CZ301148B6 - Zpusob pestování lidských mezenchymových kmenových bunek, zejména pro lécbu nehojících se fraktur, a bioreaktor k provádení tohoto zpusobu - Google Patents

Abstract

Podstata rešení spocívá ve zpusobu pestování mezenchymových kmenových bunek, ve kterém po aseptickém oddelení mononukleárních bunek z drenové krve jsou tyto nasazeny v nízké hustote do sterilních plastových kultivacních nádobek a pestovány po dobu cca jednoho až trí týdnu v médiu CellGro.sup.TM.n. hematopoietic stem cell, schváleném pro klinické použití s prídavkem 10% lidského séra a suplementu, pricemž v prubehu kultivace jsou alespon jednou pridány suplementy, aniž je treba odmývat neadherentní hemopoetické bunky, aniž je treba menit živný roztok a aniž je jakkoli treba zasahovat do uzavreného kultivacního systému za bežných podmínek pro pestování tkánových kultur. Pro pestování mezenchymových kmenových bunek v uzavreném kultivacním systému ke klinickému použití v oblasti rekonstrukcní ortopedie je navržen jednoduchý bioreaktor, sestávající z kazetove razených kultivacních nádobek s filtry pro zabezpecení sterilní výmeny vzduchu a s aseptickými vstupy pro nasazování a sklizení bunek a pro doplnování suplementu, spocívajících volne ve vhodném nosici.

Description

Vynález se týká způsobu pěstování lidských mezenchymových kmenových buněk v kvalitě nutné ke klinickému použiti, zejména pro léčbu nebojících se fraktur jako náhrada současných způsobů implantace autologních a alogenních kostních štěpů či autologních, nemanipulovaných dřeňo10 vých buněk. Dále se vynález týká zařízení, tj. bioreaktoru k provádění tohoto způsobu.

Ρο^άηί stay te^haiky

Nehojící se zlomeniny jsou poměrně Častou ortopedickou komplikací, jejíž celková frekvence činí 3 %, ale například u lýtkových kostí je to 9 % a u otevřených zlomenin, spojených s poškozením okolních měkkých tkání, až 75 % (Csongradi JJ, and Maloney WJ, Ummited lower limb fractures. West J Med. 1989; 150: 675-680). Mezi další rizikové faktory, predikující pravděpodobnost špatného hojení či nezhojení fraktury, patří kouření, abusus alkoholu, obezita, špatné postavení kostních úlomků, osteopenie a použitá chirurgická metoda léčby (Chen F et al: Smolo king and bony union afier ulna-shortening osteotomy. Am J Orthop. 2001: 30: 486-489: Foulk DA. and Szabo RM: Diaphyseai humerus fractures: natural history and occurence ofnommion. Orthopedics. 1995: 18: 333-335; Nilsson LT, et al, Factors predicting healing complications in femoral neck fractures. 138 patients followed for 2 years. Acta Orthop. Scand 1993; 64: 175177; Heetveld MJ, et al: Interna! fixation for displacedfractures of the femoral neck. Does bone density affěct clinical outcome? JBone Joint Surg Br. 2005; 87:367-373).

Sama definice Špatně se hojících či nebojících se zlomenin není jednoznačná. Někteří autoři se spokojují pouze s definicí radiologickou a funkční (palpační bolest v místě zlomeniny, bolest při zátěží a absence překlenuj ícího kostěného svalku - Sarmiento A, et al: Factors influencing the outcome of closed tibial fractures treated with functional bracing. Clin Orthop. 1995; 315: 824), Mezi ortopedy neexistuje ani jednoznačná shoda ohledně toho, za jak dlouho by se měla zlomenina zhojit - v recentně publikovaném dotazníkovém průzkumu 444 ortopedů byla průměrná doba 3,5 ± 1,4 měsíce pokládána za kritérium opožděného hojení a doba 6.3 + 2.1 měsíce za kritérium pro nezhojení (Bhandari M, et al: A lack of consensus in the asessment of fracture healing among orthopaedic surgeons. J Orthop Trauma. 2002; 16: 562-566). Obdobné časové údaje je možno nalézt i v ortopedických učebnicích (Bucholz RW: Tibial shafi fractures. In: Orthopaedic Decision Making. 2nd ed St. Louis MO: Mosby; 1996: 74; Gorczyca JT: Tibial shaft fractures. In: Brinker MR ed Review of Orthopaedic Trauma. Philadelphia, PA; Saunders; 2001:127). Shoda ohledně časového údaje pro opožděné zhojení či nezhojení je přitom důležitá, protože po uplynutí očekávaného období většinou následuje další terapie.

Mezi klasické metody léčby špatně se hojících a nehojících zlomenin patří adekvátní imobilizace, dosažená většinou za pomoci zevního (Green SA, et al: Extemal fixation for the uninfected angulated nonunion of the tibia. Clin Orthop. 1984; 190:204-211) či vnitřního hřebování, auto45 logní či alogenní kostní štěp, případně kombinace několika těchto postupů (Wang JW, and Weng LH: Treatment of distal femoral nonunion with intemal fixation, cortical allografi struts, and autogenous bone-grafting. J Bone Joint SurgAm. 2003; 85: 436- 440). Všechny tyto způsoby léčby mají své nevýhody - zevní hřebování (včetně populární Ilizarovovy metody - Ilizarov GA, et al: Treatment of dosed diaphysial fractures of long tubular bones by means of transosseous so osteosynthesis. Sov Med 1983; 9: 21-24) s sebou nese zvýšené riziko infekce, vnitřní hřebování může poškodit vaskulámí zásobení místa zlomeniny, objem autolognOio Štěpu je omezený a užití alogenního štěpu s sebou nese sice malé, ale přece jen jisté riziko infekční či chemické kontaminace nebo imunní reakce ze strany hostitele.

-ICZ 301148 B6

V roce 1989 Connoly poprvé publikoval výsledky léčby nehojících se fraktur dlouhých kostí pomocí injekce dřeňové krve do zlomového místa (Connoly JF, et al: Autologous marrow injection for delayed unions of the tibia: a preliminary report. J Orthop Trauma. 1989: 3: 276282). Z prvních 10 pacientů se devět uzdravilo, přičemž morbidita procedury byla podstatně menší než by byla očekávaná morbidita standardních operačních procedur využívajících autologní či alogenní kostní štěpy. Podstata této metody spočívá vtom, že kostní dřeň obsahuje osteoblastické i osteoklastové prekurzoty i prekurzorové buňky cévní, a při místní aplikaci může podstatně urychlit tvorbu přemosťujícího svalku, obnovit cévní zásobení a podílet se na resorpci nekrotické kosti. V současné době je tato metoda užívána ve spojení s moderní technikou zpraco10 vání kostní krve, původně vyvinutou pro transplantace kostní dřeně pacientům s nádorovými chorobami krvetvorby či poruchami imunity. Hemigou léčil šedesát pacientů mononukleámím koncentrátem, získaným ze 350 ml dřeňové krve a všímal si přitom množství osteogenních či mezenchymových progenitorů, vyjádřených v jednotkách CFU-F (jedná se o množství klonogenních mezenchymových buněk, schopných tvorby kolonií na plastovém adherentním povrchu).

Zatímco 53 pacientů, u nichž došlo k úspěšnému zhojení fraktury, obdrželo průměrně 54 962 ± 17 431 CFU-F do místa zlomu, 7 pacientů, u nichž ke zhojení nedošlo, obdrželo pouze 19 324 i 6843 progenitorů (p < 0,01). Je tedy zřejmé, že i při odběru značného množství dřeňové krve nemusí být v získaném aspirátu dostatek osteoblastových prekurzorů, nutných ke zhojení fraktury (Hernigou P, et al: Percutaneous autologous bone-marrow graftingfor nonunions. J Bone Joint

SurgAm. 2005; 87: 1430-1437).

Předchůdci osteoblastových prekurzorů jsou takzvané mezenchymové kmenové ěi podle nové nomenklatury dřeňové stromální buňky (MSC). Jde o vzácné buňky vyskytující se v kostní dřeni s frekvencí zhruba 10^ až 10^ jaderných buněk, v závislosti na věku pacienta (Werntz JR, et al:

Qualitative and quantitative analysis oforthotopic bone regeneration by marrow. J Orthop Res. 1996; 14: 85-93). Tyto buňky jsou schopné diferenciace v buňky specializovaných tkání - podpůrného stromatu krvetvorné tkáně, v kostní tkáň, šlachu, chrupavku, srdeční sval aj., ato buď po přenesení do příslušného permisívního prostředí in vivo (Bruder SP, et al: The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects.

J Bone Joint Surg Am. 1998; Jul; 80: 985-996; Jiang X etal: Pluripotency of mesenchymal stem cells derivedfrom adult marrow. Nátuře. 2002; 418: 41-49) nebo po poskytnutí diferenciačních podnětů in vitro (Pittenger MF, et al: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284: 143-147; Reyes M, et al: Purification and ex vivo expansio of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood. 2001; 98: 2615-2625; Makino S, et al: Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J din Invest. 1999; 103; 697-705). Tyto vlastnosti MSC vzbuzují nejen naděje na nové způsoby léčby defektů kostí a chrupavek, ale například i infarktu myokardu (Pittenger MF, and Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res. 2004; 95: 9-20) či mozkomíšních poranění a defektů (Jendelová P, Herynek V, DeCroos J, et al. Imaging the fale of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn Reson Med. 2003; 50: 767-776).

Pro klinické využití mezenchymových kmenových buněk je nejprve třeba je rychle rozmnožit (expandovat) ze dřeňové krve, a to způsobem odpovídajícím podmínkám dobré výrobní praxe (good manufacturing practice, GMP). Příprava buněk podle podmínek dobré klinické praxe předpokládá jejich kultivaci v nádobách schválených k tomuto účelu, v médiích schválených k tomuto účelu a v prostorách schválených k tomuto účelu příslušnou pověřenou institucí (v České republice Státní ústav pro kontrolu léčiv, SÚKL). V České republice toho času není možno připravovat MSC ke klinickým účelům, a to především z důvodů současné praxe přípravy mezenchymových buněk:

1. Způsob klasické přípravy mezenchymových kmenových buněk klade velké nároky na čistotu prostředí. Příprava probíhá tak, že mononukleární buňky z kostní krve jsou resuspendovány v živném médiu v plastových či skleněných nádobách a ponechány 1 až 3 dny adherovat k povrchu těchto nádob. Po uvedené době jsou neadherentní buňky odmyty a k adherentním buňkám je přiCZ 301148 B6 dáno nové médium, které je měněno většinou 2x týdně (DiGirolamo CM, et al: Propagation and senescence of human marrow stromaž cells in culture: a simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate. Br J Haematol. 1999: 107:

275-281; Colter DC, et al: Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of píastic adhe5 rent cells from human bone marrow. Proč Nati Acad Sci USA. 2000; 97: 3213-3218). Při těchto manipulacích je nutno kultivační nádoby otevírat, což zvyšuje riziko mikrobiální kontaminace. Za 2-3 týdny kultivace je dno nádoby pokryto 70 až 90% splývavou vrstvou mezenchymových buněk, přičemž ze 7.5 až 10 miliónů jaderných buněk je možno získat kolem 0.4. až 1.0 miliónu buněk mezenchymových (příklad 3).

io

2. Klasickým prostředím pro pěstování mezenchymových kmenových buněk je Dulbeccovo modifikované Éaglovo médium (DMEM) či Eaglovo minimální esenciální médium v alfa- modifikaci (alfa-MEM) s 10 až 20% fetálním telecím sérem (Coelho MJ, Trigo Cabral A, and Fernandes MH: Human bone cell cultures in biocompatibility testing. Part 1: osteoblastic diffe15 rentiation of serially passaged human bone marrow cells cultured in a-MEM and in DMEM.

Biomaterials. 2000; 21:1087-1094; NovotováE, Strnadova H, Procházka B, a Pytlík R. In vitro kultivace mezenchymových kmenových buněk u pacientů s lymfoidnimi malignitami. Transfuse dnes, 2003; 9: 28-34). Ani DMEM, ani alfa-MEM nejsou tč. schváleny ke klinickému použití a použití zvířecího séra je v současné době považováno za velmi problematické vzhledem k mož20 nosti přenosu zvířecích onemocnění (např. bovinní spongifortnní encefalopatie, BSE) a vzhledem k možnosti vzniku prudkých alergických (anafylaktických) reakcí na zvířecí bílkovinu, zejména pokud by byly buňky u téhož pacienta používány opakovaně (Mackensen A, et al: Presence of IgE antibodies to bovine sérum albumin in a patient developing anaphylaxis after vaccination with human peptide-pulsed dendritic cells. Cancer Immunol Immunother. 2000; 49:152-156).

3. Klasickým způsobem uvedeným v bodu 1 není možno získat dostatečné množství MSC pro klinické použití v průběhu jednorázové expanze. Buňky je nutno 1 až 2x přesazovat (pasážovat), což zvyšuje riziko nákazy buněčné kultury a též prodlužuje dobu mezi odběrem dřeňové krve a získáním konečného produktu pro buněčnou terapii na 4 až 6 týdnů. Kromě toho se zdá, že v průběhu pasážování mezenchymové kmenové buňky ztrácejí schopnost diferenciace ve specializované tkáně (Sugiura F, Kitoh H, Ischiguro N. Osteogenic potential of rat mesenchymal stem cells after severalpassages. Bioch Bioph Res Comm. 2004; 316:233-239).

Uvedená omezení se snažila vyřešit celá řada autorů, avšak žádný z nich dosud nezpracoval tuto problematiku komplexním způsobem. Již v roce 1995 zkoumali Gronthos a Simmons efekt 25 rekombinantních růstových faktorů na kultivaci dřeňových stromálních buněk (Gronthos S, and Simmons PJ: The growth factor requirements fo STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived contitions in vitro. Blood. 1995; 85: 929-940). Zjistili, že nejlepšího růstu CFU-F je možno docílit kombinací kyseliny askorbové, dexamethasonu, destičko40 vého růstového faktoru BB (PDGF-BB) a epidermálního růstového faktoru (EGF). Jing-Xiang se spolupracovníky zjistili, že rekombinantní lidský monocytový kolonie-stimulující faktor (rh M-CSF) zvyšuje množství CFU-F o 25% a celkové množství kultivovaných MSC 8-1 Ox (JinXiang F, et al: Homing efftciency and hematopoietic reconstitution of bone marrow-derived stroma cells expanded by recombinant human macrophage-colony stimulating factor in vitro.

Exp Hematol 2004; 32: 1204-1211). Tsutsumi se spolupracovníky prokázali, že mezenchymové kmenové buňky expandované s fibroblastovým růstovým faktorem 2 (FGF-2) si zachovávají lepší schopnost diferenciace ve srovnání s MSC expandovanými bez tohoto faktoru (Tsutsumi S, et al. Retention of multilineage dijferentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF. Bioch Bioph Res Comm 2001; 288: 413-419). Z těchto prací vyplývá, že užití určitých suplementů či růstových faktorů, z nichž většinu je dnes možno vyrobit rekombinantním způsobem, může být výhodné jak pro zvýšení množství mezenchymových kmenových buněk, tak i pro zachování jejich schopností vytvářet specializované tkáně.

Další autoři se snažili obejít se bez přítomnosti fetálního telecího séra v kultivačním médiu.

Obecně lze říci, že pokusy o pěstování MSC ve zcela bezsérových podmínkách neměly úspěch (Hankey DP, et al: Enhacement of human osteoblast proliferation and phenotypic expression when cultured in human sérum. Acta Orthop Scand. 2001; 72: 395-403), což je ve shodě s našimi vlastními experimenty (příklad 3). Lepších, i když nejednoznačných výsledků bylo dosahováno s lidským sérem či lidskou plazmou - v některých studiích bylo dosaženo lepších výsledků s lidským autologním sérem (Stute N, et al: Autologous sérum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cellsforclinical use. ExpHematol. 2004; 32: 1212-1225), či s lidskou autologní plazmou (Schecroun N, and Delloye Ch: In vitro growth and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells supporte by autologous plasma. Bone. 2004; 35: 517524), než s fetálním telecím sérem, ale např. studie Kuznetzova tyto výsledky nepotvrdila io (Kuznetsov SA, Mankani MH, and Robey PG. Effet of sérum on human bone marrow stromal cells: ex vivo expansion and in vivo bone formation. Transplantation. 2000; 70; 1780-1787). Naše vlastní experimenty shrnuté v příkladu 3 ukazují, že tyto nejednoznačné výsledky mohou být způsobeny výraznou interindividuální variabilitou růstu buněk od různých jedinců při použití poolovaného lidského séra bez dalších suplementů a že užití lidské autologní plazmy se suple15 menty nevede k lepším výsledkům než použití lidského poolovaného séra,

V roce 2003 ukázala práce Bakshe, Daviese a Zandstry, že mezenchymové buňky jsou schopné růstu a proliferace i v neadherentní buněčné suspenzi, a to za předpokladu, že nejsou odstraněny hemopoetické buňky (Baksch D, Davies JE, and Zandstra PIV. Adult human bone marrow-deri20 ved mesenchymal progenitor cells are capable of adhesion-independent survival and expansion.

Exp Hematol. 2003; 31: 723-732). V roce 2005 stejní autoři ukázali, že expanze CFU-F aCFUO (osteoblastové kolonie formující jednotky, funkční test udávající množství mononukleámích buněk ve zkoumaném vzorku, které jsou schopny dát vzrůst koloniím osteoblastových buněk) v neadherentních kulturách je při společné kultivaci s krvetvornými buňkami lepší, než pokud jsou krvetvorné buňky z kultury odstraněny (Baksch D, Davies JE, and Zandstra PW. Soluble factor cross-talk between human bone marrow-derived hematopotetic and mesenchymal cells enhances in vitro CFU-F and CFU-0 growth and reveals heterogeneity in the mesenchymal progenitor cell compartment. Blood. 2005; 106: 3012-3019). Vzhledem k tomu, že je známo, že stromální buňky a kostní buňky (osteoblasty) mají příznivý vliv na tvorbu buněk krvetvorných (Taichman

RS. Blood and bone: two tissures whose fates are intertwinned to create the hematopoietic stemcell niche. Blood, 2005; 105: 2631-2639), zdá se logické, že na oplátku i krvetvorné buňky přispívají k lepšímu růstu buněk stromálních. Ve stejné době, kdy byla publikována první práce citovaná v tomto odstavci, zahájili jsme naše vlastní experimenty se společnou kultivací krvetvorných a stromálních buněk, ovšem v běžných, adherentních kulturách. Podobně jako Baksh,

Davies a Zandstra jsme došli k závěru, že ponechání hemopoetických krvetvorných buněk v systému nejenže růstu stromálních buněk nevadí, ale za určitých okolností může být i přínosné.

Z dosud uvedeného je zřejmé, že určité aspekty kultivace mezenchymových kmenových buněk či dřeňových stromálních buněk jsou v současné době do jisté míry prozkoumány, ale žádná z uve40 děných prací se nezabývá syntézou jednotlivých poznatků se zřetelem na vytvoření funkčního a reprodukovatelného systému rychlé kultivace mezenchymových kmenových buněk pro klinické použití. Předložený vynález si klade za cíl kultivaci dostatečného množství mezenchymových kmenových buněk v co nejkratším čase a v podmínkách, které budou vyhovovat správné výrobní praxi (GCP) a které současně bude možno vytvořit bez extrémních investičních a provozních nákladů ve stávajících centrech, zabývajících se zpracováním krve a krvetvorných buněk pro klinické užití.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je způsob pěstování mezenchymových kmenových buněk, zejména pro léčbu nehoj ících se fraktur, z mononukleámích buněk dřeňové krve, jehož podstata spočívá v tom, že kultivace buněk se provádí jednorázově v uzavřeném systému v médiu schváleném pro klinické použití s přídavkem 10% lidského séra a suplementů, bez zvířecích bílkovin, bez odstraňování hemopoetických buněk a bez výměny živného roztoku v průběhu kultivace za běžných podmínek pro pěstování tkáňových kultur.

io Význakem předloženého vynálezu je, že jako suplementy se používají dexamethason, kyselina askorbová, lidský rekombinantní inzulín, lidský rekombinantní PDGF-BB a lidský rekombinantní EGF v kombinaci s lidským rekombinantním FGF-2 a lidským rekombinantním M-CSF.

Význakem předloženého vynálezu dále je, že jako médium schválené pro klinické použití se pou15 žívá CellGro™ Hematopoietic Stem Cell medium.

Význakem předloženého vynálezu také je, že během kultivace buněk se alespoň jednou přidávají suplementy.

Dalším význakem předloženého vynálezu je, že se kultivace buněk provádí pod dobu jednoho až tří týdnů, s výhodou po dobu 13 až 17 dní.

Předmětem předloženého vynálezu je dále bíoreaktor k provádění způsobu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že sestává z nosiče a z uzavřených plastových kultivačních nádobek, které jsou opatřeny filtry pro zabezpečení sterilní výměny vzduchu a aseptickými vstupy pro nasazování a sklizeň buněk a přídavky suplementů, přičemž kultivační nádobky jsou umístěny, nejlépe kazetovým způsobem, v nosiči.

Nosič podle předloženého vynálezu je tvořen dvěma rámy spojenými nosnými dráty uloženými kolmo krámům a připevněnými v pravidelných rozestupech k bočním stranám rámů.

Nosič je podle předloženého vynálezu s výhodou kovový, a to zhotovený z nerezové nebo jinak upravené zušlechtěné oceli, popřípadě mědi. Je rovněž možné nosič vyrobit z jiných vhodných materiálů.

Při provádění způsobu pěstování mezenchymových kmenových buněk podle předloženého vynálezu se postupuje tak, že po aseptickém oddělení mononukleámích buněk z dřeňové krve jsou tyto nasazeny v nízké hustotě do sterilních plastových nádobek a pěstovány po dobu cca jednoho až tří týdnů v médiu CellGro™ hematopoietic stem ceíl, schváleném pro klinické použití s přídavkem 10% lidského séra a suplementů, přičemž v průběhu kultivace jsou alespoň jednou přidány suplementy, aniž je třeba odmývat neadherentní hemopoetické buňky, aniž je třeba měnit živný roztok, a aniž je jakkoli třeba zasahovat do uzavřeného kultivačního systému, za běžných podmínek pro kultivaci tkáňových kultur.

Mononukleámí buňky z dřeňové krve jsou získány na operačním sále za aseptických podmínek pomocí certifikované jehly na odběr dřeňové krve a certifikovaných sterilních stříkaček pro jednorázové užití. Srážení dřeňové krve je zabráněno pomocí roztoku heparinu ve fyziologickém roztoku. Dřeňová krev je shromážděna ve sběrném systému (např. firma Baxter), dřeňové částice jsou odfiltrovány pomocí filtrů zabudovaných v uvedeném systému a přefiltrovaná dřeňová krev je zbavena erytrocytů pomocí sedimentace s hydroxyetylškrobem. Mononukleámí buňky jsou resuspendovány v malém množství autologního séra a nasazeny do výše uvedeného média.

Po dvou týdnech kultivace jsou neadherentní buňky odstraněny spolu s médiem. Adherentní vrstva je omyta sterilním fyziologickým pufrem (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, PBS) a odlepena enzymatickým způsobem (např. roztokem 0,05% trypsinu a 1% EDTA, s výhodou pak pomocí některého z přípravků řady TrypLE™, Pharmingen, který neobsahuje zvířecí bílkoviny).

Ke vzniklým shlukům buněk je přidáno množství čerstvého kultivačního média dostatečné pro pohodlnou sklizeň a eventuální zrušení efektu trypsinu. Shluky buněk jsou dál rozvolněny nasátím odlepených buněk tenkou injekční jehlou do sterilní injekční stříkačky a přeneseny do trans5 fúsního vaku. Buňky jsou zcentrifugovány a promyty čistým CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiem. Koncentrace buněk je změřena na hematologickém analyzátoru ajejich složení určeno pomocí průtokové cytometrie. Buňky jsou dále pomocí CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média rozředěny na požadovanou koncentraci a připraveny k použití.

i o Kultivace buněk se podle vynálezu provádí ve speciálním bioreaktoru, který se skládá s výhodou z osmi plastových nádobek najedno použití o vnitřních rozměrech vyhovujících potřebám konkrétní laboratoře a nosiče s výhodou kovového. Bioreaktor je následně vložen do CO₂ inkubátoru s udržovaným vnitrním prostředím s atmosférou 5% CO? a při teplotě 37 °C. Počet a rozměry plastových nádobek je možné zvolit tak, aby vyhovovaly k použití v CO₂ inkubátorech dostup15 ných na trhu.

Předložený vynález přináší oproti dosavadnímu stavu techniky nové a originální řešení v tom, že

a) poprvé dokazuje možnost kultivace mezenchymových buněk ve speciálním médiu schváleném pro klinické užití a ukazuje, že toto médium ve spojení s lidským sérem a s lidskými rekombinantními růstovými faktory a dalšími suplementy vede k lepším výtěžkům mezenchymových kmenových buněk než běžně užívané výzkumné médium alfa-MEM;

b) jako první ukazuje, že dostatečné množství mezenchymových buněk pro klinické použití (včetně dostatečného množství CFU-F nutných pro zhojení kosti) je možno získat z dřeňové krve v průběhu jednoho přibližně dvoutýdenního kultivačního cyklu, v uzavřeném systému a bez nutnosti odmývání krvetvorných buněk, jakož i bez nutnosti výměny média;

c) přináší originální řešení bioreaktoru pro sterilní uzavřenou kultivaci mezenchymových kmenových buněk společně s buňkami krvetvornými;

d) spojuje organicky jednotlivé kroky kultivace mezenchymových kmenových buněk od aseptického odběru kostní krve až k získání finálního produktu;

e) umožňuje pří určitých úpravách kultivačních podmínek rovněž přípravu mezenchymových kmenových buněk k jiným než ortopedickým účelům.

Předložený vynález tedy přináší oproti dosavadnímu stavu techniky způsob manipulace s mezenchymovými kmenovými buňkami, kdy od aseptického odběru kostní krve až k finálnímu pro35 duktu jsou tyto buňky pěstovány v uzavřeném systému a zpracovány způsobem běžným pro zpracování jiných transfusních produktů.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je znázorněný růst mezenchymových kmenových buněk v alfa-médiu s fetálním telecím sérem (1 a - po týdnu kultivace, 1 b - po dvou týdnech kultivace)

Na obrázku 2 je znázorněný růst mezenchymových buněk v CellGro™ s lidským sérem a supie45 menty (2a - po týdnu kultivace, 2b - po dvou týdnech kultivace)

Obrázek 3 představuje výpočet percentuálního zastoupení mezenchymových kmenových buněk (CD45^negCD235^nee) z celkového počtu adherentních buněk získaných při sklizni. Mezenchymové buňky jsou označeny zeleně, leukocyty (CD45⁺) modře a nezralé červené krvinky (CD235a⁺) červeně. FSC = forward scatter, SSC - side scatter. CD90 je jeden z povrchových znaků mezenchymových buněk, ale nemusí být přítomen na všech mezenchymových buňkách ani není pro tyto buňky výlučný.

Obrázek 4 znázorňuje výtěžky získané pěstováním mezenchymových buněk v různých médiích s různým počtem suplementů. Srovnání výtěžků z CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média s lidským sérem a sedmi suplementy s ostatními živnými roztoky (s výjimkou CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média s autologní plazmou a sedmi suplementy) je statisticky významné.

Obrázek 5 znázorňuje tvorbu CFU-F z mezenchymových kmenových buněk získaných primární expanzí v alfa-MEM s fetálním telecím sérem nebo v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy. Vzhledem k malému množství experimentů nejsou rozdíly s výjimkou dvojic, označených hvězdičkou, statisticky signifikantní (párový t-test).

Obrázek 6 ukazuje tvorbu alkalické fosfatázy buňkami pěstovanými v dvourozměrných kulturách v osteogenním indukčním médiu. 6a - buňky vypěstované v alfa-MEM s fetálním telecím sérem, 6b - buňky vypěstované v CellGro™ s lidským sérem a suplementy (alkalická fosfatáza modře, dobarveno neutrální červení).

Obrázek 7 je nativní snímek růstu buněk na trojrozměrných polylaktidových nosičích 6. den po nasazení (7a) a 13. den po nasazení (7b). Mezibuněčná hmota (matrix) je označena šipkou.

Obrázek 8 znázorňuje růst buněk na trojrozměrných polylaktidových nosičích a tvorbu matrix I.

8a - polotenký řez, přehledné barvení (buňky modře - dlouhá šipka, matrix pěnitá, bledá - krátká šipka, černé čáry jsou artefakty - vzduchové bubliny), 8b - parafínový řez, barvení na osteoid (modře).

Obrázek 9 znázorňuje růst buněk na trojrozměrných polylaktidových nosičích a tvorbu matrix II.

9a - barvení na kolagen (van Gieson, červeně), 9b - imunohistochemické barvení na osteonektin (tmavě, dobarveno zeleným trichromem).

Obrázek 10 znázorňuje tvorbu kosti na trojrozměrných nosičích III. 10a - stereomikroskopické zobrazení trojrozměrného polylaktidového nosiče, barvení von Kossa (tmavě), 10b - mammogra30 fický snímek myši s implantovanými dvěma nosiči. Nahoře patrný nosič s buňkami pěstovanými v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy - obdélníkové zahuštění (bílá šipka), zrcadlově dole kontrolní nosič bez buněk se nezobrazuje.

Obrázek 11 představuje prvkovou analýzu matrix pomocí rastrovacího elektronového mikrosko35 pu. 11a - elektronmikroskopický obrázek místa analýzy, 11b- graf prvkové analýzy se zachycenými peaky uhlíku (C), kyslíku (O), vápníku (Ca) a fosforu (P).

Obrázek 12 znázorňuje tvorbu kosti na polylaktidových nosičích pěstovaných podkožně v imunodeficientních myších. Zvápenatělá hmota je zbarvená červeně, osteoid (nezvápenatělá kostní hmota) modře, vidět jsou zbytky polylaktidových vláken. 12a - přehledný snímek, 12b detail pod větším zvětšením.

Na obrázku 13 je znázorněn bioreaktor v perspektivním pohledu.

Obrázek 14 představuje pohled na bioreaktor zepředu.

Obrázek 15 představuje pohled na bioreaktor z boku.

Obrázek 16 znázorňuje perspektivní pohled na nosič, v němž jsou pro ilustraci umístěny dvě kul50 tivaění nádobky.

Obrázek 3 7 představuje kultivační nádobku z perspektivního pohledu.

Obrázek 18 znázorňuje kultivační nádobku z nárysu, obrázek 19 v půdorysu a obrázek 20 v boko55 rysu.

Provedení vynálezu

1. Pokusné osoby

Byly použity dvě skupiny pokusných osob. První skupinu tvořili pacienti s íschemickou chorobou dolních končetin, u nichž byl prováděn aseptický postup při získávání kostní krve a její zpracování na mononukleámí frakci k terapeutickým účelům. Současně byly od těchto osob získány vzorky mononukleámích dřeňových buněk na pěstování v médiích pro růst mezenchymových kmenových buněk. Druhou skupinu pokusných osob tvořili pacienti se suspektní nebo prokázalo nou krevní chorobou, kteří podstupovali odběr kostní dřeně za účelem stanovení diagnózy čí kontroly průběhu onemocnění. Mezenchymové buňky u těchto pacientů jsou pokládány za normální a tudíž z hlediska prováděného výzkumu za použitelné (Soenen-Cornu V, et al: Mesenchymal cells generated from patients with myelodysplastic syndromes are devoid ofchromosomal clonal markers and support short- and long-term hematopoiesis in vitro. Oncogene.

2005; 24: 2441-2448). Pokusné osoby byly cíleně vybírány tak, aby věkově odpovídaly předpokládané cílové skupině potenciálních pacientů se špatně se hojícími frakturami, tj. většina vzorků zcela záměrně a na rozdíl od obdobných experimentů, které často využívají osoby mladší, pochází od osob mezi 50. až 80. rokem života, i když někteří z nich jsou mladší. Veškeré procedury s pokusnými osobami probíhaly ve Všeobecné fakultní nemocnici v Praze, byly schváleny místní etickou komisí Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty a všechny pokusné osoby podepsaly příslušný informovaný souhlas ke všem rutinním i výzkumným procedurám. Demografická charakteristika pokusných osob je uvedena v příkladu 1.

2. Aseptický postup při získávání kostní krve

U pacientů s íschemickou chorobou dolních končetin byly prováděny odběiy kostní krve k terapeutickému užití s cílem aplikovat získané mononukleámí buňky (tj. buňky zbavené červených krvinek a zralých bílých krvinek; tato populace obsahuje nezralé krevní buňky, nezralé vaskulární buňky, mezenchymové buňky a kostní buňky) do končetiny postižené ischémii pomocí infúze do uzavřené tepny. Zde tyto buňky podporují tvorbu náhradního cévního řečiště. U pacientů ve spinal ní či epidurální anestezii či v analgosedaci za použití krátce působícího opiátu a tlum i vých léků byla místa odběru kostní krve, konkrétně zadní lopaty kyčelních kostí se širokým okolím, potřeny desinfekčním roztokem a sterilně zarouškovány. Za běžných aseptických podmínek potom bylo z jednoho či více vpichu do každé z obou lopat kyčelní kosti odebráno cca 350 ml kostní krve ve 3 až 4 mililitrových porcích. Srážení krve bylo zabráněno přidáním fyziologického roztoku s heparinem. Kostní krev byla sbírána do atestovaných vaků Bone Marrow Collection Kit with Pre~Filter and Inline Filters (Baxter R4R2107), které obsahují filtry k odstranění velkých dřeňových částic. Po přefiltrování krve ze sběrného do transportního a zpracovatelského vaku byla krev přenesena do místnosti certifikované pro její zpracování, kde byl přímo do zpracovatelského vaku podáno stanovené množství Gelofusin (B. Braun, Melsungen AG) a následně probíhala opakovaná sedimentace červených krvinek po dobu zhruba 2 hodin. Supernatantní plasma, obsahující především jaderné buňky a jenom minimum erytrocytů, byla plasmaextraktorem přetlačena do transportního vaku a centrifugována. Čirá plasma se vrací do původního sedimentačního vaku a sedimentační cyklus se opakuje. Poté jsou tyto buňky v autologní plasmě zahuštěny na požadovanou koncentraci a připraveny k podání injektorem či k nasazení do bioreaktoru k další kultivaci. Výtěžnost procedury přesahuje standardně 90 % a kontaminace erytrocyty klesá pod 3 % původního množství. Výsledky odběru kostní krve aseptickou metodou a efektivita získávání mononukleámí frakce z kostní krve jsou uvedeny v příkladu 2.

3, Příprava reagencií a kultivace mezenchymových kmenových buněk

Necertifikovaná kultivační média a další reagencie (tj. alfa-MEM, roztok EDTA-trypsinu, glutamín, roztoky antibiotik a fetální telecí sérum) byla zakoupena od firmy Gibco (Paisley, Skotsko). Certifikované CellGro™ Medium for Hematopoietic Stem Cells bylo získáno od firmy

CZ 30Π48 B6

CellGenix (Freiburg, Spolková republika Německo). Lidská plazma skupiny AB- byla získána z krevní banky Ústavu hematologie a krevní transfuse (Praha, ČR).

Dále byly použity následující suplementy: ve vodě rozpustný dexamethason byl získán od firmy

Sigma-Aldrich (Steínheim, Spolková republika Německo), lidský rekombinantní inzulín pro běžné léčebné použití od firmy Eli Lilii (Praha, Česká republika), kyselina askorbová (vitamin C) pro běžné léčebné použití od firmy Sigma-Aldrich (Steínheim, Spolková republika Německo), rekombinantní lidský epidermální růstový faktor (EGF) a rekombinantní lidský destičkový růstový faktor BB (PDGF-BB) od firmy BD Biosciences (Bedforg, MA, USA) a rekombinantní lidsio ký fíbroblastový růstový faktor 2 (FGF-2) od firmy ínvitrogen (Eugene, Oregon, USA). Rekombinantní lidský makrofágové kolonie stimulující faktor (M-CSF) byl zakoupen od firmy R&D (Minneapolis, Minnesota, USA) Všechny růstové faktory byly lyofilizované bez nosiče (tj. bez hovězího albuminu) a byly rekonstituovány vodou pro tkáňové kultury (tissue grade) s lidským albuminem ve fyziologickém roztoku pro běžné léčebné použití (Baxter AG, Vídeň, Rakousko).

Výběr konkrétních firem, od kterých byla necertifikovaná média, další reagencie a suplementy získány, stejně tak jako výběr konkrétních produktů, byl veden pouze hlediskem dostupnosti. Dbali jsme na to, aby objednávané lidské rekombinantní bílkoviny byly bez příměsi zvířecího albuminu a tam, kde to bylo možné, jsme použili přípravek certifikovaný pro lidské použití.

Lidské sérum bylo získáno rekalcifikací plazmy metodou dle Dyra. K přípravě lidského séra bylo smíseno (poolováno) vždy 5 alikvotních dílů plazmy od různých dárců s cílem omezit interindividuální variabilitu jednotlivých sér a pokud možno po celou dobu průběhu experimentů používat tutéž sérovou směs. Lidská plazma byla smíšena s 0,1 M CaCl₂ v poměru 9:1 a inkubována 180 minut při teplotě místnosti. Po odstranění fibrinové sraženiny byla plazma inkubována ještě dalších 48 hodin při teplotě 4 °C. Poté byl zbylý fibrin odstraněn filtrací přes kovovou síťku, vzniklé sérum bylo sterilizováno filtrací přes 0,22 pm filtr a v alikvotech zamrazeno při teplotě 80 °C. Popsaný postup byl zvolen s ohledem na snadnost provedení, je běžně používaný, a jistě je možno k přípravě lidského séra užít i jiný, obdobně běžný postup. Zcela záměrně jsme se vyhnuli vysrážení fibrinogenu zvířecím trombinem.

Mezenchymové kmenové buňky byly pěstovány v různých kombinacích médií, sér a suplementů. Mononukleámí buňky z kostní krve byly nasazovány v různých množstvích od 2,5xl0⁶ až po 10x10⁶ buněk na 10 ml živného roztoku v 75 cm² kultivační láhvi (tj. v hustotě 33x10³ až 133x10³ buněk na cm²). V médiích s lidským sérem a suplementy nebyly zjištěny žádné rozdíly ve výtěžku mezenchymových buněk, pokud bylo použito 2,5x10⁶ nebo 7,5x10⁶ mononukleámích buněk v 10 ml živného roztoku nasazeného do 75 cm² kultivační láhve. Naopak v médiích s fetálním telecím sérem nebyly zjištěny rozdíly ve výtěžku mezenchymových buněk při použití 7,5x10⁶ nebo 10x10⁶ buněk v 10 ml živného roztoku nasazeného do 75 cm² kultivační láhve. V pozdějších experimentech tedy bylo nasazováno 2,5x10⁶ mononukleámích buněk z kostní krve do médií s lidským sérem a suplementy a 10x10⁶ buněk do médií s fetálním telecím sérem bez suplementů.

Ke kultivaci bylo používáno 6 následujících živných roztoků:

a. alfa-MEM + 10% fetální telecí sérum + 2% glutamin + 1 % roztok penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B.

b. alfa-MEM + 10% lidské sérum + 2% glutamin + 1% roztok penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B,

c. alfa-MEM + 10% lidské sérum + 2% glutamin + 1% roztok penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B a další suplementy.

d. CellGro™ for Hematopoietic Stem Cells + 1% roztok penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B a další suplementy.

e. CellGro™ for Hematopoietic Stem Cells + 10% lidské sérum + 1% roztok penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B a další suplementy.

f. CellGro™ for Hematopoietic Stem Cells + 10% autologní plazma + 1% roztok penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B a další suplementy,

Tzv. „další suplementy“ zahrnovaly následující:

Mezi základních pět suplementů patřilo (dle Gronthose a Simmonse, viz výše)'.

ng/ml EGF 100 ng/ml PDGF-BB 0.25 U/ml lidský inzulín 0,01 μΜ dexamethason ío 100 μΜ vitamin C.

Vzhledem k tomu, že Gronthos a Simmons testovali široký panel růstových faktorů a hormonů v různých kombinacích i koncentracích, převzali jsme od nich formuli, která se nejlépe osvědčila a neověřovali jsme různé poměry uvedených suplementů. Tato formule byla již dříve publikována aje volně přístupná.

Další dva suplementy byly přidávány postupně. Nejprve bylo do živného roztoku přidáno 25 ng/ml M-CSF. Jin-Xiang ve výše citované práci užíval 50 ng/ml, ale nepoužíval jiné suplementy. Množství M-CSF bylo zvoleno empiricky. Naposledy byl přidán 1 ng/ml FGF-2 dle výše uvedené citace Tsutsumiho práce. Tato práce byla veřejně publikována a množství užitého FGF2 není předmětem předloženého vynálezu.

Vzhledem k tomu, že množství vypěstovaných adherentních buněk velmi výrazně vzrostlo právě při přidání M-CSF a FGF-2 k základní pětici suplementů, lze tedy říct, že kombinace základní pětice suplementů s M-CSF a FGF-2, v jakýchkoli vzájemných poměrech a koncentracích a s jakýmikoli dalšími faktory je v souladu s předmětným vynálezem.. Vliv postupného přidávání jednotlivých suplementů je uveden v příkladu 3 a na obr. 5.

Zpočátku byly pro kultivaci mezenchymových kmenových buněk používány pouze roztoky a-c s cílem zjistit vliv postupného přidávání suplementů k médiu s lidským sérem. Po zjištění výrazného nárůstu výtěžku po přidání M-CSF a FGF-2 k základní pětici suplementů jsme zaměnili běžně užívané alfa-MEM za atestované CellGro™ Hematopoietic Stem Cell Medium s cílem:

i. zjistit, zda přidání suplementů k tomuto atestovanému médiu je dostačující k tomu, aby bylo možno sérum zcela vynechat, ii. zj istit, do jaké míry výměna média pri ponechání séra ovlivní výtěžky adherentních buněk.

Mezenchymové kmenové buňky byly kultivovány ve výše uvedeném množství a ve výše uvedených živných roztocích po dobu dvou týdnů v inkubátoru s 5% CO₂ při teplotě 37 °C. Jednotná doba kultivace byla zvolena arbitrámě, aby výsledky různých experimentů byly srovnatelné.

Vzhledem k tomu, že u některých vzorků by k dosažení ideálních výsledků bylo třeba kultivace delší, nepokládáme 14-denní interval od nasazení buněk za jediný možný. Fotografická dokumentace kultur byla rutinně prováděna den 4, 8 a 14, přičemž den nasazení byl považován za den 1.

Kultury s fetálním telecím sérem byly po 24 hodinách zbaveny neadherentních buněk pomocí fosfátového pufru a převrstveny čerstvým živným roztokem. U těchto kultur byl živný roztok měněn lx týdně, což vycházelo z našich empirických zkušeností, že výměna média lx týdně nevede ke strádání buněk ani k horším výtěžkům než běžně užívaná výměna média 2x týdně. Růst mezenchymových kmenových buněk po odmytí adherentních buněk po jednom a dvou týd50 nech kultivace je znázorněn na obr. 1.

U médií s lidským sérem jsme po úvodních experimentech došli k zjištění, že neadherentní buňky není třeba odmývat a živný roztok je možno ponechat v nádobce po celou dobu dvoutýdenní kultivace, což dle našich vědomostí nebylo dosud publikováno. Suplementy byly do nádobek přidáCZ 301148 B6 vány 2x týdně, tj. při zahájení kultury a pak ještě 3x v průběhu dvoutýdenní kultivace. Adherentní buňky bez výměny média a bez odstranění neadherentních mononukleárů nijak nestrádaly, naopak, druhý týden došlo k výraznému urychlení růstu (obr. 2b). Společná kultivace neadherentních a adherentních buněk v médiu s lidským sérem a suplementy bez výměny živného roz5 toku po dobu kultivace je předmětem předloženého vynálezu.

Patnáctý den (den zahájení kultury = den 1) byly neadherentní buňky tam, kde bylo třeba, odstraněny spolu s živným roztokem, adherentní buňky byly opláchnuty fosfátovým pufrem a sklizeny pomocí 0,25% EDTA s 1% trypsinem. Po centrifiigaci a naředění ve 2 ml čerstvého živného ío média byl výtěžek měřen na krevních analyzátorech Beckman-Coulter JT nebo BeckmanCoulter AcTdiff2 (Fullerton, Kalifornie, USA).

Efekt použití CellGro™ Hematopoietic Stem Cell Media bez lidského séra se suplementy a s lidským sérem a suplementy je znázorněn v příkladu 3 a na obr. 4.

4. Určování výtěžků 0045^neg CD235a“⁸ buněk

Mezenchymové kmenové buňky nemají na svém povrchu ani panleukocytámí antigen CD45, ani antigen přítomný na buňkách červené krevní řady (glykoforin A nebo CD235a). Protože při kul20 tivaci mezenchymových buněk bez předchozího odstranění buněk neadherentních bylo možno předpokládat významnou kontaminaci krvetvornými buňkami, využili jsme absence těchto znaků a definovali mezenchymové buňky pomocí průtokové cytometrie jako 0045^ne8 CD235^neg buňky. Ke stanovení antigenů CD45 a CD235a jsme používali monoklonální protilátky CD45 PE-Cy5 a CD235a PE (DakoCytomation Czech Republic, Brno, ČR).

Mezenchymové buňky mají na svém povrchu celou řadu antigenů, většinou adhezívních molekul, žádná z nich však není pro ně zcela specifická. Současně s protilátkami proti antigenům CD45 a CD235a jsme proto používali střídavě protilátky proti antigenům CD29, CD44 a CD90, s cílem zjistit, který z těchto antigenů je nejlépe exprimován mezenchymovými buňkami pěstovanými v různých sérech. Protilátky proti těmto antigenům byly označeny imunofluorescenční barvou FITC. Pozitivitu na uvedené antigeny jsme však nevyžadovali k tomu, abychom příslušnou buňku označili za mezenchymovou. Schéma zjišťování percentuálního zastoupení mezenchymových buněk v adherentní populaci je uvedeno na obr. 3.

Průtoková cytometrie byla prováděna na přístroji FACSCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA) a výtěžek mezenchymových buněk byl počítán jako:

(celkový počet buněk) x (% CD45^negCD235a^neg buněk) množství mezenchymových buněk =--— --—40 100

5. Detailní imunofenotypizace mezenchymových buněk

Bylo provedeno detailní porovnání znaků na povrchu mezenchymových buněk pěstovaných v alfa-MEM s fetálním telecím sérem a v CellGro™ for Hematopoietic Stem Cells s lidským sérem a suplementy. K odstranění rušivých krvetvorných buněk byla pro tento účel provedena deplece CD45 pozitivních buněk pomocí anti_CD45 magnetických mikročástic spolu s magnetickým zařízením MiniMACS či MidiMACS (Milténiy Biotec, Bergish Gladbach, Germany). K vlastní imunofenotypizaci na přístroji FACSCalibur byl použit následující panel protilátek:

CD1 lb FITC (BD Biosciences Pharmingen, Erembodegem, Belgie), CD1 lc FITC (DakoCytomation Czech Republic, Bmo, ČR), CD 14 FITC nebo PE (DakoCytomation), CD 18 PE (Pharmingen), CD29 PE (Pharmingen), CD34 PE (DakoCytomation), CD44 FITC (Pharmingen), CD45 FITC nebo PE (DakoCytomation), CD49a FITC (DakoCytomation), CD49c FITC (R&D Systems, Minneapolis, Minnesotta, USA), CD49d FITC (DakoCytomation), CD49e

FITC (R&D Systems), CD63 PE (DakoCytomation), CD71 FITC (DakoCytomation), CD90

FITC (Pharmingen), CD 105 FITC a PE (DakoCytomation), CD 106 PE (Pharmingen), CD 117

PE (Pharmingen), CD 166 PE (Pharmingen), biotinylovaná anti ALP (R&D Systems), CXCR4

PE (R&D Systems), HLA-A, B, C (DakoCytomation) a HLA-DR, DP, DQ (DakoCytomation).

Streptavidin-PE ke znázornění vazby alkalické fosfatázy byl získán od firmy Sigma-Aldrich (Steinheim, Spolková republika Německo). Současně byly použity izotypové kontroly IgGi FITC, IgG] PE, IgG₂b PE a IgG] PE-Cy5 (vše DakoCytomation). Srovnání výsledků imunofenotypizace je uvedeno v příkladu 4,

6. Stanovení tvorby sekundárních kolonií u primoexpandovaných mezenchymových i o kmenových buněk

Mezenchymové kmenové buňky primoexpandované v alfa-MEM s fetálním telecím sérem či v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy byly rozesazeny v počtu 1,5, 3, 5 nebo 10 buněk/cm² do 100 mm Petriho misek do 10 ml alfa-MEM s fetálním tele15 cím sérem. Pro některé experimenty byly buňky primoexpandované v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy zbaveny buněk krvetvorných metodou imunomagnetické CD45 deplece (viz výše). Buňky byly pěstovány po dobu dvou týdnů s výměnou média po prvním týdnu. V den 15 (den založení kultuiy - den 1) byl z misek odstraněn živný roztok, misky byly opláchnuty fosfátovým pufrem a fixovány a barveny krystalovou violetí.

Kolonie mezenchymových buněk (CFU-F) byly počítány pouhým okem jako shluky mezenchymových buněk o průměru alespoň 2 mm.

7. Stanovení osteogenního potenciálu mezenchymových kmenových buněk

a. kultivace v dvourozměrných kulturách

Mezenchymové kmenové buňky pěstované v alfa-MEM s fetálním telecím sérem nebo v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy byly rozesazeny v koncentracích 10³ až 10⁴ na cm² do šestijamkových kultivačních destiček do kontrolního média (alfa-MEM + 10% fetální telecí sérum) nebo do osteogenního média (alfa-MEM + 10% fetální telecí sérum + 10 mM U-glycerolfosfát, 0.1 μΜ dexamethason a 0.5 mM fosfát kyseliny askorbové). Médium bylo měněno Ix týdně po dobu 3 až 4 týdnů. V některých experimentech byly buňky pěstované v živném roztoku s CellGro™ médiem zbaveny krvetvorných buněk pomocí CD45 imunomagnetické deplece. V jiných experimentech bylo ke zjištění schopnosti diferenci35 ace kultivovaných buněk do více linií použito též adipogenní diferenciační médium (indukční médium: alfa-MEM + 10% fetální telecí sérum + 1 μΜ dexamethason, 0.2 mM indomethacin, 0,01 mg/ml inzulín a 0.5 mM 3-isobuty 1-1-methyIxanthin; udržovací médium: alfa-MEM + 10% fetální telecí sérum + 0,01 mg/ml inzulín). V tomto případě bylo indukční a diferenciační médium užíváno střídavě a změna média probíhala 2x týdně. Všechny suplementy byly získány od firmy Sigma-Aldrich.

Po 3 až 4 týdnech byly z kultur odstraněny živné roztoky a jamky byly opláchnuty fosfátovým pufrem. Osteogenní kultury byly buď fixovány 4% paraformaldehydem a následně barveny na alkalickou fosfatázu kitem firmy Sigma Aldrich dle doporučení výrobce, či byly fixovány 2% paraformaldehydem s 0,2% glutaraldehydem a barveny von Kossovým barvením na kostní uzlíky. Adipogenní kultury byly fixovány 70% metanolem, barveny olejovou červení a v některých případech dobarvovány Mayerovým hematoxylinem. Výsledky osteogenní diferenciace v dvourozměrných kulturách jsou uvedeny v příkladu 6 a na obr. 6 a 7.

so b. Příprava trojrozměrných polylaktidových nosičů a kultivace buněk na těchto nosičích

Trojrozměrné polymerní nosiče s kontinuálními póry byly připraveny z vláken poly(L-laktidu), Pro přípravu vláken byl syntetizován vysokomolekulámí poly(L-laktid) (PLLA). K dosazení dobré kvality vláken je zapotřebí, aby střední molekulová hmotnost polymeru byla minimálně

200 000 až 250 000. PLLA byl připraven polymerizaci otevřením kruhu L-laktidu (L-LA) v tavenině při teplotě 110 °C s použitím stannum(II)-2-ethylhexanoátu (Sn(Oct>2) jako katalyzátoru, Pro dosažení vysoké molekulové hmotnosti je nutné připravit monomer (L-laktid) o vysoké čistotě a zamezit přístupu vzdušné vlhkosti a kontaktu s povrchy a látkami protického charakteru při manipulaci se všemi komponentami polymerizační směsi a vlastní polymeraci. Dále je uveden typický příklad postupu přípravy vysokomolekulámího polylaktidu.

Monomemí L-laktid (3S-cis-3,6-dimethyl-l,4-dioxan-2,5-dion, od firmy Sigma-Aldrich) byl před použitím opakovaně krystalizován ze směsi suchých rozpouštědel ethylacetát/toluen a krystalický monomer byl vysušen ve vakuu. Vnitrní povrchy skleněné polymerizační ampule byly io silanizovány reakcí s d imethy Ichlorsi lanem, ampule vymyta hexanem a vysušena ve vakuu za žíhání. Do ampule bylo pod inertní atmosférou nadávkováno 25 g krystalického L-laktidu a

370 μΐ 0,1 M roztoku Sn(Oct)2 v bezvodém toluenu. Násada byla dosušena 90 minut pod vakuem a ampule byla zatavena. Polymerizace probíhala 60 hodin pri teplotě 110 °C. Vzniklý polymer byl rozpuštěn v 1 1 dichlormethanu a izolován srážením do 9 1 methanolu. Po filtraci byl polymer sušen ve vakuu při 40 °C. Bylo získáno 23,2 g (93 %) polymeru o váhovém středu molekulové hmotnosti M_w = 360 000 (stanoveno pomocí objemově vylučovací chromatografie (SEC) v tetrahydrofuranu).

Polylaktidová vlákna byla připravena zvlákňováním PLLA z roztoku. Zvláknění bylo dosaženo vytlačováním roztoku PLLA v dichlormethanu konstantní rychlostí tryskou o kruhovém průřezu a průměru v rozmezí 0,6 až 1,5 mm do koagulační lázně (methanol). Použitím roztoků o různé koncentraci (v rozmezí 2 až 12% hmotn.) bylo možné získat vlákna o průměru v rozmezí 30 až 320 pm. Vlákna byla promyta methanolem a sušena při laboratorní teplotě.

Trojrozměrné, porézní polymerní nosiče byly připraveny z vláken PLLA jejich slisováním ve formě, která určuje i výsledný tvar a geometrické parametry nosiče. Fixování tvaru a objemu porézní struktury bylo dosaženo částečným slinutím vláken naleptáním jejich povrchu v parách rozpouštědla nebo slepením vláken v místech jejich dotyku roztokem poly(D,L-Iaktídu), (PDLLA). Poly(D,L-laktid) (M_w - 630 000) byl připraven polymerizaci D,L-láktidu analogic30 kým postupem jako je popsáno výše pro PLLA.

PLLA byl použit pro přípravu vláken pro svoje výhodné mechanické vlastnosti a omezenou rozpustnost v rozpouštědlech jako je aceton, THF, toluen. To umožňuje potažení vnitřních povrchů porézní struktury z PLLA vláken tenkou vrstvou PDLLA použitím roztoku PDLLA v acetonu, aniž by došlo k zhroucení porézní struktury PLLA vláken. Povlak PDLLA na povrchu vláken zpevňuje 3D strukturu a vytváří můstky mezi jednotlivými vlákny v místě jejich překřížení, což umožňuje vytvořit kontinuální vnitřní povrch potřebný pro migraci buněk v nosiči. Objem pórů v matrici je možné řídit hustotou vláken a mírou jejich komprese. Poměry objemu pórů, jejich středního průměru (střední vzdálenosti vláken) a vnitřního povrchu struktury závisí, kromě hus40 toty vláken i na jejich průměru.

c. prvková analýza pomocí elektronového mikroskopu

Prvková analýza byla provedena na rastrovacím elektronovém mikroskopu Hitachi energie 8,8 keW. Výsledek prvkové analýzy je znázorněn na obr. 11.

d. implantace polylaktidových nosičů s lidskými mezenchymovými buňkami pod kůži imunodeficientních myší

Lidské buňky byly nejprve kultivovány na polylaktidových nosičích v osteogenním médiu s fetálním telecím sérem ěi v osteogenním médiu s lidským sérem a suplementy 2 až 4 týdny. Imunodeficientní (NOD/LtSz-^gf j myši byly uvedeny do krátkodobé celkové anestesie pomocí xylazinu a označeny fuchsinem k pozdějšímu rozlišení. Za aseptických podmínek byly provedeny samostatné střihy nad laterální stranou hrudníku vlevo i vpravo a do předem tupě vypreparova55 ných tunelů byly PLLA nosiče s lidskými buňkami implantovány. Kůže byla sešita běžným chirurgickým šicím materiálem a myši byly přeneseny zpět do svých kotců. Myši byly chovány způsobem běžným pro imunodeficientní zvířata s podáváním sterilizované stravy a vody s antibiotiky a každý druhý den kontrolovány. Jednou za tři týdny byly myši uvedeny do delší celkové anestézie pomocí ketaminu a xylazinu a rentgenovány pod mammografickým přístrojem. Rentge5 ne gram myši po osmi týdnech od implantace scaffoldu s buňkami expandovanými v CellGro Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy a kontrolního scaffoldu bez buněk je uveden jako obr, 11b.

Po 6 až 9 týdnech byly myši humánně usmrceny parami diethyléteru a bezprostředně po usmrcení io fixovány perfuzí 10% formaldehydem. Pak byly polyíaktidové nosiče vyjmuty, vloženy do nádobky s 10% formaldehydem a postoupeny k histologickému a imunohistochemickému vyšetření. Výsledky uvedených vyšetření jsou znázorněny na obr. 12. Veškerá manipulace s laboratorními zvířaty byla prováděna dle Zásad zacházení s laboratorními zvířaty pracovníky vyškolenými a certifikovanými k práci s laboratorními zvířaty a experimentální protokol byl schválen Komisí pro laboratorní zvířata I. lékařské fakulty UK.

8. Principy kultivace adherentních buněk v uzavřeném systému

Pokud má být po získání mononukleámí suspenze dřeňových buněk pokračováno v jejich mani20 pulaci v uzavřeném systému, bylo nutno navrhnout vyhovující zařízení pro kultivaci buněk vlakovém systému, tj. bioreaktor. Běžná kultivační lahvička je nádobka z plastu ošetřeného pro optimální růst buněk (tissue-treated), má stěny zužující se k hrdlu a na hrdle šroubovací uzávěr s filtrem či bez něho. Vkládá se přímo do inkubátoru, v němž je udržována stálá teplota 37 °C a množství CO₂ ve výši 5 %, což odpovídá obsahu této látky v živočišných tkáních. V lahvičce a v inkubátoru je antimikrobiální prostředí udržováno různými způsoby -buď jsou stěny inkubátoru potaženy měděným plechem, nebo alespoň voda ve zvlhčovačích nádobkách obsahuje síran měďnatý, do živného roztoku je možno přidat antibiotika a antimykotika a bezpečnost kultury je možno zvýšit použitím lahviček namísto plastových misek a použitím šroubovacího uzávěru s filtrem místo uzávěru bez filtru, které se nedovírá, aby mohla pokračovat výměna plynů mezi atmosférou v nádobce a v inkubátoru. Manipulace probíhá v laminámích boxech různých stupňů čistoty filtrovaného vzduchu (označované jako tzv. Biohazard, přičemž stupeň Biohazard III je pokládán za nezbytný pro manipulaci s tkáněmi určenými ke klinickému užití). Při manipulaci uvnitř laminámího boxu je buď nutno odšroubovat víko nádobky, či odstranit kryt kultivační misky, což znamená další možnost kontaminace. Největší riziko kontaminace však vzniká při výměně média a zejména při převádění adherentních buněk do suspenze, tj. při tzv, sklizni, a při jejich následné centrifugací a pasážování. Tudíž právě způsob jednorázové kultivace podle předmětného vynálezu bez pasážování buněk odstraňuje jedno z rizik kontaminace, totiž riziko vznikající pasážováním.

Dalším rizikem je otevření kultivační lahvičky v laminámím boxu. I když v boxu by mělo laminámí proudění filtrovaného vzduchu spolu se zásadami pracovní hygieny riziko kontaminace snížit na minimum, toto riziko přesto hrozí (např. při pipetování roztoků, kde v prostředí laminámího proudění vzduchu mohou vznikat aerosoly). Je přitom možno ho odstranit pomocí jednoduchého zařízení, které je užíváno v transfusních vacích a infuzních sadách. Jedná se o pryžovou či plastovou zátku, kterou je možno opakovaně penetrovat injekční jehlou a aplikovat či odebírat roztoky. Opatření kultivační nádobky takovouto zátkou by znamenalo možnost pokračovat v kultivaci buněk v uzavřeném systému i po jejich zpracování podle výše uvedeného bodu 2 a taková lahvička by se stala logickou součástí celého kultivačního systému. Užití neprodyšných pryžových zátek by pochopitelně znamenalo nutnost umístění filtrů na svrchní stranu nádobky.

Užití takovýchto zátek a aplikace buněčné suspenze, živných roztoků a suplementů do láhve s jejich pomocí je ovšem výhodné jen tehdy, není-li nutno opakovaně měnit celý obsah nádobky, V případě námi navrhovaného kultivačního postupu by se jednalo pouze o naplnění nádobky a odstranění buněk, mezi těmito dvěma procesy by bylo pouze trojí přidání suplementů velmi tenkou jehlou (např. oranžová 25 G 1, firma Braun). Nicméně i tak by při jednorázovém plnění nádobky větším množstvím roztoku či při konečném odstraňování buněčné suspenze mohlo dojít k vytvoření nežádoucího přetlaku či podtlaku, který by filtry nebyly schopné dostatečně rychle vyrovnat. Z tohoto důvodu pokládáme za výhodné, aby kultivační nádoba měla vstupy alespoň dva, přičemž při plnění nádobky jedním vstupem by bylo možno odsávat nadbytečný vzduch druhým vstupem a podobně by bylo možno vstřikováním vzduchu pomocí stříkačky s injekční jehlou usnadnit sklizeň buněčné suspenze. Přidávání či odebírání obsahu nádobek, jakkoli pomocí sterilní certifikované injekční jehly a stříkačky, by pochopitelně probíhalo v boxu příslušného stupně biohazardu.

K zajištění sterilních podmínek v průběhu kultivace by pochopitelně bylo ideální mít pro tyto io nádobky vlastní inkubátor, kde by byly nádobky seřazeny kazetovým systémem a který by byl užíván pouze k tomuto účelu. Takové zařízení by však bylo poměrně nákladné a jeho konstrukce se vymyká znalostem autorů. Domníváme se však, že stejně tak je možno použít jakýkoli sériově vyráběný CO₂ inkubátor certifikovaný ke kultivaci buněk ke klinickému užití a do něho vložit bioreaktor, koncipovaný v tomto případě jako jednoduchý kazetový systém nádobek spolu s pří15 slušným nosičem (příklad 10 a obr. 13 až 20).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - odběr mononukleámích buněk z kostní dřeně aseptickým způsobem.

V letech 2004-2005 byly celkem patnácti pacientům s íschemickou chorobou dolních končetin ve věku od 26-85 let odebrána a zpracována kostní krev aseptickým způsobem popsaným v bodě 2 v části provedení vynálezu. Dvěma pacientům byly provedeny odběry dva. Ze získaného kon25 centrátu mononukleámích buněk byly odebrány vzorky ke kultivaci mezenchymových buněk a zbylé buňky byly aplikovány zpět pacientům v experimentálním protokolu buněčné léčby ischemické choroby dolních končetin. Charakteristiky jednotlivých odběrů jsou uvedeny v tabulce 1. Popisná statistika dosažených výsledků je uvedena v tabulce 2.

Z uvedených výsledků vyplývá, že k osazení jedné kultivační láhve o povrchu dna 75 cm² množstvím 2,5x10⁶ mononukleámích buněk bylo zapotřebí v průměru pouze 23 μί (23 mikrolitry) buněčné suspenze, získané uvedeným postupem (rozmezí, 11 až 69 μί). Z toho dále vyplývá, že k získání potřebného množství mononukleámích buněk by mělo stačit podstatně menší množství kostní krve, než bylo odebráno zde (20 až 30 ml by postačovalo k získání dostatečného množství mezenchymových buněk a CFU-F ve všech případech, viz příklad 3 a příklad 5).

CZ 301148 Bó

Koncentrace

Konečný objem Celkový počet mono-nukleámích

Odebraný suspenze mono- získaných mono- buněk v 1 ml Objem potřebný objem kostní nukleárních buněk nukleárních výsledné suspenzek získání 2,5xl0⁶

Tabulka 1

číslo	Věk	Pohlaví	krve (ml)	(ml)	buněk (x 10*)	(xl0ó)	buněk (v μΐ)
K.A.	70	žena	436	56	51,13	91,3	27
K.A.	76	muž	323	50	18,13	36,3	69
O.K.	26	muž	600	36	79,2	220	12
K.L.	40	muž	700	40	94	235	11
M.M.	75	žena	540	42	57,22	136,2	18
LJ.	43	muž	400	45	69,6	154,7	16
AJ.	61	muž	400	35	45,5	130	19
C.E.	39	žena	400	50	55	110	23
s.v.	73	muž	643	53	45,6	91,2	28
B.E.	47	žena	440	48	65,52	136,5	19
HJ.	85	muž	450	25	23,8	95,2	27
S.V.	68	muž	600	35	63,67	209	12
C.E.	39	žena	366	42	46,2	110	23
Z.M.	67	žena	455	49	61,25	125	20
M.J.	52	žena	346	44	37,4	85	30
H.A.	75	žena	350	74	125,8	170	15
LJ.	43	muž	440	68	95,2	140	18

Tabulka 2

Počet pacientů	15
Muži: ženy (poměr, %)	8:7 (53%:47%)
Počet odběrů	17
Množství odebrané kostní krve (ml, medián a	440
rozmezí)	(323 až 700)
Výsledný objem mononukleámí suspenze	45
(ml, medián a rozmezí)	(25 až 74)
Množství získaných mononukleámích buněk	57,2
(x 108, medián, rozmezí)	(18,1 až 125,8)
Koncentrace mononukleámích buněk ve	130
výsledné suspenzí (v 106/ml, medián +	(3óaž235)
rozmezí)
Objem obsahující 2,5x106 buněk (medián,	19 μΐ
rozmezí)	(llaž69 μί)

Příklad 2 - Pěstování buněk v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell medium s lidským sérem a suplementy

V roce 2005 byly pěstovány v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy mononukleámí buňky z kostní dřeně celkem 18 pokusných osob. Tento soubor se poněkud liší od souboru uvedeného v příkladu 1, a to z toho důvodu, že od některých pacientů ze souboru uvedeného v příkladu 1 nebyly buňky v tomto médiu pěstovány, protože toto médium ještě nebylo k dispozici, avšak po získání média byl soubor doplněn o pacienty, jímž byla odebíio rána kostní dřeň z důvodů diagnostiky ěi sledování krevního onemocnění. Demografická charakteristika souboru pokusných osob, od nichž byly pěstovány buňky v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy jsou uvedeny v tabulce 3 a výsledky kultivace jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 3

Věk (medián, rozmezí)	65,5 roku (39 až 78 let)
Muži: ženy (počet, procenta)	7:11 (39% v. 61%)
Pacienti s ICHDK Či zdraví pacienti v.	8: 10 (44%: 56%)
pacienti s hematologickou malignitou (počty,
procenta)
Pacienti s infiltrací kostní dřeně v. pacienti	5 : 13 (27% v. 73%)
bez infiltrace kostní dřeně
Použitá šarže (1 v. 2, počty, procenta)	7:11 (39% v 69%)

Tabulka 4

Nasazené množství buněk (na 75 cm2 láhev) Vykultivované množství adherentních buněk (medián, rozmezí)	á 2,5x10s 7,0xl06(l,4 až lOxlď)
Z toho procent CD45‘ CD235a'	88,2% (63,9% až 96,5%)
(mezenchymových) buněk (medián, rozmezí)
Celkové množství CD45*CD235a'	6,19xl06(l,12až 7,88χΙ(ή
(mezenchymových) buněk (medián, rozmezí)

Vzhledem k tomu, že mononukleámí buňky z kostní dřeně pacientů s hematologickým onemocněním mohly mít odlišné charakteristiky od mononukleámích buněk zdravých osob a kromě toho mohly být výsledky ovlivněny věkem a pohlavím pacienta, provedli jsme statistické zpracování výsledků kultivace v CellGro™ živném roztoku na základě věku pokusných osob, pohlaví, onemocnění, postižení kostní dřeně onemocněním a šarže CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média (celkem byly v pokusech použity dvě šarže). Konzistentním výsledkem byla velmi slabá negativní korelace mezi počtem adherentních buněk, procentem mezenchymových buněk v adherentních buňkách a celkovým množstvím mezenchymových buněk s věkem, která však ani zdaleka nedosahovala statistické významnosti. Univariantní analýza nezjistila rozdíly v počtu sklizených adhet n rentních buněk, v procentu MSC mezi těmito buňkami ani v celkovém počtu MSC v závislosti na pohlaví, diagnóze pacienta či postižení kostní dřeně hematologickou chorobou, ani nebyly zjištěny rozdíly v šaržích použitého CellGro™ Hematopoietic Stem Cell media.

Příklad 3 - srovnání výtěžků mezenchymových kmenových buněk pěstovaných v různých médiích s různou kombinací suplementů.

Srovnání výtěžku adherentních buněk v různých médiích s různými séry a s různým počtem šuplo lementů bylo provedeno pomocí Mann-Whitneyho rank-sum testu a multivariantní analýza byla provedena Kruskall-Wal li sovou verzí testu ANOVA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5 a 6 a na obr. 4. V tabulce 5 jsou uvedeny mediány výtěžků z jednotlivých médií a rozmezí mezi 25 až 75 percentilem. P < 0,05 je pokládáno za statisticky významné.

Tabulka 5 - výtěžky adherentních buněk z různých médií s různými séry a s různým počtem suplementů

Živný roztok	Počet vzorků	Medián (xlO6 buněk)	25% až 75 %) (xlO6 buněk)	Statistické srovnání s CellGro™ + LS + 5S
Alfa-MEM + FCS	35	0,6	0,4 až 1,0	p <0,001
Alfa-MEM+ LS	20	0,7	0,4 až 1,1	p <0,001
Alfa-MEM+ LS + 5S	7	0,4	0,25 až 1,1	p <0,001
Alfa-MEM+ LS + 5S i- M-CSF	5	1,2	0,55 až 1,95	p = 0,002
Alfa-MEM+ LS + 5S + M-CSF+ FGF2	21	2,4	1,2 až 5,75	p <0,001
CellGro1+ LS + 5S +M-CSF + FGF2	18	7,0	5,4 až 8,4
CellGro1+ AP + 5S + M-CSF + FGF2	5	3,4	1,55 až 5,7	p = 0,136

Tabulka 6 - multivariantní analýza

Srovnání	Statisticky významný rozdíl (p <0,05)
CellGro1 + LS + 5S + M-CSF + FGF2 v. alfa-MEM + FCS	ano
CellGro1M + LS + 5S + M-CSF + FGF2 v. alfa-MEM + LS	ano

CellGro1 + LS + 5S + M-CSF + FGF2 v. alfa-MEM + LS + 5S	ano
CellGro1” + LS + 5S + M-CSF + FGF2 v. alfa-MEM + LS + S + M-CSF	ne
CellGro1” + LS + 5S + M-CSF + FGF2 v. alfa-MEM + LS + 5S + M-CSF + FGF2	nelze testovat
CellGro1” + LS + 5S + M-CSF + FGF2 v. CellGro™ + AP + 5S + M-CSF + FGF2	nelze testovat

Zkratky (v obou tabulkách): FCS = fetální telecí sérum, LS = lidské sérum, AP - autologní plazma, 5S = pět základních suplementů dle Gronthose a Simmonse (kyselina askorbová, dexamethason, EGF, inzulín a PDGF-BB), M-CSF = makrofágové kolonie stimulující faktor, FGF-2 s = fíbroblastový růstový faktor 2.

Z uvedených výsledků vyplývá, že procento adherentních buněk bylo nejvyšší v živném roztoku sestávajícím z CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média s lidským sérem a suplementy a že při srovnání dvou skupin proti sobě byly výtěžky adherentních buněk z tohoto živného roztoku sta1 o tisticky signifikantně vyšší než výtěžky adherentních buněk z jakéhokoli jiného živného roztoku s výjimkou CellGro™ Hematopoietic Stem Cell media $ autologní plazmou a suplementy. Nedostatek statistické významnosti v tomto případě stejně jako nedostatek statistické významnosti při multivariantní analýze je možno přičíst tomu, že statistický test nedisponoval dostatečnou silou vzhledem k malému množství zkoumaných vzorků,

Z obr. 4 dále vyplývá, že výtěžek adherentních buněk se konstantně zvyšoval s přidáváním počtu suplementů k alfa-MEM médiu s lidským sérem, že výrazné zvýšení výtěžku lze pozorovat až po současném přidání M-CSF a FGF-2 k živnému roztoku tvořeného alfa-MEM médiem s lidským sérem a pěti Gronthos-Simmonsových základními suplementy a že dalšího výrazného zvýšení výtěžku adherentních buněk bylo dosazeno záměnou alfa-MEM média za CellGro™ Hematopoietic Stem Cell medium. Z uvedených výsledků dále vyplývá, že záměna poolovaného lidského séra za autologní plazmu nevede k dalšímu zvýšení výtěžku, naopak, je možné, že v takovém případě se výtěžek adherentních buněk sníží.

Vzhledem k tomu, že adherentní frakce vedle mezenchymových kmenových buněk obsahuje též buňky krvetvorné, provedli jsme na menším počtu vzorků měření procenta mezenchymových buněk (tj. CD45^neg CD235a^neg buněk) v adherentní frakci pomocí průtokové cytometrie a čistý výtěžek mezenchymových buněk jsme spočítali dle vzorce uvedeného v Provedení vynálezu, bod 4. Protože v devíti případech jsme vždy provedli příslušná měření na vzorcích adherentních buněk, které byly vypěstovány v různých živných roztocích, ale pocházely od stejné osoby, mohli jsme ke zhodnocení výsledků použít párového t-testu. Srovnání výtěžku CD45^neg CD235a^neg buněk z alfa-MEM s lidským sérem a všemi 7 suplementy a z CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média s lidským sérem a suplementy je uvedeno v tabulce 7. Výsledky jsou uvedeny jako průměr a směrodatná odchylka, statistické hodnocení se týká počtu CD45^ncg CD235a^neg buněk

Tabulka 7 - vliv záměny alfa-MEM za CellGro™ Hematopoietic Stem Cell Medium na získané množství CD45^neg CD235a^neg buněk (tj. mezenchymových kmenových buněk)

Živný roztok	Množství adherentních buněk	Procento CD45nee CD235aníf! buněk	Množství CD45'wg CD235aM|!buněk	Statistická významnost
alfa-MEM + I,S + 5S + M-CSF+ FGF2	3.69 ± 2,53xl06	80,1 ± 12,4%	3,06 + 2,31xl06	p = 0,019
CelIGrolM + LS + 5S + M-CSF + FGF2	5,47 ± 3,14xl06	85,7 + 10,3%	4,62 ±2,96x106

Z těchto výsledků vyplývá, že záměnou alfa-MEM za CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médium je možno nejen získat větší množství adherentních buněk, ale že adherentní buňky získané při použití CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média obsahují i větší procento buněk mezenchymových, což dohromady vede ke statisticky významně vyššímu zisku CD45^ncg CD235a^ncg mezenchymových buněk.

Uvedený příklad tedy ukazuje, že zásadního pokroku ve zvýšení výtěžku adherentních buněk bylo dosaženo přidáním M-CSF a FGF2 k základním pěti Gronthosovým a Simmonsovým suplementům, že k dalšímu zvýšení výtěžku vedla záměna alfa-MEM za CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médium certifikované k lidskému použití a že uvedeným způsobem je možno v 75 % případů získat více než 5x10⁶ adherentních buněk z původně vložených 2,5x10⁶ mononukleámích buněk z kostní dřeně v průběhu jediné expanze. 85 % těchto adherentních buněk je dvojitě negativních na znaky CD45 a CD235a aje tudíž možno je pokládat za mezenchymové kmenové buňky.

Příklad 4 - srovnání imunofenotypu mezenchymových kmenových buněk pěstovaných v

CellGro™ Hematopoietic Stem Cell mediu s lidským sérem a suplementy s mezenchymovými kmenovými buňkami pěstovanými ve alfa-MEM s fetálním telecím sérem

Ke zjištění, do jaké míry se buňky vypěstované v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy od buněk rostoucích v běžném alfa-MEM médiu s fetálním telecím sérem, jsme použili charakteristiky povrchových znaků pomocí průtokové cytometrie. Pozitivita pro daný znak byla vyjádřena jako procento pozitivních buněk, přičemž jako kritérium pozitivity byla zvolena imunofluorescence vyšší než imunofluorescence 0,5 % nejjasněji svítících buněk negativní kontroly, která byla tvořena buňkami ze stejného vzorku, označenými irelevantním izotypovým imunoglobulinem s příslušnou fluorescenční látkou. Pozitivita na alkalickou fosfatázu (ALP) byla určována pomocí protilátky proti alkalické fosfatáze značené biotinem, na níž byl ve druhém kroku navázán konjugát streptavidinu s fluorescenčním barvivém fykoeryteinem. Negativní kontrolu v tomto případě tvořily buňky značené samotným fykoeryteinem.

Před provedením měření byly z buněk rostoucích v CellGro™ médiu částečně odstraněny krvetvorné buňky inkubací s antiCD45 protilátkou značenou imunomagnetickými částicemi a následným odstraněním CD45 pozitivních buněk pomocí magnetického zařízení MiniMACS Či CliniMACS (Míltényi Bíotec, Německo).

Rozdíly v pozitivitě buněk rostoucích v CellGro™ Hematopoietic stem cell médiu s lidským sérem a suplementy a buněk rostoucích v alfa-MEM médiu s fetálním telecím sérem na jednotlivé povrchové znaky byly zjišťovány statisticky pomocí t-testu a Mann-Whitneyho rank-sum testu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8 jako mediány a hodnoty statistické významnosti p jsou uvedeny tak, jak vyšly pomocí Mann-Whitneyho rank-sum testu (v t-testu byly výsledky obdobné, avšak řada srovnání se vyznačovala nerovností rozptylů či neparametrickým rozložením měření, což činí aplikaci t-testu jako problematickou). Jako statisticky významné jsou pokládány hodnoty p <0,05.

Tabulka 8

L	alfa-MEM + FCS	CellGro + LS + suplementy
Znak	Počet vzorků	Medián pozitivity (%)	Počet vzorků	Medián pozitivity (%)	Statistická významnost
CD 11c	13	26,3%	6	11,1%	p = 0,048
CD 29	9	77,6%	7	95,0%	p <0,001
CD 44	9	52,2%	7	90,8%	p = 0,011
CD 45	8	15,2%	7	8,8%	p-0,152
CD 49a	9	14,2%	7	14,3%	P- 0,953
CD 49c	9	6,3%	7	34,7%	p = 0,001
CD 49d	9	9,3%	7	30,2%	p = 0,008
CD 49e	9	15,1%	7	25,8%	p = 0,244
CD 63	9	55,6%	7	64,2%	p = 0,244
CD 71	9	21,6%	7	47,4%	p = 0,034
CD 90	6	58,1%	7	65,0%	p —0,731
CD 105	9	44,2%	7	25,5%	p = 0,290
CD 106	8	3,7%	7	13%	p = 0,014
CD 166	8	50,8%	7	31,0%	p — 0,072
ALP	7	15,1%	7	14,2%	p= 1,000

zkratky: FCS = fetální telecí sérem, LS = lidské sérum

Uvedené výsledky ukazují, že množství znečištění mezenchymových buněk získaných z obou médií buňkami krvetvornými je v době měření zhruba srovnatelné (díky částečné depleci CD45+ buněk z produktu získaného z CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média s lidským sérem a suplementy), což znamená, že výsledky měření by neměly být ovlivněny rozdílnou příměsí krvetvorných buněk. Mezenchymové buňky jsou charakterizovány vedle svých funkčních vlastností též fenotypickými charakteristikami, mezi něž patří exprese povrchových znaků CD29, CD44, CD63, CD90, CD105, CD 106 a CD 166. Ze získaných měření vyplývá, že mezenchymové buňky rostoucí v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu mají na svém povrchu tyto molekuly v míře buď srovnatelné (CD63, CD90, CD105, CD166), nebo vyšší (CD44, CD29, CD 106) než buňky rostoucí v alfa-MEM s fetálním telecím sérem a naplňují tudíž fenotypické charakteristiky mezenchymových kmenových buněk minimálně stejně dobře. Znak CD71 je znakem růstové aktivity a tento znak je lépe vyjádřen na mezenchymových buňkách rostoucích v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy. Buňky expandované v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy mají tedy vyšší růstovou aktivitu než buňky expandované v alfa-MEM s fetálním telecím sérem, což odpovídá většímu výtěžku buněk pěstovaných v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu. Exprese alkalické fosfatázy (ALP) znamená, kolik mezenchymových buněk se již v průběhu primární expanze diferencuje směrem k osteoblastové linii a toto procento je u buněk rostoucích v obou médiích srovnatelné.

Z uvedeného příkladu tedy vyplývá, že adherentní nekrvetvomé buňky vypěstované z mononukleámích buněk z kostní dřeně v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy naplňují fenotypické charakteristiky mezenchymových kmenových buněk minimálně stejně dobře jako buňky rostoucí v alfa-MEM s fetálním telecím sérem, mají dobrou růstovou

Λ * aktivitu a očekávané množství z nich se diferencuje do osteoblastové linie již v době úvodní expanze.

Příklad 5 - srovnání tvorby sekundárních kolonií u mezenchymových kmenových buněk primoexpandovaných v alfa-MEM s fetálním telecím sérem a v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell mediu s lidským sérem a suplementy a výpočet množství sekundárních CFU-F na počet nasazených mononukleámích buněk v primoexpanzi ío Má se za to, že ne každá mezenchymová buňka je současně buňkou klonogenní, tj. takovou, která má schopnost dalšího dělení. Klonogenicita buněk se zkoumá pomocí tzv. CFU-F eseje, zavedeného Colterem (Colter DC, et al: Rapid expansivn of recycling stem cells in cultures of ploštic adherent cells from human bone marrow. Proč Nati Acad Sci USA. 2000; 97: 3213-3218) a již dříve úspěšně reprodukovaného v našich podmínkách (Novotová E, Strnadova H, Procházka B, a

Pytlík R. In vitro kultivace mezenchymových kmenových buněk u pacientů s lymfoidnimi malignitami. Transfuse dnes, 2003; 9: 28-34). Princip CFU-F eseje, jak je popsán v obou pracích, je stručně vysvětlen v Provedení vynálezu, bod 6. Pomocí tohoto eseje jsme zkoumali, zdaje možné získat úvodní expanzí v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským telecím sérem a suplementy dostatečné množství CFU-F nutných ke zhojení kostní fraktury, přičemž jsme vycházeli z výše citované práce, která udává, že ke zhojení fraktury je třeba zhruba 50 000 CFUF (Hemigou P, et al: Percutaneous autologous bone-marrow grafting for nonunions. J Bone JointSurgAm. 2005; 87: 1430-1437).

Způsobem popsaným v Provedení vynálezu, bod 6 jsme pěstovali buňky od sedmi pokusných osob, které byly primárně expandovány buď v alfa-MEM s fetálním telecím sérem, nebo v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy. Ke zjištění, jakou roli hrají v tvorbě CFU-F buňky krvetvorné, jsme provedli u části adherentních buněk získaných z CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média s lidským sérem a suplementy depleci těchto buněk pomocí antiCD45 protilátky s imunomagnetickými částicemi na přístroji MiniMACS (Miltényi ao Biotec). Počty kolonií z buněk získaných popsanými způsoby jsme srovnávali pomocí párového t-testu. Výsledky našich experimentů jsou uvedeny v tabulkách 9 a 10 a na obr. 5.

Tabulka 9

Počty kolonií v závislosti na způsobu primární expanze mezenchymových buněk ajejich rozesazení na 79 cm² misku (průměr ± směrodatná odchylka)

	Počet kolonií po nasazení
Způsob úvodní expanze	1,5 bunky/cm2 (120 buněk)	3 buňky/cm2 (240 buněk)	5 buněk/cm2 (395 buněk)	10 buněk/cm2 (790 buněk)
Alfa-MEM + fetální telecí sérum	8,3 ±8,1	14,6+10,1	21,7± 16,2	39,4 ± 35,0
CellGro™ + lidské sérum + suplementy	4,6 + 7,6	5,1 ±6,0	8,6 ±8,7	14,6 + 8,6
CellGro™ + lidské sérum + suplementy s následnou CD45 depleci	2,1 ±3,2	2,7 + 4,2	3,9 + 4,5	16,0 ±20,8

Tabulka 10

Odhad množství nutných ke vzniku jedné CFU-F kolonie

	Počet nasazených buněk nutných ke vzniku jedné kolonie
Způsob úvodní expanze	1,5 buňky/cm2 (120 buněk)	3 buňky/cm2 (240 buněk)	5 buněk/cm2 (395 buněk)	10 buněk/cm2 (790 buněk)
Alfa-MEM + fetální telecí sérum	15 (8-600)	17(10-54)	19(11-72)	20(11 - 180)
CellGroIM + lidské sérum + suplementy	27 (10 - nelze určit)	47 (22 - nelze určit)	46 (23-nelze určit)	54(34- 132)
CellGroIM + lidské sérum + suplementy s následnou CD45 depleci	57 (23 -nelze určit)	89 (35-nelze určit)	102 (47- nelze určit)	50 (26 - nelze určit)

Z uvedených výsledků je patrné, že buňky získané z alfa-MEM s fetálním telecím sérem mají lepší schopnost tvorby CFU-F než buňky získané z CellGro™ s lidským sérem a suplementy (i io když výsledky vzhledem k malému množství pacientů nedosahovaly statistické významnosti). Je však nutno vzít do úvahy, že buňky z CellGro™ s lidským sérem a suplementy byly při tvorbě

CFU-F kolonií pěstovány v alfa-MEM s fetálním telecím sérem, tedy v jiném médiu, než v němž byly expandovány a též v jiných podmínkách, než v jakých by rostly in vivo. Každopádně, i kdyby byla expanzní schopnost mezenchymových buněk získaných z CellGro™ s lidským sérem a suplementy skutečně snížená, je to vyváženo větším výtěžkem buněk při primární expanzi v tomto médiu (viz příklad 3). 1 kdybychom předpokládali, že pouze jedna z padesáti buněk získaných z CellGro™ s lidským sérem a suplementy je schopná dalšího dělení, stále to znamená, že z 5x10⁶ získaných adherentních buněk vznikne přibližně 100 000 kolonií, což ie dle výše citovaného Hemigoua množství dostatečné ke zhojení fraktury. Uvedený počet 5x10° adherentních buněk je navíc možno získat ve více než 75 % případů z pouhých 2,5x10⁶ mononukleámích buněk z kostní dřeně v průběhu jediné expanze (příklad 3, tabulka 5).

Z uvedených výsledků je dále patrné, že adherentní buňky získané z CellGro™ Hematopoietic Stem Cell média s lidským sérem a suplementy je možno k ortopedickým účelům použít bez

CD45 deplece, protože tvorba kolonií z nedepletovaných buněk (tj. z buněk, které obsahují menší procento mezenchymových buněk než buňky po CD45 depleci) je minimálně stejně dobrá jako z depletovaných buněk. Toto není možné vysvětlit usmrcením velkého množství mezenchymových kmenových buněk v průběhu depleění procedury, protože množství mrtvých buněk po depleční proceduře se pohybovalo pouze mezi 3 až 23 %, přičemž procento mrtvých buněk mezi buňkami získanými z alfa-MEM s fetálním telecím sérem a suplementy se pohybovalo od 13 až 52% (měřeno pomocí 7-AAD na průtokovém cytometru). Tyto výsledky tedy teoreticky potvrzují koncept, že příměs krvetvorných buněk mezi buňkami mezenchymovými je užitečná nejen pro jejich primární expanzi, ale i pro jejich další růst a z praktického hlediska to znamená, že mezenchymové buňky k ortopedickým aplikacím není nutno od buněk krvetvorných pracně očišťovat.

Z uvedeného příkladu tedy vyplývá, že námi popsaným způsobem je možno z malého množství mononukleámích buněk získat v průběhu jediné expanze dostatečné množství CFU-F ke zhojení špatně srůstající zlomeniny a že přimíšené krvetvorné buňky nejsou na závadu dalšímu růstu buněk mezenchymových.

Příklad 6 - diferenciace mezenchymových kmenových buněk v dvourozměrných kulturách.

Mezenchymové buňky úvodně expandované v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským telecím sérem a suplementy a mezenchymové buňky úvodně expandované v alfaMEM s fetálním telecím sérem byly přeneseny v počtu 1000 až 2500 buněk/cm² do šestijamkových plastových destiček o povrchu jedné jamky zhruba 10 cm² a pěstovány ve 2 ml osteogenního indukčního média (popsáno v provedení vynálezu, bod 3). Médium bylo měněno každý týden a expanze buněk a tvorba kostních uzlíku byla pozorována pod inverzním mikroskopem. Po 2 až 4 týdnech expanze byly buňky fixovány buď 4% paraformaldelhydem ve fosfátovém solném rozio toku a následně barveny na alkalickou fosfatázu kitem Sigma C86 (Sigma-Aldrich, Německo) nebo byly fixovány 2% paraformaldelhydem s přídavkem 0,2% glutaraldelhydu ve fosfátovém solném roztoku a barveny von Kossovým barvením.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 6 a 7. Buňky úvodně expandované v CellGro™ Hematopoietic

Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy tvořily již po dvou týdnech viditelné kostní uzlíky (6a), které jevily pozitivitu při von Kossově barvení (6b). U buněk úvodně expandovaných v alfa-MEM a fetálním telecím séru nebyla tvorba obdobně zřetelných kostních uzlíků pozorována, i když po čtyřech týdnech rovněž jamky s těmito buňkami byly pozitivní na von Kossovo barvení. Buňky úvodně expandované v obou živných roztocích jevily po 3 až 4 týdnech pozitivitu na alkalickou fosfatázu (7a, buňky úvodně expandované v alfa-MEM s fetálním telecím sérem, 7b, buňky úvodně expandované v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy), přičemž pozitivita buněk úvodně expandovaných v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy byla minimálně stejně výrazná jako pozitivita buněk úvodně expandovaných v alfa-MEM s fetálním telecím sérem.

Z uvedeného příkladu tedy vyplývá, že buňky úvodně expandované v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell mediu s lidským sérem a suplementy tvoří v osteogenních podmínkách in vitro kostní uzlíky dříve, než buňky úvodně expandované v alfa-MEM s fetálním telecím sérem a jeví minimálně srovnatelnou pozitivitu na alkalickou fosfatázu, která je známkou diferenciace do osteo30 genní linie.

Příklad 7 - příprava polylaktidových nosičů a tvorba kostní matrix buňkami expandovanými v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell mediu s 10% lidským sérem a suplementy

Způsobem popsaným v provedení vynálezu, bod 7b, byly z PLLA vláken připraveny porézní polylaktidové nosiče (scaffoldy) ve formě terčíků o průměru 5,6 mm, tloušťce 1,5 až 2 mm a vzdálenosti vláken 100 až 400 pm pro kultivaci mesenchymálních buněk. Terčíky byly sterilizovány pod germícidní lampou po dobu 2 hodin a následně byly na 3 až 24 hodiny vloženy do osteogenního média s fetálním telecím sérem nebo osteogenního média s lidským sérem, aby nasákly médiem a zbavily se vzduchových bublin, které způsobovaly plavání čerstvých terčíků na hladině živného roztoku. Buňky pěstované v alfa-MEM s fetálním telecím sérem nebo v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s lidským sérem a suplementy byly poté nasazeny v počtu 2xl0⁵ najeden scaffold, přičemž do média s lidským sérem bylo přidáno 10 ng/ml EGF,

100 ng/ml PDGF-BB, 25 ng/ml M-CSF a 1 ng/ml FGF-2. Tento postup byl zvolen proto že buňky z živného roztoku s CellGro™ Hematopoietic Stem Cell mediem, lidským sérem a suplementy rostly v první pasáži hůře než buňky primárně expandované ve fetálním telecím séru, což jsme přičítali nedostatku suplementů. Živné roztoky (bez ohledu na to, zda byly připraveny s fetálním telecím sérem či s lidským sérem) byly měněny lx týdně, přičemž do živného roztoku s lidským sérem a suplementy byly čerstvé suplementy dodány ještě jednou uprostřed kultivačního týdne. Fotografická dokumentace probíhala jednou týdně. Po dvou až čtyřech týdnech byly scaffoldy s buňkami vyjmuty a buď voperovány pod kůži imunodeficientních myší (viz níže) nebo odeslány na histologické, imunohistochemické nebo elektronmikroskopické zpracování.

Růst buněk na trojrozměrných nosičích je znázorněn na obr. 8. Zde je patrné, že již po několika dnech buňky na povrchu nosiče začaly přemosťovat mezery mezi vlákny (8a) a po dvou az čtyřech týdnech jíž byly buňky přítomny i uvnitř scaffoldu a produkovaly extracelulámí matrix (8b). Na obr. 9 a 10 je znázorněna tvorba této matrix. Aby nedošlo k posunu vláken, buněk a matrix, s bylo nutno provést polotenké řezy zalité do syntetické pryskyřice (9a). Při tomto zpracování sice vznikají četné artefakty, ale dobře vynikne ukládání pěnité matrix (malá šipka) v porovnání s uložením buněk (velká šipka). Toto zpracování však neumožňuje provést některá speciální barvení. Pro tato barvení byly použity bločky zalité do parafínu nakrájené standardním způsobem a nalepené na podložní sklíčko. Pri tomto způsobu zpracování sice může dojít k částečné ztrátě io polylaktidových vláken (10b) a dochází k posunu vláken a matrix (9b, 10b), ale je možno znázornit pomocí speciálních barvení osteoid (9b), tvorbu kolagenu (10a) a ukládání osteonektinu (10b). Tyto proteiny či proteinové směsi jsou charakteristické pro tvorbu kosti, avšak uvedené preparáty nedokazují, zda dochází rovněž ke zvápenatění znázorněných struktur. Z tohoto důvodu bylo provedeno von Kossovo barvení polylaktidových terčíků a jejich fotografování pod stereomikroskopem (obr. 12a). Pozitivita barvení dle von Kossy prokazuje, že skutečně dochází k ukládání vápníku, a to uvnitř scaffoldu, nikoli (pouze) na jeho povrchu.

Příklad 8 - prvková analýza a tvorba kostní matrix buňkami rostoucími na polylaktidových nosičích

Kalcifikace tkání může být buď dystrofícká ěi osteogenní. K dystrofické kalcifikaci dochází pri vypadávání vápníku do nekrotických a jizevnatých tkání, přičemž dochází k tvorbě anorganických a organických sloučenin vápníku s různými dalšími prvky, ale nedochází k tvorbě hydroxy25 apatitu. Hydroxyapatit je charakterizován krystalickou strukturou a poměrem vápníku a fosforu 3:5 při prvkové analýze.

Z těchto důvodů jsme provedli znázornění krystalků hydroxyapatitu na trojrozměrných nosičích pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu a současně prvkovou analýzu na témže přístroji.

Použit byl rastrovací mikroskop Hitachi a energie 8,8 keV. Energie odražených elektronů byla hodnocena pomocí přístroje Narcom tzv. ETMA analýzou. Na obr. 1 la jsou dobře patrné četné krystalky hydroxyapatitu charakteristického vzhledu. Navíc na obr. 1 lb je znázorněn diagram z prvkové analýzy, kde jsou charakteristické peaky odražených elektronů v energetických oblastech vápníku a fosforu, navíc přibližně ve výše uvedeném poměru 3:5. Tyto výsledky tedy uka35 zují, že buňky vypěstované v CellGro™ Hematopoietic Stem Cell médiu s 10% lidským sérem a suplementy jsou schopné tvořit všechny složky kostní hmoty ve vhodném osteoindukěním prostředí a na trojrozměrných nosičích.

Příklad 9- tvorba kostí z lidských buněk rostoucích na polylaktidových nosičích v imunodeficíentních myších

Po šesti až devíti týdnech od implantace terčíků s lidskými osteoblasty byly myši humánně usmrceny parami dietyléteru a fixovány perfuzní fixací 10% formolem pomocí injekční jehly zavede45 né přes levou komoru srdeční se současným nastřižením pravé komory srdeční. Explantáty byly rozděleny na čtyři díly kolmými řezy přes střed terčíku, zpracovány zalitím do formolu, rozděleny nakrájeny na tenké řezy a barveny Ladewigovou modifikací Masonova trichromu. Toto barvení umožňuje odlišení mineralizované kostní matrix (červeně) od osteoidu (nemineralizované matrix - modře) a eventuálních dystrofických tkání (amyloid aj.), které se barví růžově. Represe zentativní výsledek je zachycen na obrázku 12. Z obrázku vyplývá, že explantát nezačíná osifíkovat z povrchu, ale z vnitřku scaffoldu, přičemž je patrná tvorba lamelami kosti. Na okrajích je dosud neosifikovaná kostní hmota (osteoid). Není patrná žádná zánětlivá čí obrovskobuněčná reakce, což dokazuje, že polylaktid byl dobře snášen.

Γ

Příklad 10 - konstrukce bioreaktoru a způsob jeho použití

Konstrukce bioreaktoru vychází z principů uvedených v bodu 8 části Provedení vynálezu. Základem bioreaktoru je kazetový systém 1 sestávající z nosiče 2 a litých plastových kultivačních nádobek 3, na jejichž vstupy 4, umístěné na přední straně, jsou nataveny pryžové uzávěry obdobným způsobem jako na plastových transfusních vacích ěi vacích určených k pěstování buněk in vitro v suspenzi (obr. 17 až 20). S výhodou mají kultivační nádobky 3 tvar obdélníku s rozměry 30x15 cm s výškou 1,5 až 2 cm, které vycházejí z rozměrů stolků běžných inverzních mikroskopů určených pro kultivaci buněk, není však nutné tyto rozměry dodržet, nádobky mohou mít ío jakýkoli účelný tvar a rozměry, umožňující jejich sestavení do kazetového systému. Ve stropní části kultivační nádobky je umístěno několik filtrů 5 z materiálu umožňujícího sterilní výměnu plynů mezi atmosférou v nádobce a v CO₂ inkubátoru a zároveň znemožňujícího vniknutí choroboplodných zárodků (běžně jsou užívány filtry o rozměru pórů 0,22 pm). V postranních deskách kultivační nádobky jsou vlisovány kolejnice 7 (viz obr. 20), které umožňují jejich vložení do kovového nosiče 2 (obr. 16), sestávajícího z alespoň dvou obdélníkových rámů 8 spojených nosnými dráty 6, uloženými kolmo k rámům 8 a připevněnými v pravidelných rozestupech k bočním stranám rámů. Rámy 8 i nosné dráty 6 jsou vyrobeny z pevně svařených drátů odpovídajícího složení a průměru. Je možno použít dráty z nerezové nebo jinak upravené zušlechtěné oceli nebo dráty měděné, které mají poté, co podlehnou mírné korozi, protibakteriální účinek neboje možno nosič zhotovit z jakéhokoli vhodného a praktického materiálu. Počet kultivačních nádobek 3 v kazetovém systému i není přesně specifikován, aby bylo možno zařízení vyrábět na míru dle dispozic CO₂ inkubátoru, do něhož bude bioreaktor vložen. Celkový perspektivní pohled na kazetový systém 1 je znázorněn na obr. 13, pohled zepředu na obr. 14 a pohled ze strany na obr. 15.

Nasazování buněk do kultivační nádobky 3 se provádí následujícím způsobem: příslušné množství buněk se aplikuje sterilní stříkačkou jedním vstupem 4 za současné aspirace vzduchu jinou stříkačkou k odstranění přetlaku druhým vstupem 4. Stejným způsobem se kultivační nádobka 3 doplní živným roztokem. Je žádoucí, aby dno kultivační nádobky 3 bylo pokryto alespoň dvěma, lépe třemi mm roztoku, což při povrchu dna kultivační nádobky 150 cm² znamená zhruba

30 až 45 ml živného roztoku na jednu kultivační nádobku. Je tedy možno použít sterilních 50 ml certifikovaných stříkaček. K zachování sterility je vhodné, aby byl živný roztok distribuován přímo v nádobkách uvedených objemů či jejich násobků a takových, aby z nich bylo možno roztok aspirovat stříkačkou a jehlou, jako z běžných infuzních lahví. Následně se doplní suplementy. Stejně jako v případě infuzních roztoků je vhodné (i když nikoli nutné), aby suplementy byly dodávány v alikvotech, ať již smísené v příslušných poměrech či každý zvlášť, v roztoku či lyofilizované.

Po nasazení buněk a živného roztoku a jeho doplnění suplementy se kultivační nádobka 3 umístí do nosiče 2 a kazetový systém I je vložen do CO₂ inkubátoru. Suplementy se doplňují dvakrát týdně. Vzhledem ke konstrukci bioreaktoru a uzavřenému systému kultivace je možné kultivační nádobky za příslušných hygienických kautel vyjmout a prohlížet pod inverzním mikroskopem, zda došlo k dostatečnému nárůstu adherentní vrstvy buněk. Po dosažení optimálního množství buněk (předpokládaná doba kultivace je 2 až 3 týdny, v našich podmínkách jsme dosahovali optimálního množství buněk při době kultivace mezi 13 až 17 dny). Poté je možno přikročit ke sklizni.

V průběhu sklizně se nejprve odstraní živný roztok s neadherentními buňkami pomocí sterilní stříkačky a injekční jehly, přičemž druhou stříkačkou se do kultivační nádobky vhání vzduch, aby se zabránilo vzniku podtlaku. Alikvoty živného roztoku se odešlou na mikrobiologickou kultivaci a ke stanovení pyrogenů a endotoxinu. Tyto alikvoty je možno odebírat i v průběhu kultivace, jeli to nutné či vhodné, protože se nejedná o velké objemy živného roztoku. Poté se adherentní buňky inkubují s malým množstvím roztoku 1% EDTA - 0,05% trypsin, což vede k jejich odloučení od povrchu plastové nádobky. Kontakt s trypsinem je jediný kontakt se zvířecí bílkovinou v průběhu kultivace. Námi používaný roztok 0,05% trypsin - 1% EDTA (Invitrogen) obsahuje prasečí trypsin v uvedené velice nízké koncentraci. Po neutralizaci živným roztokem s lidským sérem a dalším promytí tímtéž živným roztokem je možnost alergické reakce na tuto zvířecí bílkovinu minimální. Virologickou bezpečnost produktu je možno zvýšit ozářením 25 Gy nebo je možno použít alternativní, trypsinu podobný enzym, který nevyžaduje neutralizaci, nepochází ze zvířecího zdroje a je virologicky zcela bezpečný (TrypLE™ Selecí či TrypLE™ Express,

Invitrogen Inc.),

Po odloučení buněk od povrchu plastové kultivační nádobky se opět přidá větší množství živného roztoku s lidským sérem, což vede jednak k omezení ztrát buněk při aspiraci, jednak k eventuální neutralizaci trypsinu. Adherentní buňky se potom odstraní opět pomocí sterilní stříkačky a io injekční jehly, za současného vhánění vzduchu druhým vstupem k udržení rovnováhy tlaků. V tomto případě je k aspiraci buněčné suspenze vhodné užít co nejtenčí jehlu, aby se shluky buněk disociovaly a buňky převedly do jednobuněčné suspenze. Aspirované odloučené adherentní buňky se poté vloží do dětského transfusního vaku, centrifugují, propláchnou živným roztokem a připravení k aplikaci. Veškerá manipulace s buňkami, jakkoli v uzavřeném systému, probíhá navíc v laminámím boxu příslušného stupně biohazardu.

Je možné, že se tento postup osvědčí k přípravě mezenchymových buněk i pro jiné než ortopedické použití. V takovém případě, za předpokladu, že přítomnost CD45+ buněk bude nežádoucí, je možno odstranit tyto buňky pomocí imunomagnetické protilátky proti CD45+ (např. v přístroji

CliniMACS™ Miltényi Biotec, který je certifikovaný pro klinické užití a pracuje rovněž v uzavřeném systému).

Claims (9)

1. Způsob pěstování lidských mezenchymových kmenových buněk, zejména pro léčbu nehojí30 cích se fraktur, z mononukleámích buněk dřeňové krve, vyznačený tím, že kultivace buněk se provádí jednorázově v uzavřeném systému v médiu pro pěstování savčích a lidských buněk, s přídavkem 10% lidského séra a suplementů dexamethasonu, kyseliny askorbové, lidského rekombinantního inzulínu, lidského rekombinantního PDGF-BB, lidského rekombinantního EGF v kombinaci s lidským rekombinantním M-CSF a lidským rekombinantním FGF-2, bez

35 zvířecích bílkovin, bez odstraňování hemopoetických buněk a bez výměny živného roztoku v průběhu kultivace při 5 % CO₂ a 37 °C.

2. Způsob pěstování lidských mezenchymových kmenových buněk podle nároku 1, vyznačený tím, že jako médium pro pěstování savčích a lidských buněk se používá médium pro

40 pěstování hemopoetických kmenových buněk.

3. Způsob pěstování lidských mezenchymových kmenových buněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2, vyznačený tím, že se během kultivace buněk alespoň jednou přidávají suplementy dexamethason, kyselina askorbová, lidský rekombinantní inzulín, lidský rekombi45 nantní PDGF-BB, lidský rekombinantní EGF v kombinaci s lidským rekombinantním M-CSF a lidským rekombinantním FGF-2.

4. Způsob pěstování lidských mezenchymových kmenových buněk podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačený tím, že kultivace buněk se provádí po dobu jednoho až tří týdnů.

5. Způsob pěstování lidských mezenchymových kmenových buněk podle nároku 4, vyznačený t í m , že kultivace buněk se provádí po dobu 13 až 17 dní.

6. Bioreaktor k provádění způsobu pěstování podle nároků laž 5, vyznačený tím, že 55 sestává z nosiče (2) a z uzavřených plastových kultivačních nádobek (3), které jsou opatřeny filtry (5) pro zabezpečení sterilní výměny vzduchu a aseptickými vstupy (4) pro nasazování a sklizeň buněk a přídavky suplementů, přičemž kultivační nádobky (3) jsou umístěny v nosiči (2), nejlépe kazetovým způsobem.

5

7. Bioreaktor podle nároku 6, vyznačený tím, že nosič (2) je tvořen dvěma rámy (8) spojenými nosnými dráty (6) uloženými kolmo k rámům a připevněnými v pravidelných rozestupech k bočním stranám rámů.

8. Bioreaktor podle nároku 7, vyznačený tím, že nosič (2) je kovový.

o

9. Bioreaktor podle nároku 8, vyznačený tím, že nosič (2) je z nerezové nebo jinak upravené zušlechtěné oceli nebo mědi.