０５３０　（５’　−ＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＧＧＡＡＣＡＴＴＧ ＡＧ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ１６０）は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるため に用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８／＋２６）が同定された。変異遺伝子 は、ｐＲＣ５９／１２６を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体ｔ、Ｄ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われ た。 実施例１１．８−　ＬＤ７８変異体Ｌｙｓ４４＞　Ｇｌｕ　（変異体１２７）の 設計と構築およびしＤ７８　Ｌｙｓ４４＞　ＧＬｕ発現ベクターの構築１、Ｄ７ ８　Ｌｙｓ４４＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２６−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド 　ＢＢ１０５３１　（５’−ＣＴＴＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＡＧＴＣＡＡＧ ＡＡＧ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ１６１１は、シ０７８遺伝子を変異させるた めに用いられ、正しいクローン（ｐ１１１ｃ５８／１２７）が同定された。変異 遺伝子は、ｐＲＣ５９／＋２７を作製するために発現ベクター中でクローン化さ れた。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、ｍ製３に記載された方法に従って行 われた。 実施例１１９−　ＬＤ７８変異体Ａｒｇ４５＞　Ｇｌｕ　（変異体１２８）の設 計と構築およびＬＤ７８　Ａｒｇ４５＞　Ｇｌｕ発現ベクターの構築ＬＤ７８　 Ａｒｇ４５＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵 母発現ベクター中でクローン化された。２５−ｍｅｒ　オリゴヌクレオチド　Ｂ Ｂ１０５３１　（５’　−ＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＣＴＴＡＧＴＣＡＡ Ｇ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１６２］は、ＬＤ７８遺伝子を変異させるために 用いられ、正しいクローン（ｐＲＣ５８／　１２８）が同定された。変異遺伝子 は、ｐＲＣ５９／１２８を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体し０７８タンパク質の発現は、！ｆｌｉｔ！３に記載された方法に従って 行われた。 実施例１２０−　ＬＤ７８変異体Ａｓｐ５２＞　Ｇｉｎ　（変異体１２９）の設 計と構築およびＬＤ７８　Ａｓｐ５２＞　Ｇｌｎ発現ベクターの構築ＬＤ７８　 Ａｓｐ５２＞　Ｇｌｎは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵 母発現ベクター中でクローン化された。２７−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　８ Ｂ＋０５３３　（５−ＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧＡ Ｃ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１６３）は、ＬＤ７８Ｃ７８遺伝子させるために 用いられ、正しいクローン（Ｍ１３ＤＢ１３＋）が同定された。変異遺伝子は、 ｐＤＢ１４９を作製するために発現ベクター中でクローン化された。変異体ＬＤ ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた。 実施例＋２１−　ＬＤ７８変異体Ｇｌｕ６６＞　Ｇｌｎ　（変異体１３ｏ）の設 計と構築およびＬＤ７８　ＧＩｕ６６＞　Ｇｉｎ発現ベクターの構築ＬＤ７８　 Ｇｌｕ６６＞　Ｇｌｎは、実施例１に記載されたように、構築され、Ｉ）ＳＷ６ 酵母発現ベクター中でクローン化された。１９−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　 ＢＢ１０５３４　（５−ＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＧ−３°ＳＥＱ 　［Ｄ　ＮＯ１６４）は、ＬＤ７８Ｃ７８遺伝子させるために用いられ、正しい クローン（ｐＲＣ５８／１３０）が同定された。変異遺伝子は、ｐＲＣ５９／＋ ３０を作製するために発現ベクター中でクローン化された。 変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に従って行われた 。 実施例＋２２−　ＬＤ７８変異体［１ｅ２４＞　Ｌｅｕ　（変異体１３１）の設 計と構築およびＬＤ７８　［１ｅ２４＞　ｌｅｕ発現ベクターの構築ＬＤ７８　 ［１ｅ２４＞　ｌｅｕは、実施例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵 母発現ベクター中でクローン化された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　Ｂ Ｂ１０５３５　（５’　−ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＧ−３’ ＳＥＱ　［ＯＮｏ　＋６５）は、ＬＤ７８Ｃ７８遺伝子させるために用いられ、 正しいクローン（帽３０Ｂ１２８）が同定された。変異遺伝子は、実施例１の方 法に従って発現ベクター中てクローン化され、変異体ＬＤ７８タンパク質の発現 は、調製３に記載された方法に従って１、Ｃ７８１１ｅ２４＞　Ｖａｔは、実施 例１に記載されたように、構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化 された。２１−ｍａｒ　オリゴヌクレオチド　ＢＢ＋０５３６　（５−ＧＴＡＧ ＴＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧ−３’ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ１６６）は、ｌ 、Ｃ７８遺伝子を変異させるために用いられ、正しいクローン（ＭＩ３ＤＢＩ２ ９）が同定された。変異遺伝子は、ｐＤ８１５０を作製するために発現ベクター 中でクローン化された。変異体ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載され た方法に従っしＣ７８Ａｒｇ１７＞　Ｇｌｕは、実施例１に記載されたように、 構築され、ｐＳＷ６酵母発現ベクター中でクローン化された。２２−ｍａｒ　オ リゴヌクレオチド　ＢＢＩＯ１９５（５−ＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＧＧＴ ＧＴＡＡＧ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１６７）は、ＬＤ７８Ｃ７８遺伝子させ るために用いられ、正しいクロ・−ン（ｐＧＨＣ５６７Ａ）が同定された。変異 遺伝子は、実施例１の方法に従、って発現ベクター中でクローン化され、変異体 ＬＤ７８タンパク質の発現は、調製３に記載された方法に非多量体化の性質につ いての変異体ＬＤ７８分子の選別のため、発現された鷹酸物の上清は最初にネイ ティブＰＡＧＥによって分析され、ＬＤ７８変異体変異体タンパ分質量は、ウサ ギ抗ＡｉＩＰ−１αポリクローナル抗血清を用いた免疫ブロンｌ−によって同定 された。 変異体（Ａ酸物（実施例１−１２４に記載された）は、調製３に記載された方法 に従って発現され、振どうフラスコ中で生育させられた。培養上清の１００μｌ アリコートはスピーディバック（ＳＰＥＥＤＩＶＡＣＴＭ）　！縮器を用いて乾 燥させ、ネイティブＰＡＧＥ試料緩衝液（２５ｍＭ　ｈリス、１０％グリセロー ル、０．０２％ブロモフェノールブルー）７μｍ中で再構成させた。 ５μＩの試料溶液は、高分子量範囲レインボー（ＲＡ　［ＮＢＯＷ”）マーカー 〔アマジャム　インターナショナル　ピーエルシー。 アマンヤムプレース、リトル　チャルフォント、アマジャム。 ハソクス　ＨＦ２９ＮＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐ ｌｃ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＰＩａｃｅ、Ｌｉｊｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ａｍ ｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｓ　ＨＦ２９ＮＡ）および標準ＬＤ７８（調製４に記載 されたように精製された）と共に５−５０％　クラディボール　ハイリンクス（ ＧＲＡＤ［ＰＯＲＥ　ＨＹＬ４ＮＸＴＭ）ネイティブ　アクリルアミドゲル〔フ ロウゲン（Ｆ　ｌｏｗｇｅｎ）　）に負荷された。ゲルは、比較例３に詳述され た製造業者の指示に従って１００ポルＦ・て１５分間電気泳動された。その後、 ゲルは、ニトロセルロールのシートにはさまれ、１２５ｍＭ　）リス、２０ｍＭ グリシン、１０％　メタノール、ｐ）１８．８緩衝液中で電気プロットされた。 タンパク質かニトロセルロース膜上にプロットされた後、膜は、室温にて３０分 間２０ｍ１の阻止緩衝液中（０，５％カセイン、＋５４ｍＭ　ＮａＣ１，２０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，４，０，０５％　トリトン）に置がれた。その後、膜は 第１抗体（標準技術を用いて生産されたポリクローナル　ウサギ抗ＭＩＰ−１α ）の１対２．０００（体積比）希釈液（阻止緩衝液中）で、ゆっくり撹拌しなが ら、３０分間室温にて培養された。その後、膜は阻止緩衝液中５分間で３回の洗 浄を行った。最後の洗浄の後、膜は第２抗体ヤギ抗ウサギ　ペルオキシツーゼ（ シグマ）の１対１０．０００　（体積比）希釈液で（阻止緩衝液中）３０分間、 ゆっくり撹拌しながら、室温にてインキュベーｈ　（ｉｎｃｕｂａｔｅ）された 。このインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）の後、膜は１５０ｍＭリン 酸塩緩衝化生理食塩水、ｐＨ７，４中で３から５回の連続した洗浄をされ、比較 例２に記載のように展開された。 この系は、有益な選別となるが、幅広い質量範囲の分離をもたらすために要求さ れる、急な（５−５０％）アクリルアミド匂配により、分子量の見積はなされ得 ない。 非多量体化変異体について期待される質量範囲（８０００−１００，０００ダル トン）により直接に集中させるために、１２％アクリルアミドバイオラド（ＢＩ ＯＲＡＤ”）ネイティブゲル（０，３７５Ｍ　ｌ−リス−塩酸ｐＨ８，８中での プレーカスト（ｐｒｅ−ｃａｓｔ）、２５ｍＭ　）リス、１９２ｍＭグリシンｐ ＨＢ、　３移動緩衝液での製造業者の指示による電気泳動〕が、発現された上演 およびキュー−セファローズ（Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯ３Ｅ”）で精製された（調製 ４に記載された方法）上記のような電気泳動のために調製されたＬＤ７８変異体 の両方を選別するのに用いられた。ゲルは、＋５０Ｖで６０分間電気泳動され、 その後上記のように電気プロットもしくは染色された。結果のクーマツ−染色さ れた試料は、このネイティブＰＡＧＥ系において、図１２および図１３に示され るように得られた。この結果は、明らかに、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ４４：Ｇ１ｎ４ ５．　（実施例２の変異体２）　）　、ＬＤ７８（ＧＩｕ４７（実施例１１の変 異体１５）〕およびＬＤ７８　（Ｇｌｕ２８：Ｇｌｕ４７（実施例１６の変異体 ２６）　）　、ＬＤ７８　（Ｓｅｒ１７：Ｇｌｕ１８（実施例２０の変異体３０ ）〕およびＬＤ７８　（Ｇｌｎ１２（実施例８の変異体１１）　）が大きな多量 体複合体を形成しないことを示す（１気泳動の際のタンパク質バンドの移動度か ら）。図１２および図１３の結果もまた、ＬＤ７８（ＡＩａ２６（実施例７の変 異体１０）　）　、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ４８（実施例Ｉの変異体１　）　）　、 ＬＤ７８　（Ｇｌｕ１８（実施例１９の変異体２９）〕およびＬＤ７８（５ｅｒ ６６（実施例６４の変異体５２）〕が、非野性型多量体化を示唆する電気泳動の 増加した移動度を有することを示す。ＬＤ７８　（Ｌｅｕ、　Ｓｅｒ、　Ａｌａ 、　Ｐｒｏｌ、　５ｅｒ３８．　Ｇｌｙ４６　（実施例２５の変異体３５）〕お よびＬＤ７８　（Ａｌａ、Ｐｒｏｌ　（実施例２４の変異体３４）〕のような公 知のＬＤ７８変異体は、野性型対照のように、高分子量バンドである同様な低い 移動度を有することが観察された。 表１は、シＤ７８変異体のネイティブＰＡＧＥ第１次分析の結果を詳述し、そこ で、非野性型多量体化の性質を存することが同定されたそれらは、表１における 分類に従って“小″′混合″　“大”として分類された。いくつかの変異体は、 大変まずく表現され、限定的に試験され得なかった。表１に挙げられていない実 施例１から１２４における変異体は、野性型電気泳動度を示した。これらの場合 において、変異された部位はタンパク質の不安定化を導入している鍵となる構造 的残基であるらしい。この選別中で同定され、選択された変異体は、比較例３に 記載されたＳＥＣによる分析や分析的超遠心分離のために９５％以上の等質性ま で精製された（調製４に記載したとおり）。これらの分析の結果は、後の実施例 に詳述される。 ゲル選別が、常に分析的遠心分離データと符号するのではない〔例えば実施例１ ３５中のＬＤ７８　（Ｇｌｕ４８）変異体ｌを参照〕ことに注意するへきである 、また、発明の最適な態様の選択は、好ましくはゲルデータだけを基礎として着 手されるべきでない。 これに対する可能な科学的関係は、（ｉ）ゲル選別において、トリスグリシン緩 衝液が金属イオンをキレートし得、従って、凝集不安定化すること、及び（ｉｉ ）荷電された側鎖の数および／もしくは型の変化は、電気泳動上の質量／荷電比 に影響しうろことである。また、分析的超遠心分離試験において使用された濃度 は、０．５ｍｇ／ｍｌであり、それは、示されたゲル選別試験中の場合ではない 。 （以下余白、次頁に続く） 表１ Ｍ、。−全セル質量平均分子量 Ｍ、ζ＝０　メニスカスにおける点平均分子量Ｍ、ζ＝１　セル底部における点 平均分子量（Ｌ。と共にＭｗζ＝０およびＭ、ζ＝１に対する値が与えられたと ころでは、試料は単分散された〕Ｅ＝サイズ分析の例番号 ＊＝大および小の種か存在する Ｌａｒｇ　Ｗｔ−ｆｌｉｔ　ＬＤ７８に相当するネイティブＰＡＧＥ上の電気泳 動の移動度 Ｌａｒｇ＝ネイティブＰＡＧＥ上のＷｔ　ＬＤ７８に比較された電気泳動移動度 における小さな増加 Ｓｍａｌｌ＝ネイティブＰＡＧＥ上のＷｔ　ＬＤ７８に比較された電気泳動移動 における大きな増加 Ｅｘｔｌ＝ＳＥＣゲルマトリックスから排除されたもの実施例１２６−　残基Ｐ ｈｅ２８からＧｌｕおよびＡｒｇ４７からＧｌｕへの変異は、４量体を形成する しＤ７８２量体の会合を阻止する。 表１に記載されたように、純粋なＬＤ７８　（ＧＩｕ２８：ＧＩｕ４７（実施例 １６の変異体２６）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐｔ（７，４緩衝液 中で、スーパーデックスフ５　（ＳＵＰＥＲＤＥＸ　７５ＴＭ）樹脂を用いるサ イズ排除クロマトグラフィーを用いて、かつ比較のために野性型ＬＤ７８を用い る沈降平衡によって研究された。ＬＤ７８変異体のＳＥＣプロフィール（図１４ ）は、単一で、限定された２１ＫＤａ質量の相同な集団を示している左右相称的 なピークである。沈降平衡データの分析は、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ２８：Ｇｌｕ４ ７　）は２量体に相当する１５．２ＫＤａ質量（Ｍｏ、）を持つタンパク質量の 単分散集団として存在することを示す。１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４におけ るＳＥＣにより測定された２１ＫＤａｌ量は、ＬＤ７８　３量体に対して期待さ れたものと近い。 この分子に対する会合のモデルは、この質量種の形成を予知していない。この緩 衝液中での沈降平衡による絶対質量決定は、分子は、１５．２　ＫＤａの単一分 子種であることを証明する非常に正確なデータを与える。ＳＥＣによる異例な高 質量は、クロマトグラフィー上の非理想（非球形）の流体力学的挙動に由来する ＬＤ７８２ｉ体の左右非相称的形状より生ずる。 この結果は、生理的イオン強度およびｐＨ１すなわち１５０ｍＦ、ＪＰＢＳｐＨ ７，４中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度において、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ２８．ＧＬｕ ４７）は、用いられた分析の方法下において単一で、限定された、明らかに存在 する大きな多量体をともない２量体種として存在する口裏１に記載したとおり、 純粋なＬＤ７８　（Ｇｌｕ４７（実施例１１の変異体１５）〕　タンパク質は、 １５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中で、スーパーデックスフ５樹脂を用い るサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、かつ比較のために野性型のＬＤ７８ を用いる沈降平衡によって研究された。このし０７８変異体のＳＥＣプロフィー ルは、単一で、限定された２１ＫＤａ質量の相同な集団を示す左右相称的なピー クである。沈降平衡データの分析は、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ４７）は２量体に相当 するｌ　７ＫＤａの質量（Ｍ’、）を持一つタンパク質量のｍ分散集団として存 在することを示す。 １５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４におけるＳＥＣにより測定された２１ＫＤａ質 量は、ＬＤ７８３量体に対して期待されたものと近い。 この分子についての我々の会合のモデルは、この質量種の形成を予知していない 。この緩衝液中での沈降平衡による絶対質量決定は、分子は、１５．２ＫＤａの 単一分子種であることを証明する非常に正確なデータを与える。ＳＥＣによる異 例な高質量は、クロマトグラフィー上の非理想（非球形）の流体力学的挙動に由 来するＬＤ７８２量体の左右非相称的形状より生ずる。 この結果は、生理的イオン強度およびｐＨ１すなわち１５０ｍＭ　ＰＢＳｐＨ７ ，４中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度において、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ４７）は、用い られた分析の方法下において、単一で、限定された、明らかに存在する大きな多 量体をともなわない２量体積として存在する異は、高分子量ＬＤ７８多量体複合 体の形成を阻止する表１に記載されたように、純粋なＬＤ７８　ＣＧｌｕ４４： Ｇ１ｎ４５（実施例２の変異体２）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ ７，４緩衝液中で、スーパーデックスフ５　（ＳＬＩＰＥＲＤＥＸ　７５量Ｍ） 樹脂を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、かつ比較のために野性型 ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究された。ＬＤ７８変異体のＳＥＣプロフ ィールは、単一ピークで（図１４）、質量２１ＫＤａの定義された集団を示して いる。沈降平衡データの分析は、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ４４；Ｇ１ｕ４５）か２量 体に相当する１６．５ＫＤａの質量（Ｍ’、）を持つタンパク質量の単分散集団 として存在することを示す。 １５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４におけるＳＥＣにより測定された２１ＫＤａ質 量は、ＬＤ７８３量体に対して期待されたものと近い。この分子についての会合 のモデルは、この質量種の形成を予知していない。 この緩衝液中ての沈降平衡による絶対質量決定は、分子が、１６゜５ＫＤａの単 一分子種であることを証明する非常に正確なデータをｔｊえる。ＳＥＣによる異 例な高質量は、クロマトグラフィー上の非理想（非球形）の流体力学的挙動に由 来するしＤ７８２量体の左右非相称的形状より生ずる。 この結果は、生理的イオン強度およびｐｌ、すなわち１５０ｍＮＩ　ＰＢＳｐ） １７．４中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度において、ＬＤ７ｇ　（Ｇｌｕ４４．Ｇｌ ｕ４５）は、用いられた分析の方法下において単一で、限定された、明らかに存 在する大きな多量体をともない二量体種として存在する。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｓｅｒ１７（実施例５の変異体５） 〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中で、スーパーデック スフ５樹脂を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、かつ比較のために 野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究された。サイズ排除プロフィール は、質量２９ＫＤａの単一ビ一つてある。４量体ＬＤ７８分子は、左右相称的で 球形であると予想され、ゆえに正しくクロマトグラフするであろう。このＬＤ７ ８変異体の観察された溶出は、４ｉ（Ｏ＊種と相関する。沈降平衡データの分析 は、３０ＫＤａ　（４量体）から１００にＤａ（１２量体）の範囲にわたる混合 分子魚種の存在を示す。 これらの結果は、ＬＤ７８中のＡｒｇ１７＞　Ｓｅｔの変異が、異種起源の高分 子ｉｉ会合体会合する能力かない分子を与えることを示す。しかしながら、変異 体は、４量体から１２量１体への会合を完全に阻止するのではなく、平衡が４量 体へ変化することがエネルギー的に存利であるらしい。 実施例１３０−　残基Ｇ１ｎ１８からＧＩｕへの変異は、高分子ｉ　ＬＤ７８多 量体複合体の会合を分裂させる 表１に記載したとおり、純粋なし０７８　（Ｇｌｎ１８（実施例１９の変異体２ ９）〕タンパク質は、１５０ｍλｌ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中て、スーパー デックスフ５樹脂を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、かつ比較の ために野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究された。サイズＩＪＦ除ク ロマトグラフィーは、１６０ＫＤａにより小さな成分を持つ、４８．５ＫＤａに 質量か集中した大きな幅広いピークである。４量体し０７８分子は、左右相称的 で球形と予想され、ゆえに正しくクロマトグラフするであろう。このしＤ７８７ ８変異観察された溶出は、４量体種に関係するため異例に高い。 沈降平衡データの分析は、７５ＫＤａから１７０ＫＤａの範囲におよぶ混合分子 魚種の存在を示す。 これらの結果は、ＬＤ７８中のＧｌｎ−１８＞　Ｇｌｕの変異が、生理的イオン 強度において異種起源の高分子量複合体を形成するいくぶんかの能力をまだ存し ている分子を与えることを示す。しかしなから、その結果から、変異は、会合平 衡においていくぶんかの分裂効果を存することが明らかである。この変異体に対 して観察された質量範囲は、野性型ＬＤ７８について見られるそれよりも小さい （表１）。また、ＳＥＣプロフィールは、分子が官憲に小さな溶液質量を有する ことを示す。ＧＩｎ１８＞　Ｇｌｕの変異は高分子ｉ　ＬＤ７８多量体の形成を 完全に止めないが、変異体分子の挙動からこの残基か多量体複合体の安定化にい くぶんかの役割を演しることは明らかである。生理的イオン強度下、タンパク質 濃度０．５ｍｇ／ｍｌ以下において、この変異体はより小さく限定された質魚種 として存在する。 表１に記載したとおり、純粋なしＤ７８　（Ｓｅｒ１７；Ｇｌｕ１８（実施例２ ゜の変異体３０）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中で 、スーパーデックスフ５樹脂を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、 かつ比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究された。サイズ排 除クロマトグラフィーは、質量２５ＫＤａの単一ピークである。４量体ＬＤ７８ 分子は、左右相称的で球形と予想され、ゆえに正しくクロマトグラフするであろ う。このＬＤ７８変異体の観察された溶出は、４量体種に対して予想されるより もわずかに低い。しかし、野性型に比較して、分子質量における変化が観察され た。沈降平衡データの分析は、３７ＫＤａから５０ＫＤａの範囲に及ぶ混合分子 魚種の存在を示す。５０ＫＤａより高い質量は観察されなかった。 これらの結果は、ＬＤ７８中Ａｒｇ１７＞　ＳｅｒおよびＧ１ｎ１８＞　Ｇｌｕ の結合した変異か、（生理的イオン強度（０，５ｍｇ／ｍｌ）において）、高分 子量複合体への会合能力を有さない分子を与えることを示す。実際、ＬＤ７８変 異体は、５０ＫＤａより高いいかなる分子魚種をも形成しないらしい。いくぶん かの不安定な制限された会合は起こりうるか、結果は、ＬＤ７８変異体が４量体 として存在することを反映することを示唆している。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｇｌｎ１２．　（実施例１８の変異 体ＩＩ）　）タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において ０、５ｍｇ／ｍｌで、スーパーデックスフ５を用いるサイズ排除クロマトグラフ ィーを用いて、かつ比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究さ れた。この分子に対して観察されたＳＥＣ溶出物は、ＬＤ７８変異体に対して見 られる最小質量である１２．８ＫＤａの単一ピークである。ＳＥＣにおける２量 体ＬＤ７８の非理想的挙動の前提より（例えば、実施例１２６）　、このプロフ ィールは、変異体が単量体として存在することを示唆する。しがしながら、沈降 平衡は、ＬＤ７８（Ｇｌｎ１２）は溶液中で１２量体であることを示す。 最初のネイティブゲル選別（実施例１２５）は、小さな種の存在を示した。表１ 中のデータは、１２量体とより小さい種間の平衡を反映し、セファデックス樹脂 の存在は、実際の平衡上でいくぶんかの物理的効果を有しつる。二者択一的に、 タンパク質は、り０マドグラフイーの際、樹脂に接着し、また、見かけ上より小 さな質量を有し、非常に遅くに溶出される。この変異体に対する質量決定におけ る例外にかかわらず、Ｐｈｅ１２　＞　Ｇｉｎの変異は、野性型と同様の範囲ま で多量体化しないＬＤ７８変異体を与える。この分子のＮ末端領域は、平衡会合 経路における一以上の状態の安定化に役割を演じている。 実施例＋３３−　Ａｓｐ２６がらＡＩａへの変異は、高分子量ＬＤ７８多量体複 合体の形成を分裂する。 表１に記載したとおり、純粋なしＤ７８　（Ａｌａ２６　（実施例７の変異体ｌ Ｏ）〕　タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０、 ５ｍｇ／ｍｌで、スーパーデックスフ５樹脂を用いるサイズ排除クロマトグラフ ィーを用いて、かつ比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究さ れた。溶出プロフィールは、２４．５ＫＤａ質量の単一ピークを与えた。沈降平 衡データの分析は、そのタンパク質かＭ　’　ｗ　＝　３０ＫＤａを存する単一 分散質量集団として存在することを示す。 この結果は、Ａｓｐ２６からＡｌａへの変異は、均質の４ｊｉ体として、生理的 イオン強度に存在するＬＤ７８分子を与えることを示す。 実施例１３４−　Ｇｌｕ２９からＡｒｇへの変異は、４量体を形成するために、 ＬＤ７８２量体が会合するのをのを分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ａｒｇ２９　（実施例１８の変異体 ２８）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０、 ５ｍｇ／ｍｌで、スーパーデックスフ５Ｍ＋脂を用いるサイズ排除クロマトグラ フィーを用いて研究された。溶出プロフィールは、２４ＫＤａ質量の単一ピーク を与える。実施例８６て議論されたように、これは均質の２量体種に最も関係す るであろう質量を観察した。 この結果は、Ｇｌｕ２９からＡｒｇへの変異が、生理的イオン強度において、単 一２量体種として存在するＬＤ７８分子を与えることを示す。 実施例１３５−　Ｇ１ｎ４８がらＧｌｕへの変異は、ＬＤ７８の多量体化の性質 に影響しない。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｇｌｎ４８．　（実施例１の変異体 １））タンハク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０゜５ ｍｇ／ｍｌで、スーパーデックスフ５（ＳＥＰＥＲＤＥＸ　７５量Ｍ）を用いる サイズ排除クロマドグフィーを用いて、かつ比較のため野性型ＬＤ７８を用いる 沈降平衡によって研究された。この分子に対して観察されたＳＥＣ溶出物は、単 一で、幅広く、見積もられた質量＋３１ＫＤａノピークをｆｕｌｌ除した。沈降 平衡は、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ４８　）が、＋００ＫＤａから６００ＫＤａの異種 起源の種範囲として存在することを示す。 たとえこの変異か、ネイティブＰＡＧＥ上で増加した移動度を有することか観察 されても、２つの独立したサイズ分析は、生理的緩衝液中この濃度において、該 タンパク質が野性型の多量体化を有することを確認する。 実際に、超遠心分離における平衡で観察される質量範囲は、この変異体は野性Ｍ より大きなより安定な多量体を形成することを示すように見える。ゆえに、この 場合、この部位における負荷電の導入か安定化効果を有するであろう。 実施例１３６−　Ｐｈｅ２８がらＧｌｕおよびＧＩｕ４８からＧｌｕへの変異は 、高分子量ＬＤ７８多量体の形成を分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｇｌｕ２８；Ｇｌｕ４８．　（実施 例＋５（７）変異体２５）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩 衝液中において０．５ｍｇ／ｍｌで、スーパーデックスフ５樹脂を用いるサイズ 排除クロマトグラフィーを用いて研究された。溶出プロフィールは、約６０ＫＤ ａの分子質量における単一で、幅広い左右非相称的なビークを示す。幅広い左右 非相称は、異成分から成る質魚種の混合を示す。結合した変異は、野性型に対し て明らかに異なる多量体化の性質を有する変異体を産生ずる。 実施例１３７−　Ａｒｇ４５からＳｅｒへの変異は、高分子量ＬＤ７８多量体複 合体の形成を分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｓｅｒ４５．　（実施例５４の変異 体４３））タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０ 、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性’ｕＬ［１７８を用いる沈降平衡によって研 究された。沈降平衡データの分析は、そのタンパク質がＭ″＋　＝　２５ＫＤａ を有する単一分散質量集団として存在することを示す。この＋ｊｇ量は、２′！ ！Ｌ体に対しては異例に高く、４量体に対しては低い。安定な３ｉｔ体は形成さ れそうもないという前提より、この質量は均質の４量体種を表していることが最 もありうる。 実施例１３８−　Ｌｙｓ４４からＳｅｒへの変異は、高分子量ＬＤ７８多量体複 合体の形成を分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なし、Ｄ７８　（Ｓｅｒ４４．　（実施例５３の変 異体４２）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において ０、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究 された。沈降平衡データの分析は、そのタンパク質か質量３５−４８ＫＤａのｉ ｔＵＭに及ふ種の多分散集団として存在することを示す。 この結果は、ＬＤ７８中Ｌｙｓ４４からＳｅｒへの変異は、高分子量複合体への 会合（生理的イオン強度下中０．５ｍｇ／＋ｎｌにおいて）の能力のある分子を 与えることを示す。４８ＫＤａより高い分子量種は、観察されないという事実は 、変異は４量体が１２量体を形成する会合を不安定化することを示唆する。 この結果は、実施例＋３１に記載されたＬＤ７８　（Ｓｅｒ１７；ＧＩｕ１８． 　（実施例２０の変異体３０）〕に対して得られたそれとまさに同様である。ゆ えに、その結果は、４量体と２量体（もしくは単量体）間にいくぶんかの不安定 な、限定された会合は生じるが、ＬＤ７８変異体か４量体として存在することを 反映することを示唆７８多量体複合体を安定化する。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ａｌａ６５．　（実施例６３の変異 体５１）〕タンパク質は、１．５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において ０、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究 された。沈降平衡データの分析は、そのタンパク質がＭｏ、、＝＝　１２０ＫＤ ａを有する単一分散質量集団として存在することを示す。これらの条件下におい ては、池の分子量種は観察されない、それゆえ、ＬＤ７８の野性型自己会合性は 修飾されている。 実施例１４０−　Ｇｌｕ６６からＳｅｒへの変異は、高分子量ＬＤ７８多量体複 合体の形成を分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　Ｃ３ｅｒ６６、　（実施例６４の変異 体５２）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０ 、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究さ れた。沈降平衡データの分析は、そのタンパク質がＭｏ、＝２７にＤａを有する 単一分散質量集団として存在することを示その結果は、生理的イ才゛、ノ強度お よびｐＨての、すなわち１５０ｍＬＩ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４，５ｍｇ／ｍｌの濃 度において、ＬＤ７８　（Ｓｅｒ６）は、単一で、限定された、大きな多量体の 存在を伴わない４量体種として存在することを示す。 実施例Ｌｌｌ−Ｐｒｏ７からＡｌａへの変異は、異成分から成る高分子量ＬＤ７ ８多量体複合体の形成を促進する。 表１に記載し、たとおり、純粋なＬＤ７８　（Ａｌａ？、　（実施例８８の変異 体５９）］　タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において ０゜５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型しＤ７８を用いる沈降平衡によって研究 された。沈降平衡データの分析は、そのタンパク質か４００から１０００ＫＤａ の範囲に及ぶ質ｉ種の多分散質量集団として存在することを示す。 その結果は、生理的イオン強度およびｐＨての、すなわち１５０ｍλげＢＳ　ｐ ｔ（７，４，０，５ｍｇ／ｍｌの濃度において、ＬＤ７８　（Ａｌａ７）は、大 きな多量体複合体の異なる成分からなる範囲として存在することを示す。これら の複合体について観察される質量範囲は、同様な条件下で野性型ＬＤ７８に対し て、通常、観察されるよりも非常に大きい（比較例３）。 Ｐｒｏ７からＡｌａへの変異は、それゆえ、ＬＤ７８の自己会合の性質を促進し 、その結果は、タンパク質のＮ末端腕はこの分子の多量体化において主要な役割 を演していることを示す。 実施例１４２−　Ｇ１ｎ１８からＳｅｒへの変異は、均質な成分からなる高分子 量ＬＤ７８多量体複合体を安定化させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｓｅｒ１８．　（実施例３５の変異 体６４）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０ 、５ｍｇ／′ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究 された。沈降平衡データの分析は、タンパク質はＭ６．＝２００にＤａを有する 単一分散質量集団として存在することを示す。 Ｇ１ｎ１８からＳｅｒへの変異は、０．５ｍｇ／ｍｌにおいて生理的イオン強度 中、２６単量体の安定で、均質な複合体へ会合しつるＬＤ７８分子を与える。こ れらの条件下では、他の分子量種は観察されない、それゆえ、ＬＤ７８の野性型 自己会合性は有意に修飾されていなる高分子！：ＬＤ７８多量体複合体を安定化 させる。 表１に記載したとおり、純粋なしＤ７８　（Ａｌａ６１．　（実施例６８の変異 体７３）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐ）１７．４緩衝液中において ０、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究 された。ＬｎＡ対このわずかに上向きの曲率は明らかであるか、沈降平衡データ の分析は、タンパク質はＭ　’　ＩＴ　＝　４００ＫＤａを有する本質的には単 一分散質量集団として存在することを示す。 Ｔｙｒ６１からＡｌａへの変異は、生理的イオン強度中において０゜５＋ｒ＋ｇ ／ｍｌで、安定で、均質な複合体へ会合しうるＬＤ７８分子を与える。これらの 条件下では、他の分子量種は観察されない、それゆえＬＤ７８の野性型自己会合 性は存意に修飾されている。 実施例＋４４−　１１ｅ１９からＡｌａへの変異は成分からなる均質なＬＤ７８ 単量体を与える。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ａｌａ１９．　（実施例８１の変異 体８０））タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０ 、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によって研究さ れた。沈降平衡データの分析は、タンパク質は、Ｍ″。 ＝　６ＫＤａを存する単一分散質量集団として存在することを示す。 １１ｅ１９からＡｌａへの変異は、生理的イオン強度中において０゜５ｍｇ／ｍ ｌで、均質の単量体として存在するＬＤ７８分子を与える。これらの条件下、他 の分子ＮＬ種は観察されない。それゆえ、ＬＤ７８の！ｆ性型自己会合性は完全 に阻害されていた。 表１に記載したとおり、純粋なしＤ７８　（Ａｌａ３９．　（実施例８４の変異 体９Ｉ）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０ 、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いた沈降平衡によって研究さ れた。沈降平衡データの分析は、タンパク質がＭ’＝＝８ＫＤａを有する単一分 散質量集団として存在することを示す。 Ｖａ１３９からＡｌａへの変異は、生理的イオン強度中において０゜５ｍｇ／ｍ ｌて、均質な単量体として存在するＬＤ７８分子を与える。これらの条件下、池 の分子魚種は観察されない、それゆえＬＤ７８の野性型自己会合性は完全に阻害 されていた。 実施例１４６−　Ａｒｇ１７からＧｌｕおよびＧ１ｎ１８からＧｌｕへの変異は 、高分子量ＬＤ７８多量体複合体の形成を分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なし０７８　（ＧＬｕ１７．Ｇｌｕ１８．　（実施 例４２の変異体１１０））タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝 液中において０．５ｍｇ／ｍ！で、比較のため野性型ＬＤ７８を用いた沈降平衡 によって研究された。沈降平衡データの分析は、タンパク質がＭ’　、　＝　３ ０ＫＤａを育する単一分散質量集団として存在することを示す。 この結果は、ＬＤ７８におけるＡｒｇ１７からＧｌｕおよびＧ１ｎ１８からＧｌ ｕへの結合した変異は、４量体より大きな多量体複合体へ会合（生理的イオン強 度において）する能力のない分子を与えることを示す。実施例＋３１に記載され た変異体３０に対して得られた結果の比較は、Ｇ１ｎ１ＢからＧｌｕに結合した Ａｒｇ１７からＧｌｕへのより根本的な置換は４量体単位のさらなる会合を分裂 させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ａｌａ１２．　（実施例２９の変異 体７７）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐｔ１７．４緩衝液中において ０、５ｍｇ／ｍｌて、比較のため野性型ＬＤ７８を用いた沈降平衡によって研究 された。沈降平衡データの分析は、タンパク質は、質量１１０から＋　７０ＫＤ ａの範囲にわたる種の多分散質量集団として存在することを示す。 この結果は、ネイティブＰＡＧＥにおける明らかに高い移動度にもかかわらず、 この変異体は、０．５ｍｇ／ｍｌにおいて生理的イオン強度下での野性ｆｆ１Ｌ ０７８に比較して自己会合におけるほんのわずかな相違しか示さないことを示す （表１および比較例３）。これは、低タンパク質濃度におけるネイティブＰＡＧ Ｅ中、変異体は、有意により小さい質量として存在するように、会合のタンパク 質濃度依存状態を反映しているであろう。Ｐｈｅ１２からＧｌｕもしくはＡｓｐ への置換を含有するＬＤ７８変異体（それぞれ実施例１３２および１４８に記載 された変異体１１および１１５）に対して得られた結果から、高タンパク質濃度 における高分子量多量体の形成を阻止するために、この部位での根本的な変異が 要求されることか明らかである。 実施例１４８−　Ｐｈｅ１２からＡｓｐへの変異は、高分子量ＬＤ７８多量体複 合体の形成を阻止する。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　［Ａｓｐ１２．　（実施例１０６の変 異体＋１５））タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中におい て０．５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いた沈降平衡によって研 究された。沈降平衡データの分析は、タンパク質は、Ｍ’、＝３０ＫＤａを有す る単一分散質量集団として存在することを示す。 Ｐｈｅ１２からＡｓｐへの変異は、生理的イオン強度において０．５ｍｇ／ｍｌ で、均質の４量体として存在する。これらの条件下では池の質魚種は存在しない 、それゆえ、この変異はより高次構造への４量体の会合を用台している。 実施例１４９−Ａｌａ４からＧｌｕへの変異は、高分子量ＬＤ７８多量体複合体 の形成を分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｇｌｕ４バ実施例４１の変異体１０ ９））タンパク質は、１５０ｎｔｌ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中、比較のため 野性型ＬＤ７８を用いた沈降平衡によって研究された。沈降平衡データの分析は 、タンパク質は、Ｍ’、＝７１ＫＤａを存する単一分散質量集団として存在する ことを示す。 Ａｌａ４からＧｌｕへの変異は、生理的イオン強度中において０．５ｍｇ／ｍｌ て、質量７１ＫＤａ安定な均質複合体へ会合するしＤ７８分子を与えた。それゆ え、ＬＤ７８の自己会合は、タンパク質のＮ末端腕が多量体化過程に直接的に含 まれることを示しているこの変異によって劇的に減少される。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　［Ａｌａ＋５．　（実施例９３の変異 体７９）〕タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中において０ 、５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型しＤ７８を用いる沈降平衡によって研究さ れた。沈降平衡データの分析は、タンパク質のＭ６．＝２００ＫＤａを有する質 量およそ１００−２５０とＤａの範囲に及ぶ種の多分散質量集団として存在する ことを示す。ネイティブＰＡＧＥ上で観察された増加した移動度は、ゲル上に負 荷された低濃度で優勢な質魚種との自己会合の濃度依存を反映しよう。極性もし くは荷電したアミノ酸に対するより根本的な置換は、さらにこの可能性を説明す るであろう。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｇｌｕ３６．　（実施例１１．７の 変異体１２６））タンパク質は、１５０ｎ＋Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４緩衝液中に おいて０．５ｍｇ／ｍｌで、比較のため野性型ＬＤ７８を用いる沈降平衡によっ て研究された。沈降平衡データの分析は、タンパク質はＭ６゜＝　２００ＫＤａ を有する質量およそ＋００−２００とＫＤａの範囲に及ぶ種の多分散質量集団と して存在することを示す。 この結果は、Ｌｙｓ３６からＧｌｕへの変異は、生理的イオン強度中０．５ｍｇ ／ｍｌにおいて、野性型会合性を有する分子を与えることを示す。ネイティブＰ ＡＧＥ上で観察された増加した移動度は、ゲル上に負荷された低ａ度で優勢な算 量積との自己会合の濃度依存を反映しよう。 実施例１５２−　Ｇ１ｎ２１からＳｅｒへの変異は、高分子量ＬＤ７８多量体複 合体の形成を部分的に分裂させる。 表１に記載したとおり、純粋なＬＤ７８　（Ｓｅｒ２１．　（実施例８６の変異 体８１）〕　タンパク質は、１５０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐｔ１７．４緩衝液中０．５ ｍｇ／ｍｌにおいて、比較のため野性型しＤ７８を用いる沈降平衡によって研究 された。沈降平衡データの分析は、タンパク質かＭ’、＝１＋２ＫＤａを有する 単一分散質量集団として存在することを示す。 Ｇ１ｎ２１からＳｅｒ〜の変異は、生理的イオン強度中０．５ｍｇ／ｍｌにおい て、質量１１２ＫＤａの安定な均質複合体へ会合しうるし［１７８分子を与える 。これらの条件下、池の分子魚種は観察されない、それゆえ、ＬＤ７８野性型自 己会合性は修飾されている。 実施例１５３−　ネイティブＰＡＧＥ中で野性型より高い移動度を示すアミノ酸 を含有するさらなる１０７８分子。 実施例１２５に記載されたネイティブＰＡＧＥ選択試験において、多数の池のＬ Ｄ７８変異体か、野性型よりも大幅に増加した移動度を有する単一種として同定 された。これらの変異体は、ＬＤ７８（Ｇｌｕ２ｇ　（実施例１３の変異体１７ ））　、ＬＤ７８　ＣＡｓｎ２４（実施例１４の変異体２４）　）　、　ＬＤ７ ８　（Ｇ１ｎ２６．　（実施例１１６の変異体１２５）　）ルＤ７８　（Ｇ１ｕ ４４．　（実施例１１８の変異体１２８））　、ＬＤ７８　（Ｇｌｕ４５．（実 施例１１９の変異体１２８））およびＬＤ７８　（ＧＬｎ６６　（実施例１２１ の変異体＋３０））である。 さらに４つの変異体が、ネイティブＰＡＧＥ上で、高および低分子魚種の混合を 示すと同定された。これらの変異体は、ＬＤ７８（Ａｌａ４３　（実施例８７の 変異体６９））　、ＬＤ７８　（（Ｓｅｔ４８　（実施例２７の異体７０））　 、ＬＤ７８　（Ｓｅｒ５１　（実施例９９の変異体９７）〕およびり、０７８　 （Ａｌａ５８（実施例１０２の変異体１００））である。 さらに５つの変異体は、ネイティブＰＡＧＥ上で、野性型と比較して移動度にお けるわずかな増加をともなって移動することが観察された、このことは、それら は大きいが、また、ＬＤ７８自己会合性の修飾に反映していることを示している 。この結論は、ゲル移動度においてはほんのわずかな増加で、沈降平衡により試 験されたとき野性型との著しい相違を示す、変異体１０．５１．５２および６４ （それぞれ実施例１３３．１３９．１４０および１４２）の分析により支持され る。これらの変異体は、ＬＤ７８　（Ｓｅｒ２６（実施例２８の変異体３９）） 　、ＬＤ７８　（Ａｌａ１３（実施例７４の変異体６２））　、ＬＤ７８　（Ａ ｌａ２３（実施例５２の変異体８３））　、ＬＤ７８　（Ａｌａ３２（実施例７ ０の変異体８８）〕および（Ａｌａ４９（実施例９８の変異体９６）〕である。 上記のように同定された変異体のいくつかは、前述の実施例に記載された多量体 化に含まれることか知られた部位における置換を含み、それゆえ、ゲル移動度に おける変化を観察することは期待されていない。しかしながら、ゲル選別の制限 を受ける残りの部位は、ＬＤ７８自己会合過程とともに直接もしくは間接的に含 まれつる。 表１に記載した通り、天然変異体ＬＤ７８　（Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ；Ｐｒｏ ｌＳｅｒ３８：Ｇｌｙ４６（実施例２５の変異体３５）〕およびＬＤ７８　（Ａ ｌａ：Ｐｒｏｌ。 （実施例２４の変異体３４）〕は、スーパーデックスフ５樹脂を用いＳサイズ（ 井除クロマトグラフィーおよび対照として野性型を用いる沈降平衡によって研究 された。両度異体はＳＥＣ樹脂から排除され、沈降平衡データは、それらはそれ ぞれ９０から２００にＤａおよび２３０から３５０ＫＤａの多分散質量として存 在することを示す。 それゆえ、これらの変異体におけるＮ末端の延長やアミノ酸置換は、ＬＤ７８タ ンパク質の多量体化の性質を分裂させる。 上記の実施例により、少なくとも残基１９と３９は単量体の二量体への会合に重 要であることかわかる。 ２量体−４量体会合に重要な残基 先に概略された実施例より、配列の２つの厳密な領域か２量体か４量体を形成す る安定な会合に重要であると同定された。 （ｉ）残基Ｐｈｅ２８＞　ＧｌｕおよびＧｌｕ２９＞　Ａｒｇの個々の変異は、 ２量体ＬＤ７８の均質集団を生せしめる。ゆえに、βシートの１および１′鎖に おいて２１体の面から突き出している残基は、４量体界面において主要な非共有 、分子間結合を形成する。 （ｉｉ）Ａｒｇ４７＞　Ｇｌｕ　もしくはＬｙｓ４４＞　ＧｌｕとＡｒｇ４５＞ 　Ｇｉｎの組合せの変異は個々に、高分子量型の欠除下で安定なＬＤ７８２２量 体を生成する。それゆえ、β−ソートの！Ｊ１２　（２’　）と３（３°）に連 結している回転領域中の残基４３から４７の配列は、４魚体を形成するＬＤ７８ 　２ｉ体の会合に対して鍵である。 ４量体−１２量体および１２量体→高次多量体に重要な残基Ａｒｇ１７＞　Ｇｌ ｕ、Ｇ１ｎ１８＞　Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１２＞　Ａｓｐ、Ａｓｐ２６＞　Ａｌａ、Ｇ ｌｕ６６ＳｅｒおよびＡｌａ４＞　Ｇｌｕの変異は、４量体から１２量体への会 合を分裂させる。Ｇ１ｎ２１＞　Ｓｅｒ、Ｌｅｕ６５＞　ＡｌａおよびＰｈｅ１ ２＞　Ｇｉｎの変異は、１２１体から多量体への会合を分裂させる。 現在の証拠は、これらの界面か積なっているか、一体となっているか、同しであ るかを示す。Ａｒｇ１７＞　ＳｅｒおよびＧｌｕ１８＞Ｇｌｕの変異は、個々に もしくは組合せにおいて、上に概略された会合の両方を分裂させる。この場合、 β−シートのｔ（ｔ’）１のＮ末端側上の残基１６から２１を含む配列領域が、 会合についての鍵であること予示された。 現在のところ、残基４８における変異に対して生じたデータはあいまいである。 しかし、この残基もまた１０７８分子の高次会合における役割を演しているらし い。 組換えタンパク質を産生させるための形質転換したサツカロミセス　セレビシェ 系統の可能性評価の簡便法は、バッチ発酵過程を用いることである。この過程は 、接種前の培地に、全ての必須成長栄養が存在している制御された環境を提供す ることに頼っている。一度、接種が起こると、培養は、組換えタンパク質発現に 適当な環境中で維持される。振どうフラスコ培養からの組換えタンパク質のスケ ールアップはファーメンタ−培養（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を 用いて行われた。ファーメンタ−中での組換え遺伝子発現に用いられるサツカロ マイセス　セレビシェ菌株はＭＣ２である（調製３参照）。この菌株は、単独お よび制限炭素源としてガラクトースか用いられたニス、セレビシェ菌株ＢＪ２］ ６８　（調製３参照）の恒成分培養槽培養液から単離された。ＢＪ２１６８とは 異なり、ＭＣ２は、単独および制限炭素源としてガラクトース上で成長させた際 、野性型遺伝子型を示す。 開発されたバッチおよびフエツドーバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）戦略は、この 遺伝子型の性質を補うよう設計された。 この実施例について用いられる形質転換された菌株は、先に調製２に記載された ように調製された。異なった形の分子を表現するために用いられたプラスミドは 、調製３（野性型ＬＤ７８）、実施例２　（Ｌｙｓ４４＞　Ｇｌｕ：Ａｒｇ４５ ＞　Ｇｌｎ）および実施例ＩＩ（Ａｒｇ４７＞Ｇｌｕ）中に記載された。 方法 １ｍｌグリセロール保存培養液（２０％グリセロール中−７０°Ｃて保存した） は解かされ、その後５０ｍ１　ｓｃ／ｇｌｃ培地（６，７ｇ／ｌ酵母窒素塩基（ ｂａｓｅ）ｗ１０アミノ酸、１ｇアデニン含有１０ｇ／ｌグルコースおよび２０ ｍ１／１アミノ酸溶液、１ｇアデニン、５ｇアスパラギン酸、５ｇグルタミン酸 、１ｇヒスチジン、１５ｇイソロイシン、１．５ｇリジン、１ｇメチオニン、２ ．５ｇフェニルアラニン、１７．５ｇセリン、１０ｇトリオニン、２ｇ）リブト ファン、１．５ｇ千ロジン、１ｇウラシル、６．７ｇバリン）を接種するのに用 いられた。この培酔養液は、ファーメンタ−（以下のように調製した）をシード （５ｅｅｄ）するのに用いられた点で、２４時時間上うプラットホーム（ｐｌａ ｔｆ。 ｒｍ）上３０°Ｃで培養した。 ５Ｌのファーメンタ−〔エル　ニス　エル　バイオラフイツト（ＳＬＳ　Ｂｉｏ ｌａｆｉｔｔｅ）　）は、４１ｇ硫酸アンモニウム（（Ｎ）１．）　！Ｓｏ、） 、５、２５ｇオルトリン酸二水素カリウム（ＫＨｔＰＯ４）　、２．８５ｇ硫酸 マンガン（ＭｇＳＯ，−７１６０）　、５５ｍｇ塩化カルシウム（ＣａＣ１ｔ） 　、１６ｍｇ硫酸マンガン（ＭｎＳＯｎ　−４１（２０）　、１８．５ｍｇ硫酸 銅（ＣｕＳＯ，−５８２０）　、５ｍｇ硫酸亜鉛（ＺｕＳ０４・７ＨｔＯ）、１ ｍｇＥつ化カリウム（Ｋｌ）　、９ｍｇモリブデン酸ナトリウム（ＮａｔＭｏＯ ａ　Ｈ２ＨＪ）　、４ｍｇ塩化フェリ（ＦｅＣ１ｚ　・６ＨｔＯ）を含む３，５ シの制限培地ＮＡＭＣ＃　４および２ｍｌ　ＰＰＧｚｏｏｏ　（抗泡剤（ａｎｔ ｉｆｏａｍ　ａｇｅｎｔ））で満たされた。 一度滅菌されたファーメンタ−は冷却され、ファーメンタ−内の培地は、ｌｏｍ ｌのフィルター滅菌されたアミノ酸保存液（シード培養液に対するように）とと もに１５ｇグルコース、１００ｇガラクトース、ｌ０ｍｇビオチン、６３ｍｇパ ントテン酸カルシウム、６３ｍｇピリドキシン塩酸塩、５０ｍｇチアミン、５０ ｍｇニコチン酸、４ｍｇ　ｐ−アミノＦ安息香酸、１００ｍｇ　ミオ−イノシト ールを含む４００ｍ１のフィルター滅菌した糖／ビタミン濃縮液の無菌的付加に よって仕上げられた。 一度、培地か仕上げられると、ファーメンタ−は、以下の環境を維持するよう設 定された：温度３０°Ｃ，ｐＨ５，０（滴定剤として３Ｍ水酸化ナトリウムと３ Ｍリン酸を用いて）、インペラー（Ｌｍｐｅ　ｌ　ｌｅｒ）７５０ｒｐｍ、空気 流速２．５Ｌ／ｍｉｎおよび溶解酸素強度約４０％飽和（インペラー速度増加を 用いて）。運転条件が得られた後、ファーメンタ−はシート培養液（前述の）で 接種され、運転条件は６５時間維持された。この点で、培養液の細胞密度は、分 光光度計（Ａ、。。）を用いて定量され、ＬＤ７８レベルは、（培養液上清にて ）ピーク高さあるいは面積を与えるＬＤ７８濃度の標準曲線を用いる逆ｔｆＪＨ ＰＬｃ　（比較例３）を用いて評価された。 Ｉ　バッチプロトコル（ｂａｔｃｈ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて次のデータが 集められた。 ＬＤ７８種　最終生物量　最終ＬＤ７８　特異的レベル（ＯＤ＋ｏａ）　レベル （ｍｇ／Ｌ）　生産性（野性型・ｌ） 野性ｕ　２６．６　７　１ ＬＤ７８の非凝集変異体を発現する種する種からの高生産性かこの実験中に明確 に示された。 実施例１５７−　野性型しＤ７８としＤ７８変異体のニス、セレビシエフエツド ーパッチ（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵フェノトーバソチ戦略は、醗酵培養液内の 高細胞密度を促進し、組換えタンパク質の体積測定レベルを増力しさせるバッチ 過程の改作である。野性型および変異体ＬＤ７８種の発現に用いられた菌株は実 施例１５６におけるとおりである。形質転換体は、調製２に記載されたように産 生され、使用されたプラスミドは、調製２（野性型）、実施例２　（ＬＹｓ４４ ＞　Ｇｌｕ：Ａｒｇ４５　＞　Ｇｉｎ）、実施例１６（Ｐｈｅ２８＞　Ｇｌｕ： Ａｒｇ４７＞　Ｇｌｕ）、実施例５３（Ｌｙｓ４４＞　５ｅｒ）、実施例６４（ Ｇｌｕ６６　＞　５ｅｒ）、実施例４２（Ａｒｇ１７＞　Ｇｌｕ；ＧＩｕ１８＞ 　Ｇｌｕ）および実施例＋９（Ｇｌｎ１８＞　Ｇｌｕ）に記載されている。 互浩 ファーメンタ−は、実施例１５６におけるように設置された。 接種後１８時間において、フィード（ｆｅｅｄ）が培養物に適用された。 飼料は容積Ｉして、３００ｇガラクトース、８．３ｇ硫酸アンモニウム（（Ｎｌ （、）、ＳＯ，）、１．０５ｇ二水素オルトリン酸カリウム、０．５７ｇ硫酸マ グネシウム（ＭｇＳ０４・７ＬＯ）　、ｌ１ｍｇ塩化カルシウム（ＣａＣ１２） 、３ｍｇ硫酸マンガン（ＭｎＳＯｔ　・４Ｈ２０）　、４ｍｇ硫酸銅（ＣｕＳ０ ４・５ＨｔＯ）、１ｍｇ硫酸亜鉛（Ｚｎ５（Ｌ　・７８２０）　、０．２ｍｇヨ ウ化カリウム（Ｋ［）、２ｍｇモリブデン酸ナトリウム（ＮａｔＭｏＯ４Ｈ２Ｈ ２０）　、１ｍｇ塩化フェリ（ＦｅＣｌｚ　・６Ｈ２０）　、４ｍｇホウ酸（Ｈ ＩＢＯｌ）　、２ｎ＋ｇ　ビオチン、１２ｍｇパントテン酸カルシウム、１２ｍ ｇ＠酸ピリドキシン、１０ｍｇチアミン、１０ｍｇニコチン酸、１ｍｇパラ−ア ミノ安息香酸、シード（ｓｅｅｄ）段階において用いられるアミノ酸保存物の１ ００ｍ１に添加した２０ｍｇミオ−イノシトールから成っていた。フィードは、 ０．２２ｍ１／ｍｉｎの速度で容器中にくみ入れられた。４８時間後、フィード は停止され、２５０ｍ１瞬間波動（ガラクトースなしのフィードと同様）が容器 中に計り分けられた。このバッチ相は、細胞密度および培養液しようせい府述（ 実施例１５６）のように分析されｔこ後、その後さらに３６時間続けられた。 形質転換されたＭＣ２細胞および上述のフエ・ノドーノ（・ソチ（ｆｅｄ−ｂａ ｔｃｈ）プロトコールを用いて、以下のデータが集められた。 この実験において、ＬＤ７８の非多量体化された変異体を発現する踵からのより 高い生産性が明確に示された。 メチロトローフな酵母ピンヤ　パストリスがいく′フかのタンパク質の産生に対 して用いられてきた。この宿主におし）て、数多くのタンパク質に対して高レベ ルの発現か得られｔこ、し力・しながら生産が困難なタンパク質もあった。特定 のポリペプチドの性質とそのビシャ系において高度に発現される能力とは、明白 な相関はない。ピシャ　バストリス発現系は、大規模生産に対する尺度可能性の 簡便性において、特別な利点を有する。　ＬＤ７８ノ発現は、ビシャ宿主株Ｇ５ １１５　（（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃａｍｐａｎｙ、　Ｂａ ｒｆｌｅｓｖｉ　ｌ　ｌｅ、　Ｏｋｌａｈｏｍａ　、　ＵＳＡ）より入手可）に おいて調べられた。 ｐＳＷ６−ＬＤ７８プラスミドは、ビー、バストリス発現ベクターｐＨＩＬＤＪ 中にクローニングするためのα−ファクターＬＤ７８融合の源として用いられた 。発現ベクターｐｉ（ｌＬＤ４は、イー、コリおよびメチロトローフ酵母ピー、 パトリスにて繁殖可能なシャトルベクターである。該ベクターは、イー、コリ　 ベクターｐＢＲ３２２由来の配列およびビー、パストリスのゲノム由来の配列を 含む。ベクターの重要な特徴は、高レベル転写のための調節可能なＡＯＸＩプロ モーターを含むピシャＡＯＸＩ遺伝子の５°領域、転写のターミネ−タ含むＡＯ ＸＩ遺伝子由来からの３゛領域、宿主ゲノムへ、の発現カセットの特定部位組込 みを可能とする５’　ＡＧＸＩ領域とともに含まれる３°ＡＯＸＩからのさらな る領域である。ビー、パストリス　ヒスチンノール　デヒドロゲナーゼ遺伝子旧 Ｓ４が保持され、ビシャ宿主系統において不完全なｈｉｓ４遺伝子を補うために 用いられる。アンピシリン耐性遺伝子か、遺伝子操作の際、イー、コリ中におけ る選択をさせるため保持される。このベクターは、ベクターがピシャ宿主系統に 導入される際、多コピー組込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）に対する選択可能な カナマイシン耐性カセットをも含むことを除いて、実施例【５９に記載されたｐ Ｈ［ＩｖＤＩヘクターと同様である。ｐＨ１ＬＤ４は、図ｔＳａに図示される。 発現に対する遺伝子は、ｐＨＩＬＤ４ベクターのＥｃｏＲ１発現クロ発現クロー ニング部位−ン化されうる。ｐＨＩＬＤ４は、フイリ・ノブ　ペトロレウム　カ ンパニー、バーｌ−レスビル、オクラホマ、米国からの許可下で入手されうる。 調製２のｐＳＷ６−ＬＤ７８は、α型因子プレープロ　リーダー配列とつながっ たサツカロマイセスに融合された野性型ＬＤ７８遺イ云子の源として用いられた 。この融合をフードする配列（よ、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限工ントヌク レアーゼによる消化の後の直線ＤＮＡフラグメントとして、ｐＳＷ６−ＬＤ７８ から単離されうる。ｐＨ［ＬＤ４ヘクターのＥｃｏＲ１発現クローニング部位へ のクローニングと両立しうろこの直線フラグメントの末端を示すため、Ｂｇｌ　 ＩＩ　／Ｂａｍ旧消化から結果として生した単鎖の張り出し部を満たすこと力・ まず必要であった。これは、常法により要求されるデオキシヌクレオント　三リ ン酸とともにイー、コリＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラ グメントを用いて行われｔこ。結果として生した平坦な末端のフラグメントは、 ＥｃｏＲＩて処理されたｐＨＩＬＤ４にクローン化され、その後上記のように鈍 端にされた。 結果として生じたプラスミドｐし旧２の完全性は制限消化と配置１分析の組合せ によって照合された。 ｐし旧２を含む発現宿主菌株は、実施例１５９下に記載された方法を用いて構成 される。 パストリス発現ベクターの構築 実施例１５８のｐＬ）１１２が早期発現分析に用いられる、一方、このベクター は、この実施例中に示されるように改良され、改良されたベクターｐＬＨ２３結 果物は、ＬＤｌ８変異体に対するピシャ発現ベクターの構築に用いられた。ピシ ャ発現ベクターｐＨ［ＬＤｌ（図１６）は、イー、コリ（遺伝子操作の簡便性の ために）およびメチロトローフな酵母ビシャ　パストリス両方において増殖可能 なツヤトル・ベクターである。ニス、セレビシェ連結型の因子アルファ分泌ソゲ ナルは、ＬＤｌ８タンパク質の培地への輸送を可能にするためｐＧＩＣＤＩベク ターへ組込まれた。ｐＨ［［、ＤＩは、マイリブ　ペトロレウム　カンパニー、 バードレスビル　オクラホマからの許可下で入手されつる。該ベクターは、イー 、コリヘクターｐＢＲ３２２由来の配列及びビンャ　パストリスのゲノム由来の 配列を含む。重要な特徴は、高レベル転写のための調節可能なＡＯＸＩプロモー ターを含むピシャ　アルコール　オキシダーゼ（ＡＯＸＩ）の５゛領域、アルコ ール　オキシダーゼ転写ターミネータ−配列を含むＡＯＸ　ｌ遺伝子からの３゛ 領域、および５’　ＡＯＸＩ領域とともに宿主ゲノムへの発現カセットの特定部 位の組込みに要求されるＡＯＸ＋遺伝子の３゛部からのさらなる領域が含まれる ことである。ビー、パストリス　ヒスチンノール　デヒドロゲナーゼ遺伝子ＨＩ ３４は保持され、ピシャ宿主菌株中の不完全なｈｉｓ４遺伝子を補うために用い られた。アンピシリン耐性遺伝子は、遺伝子操作の際用いられるイー、コリ宿主 での選択を可能とするために保持された。ｐ旧しＤ１ベクターは、アルファ因子 分泌シグナルの制御下にて、調製Ｉの合成ＬＤ７８遺伝子（ｐＵｃ　１８−　Ｌ Ｄ７８か□ら得られた）の発現をさせるよう操作された。ｐＨＩＬＤｌは、異種 タンパク質の輸送をさせる分泌シグナルをコードするいかなる配列も保っていな い。そのようなシグナルを含むために、ニス。 セレビシェ　アルファ因子リーダーからの配列の添加によって操作された。ベク ターは、より最適なプロモーター状況を提供し、調製２のｐＳＷ６−　ＬＤ７８ からのＬＤ７Ｂ遺伝子のクローニングを妨害する好ましくないＨｉｎｄＩ［Ｉ制 限部位を除去するために、ＢａｍＨ［部位は、その後ＨｉｎｄｌＩＩ　−Ｂａｍ 旧制限部位上でＬＤ７８遺伝子（調製１のｐＵｃ１８−ＬＤ７８）のクローニン グをさせるように残厚の１ｌｉｎｄ■に３゛を導入され、形質転換されたピシャ 宿主菌株中での多コピー組込み体の選択を可能にするカナマイシン耐性カセット を含ませるようさらに設計された。操作の段階は、下記のとおりである。戦略の ｉ略は、図１８に示す。 アルファ因子分泌シグナルの包含 アルファ因子配列は、ニス、セレビシェ発現ベクターｐＳＷ６（図２）（詳しく は調製２）からのｐＨ［ＬＤＩベクター中にクローン化された。アルファ因子配 列は、約４３０ｂｐ　ＢａｍＨＩ　ＤＡＮフラグメント上てｐＳＷ６から単離さ れた。このフラグメントは、ヒト上皮成長因子合成遺伝子（ＥＧＦ）に融合され たアルファ因子を含む。 このＤＡＮフラグメントの張り出した末端は最初に、従法により要求されるデオ キシヌクレオシド　三リン酸とともにイー、コリＤＡＮ　ポリメラーゼＩのフレ ノウ　フラグメントを用い、満たされた。その後、平坦なフラグメントは、Ｅｃ ｏＲＩて処理されたｐＨＩＬＤｌベクター中にクローン化され、上記のように鈍 端にされた。結果として生じたプラスミドｐＬＨＯＯ＋の完全性は、制限消化お よびＤＡＮ配列分析の組合せによって、照合された。配列分析に使用されたプラ イマーは、 ８８５７６９　（５’　−ＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴ　−３’　ＳＥ ｏ　１０　Ｎｏ　１６８　）　テあった。アルファ因子コード配列の配列は確認 された。 変異体ＬＤ７８発現へのベクター最適化のための突然変異ｐＬＨＯＯｌベクター は、好ましくないＨｉｎｄｌｌＩ制限部位を除去し、プロモーター領域を最適化 し、Ｂａｍ旧部位を導入するため、さらに修飾された。適切なフラグメントが、 特定部位の突然変異のためにバクテリオファージＭ１３中にクローン化された。 クローン化されたフラグメント、突然変異に用いられたプライマー、および配列 決定に対して用いられたプライマーは、以下に詳述される。さらに、カナマイシ ン耐性カセットは、ベクターがビシャ　パストリス宿主菌株中に導入される際、 多コピー組込み体に対して選択しつるよう、最終発現ベクター中に導入するよう に修飾された。 約１２２０ｂｐのＳａｃ　Ｉ−Ｓａｃ　［フラグメントがｐＬＨＯＯｌがら単離 され、ＭＩ３ｍｐ１９にクローン化された。その後、このＭ１３の構成は、オリ ゴヌクレオチド　ブライ？−ＢＢ６０４０　（５’　−ＣＧＴＴＡＡＡＡＴＣＡ ＡＣＡＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＡＣＣ−３’　ＳＥＱ　［ＯＮＯ１６９） 　ヲ用いてＨｉｎｄＩ［部位が除去される突然変異に用いられ、突然変異体は、 配列決定ブライ７−ＢＢ６２９６　（５’　−ＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴ ＣＴ−３’　ＳＥＱ　［ＯＮＯ＋７０）　ヲ用いる配列分析によって同定された 。このフラグメントは、現在ピシャ　ゲノム上のＡＯＸＩ遺伝子の天然５゛非翻 訳リーダー中に見られるものと同一であり、ＡＯＸＩプロモーターの上位を占め る５゛非翻訳リーダー領域を最適化させる欠失突然変異によって、さらに修飾さ れた。５°−非翻訳リーダー付近の正しい状況の保持は、最大発現にとって好ま しい。この段階で用いた突然変異プライマーは、ＢＢ８４６１　（５’　−ＧＡ ＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＧＴＴＴＧＡＡＴＡ−３’　５ＥＱＩＤ　ＮＯ＋７ １　）であった。突然変異体は、配列決定プライマーＢＢ８７４０　（５°−Ｇ ＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＣ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ　＋７２）を用 いた配列分析によって同定された。 さらに２つのＨｉｎｄｌｌｌｌ［部位か、ｐＬＨＯＯｌの約７７０ｂｐ　５ａｃ ｌ−Ｘｂａｌフラグメントから突然変異誘発によって除去された。ｐＬＨＯＯｌ の５ａｃｌ−Ｘｂａｌフラグメントは、最初にＭ　＋３ｍｐｌａ中でクローン化 され、ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位の１つかブライ７−ＢＢ６３９４　（５°−ＣＣＧＧ ＣＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＣ−３’　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ　＋７３）を用いて除去された。この突然変異体の同一性は、配列決定 プライマーＢＢ６０３７　（５’　−ＧＣＧＣＡＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＣ−３ °ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１７４）を用いる配列分析によって確認された。２番目の ＨｉｎｄＩＩ［部位は、突然変異プライマーＢＢ６８４１　（５’−ＣＴＴＡＴ ＣＧＡＴＣＡＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＣＧ−３°ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１７５）を 用いて、この新たな突然変異フラグメントから除去された。正しい突然変異体は 、配列プライマーＢＢ６０３７を用いる配列分析によって同定された（上記参照 ）。再構築の前に、Ｂａｍ８１部位は、ＨｉｎｄＩ［−Ｂａｍ旧フラグメント上 において調製２のしＤ７８遺伝子の後のクローニングをさせるためにＨｉｎｄＩ ［［欠損させた５ａｃｌ−Ｘｂａｌフラグメントに導入された。ＢａｍＨ１部位 導入に用いられた突然変異誘発プライマーは、ＢＢ６１８９　（５’　−ＧＴＣ ＡＴＧＴＣＴＡＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＣ−３°ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ Ｏ１７６）であった。突然変異体の同一性は、配列決定るプライマーＢＢ５７６ ９　（５’　−ＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴ−３’　５ＥＱＩＤ　Ｎｏ 　＋６８）用いてを同定された。 カナマイノン耐性カセットの修飾 カナマイシン耐性カセットは、ファルマシア　バイオシステムズ　リミテッドデ ービー　アベニュー、シノールヒル。ミルトン　ケインズ、　ＭＫ５　８ＰＨ（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｉｍｔｅｄ。 Ｄａｖｙ　Ａｖｅｎｕｅ、　Ｋｎｏｗｌｈｉｌｌ、　Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅ ｓ、　ＭＫ５８ＰＨ）から購入された。この力’＋　ソトは、ファルマシアより ＥｃｏＲＩフラグメントとして供給され、これはＥｃｏＲＩフラグメントとして ＭＩ３ｍｐｌＱ中でクローン化された。内部のＨｉｎｄＩｌｌ［制限部位は、突 然変異誘発プライマーＢＢ８６６１　（５’　−ＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡ ＣＴＴＡＴＧＣＡＴＴ−３’　５ＥＱｔＤ　Ｎｏ　１７７　）を用いて欠損され た。この突然変異は、配列決定プライマーＢ８６０３８　（５’　−ＣＣＡＡＣ ＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣ−３’　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ＋７８）を用いて確認さ れた。 発現ベクターの再構築 ベクターは、クローニングのためのバックボーンとして、フィリップス　ペトロ レウム　ベクターｐＨＩＬＤｌを用いて、段階的手段で再構築された。 突然変異誘発されたフラグメントを含む発現ベクター再構築のために、修飾され た約７７０ｂｐ　５ａｃｌ−ＸｂａＩフラグメントは最初に、５ａＣ１−Ｘｂａ ｌ処理されたｐＨ［ＬＤｌベクター中に連結された。その後組換え構成物の完全 性は、制限分析およびオリゴヌクレ才チド配列決定プライマーＢＢ６０３７　（ ５’　−ＧＣＧＣＡＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＣ−３’　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　＋ ７４）用いるＤＡＮ配列決定分析によって確認され、その構成物は、中間体ベク ター■と呼された。次に、修飾された５ａｃｌ−３ａｃｌフラグメントは、Ｓａ ｃ［および子ウシ小腸ホスファターゼで処理された中間体ベクター１にクローン 化された。中間体ベクター２と称された結果どして生じた構成物は、制限分析お よび、欠損されたＨｉｎｄＩ［Ｉ部位を介して読むためにオリゴヌクレオヂト　 プライマー８８６２９６　（５°−ＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡＴＣＴ−３’ 　ＳＥＱ　Ｉｔ）　Ｎｏ　１７０）　、また最適化された５゛非翻訳リーダー領 域を介して読むためにＢＢ８７４０　（５’　−ＧＣＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴ ＧＣ−３’　ＳＥＱ　ｉＤ　Ｎ０１７２）を用いたＤＡＮ配列決定分析によって 、再び確認された。 中間体ベクター２は、好ましくないＨｉｎｄＩＩ［部位を欠き、最適化された５ ゛非翻訳領域を存し、残っているＨｉｎｄＩＩＩ部位を後にもつニス、セレビシ ェ　アルファ因子分泌シグナルをコードする配列を含み、調ｉ！！■に記載され た合成１、Ｄ７８のクローニングをさせうるＢａｍ８１部位３′からＨｉｎｄｎ Ｉ部位を有する。 突然変異誘発されたカナマイシン　カセットを含む１．２００ｂＰｔ（ｉｎｃ］ Ｉフラグメントは、（カナマイシン耐性遺伝子からＨｉｎｄｌＩＩ部位を除去す るために用いられた）　ＭＩ３ｍｐ１９突然変異誘発ベクターから除去され、中 間体ベクター２の唯一のＮａｅ　１部位中にクローン化された。そのベクターは ｐＬ）ＩＤ４と改名された。ｐＬＨＤ４の完全性は、制限分析によって確認され た。ｐＬＨＤ４の地図は、図１５ｂ中に示された。ｐｔ、ＨＯ２は、ニス、セレ ビシェ　アルファ因子分泌シグナルに融合したヒトＥＧＦを含む。 改良されたピンヤ発現ベクターの構築 野性型ＬＤ７８発現に対する改良された発現ベクターは、ｐＬ）１０４中ての、 ｐＳＷ６−　ＬＤ７８　（ｍ製２）の）ｌｉｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨ［フラグメ ントのクローニングによって構築された（この旧ｎｄ　ＩＩ　−Ｂａｍ）Ｉ　［ フラグメントは、ビシャ宿主からの分泌の後に、成熟ペプチドの遊離に要求され るＫＥＸ２開裂部位の上位を占める酵母アルファ因子の５つのアミノ酸をコート する配列の３゛末端に融合された合成ｔ、０７８遺伝子を含む）。 ＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントは、ニス、セレビシェ発現ベクター ｐＳＷ６−　ＬＤ７８の制限消化によって得られた。このフラグメントは、１． ５％低融点アガ０−スゲル上にて精製され、その後、子ウシ小腸ホスファターゼ 処理したｐＬＨＤ４．　ＨｉｎｄＩ［Ｉ　−ＢａｍＨＩに連結された。結果とし て生した組換え体は、ｐＬＨ２３と称された。 ベクターは、図１７に示される。その構成物の完全性は制限分析および配列決定 プライマーＢＢ５７６９　（５’　−ＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴ−３ ゜ＳＢＱ　１０　Ｎｏ　＋６８）を用いる配列決定分析によって確認された。 図１８は、ｐＬＨ２３の構成物についての計画を示す。 実施例１５９の改良されたベクターは、全ＬＤ７８変異体のための基礎的な発現 ベクターとして用いられた。ＬＤ７８変異体をコードするＤＮＡは、実施例１６ ．２．１１．５．２０．１８．１．１５および８に記載されたニス、セレビシェ から得られた。簡潔には、これらの種々の実施例からのプラスミドＤＮＡは、Ｈ ｉｎｄｌＩＩおよびＢａｍＨ１制限エントヌクレアーゼを用いて消化された。こ れは、ニス。 セレビシェ連結撃アルファ因子の最後の５つのアミノ酸をコートする配列に融合 されたＬＤ７８変異体をコードする配列を含むフラグメントを放出する。Ｈｉｎ ｄｌＩＩ／ＢａｍＨ［ＤＮＡフラグメントは、ｔ（ｉ　ｎｄ　ｍ　／　Ｂａｍｔ （Ｉ処理ｐｔ、Ｈ２Ｓに連結された。し１）７Ｂ変異体ど共に結果として生した ベクターは、下の表中に見られる。 これらの種々のプラスミ）・ための発現宿主は、実施例＋６１下に記載した方法 に従い構築される。 実施例＋６１−　ピン十発現系統の構築実施例１５８にて調製されたｐＬＨ１２ プラスミドＤＮＡは、制限エントヌクレアーゼＳａｃ　ｌを用いる切断によって 直線化された。これは、発現カセットか、発現カセットと宿主染色体上の配列の 相同組換えを介する組込みをすることを可能とした。その後直線化したプラスミ ドは、遺伝子型ｈｉｓ４を有するビー、パストリス菌株ＧＳＩ＋５（ＮＲＲＬ　 Ｙ−１５８５）中に形質転換された。菌株Ｇ５ｌｌ５は、この調製および発明一 般の使用においても決定的ではない。実施例えば、それぞれ遺伝子型ｈｉｓ４． 　ＡＯＸＩ　：　：ＡＲＧ４およびｈｉｓ４．　ｐｒｅｌ、　ｐｅｐ４を存する 菌株ＫＩＪ７１もしくはＳＭＤ１１６３のような、いずれの適切な菌株をも使用 しうる。菌株Ｇ５１１５およびＫＭ７１は、フィリップスの特許番号ＡＵ−８− ６３８８２／８６に記載されている。これらの宿主は、特許下でフィリップス　 ベトロレウス　カンパニー。 ハートレスヒル、オクラホマ、米国から入手しうる。 下記の方法を用いて、プラスミドＤＮＡは、宿主菌株に形質転換された。 簡潔には、酵母菌株Ｇ５１１５は、オービタル　シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ　 ５ｈａｋｅｒ）上、３０°Ｃにて、２００ｍ１のＹＥＰＤ培地中て一夜生育させ られた。Ａ、。。が０．１から０．３の間において、培養物は、５分間、３００ Ｏｒｐｍにおける遠心分離によって採取され、滅菌水中で洗浄され、再遠心分離 され、ＳＥＤ緩衝液（実施例の終りの付録Ａ）中で洗浄され、再遠心分離され、 １Ｍソルビトール中で洗浄され、回速、１＞分離され、２０ｍ１　ＳＣＥ緩衝液 中（付録Ａ）に再懸濁された。その後、細胞は、細胞壁を除去するため３０°Ｃ に酵素チモリアーゼとともにインキュベートされた。スフェロラスティング（ｓ ｐｈｅｒｏｐｌａｓｔｉｎｇ）は、約７０％の細胞がスフェロプラストに変わる まで続けられた。その後、これらは、緩和な遠心分離（７５０Ｘ　ｇ、　ｔｏ分 ）によって集められた。その後、スフェロプラスト（Ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ） は、１Ｍソルビトール中で洗浄され、６００ｍμＬ　ＣＡＳ緩衝液（添付物Ａ） 中に再懸濁された。その後、スフェロプラストの１００μＬアリコートは、１０ μｇの直線化されたＤＮＡとともに１０分間インキュベートされた。緩和な遠心 分離によるスフェロプラストの集取とＰＥＧ溶液の吸引の後、細胞は１５０μＬ のＳＯ３培地（添付物Δ）中に再懸濁され、２０分間インキュベートした。８５ ０μＬの１Ｍソルビトールの添加後、細胞は、再生アガロース上でのブレーティ ングのために用意された。その後、１００μしの形質転換されたスフェロプラス トは、１０ｍＬの溶解した（４２°Ｃ）アガロース−ソルビトール再生培地プレ ート上に添加され、アガロース−ソルビトール基礎プレート上に注がれ３０°Ｃ にて５−７日間生長させられた。 全ての酵母培地および形質転換培地は、付録中に記載されたとおりである。 ５〜７日後、形質転換体は、それらが生育されたアガロースオーバーレイ（ｏｖ ｅｒｌａｙ）とともに集められ、５０ｍ１遠心分離試験管に移され、５０ｍＭリ ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６に再懸濁され、アガロースから細胞を除去するだめ の、適切な混合および撹拌の後、それらは希釈され、濃度０と２．０００μｇ／ ｍＬ間の濃度で抗生物質Ｇ４１８を含有するＹＥＰＤ寒天プレート上に、プレー ト（ｐｌａｔｅ）された。宿主染色体に発現カセットのいくつかのコピーか組み 込まれた細胞のみか、それらの増強されたカナマイシン耐性によって、高レベル ・抗生物質上にても生育することがてきるてあろう。それらはまた、シＤ７８遺 伝子のいくつかのコピーを保持しているので、望ましい細胞とみなされる。以前 の研究は、そのような多コピー組込み体は、外来遺伝子が発現される条件下にお いて、高い生産者であることを示した（クラーレら（１９９１年））。プレート は、５−７日間、３０°Ｃにてインキュベートされた。その後、高濃度の抗生物 質を合作するプレート上に生じているコロニーは、採取され、新鮮なＭＤ寒天プ レート上にストリーク（ｓｔｒｅａｋ）された。単独コロニーは、３０°Ｃにて ３−４日生育の後に得られた。 宿主染色体上に組込んだ発現カセットのコピー数を決定するために、クラーレら （１９９１年）による記載に基づくサザン　ブロッティング技術が採られた。 簡潔には、染色体ＤＮＡは、形質転換された細胞から調製され、制限エンドヌク レアーゼＢｇｌＩ［を用いて消化された。結果として得られたＤＮＡフラグメン トは、ゲル電気泳動により分離され、エレクトロプロッティング（ｅｌｅｃｔｒ ｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりニトロセルロースに移された。その後、結果として 生したサザン　プロットは、発現カセット上のＤＮＡ配列の１つ（実施例えばＨ ＩＳ４）を認識する標識されたプローブとともにインキュベートされた。プロー ブはまた、宿主染色体上に存在するｈｉｓ４遺伝子の単独コピーをも認識するで あろう。未知多コピーシグナルと既知の単独コピーからのシグナルの強度の比較 により（比重走査による）、存在するコピーの数の定量か可能である。 正に同じ方法が、形質転換および実施例１６０に記載されたし０７８変異体発現 ベクターからの発現菌株の構築のために採られた。 実施例１６２−　ピンヤ　パストリス中のｗｔ　Ｌ０７８の発現野性型発現宿主 は、実施例１５８中に記載されたｐＬＨ１２を含んだ。 形質転換された菌株の単独コロニーは、５ｍｌの８＋１１ＧＣ培地（添付物Ａ） を接種するために用いられ、その培養物は、オービタル　ンエーカー　上で３０ °Ｃにて一夜生育させられた。その後、この５ｍｌの一夜生育させた培養物は、 ５０ｍ１の培地ＢＭＧＣを合作する２しの流れを調節された振どうフラスコに接 種するために用いられた。オービタル　インキュベータ−（ｏｒｂｉｔａｌ　１ ｎｃｕｂａｔｏｒ）上、３０°Ｃて、２４ｈ生育の後、細胞は、５分間、３００ ０ｒｐｍての遠心分離によって採取され、５０ｍ１のＢへ１ｌｔｌｃ　（添付物 Ａ）に再懸濁された。これは、ＡＯＸ　ｌ　プロモーターから遺伝子発現を誘導 させた。誘導は、４８〜７２時間、３０°Ｃにて培地を含むメタノール中におけ る生育によって行われた。 ４８時間および７２時間のいずれの培養上清も、細胞を除去するために、５分間 、３０００ｒｐでの遠心分離によって集められた。 この上清は、調製３および４に記載された方法によるさらなる分析と、ＬＤ７８ の精製に用いられた。この方法を用いて産生された野性型ＬＤ７８のレベルは、 ＨＰＬＣによって決定されるように典型的に３〜５Ｂ凡である。 そのようなレベルは、産生ずる菌株をファーメンタ−（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）中 て生育させることによって改良されつる。単独コロニーは、５ｍｌ　ＭＤ培地（ 添付物へ）中に接種され、オービタルインキュｌベーター中、３０°Ｃて一夜生 育させた。その後、この培養物は、２Ｌの流れを調節されたフラスコ中５００ｍ １のＹＥＰブリセロール培地（添ｆ寸物Ａ）に接種するために用いられた。この 培養物は、２４〜４８時間生育させられ、ファーメンタ−に接種材料として用い られた。５Ｌファーメンタ−は、３．５Ｌの高細胞密度（ＨＣＤ）培地（添は物 Ａ）とともにオートクレーブされた。アンモニア溶液を用いたｐＨ５，８５への 調整、および１０ｍ１の微量元素液［ＰＴＩＪ、、　（添付物Ａ））の添加の後 、ファーメンタ−は、上記培養物を用いて接種された。生育条件は典型的には、 ｐＨ５，８５（要時アンモニア溶液の添加によって維持される）、２９．８°Ｃ Ｃ５８０１２０ｏｒｐ、　ｌｌ−２ｖｖ　ａｉｒ、　２０−１００％ＤＯＴであ る。２０−２４時間後、培地中の炭素源は使い尽くされ、メタノール　フィー１ ”（５ｍＬ／Ｌ微量元素溶液ＰＴ！Ｊ、および２ｍＬ／Ｌビオチン　保存溶液を 含む、０２ｇ／いは、３．４ｇ／ｈにて開始された。２４−３０時間後、フィー ルド速度は、およそ２０ｈの間て６ｇ／ｈに増加された。この後、フィールド速 度はブロス（ｂｒｏｔｈ）中の残存メタノール濃度を１〜１０８／Ｌ（ガス　ク ロマトグラフィーによって決定されたように）の間に維持するように増加もしく は減少された。発酵は、７０−１８０時間続けられ、ブロス中の野性！ｕ　ＬＤ ７８レベルは、ＨＰＬＣによって６〇−１００ｍｇ／Ｌと決定された。 ピンヤ発現系を用いて産生された物質は、サラカワミセスによって産生された物 質に対して適用された技術を用いて精製され、特徴つけされた（調製３，４およ び１３参照）。 実施例１６３−　促進された非多量体化された変異体の発現実施例＋６０に記載 されたような非多量体化された変異体についての発現構築物は、実施例１６１の 方法に従ってビシャ宿主菌株Ｇ５ｌｌ５中に導入された。一般的に、非多量体化 された分子梨を生しるＬＤ７８遺伝子の変異体は、野性型ＬＤ７８分子よりも培 養物上清中に高レベルの発現をもたらすことか示された。 実施例１６２に記載されたように、振どうフラスコ中誘導における発現レベルは 、野性型ＬＤ７８分子について、３−５ｍｇルと決定された。非多量体化された 変異体の組み込まれた発現カセットを含む産生菌株が、実施例１５７に記載され るように生育された場合、発現レベルは、５０−２００ｍｇ／Ｌ　（特に変異体 ２６（ＬＤ７８　Ｇｌｕ２８、Ｇｌｕ４７）−１５８ｍｇ／Ｌ、変異体２　（Ｌ Ｄ７８　Ｇｌｕ４４．Ｇ１ｎ４５）−７６ｍｇ／Ｌ、変異体１５（ＬＤ７８　Ｇ ｌｕ４７）−６３ｍｇ／Ｌ、変異体５　（ＬＤ７８５ｅｒ１７）−７９ｍｇ／し 、変異体３０（ＬＤ７８５ｅｒ１７．Ｇｌｕ１８）−１３８ｍｇ／Ｌ、変異体２ ８（ＬＤ７８　Ａｒｇ２９）−１６９ｍｇ／Ｌ）の大きさまで上昇されるのが見 られた。この現象は、ピンヤ系に限らず、サツカロミセス系についても示された （実施例＋５６および１５７） 非多量体化された変異体発現カセットを含む産生菌株が、ファーメンタ−中で生 育させられた場合、発現レベルは再び促進される。グリセロール保存培養物は、 ２Ｌの流れを調整された振どうフラスコ中て５００ＪのＹＥＰ　２Ｌのグリセロ ール培地に接種するため用いられた。これは、オービタル　シェーカー中、３０ °Ｃにて＋８−２４時間生育された。この培養物は、ファーメンタ−について、 接種材料として用いられた。５Ｌファーメンタ−は、実施例１６２に詳述された ように調製された。バッチ相炭素が使い尽くされた後、制限グリセロールフィー ド（５００ｇ／Ｌグリセロール、　５ｍＬ／Ｌ微量元素ＰＴＭ、、　２ｍＬ／Ｌ ビオチン保存溶液−０，２ｇ／いか開始され、１４ｇ／ｈて３−６時間続けられ た。その後、グリセロールフィート速度はｌＯｇ／ｈに減じられ、メタノールフ ィード（５ｍＬ／Ｌ　微量元素ＰＴＭ、および２ｍＬ／Ｌビオチン保存溶液０． ２ｇ／ｌ添加メタノール）が５［ｉ／ｈにて開始された。合計して７５時間の経 過した発酵時間の後、メタノールフィードは、最終フィード速度３０ｇ／ｈに達 するまで時間とともに指数関数的に増加された。 この周期の際生育条件は、実施例１６２に詳述されたと通りであった。この過程 は、野性型ＬＤ７８分子の６０−１００ｍｇ／Ｌと比較して、発酵ブロス中への 、非多量体化された変異体２６（ＬＤ７８　Ｇｌｕ２８．ＧＩｕ４７）の１．５ ｇルの産生を生じた。明らかに、発現レベルは、宿主染色体へ組み込まれた発現 カセットの数に依存する。野性型のそれと非多量体化した変異体の発現レベルと を比較するために、コピー数における差が考慮されなけらばならない。変異体２ ６産生菌株に対して４２であるのに比較して、野性型ＬＤ７８産生菌株は、発現 カセットの４コピー有する。しかし、この差を考慮しても、変異体２６は予想さ れたレベルよりも高く産生される（野性Ｖについて０．７５−１．２５ｍｇ／Ｌ ／ｃｏｐｙに対して３．１ｍｇ／Ｌ／ｃｏｐｙ）。 このファーメンタ−中での非多量体化された変異体の促進された発現の現象は、 またサツカロミセス系でも観察された（実施例１５７参照）。 ＬＤ７８の生物学的活性における変異の効果は、始めに、それらのマウス幹細胞 系ＦＤＣＰ細胞混合物（Ａ４細胞）がら放射性標識ＬＤ７８を置換する能力を測 定することにより、評価された〔デクスター（Ｄｅｘｔｅｒ）ら、ジエイ、エク スブ、メト、　（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　）　１５２１０３６　（１９８０ ）　）。Ａ４　ＦＤＣＰ細胞混合細胞系は、パダーリンキャンサー　リサーチ　 インスティチュート、デパートメントオブ　へマトロジー、ウィルムスロー　ロ ード、マンチェスター、ｌｉ！２０９Ｂχ、英国（Ｐａｔｅｒｓｏｎ　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　［ｎ５ｔｉｔｕｔｅ。 Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、　Ｗｉｌｍｓｌｏｗ　 Ｒｏａｄ、　Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｍ２Ｏ９ＢＸ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎ ｇｄｏｍ　）から依頼により入手可能である。 試験手順は、以下のとおりＦＤＣＰ−混合Ａ４細胞は、使用前日に１−２Ｘ　１ ０’／ｍｌ　（通常２−４倍）となるよう、新鮮な生育培地で希釈される。試験 当日、細胞は計算され、その後、遠心分離によって採取される。無血清培地て一 回、結合培地で一回の洗浄の後、細胞は、結合培地（ＲＰＭＩ　１６４０＋２０ ｍＭ　ＨＥＰＥＳ＋１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）中、５ｘ　１０’／ｍｌに再び濁さ せた。２００μｌの細胞上清は、エノベントルフ試験管にピペットて移され、そ の後２５μｌの非標識競合物か加えられ、１０倍の要求された最終濃度に仕上げ られ、２５μｍ漂識も同じ方法で調製される。使用される標識されたりガントの 最終濃度は、０．５ｎＭすなわち３．８５ｎｇ／ｍｌである。 試験管は、室温で２時間、懸濁ミキサー上でインキュベートされる。その後、１ ｍｌの冷ＰＢＳか加えられ、その試験管は２００’Ｏｒｐｍで遠心分離された。 ２倍量のＰＢＳ中での洗浄の後、細胞は、最終的にバイアルに移され、パラカー ド　コブラ　オート−ガンマ（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｏｂｒａ　Ａｕｔｏ−Ｇａｍ ｍａ）計数装置を用いる計数によって、放射活性か測定される。試験は、三つ組 で行われ、過剰の非放射性ＬＤ７８もしくはＬＤ７８変異体の存在下、”　’　 Ｉ−ＬＤ７８の結合か、非放射性物質の非存在下における結合と比較された。 ＬＤ７８もしくはＬＤ７８変異体は、結合培地中、ある範囲の濃度を提供するよ う希釈された。一連の手順において、試験中での１０倍希釈となり、”　’　［ −ＬＤ７８の濃度がそれぞれ１００倍および１ｏ倍である非放射性物質の濃度を 生じる、３．８５μｇ／ｍ！および０．３８５μｇ／ｍｌの濃度か調製された。 ”　’　［−ＬＤ７８は、アマジャム　ピーエルシー（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｌ ｃ、）によって調製された。選択された変異体のより詳細な特徴づけについて、 詳細な投薬応答曲線を構築するため０．　Ｏｌ−１１００ｎ／ｍｌの試料濃度の 範囲が採られた。試験間の比較を確実にするため、ＬＤ７８変異体の活性は、Ｉ Ｃｓ。値に基づき野性型活性の百分率として表現された。野性型ＬＤ７８は、常 に、対照として含まれた。その後、野性型活性が１００％、野性型のＩＣ，。の １０倍のＩＣ，。を有する変異体が１０％として（すなわち受容体にｌ／１０程 度結合）、また野性型のＩＣｓ。の１／２のＩＣ，。値を有する変異体が２００ ％として、（すなわち受容体に２倍程度結合）表現された。 ５３のＬＤ７８変異体対する受容対結合データは、それらの多量体化状態に関す る適切な物理科学的データの要約とともに表２に示される。 （以下余白、次頁につづく） 表２ ＳＣ［変異体の生物学的活性 変異体　残基　変　異　ネイティブ　ば　構造　受容体結合　％酊間、陶　ゲル 上の　汗均〕 大きさ ０　い７１１　ＷＴ　１６＋）　引　１　ｍ１４８ＧＩｎ＞Ｇｌｕ大？ｏｗ＋２ ２　４４　Ｌｙｓ＞　Ｇｌｕ　小　１６　０　４　５４５　Ａｒｇ＞　ｃｌｎ ５　１７　Ａｒｇ＞Ｓｅｒ　混合　５７．５　Ｔ／Ｄｏ　２　δｔｏ　２６　Ａ ｓｐ＞＾１ａｚｌＸ３５　Ｔ　ｌ　７７．４ＩＩ　１２　Ｐｈｅ＞Ｇｌｎ　ｉ足 台　９８　Ｔ／［）ｏ　ｌ　３４２６　２８　Ｐｈｅ＞Ｇｌｕ小　＋６　０　４ 　１４７　Ａｒｇ＞　Ｇｌｕ ７３　２ｇ　Ｇｌｕ＞Ａｒｇ小　Ｔ２７７２９　１８　Ｇｉｎ＞　Ｇｌｕ小　１ ３０　Ｄｏ　１３０　１７　Ａｒｇ＞Ｓｅｒ小　４１　Ｔ　３　４．２１８　Ｇ Ｉｎ＞　Ｇｌｕ ３５　−３　）Ｌｅｕ　Ｍ　１％　Ｖｉｔ　４　３１　５ｅｒ）　Ｐｒ。 ３８　Ｇｌｙ＞　５ｅｒ ４６　Ｓｅｒ＞　Ｇｌｙ ３；７　５　Ａｓｐ＞５ｅｒＷＴ　Ｗｔ　ｌ　４５３８　２４　１１ｅ＞ＡＩａ ＷＴ　Ｗｔ　Ｉ　５０４０　２９　Ｇｌｕ＞５ｅｒＷＴ　４ ４２　４４　Ｌｙｓ＞Ｓｅｒ小　４５　τ／Ｄｏ　１　１８４３　４５　Ａｒｇ ＞Ｓｅｒ小　２５Ｔ３４５　５２　Ａｓｐ＞Ｓｅｒ　ＷＴ　４４８　６０　Ｌｙ ｓ＞５ｅｒＷＴ　１ ５２　６６　Ｇｌｕ＞　Ｓｅｒ犬　２７　Ｔ　ｌ　１６１．５５４　＋　Ｓｅｒ ＞Ａｌａ　ＷＴ　Ｉ　１４５６０　８　Ｔｈｒ＞Ａｌａｌ’ｌＴ　１６２　１３ 　Ｓｅｔ＞Ａｌａ大　３７０　ｗｔ　＋　５ｓ６３　１６　Ｓｅｒ＞ＡｌａＷＴ 　３ ６４　１８　Ｇｉｎ＞Ｓｅｒ大　２００　Ｗｌ　４６６　２７　Ｔｈｒ＞Ａｌａ Ｗｒ　２　４７６８　３５　Ｓｅｒ＞ＡｌａＷＴ　’ｌｔｔ　ｌ　１２５表２つ づき 変異体残基　変　異　ネイティブ　ＡＩＤ　構造　受容体結合　％酊Ｎｏ、　Ｎ ｏ、　ゲル上の　呼均〕 大きさ ７０　４８　Ｇｉｎ＞Ｓｅｒ　混合　２７１　５３　Ｐｒｏ＞ＡｌａｌｖＴ　３ ７５　６７　Ｌｅｕ＞ＡｌａＷＴ　＋ ｎ　１２　Ｐｈｅ＞Ａｌａ小　１５０　３７９　１５　Ｔｈｒ＞　Ａｌａ小　１ ８０　１８２　Ｚ！　Ａｓｎ＞５ｅｒＷＴ　１ ８４　２５　Ａｌａ＞５ｅｒＷｒ　＋ ８５　２８　Ｐｈｅ＞Ａｌａｉ’ｌＴ　３８７　３１　Ｓｅｒ＞ＡｌａＷｒ　３ ９４　４２　Ｌｅｕ＞ＡｌａＷｒ　１ ９７　５１　Ａｌａ＞　Ｓｅｔ　混合　２１０１　２６　Ａｓｐ＞Ａｌａ　Ｗｒ 　２２９　Ｇｌｕ＞　Ａｒｇ ＋０２２６　Ａｓｐ＞　Ａｌａ小　４ ２９　Ｇｌｕ＞　Ａｒｇ ４７　Ａｒｇ＞　Ｇｌｕ 手引き：ＡＵＣ”分析的超遠心分離（ＫＤａ）受容体結合　ｌ＝野野性 ２＝１／１０　ｔｏ　Ｉ／２　Ｗｔ ３＝１／１００−１／１０　Ｗｔ ２０４＝不活性 Ｔ＝４量体 Ｔ／ＤＯ＝　４量体／１２量体　平衡 Ｄ＝２量体 ＷＴ＝野性型 この分析から次の事実が明らかになる １）野性型もしくは最小限に影響された多量体化の性質を有する変異体の大部分 は、野性型もしくは野性型に近い受容体結合を示す。 ２）明らかな変異体のサブセットが存在し、しかし、大きさに関し野性型は、受 容体統合について、野性型ＬＤ７８と競合しうるそれらの能力において影響され る。これらの変異体における変異はおそらく、受容体との相互作用に含まれる残 基を明確にする。これらの重要な残基は、Ｌｙｓ−４４、Ａｒｇ−４５，Ａｒｇ −１７，Ｇｌｎ−１８，Ｐｈｅ−２８およびＧｌｕ−２９を含む。 ３）非多量体化された変異体のほとんとか、受容体結合に含まれるらしい。これ は、多量体化に含まれる残基はまた受容体結合に含まれ、受容体結合はＬＤ７８ の多量体化型を要求することを意味する。野性型受容体結合活性は、４量体より 小さい変異体には見られなかった。これは、図１９に要約される。番号は、それ ぞれの分類に見られる変異体の番号を対象とする。４量体と１２量体の間に横た わる変異体は、２つの状態の間の平衡を表す。 ４）ＬＤ７８のＮ末端か延長された変異体は、受容体結合についての大いに減少 された競合能を示す。驚いたことに、これらは変異体＃３５（国際出願　第９１ ０４２７４号）および変異体＃３４（日本特許出願　第０３２２８６８３号）中 におけるように以前記載されたＬＤ７８の梨を含む。対照的に、Ｎ末端残基の欠 失は、受容体結合における最小限の効果を有するらしい。文献〔プラグネル（Ｐ ｒａｇｎｅｌｌ））ら、シーアールシー　ビートソン　ラボラトリーズ　サイエ ンティフィック　レポート（ＣＲＣＢｅａｔｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔ）　、ビートソン　インステイテユート ７ｔア　カンサー　シサーチ（Ｂｅａｔｏｓｏｎ　［ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）　、　ス コツトランド（Ｓｃｏｔｌａｎｄ））に記載されたその池のＮ末端型は、本願に 記載された酵母発現系中に発現されない。 ５）ＬＤ７８模型の表面上の２つの定義された領域に対する受容体結合地図に含 まれる残基は、上記された。一つの領域はＮ末端セリン側に位置し、残基４４− ４８（Ｌｙｓ−Ａｒｇ−４４−４８（Ｌｙｓ−Ａｒ付近のβ−ターン中の残基を 含む。 同時に、これらのデータは、ＬＤ７８の活性型は４量体であることを示唆する。 図２０は、受容体結合に含まれる残基の劇的な群を示す、４量体ＬＤ７８の模型 の概要を示す。このＬＤ７８構造と機能の模型において、２量体間界面ての変異 は、活性な４量体種の形成を分裂させることにより、間接的に受容体結合におけ るそれらの効果を及ぼす。この模型の第２の示唆は、Ｎ末端延長されたＬＤ７８ の型は、少なくともＡ４細胞上に存在する受容体に関して、おそらく不活性な分 子のプロ型（ｐｒｏｆｏｒｍ）であろうということである。これらの結論の双方 ともが、従来技術の観点から驚くべきことであった。国際出願　第９１０４２７ ４において、彼らか記載するＬＤ７Ｂ型のＮ末端は、明確にされなかった。その 物質は、おそらくそれらのコロニー形成のイン　ビトロ試験中に存在するタンパ ク分解酵素による過程の結果物としで、もしくは使用された物質の高濃度の観点 からも、明らかに生物学的に活性であった。 分子のＳＣＩファミＩＪ−の活性種は、推測のだめの事柄であるが、最近、ＬＤ ７Ｂに対して活性種が単量体であることが主張された〔マンテル（Ｍａｎｔｅｌ ）ら、（１９９２）、ロンク、ジット、（Ｉｏｃ、　ｃｉｔ。 ）〕。これは、イー、コリ由来ＬＤ７８が、３０％アセトニトリル、０．１％Ｔ ＦＡ中て非凝集てあり、造血系前駆体ＢＦｔＪ−ＥおよびＧＭ−ＣＦＣ細胞上で の種々のイン　ビトロ　コロニー形成単位試験において、１０００倍以上活性で あるという観察に基づいていた。我々は、この大きな相違は、凝集したイー、コ リ由来物質の活性についての問題を反映するどのみ推測しつる。 変異体１０（実施例７）がマウス１２日目ＣＰＵ−５細胞コロニーの形成を阻害 する能力は、以下の方法に従ってイン　ビトロ゛Ｃ測定された。活性は、慣造お よび受容体結合に関して野性型である変異体　番号８２（実施例９４）のそれと 比較された。 １２０口ＣＦＵ−３細胞は、正常マウス骨髄細胞から、ロード（Ｌｏｒｄ）とス プーンサー（Ｓｐｏｏｎｃｅｒ）　（１９８６年）リンフ才力イン　リサーチ（ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）５：５９−７２中に記載されたよう に選別された。選ｚＩＩされた細胞（５００−１０００の間）は軟寒天中にプレ ートされ、“ヘモボイエシス　−　ア　プラクティカルアプローチ（Ｈａｅｍｏ ｐｏｉｅｓｉｓ　−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）”　３７頁　 アイアールエル　ブレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）　（テスタ（Ｔｅｓｔａ）とモ リ　・ネックス（Ｍｏ　ｌ　１ｎｅｕｘ）編〕中、ヘイワース０（ｅｙｗｏｒｔ ｈ）とスプーンサー（Ｓｐｏｏｎｃｅｒ）（１９９２年）に記載された方法に従 って、そのコロニー形成能について試験された。 成長因子は、Ｌ細胞およびＡＰＩ−１９Ｔ細胞の条件付された培地から供給され た。それぞれの条件付された培地は、プラグネルら（１９８８年）、ブラット（ Ｂｆｏｏｄ）　７２号、！９６−２０１頁に記載されたように１０％にて用いら れた。しＤ７８変異体ｌＯもしくは８２は、１０μｌのＰＢＳ中、トップ（ｔｏ ｐ）寒天に１５０ｎｇ／ｍ１．１５％ｇ／ｍｌ、　１．５１ｇ／ｍｌもしくは０ ．１５％ｇ／ｍｌにて添加され、ｔｅｈプレートを介して拡散された。その後、 プレートは、１４日間５％島５％Ｃｏｔ中、３７°Ｃにてインキュベートされた 。コロニーは、倒立顕微鏡を用いて計数された。全ての試験は、三つ組にて行わ れた。調製１から４のし０７８野性型タンパク質の１５０ｎｇ／ｍｌおよびＰＢ Ｓが、この実験において対照として用いられた。 結果は、キャリアーＰＢＳ単独で処理された対照の百分率として表された。この 試験中で用いられた変異体ＩＯは、１．５ｎｇ／ｍ１以下の濃度においても、１ ２日目ＣＦＵ−３細胞についてのコロニー形成を阻害しつる。変異体１０（図２ ４）および８２（図２５）ともに、１５％ｇ／ｍｌにおいて、最適阻害剤と同様 の効力を示す。これは、非多量体化された変異体は、受容体への結合と同様に機 能的な効果を及ぼしうることを示す。 （以下余白、次頁につづく） 添付物Ａ リットル当たりの量 リン酸ナトリウム緩衝液Ｉ　Ｍ、　ｐＨ６１００ｍＬカサミノ酸（ｌｏｏｇ／Ｌ ）　１００ｍＬ酵母窒素原基礎培地（１３，４ｇ／Ｌ）　＋　００ｍＬグリセロ ール　１００ｍＬ フィルター減菌 ＭＭＣ グリセロールを５ｍＬメタノールで置換する以外は上記の通りである。 ＥＰＤ 酵母抽出物　１０ｇ／Ｌ ペプトン　２０ｇ／Ｌ グルコース　１０ｇ／Ｌ 固体培地のために１５ｇ几寒天を添加 １５分間、１２１°ＣにてオートクレーブＹＥＰグリセロール グルコースをグリセロールで置換する以外は上記の通りである。 ）（ＣＤ Ｈ，ＰＯ，（８５％）　２１ｍＬ／Ｌ ＣａＳＯ４・Ｈ２Ｏ０，９ｇ／Ｌ Ｋ２Ｓ０．　１４．２８ｇ／Ｌ 八Ｉｇｓへ４−７Ｈ２０１１，７ｇ／ｌ調製時、ｐＨは約１．７゜ファーメンタ −中、アンモニア溶液にてｐＨを４にする（滅菌の前に）。ファーメンタ−中、 滅菌を行ない、インキュベーション前にアンモニアにてｐＨを５．８５にする。 ファーメンタ−中、３．５Ｌの培地に１０ｍＬの以下の微量元素溶液（ＰＴＭ、 ）を添加する。 Ｃｕ５Ｏ，・５ＨｔＯ６ｇ几 Ｋｌ　Ｏ，８ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈｔｏ　３．　Ｏｇ／Ｌ ＮａＭＯ０４’　２Ｈ！０　０．２ｇルＨｚＢＯ＊　０．０２ｇ／Ｌ ＣｏＣ１ｔ　Ｈ６ＨｔＯＯ，Ｓｇ／Ｌ ＺｎＳＯ＊　２０ｇ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４５ｍＬル ＦｅＳＯ４・７ＨｔＯ６５ｇ／Ｌ ビオチン　０．２ｇ／Ｌ Ｄ 酵母窒素原基礎培地　１３．４ｇ／Ｌ ビオチン　０．４ｇ／Ｌ グルコース　２０ｇ／Ｌ フィルター滅菌 図体培地のために１５ｇル寒天を添加 ＥＤ ソルビトール　ＩＭ Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ８）２５ｍ　ＭＤＴ７　５０ｍＭ（使用直前に添加） ＣＥ ソルビトール　ＩＭ ＥＤＴＡ　ＩＭ クエン酸ナトリウム緩衝液ｐ）１５．８　１０ｍ　ＭＡＳ ソルビトール　ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ７，５１０Ｍ ＣａＣ１，１０ｍＭ ＰＥＧ溶液 Ｐ　Ｅ　Ｇ　３３５０　２００ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ７，５１０ｍＭ ＣａＣ１ｚ　ｌ０ｍＭ 新鮮に調製し、フィルター滅菌する。ｐＨが７以下となれば捨てる。 ＯＳ ソルビトール　ＩＭ ＹＥＰＤ　ｘＯ，３ ＣａＣ１ｚ　１０ｍＭ 再生培地（ＲＤ） ソルビトール　１８６ｇ／Ｌ アガロース　ｌｏｇ／Ｌ グルコース　２０ｇ／Ｌ 酵母窒素原基礎培地　１．３４ｇ／Ｌ ビオチン　４００ｇ／Ｌ ヒスチジン試験培地　２ｇ／Ｌ グルタミン酸　５０ｍｇル メチオニン　５０ｍｇ／Ｌ リジン　５０ｍｇル ロイシン　５０ｍｇ／Ｌ イソロイシン　５０ｍｇ／Ｌ ディフコ　リミテッド 基礎プレートのためにアガロースを２０ｇルにて使用（以下余白、次頁に続く） 添付の参照文献 クラーレ（Ｃ１ａｒｅ）ら、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯ ＧＹ）９巻、　４５５−４６０頁、（１９９１年）’）ラ−Ｌ／う、ジエイ、パ イオル、ケム、（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６４巷、　１Ｂ９０７−１ ８９１１頁、　（１９８９年）クラ−しら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ）２９巻、　１６８９−１６９６頁、（１９９０年） クラーレとグローネンボーン（Ｇｒｏ口ｅｎｂｏｒｎ）、ジエイ０モル。 ハイオル、（Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、）、（１９９１年）グリース（Ｇｒｅ ｅｊｈ）とバーディング（［（ａｒｄｉｎｇ）、ジエイ、ノ＜イオケム　バイオ フイズ、メ′パッズ（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、λＩｅｔｈｏ ｄｓ）７巻、　２５−３４頁、（１９８２年）グリースとベイン（Ｐａｉｎ）、 ブロッグ、バイオフイズ１モル。 パイオル、（Ｐｒｏｇ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｏ１．　Ｒｉａｌ）１７巻、　 ２＋７−２８７頁、（１９６７年） ドツト・ノン（Ｄｏｄｓｏｎ）、ミーティング　アブストラクト（Ｍｅｅｔｉｎ ｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔ）、プロスペクツ　イン　プロティン　エンジニアリング （Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、グ ローニンゲン（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）、スイス、４９−５３頁、　（１９Ｂ９年 ）グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、ネイチャー　（ｔ４ａｔｕｒｅ）（ロンドン） 、３４４巻、４４２−頁、　（１９９０年） グローネンボーンとクローレ、プロティン　エンジニアリング（Ｐｒｏｊｅｉｎ 　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、　４巻、　２６３−２６９頁、（１９９１年）バ ーディングら編、アナリティカル　ウルトラセントリフユケーション　イン　バ イオケミストリー　アンド　ポリマーサイエンス（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌｌ ｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａ ｎｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ）、　ｏイヤル　ソサイエテイー　オブ ケミストリー　プレス（Ｒｏｙａｌ　５ｏｃｉｅ４ｙ　ＯｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ 　ＰｒｅｓＳ） ラコビッツ（Ｌａｃｋｏｗｉ　ｔｚ）、プリンシブルズ　才ブ　フルオレッセン ス　マイクロスコピー（Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ブレナム、パブ、（Ｐｌｅｎｕ＋ｎ、　Ｐｕｂ、Ｘニ ューヨーク）、　（１９８３年） ロード（Ｌｏｒｄ）ら、ブリット、ジエイ、ヘマトル（Ｂｒｉｔ、　Ｊ、　Ｈａ ｅｍａｔｏｌ、　）、　３４巻、４４１−巻、（１９７６年）ロードとライト（ Ｗｒｉｇｈｔ）、ブラッド　セルズ（Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ）、６巻、５８１ −頁、（１９８０年）マンテル（Ｍａｎｔｅｌ）ら、エクスブト、ヘマトル（Ｅ ｘｐｔ、　ｌ（ａｅｍａｔ。 １、）２０巻：　Ｎｏ、３６８．８００ｐ頁、（１９９２年）マヨ（Ｍａｙｏ） とチェノ（Ｃｈｅｎ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　５ｔｒｙ）、 ２８巻、　９４６９−９４７８頁、　（１９８９年）ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、 バイオヒム、バイオフィズ、アクタ（Ｂｉ。 ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、３７９巻、　３７９−３８４頁、 （１９７５年）モルガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら、ベックマン　オブティマ　エック スエル−ニー　テクニカル　ビュレティン（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＯＰＴ［ＭＡＸＬ −ＡＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎｄ）、（１９９２年）オー（Ｏｈ） ら、ジエイ、イムノロジー〇、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１４７巻。 ２９７８−２９８３頁、（１９９１年）プロヘンチャー（Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ ）、フンビュート、フィズ、コミュ、（Ｃｏｍｐｕｔ、　Ｐｈｙｓ、　Ｃｏｍｍ ｕｎ、）、２７巻、　２２９−２４２頁、（１９８２年）プロペンチャーとグレ ノクナ−（Ｇ　ｌ　ｏｅｃｋｎｅｒ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ）、　２０巻、　３３−３７頁、　（１９８１年）ノヤル（Ｓｃｈａｌ ｌ）、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、　３巻、　１６５−１８３頁２（１ ９９１年） シェリー（Ｓｈｅｒｒｙ）ら、ノエイ、エクスブ、メッド、（，１，εＸｐ、八 （ｅｄ、　）、　１６８巻、２２５＋−頁、（１９８８年）エステイ−チャール ズ（Ｓｔ、　Ｃｈａｒｌｅｓ）ら、ジエイ、ノ１イオル　ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、）、２６４巻、　２０９２−２０９９頁、（１９８９年）ストリ ックラント（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ）、　ノー、アール、シー、クリット、レブ 、ハイオケム、（Ｃ，Ｒ，Ｃ，Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）。 ２巻、＋３３−１７５頁、　（１９７４）ウィングフィールド（Ｗｉｎｇｆ　１ ｅｌｄ）ら、ニー咀　ジエイ、バイオケム（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）、１７３巻、　６５−７２頁、（１９８８年）特許番号ＡＵ−８−６３８８２ ／８６ つすパブ（Ｗｏｌｐｅ）とセラミ（Ｃｅｒａｍｉ）、ｘ−フエーエスイービー（ ＦＡＳＥＢ）、ジエイ（Ｊ）、　３巻、　２５６５−２５７３頁（１９８９年） イパンティス（Ｙｐｈａｎｔｉｓ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉ ｓｔｒｙ）、　３巻、　２９７−３１７頁、　（＋９６４）（以下余白、次頁に 続く） 配列リスト （１）一般的情報： （ｉ）出願人。 （Ａ）名前−ブリティソシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド（ＢｒＮｉｓ ｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）　（非米国）（Ｂ）街、 ウォトリントンロード（Ｗａｔｌｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ）（Ｃ）市・カウリー 、オックスフォード（Ｃｏｗｌｅｙ、　０ｘｆｏｒｄ）（＋）出願人 （Ａ）名前・クレイグ、スチュワード（ＣＲＡＩＧ、　Ｓｔｅｗａｒ＋）　（米 国のみ） （Ｂ）街　ブリティッンユ　バイオ−テクノロジー　リミテッド、つオドリント ンロード（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔ、１ｍ１ｔｅｄ、 　Ｗａｔｌｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ）（Ｃ）市：カウリー、オックスフォード（ Ｃｏｗｌｅｙ、　０ｘｆｏｒｄ）（Ｅ）国、イギリス （Ｆ）郵便番号（２ＩＰ）　：　ＯＸ４５ＬＹ（１）出願人： （Ａ）名前：ハンター、ミカエル　ジョーク（ＨＵＮＴＥＲ，ＭｉｃｈａｅｌＧ ｅｏｒｇｅ）　（米国のみ） （Ｂ）街；ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド、ウォトリント ン　ロード（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙしｊｍｉｔｅｄ、 ＷａｔＬｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ）（Ｃ）市：カウリー、オ・ツクスフオード（ Ｃｏｗｌｅｙ、０ｘｆｏｒｄ）（ε）国：イギリス （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＯＸ４５ＬＹ（ｉ）出願人： （Ａ）名前：エドワード、リチャード　マーク（εＤＷＡＲＤＳ、　Ｒｉｃｈａ 「ｄん１ａｒｋ）　（米国のみ） （Ｂ）街：ブリティッンユ　バイオ−テクノロジー　リミテッド、ウォトリント ン　ロード（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄ、 　Ｗａｔｌｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ）（Ｃ）市二カウリー、オックスフォード（ Ｃｏｗｌｅｙ、　０ｘｆｏｒｄ）（Ｅ）国、イギリス ＣＦ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＯＸ４５ＬＹ（１）出願人： （Ａ）名前：ツァブレウスキー、ロイド　ジョージ（ＣＺＡＰＬＥＷＳＫｌ、Ｌ ｌｏｙｄ　Ｇｅｏｒｇｅ）　（米国のみ）（Ｂ）街：ブリティッシュ　バイオ− テクノロジー　リミテッド、ウォトリントン　ローＦ（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ −ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄ、　Ｗａｔｌｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ） （Ｃ）市：カウリー、オツクスフオード（Ｃｏｗｌｅｙ、　０ｘｆｏｒｄ）（Ｅ ）国；イギリス （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＯＸ４５ＬＹ（１）出願人： （Ａ）名前：ギルバート、リチャード　（ＧＩＬＢＥＲＴ、　Ｒｉｃｈａｒｄ） （米国のみ） （Ｂ）街：ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド、ウヤトリント ン　ロード（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄ、 　Ｗａｔｌｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ）（Ｃ）市：カウリー、オックスフオード（ Ｃｏｗｌｅｙ、　０ｘｆｏｒｄ）（Ｅ）国：イギリス （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＯＸ４５ＬＹ（ｉ　ｉ）発明の名称二幹細胞阻 害タンパク質（ｉｉｉ）配列の数：１７８ （ｉｖ）コンピュータ可読型： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：［ＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティング　システ ム：　ＰＣＤＯＳ／ＭＳＤＯＳＣＤ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ １ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ＥＰＯ） ＴＴＣＴＣＴ　ＴＡＣＡＣＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＣＡＡ 　ＡＡＴ　ＴＴＣＡＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＴＡＣＰｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈ ｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　ｌｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　［ｌ ｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＴｙｒＴＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＡ 　ＴＧＴ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧ　ＡＣＴ Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＰ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　［Ｉｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＡＡＧ　Ｃ（、ＣＴＣ Ｇ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＧＴＣＴＧＴ　ＧＣＴ　（、ＡＣＣＣＡ　ＴＣＴ　ＧＡＡ 　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＴＴ　ＣＡＡしｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　 Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　 Ｖａｌ　Ｇ１ｎＡＡＡＴＡＴＧ１’ＴＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧ、’、ＡＴＴＧＴＣ ＴＧＣＣＴ、ＡＡＴＡＡＧＬｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｉａ　本　零（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　２ についての情報：（１）配列の特徴； （Ａ）長さ、７６　アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｄ）形態−直線 （１１）分子型：　蛋白質 （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２　：Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａ’ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ 　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙ■ ＋　５　ｔｏ　１５ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＴｙｒＰｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔ ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｌ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒしｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｉ ｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒ ｐ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎＬｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　、Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ネ　零（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　３につい ての情報。 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２２９塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　２本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｉｉ）アンチセンス：　ＹＥＳ （ｘｉ）配列の記載・　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３　：ＣＴＴＡＴＴＡＧＧＣＡＧ ＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡ　ＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧ　ＡＡＣＣＣＡ ＴＴＣＴ　ＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＡＧ　 ＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡ　ＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧ　ＧＡＡＣ ＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣＡ　ＧＣＡＡＴＧＡＡＡ Ｔ　ＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴ　ＴＴＧＴＣＴＡＧＡＧ　ＧＴＧＴＡＡＧＡＧ` Δ、ＡＣＡＡＣＡＡ、ＧＣＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧ　ＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡ　ＡＧ ＧＡＴＣＴＴＴＴ　ＡＴＣＣＡＡＧＣＴ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　４につ いての情報：（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ、４５　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態、　直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．４５ （Ｄ）他の情報：／生成物＝　“合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマー ” （ｘｉ）配列の記載、ＳＥＱ　ｌ［ｌ　ＮＯ：４：ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡ　ＡＡ ＡＧＡＴＣＣＴＴ　ＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＣＣＡＡＣＣＧ　ＣＴＴＧＴ（ ２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）８在：　１．．４８ （Ｄ）他の情報：／生成物繁　“合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマー ” （Ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡ　ＡＧ ＣＧＧＴＴＧＧＡ　ＧＴＧＴｃＡＧＣＡＧ　ＣＣＡＡＧＧＡＴＣＴ　ＴＴτＡＴ ＣＣＡ（２）　ＳＥＱ　ＩＱ　ＮＯ：６についての情報；（１）配列の特＠： （Ａ＞長さ：５０塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）＄１：１本鎖 ＣＤ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．５０ （１））池の情報、／生成物・　“合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマ ー〇 （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：ＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴ　ＡＣ ＡＣＣＴＣＴＡＧ　ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ　ＣＡＡＡＡＴＴＴＣＡ　ＴＴＧＣＴ ＧＡＣＴＡ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアについての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝５０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．５０ （Ｄ）池の情報、／生成物・　”合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマー 〇 （ｘｉ）配列の記載　ＳＥｏ　１０　ＮＯニア：ＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧ　ＴＣＡ ＧＣＡＡＴＧＡ　ＡＡＴＴＴＴＧＴＧＧ　ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡ　ＧＡＧＧＴＧ ＴＡＡＧ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ・８についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、４８塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉ：＜）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、４８ （Ｄ）池の情報：／生成物・　“合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマー ” （ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：ＣＴＴＴＧＡＡＡＣＴ　ＴＣ ＴＴＣＴＣＡＡＴ　ＧＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡ Ｃ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９についての情報：（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ　４８塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖＝　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．４８ （Ｄ）他の清報　／生成物・　“合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマー ” （ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：ＧＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧ ＡＡＧＡＴＧＡ　ＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴ　ＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡ　ＧＡＡＧＡＡ ＧＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０についての情報：（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ：４６塩基対 （Ｂ）　！！２　核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：１．．４６ （Ｄ）他の情報：／生成物・　“ＬＤ７８合成遺伝子の構成のためのオリゴマー ” （ｘｌ）配列の記載＋　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０　：ＴＡＡＧＣＧＣＴＣＧ　 ＡＧＡＣＡＡＧＴＣＴ　ＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡ　ＴＧＧＧ ＴＴ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ＩＩについての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　４６塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型　ＤＮＡ （ｌ＼）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：１．．４６ （Ｄ）他の情報　／生成物＝　“合成ＬＤ７８遺（立子の構成のためのオリゴマ ー” （Ｘｌ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ＩＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＴ ＴＣＴＴＣＡ　ＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧ　ＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧ　ＴＣＴＣＧＡ（ ２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１２についての情報：（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ、４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：１．．４０ （Ｄ）他の情報　／生成物＝　“合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマー ２ （Ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ２　：ＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ　Ｔ ＴＴＣＴＧＡＣＴＴ　ＧＧＡＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＣＣＴＡＡＴＡＡＧ（２）ＳＥ Ｑ　ＩＤＮ０：Ｉ３についての情報・（１）配列の特徴： （Ａ）長さ　３７塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （目）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：１．．３７ （Ｄ）他の情報　／生成物＝゛°合成ＬＤ７８遺伝子の構成のためのオリゴマー ” （ｘｌ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ３　：ＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴ　Ａ ＧＧＣＡＧＡＣＡＡ　ＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡ　ＧＡＡＡＣＡＴ（２）ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：１４についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　１８塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）　Ｓｌ　：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （ｉ　ｉ）分子型　ＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：ｔ４　：ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧ　Ｔ ＣＡＮＣＧＡＣ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１５についての情報・（ｉ）配列 の特＠： （Ａ）長さ：　７８５９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　Ｍ・２本鎖 （Ｄ）形態、環状 （１１）分子型・ＤＮＡ （Ｘｌ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ５　：ＴＴＣＣＣＡＴＧＴＣＴＣ ＴＡＣＴＧＧＴＧ　ＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＡ　ＴＴＧＧＡＡ ＧＧＴＡ　ＡＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＴ　ＴＴＣＴＴＡＴＣＣＧ 　ＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡ　ＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧ　ＡＡＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴ １＼ＧＡＴＣ`Ａ 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ＣＴＴＡＧＡＴ　ＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴ　ＴＣＴＣＴＴＴＴsＴ ＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＡ　ＴＴＡＴＣＴＡＣＴＴ　ＴＴＴＡ ＣＡＡＣＡＡ　ＡＴＡＣＡＡＡＡＧ／ｉ　ＴＣＴＡＴＧＡＧ`Ｔ ＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴ　ＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡ　ＧＴＴＴＴＡＴＴＣＧ　ＣＡＧ ＣＡＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴ　ＧＣＴＣＣＡＧＴＣ` ＡＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡ　ＡＣＧＧＣＡＣＡＡＡ　ＴＴＣＣ ＧＧＣＴＧＡ　ＡＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＴＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧ Ｇ　ＧＧＡＴＴＴＣＧＡＴ　ＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴ　ＴＧＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡ ＡＣＡＧＣＡＣＡ　Ａ、ＡＴＡＡＣＧＧfＴ ＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴ　ＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴ　ＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡ　ＴＴＧ ＣＴＧＣＴＡＡ　ＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧ　ＧＴＡＡＧＣＴＴfＧ ＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡ　ＣＡＧＣＧＡＣＴＣＴ　ＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＡＧ ＣＣＡＴＧＡ　ＴＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡ Ｔ　ＧＴＡＴＡＴＣＧＡＡ　ＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡ　ＡＡＴＡＣＧＣＡＴＧ　Ｃ ＡＡＣＴＧＣＧＴＡ　ＧＴＴＧＧＴＴＡbＡ ・　ＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧ　ＴＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＡ　ＡＡ ＴＧＧＴＧＧＧＡ　ＧＣＴＣＣＧＴＴＡＡ　ＴＡ、ＡＧＧＡsＣＣ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６についての情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　１７　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎮、　１本鎖 （Ｄ）形態・　直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ｘｉ）　配列ノ記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ旧６　：ＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡ　Ａ ＡＧＡＧＡＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｉ７についての情報。 （１）配列の特徴： （Ａ）長さ・　２３４塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）　ｊｌ　：　２本鎖 （Ｄ）形ｇ３＝　直線 （２）分子型・　ＤＮＡ　（ゲノムの）（ｉｉｉ）アンチセンス　Ｎｏ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）局在：　１．．２３４ （Ｄ）他の情報　／コドンー開始＝１ ／生成物・”Ｍｌｌアルファ遺伝子” （ＩＸ）特徴： （Ａ）名前／キー・３’　ＵＴＲ （Ｂ）局在・２２３．　、２２５ （Ｄ）池の情報：／機能＝“非翻訳停止フドン” （ｉｘ）特＠： （Ａ）名前／キー＋３’ＵＴＲ ＣＢ）局在：　２２６．．２２８ （Ｄ）池の情報：／ｎ能＝“非翻訳停止フドン。 （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ７　：ＡＧＣＴＴＡ　ＣＣＴ　 ＧＣＣＡＴＧ　ＧＣＧ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＣＣＣＣＧ 　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＡＣＡＧＣＣＧＧ　ＡＡＧ　Ａ ＴＴ　ＣＣＡ　ＣＧＣＣＡＡ　ＴＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣｙｓ　Ｐｈｅ 　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ 　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＴｙｒＴＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　 ＡＧＣＣＴＴ　ＴＧＣＴＣＣＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＡＴＴ　ＴＴＣＣ ＴＧ　ＡＣＴＰｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｔｉｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＡＡＧ 　ＡＧＡ　ＡＡＣＣＧＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＧＣＧＣＴ　ＧＡＣＴＣＣＡＡＡ　 ＧＡＧ　ＡＣＣＴＧＧ　ＧＴＣＣＡＡＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ 　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ 　Ｖａｌ　Ｇ１ｎＧＡＡ　ＴＡＣＡＴＣＡＣＴ　ＧＡＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＧ　 ＡＡＴ　ＧＣＣＴＧＡ　ＴＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧＧｌｕ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈ ｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　本　零　Ａｓｐ　Ｐｒ 。 （２）　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：１８についての情報：（１）配列の特徴。 （Ａ）長さ　７８　アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　蛋白質 （ｘｉ’）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８　・Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ 　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ 　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　Ｐｒｏ　 Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　ＴｙｒＰｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔ ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｌ　、Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈ■ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　ｆｌｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎＧｌｕ　Ｔｙｒ　［ ｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　＊　零　Ａ ｓｐ　Ｐｒ。 （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９についての情報。 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　２３４塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　２本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ＞分子型　ＤＮＡ （ｉｉｉ）アンチセンス・　ＹＥＳ （Ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９　・ＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴ　 ＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡ　ＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＴＧＴＡＴ　ＴＣＴＴ ＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＧ　ＣＡＧＡＴＣＴＧＣ ＣＧＧＴ′ｒＴＣＴＣＴＴ　ＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡ　ＡＴＧＡＣＡＣＣＴＧ　Ｇ ＣＴＧＧＧＡＧbＡ ＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡ　ＧＴＴＴＣＡ八ＡＡＴ　へＡＧＴＣＧＡＣＧＡＴ　ＧＡ ＡＴＴＧＧＣＧＴ　ＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＡＧfＡ ＧＡＡＧＣＡＧＣへＴ　ＧＣＡＧＴＣＧＧＧＧ　ＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＡ ＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＴＡ　ＡＧＣＴ２３．１ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０についてのＩ’ＷｔＦｉ：（１）配列の特徴 。 （Ａ）長さ　３８　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖−１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．．３８ （Ｄ）他の情韓・／生成物＝”ＭＩＰ−アルファ遺伝子の構成のためのオリゴマ ー” （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２０：ＡＧＣＴＴ、ＡＣＣＴＧ　 ＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＴ　ＧＡＣＡＣＣＣＣ（２）　ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ・２１についての情報・（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ　４１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態Ｓ直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．４１ （Ｄ）他の情報：／生成物＝”ＭＩＰＩ−アルファ遺伝子の構成のだめのオリゴ マー′ （ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２１：ＴＧＣＡＧＴＣＧＧＧ　ＧＴ ＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＡＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＴ　Ａ（２）　ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２２についての情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　４４塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ｉＸ）特徴 （Ａ’）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴（Ｂ）局在：　１．．４４ （Ｄ）池の情報、／生成物・“Ｍ　Ｉ　Ｐ　ｌ−アルファ遺伝子の構成のための オリゴマー” （Ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２・ＧＡＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧ ＣＴＴＣＴＣＣＴ　ＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡ　ＧＡＴＴＣＣＡＣＧＣＣＡＡＴ＜２ ）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２３についての情報：（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　４４塩基対 （Ｂ）型核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．４３ （Ｄ）他の情報＝７生成物・”ＭＩＰＩ−アルファ遺伝子の構成のためのオリゴ マー′ （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２３＋ＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴ　Ｇ ＧＣＧＴＧＧＡＡＴ　ＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧ　ＴＡＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡ（ ２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２４についての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ　３９塩基対 （Ｂ）ヤニ核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．３９ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＭＩＰＩ−アルファ遺伝子の構成のためのオリゴ マー１ （ｘｉ）配列の記載−５ＥＱ　［ＯＮＯ：２４：ＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡ　ＣＴＡ ＴＴＴＴＧＡＡ　ＡＣＴＡＧＴＡＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＣＣ（２）ＳＥＱ　［Ｏ ＮＯ：２５１：−ツイテ（ＤｔｔＪ報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・３９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖−１本鎖 ＣＤ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．３９ ＣＤ）他の情報：／生成物・”ＭＩＰＩ−アルファ遺伝子の構成のためのオリゴ マー” （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５：ＣＣＴＧＯＣＴ［ｌ、Ｇ［ 、ＡにＣＡＡＡＧＧＣＴ　ＡＣＴＡＧＴＴＴＣＡ　ＡＡＡＴＡＧＴＣＧ（２）　 ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２６についての情報：（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ　３７塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （ｉｉ）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、３７ （Ｄ）　ｆｌ！！の情報　／生成物＝”ＭＩＰｌ−アルファ遺伝子の構成のため のすリボマー” （ｘｌ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６：ＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴ　ＣＡ ＴＴＴＴＣＣＴＧ　ＡＣＴＡＡＧＡＧＡＡ　ＡＣＣＧＧＣＡ（２）　ＳＥＱ　［ Ｄ　ＮＯ：２７についての情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ；３７塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー二ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在　１．３７ （Ｄ）他の情ｎ・／生成物＝“ＭＩＰＩ−アルファ遺伝子の構成のためのオリゴ マー” （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２７：ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧ ＧＴＴＴＣＴＣＴ　ＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡ　ＡＡＴＧＡＣＡ（２）　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：２８についての情報：（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ：４４塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．４４ （Ｄ）他の情報・／生成物＝”ＭＩＰＩ−アルファ遺伝子の構成のためのオリゴ マー１ （ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８ＧＡＴＣＴＧＣＧＣＴ　ＧＡＣ ＴＣＣＡＡＡＧ　ＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴ　ＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡ（２） 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２９についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４４塩基対 （Ｂ）盟、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子量　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、４４ （Ｄ）池の情報、／生成物・“ＭＩＰＩ−アルファ遺伝子の構成のためのすリボ マー” （Ｘｌ）配列の記載・ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２９＋ＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡ　ＴＧ ＴＡＴＴＣＴＴＧ　ＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧＴ　ＣＡＧＣ（２ ）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：３０についての情報。 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　３２塩基対 （Ｂ）梨　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （ｉｉ）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （１Ａ）名前／′キー　ｍ１ｓｃ−特徴（Ｂ）局在　１．．３２ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＭＩＰＩ−アルファ合成遺伝子の構成のためのオ リゴマー′ （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０・ＣＴＧＡＣＣＴＣＧＡ　Ｇ ＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１ についての情報（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・２９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特１ｆｉ： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２９ ＣＤ）池の情報：／生成物＝”ＭＩＦ’ｌ−アルファ遺伝子の構成のためのオリ ゴマー“ （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　Ｉｌｌ　ＮＯ：３１：ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣ ＴＡＴＣＡＧＧＣＡ　ＴＴＣＡＧＣＴＣＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２に ついての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ’）長さ・１５１基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）　［Ｉ：　１本鎖 ＣＤ）形態、直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．、＋５ （Ｄ）他の情報−／生成物＝”オリゴヌクレオチド　了ダブターのトップ１ｎ− （ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２：ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡ　Ａ ＡＡＧＡ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３３についての情報。 （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ・ＩＩ塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特＠： （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （８）局在・１．．１Ｉ （ｘｉ）　配列ノ記ｆｉ＋　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３：ＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣ Ａ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４ｉ：ツィテノ情報。 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、２２９塩基対 （Ｂ）壓：核酸 ＡＣＣＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＡＡ　ＧＴＣＴＧＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣ ＣＣ’Ｇ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＴＧＧ　ＧＴＣＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａ１ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＴＡＣＧＴＧ　ＴＡＴ　ＧＡＣ ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＣＴＧＡ　ＴＡＡＧＧｉｎ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖ ａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ｔ（２）　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：３５についての情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　７５アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 ＣＤ）形態　直線 （１１）分子型　蛋白質 （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５：Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ｖａｔ　ＡｓｐＴｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａ ｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇ１ｎＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙ ｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅ ｒ　Ｔｒｐ　Ｖａ１５０　５５　’　６０ Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ａｓｎ　本（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６についての情報。 （１）配列の特徴。 （Ａ）長さ　２２９塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）　ｊｉ：　２本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型・ＤＮＡ　（ゲノムの）（ｉｉｉ）アンチセンス　ＹＥＳ （Ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６・ＣＴＴＡＴＣＡＧＴＴ　Ｃ ＡＡＴＴＣＣＡＡＧ　ＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴ　ＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧ ＡＴＴＣＡ　ＣＴＣＧＧＧＴＣＡf ＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧ　ＣＴＴＧＧＡＴＣＴＴ　ＴＴＧＧＴＴＴＧＧＡ　ＡＴＡ ＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧ　ＣＡＣＡＡＡＧＡＡf 、へＧＧＴＣＴＣＡＴＡ　ＧＴＡＧＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＧＧ ＣＡＡＣＴＴ　ＣＣＴＡＧＣＧＧＴＧ　ＴＡＡＧＡＡＡＡＧb ＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴ　ＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴ　ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＧ　ＧＴＧ ＣＴＣＴＴＴＴ　ＡＴＣＣＡＡＧＣＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３７につい ての情報：（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ　４６塩基対 （Ｂ）梨、核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．　、４６ （Ｄ）池の情報　／生成物・“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマー ′ （Ｘｌ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３７：ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡ　ＡＡ ＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＴＣＡ　ＧＡＣＣＣＴＣＣＡＡ　ＣＣＧＣＡＴ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４５塩基対 （８）堅：核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．．４５ （Ｄ）他の情報：／生成物＝　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマ ー” （ｘｉ）　配列（Ｄ記載＋　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８：ＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴ 　ＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴ　ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＧ　ＧＴＧＣＴＣＴＴＴＴ　ＡＴ ＣＣＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３９についての１Ｒ報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．４７ （Ｄ）他の情報・／生成物・　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマ ー” （ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：３９：ＧＣＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＡＣ ＡＣＣＧＣＴ　ＡＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＡＧＡＡＡＣＴＴ　ＴＧＴＧＧＴＣ（ ２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：４０についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ・５１塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴。 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．５１ （Ｄ）他の情報　／生成物＝　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマ ー” （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ＋４０：ＡＧＴＡＧＴＣＧＡＣＣＡ ＣＡＡＡＧＴＴＴ　ＣＴＡＧＧＣＡＡＣＴ　ＴＣＣＴＡＧＣＧＧＴ　ＧＴＡＡＧ ＡＡＡＡＧ　Ｃ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１についての情報：（１）配列 の特徴・ （Ａ）長さ：４６塩基対 （Ｂ）梨・核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．．４６ （Ｄ）他の情報：／生成物＝　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマ ー” （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４１：ＧＡＣＴＡＣＴＡＴＧ　Ａ ＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧ　ＴＧＧＴＡＴ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４２についての情報：（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　４６塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．　、４６ （Ｄ）池の情ｆ’ｌ：／生成物・　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリ ゴマー” （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４２：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：４３についての情報。 （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ＝４７塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ’）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前１件−・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．４７ （Ｄ）他の情報、／生成物・　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマ ー“ （ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３：ＴＣＣＡＡＡＣＣＡＡ　ＡＡ ＧＡＴＣＣＡＡＧ　ＣＡＡＧＴＣＴＧＴＧ　ＣＴＧＡＣＣＣＧＡＧ　ＴＧＡＡＴ ＣＣ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４４についての情報：（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ　４７塩基対 （Ｂ）幇　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、４７ （Ｄ）池の情報　／生成物＝　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のだめのオリゴマ ー” （ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４４ＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡ　ＴＴ ＣＡＣＴＣＧＧＧ　ＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡ　ＣＴＴＧＣＴＴＧＧＡ　ＴＣＴＴＴ ＴＧ（２）ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：４５についての情報：（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ　４３塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴。 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ＝特徴 （Ｂ）局在：１．．４３ （Ｄ）他の情報、／生成物・　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマ ー” （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５：ＴＧＧＧＴＣＣＡＧ（、Ａ ＧＴＡＣＧＴＧＴＡ　ＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡ　ＴＴＧＡＡＣＴＧＡＴ　ＡＡＧ（ ２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４６についての情報：（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ　４０塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （Ｉ【）分子型　ＤＮＡ （１ｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．４０ （Ｄ）他の情報：／生成物・　“ヒトＡＣＴ−２遺伝子の構成のためのオリゴマ ー“ （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：４６：ＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＧ ＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＡＣＴＣＣＴ（２）　ＳＥＱ　 ｉＤ　ＮＯ：４７についての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１７塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖−１本鎖 （Ｄ）形態；直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４７：ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧ　Ｔ ＣＡＣＧＡＣ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：４８についてのｔｔＦｆＦｉ：（ｉ ）配列の特徴： （Ａ）長さ、２２塩基対 （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢ６３００オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０：ＡＡＡＣＡＡＣＡＡＧ　ＡＧＧＴＴＧＧＡＧＴ　 ＧＴ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：５１についての情報；（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：１．．２５ （Ｄ）他の情報　／生成物＝”ＢＢ６３８１オリゴマー゛（ｘｉ）配列の記載＋ 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１ＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴ　ＣＡＢＡＧＴＡＧＴＣＡＧ ＣＡＡ（２）ＳＥＱ　［ＯＮＯ：５２についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖。１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴。 （Ａ）名前／キー＋　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２５ （Ｄ）池の情報、／生成物＝“ＢＢ６３０２オリゴマー”（ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２：ＧＴＧＧＡＡＴＴＴＧ　ＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧ　 ＴＡＡＧＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　２７塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）　ＳＪＩ：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１］）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２７ （Ｄ）池の情報、／生成物＝“ＢＢ６３０３オリゴマー”（ＸＩ）配列ノ記ａ： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：５３ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡ　ＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴ　Ｇ ＴＧＧＡＡＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４についての情報：（１）配列の 特＠： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）型核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、２５ （Ｄ）他の情報、／生成物＝”ＢＢ６６２５オリゴマー”（ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４：ＴＴＴＣＡＡＡＧＴＡ　ＧＲＣＡＧＣＡＡＴＧ　Ａ ＡＡＴＴ（２）　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：５５についての情報：（ｉ）配列の特徴 ： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）望：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （ｉ　ｉ）分子型：　ＤＮＡ （ば）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２４ （Ｄ）池の情ｎ、／生成物＝　”ＢＢ６３０１ｔ　’Ｊ　コマ−”（ｘｉ）配列 の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ・５５：ＡＧＧＴＧＴＡＡＧＡ　ＴＴＧＡＣＡＡ ＣＡＡ　ＧＣＧＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６についての情報（ｉ）配列 の特徴： （Ａ）長さ・２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｌ：１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２５ （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢ６３８２オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記載・ ＳＥＱ　１０　ＮＯ：５６：ＡＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＢＴＧＡＡＡＴＴＴ　ＴＧ ＴＧＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７についての情報・（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．２４ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ６３８３オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７ＴＡＧＴＣＡＡＧＡＡ　ＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴ　Ｇ ＧＣＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８についての情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２Ｇ塩基対 ＣＢ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、２６ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ６３８４オリゴマー″（Ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：５８ＧＣＡＣＡＧＡＣ，ＴＴ　ＧＴＴＣＣＧＡＧＣＧ　Ｃ ＴＴＡＧＴ（２）　ＳＥＱ　（Ｄ　ＮＯ：５９についての情報・（ｉ）配列の特 徴 （Ａ）長さ、３５塩基対 ＣＢ）　！ｕ・核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態６直線 （ｉｉ）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：１．．３５ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“８Ｂ６３８５オリゴマー“（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：５９：ＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴ　ＴＡＧＡＡＡＣＡＴＡ　 ＴＴＧＴＴＧＡＡＣＣＣＡＴＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０についての 情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、２５塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴； （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２５ （０）他のｆＲ報：／生成物＝“ＢＥ！６３４５オリゴマー。 （ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０：ＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴ　Ｃ ＴＴＣＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：６１についての情 報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ロ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　１１）　ＮＯ：６３：ＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡ　 ＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴ　ＡＧＴＣ（２）　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：６４についての情 報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）　ｉｉ・　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キーニｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在＋　１．．２４ （Ｄ）池の情報、／生成物＝”ＢＢ９１１０オリゴマー。 （ｘｌ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４：ＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡ　Ａ Ｎ”ｒＴｌｃ１ゴＡＧ　ＡＧＧＴ（２）ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：６５についての情 報：（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖；１本鎖 （Ｄ）形態二直線 （１１）分子型：１ＤＮＡ （１ｘ）特＠： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．．３０ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９１１１オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６５：（２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：６６１こついての情Ｎ ：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 ＣＢ）型、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ’）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．３０ ＣＤ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９１０４オリゴマー“（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：６６・ＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧ　ＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴ ＴＴＴＡＴＣＣＡＡ（２）ＳＥＱ　［ＯＮＯ：６７についての情報：（ｉ）配列 の特徴： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、３６ （Ｄ）他の情報・／生成物＝”ＢＢ９１０５オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・６７：ＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧ　Ａ ＣＡＡＴＣＴＴＴＴ　ＡＴＣＣＡＡ（２）　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：６８についての 情報：（１）配列の特徴 （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　８１：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２４ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９１０６オリゴマー″（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６８：ＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡ　ＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴ　 ＣＣＡＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤＮ０：６９についての情報（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ　３０塩基対 （Ｂ）型核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （８）局在：　１．．３０ （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢ９１０３オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：６９：ＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＴ ＴＴＡＴＣＣＡＡ（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ・７０についての情報（１）配列 の特徴・ （Ａ）長さ＝４８塩基対 （Ｂ）盟：核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型、ＤＮＡ （１ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．４８ （Ｄ）他の１ｎ報・／生成物＝　”ＢＢ９１０８オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア０：ＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴ　ＣＴＡＣＣＧＣＧＣ Ｔ　ＴＡＧＴＣＡＡＧＡＡ　ＧＡＴＧＡＣＡＧＡＴ　ＧＧＣＴＴＧＧＡ（２）　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア１についての情報・（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　２４塩基対 （Ｂ）堅　核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ｉＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２４ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９１０７オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯニア１ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＴＡＡＧ　ＡＧＡ Ａ（２）ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯニア２についての情報。 （ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ・２１塩基対 （Ｂ）梨　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ＩＩ）分子Ｌ”：ＤＮＡ （１ｘ）特徴− （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２＋ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９５１２オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　１０　ＮＯニア２：ＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧ　Ｃ（ ２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯニア３についての情報：（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ＝１８塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ＝特徴 （Ｂ）局在用、１８ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９４３２オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　（Ｄ　Ｎｏ・７３・ＣＡＡＡＧＴＡＧＧＡ　ＡＧＣＡＡＴＧＡ（２）　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア４についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１９塩基対 ＣＢ）堅・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ’）局在・１８．１９ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９５１９オリゴマー“（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア４・ＧＴＧＴＡＡＧＡＧＧ　ＣＡＣＡＡＣＡＡＧ（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５についての情報：（１）配列の特徴。 （Ａ）長さ　＋９１−基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）　ｊＪｌ：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子ジ　ＤＮＡ （Ｉ＼）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．１９ （Ｄ）他の情報　／生成物＝“ＢＢ９５２７オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５：ＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＧＴ、へＧＴＣＡＧ（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア６についての情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２１塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ＩＩ）分子型　ＤＮＡ （１Ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１，２１ （Ｄ）池ノｔ’Ｒ報・／生成物＝　−ＢＢ９４３１ｔｌＪゴマ−′（＼１）配列 の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア６ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡ　ＧＣＧＡＡＡＴＴＴ Ｔ　ＧＩ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア７１こついての情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）梨、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型　ＤＮＡ Ｃ１ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．１９ （Ｄ）他の情報　／生成物＝”ＢＢ９５３４オリゴマー。 （ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア７・ＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧ　ＣＧ ＡＣＡＣＣＴＧ（：））　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア８についての情報：（１）配 列の特徴 （Ａ）長さ　２１塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 特表千７−５０２４０４　（７２） （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴。 （Ａ）名前／′キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２＋ （Ｄ）他の情報　／生成物＝“ＢＢ９４３７オリゴマー゛（Ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア８：Ｃ，ＡＣＡＧＡＣＴＴＧ　ＡＧＡＣＧＡＧＣＧＣ Ｔ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア９１：−ツイテノＩ’ｔ？？［１：（１）配 列の特徴： （Ａ）長さ一２２塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）　ｉＡ：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 ＣＢ）局在・１．．２３ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢＩＯＩ９４　オリゴマー゛（ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ＋８１＋ＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧ　ＣＧＡＧＣＡＧＣＣ Ａ　ＡＧＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤＮ０・８２についての情報：（り配列の特徴。 （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）盟：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２２ （Ｄ）池の情報・／生成物＝“ＢＢ１０１９５　オリゴマー”（ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：８２：ＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴ　ＣＡＧＡＧＧＴＧＴＡ 　ＡＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８３についての情報；（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ４２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （１ｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ＞局在・１．　、２７ （Ｄ）他の情報：／生成物＝”ＢＢＩＯ１９６オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載 ：　ＳＥＱ　ＩＩ）　Ｎ［ｌ：８３ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴ　ＧＴＣＴＴＴＣＧＣ Ｇ　ＣＴＴＡＧＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８４についての情報。 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２９塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （１＼）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　］、、２９ （Ｄ）他の情報　、／生成物＝”ＢＢＩＯ１９７オリゴマー”（＼１）配列の記 載　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：８４ＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧ　ＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡ　 ＴＣＴＴＴＴＡＴＣ（２）　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：８５についての情報（１）配 列の特徴 （Ａ）長さ、２２塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　］、、２２ （Ｄ）他の情報　／生成物＝“ＢＢ１０１９８　オリゴマー″（＼１）配列の記 載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５・ＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧ　ＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡ 　ＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８６についての情報：（ｉ）配列の特ｍ： （八）長さ＝２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖−１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （目）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２３ （Ｄ）池の情報　／生成物＝”ＢＢＩＯＩ９９　オリコ′マー”（＼ｌ）配列の 記載・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８６：ＧＧＴＴ’ＧＧＡＧＴＧ　ＴＣＴＴＣＡＧＣ ＣＡ　ＡＧＧ（２）　ＳＥｇ　ＩＤ　ＮＯ：８７ｉこついての情幸証（ｉ）配列 の特徴： （八）長さ一２２塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖−１本鎖 ＣＤ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２２ （Ｄ）池の情報、／生成物＝“ＢＢ１０２００　オリコ′マー”（＼１）配列の 記載・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８７・ＧＧＡＡＴＴＴＣＴＴ　ＣＡＧＡＧＧＴＧＴ Ａ　ＡＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８についての情報：（ｉ）配列の特徴 （八）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型　ＤＮＡ （ｌλ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ＝特徴 （Ｂ）局在　］、、２８ （Ｄ）他の１・ｎ報・、／生成物＝　”ＢＢＩ０２０１　ｆｌＪゴマ−Ｃ＼１） 配列の記！ｉｉ：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：８８：ＣＣＴＴＡＴＴ、ＡＧＧ　ＣＡ ＧＡＴＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧ＜２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８９ｉこつい ての情幸侵（１）配列の特徴 （Ａ）長さ一２０塩基対 ＜Ｂ）型核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．．２０ （Ｄ）池の情報、／生成物＝“ＢＢ９５３７オリゴマー”（Ｘ］）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８９：ＧＡＣＴＴＧＴＣＴＡ　ＧＣＧＣＧＣＴＴＡＧ（２ ’）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９０についての情報・（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型核酸 （Ｃ）ｊ！：　］本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１９ （Ｄ）他の情報：／生成物＝″ＢＢ９４９７オリゴマー゛（ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９０：ＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡ　ＧＣＧＧＡＴＣＴＴ（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９＋についての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ　１７塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖。１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （１ｘ）特徴・ （Ａ）名・前／キー＋　ｍ１ｓｃ−特徴ＣＢ）局在　１．　、１７ ・■）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９４９８オリゴマー”（ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　Ｉ［ｌ　ＮＯ：９１：ＧＴＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＣ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９２についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー＋　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．１８ （Ｄ）他の情報　／生成物＝“ＢＢ９４９９オリゴマー”（ｘｉ）　配列（７） 記載　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９２：ＧＡＧＴＧＴＣＡＧＡ　ＡＧＣＣＡＡＧＧ（ ２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９３１ｍツいテ（７）情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２２ （Ｄ）他の情報：／′生成酸物“ＢＢ９５１７オリゴマー”（ｘｌ）配列の記載 ＋　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ＋９３：ＡＴＴＡＧＧＣＡＧＡ　ＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧ 　ＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４についての情報コ（１）配列の特徴： （Ａ）長さ、３４塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　Ｉ、＄鎖 （Ｄ）形態、直線 （ｉ　ｉ）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴・ （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．　、３４ （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢ９７８１オリゴマー”（ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４：ＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＧＧＴＡＧＡ　ＴＣ ＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＣ（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：９５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１χ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２０ （Ｄ）　ｆｌｔ！の情報・／生成物＝“ＢＢ９４３０オリゴマー”（Ｘｌ）配列 の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９５ＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧ　ＡＡＧＣＡＧＣＣＡ Ａ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９６についての情Ｍ：（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー・口＋１ｓｃ＝特徴 （Ｂ）局在　１．　、　＋８ （Ｄ）池の情報、／生成物＝”ＢＢ９５２５オリゴマー′（Ｘｌ）配列の記載・ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９６：ＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧ（２）　Ｓ ＥＱ　１０　ＮＯ：９７についての情報・（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２１塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖；　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子ヤ　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　ｌ、２１ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ９４３５オリゴマー”（＼１）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７：ＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧ　ＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧ　Ａ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９８についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・１８塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （１χ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１８ （Ｄ）他の情報・／生成物＝“ＢＢ９４３６オリゴマー”（Ｘｌ゛）配列の記載 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９８：ＧＴＣＴＣＧＡＧＧＡ　ＣＴＴＡＧＴＣＡ（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９９についての情報。 （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 ＣＤ）形ｖ、：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー、ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・］、、２２ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９４２３オリゴマー′（ｘｉ）配列の記＠： 　ＳＥＱ　ＩＤＮ０＋９９：ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＧ　ＴＣ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＯＯについての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・２１塩基対 （Ｂ）型核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特＠： （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．．２１ ＣＤ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９４２４オリゴマー“（ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１００：ＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡ　Ａ’ＧＡＴＴＣＡＧＡ Ｔ　Ｇ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１０１についての情報。 （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ・２１塩基対 （Ｂ）梨−核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２１ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ９４２５オリゴマー′（ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤＮ０：Ｉｏｌ：ＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡ　ＡＧＡＴＴＧＡＡＣＣＣ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０２についての情報・（１）配列の特徴。 （Ａ）長さ、２０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態−直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２０ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９４２７オリゴマー“（ｘｉ）　配列（７） 記１ｉ：　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：Ｉ０２＋ＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧ　ＧＡＡＧＡＡＡ ＣＡＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３ニツいテノ情報：（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　１７塩基対 （Ｂ）梨・核酸 （Ｃ）　ｊ貞　１　本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．、Ｉ７ （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢ９５０３オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１０３＋ＣＣＴＴＡＴＴＡＧＴ　ＣＡＧＡＡＡＣ（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ０４ニッＬｔテ（７）情報。 （１）配列の特徴： （Ａ）長さ・３３塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）　！１１・　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１］）分子型：　ＤＮＡ （ｌλ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：］、、３３ （Ｄ）他の情報　／生成物＝　”ＢＢ９４４３オリゴマー”（ｘｌ）配列の記載 二ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１０４：ＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡ　ＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴ 　ＡＧＧＣＡＧＣＡＡＴ　ＧＡ＾（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０５について の情報：（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ　２０塩基対 ＣＢ）梨：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （］１）分子型　ＤＮＡ （ｌλ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２０ （Ｄ）池の情９１２：／生成物＝“８Ｂ９４３４オリゴマー“（ｘｉ）　配列ノ 記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ＩＯ２：ＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡ　ＧＡＧＧＡＡＣ ＡＴＴ（２）　ＳＥＱ　ｉＤ　ＮＯ：１０６１：：ライＴ（７）ｔＦ２ｆ［？（ ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、２２塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在用１．２２ （Ｄ）　Ｉｔ！＋の情ｆｇ、：／生成物＝“ＢＢ９２２８オリゴマー”（ｘｉ） 配列の記載、　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，１０６：ＣＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＧＴ ＣＡＧＡＡ　ＡＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ４０７についての情報：（１）配 列の特徴 （Ａ）長さ　２０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態。直線 （■）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２０ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ９４２９オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１０７：ＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡ　ＧＡＣＡＡＧＴＣＡＧ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１９塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖＝　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ＝特徴 （Ｂ）局在：　１．．１９ （Ｉ））他の情報　／生成物＝“ＢＢ９４９５オリコ゛マー”（ｘｉ）配列の記 載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ０８：ＣＴＴＡＴＴＡＧＧＡ　ＡＧＡＣＡＡＴＴＣ （２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ二１０９についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、１９塩基対 ＣＢ）型、核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー、叫ＳＣ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１９ （Ｄ）他の情報：／生成物＝　”ＢＢ９４９６オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載 ：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０９：ＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣ（ ２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：ＩＩＯについての情報。 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、２０塩基対 （Ｂ）梨、核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子を　ＤＮＡ （夏Ｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２０ （Ｄ）池の情ｆ♂・／生成物＝“ＢＢ９５０９オリゴマー“（ｘｉ）配列の記載 ：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１０：ＣＴＴＧＧＡＡＣＡＡ　ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ Ｇ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＱ：ｌｌｌについての情報・（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （８）局在　１．．１９ （ｘｉ）　配列ノ記ｆｉｌ：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＩＩ：ＧＴＣＡＧＡ八Ａ Ｃ，ＡへＧＣＴＴＴＴＴＧＡ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＩ２についての情 報６（１）配列の特＠： （Ａ）長さ　１９塩基対 （Ｂ）　、！ｕ・核酸 （Ｃ）　ｉｊｉ：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴； （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （８）局在：１．．１９ （Ｄ）池の情報、／生成物＝“ＢＢ９５２９オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＩ２：ＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧ　ＣＡＧＴＴＴＣＡＡ（ ２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：］ｌ１３：ツィテ（７）ｔｔ７報：（１）配列の特 徴 （Ａ）長さ用９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （ＩＩ）分子Ｖ・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー　ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１９ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９５３０オリゴマー″（ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１３：ＧＡＡＣＡＴＴＧＡＧ　ＣＡＧＡＡＧＴＴＴ（ ２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：！＋４についての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ・２１塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖；　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．　、２＋ （Ｄ）池の情ｅ’ｉｉ：／生成物＝　”ＢＢ９５３６オ’Ｊ　コアー”（Ｘｌ） 配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ１４：ＧＣＧＣＴＴＡＧＴＡ　ＧＣＧＡＡ ＧＡＴＧＡ　Ｃ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ１５についての情報。 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２２塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ｉ：＜）特徴。 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２２ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ９４２２オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ１５・ＣＴＴＣＡＧＡＴＧＧ　ＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧ　 ＡＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ１６についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形帖・直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２１ （Ｄ）池の情報　／生成物＝″ＢＢ９４２６オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１１６：ＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡ　ＧＣＡＴＡＴＴＴＴＴ　 Ｇ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ・１１７についての情報二（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ・１７塩基対 （Ｂ）型：ＦＸ酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー＋　ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在　１．　、１７ （Ｄ）他の情輯：／生成物＝“８８９５０４オリゴマー”（×１）配列の記載： 　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：１１７：ＧＧＴＧＴＡＡＧＣＧ　ＡＡＡＣＡＡＣ（２） 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＱ：１１Ｂについての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 ＣＤ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 イ（Ｂ）局在：　１．、＋９ ■）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９５０５オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載：　 ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：ｌ１８：ＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ　ＣＧＧＴＧＴＡＡＧ（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ（１：１１９についての情報―（１）配列の特徴。 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）壓・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．．２０ （Ｄ）他の情報、／生成物”　”ＢＢ９５０７オ’Ｊ　コマ−”（ｘｉ）　配列 ｃｌ’）記載：　ＳＥＱ　ｆＤ　ＮＯ：ｌＩ９：ＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡ　ＧＣＡ ＡＴＴＴＧＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ２０１．−ライての情報・（１ ）配列の特徴 （Ａ）長さ　１８塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｙ；）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．１８ （Ｄ）他の情報　／生成物＝“ＢＢ９５１０オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２０：ＣＴＧＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＡＧ（２）　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１についての情報（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ　２３塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （ｉ　ｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴二 （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２３ （０）他の情報・／生成物＝“８８９５１４オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ・＋２１　：ＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴ　ＴＡＧＡＡＡＣＣＣＡ 　ＴＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１２２についての情報：（ｉ）配列の特 徴： （Ａ）長さ・１９塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形懇：直線 特表千７−５０２４０４　＜８２） （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．、ｔ９ （ｘｌ）配列の記載・ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１２２：ＡＴＴＡＧＧＣＡＧＣＣＡ ＡＴＴＣＣＡＡ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２３についての情報：（ｉ）配 列の特徴： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．１９ （Ｄ）他の情報・／生成物＝“ＢＢ９５２０オリゴマー“（Ｘｌ）配列の記載、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ２３：ＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧ　ＣＡＧＡＧＡＡＡＣ（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，１２４についての情報。 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　１９塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態−直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　］、、Ｉ１ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９５２２オリゴマー”（ｘｉ）配列ノ記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ２４：ＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧ　ＣＴＴＧＴＣＴＡＧ（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２５についての情報：（１）配列の特徴、 （Ａ）長さ　２０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２０ （Ｄ）他の情報・／生成物＝“ＢＢ９５３１オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１２５＋ＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡ　ＧＣＣＴＴＧＧＡＡＣ （２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：Ｉ２６についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ一２０塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖−１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉ　ｉ）分子型：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （＾）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．．２０ （Ｄ）池の情報；／生成物＝“ＢＢ９５３２オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載・ ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１２６：ＧＡＡＧ＾τＧＡＣＡ　ＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧ（ ２）　ＳＥＱ　ＩＤ’ＮＯ＋１２７についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　８１：　１本鎖 （Ｄ）形！！！：直線 （１１）分子型：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）特＠： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１８ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９５３３オリゴマー“（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７：＾ＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＣＣτＧＧＣＴ（２） 　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：Ｉ２８についての情報：（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ暑７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （ｉｉ）分子型、ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．１７ （Ｄ）他の情￥９．４／生成物＝“ＢＢ９５００オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２８ＧＧＴＴＧＧＡＧＣＧ　ＴＣＡＧＣＡＧ・　 １７ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２９１ｍ２９１ｍライ＝（ｉ）配列の特徴； （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型−核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ｃＤＮＡ （（Ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．．２２ ＣＤ＞他の情報、／生成物＝“ＢＢ９５２３オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１２９：ＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴ　ＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴ 　ＴＧ（２）　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：１３０１ｍツいテ＜７）情報：（１）配列の 特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ｃＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．、＋７ （Ｄ）池の情報・／生成物＝　”ＢＢ９５１１オリゴマー′（Ｘｌ）配列ノ記載 ：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：＋３０：ＧＣＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：＋３１についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （■）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー＋　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１９ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９５０１オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載　 ５ＥＱＩＤ　ＮＯ：１３１　：ＣＡＡＧＣＧＧＴＡＧ　ＣＡＧＴＧＴＣＡＧ（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１３２についての情報：（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　１８　塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子ヤ・ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．１８ （Ｄ）他の情報・／生成物＝“ＢＢ９５０２オリゴマー”（＼Ｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３２ＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴ　ＧＧＡＧＴＧＴＣ（２）　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＋３３についての情報（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ　１８　塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・　１．、＋８ （Ｄ）池の情報：／生成物＝”ＢＢ９５０８オリゴマー”（ｘｉ）配列ノ記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３：ＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧ　ＣＧＴＣＡＧＣＡ（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１３４についての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２０　塩基対 ＣＢ）型：咳酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形部：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特＠： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２０ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ９５１３オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　１０　ＮＯ二１３４：τＴＣＴＴＣＡＧＡＴ　ＧＣＧＴＣＡＧＣＡＣ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１３５についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８　塩基対 （Ｂ）盟・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 ＣＤ）形態、直線 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１８ （Ｄ）池の情報・／生成物＝“８８９５１６オリゴマー”（２）　ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ・１３６についての情報：（１）配列の特徴； （Ａ）長さ：１７　塩基対 （Ｂ）堅：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形感：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．、＋７ ＣＤ）池の情報・／生成物＝“ＢＢ９５２１オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６：ＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＡＡＧＡＧ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３７についての情報。 （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ・１７　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （０）形態・直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１７ （Ｄ）他の情報：／生成物＝″ＢＢ９５２４オリゴマー”（ｘｉ）　配列（７） 記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＋３７：ＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡ　ＴＴＧＴＧＧＡ Ａ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：ｌ３８１．Ｔ、ツいテ（７）情報：（ｉ）配列 の特徴・ （Ａ）長さ＝１７　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖。１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・　１．．１７ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢ９５２６オリゴマー′（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３８：ＧＴＡＧＴＣＡＧＡＡ　ＡＴＧＡＡＡＴ（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ川８　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１８ ＣＤ）他の情報：／生成物＝　”ＢＢ９５２８オリゴマー”（ｘｌ）配列の記載 ：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：Ｉ３９：ＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＴ（２ ）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ・＋４０についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２０　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴： （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−一特徴 （Ｂ）局在　１．．２０ ＣＤ）池のｔ＃報、／生成物＝“ＢＢ９５３５オリゴマー“（Ｘｌ）配列ノ記載 ：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：Ｉ４０：ＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧ　ＧＣＧＡＴＧＡＣＡ Ｃ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，Ｉ４１についての情報・（ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ　２０　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子”Ｊ：ＤＮＡ （ＩＸ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ＝特徴 （Ｂ）局在　１．．２０ （Ｄ）　ｆｔｈの情報　／生成物＝“ＢＢ９５３８オリゴマー“（Ｘｌ）配列の 記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ４１：ＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧ　ＧＣＴＴＧＴＣＴ ＣＧ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋１４２についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さＩ１７　塩基対 （Ｂ）梨、核酸 （Ｃ）　ｊｌ：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・　１．．１７ （Ｄ）他の情報　／生成物＝“ＢＢ９５３９オリゴマー“（ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：＋４２二ＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡ　ＣＡＧＡＣＴＴ（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４３についての情報；（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：Ｉ９　塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）頑：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在−１，，１９ （Ｄ）　ｌｔｌ！の情報：／生成物＝“ＢＢ９５４０オリゴマー”（ｘｉ）配列 の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１４３：ＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧ　ＣＴＧＧＧＴ ＣＡＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４４についての情１１１１：（１）配列 の特徴； （Ａ）長さＩ２０　塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）　＠：　１本鎖 （Ｄ）形！！ｉ：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ Ｇｘ）特徴； （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２０ ＣＤ）池のｔ１１１９・／生成物＝“ＢＢ９５４１オリコ゛マー”（ｘｉ）配列 の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ４４：ＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴ ＴＣＡ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１４５についての情報。 （ｉ）配列の特Ｉ！＝ （Ａ）長さ＝２２　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１工）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２２ （Ｄ）他の情報　／生成物＝”ＢＢ９５４２オリゴマー″（Ｘｌ）配列の記載： 　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＱ：１４５・ＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧ　ＡＧＣＣＣＡＴＴＣＴ 　ＴＣ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１４６についての情報：（ｉ）配列の特徴 。 （Ａ）長さ　２１　塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 らｔゝ （１１）分子型−ＤＮＡ （１ｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （帥局在：　１．．２１ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“８８１０３７４　オリゴマー“（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ４６：ＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡ Ｇ　Ａ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１４７についての情報：（ｉ）配列の特徴 。 （Ａ）長さＩ２１　塩基対 （Ｂ）　Ｑ、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｅ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２１ ＣＤ）他の情Ｎ：／生成物＝″ＢＢＩ０３７５　オリゴマー”（ｘｉ）配列の記 載＋　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１４７：ＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡ　ＡＴＣＴＴＧＡＡ ＣＣＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：Ｉ４８についての情報；（ｉ）配列の特 徴： （Ａ）長さ：１９　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１９ ＣＤ）池の情報−／生成物＝　”ＢＢ１０３７６　オリゴマー”（ｘｌ）配列の 記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８：ＧＴＣＡＧＡＡＡＣＡ　ＴＣＴＴＴＴＴ ＧＡ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１４９についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｆｆｌ：１本鎖 （Ｄ）形！！Ｉ！：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 ＣＢ）局在：　１．、＋９ （Ｄ）他の情Ｎ：／生成物＝　”ＢＢ１０３７７　ｔ＋）コマ−’（ｘｌ）配列 の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４９：ＧＴＧＴＡＡＧＡＡＴ　ＣＡＣＡＡＣＡ ＡＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＋５０についての情報。 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・２３　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （０鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２３ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ１１２３５　オリゴマー”（ｘｉ）配列の記 載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１５０：ＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡ　ＧＣＴＴＣＴＧＧＡ Ｇ　ＴＧＴ（２）　ＳＥＱ　ｆＤ　ＮＯ＋１５１についての情報（１）配列の特 徴。 （Ａ）長さ、１９　塩基対 （Ｂ）繁　核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （■）分子型：　ＤＮ、’１ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．、＋９ （Ｄ）池の情報、／生成物＝“８Ｂ！０３７９　オリゴマー“（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１：ＡＴＴＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５２じついての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２＠基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２２ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ１０３８０　オリゴマー”（ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１５２：ＡＴＴＡＧＧＣＡＧＡ　ＡＴＣＴＴＣＣＡ ＡＧ　ＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＋５３についての情報：（ｉ）配列の 特徴： （Ａ）長さ：２０　塩基対 ＣＢ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・　１．．２０ （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢ１０３８１　オリゴマー”（ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１５３：ＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴ　ＣＴＡＧＡＡＡＣ ＡＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４についての情報。 （ｉ）配列の特徴コ （Ａ）長さ、１９　塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．１９ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ１０３８２　オリゴマー“（Ｘｌ）配列の記 載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４・ＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴ　ＣＡＧＴＴＴＣＡＡ （２）　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：１５５についての情報：（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　１９　塩基対 （Ｂ）　ｆｉ：核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形管−直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／′ギキー　ｍ１ｓｃ−特徴（Ｂ）局在・　１．　、　＋９ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ１０３８３　オリゴマー”（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：＋５５：ＧＴＣＡＡＧＡＡＧＴ　ＴＧＡＣＡＣＣＴ Ｇ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５６についての情報：（１）配列の特徴・ （Ａ）長さ、２１　塩基対 （Ｂ）型、核酸 （ＣＮＪｔ：１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （ｉｉ）分子：！ｉ！：ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２１ ＣＤ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ１０９６４　オリゴマー“（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１５６＋ＧＣＧＣＴＴＡＧＴＧ　ＴＴＧＡＡＧＡＴ ＧＡ　Ｃ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５７についての情報：（ｉ）配列の特 徴。 ＜Ａ）長さ　２７　塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴。 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２７ ＣＤ）池の情報：／生成物＝“ＢＢ１０３８５　オリゴマー”（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：Ｉ５７：ＧＴＡＡＧＡＧＡＡＡ　ＣＡＴＴＧＡＣＡ ＡＧ　ＣＧＧＴＴＧＧ（２）　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：１５８についての情報・（１ ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４　塩基対 （Ｂ）盟・核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形懇：直線 （ｉｉ）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・　１．　、２４ （Ｄ）池の情報・／生成物＝“８８１０３８６　オリゴマー“（Ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１５８ＴＴＧＡＡＣＣＣＡＴ　ＴＧＴＴＧＡＧＡＴ Ｇ　ＧＧＴＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５９についての情報：（ｉ）配列 の特徴： （Ａ）長さ　２１　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ”）形態：直線 （■）分子型　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２＋ （Ｄ）他の情報二／生成物＝“ＢＢＩ０５２９　オリゴマー”（Ｘｌ）配列の記 載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１５９・ＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴ　ＡＴＴＧＡＧＣＡ ＡＴ　Ｇ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６０についての情報：（１）配列の特 徴： （Ａ）長さ・２６　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー・ｍｉ　ｓｃ＝特徴 （Ｂ）局在：　１．．２６ （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢＩ０５３０　オリゴマー”（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１６０：ＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴ　ＧＧＴＴＣＧＧＡ ＡＣＡＴＴＧＡＧ（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１６１についての情報：（ｉ） 配列の特徴： （Ａ）長さ−２６ａ基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態−直線 （１１）分子型＋　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２６ （Ｄ）他の情報、／生成物＝“ＢＢＩ０５３１　オリゴマー“（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６１：ＣＴＴＧＴＣＴＣＧＡ　ＧＣＧＴＴＣＡＧ ＴＣＡＡＧＡＡＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６２についての情報：（ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：２５　塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）ｉｉ：１本鎖 （Ｄ）形態−直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （１ｘ）特徴。 （Ａ）名前／キーニｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２５ （Ｄ）　池１７）情報：／生成物＝　−ＢＢ１０５３２　オリゴマー“（ｘｉ） 配列の記［：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６２：ＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣ ＣＴＴＡＧ　ＴＣＡＡＧ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１６３についての情報： （ｉ）配列の特徴。 （Ａ）長さ：２７　塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖・　ｌ＊鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型　ＤＮＡ （１ｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．２７ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ１０５３３　オリゴマー”（ｘｉ）配列の記 載　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６３：ＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡ　ＧＡＴＧＧＴＧＧＡ Ｇ　ＣＡＣＡＧＡＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６４についての情報：（］ ）配列の特徴。 （Ａ）長さ　Ｉ９　塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （ｌり分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１９ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ１０５３４　オリゴマー″（ｘｉ）配列の記 載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６４：ＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴ　ＧＣＡＡＧＴＣＡ Ｇ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１６５についての情報。 （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ　２１　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型・ＤＮＡ （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　！、、２１ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ１０５３５　オリゴマー”ｈｉ）配列の記載 ・ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６５・ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴ　 Ｇ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６６についての情報・（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１　塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在二　１．　、２１ （Ｄ）池の情報二／生成物＝　”ＢＢ１０５３６　才ＩＪゴマ−′（ｘｉ）配列 の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６６：ＧＴＡＧＴＣＡＧＣＧ　ＡＣＧＡＡＡ ＴＴＴＴ　ＧＣ２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ・１６７についての情報：（１）配列 の特徴。 （Ａ）長さ＝２２　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ （ｉｘ）特ｙｉ： （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２２ （Ｄ）池の情報：／生成物＝“ＢＢＩＯ１９５オリゴマー”（ｘｉ）配列の記載 ：　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：１６９：ＣＧＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴＧＴ 　ＣＡＡＴＴＧＧＡＡＣＣ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１７０についての情報 ：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）堅：核酸 （Ｃ）鎖；　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在　１．．１７ （Ｄ）他の情報二／生成物＝“ＢＢ６２９６プライマー”（ｘｌ）配列の記載　 ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１７０：ＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡ　ＣＡ己ＴＣＴ （２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１７１ｉ：１ツいテ（Ｄ情報：（ｉ）配列の特徴 ： （Ａ）長さ＝２４塩基対 （８）盟：核酸 （Ｃ）　鎖二　１本鎖 （Ｄ）形！＠：直線 （ＩＯ分分子型　ｃＤＮＡ （１ｘ）特徴 ＣＡ＞名ｎ’ｑ／キー　ｍｌ５ｃ−特徴（Ｂ）局在：　１．．２４ （Ｄ）池０）ｔｎ報：／生成物＝　”ＢＢ８４６１プライマー′（ｘｉ）　配列 の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：Ｉ７１：ＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＧＴ ＴＴＧ　ＡＡＴＡ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７２ニツイＴ（７）情報：（ ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・１７塩基対 （Ｂ）壓　核酸 （Ｃ）鎖、１本鎖 （Ｄ）形態・直線 （１１）分子型　ｃＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー　町ＳＣ−特徴 （Ｂ）局在　１．１７ （Ｄ）池の情報　／生成物＝“ＢＢ８７４０プライマー”（ｘｉ）　配Ｆｌｌ（ ７）ｇｃＪ：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７２：ＧＣＴＡＡＴＧＣＧＧ　ＡＧＧ、 ＩＴＧｃ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ７３１：ツィテノ清報；（ｉ）配列の ＃徴・ （Ａ）長さ：３ｊ塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形管、直線 （１１）分子型　ｃＤＮＡ （ＩＸ）特徴・ （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．３］ （Ｄ）　Ｑの情罷／生成物＝”ＢＢ６３９４プライマー”（ｘｉ）　配列（７） 記載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：ｌ７３ＣＣＧＧＣＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＧ Ａ　ＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡ　Ｃ（２）　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：Ｉ７４ニツィＴ： ノイ訂ｖ。 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、】７塩基対 （Ｂ）梨　核酸 （Ｃ）鎖　１本鎖 （Ｄ）形態　直線 （１１）分子型：　ｃＤＮＡ （１ｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１７ （Ｄ）池の情報：／生成物＝”ＢＢ６０３７プライマー”（ｘｉ）配列の記載　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７４：ＧＣＧＣＡＴ丁ＧＴＴ　ＡＧＡＴＴＴＣ（２）Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７５についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖＝　１本鎖 （Ｄ）形態、直線 （１１）分子型　ｃＤＮＡ （１ｘ）特徴。 （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在＋　１．．２４ （Ｄ）他の情報：／生成物＝　”ＢＢ６８４１プライマー″（ｘｌ）配列の記載 ：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１７５：ＣＴＴ、ＡＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＴＧＣＡＣ Ａ　ＡＡＣＧ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ７６についての情報：（１）配列 の特徴： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （１１）分子型：　ｃＤＮＡ （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．２８ ＣＤ＞他の情報；／生成物＝“ＢＢ６１８９プライマー“（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：Ｉ７６：ＧＴＣＡＴＧＴＣＴＡ　ＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣ ＴＴＡＴＴＡＡＣ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ７７についての情報：（１） 配列の特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖・　１本鎖 （Ｄ）形態；直線 （ｉｉ）分子型：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名前／キー・ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在・１．．２４ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ８６６１プライマー“（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７７：ＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡ　ＡＣＡＡＣＴＴＡＴＧ 　ＣＡＴＴ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１７８についての慣ｌｌｉ：（ｉ）配 列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖：　１本鎖 （Ｄ）形態：直線 （ｉ　ｉ）分子型：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）局在：　１．．１７ ＣＤ）他の情報：／生成物＝“ＢＢ６０３８プライマー”（ｘｉ）配列の記載： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７８：ＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡ　ＴＡＣＡＡＣＣ図ＩＡ 図ＩＢ 図１０　疫 八 （。 図２ 図３ 図４ 図５ 図６ Ａ　檀準 ブルー　デキストラン　２０００ｋＤ シンザイム　１４ｋＤ Ｂ　アルドラーゼ　１５８ｋＤ ＣＭＩＰ−１ａ　５００−８００ｋＤ Ｄ　ＬＤ７８　３００−７００ｋＤ Ｅ　ＡＣＴ−２５００−１０００ｋＤ 図７ ５　マーカー 図８ 図９ １０’　Ｘ　モル楕円率 図１０ ｔｏ”ｔモル楕円率 Ｍｌつ 図１３ ｑｌ ぐ 図１４ 図１９ 単量体　２量体　４量体　１２！体　野性型多量体状態 図２Ｑ 特表千７−５０２４０４　（１０Ｉ） Ｖ−ｆ１４’ｌ°ん 、、ｌｌｉ＋ＰＣＴ／Ｇ１１９２１０２３９０フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：８４） （Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８４） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。 ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ。 ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎ○、　Ｎ Ｚ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＡ、　ＵＳ（７２）発明者　ハンター 、ミカエル　ジョージイギリス国、オックスフォード　オーエックス４５エルワ イ、カウリー、ウオトリントン　ロード（番地なし）　ブリティッシュ　バイオ −テクノロジー　リミテッド内 ＦＩ （７２）発明者　ニドワード、リチャード　マークイギリス国、オックスフォー ド　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォトリントン　ロード（番地なし ）　ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド内 （７２）発明者　ツァプレウスキー、ロイド　ジョージイギリス国、オックスフ ォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォトリントン　ロード（番地 なし）　ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド内 （７２）発明者　ギルバート、リチャード　ジェームスイギリス国、オックスフ ォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォトリントン　ロード（番地 なし）　ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド内

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．生理的イオン強度において、１２量体より高次の安定な多量体形成をする能 力が実質的にない分子である幹細胞阻害（ＳＣＩ）活性を有するタンパク様分子 。
2. ２．生理的イオン強度において、４量体より高次の安定な多量体形成をする能力 が実質的にない請求項１記載の分子。
3. ３．生理的イオン強度において、４量体の実質的に均質の集団を形成する請求項 ２記載の分子。
4. ４．生理的イオン強度において、２量体より高次の安定な多量体を形成をする能 力が実質的にない請求項１記載の分子。
5. ５．生理的イオン強度において、単量体より高次の安定な多量体形成をする能力 が実質的にない請求項１記載の分子。
6. ６．天然ＳＣＩに比較して、２量体、４量体、１２量体もしくは高次複合体の成 分の会合の促進および／もしくは安定化に含まれる１もしくはそれ以上のアミノ 酸残基が、より少ない促進および／もしくは安定化効果を有するように変質され た天然ＳＣＩの類似体である請求項１から５のいずれか１つに記載の分子。
7. ７．天然ＳＣＩがＬＤ７８もしくはＭＩＰ−１αである請求項６記載の分子。
8. ８．変質が置換である請求項６記載の分子。
9. ９．置換が電荷反発を生じさせるようなものである請求項８記載の分子。
10. １０．疎水性残基が親水性残基で置換されている請求項８記載の分子。
11. １１．荷電した残基が、中性残基で置換されている請求項８記載の分子。
12. １２．大きな、強く疎水性な残基が、小さな、弱く疎水性な残基で置換された請 求項６記載の分子。
13. １３．置換が、ＬＤ７８の残基１２から１６の１もしくはそれ以上で行われてい る請求項８から１２のいずれか１つに記載の分子。
14. １４．置換が、ＩＩｅ１９＞Ａｌａおよび／もしくはＶａ１３９＞Ａ１ａである 請求項１２記載の分子。
15. １５．置換が、β−シートの鎖１、および／もしくは該シートの鎖２および３間 の曲りにおいて、２量体の表面から突き出している残基の１つもしくはそれ以上 において行われている請求項８から１１のいずれか１つに記載の分子。
16. １６．置換が、ＬＤ７８の残基２４から２９（を含む）および／もしくはＬＤ７ ８の４３から４７（を含む）間で行われている請求項１５記載の分子。
17. １７．置換が、（ｉ）ｌｌｅ２４＞Ａｓｎ，（ｉｉ）Ｔｙｒ２７＞Ａｓｎ，（ｉ ｉｉ）Ｐｈｅ２８＞Ｇｌｕ，（ｉｖ）Ｇｌｕ２９＞Ａｒｇ，（ｖ）Ｌｙｓ４４＞ Ｇｌｕ（特にＡｒｇ４５＞Ｇｌｎと共に）、および／もしくは（ｖｉ）Ａｒｇ４ ５＞Ｇｌｕである請求項１６記載の分子。
18. １８．置換が、鎖Ｎ末端をシートの鎖１の方向に形成する少なくとも１つの残基 で行われている請求項８から１２のいずれか１に記載の分子。
19. １９．野生型ＬＤ７８に関して、少なくとも１つの次の置換：Ｌｙｓ４４＞Ｇｌ ｕ（とともにＡｒｇ４５＞Ｇｌｎ），Ａｒｇ４７＞Ｇｌｕ，Ｐｈｅ２８＞Ｇｌｕ ，Ｐｈｅ２８＞Ｇｌｕ（とともにＧｌｎ４８＞Ｇｌｕ），Ｐｈｅ２８＞Ｇｌｕ（ とともにＡｒｇ４７＞Ｇｌｕ），Ａｒｇ１７＞Ｓｅｒ（とともにＧｌｎ１８＞Ｇ ｌｕ），Ｐｈｅ１２＞Ａｌａ，Ｖａｌ３９＞Ａｌａ，Ｉｌｅ４０＞Ａｉａ，Ａｓ ｐ２６＞Ａｌａ（とともにＧｌｕ２９＞Ａｒｇ　ａｎｄ　Ａｒｇ４７＞Ｇｌｕ） ，Ａｒｇ１７＞Ｓｅｒ，Ｇｌｕ２９＞Ａｒｇ，Ｇｌｎ１８＞Ｇｌｕ，Ａｓｐ２６ ＞Ｓｅｒ，Ｇｌｎ４８＞Ｓｅｒ，Ｔｈｒ１５＞Ａｌａ，Ｇｌｎ２１＞Ｓｅｒ，Ｐ ｈｅ２３＞Ａｌａ，Ｓｅｒ３２＞Ａｌａ，Ａｌａ５１＞Ｓｅｒ，Ａｌａ４＞Ｇｌ ｕ，Ｐｈｅ１２＞Ａｓｐ，Ａｓｐ２６＞Ｇｌｎ，Ｌｙｓ３６＞Ｇｌｕ，Ｌｙｓ４ ４＞Ｇｌｕ，Ａｒｇ４５＞Ｇｌｕ，Ｇｌｕ６６＞Ｇｌｎ，Ｐｈｅ１２＞Ｇｌｎ， Ｌｙｓ４４＞Ｓｅｒ，Ａｒｇ１７＞Ｇｌｕ（とともにＧｌｎ１．８＞Ｇｌｕ）， Ａｓｐ２６＞Ａｌａ，Ｇｌｕ６６＞Ｓｅｒ．を有するＬＤ７８類似体である請求 項１から８のいずれか１つに記載の分子。
20. ２０．野生型ＬＤ７８に関して、少なくとも１つの次の置換：Ａｒｇ１７＞Ｓｅ ｒ，Ｇｌｕ２９＞Ａｒｇ，Ｇｌｎ１８＞Ｇｌｕ，Ａｓｐ２６＞Ｓｅｒ，Ｇｌｎ４ ８＞Ｓｅｒ，Ｔｈｒ１５＞Ａｌａ，Ｇｌｎ２１＞Ｓｅｒ，Ｐｈｅ２３＞Ａｌａ， Ｓｅｒ３２＞Ａｌａ，Ａｌａ５１＞Ｓｅｒ，Ａｌａ４＞Ｇｌｕ，Ｐｈｅ１２＞Ａ ｓｐ，Ａｓｐ２６＞Ｇｌｎ，Ｌｙｓ３６＞Ｇｌｕ，Ｌｙｓ４４＞Ｇｌｕ，Ａｒｇ ４５＞Ｇｌｕ，Ｇｌｕ６６＞Ｇｌｎ，Ｐｈｅ１２＞Ｇｌｎ，Ｌｙｓ４４＞Ｓｅｒ ，Ａｒｇ１７＞Ｇｌｕ（とともにＧｌｎ１８＞Ｇｌｕ），Ａｓｐ２６＞、Ａｌａ ，Ｇｌｕ６６＞Ｓｅｒ．を有するＬＤ７８類似体である請求項１から８のいずれ か１つに記載の分子。
21. ２１．野生型ＬＤ７８に関して、少なくとも１つの次の置換：Ｐｈｅ１２＞Ｇｌ ｎ，Ｌｙｓ４４＞Ｓｅｒ，Ａｒｇ１７＞Ｇｌｕ（とともにＧｌｎ１８＞Ｇｌｕ） ，Ａｓｐ２６＞Ａｌａ，Ｇｌｕ６６＞Ｓｅｒ． を有するＬＤ７８類似体である請求項１から８のいずれか１つに記載の分子。
22. ２２．野生型ＬＤ７８に関して、少なくとも１つの次の置換：Ａｓｐ２６＞Ａｌ ａ，Ｇｌｕ６６＞Ｓｅｒを有するＬＤ７８類似体である請求項１から８のいずれ か１つに記載の分子。
23. ２３．ＬＤ７８（Ａｓｐ２６＞Ａｌａ）。
24. ２４．ＬＤ７８（Ｇｌｕ６６＞Ｓｅｒ）。
25. ２５．実質的にＬＤ７８に相当するが、以下のアミノ酸残基：Ｓｅｒ１，Ｌｅｕ ２，Ａｌａ３，Ａｌａ４，Ａｓｐ５，Ｔｂｒ６，Ａｌａ９，Ｐｈｅ１２，Ｓｅｒ １３，Ｔｙｒ１４，Ｓｅｒ１６，Ａｒｇ１７，Ｇｌｎ１８，Ｉｌｅ１９，Ｐｒｏ ２０，Ｇｌｎ２１，Ｐｈｅ２３，Ｉｌｅ２４，Ａｓｐ２６，Ｔｙｒ２７，Ｐｈｅ ２８，Ｇｌｕ２９，Ｓｅｒ３１，Ｓｅｒ３２，Ｇｉｎ３３，Ｓｅｒ３５，Ｌｙｓ ３６，Ｐｒｏ３７，Ｇｌｙ３８，Ｖａｌ３９，ＩＩｅ４０，Ｌｅｕ４２，Ｔｈｒ ４３、Ｌｙｓ４４，Ａｒｇ４５，Ｓｅｒ４６，、Ａｒｇ４７、Ｇｌｎ４８，Ａｓ ｐ５２，Ｇｌｕ５５，Ｇｉｕ５６、Ｇｌｎ５９，Ｌｙｓ６０，Ｔｙｒ６１，Ｖａ ｌ６２，Ａｓｐ６４，Ｌｅｕ６５，Ｌｅｕ６７，Ｇｌｕ６６，Ｓｅｒ６８および Ａｌａ６９． の１つもしくはそれ以上（しかし、好ましくは２以上でない）での変異を有する 配列からなる請求項１から１２のいずれか１つに記載の分子。
26. ２６．ＬＤ７８類似体であり、Ｓｅｒ−１の上位にいかなるＮ末端延長も有しな い請求項１から２５のいずれか１つに記載の分子。
27. ２７．ＬＤ７８類似体であり、野生型分子と比較して、１から７までの残基のＮ 末端欠失を有する請求項１から２６のいずれか１つに記載の分子。
28. ２８．実質的にＭＩＰ−１αに相当するが、以下のアミノ酸残基：Ａｌａ１，Ｐ ｒｏ２，Ｔｙｒ３，Ｇｌｙ４，Ａｌａ５，Ａｓｐ６，Ｔｂｒ７，Ａｌａ１０，Ｐ ｈｅ１３，Ｓｅｒ１４，Ｔｙｒ１５，Ｓｅｒ１６，Ａｒｇ１７，Ｌｙｓ１８，Ｉ ｌｅ１９，Ｐｒｏ２０，Ａｒｇ２１，Ｐｈｅ２３，Ｉｌｅ２４，Ａｓｐ２６，Ｐ ｈｅ２８，Ｇｌｕ２９，Ｓｅｒ３１，Ｓｅｒ３２，Ｇｌｕ３３，Ｓｅｒ３５．Ｇ ｌｎ３６，Ｐｒｏ３７，Ｇｌｙ３８，Ｖａｌ３９，Ｉｌｅ４０，Ｌｅｕ４２，Ｔ ｈｒ４３，Ｌｙｓ４４，Ａｒｇ４５，Ａｓｎ４６，Ａｒｇ４７，Ｇｌｎ４８，Ａ ｓｐ５２，Ｇｌｕ５５，Ｔｈｒ５６，Ｇｌｎ５９，Ｇｌｕ６０，Ｔｙｒ６１，Ｉ ｌｅ６２，Ａｓｐ６４，Ｌｅｕ６５，Ｇｌｕ６６，Ｌｅｕ６７，Ａｓｎ６８およ びＡｌａ６９． の１つもしくはそれ以上（しかし、好ましくは２以上でない）で変異を有する配 列からなる請求項１から１２のいずれか１つに記載の分子。
29. ２９．請求項１から２８のいずれか１つ記載されたタンパク質をコードしている 核酸。
30. ３０．ベクターの形での組換えＤＮＡである請求項２９記載の核酸。
31. ３１．請求項３０記載のベクターで形質移入もしくは形質転換された宿主細胞。
32. ３２．医薬への使用のための請求項１から２８のいずれか１つに記載の化合物。
33. ３３．幹細胞保護剤としての使用のための薬剤の製造における請求項１から２８ のいずれか１つに記載の化合物の使用。
34. ３４．請求項１から２８のいずれか１つに記載された化合物と医薬的に許容され うる担体とからなる医薬製剤。
35. ３５．エス．セレビシェ中での請求項２９記載の核酸の発現による請求項１から ２８のいずれか１つに記載の化合物を産生する方法。
36. ３６．ピーバストリス中での請求項２９記載の核酸の発現による請求項１から２ ８のいずれか１つに記載の化合物を産生する方法。
37. ３７．分子についてコードする発現可能な非相同核酸を有するピシャ属、および 好ましくはバストリス種の酵母を培養することからなる幹細胞阻害活性を有する 分子の生産方法。
38. ３８．多量体タンパク質についてでなく、代りに多量体タンパク質と比較して、 可溶性多量体複合体を形成する傾向が減少された変異体をコードしているＤＮＡ からなるベクターで形質転換もしくは形質移入された発現系細胞における使用か らなり、所望のタンパク質が、通常、生理的イオン強度において可溶性多量体複 合体（‘多量体タンパク質′）を形成する系においてタンパク質発現レベルを増 加する方法。
39. ３９．タンパク質が幹細胞阻害活性を有する請求項３８記載の方法。