MXPA04009997A

MXPA04009997A - Modulacion de la diferenciacion de celulas madre y progenitoras, ensayos y usos de las mismas.

Info

Publication number: MXPA04009997A
Application number: MXPA04009997A
Authority: MX
Inventors: W H Chan Kyle
Original assignee: Celgene Corp
Priority date: 2002-04-12
Filing date: 2003-04-11
Publication date: 2004-12-13
Also published as: WO2003087333A3; US20050118715A1; JP2005522215A; CA2481385A1; WO2003087333A2; KR20050000400A; EP1538913A2; WO2003087333A8; AU2003262187A1

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos de modulacion de la diferenciacion de celulas madre y celulas progenitoras de mamiferos. Los metodos de la invencion se pueden emplear para regular y controlar la diferenciacion y la maduracion de las celulas madre de mamiferos, particularmente de humanos, junto con linajes especificos de celulas y de tejidos. Los metodos de la invencion se refieren al uso de ciertas moleculas organicas pequenas para modular la diferenciacion de las poblaciones de celulas madre o progenitoras junto con linajes especificos de celulas y de tejidos, y en particular, para la diferenciacion de celulas madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta post-parto o para la diferenciacion de celulas progenitoras tempranas para un linaje de granulocitos. Finalmente, la invencion se refiere al uso de tales celulas madre o progenitoras diferenciadas en los transplantes y otros tratamientos medicos.

Description

MODULACIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE PROGENITORAS, ENSAYOS Y USOS DE LAS MISMAS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos de modulación de la diferenciación de células madre y/o progenitoras de mamíferos. Los métodos de la invención se pueden emplear para regular y controlar la diferenciación y la maduración de las células progenitoras y madre de mamíferos, particularmente de humanos, junto con linajes específicos de células y de tejidos. Los métodos de la invención se refieren al uso de ciertas moléculas orgánicas pequeñas para modular la diferenciación de las poblaciones de células madre junto con linajes específicos de células y de tejidos, y en particular, a la diferenciación de células madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta post-parto o la modulación de células progenitoras, hematopoyéticas , tempranas, junto con una ruta específica de diferenciación, particularmente una ruta de diferenciación de granulocitos. La invención también se refiere al uso de estas moléculas orgánicas para modular la diferenciación de linajes particulares de células progenitoras, tales como CD34+, CD45+ y CD133+. La invención también se refiere a los aspectos temporales del desarrollo de células progenitoras, y modelos in vi tro basados en estos aspectos temporales. La invención además se refiere al uso de estas células moduladas en métodos profilácticos y terapéuticos, que se incluyen composiciones farmacéuticas de tales compuestos orgánicos células y/o pequeños. Finalmente, la invención se refiere al uso de tales células madre o progenitoras diferenciadas en transplantes y otros tratamientos médicos. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe un considerable interés en la identificación, aislamiento y generación de células madre y progenitoras de humanos. Las células madre son células precursoras totipotenciales o pluri-potenciales capaces de generar una variedad de linajes de células maduras, y las células precursoras son células capaces de generar células de linajes de células específicas. Estas habilidades sirven como la base para la diferenciación y especiali zación celular necesarias para el desarrollo de órganos y tejidos. El reciente éxito en el transplante de células madre y progenitoras ha proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o suplementar la médula ósea después de la mieloablación debido a un padecimiento, exposición a químicos tóxicos y/o radiación. Además existe evidencia que demuestra que se pueden emplear células madre para repoblar muchos, sino es que todos, los tejidos y para restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. También se ha avanzado rápidamente en la aplicación de células madre en la ingeniería de tejidos, suministro de terapia génica y terapéutica celular. Se ha caracterizado una gran cantidad de diferentes tipos de células madre progenitoras y de mamíferos. Por ejemplo, son conocidas las células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre de adultos o células madre consignadas o células progenitoras. No solamente se han aislado y caracterizado ciertas células madre, también se han cultivado bajo condiciones que permiten la diferenciación hasta un punto limitado. Sin embargo, permanece un problema básico; es decir, que ha sido difícil controlar o regular la diferenciación de células madre y células progenitoras, tal como las células progenitoras hematopoyéticas . Actualmente, los métodos existentes para modular la diferenciación de estas células son burdos y no regulables, tal que las células se diferencian en tipos de células indeseadas, en tiempos indeseados . Además, el campo de las células del producto es típicamente bajo. Además, es problemático obtener un suficiente número de células madre de humanos para propósitos terapéuticos y de investigación. El aislamiento de poblaciones normalmente presentes de células madre o progenitoras en tejidos de adultos, ha sido difícil técnicamente y costoso, debido, en parte, a la cantidad limitada de células madre o progenitoras encontradas en la sangre o los te idos, y la incomodidad significativa implicada al obtener aspirantes de médula ósea. En general, la cosecha de células madre o progenitoras de fuentes alternativas en cantidades adecuadas para propósitos terapéuticos y de investigación generalmente es laboriosa, que involucra, por ejemplo, la cosecha de células o tejidos de un sujeto donador o paciente, el cultivo y/o propagación de células in vi tro, disección, etc. Con respecto a las células madre en particular, la obtención de estas células de embriones o tejidos fetales, que incluye los abortos, ha planteado inquietudes religiosas y éticas. La creencia ampliamente aceptada de que el embrión humano y el feto constituyen una vida independiente, ha motivado restricciones gubernamentales en el uso de tales fuentes para todos los propósitos, incluyendo la investigación médica. Por lo tanto son deseadas fuentes alternativas que no requieran el uso de células adquiridas de tejido embrionario o fetal para un avance adicional en el uso de células madre clínicamente. Existen, sin embargo, pocas fuentes alternativas viables de células madre o progenitoras, particularmente células madre o progenitoras de humanos, y por consiguiente el abastecimiento está limitado.

Hu et al. (WO 00/73421 titulada "Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells," publicada el 7 de Diciembre del 2000) describe células epiteliales amnióticas, de humanos, derivadas de la placenta en el suministro que se aislan, cultivan, criopreservan para su uso futuro, o que se inducen para diferenciarse. De conformidad con Hu et al., se cosecha inmediatamente una placenta después de la administración y la membrana amniótica separada del corion, por ejemplo mediante disección. Las células epiteliales amnióticas se aislan de la membrana amniótica de conformidad con las técnicas estándar del asilamiento de células. Las células descritas se pueden cultivar en varios medios, expandir en cultivos, criopresevar , o inducir para diferenciarlas. Hu et al. describe que las células epiteliales amnióticas son multi-potenciales (y posiblemente pluripotenciales) , y se pueden diferenciar en tejidos epiteliales tales como el epitelio de la superficie de la córnea o el epitelio vaginal. Sin embargo, el inconveniente de tales métodos, es que los mismos requieren mano de obra intensiva y el rendimiento de células madre es muy bajo. Los métodos disponibles actualmente para la expansión ex vivo de poblaciones celulares, también requieren mano de obra intensiva. Por ejemplo, Emerson et al., (Emerson et al., Patente Norteamericana No. 6,326,198 titulada "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells", publicada el 4 de Diciembre del 2001); describe métodos, y condiciones de medios de cultivo para el cultivo ex vivo de la división y/o la optimización de células madre de humanos de células madre progenitoras , hematopoyéticas, de humanos. De acuerdo con los métodos descritos, las células madre de humanos o las células progenitoras derivadas de la médula ósea, se cultivan en un medio de cultivo líquido es decir se reemplazan, preferiblemente se perfusionan, ya sea continua o periódicamente, en una relación de 1 mi de medio por mi de cultivo por un periodo de aproximadamente 24 hasta aproximadamente 48 horas. Se remueven los productos metabólicos y los nutrientes agotados se reponen mientras que se mantiene el cultivo bajo condiciones fisiológicamente aceptables . Kraus et al. (Kraus et al., Patente Norteamericana No. 6,338,942, titulada "Selective expansión of target cell populations" , expedida el 15 de Enero del 2002) describe que una población objetivo predeterminada de células se puede expandir selectivamente introduciendo una muestra de partida de células de sangre de cordón umbilical o sangre periférica en un medio de crecimiento, provocando que las células de la población celular objetivo se dividan, y pongan en contacto con las células en el medio de crecimiento con un elemento de selección que comprende moléculas de enlace con afinidad específica (tal como un anticuerpo monoclonal para CD34) para una población predeterminada de células (tal como células CD34) , para seleccionar células de la población objetivo predeterminada de otras células en el medio de crecimiento. Rodgers et al. (Patente Norteamericana No. 6,335,195 titulada "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation, " expedida el 1 de Enero del 2002) describe métodos para el cultivo ex vivo de células madre hematopoyé icas y mesenquimales y la inducción de la proliferación y diferenciación de células de linaje específico mediante el crecimiento en la presencia de angiotensinógeno, angiotensina I (AI), análogos AI, fragmentos AI y análogos de los mismos, angiotensina II (AII) , fragmentos AII o análogos de los mismos o agonistas del receptor tipo 2 AII AT2, ya sea solos o en combinación con otros factores de crecimiento y citocinas. Las células madre se derivan de la médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón umbilical. Sin embargo, la desventaja de tales métodos, es que tales métodos ex vivo para inducir la proliferación y diferenciación de células madre es que consume tiempo, como se describió anteriormente, y también el resultado en bajos rendimientos de células madre. Las células madre y progenitoras tienen el potencial de ser utilizadas en el tratamiento de una variedad de padecimientos, que incluyen malignidades, errores congénitos de metabolismo, hemoglobinopatías , e inmunodeficiencias . Una mayor área de uso e investigación que involucra las células madre de sangre de cordón umbilical o placenta, ha sido el uso de tales células para generar pequeñas cantidades de células para la médula ósea y otros transplantes relacionados. Sin embargo, hasta la fecha, ninguno ha descrito un método para producir cifras sustanciales de células madre o progenitoras, tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+. Grandes números de las últimas células, en particular, podrían facilitar métodos de tratamiento utilizando células progenitoras. Los métodos de la invención descritos aquí atienden esta necesidad . Los retinoides, tales como la vitamina A y el ácido retinóico (RA) , han sido conocidos por afectar la diferenciación de las células madre. Por ejemplo, el ácido retinóico ha demostrado inhibir la proliferación de células madre hematopoyéticas consignadas anormalmente (leucemia mielógena crónica) (Nadkarni et al. 1984, Tumori 70:503-505) e inducir la diferenciación y pérdida del potencial de auto-renovación en las células de leucemia promielocítica (Melchner et al., 1985, Blood 66(6):, 1469-1472) . El ácido retinóico también ha demostrado inducir la diferenciación de las neuronas de las células madre embrionarias y reprimir la diferenciación mesodérmica espontánea (Slager et al., Dev. Genet. 1993; 14 (3) : 212-24 , Ray et al., 1997, J. Biol . Chem. 272(30): 18702-18708). El ácido retinóico además ha demostrado inducir la diferenciación de precursores de células germinales transformadas (Damjanov et al., 1993, Labor. Investig. 68(2) :220-232), precursores de células de placenta (Yan et al., 2001, Devel. Biol. 235: 422-432), y precursores de células endoteliales (Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468) . El efecto de los retinoides en la diferenciación, sin embargo, todavía tiene que ser entendido completamente de tal forma que el mismo se pueda utilizar como un medio regulable para controlar la diferenciación de las células madre. Se han estudiado los efectos de los análogos de ácido fólico, tales como la aminopterina y ametopterina (metotrexato) , sobre la diferenciación de las células madre hematopoyéticas . Los análogos de ácido fólico se utilizan como agentes quimioterapéuticos en anemias linfoblásticas agudas y otros padecimientos y cánceres de proliferación sanguínea, y ha demostrado efectuar la diferenciación de las células madre exterminando ciertas poblaciones de células madre (DeLoia et al., 1998, Human Reproduction 13 (4 ) : 1063 -1069) , y por consiguiente, podría ser una herramienta efectiva para regular la diferenciación de grandes cantidades de células madre para su administración a un paciente. Varias citocinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL7, IL-11, así como proteínas tales como la eritropoyetina, ligando Kit, M-CSF y GM-CSF han demostrado dirigir la diferenciación de las células madre en tipos específicos de células en el linaje hematopoyético (Dushnik-Levinson et al., 1995, Biol . Neonate 67:77-83), sin embargo, estos procesos no son bien entendidos y aún siguen siendo demasiado burdos e imprecisos para permitir un medio regulable para controlar la diferenciación de las células madre. Hasta la fecha, ninguno ha descrito el uso de compuestos, tales como los inhibidores PDE IV descritos posteriormente, en la diferenciación de células madre o células precursoras. En particular, ninguno ha demostrado el uso de tales compuestos para modular la diferenciación de células progenitoras , tales como células progenitoras CD34+, lejos de un linaje celular dendrítico, una capacidad útil para estimular la tolerancia inmune en los trasplantes. Asimismo, ninguno ha descrito el uso de los compuestos descritos aquí para expandir las poblaciones de células progenitoras para producir una composición farmacéutica que contenga tales células. Tales cultivos de células progenitoras expandidas podrían ser útiles en el tratamiento del padecimiento injerto-versus-huésped y el desarrollo de tolerancia inmune. Debido a que el control sobre la diferenciación de las células madre y precursoras puede producir poblaciones de células que sean útiles terapéuticamente, existe la necesidad de la capacidad de controlar y regular la diferenciación de células de linaje celular dendrítico, mieloide, o células progenitoras tempranas, tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+, para la producción controlada de células dendríticas y/o granulocitos . 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células progenitoras o células madre de mamíferos, particularmente de humanos. En particular, los métodos de la invención se pueden emplear para regular y controlar la diferenciación y la maduración de las células madre de humanos junto con linajes específicos de células y de tejidos. La invención abarca el uso de inhibidores PDE IV, particularmente la clase de compuestos conocidos como SelCIDS (Celgene) , para efectuar tal regulación y control. La invención además contempló la administración de estos compuestos a células progenitoras en tiempos específicos para modular su diferenciación en formas específicas. Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de una célula madre o célula progenitora en un linaje celular específico, que incluye, pero no está limitado a, un linaje mesenquimal, hematopoyético, adipogénico, hepatogénico, neurogénico, gliogénico, condrogénico, vasogénico, miogénico, condrogénico, u osteogénico. En una modalidad particular, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre a una célula de un linaje hematopoyético. La invención también abarca la modulación de una célula consignada a un tipo específico de célula, por ejemplo, célula mesenquimal, célula hematopoyética, adipocito, hepatocito, neuroblasto, gliobasto, condrocito, progenitor de células endoteliales (EC) , miocito, condrocito, u osteoblasto. En modalidades específicas, la invención abarca la modulación de una célula progenitora hematopoyética, consignada, a un eritrocito, un trombocito, o un leucocito (célula sanguínea blanca) tal como un neutrófilo, monocito, macrófago, eosinófilo, basófilo, mastocitos, célula B, célula T, o célula de plasma. En otra modalidad, los métodos de la invención se refieren a la modulación de la diferenciación de células madre con respecto a las células de un linaje hematopoyé ico, en particular, linajes hematopoyéticos CD34+, CD133+, y CD45+, y métodos para producir composiciones farmacéuticas benéficas profiláctica y terapéuticamente que contienen tales células. En otra modalidad específica, los métodos de la invención se refieren a la modulación de la diferenciación de células progenitoras tempranas de un linaje celular dendrítico o un linaje de granulocitos, linaje endotelial, o linaje de cardiomiocitos . En otra modalidad, la invención proporciona métodos para regular la diferenciación de una célula progenitora en un linaje hematopoyético, particularmente una célula dendrítica o linaje granulocítico, linaje endotelial, linaje neural o linaje cardiomiocito . En una modalidad específica, dicha célula progenitora es una célula CD34+ ó CD133+. Tal regulación se logra poniendo en contacto las células progenitoras durante el cultivo con un compuesto de la invención. En una modalidad, dicho compuesto en un inhibidor de actividad PDE IV. En una modalidad más específica, dicho compuesto es un inhibidor PDE IV. Más preferiblemente, dicho inhibidor PDE IV es un SelCID™ (ver la Sección 4.3, a continuación) . En otra modalidad específica, los métodos de la invención abarcan la supresión de la diferenciación de células progenitoras en una célula dendrítica. En otra modalidad específica, la invención proporciona un método para modular la diferenciación de células progenitoras durante los primeros seis días del cultivo para producir un cultivo expandido de tales células progenitoras. En otra modalidad, los métodos de la invención abarcan la promoción del desarrollo de células progenitoras tempranas en un granulocito, el cual puede ser útil para combatir infecciones. El incremento de progenitores asignados de linaje de granulocitos (células CD15+) , puede ser de uso potencial en la reducción de la neutropenia y sus subsecuentes complicaciones infecciosas que representan la toxicidad más común limitante de dosis de quimioterapia para el cáncer. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir la diferenciación de células dendríticas, la cual es útil para mitigar los efectos del padecimiento inj erto-versus -huésped . Las células progenitoras de la invención, cuando se modulan mediante un compuesto de la invención, son útiles para un transplante (es decir, reconstitución hematopoyética) , y se pueden utilizar en la medicina regenerativa como una fuente renovable de células y tejidos de reemplazo (tales como células pancreáticas, cardiacas, hepáticas, del riñon, hígado, cerebro, pulmón, vejiga, intestinales o de músculos) para tratar la senectud normal, daños o padecimientos tales como padecimiento cardiaco, apoplejía, padecimiento de Parkinson, y padecimiento de Alzheimer. Las células también serán útiles en la determinación de las rutas bioquímicas intracelulares que median la acción de los compuestos de la invención. Estas células también pueden ser útiles para la selección de nuevos fármacos y toxinas, por ejemplo, para determinar potenciales fármacos anti -cancerígenos, para entender los orígenes de defectos congénitos, etc. Los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células rojas de la sangre o glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , mientras que aumentan tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) y mejoran la producción total de la unidad formadora de colonias. Los métodos de la invención se pueden utilizar no solamente para regular la diferenciación de las células madre, y células progenitoras tales como las células progenitoras CD34+, sino que también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias, proporcionando un beneficio significativo al transplante de células progenitoras hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea . Se puede utilizar cualquier célula madre de mamífero de acuerdo con los métodos de la invención, que incluyen pero no están limitados a, células madre aisladas de la sangre de cordón umbilical, placenta y otras fuentes. Las células madre se pueden aislar de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, ratón, rata, conejo, conejillo de indias, perro, gato, cerdo, oveja, vaca, caballo, mono, etc., más preferiblemente, un humano. Las células madre pueden incluir células pluripotentes, es decir, células que tengan una versatilidad completa de diferenciación, que sean auto-renovables, y que puedan permanecer letárgicas o inmóviles dentro del tejido. Las células madre también pueden incluir células multipotentes o células progenitoras consignadas. En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son células madre viables, inmóviles y pluripotentes que existen dentro, o que son producidas después por, la placenta de término completo, es decir, tales células se pueden recuperar después de un nacimiento exitoso y de la expulsión de la placenta, desangramiento y perfusión de la placenta, dando como resultado la producción y recuperación de tantas como un billón de células que poseen un núcleo, las cuales dan 50 a 100 millones de células madre multipotentes y pluripotentes. Tales células se mencionan aquí como células madre de placenta humana o células madre similares a las embrionarias .

En una modalidad particular de la invención, las células, por ejemplo las células endógenas a la médula ósea o a una placenta perfusionada post -parto, que incluyen, pero que no están limitadas a, células madre similares a las embrionarias, células progenitoras tales como células CD34+ ó CD133+, células pluripotentes y células multipotentes , se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse. Las células endógenas se pueden propagar in vi tro. En otra modalidad, las células endógenas se pueden recolectar de la placenta y del medio de cultivo y se cultivan in vi tro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación con respecto al tipo o linaje de célula deseada. En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras se derivan de otras fuentes tales como sangre de cordón umbilical, sangre periférica o sangre de adulto, y se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse. En una modalidad preferida, la diferenciación se realiza in vitro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación en el linaje deseado o tipo de célula. Los compuestos de la invención se utilizan en la diferenciación/medio de cultivo mediante la adición, generación in situ, o de cualquier otra manera que permita el contacto de las células madre o progenitoras con los compuestos de la invención. Se ha descubierto que la gestión del momento oportuno de la administración de los compuestos de la invención, tiene un profundo impacto en la diferenciación de las células progenitoras CD34+. Por consiguiente, en una modalidad de la invención, la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células dendríticas se retrasa o suprime mediante un método que comprende poner en contacto la célula progenitora en el primer día del cultivo con un compuesto de la invención. En otra modalidad, se reduce o previene el desarrollo de las células CDla+ de las células progenitoras CD34+ mediante un método que comprende poner en contacto dichas células progenitoras con un compuestos de la invención en el primer día del cultivo. En otra modalidad, se incrementa la persistencia de una población de células CDla+ derivada de las células progenitoras CD34+ poniendo en contacto dichas células progenitoras con un compuesto de la invención después de cultivar dichas células progenitoras durante seis días en la ausencia de dicho compuesto. La presente invención también abarca métodos de modulación de la diferenciación de células progenitoras tempranas, tales como células CD34+ y CD133+, que comprenden poner en contacto las células progenitoras en diversos tiempos durante las fases de proliferación y diferenciación con uno o más del (los) compuesto (s) de la invención. Por consiguiente, en una modalidad, la invención abarca un método de la modulación de la diferenciación de las células progenitoras que comprenden poner en contacto dichas células con uno o más compuesto (s) de la invención solamente en el primer día del cultivo. En otra modalidad, dichas células se ponen en contacto con dicho (s) compuesto (s) en una dosis en cualquier día entre el primer día y el doceavo día del cultivo. En otra modalidad, dichas células se ponen en contacto al menos dos veces con dicho(s) compuesto (s) , inclusive en diferentes días, entre los días 0-12. Aún en otra modalidad, dichas células se ponen en contacto con uno o más compuesto (s) dos veces al día, una vez al día, o una vez cada tercer día durante las fases de proliferación y/o diferenciación. En otra modalidad, dicho contacto se realiza in vi tro. Aún en otra modalidad, dicho contacto se realiza in vivo en un sujeto. En una modalidad más específica, dicho sujeto es un humano, un mamífero no humano, un ave o un reptil . En resumen, una exposición de células progenitoras o madre endógenas o exógenas las cuales se pueden cultivar en una placenta perfusionada post -parto, a compuestos de la invención puede ocurrir mientras que las células se cultivan en la placenta, o preferiblemente, puede ocurrir in vi tro después de que se han recuperado y removido las células de la placenta . La invención abarca el uso de compuestos que tienen una actividad inhibidora PDE IV como moduladores del desarrollo de células madre y/o progenitoras . En modalidades específicas, los compuestos son inhibidores PDE IV tales como clases de compuestos conocidos como SelCIDs™ (Celgene Corp., Warren, NJ) . La invención también abarca el transplante de células madre o progenitoras pretratadas para tratar o prevenir un padecimiento. En una modalidad, también se administra un compuesto de la invención a un paciente en necesidad de un transplante antes, durante y/o después del transplante. La invención además abarca el uso de una célula progenitora o tipo específico de célula producida a partir de un método de la invención. En otras palabras, la invención abarca el uso de leucocitos, granulocitos , o células dendríticas hechas a partir de la diferenciación de un progenitor hematopoyético donde quiera que dicha diferenciación del progenitor se module o regule utilizando un compuesto de la invención. En otras modalidades, la invención abarca el control o regulación de las células madre in vivo mediante la administración tanto de una célula madre como de un compuesto de molécula pequeña de la invención a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende células progenitoras CD34+ ó CD133+ que se han puesto en contacto con un compuesto de la invención, particularmente una que inhibe la actividad del PDE IV, en los primeros seis días del cultivo, bajo condiciones que promueven la proliferación y diferenciación de dichas células progenitoras, y un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad específica, la composición farmacéutica incluye células que se han recolectado y criopreservado después de seis días del cultivo. En otra modalidad específica, las células de la composición farmacéutica son células CD34+CD38"CD34" ó CD34+CD38CD34+. En otra modalidad específica, el compuesto con el cual las células se ponen en contacto es un inhibidor PDE IV de la invención. En otra modalidad específica, el compuesto con el cual las células se ponen en contacto es un SelCID™. En otra modalidad, la invención también proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica, que comprende poner en contacto células progenitoras CD34+ ó CD133+ con un compuesto que inhiba la actividad PDE IV, en donde dichas células progenitoras se cultivan durante seis días en un medio de cultivo bajo condiciones de cultivo que permiten la proliferación y diferenciación de dichas células progenitores; recolectar dichas células después de seis días de cultivo; y combinar dichas células con un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad específica de este método, dicho contacto se realiza en el primer día del cultivo. En otra modalidad específica de este método, dicho contacto se realiza al menos dos veces durante dichos seis días del cultivo. En otra modalidad específica, el compuesto con el cual las células se ponen en contacto es un inhibidor PDE IV de la invención. En otra modalidad específica, el compuesto con el cual las células se ponen en contacto es un SelCID™. Aún en otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se han aislado de otras células sanguíneas antes de dicho cultivo. En otra modalidad específica de este método, dicho medio de cultivo contiene adicionalmente GM-CSF y TNF-OÍ. En una modalidad más específica de este método, dicho SelCID™ está presente en una concentración de entre 0.1 µ? y 10.0 µ?. En otra modalidad más específica de este método, dicho SelCID™ está presente en una concentración de 1.0 µ?. En otra modalidad específica de este método, dichas células se criopreservan después de dicha recolección . La invención además proporciona un método para expandir una población de células progenitoras en un sujeto mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de células progenitoras CD34+ ó CD133+ y uno o más SelCIDs™ a dicho sujeto mamífero receptor. En una modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se diferencian en el sujeto mamífero receptor. En otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se administran a dicho sujeto en una preparación de células que está sustancialmente libre de células rojas de la sangre o glóbulos rojos. En otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se administran al sujeto mamífero receptor en una preparación de células que comprende células de médula ósea, células de placenta, células de cordón umbilical o PBMCs . En otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se administran al sujeto mamífero receptor en conjunción con un portador. En otra modalidad específica de este método, dicha célula progenitora es una célula progenitora CD34+CD133+. En otra modalidad específica de este método, las células progenitoras expresan material genético incorporado de interés. La presente invención también proporciona las células que se producen mediante los métodos anteriores que son útiles como composiciones farmacéuticas. Aún en otras modalidades, la invención abarca métodos para acondicionar células madre o células progenitoras, por ejemplo, células progenitoras CD34+, después de la criopreservación y el deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la criopreservación y la exposición a los crioconservadores de las células madre. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para acondicionar las células madre después de la criopreservación y deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la exposición a lo crioconservadores (por ejemplo, DMSO) en la capacidad de proliferación y migratoria de las células madre. 3.1 DEFINICIONES Cuando se utiliza aquí, el término "biorreactor o termentador" se refiere a un sistema ex vivo para propagar células; producir o expresar materiales biológicos y desarrollar o cultivar células de tejidos, organoides, virus, proteínas, polinucleo idos y microorganismos. Cuando se utiliza aquí, "células DC" se refiere a células dendríticas. Cuando se utiliza aquí, "célula progenitora temprana" significa una célula progenitora CD34+, una célula progenitora CD133+, o el equivalente ya sea de mamífero, ave o reptil. Cuando se utiliza aquí, el término "célula madre embrionaria" se refiere a una célula que se deriva de la masa celular interna de un blastocisto (por ejemplo, un embrión humano de 4 a 5 días de edad) y que es pluripotente .

Cuando se utiliza aquí, el término "célula madre similar a una embrionaria" se refiere a una célula que no se deriva de la masa celular interna de un blastocisto. Cuando se utiliza aquí, una "célula madre similar a una embrionaria" también se puede mencionar como una "célula madre de placenta" . Una célula madre similar a una embrionaria preferiblemente es pluripotente . Sin embargo, las células madre las cuales se pueden obtener de la placenta incluyen células madre similares a las embrionarias, células multipotentes , y células progenitoras consignadas . De acuerdo con los métodos de la invención, las células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta, se pueden recolectar de la placenta aislada un vez que se ha desangrado y perfusionado durante un periodo de tiempo suficiente para remover las células residuales. Preferiblemente, las células similares a las embrionarias son humanas, aunque las mismas se pueden derivar de cualquier mamífero. Cuando se utiliza aquí, el término "desangrado" o "desangramiento" cuando se utiliza con respecto a la placenta, se refiere a la remoción y/o drenado de sustancialmente toda la sangre del cordón umbilical de la placenta. De acuerdo con la presente invención, el desangramiento de la placenta se puede lograr mediante, por ejemplo, pero no a manera de limitación, drenado, emanación inducida con gravedad, masaje, estrujamiento, bombeo, etc. En una modalidad preferida, el desangramiento de la placenta se puede lograr además perfusionando, enjuagando o llenando la placenta con un fluido que puede o no puede contener agentes, tales como anticoagulantes, para ayudar en el desangramiento de la placenta . Cuando se utiliza aquí, el término "perfusar" o "perfusión" se refiere al acto de verter o pasar un fluido sobre o a través de un órgano o tejido, preferiblemente el paso de fluido a través de un órgano o tejido con suficiente fuerza o presión para remover cualquier célula residual, por ejemplo, células no adheridas del órgano o tejido. Cuando se utiliza aquí, el término "perfusado" se refiere al fluido recolectado después de su paso a través de un órgano o tejido. En una modalidad preferida, el perfusado contiene uno o más anticoagulantes . Cuando se utiliza aquí, el término "célula endógena" se refiere a una célula "no extraña", es decir, una célula "propia" o autóloga que se deriva de la placenta. Cuando se utiliza aquí, el término "célula exógena" se refiere a una célula "extraña", es decir, una célula heteróloga (es decir, una célula "no-propia" derivada de una fuente diferente del donador de placenta) o célula autóloga (es decir, una célula "propia" derivada del donador de placenta) que se deriva de un órgano o tejido diferente de la placenta . Cuando se utiliza aquí, el término "inhibidor PDE IV" se refiere a los compuestos descritos en la Sección 4.3, posterior. Cuando se utiliza aquí, el término "organoide" se refiere a una agregación de uno o más tipos de células ensambladas en apariencia superficial o de estructura real como cualquier órgano o glándula del cuerpo de un mamífero, preferiblemente el cuerpo humano. Cuando se utiliza aquí, el término "célula multipotente" se refiere a una célula que tiene la capacidad de crecer en cualquier subconjunto de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de un mamífero. A diferencia de una célula pluripotente , una célula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos de células. Cuando se utiliza aquí, el término "célula pluripotente" se refiere a una célula que tiene una versatilidad completa de diferenciación, es decir, la capacidad de crecer en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de un mamífero. Una célula pluripotente se puede auto-renovar, y puede permanecer inactiva o inmóvil dentro de un tejido. A diferencia de una célula totipotente (por ejemplo, una célula de un huevo diploide, fertilizado) , una célula madre embrionaria usualmente no puede formar un nuevo blastocisto. Cuando se utiliza aquí, el término "célula progenitora" se refiere a una célula que está consignada para diferenciarse en un tipo específico de célula o para formar un tipo específico de tejido. Cuando se utiliza aquí, el término "célula madre" se refiere a una célula maestra que se puede reproducir indefinidamente para formar las células especializadas de tejidos y órganos. Una célula madre es una célula desarrolladamente pluripotente o multipotente . Una célula madre se puede dividir para producir dos células madre hijas, o una célula madre hija y una célula progenitora (de "tránsito"), que luego prolifera en las células completamente formadas, maduras, del tejido. Cuando se utiliza aquí, el término "célula totipotente" se refiere a una célula que es capaz de formar un embrión completo (por ejemplo, un blastocisto) . 4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento inesperado de que la exposición de células madre o células progenitoras a los compuestos de la invención, da como resultado un medio regulable para controlar la diferenciación de las células madre o progenitoras en poblaciones específicas de células progenitoras o la diferenciación de células progenitoras en tipos específicos de células, tales como células dendríticas, granulocitos , células endoteliales o células neurales . En particular, la exposición de las células madre o progenitoras a los compuestos de la invención, da como resultado la diferenciación regulable y la expansión de poblaciones específicas de células hematopoyéticas , que incluyen las células CD34+, CD38+ y CD133+. Tal regulación de la diferenciación se logra sin una pérdida significativa del rendimiento debido a que la muerte de las células o la diferenciación con respecto los tipos de células no deseadas o linajes celulares, en otras palabras, los compuestos de la invención no provocan la apoptosis de una o más poblaciones de células. Además, la exposición de células progenitoras a los compuestos de la invención, da como resultado la diferenciación regulable y la expansión de tipos específicos de células. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células madre de humanos, específicamente la célula progenitora hematopoyética CD34+, y la diferenciación de la célula progenitora CD133+. En particular, la presente invención proporciona métodos que emplean pequeñas moléculas orgánicas que inhiben la actividad PDE IV para modular la diferenciación de las poblaciones de células progenitoras junto con los linajes específicos de células y tejidos. Además, la invención abarca métodos para expandir células progenitoras tempranas, tales como CD133+ ó CD34+ de humanos, particularmente células CD34+CD38", para su transplante en mamíferos, aves y reptiles, que comprende exponer las células progenitoras hematopoyéticas a un inhibidor o antagonista PDE IV, en donde el inhibidor o antagonista es una pequeña molécula. La invención también proporciona métodos para producir otros tipos de células de estas células progenitoras tempranas, que incluyen, pero no están limitadas, células del cerebro, riñon, tracto intestinal y músculos. Los compuestos de la invención también actúan para suprimir la diferenciación de las células dendríticas, y para promover la diferenciación de las células granulocíticas , a partir de las células progenitoras tempranas, tales como las células progenitoras CD34+ de humanos. Los ejemplos de los compuestos de moléculas pequeñas que se pueden utilizar en relación con la invención, incluyen, pero no están limitados a, compuestos que inhiben la actividad PDE IV. Los compuestos que se pueden utilizar en los métodos de la invención se describen con detalle en la Sección 4.3. En modalidades particularmente preferidas, los compuestos son SelCIDs™ (Celgene) .

Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de una célula madre o progenitora en un linaje específico de células, que incluyen, pero que no están limitados a, un linaje mesenquimal, hematopoyético, adipogénico, hepatogénico, neurogénico, gliogénico, condrogénico, vasogénico, miogénico, condrogénico , u osteogénico que comprende incubar la célula madre o progenitora con un compuesto de la invención, preferiblemente in vi tro, durante un periodo suficiente de tiempo para dar como resultado la diferenciación de la célula en una célula de un linaje deseado de células. En una modalidad específica, se modula la diferenciación de una célula madre o progenitora en una célula del linaje hematopoyético. En particular, los métodos de la invención se pueden utilizar para modular la generación de una generación de colonias de células en la sangre a partir de células progenitoras hematopoyéticas CD34+, CD133+ y CD45+ de una manera sensible a la dosis. Los métodos de la invención también abarcan la regulación de la diferenciación de una célula progenitora CD34+ en células dendríticas que comprende incubar la célula progenitora con un compuesto de la invención, preferiblemente in vi tro, durante un periodo de tiempo suficiente para dar como resultado la diferenciación de la célula en una célula de un linaje deseado de células. En una modalidad específica, se modula la diferenciación de tal célula progenitora en una célula del linaje de células dendríticas a través del contacto de dicha célula con un inhibidor PDE IV, particularmente un SelCID™, o un análogo o profármaco de tal inhibidor o SelCID™. En otra modalidad específica, se modula la diferenciación de una célula progenitora CD34+ para suprimir la diferenciación junto con un linaje mieloide y para estimular la diferenciación junto con un linaje granulocítico . En una modalidad más específica, se modula la diferenciación de una célula progenitora CD34+ en una célula de un linaje de células granulocíticas mediante un método que comprende poner en contacto una célula progenitora CD34+ con un compuesto de la invención en el primer día se cultivan dichas células progenitoras . Se puede utilizar cualquier célula madre o progenitora de mamífero de acuerdo con los métodos de la invención, que incluye pero no está limitado a, células madre aisladas de la sangre del cordón umbilical (células "CB"), placenta y otras fuentes. Las células madre pueden incluir células pluripotentes, es decir, células que tengan una versatilidad completa de diferenciación, que se auto-renuevan, y que pueden permanecer inactivas o inmóviles dentro del tejido. Las células madre también pueden incluir células multipotentes o células progenitoras consignadas. En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son viables e inmóviles, las células madre pluripotentes que existen dentro de la placenta de término completo se pueden recuperar después de un nacimiento exitoso y de la expulsión, desangramiento y perfusión de la placenta, dando como resultado la recuperación de células madre multipotentes y pluripotentes. En otra modalidad preferida, las células progenitoras son células progenitoras tempranas, particularmente células CD34'1" ó CD133+ . Preferiblemente, las células progenitoras CD34+ ó CD133+ se derivan de la médula ósea, placenta, o sangre de cordón umbilical de humanos. También se pueden utilizar equivalentes de estas células de otros mamíferos . En los ratones, por ejemplo, se pueden utilizar células progenitoras Sca+ en los métodos de la invención. También se pueden utilizar células progenitoras tempranas equivalentes de aves o reptiles . En una modalidad particular de la invención, las células endógenas a la placenta, o producidas por una placenta perfusionada post-parto, que incluyen, pero que no están limitadas a, células madre similares a las embrionarias, células progenitoras, células pluripotentes y células multipotentes , se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse mientras que se cultivan en una placenta aislada y perfusionada. Las células endógenas propagadas en la placenta perfusionada post-parto se pueden recolectar, y/o recuperar las moléculas bioactivas del perfusado, medio de cultivo o de las células mismas de la placenta . En otra modalidad de la invención, se exponen las células madre o progenitoras que se derivan de fuentes que no sean de la placenta post-parto, a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse mientras que se cultivan in vi tro. Por consiguiente, la invención abarca métodos para diferenciar las células madre de mamíferos en células progenitoras especificas que comprenden diferenciar las células madre bajo condiciones y/o medio adecuado para la diferenciación deseada y en la presencia de un compuesto de la invención . Además, la invención abarca métodos para modular o regular la diferenciación de una población de una célula progenitora específica en tipos específicos de células que comprenden diferenciar dicha célula progenitora bajo condiciones adecuadas para dicha diferenciación y en la presencia de uno o más de los compuestos de la invención. En forma alternativa, la célula madre o progenitora se puede exponer a un compuesto de la invención y subsecuentemente diferenciar utilizando condiciones adecuadas. Los ejemplos de condiciones adecuadas incluyen formulaciones de medios de nutrientes suplementados con suero humano y matrices de cultivo celular, tales como MATRIGEL* suplementado con factores de crecimiento. El método de la invención también contempla que se puedan producir diferentes poblaciones de células poniendo en contacto la(s) célula(s) progenitora (s) con un compuesto de la invención en diferentes momentos durante el cultivo, ya sea en la etapa de proliferación o diferenciación. Ver la Sección 4.4, particularmente la Sección 4.4.2, posterior. En una modalidad específica, la presente invención proporciona métodos que emplean moléculas pequeñas, particularmente inhibidores PDE IV, preferiblemente SelCIDs o profármacos de los mismos, para modular y regular la hematopoyesis en el contexto del acondicionamiento para el pre-transplante de los progenitores hematopoyéticos . La presente invención también proporciona métodos que emplean las moléculas pequeñas de la invención para modular y regular la hematopoyesis en el contexto del acondicionamiento ex vivo de los progenitores hematopoyétieos . Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre o progenitoras in vitro, que comprende incubar las células madre o progenitoras con el compuesto in vitro, después del transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto.

La invención también abarca el control o regulación de células madre o progenitoras in vivo mediante la administración tanto de una célula madre o progenitora y un compuesto de la invención a un paciente en necesidad del mismo . La invención además abarca el transplante de células madre o progenitoras pretratadas para tratar o prevenir un padecimiento. En una modalidad, también se administra un compuesto de la invención antes, durante y/o después del transplante a un paciente en necesidad de un transplante. En otra modalidad, también se administran células madre o progenitoras no tratadas a un paciente en necesidad del transplante, por ejemplo, células de la sangre del cordón umbilical, células de la sangre de un adulto, células de sangre periférica, o células de médula ósea. En otra modalidad, los métodos de la invención incluyen la administración de los compuestos a un sujeto que es el receptor de células madre o progenitoras no acondicionadas o células progenitoras con el propósito de suscitar un efecto modulador en las células madre que ya se han transplantado. En ciertas modalidades, la invención abarca el transplante de médula ósea que comprende transplantar sangre del cordón umbilical (o células madre obtenidas de la sangre del cordón umbilical) , sangre periférica (es decir, de adulto) (o células madre de sangre periférica) , en donde dicha sangre del cordón umbilical o células madre se han pretratado con un compuesto de la invención. Además, la invención abarca el uso de células blancas de la sangre o glóbulos blancos elaboradas a partir de células progenitoras hematopoyéticas que se han diferenciado en la presencia de un compuestos de la invención. Por ejemplo, se pueden utilizar células de glóbulos blancos producidas diferenciado el progenitor nematopoyético en el transplante o se pueden mezclar con la sangre del cordón umbilical o con células madre de la sangre del cordón umbilical antes del transplante. En otras modalidades, la invención abarca el transplante de médula ósea que comprende transplantar células progenitoras tempranas, tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+, obtenidas de acuerdo con los métodos de la invención, en donde dichas células progenitoras se han pretratado con un compuesto de la invención. En una modalidad de la invención, dichos precursores de células dendríticas son las células precursoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38"CD33~ . Además, la invención abarca el uso de células elaboradas a partir de células progenitoras CD34+ que se han diferenciado en la presencia de un compuesto de la invención. Por ejemplo, las células precursoras CD34+CD38~CD33+, las células precursoras CD34+CD38~CD33~, los granulocitos , etc., producidos mediante la diferenciación de las células progenitoras CD34* utilizando los compuestos de la invención se pueden utilizar en el transplante. Las células diferenciadas de las células CD133+, utilizando los compuestos de la invención, también se abarcan por la presente invención. La invención además abarca métodos para acondicionar las células madre después de la criopreservación y el deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la criopreservación y exposición a los crioconservadores en las células madre. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para acondicionar las células madre después de la criopreservación y el deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la exposición a los crioconservadores (por ejemplo, DMSO) en la capacidad de proliferación y migración de las células madre. 4.1. MODULACIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE Y CÉLULAS PROGENITORAS CD34+ Ó CD133+ 4.1.1. Células Madre La presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células madre de humanos. En ciertas modalidades, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre o progenitoras in vi tro, que comprenden incubar las células madre con el compuesto in vi tro, seguido por el transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En otras modalidades, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre o progenitoras in vivo, que comprende administrar los compuestos a un sujeto que es el receptor de las células madre no acondicionadas, seguido por la administración directa del compuesto al sujeto. Las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención se pueden inducir para diferenciarse junto con linajes específicos de células, que incluyen, aunque no están limitados a un linaje mesenquimal, nema opoyético, adipogénico, hepatogénico, neurogénico, gliogénico, condrogénico, vasogénico, miogénico, condrogénico, u osteogénico. En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias obtenidas de acuerdo con los métodos de la invención, se inducen para diferenciarse para su uso en el transplante y en los protocolos de tratamiento ex vivo. En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención, se inducen para diferenciarse en un tipo de célula particular y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. En una modalidad específica, las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención, se incuban con un compuesto, tal como una pequeña molécula orgánica, in vi tro, que se induce para diferenciarse, seguido por el transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, los compuestos que se utilizan para controlar o regular la diferenciación de las células madre no son polipéptidos , péptidos, proteínas, hormonas, citocinas, oligonucleótidos o ácidos nucleicos. Las células madre que se pueden utilizar de conformidad con la invención incluyen, pero no están limitadas a, células de cordón umbilical (CB) , células de placenta, células madre embrionarias (ES) , células madre similares a las embrionarias, células madre de trofoblastos , células progenitoras , células madre de médula ósea y células multipotentes, pluripotentes y totipotentes . En particular, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las poblaciones de células madre, además de las células madre mesequinales , en linajes de tejidos específicos. Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden emplear para regular la diferenciación de una célula madre multipotente en células de linaje condrogénico , vasogénico, miogénico, y osteogénico promoviendo la regeneración y reparación músculo-esquelética específica, neoangiogénesis, y la repoblación de tejidos musculares específicos, tales como el miocardio y el músculo esquelético, y la revascularización de una variedad de órganos y tejidos que incluyen, pero no están limitados al cerebro, espina dorsal, hígado, pulmón, riñon y páncreas. Los métodos de la invención se pueden emplear para regular la diferenciación de una célula madre multipotente en una célula de linaje adipogénico, condrogénico, osteogénico, neurogénico o hepatogénico . El agente utilizado para modular la diferenciación se puede introducir en la placenta perfusionada post-parto para inducir la diferenciación de las células que se cultivan en la placenta. En forma alternativa, el agente se puede utilizar para modular la diferenciación in vitro después de que las células se han recolectado o removido de la placenta. Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre progenitoras con respecto a una célula del linaje hematopoyético , que comprende incubar las células madre progenitoras con el compuesto in vitro durante un periodo suficiente de tiempo para dar como resultado la diferenciación de estas células con respecto a un linaje hematopoyético. En particular, los métodos de la invención se pueden utilizar para modular la generación de la generación de colonias de células sanguíneas de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, CD133+, y CD45+ de una manera sensible a la dosis (para la descripción de la dosificación, ver la Sección 4.7) .

Preferiblemente, los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células rojas de la sangre o glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Los métodos de la invención se pueden utilizar no solamente para regular la diferenciación de las células madre, sino que también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias, proporcionando beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción de plaquetas. En otras modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de por ejemplo, una célula precursora neuronal o neuroblasto en un tipo específico de célula neuronal tal como una neurona sensorial (por ejemplo, una célula de la retina, una célula olfativa, una neurona mecanosensorial , una neurona quimiosensorial , etc.), una neurona motora, o neurona cortical, o una interneurona . En otras modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de los tipos de células que incluyen, pero no están limitadas a, neuronas colinérgicas , neuronas dopaminérgicas , neuronas GABA-ergicas, células gliales (que incluyen oligodendrocitos , las cuales producen mielina) , y células ependimales (que alinean el sistema ventricular del cerebro) . Aún en otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células que están constituidas de órganos, que incluyen, pero que no están limitados a, células purkinje (una especie de fibra muscular) del corazón, epitelio biliar del hígado, células isleta beta del páncreas, células corticales o medulares del riñon, y células fotorreceptoras de la retina del ojo. La valoración del estado de diferenciación de las células madre obtenidas de conformidad con los métodos de la invención, se pueden identificar mediante la presencia de marcadores de superficie celular. Las células madre similares a las embrionarias de la invención, por ejemplo, se pueden distinguir por los siguientes marcadores de superficie celular: OCT-4+ y ABC-pt. Además, la invención abarca las células madre similares a las embrionarias que tienen los siguientes marcadores: CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2 , SH3 , SH4, OCT-4 y ABC-p, o que carecen de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, CD38, CD45, SSEA3 y SSEA4, como se describe aquí anteriormente. Tales marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante citometría de flujo, seguida por el lavado y teñido con un anticuerpo del marcador de superficie anti-celular . Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 ó CD38, las células se pueden lavar en PBS y luego teñirse doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . 4.1.2. Células Progenitoras Tempranas CD34+ y CD133+ La presente invención también proporciona métodos de modulación de la diferenciación de las células CD34+ ó CD133+ de humano. En ciertas modalidades, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de células madre o progenitoras in vitro, que comprenden incubar las células madre con el compuesto in vitro, seguido por el transplante de las células diferenciadas a un sujeto. Las células progenitoras obtenidas mediante los métodos de la invención, se pueden inducir para diferenciarse a lo largo de linajes específicos de células, que incluyen, pero no están limitados a, células progenitoras CD34+, un linaje mieloide o granulocítico, y para las células CD133+, un linaje de células neurales o endoteliales . En ciertas modalidades, las células progenitoras se inducen para diferenciarse para su uso en un transplante y protocolos de tratamiento ex vivo. En ciertas modalidades, las células progenitoras se inducen para diferenciarse en un tipo particular de célula y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético, terapéutico. En una modalidad específica, las células progenitoras se incuban con un compuesto, tal como una pequeña molécula orgánica, in vi tro, que induce la misma a diferenciarse, seguido por el transplante de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, los compuestos que se utilizan para controlar o regular la diferenciación de las células madre no son polipéptidos , péptidos, proteínas, hormonas, citocinas, oligonucleótidos o ácidos nucleicos. En otra modalidad preferida, se provoca que la célula progenitora se diferencie en una célula progenitora CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38"CD33" . Preferiblemente, los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Los métodos de la invención se pueden utilizar no solamente para regular la diferenciación de las células madre, sino que también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias, proporcionando beneficios significativos al transplante de las células madre hematopoyé icas mejorando la rapidez del injerto de la médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción de plaquetas . En otras modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células CDla+, particularmente las células CD86+CDla+. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir o prevenir la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células CD14+CDla- . Las células CD14+CDla- son una célula dendrítica dérmica o células progenitoras de monolitos/macrófagos . En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir la expresión en la proliferación de células progenitoras CD34+ de moléculas co-estimuladoras CD80 y CD86. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir la diferenciación de la proliferación de las células progenitoras CD34+ en células CD34brill nte, y para estimular la diferenciación en células CD34opaco. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para incrementar el número de células CD133+, las cuales son células progenitoras de una célula endotelial. Aún en otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para disminuir la diferenciación de la proliferación de las células CD34+ en células CDllc-CD15+, y para incrementar la diferenciación en las células CDllc+CD15-, cambiando así la diferenciación de un linaje mieloide de células dendríticas a un linaje granulocítico . La valoración del estado de diferenciación de las células madre obtenidas de conformidad con los métodos de la invención, se pueden identificar mediante la presencia de los marcadores de superficie celular. Las células progenitoras de la invención, por ejemplo, se pueden distinguir mediante los marcadores de superficie celular CD34+ ó CD133+. Además, la invención abarca la proliferación de células progenitoras que poseen, o muestra una expresión incrementada con relación a un control, de uno o más de los siguientes marcadores: CD15, CD34, CD33, CD133 ó CD54opaco, como se describe aquí anteriormente. La invención abarca además la proliferación de células progenitoras que carecen, o que muestran una expresión reducida con relación a un control, de uno o más de los siguientes marcadores: HLA-DR, CDla, CDllc, CD38, CD80, CD86, CD54brillante ó CD14. En una modalidad preferida, la proliferación de las células progenitoras de la invención, exhibe CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38+CD33" . Tales marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo lavando y tiñendo con un anticuerpo de marcador de superficie anti -celular, seguida por citometría de flujo. Por ejemplo, para determinar la presencia de células CD34 ó CD38, se pueden lavar en PBS y luego teñir doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . En cierta modalidad, las células diferenciadas se pueden caracterizar, caracterizando la capacidad fagocítica de las células diferenciadas. Se pueden valorar la capacidad de diferenciar, o que diferencia, las células con respecto a la fagocitosis, por ejemplo, etiquetando dextrano con FITC y determinando la cantidad de absorción mediante métodos bien conocidos. La capacidad de diferenciar, o que diferencia, las células para que sea posible estimular las células T, se puede valorar en una reacción de leucocitos mezclados (MLR) , en la cual las células presumiblemente cargadas con antígenos se mezclan con células T, y se determina el nivel de activación de las células T. 4.1.3. Identificación y Caracterización de Células En ciertas modalidades, las células di erenciadas se pueden identificar caracterizando los genes expresados diferencialmente (por ejemplo, caracterizando un conjunto de genes de una célula (s) progenitora (s) no diferenciada (s) de interés contra un conjunto de genes de una célula diferenciada derivada de la célula progenitora) . Por ejemplo, los métodos de amplificación con ácido nucleico tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o, los métodos de amplificación basados en una trascripción (por ejemplo, trascripción in vitro (IVT) ) , se pueden utilizar para perfilar la expresión genética en diferentes poblaciones de células, por ejemplo, mediante el uso de un microarreglo de polinucleótidos . Tales métodos para perfilar la expresión genética diferencial, son bien conocidos en la técnica (ver; por ejemplo, Wieland et al., Proc. Nati. Acad: Sci . USA 87: 2720-2724 (1990; Lisitsyn et al., Science 259: 946-951 (1993); Lisitsyn et al., Meth. Enzymology 254: 291-304 (1995); Patente Norteamericana No. 5,436,142; Patente Norteamericana No. 5,501,964; Lisitsyn et al., Nature Genetics 6: 57-63 (1994); Hubank y Schatz, 1994, Nucleic Acids Research 22: 5640-5648; Zeng et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385; Patente Norteamericana No. 5,525,471; Linsley et al., Patente Norteamericana No. 6,271,002, titulada "RNA ampl ification method, " expedida el 7 de Agosto del 2001; Van Gelder et al., Patente Norteamericana No. 5,716,785, titulada "Processes for genetic manipulations using promoters," expedida el 10 de Febrero de 1998; Stoflet et al., 1988, Science 239:491-494, 1988; Sarkar y Sommer, 1989, Science 244: 331-334; Mullís et al., Patente Norteamericana No. 4,683,195; Malek et al., Patente Norteamericana No. 5,130,238; Kacian y Fultz, Patente Norteamericana No. 5,399,491; Burg et al., Patente Norteamericana No. 5,437,990; R. N Van Gelder et al. (1990), Proc. Nati. Acad. Sci . USA 87, 1663; D. J. Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol . 14, 1675; Shannon, Patente Norteamericana No. 6,132,997; Lindemann et al., Patente Norteamericana No. 6,235,503, titulada "Procedure for subtractive hybridization and difference analysis," expedida el 22 de Mayo de 2001) . Los equipos disponibles comercialmente están disponibles para el perfil genético, por ejemplo, la serie displayPROFILE™ de equipos (Qbiogene, Carlsbad, CA, la cual utiliza una metodología con base en gel para perfilar la expresión genética) . Los equipos utilizan la PCR de Despliegue Diferencial de Fragmento de Restricción (RFDD-PCR) para comparar los patrones de expresión genética en las células eucarióticas . También se puede utilizar un Equipo de Substracción Selecta de PCR (Clontech) y un Equipo de Selección Diferencial de Selección PCR (Clontech) , el cual permita la identificación de clones expresados diferencialmente en una biblioteca o genoteca substraída. Después de generar conjuntos de genes expresados diferencialmente con el equipo de Substracción de Selección con PCR, se utiliza el equipo de Selección Diferencial de Selección con PCR. La biblioteca substraída se hibridiza con sondas sintetizadas directamente del analizador y poblaciones de accionamiento, una sonda hecha del ADNc substraído, y una sonda hecha del ADNc substraído inverso (una segunda substracción realizada a la inversa) . Los clones que se hibridizan para las sondas analizadoras pero no para las sondas accionadoras se expresan diferencialmente ; sin embargo, las sondas no sustraídas no son lo suficientemente sensibles para detectar mensajes extraños. Las sondas substraídas enriquecen en gran medida los ADNcs expresados diferencialmente, aunque pueden dar resultados positivos falsos. Utilizando sondas tanto substraídas como no substraídas de conformidad con las instrucciones del fabricante (Clontech) se identifican los genes expresados diferencialmente . En otra modalidad, las células madre o progenitoras diferenciadas se identifican y caracterizan mediante un ensayo de la unidad formadora de colonias, el cual es comúnmente conocido en la técnica, tal como un medio Mesen Cult™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia). La determinación de que una célula madre o progenitora se ha diferenciado en un tipo particular de célula, se puede lograr mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de superficie celular utilizando técnicas tales como la citometría de flujo o inmunocitoquímica (por ejemplo, células de teñido con anticuerpos específicos de marcadores celulares o de tejidos específicos), mediante el examen de la morfología de las células utilizando microscopía de luz o confocal , o midiendo los cambios en la expresión genética utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, tal como el PCR y el perfil de expresión genética. 4.2. POBLACIONES DE CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS La presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células madre de humanos. Cualquier célula madre de mamífero se puede utilizar dentro de los métodos de la invención, que incluye, pero no están limitados a, células madre aisladas de la sangre del cordón umbilical (células CB) , sangre periférica, sangre de adulto, médula ósea, placenta, células madre mesenquimales y otras fuentes. En una modalidad no preferida, las células madre son células madre embrionarias ó células que se han aislado de fuentes diferentes de la placenta. Las fuentes de células madre mesenquimales incluyen la médula ósea, saco vitelino embrionario, placenta, cordón umbilical, piel fetal y adolescente, y sangre. Se pueden obtener células de médula ósea, por ejemplo, de cresta iliaca, fémur, tibia, espina, costilla u otros espacios medulares. Las células madre que se utilizan de conformidad con los métodos de la presente invención, pueden incluir células pluripotentes , es decir, células que tengan una versatilidad completa de diferenciación, que son auto-renovables, y que puedan permanecer letárgicas o inmóviles dentro del tejido. Las células madre también pueden incluir células multipotentes , células progenitoras consignadas, y células de fibroblastoides . En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son viables, letárgicas, células madre pluripotentes aisladas de una placenta de término completo, perfusionada, desangrada. Las poblaciones de células madre pueden consistir de células madre de placenta obtenidas a través de un servicio comercial, por ejemplo LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ) , ViaCord (Boston MA) , Cord Blood Regístry (San Bruno, CA) y Cryocell (Clearwater, FL) . Las poblaciones de células madre también pueden consistir de células madre de placenta, recolectadas de conformidad con los métodos descritos en la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20020123141, publicada el 5 de Septiembre del 2002, titulada "Method of Collecting Placental Stem Cells" y la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20030032179, publicada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom" (ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia en sus totalidades) .

En una modalidad, se pueden utilizar células madre de sangre de cordón umbilical. La primera recolección de sangre de la placenta se menciona como sangre del cordón umbilical, la cual contiene predominantemente células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y CD38+. Dentro de las primeras veinticuatro horas de la perfusión posparto, se pueden aislar altas concentraciones de células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD38" de la placenta. Después de alrededor de veinticuatro horas de la perfusión, se pueden aislar altas concentraciones de células CD34~CD38~ de la placenta junto con las células antes mencionadas. La placenta perfusionada aislada de la invención proporciona una fuente de grandes cantidades de células madre enriquecidas para las células madre CD34+CD38" y células madre CD34"CD38+: La placenta aislada que se ha perfusionado durante veinticuatro horas o más, proporciona una fuente de grandes cantidades de células madre enriquecidas para las células madre CD34" y CD38". Las células preferidas que se pueden utilizar de conformidad con la presente invención, son células madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta perfusionada desangrada, o células que se derivan de células madre de placenta similares a las embrionarias. Las células madre similares a las embrionarias de la invención se pueden caracterizar midiendo los cambios en la morfología y en los marcadores de superficie celular utilizando técnicas tales como citometría de flujo e inmunocitoquímica, y midiendo los cambios en la expresión genética utilizando técnicas, tales como PCR. En una modalidad de la invención, tales células madre similares a las embrionarias se pueden caracterizar por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2 , SH3 , SH4 , OCT-4 y ABC-p, ó la ausencia de los siguientes los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, CD38, CD45, SSEA3 y SSEA4. En una modalidad preferida, tales células madre similares a las embrionarias se pueden caracterizar por la presencia de marcadores de superficie celular OCT-4 y APC-p. Tales marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante citometría de flujo, seguido por el lavado y teñido con un anticuerpo de marcador de superficie anti-celular . Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 ó CD38, se pueden lavar las células en PBS y luego se tiñen doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) .

Las células madre similares a las embrionarias que se originan de la placenta tienen características de células madre embrionarias aunque no se deriven del embrión. En otras palabras, la invención abarca el uso de células OCT-4+ y ABC-p+ que son células madre no diferenciadas que se aislan de una placenta perfusionada post -parto. Tales células son tan versátiles (por ejemplo, pluripotentes) como las células madre embrionarias de humanos. Como se mencionó anteriormente, se puede aislar un cierto número de diferentes células madre pluripotentes o multipotentes de la placenta perfusionada en diferentes puntos de tiempo, por ejemplo, células hematopoyéticas CD34+ CD38+, CD34+ CD38-, y CD34-CD38-. De conformidad con los métodos de la invención, se utiliza la placenta humana posterior al nacimiento como la fuente de células madre similares a las embrionarias. Por ejemplo, después de la expulsión del útero, la placenta se desangra tan rápido como sea posible para prevenir o minimizar la apoptosis. Subsecuentemente, tan pronto como sea posible después del desangramiento la placenta se perfusiona para remover la sangre, células residuales, proteínas, factores, y cualquier otro materia presente en el órgano . También se pueden Los desechos de materiales remover de la placenta. La perfusión normalmente se continúa con un perfusado apropiado durante al menos dos o más de las veinticuatro horas. En varias modalidades adicionales la placenta se perfusiona durante al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, y 22 horas. En otras palabras, esta invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de que las células de una placenta post-parto, se pueden activar mediante el desangramiento y perfusión durante una cantidad suficiente de tiempo. Por lo tanto, la placenta se puede utilizar rápidamente como una fuente rica y abundante de células madre similares a las embrionarias, cuyas células se pueden utilizar para la investigación, incluyendo el descubrimiento de fármacos, el tratamiento y la prevención de padecimientos, en particular cirugías o terapias de transplante, y la generación de células consignadas, tejidos y organoides . Ver la Solicitud co-pendiente No. de Serie 10/004,942, presentada el 5 de Diciembre del 2001 titulada "Method of Collecting Placental Stem Cells" y la Solicitud No. de Serie 10/076,180, presentada el 13 de Febrero del 2002, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom," ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia en sus totalidades . Las células madre similares a las embrionarias se extraen de una placenta drenada por medio de una técnica de perfusión que utiliza ya sea una o ambas de las arterias umbilicales y la vena umbilical. La placenta preferiblemente se drena mediante el desangramiento y la recolección de sangre residual (por ejemplo, sangre del cordón umbilical residual) . La placenta drenada se procesa entonces de tal manera que para establecer un ambiente de bioreactor natural, ex vivo, en el cual las células madre similares a las embrionarias residentes se reclutan dentro de la parénquima y el espacio extravascular . Las células madre similares a las embrionarias migran a la microcirculación vacía, drenada, en donde, de conformidad con los métodos de la invención, los mismos se recolectan, preferiblemente lavándolos en un recipiente recolector mediante perfusión. La modulación de las células progenitoras CD34+ y CD133+ en las células mieloides, particularmente las células dendríticas o granulocíticas , está contemplada específicamente como parte de la invención. Reportes recientes indican que tales células son pluripotentes , por consiguiente, la invención también contempla la modulación del desarrollo de estos progenitores en células del cerebro, riñon, tracto intestinal, hígado o músculos. Se puede utilizar cualquier célula madre o progenitora CD34+ ó CD133+ de mamífero, ave o reptil, dentro de los métodos de la invención, que incluyen, pero no están limitados a, células madre aisladas de sangre de cordón umbilical (células CB) , sangre periférica, sangre de adulto, médula ósea, placenta, incluyendo la placenta perfusionada (ver la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20030032179 presentada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom, " la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad), células madre mesenquimales y otras fuentes. En una modalidad preferida, las células madre son células madre hematopoyéticas o células que se han aislado de la médula ósea. Tales células se pueden obtener de otros órganos o tejidos, aunque tales fuentes son menos preferidas. En una modalidad, se pueden utilizar células progenitoras de sangre de cordón umbilical o de la placenta post -parto. Como se observa aquí, la sangre de cordón umbilical contiene predominantemente células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y CD38+. Dentro de las primeras veinticuatro horas de la perfusión post-parto, se pueden aislar altas concentraciones de células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD38- de una placenta perfusionada, aislada. Después de aproximadamente veinticuatro horas de la perfusión post-parto, se pueden aislar altas concentraciones de células CD34-CD38- de la placenta junto con las células antes mencionadas. En otra modalidad, se pueden obtener poblaciones de células progenitoras a través de un servicio comercial, por ejemplo LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ) , ViaCord (Boston MA) , Cord Blood Registry (San Bruno, CA) y Cryocell (Clearwater, FL) . 4.3. LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN Los compuestos utilizados en la invención incluyen fármacos inhibidores de la citocina selectiva, enriquecidos estereoméricamente o estereoméricamente puros, compuestos estereomericamente o enantioméricamente puros que tienen actividades selectivas, inhibidoras de la citocina, y sales solvatos, hidratos, estereoisómeros , clatratos, aceptables farmacéuticamente, y profármacos de los mismos. Los compuestos preferidos utilizados en la invención son Fármacos Inhibidores Selectivos de la Citocina (Selective Cytokine Inhibitory Drugs (SelCIDs™) ) de Celgene Corporation. Cuando se utiliza aquí y a menos que se indique de otra manera, el término "SelCIDs™" utilizado en la invención, abarca fármacos de moléculas pequeñas, por ejemplo, pequeñas moléculas orgánicas, los cuales no son péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, oligosacáridos u otras macromoléculas . Los compuestos preferidos inhiben la producción de TNF-cx. Además, los compuestos también pueden tener un efecto inhibidor modesto en el IL1 e IL12 inducidos con LPS. Más preferiblemente, los compuestos de la invención son potentes inhibidores de PDE4. El PDE4 es una de las principales isoenzimas de fosfodiesterasa encontradas en las células delinaje mieloide y linfoide de humanos. La enzima juega una parte crucial en la regulación de la actividad celular degradando el segundo mensajero omnipresente cAMP y manteniéndolo a niveles intracelulares bajos. Sin que se límite por la teoría, la inhibición de la actividad PDE4 en niveles de cAMP incrementados que llevan a la modulación de las citocinas inducidas con LPS, incluyendo la inhibición de la producción de TNF- en los monocitos así como también en los linfocitos. Los ejemplos específicos de fármacos inhibidores selectivos de la citocina incluyen, pero no están limitados a, las imidas cíclicas descritas en la Patente Norteamericana No. 5,605,914; las amidas de cicloalquilo y los nitrilos de cicloalquilo de las Patentes Norteamericanas Nos. 5,728,844 y 5,728,845, respectivamente, las amidas de arilo (por ejemplo, una modalidad es N-benzoil-3 -amino-3- (3 ' , 4 ' -dimetoxifenil ) -propanamida) de las Patentes Norteamericanas Nos. 5,801,195 y 5,736, 570; los éteres y alcoholes de imida/amida (por ejemplo 3-ftalimido-3- (3 ', 4 ' -dimetoxifenil) propan-l-ol) descritos en la Patente Norteamericana No. 5,703,098; las succinimidas y maleimidas (por ejemplo 3 - (3 ' , 4 ' , 5 ' 6 ' -petrahidroftalimdo) -3 - (3" , 4" -dimetoxifenil ) ropionato de metilo) descrito en la Patente Norteamericana No. 5,658,940; ácidos alcanohidroxámicos substituidos con imido y amido descritos en WO 99/06041 y fenetilsulfonas substituidas descritas en la Patente Norteamericana No. 6,020,358; y amidas de arilo tales como N-benzoil -3 -amino-3 - (3 , 4 ' -dimetoxifenil) propanamida como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,046,221. La totalidad de cada una de las patentes y solicitudes de patente identificadas aquí se incorpora en la misma como referencia. Los fármacos adicionales, inhibidores selectivos de la citocina, pertenecen a una familia de compuestos químicos sintetizados cuyas modalidades típicas incluyen 3- (1,3-dioxobenzo- [f] isoindol-2-il ) -3- (3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil) propionamida y 3- (1, 3-dioxo-4-azaisoindol-2-il ) -3-(3, -dimetoxifenil ) -propionamida. Otros fármacos específicos, inhibidores selectivos de la citocina, pertenecen a una clase de amidas cíclicas no-polipeptídicas descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,698,579 y 5,877,200 ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia. Las amidas cíclicas representativas incluyen los compuestos de la fórmula: en donde n tiene un valor de 1, 2, ó 3; R5 es o-fenileno, sustituido o no sustituido con 1 a 4 sustituyentes cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi, carbopropoxi, acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, acilamino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, y halo; R7 es (i) fenilo o fenilo sustituido con uno o más sustituyentes cada uno seleccionado independientemente de otro de los grupos que consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi, carbopropoxi, acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, amino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, y halo, (ii) bencilo sustituido o no sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi, carbopropoxi, acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, amino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, y halo, (iii) naftilo, y (iv) benciloxi; R12 es -OH; alcoxi de 1 a 12 átomos de carbono; o —N SR9 R8 es hidrógeno o alquilo de 1 a 10 átomos de carbono; y R9 es hidrógeno, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, -COR10, ó -S02R10, en donde R10 es hidrógeno, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, o fenilo. Los compuestos específicos de esta clase incluyen, pero no están limitados a: ácido 3-fenil-2- (l-oxoisoindolin-2-il) propiónico; 3-fenil-2- ( l-oxoisoindolin-2 -il ) propionamida; ácido 3-fenil-3- (l-oxoisoindolin-2-il) propiónico; 3-fenil-3 - ( 1-oxoisoindolin-2 -il ) ropionamida ; ácido 3- (4-metoxifenil) -3- (1-oxisoindolin-il) propiónico; 3- (4 -metoxifenil) -3- (1-oxisoindolin-il) propionamida; ácido 3- (3 , 4-dimetoxifenil) -3- (l-oxisoindolin-2-il) propiónico; 3- (3 , 4-dimetoxi-fenil) -3- (1-oxo-l, 3-dihidroisoindol-2-il) -pro ionamida ; 3 - (3 , 4-dimetoxifenil ) -3 - (l-oxisoindolin-2 - il) propionamida ; ácido 3 - (3 , 4 -dietoxifenil ) -3 - (1 -oxoisoindolin-i1 ) propiónico; 3- (l-oxoisoindolin-2-il) -3- (3-etoxi-4-metoxifenil) propionato de metilo; ácido 3- (l-oxoisoindolin-2-il) -3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -propiónico; ácido 3- (l-oxoisoindolin-2-il) -3- (3 -propoxi -4 -metoxifenil ) -propiónico; ácido 3- (l-oxoisoindolin-2-il) -3- (3-butoxi-4-metoxifenil ) propiónico; 3- (l-oxoisoindolin-2-il) -3- (3-propoxi-4-metoxifenil) -propionamida ; 3- (1-oxoisoindolin-2-il) -3- (3-butoxi -4 -metoxifenil) -pro ionamida ; 3- ( l-oxoisoindolin-2-il ) -3- ( 3-butoxi-4 -metoxifenil ) propionato de metilo; y 3- ( l-oxoisoindolin-2-il) -3- ( 3-propoxi-4-metoxifenil) -propionato de metilo. Otros fármacos específicos, inhibidores selectivos de la citocina, incluyen los ácidos alcanohidroxámicos substituidos con imido y amido descritos en O 99/06041, la cual se incorpora aquí como referencia. Los ejemplos de cada compuesto incluyen, pero no están limitados a: en donde cada uno de R1 y R2, cuando se toman independientemente entre sí, es hidrógeno, alquilo inferior, ó R1 y R2, cuando se toman conjuntamente con los átomos de carbono representados a los cuales cada uno se une, es o-fenileno, o-naftileno, o ciclohexen-1 , 2-diilo, sustituido o no sustituido con 1 a 4 sustituyentes cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi, carbopropoxi , acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, acilamino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, y halo, 3 es fenilo sustituido con uno a cuatro sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi , carbopropoxi , acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi , amino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 10 átomos de carbono, benciloxi, cicloalcoxi de 3 a 6 átomos de carbono, cicloalquilidenmetilo C4-C3, alquilidenmetilo C3-Ci0, indaniloxi, y halo; R4 es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, fenilo, o bencilo; R4' es hidrógeno o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R5 es -C¾-, -CH2-CO-, -SO2-, -S-, ó -NHCO-; n tiene un valor de 0 , 1, ó 2 ; y las sales de adición ácida de dichos compuestos las cuales contienen un átomo de nitrógeno capaz de ser protonado.

Los fármacos adicionales, inhibidores selectivos de la citocina, utilizados en la invención incluyen, pero no están limitados a: 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- (1-oxoisoindolinil) -propionamida ; 3- (3 -etoxi-4 -metoxifenil ) -N-metoxi-3- (1-oxoisoindolinil) -propionamida ; N-benciloxi-3 - (3 -etoxi-4 -metoxifenil ) -3 -ftalimidopropionamida; N-benciloxi -3 - (3 -etoxi-4 -metoxifenil ) -3- (3 -nitroftalimido) -propionamida ; N-benciloxi -3 - (3 -etoxi-4 -metoxifenil ) -3- (1-oxoisoindolinil) -propionamida; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- ftalimidopropionamida; N-hidroxi-3- (3 , 4 -dimetoxifenil) -3-ftalimidopropionamida; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- (3 -nitroftalimido) -propionamida ; N-hidroxi-3- (3 , 4 -dimetoxifenil) -3- (1-oxoisoindolinil) -propionamida ; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- (4-metil-ftalimido) propionamida ; 3- (3 -ciclopentiloxi-4 -metoxifenil) -N-hidroxi-3 -ftalimidopropionamida; 3 - (3 -etoxi-4 -metoxifenil ) -N-hidroxi-3 - (1,3 -dioxo-2 , 3 -dihidro- ??-benzo [f] isoindol-2-il) propionamida ; N-hidroxi-3- {3- (2-propoxi) -4 -metoxifenil } -3-ftalimidopropionamida; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -3- (3 , 6-difluoroftalimido) -N-hidroxipropionamida; 3- (4 -aminoftalimido) -3- (3 -etoxi-4 -metoxifenil ) -N-hidroxipropionamida ; 3- (3-aminoftalimido) -3- ( 3-etoxi-4-metoxifenil ) -N- hidroxipropionamida ; N-hidroxi-3- (3, 4-dimetoxifenil) -3- ( 1-oxoisoindolinil ) - propionamida ; 3- (3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- ( 1- oxoisoindolinil) propionamida; y N-benciloxi-3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -3- ( 3-nitroftalimido) - propionamida . Los fármacos adicionales, inhibidores selectivos de la citocina, utilizados en la invención incluyen las fenetilsulfonas sustituidas, sustituidas en el grupo fenilo con un grupo oxoisoindina . Los ejemplos de tales compuestos, incluyen, pero no están limitados a, aquéllos descritos en la Patente Norteamericana No. 6,020,358, que se incorpora aquí, la cual incluye lo siguiente: en donde el átomo de carbono designado * constituye un centro de quiralidad; Y es C=0, CH2, S02, ó CH2C=0; cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los otros, es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, nitro, ciano, hidroxi, ó -NR8R9,- o dos de cualquiera de R1, R2, R3, y R4 en átomos de carbono adyacentes, conjuntamente con el anillo de fenileno representado son naftilideno cada uno de R5 y R6, independientemente del otro, es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, ciano, o cicloalcoxi de hasta 18 átomos de carbono; R7 es hidroxi, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, bencilo, ó NR8'R9' ; cada uno de R8 y R9 tomados independientemente del otro es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos, fenilo, o bencilo, o uno de R8 y R9 es hidrógeno y el otro es -COR10 ó -S02R10, o R8 y R9 tomados conjuntamente son tetrametileno, pentametileno , hexametileno, ó -CH2CH2X1CH2CH2- en el cual X1 es -O-, -S- ó -NH-; y cada uno de R8' y R9' tomados independientemente del otro es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos, fenilo, o bencilo, o uno de R8' y R9' es hidrógeno y el otro es -COR10 ó -S02R10, ó R8' y R9' tomados conjuntamente son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, ó -CH2CH2X2CH2CH2- en el cual X2 es -O-, -S- ó -NH- .

Se apreciará que aunque por conveniencia los compuestos anteriores se identifican como fenetilsulfonas , las mismas incluyen sulfonamidas cuando R7 es NR8'R9' . Los grupos específicos de tales compuestos son aquéllos en los cuales Y es C=0 ó CH2. Un grupo específico adicional de tales compuestos son aquéllos en los cuales cada uno de R1, R2, R3, y R4 independientemente de los otros, es hidrógeno, halo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, nitro, ciano, hidroxi , ó -NR8R9 en los cuales cada uno de R8 y R9 tomados independientemente del otro es hidrógeno o metilo o uno de R8 y R9 es hidrógeno y el otro es -COCH3. Los compuestos particulares son aquellos en los cuales uno de R1, R2, R3, y R4 es -NH2 y el resto de R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno. Los compuestos particulares son aquellos en los cuales uno de R1, R2, R3, y R4 es -NHC0CH3 y el resto de R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno . Los compuestos particulares son aquéllos en los cuales uno de R1, R2, R3, y R4 es -N(CH3)2 Y el resto de R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno. Un grupo preferido adicional de tales compuestos son aquéllos en los cuales uno de R1, R2, R3, y R4 es metilo y el resto de R1, R2 , R3 y R4 son hidrógeno.

Los compuestos particulares son aquellos en los cuales uno de R1, R2 , R3, y R4 es fluoro y el resto de R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno. Los compuestos particulares son aquellos en los cuales cada uno de R5 y R6, independientemente del otro, es hidrógeno, metilo, etilo, propilo, metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentoxi , o ciclohexoxi. Los compuestos particulares son aquellos en los cuales R5 es metoxi y R6 es monocicloalcoxi , policicloalcoxi , y benzocicloalcoxi . Los compuestos particulares son aquellos en los cuales R5 es metoxi y R6 es etoxi. Los compuestos particulares son aquellos en los cuales R7 es hidroxi, metilo, etilo, fenilo, bencilo, ó NR8R9' en los cuales cada uno de R8' y R9' tomados independientemente del otro es hidrógeno o metilo. Los compuestos particulares son aquéllos en los cuales R7 es hidroxi, metilo, etilo, fenilo, bencilo, ó NR8R9' en los cuales cada uno de R8' y R9' tomados independientemente del otro es hidrógeno o metilo. Los compuestos particulares son aquellos en los cuales R7 es metilo.

Los compuestos particulares son aquellos en los cuales R7 es NR8'R9' en los cuales cada uno de R8' y R9' tomados independientemente del otro es hidrógeno o metilo. Otros fármacos específicos, inhibidores selectivos de la citocina, incluyen compuestos de 1 , 3-dihidro-isoindolilo sustituidos con fluoroalcoxi encontrados en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/436,975 de G. Muller et al., presentada el 30 de Diciembre del 2002, la cual se incorpora aquí en su totalidad como referencia. Los compuestos de 1 , 3-dihidro-isoindolilo sustituidos con fluoroalcoxi incluyen los compuestos de la fórmula: en donde: Y es -C(0)-, -CH2, -CH2C(0)-, -C(0)CH2-, ó S02; Z es -H, -C(0)R3, -(alquilo C0-i ) -S02- ( alquilo Ci_4), -alquilo Ci-8, -CH2OH, CH2(0) (alquilo Ci-g) o -CN; R1 y R2 son cada uno independientemente -CHF2, -alquilo Ci-8 , -cicloalquilo C3-i8, ó -(alquilo Ci-i0) (cicloalquilo C3-18) , y al menos uno de Rx y R2 es CHF2; R3 es -NR4R5, -alquilo, -OH, -O-alquilo, fenilo, bencilo, fenilo sustituido, o bencilo sustituido; R4 y R5 son cada uno independientemente -H, -alquilo Ci-8, -OH, -OC(0)R6; R6 es alquilo Ci-8, amino (alquilo Ci_8) , -fenilo, -bencilo, o-arilo; Xi, X2, X3, y 4 son cada uno independientemente -H, -halógeno, -nitro, -NH2, -CF3 / -alquilo Ci-6, - (alquilo C0-4) -(cicloalquilo C3-6) , (alquilo C0-4) -NR7R8, (alquilo C0-4) -N (H) C (O) - (R8) , (alquilo C0-4) -N (H) C (0) N (R7R8) , (alquilo C0-*) -N(H) C(0)0(R7R8) , (alquilo C0-4) -OR8, (alquilo C0-4 ) - imidazolilo , (alquilo C0_4) -pirrolilo, (alquilo C0-4) -oxadiazolilo , ó (alquilo C0-4) -triazolilo, o dos de Xi, X2 , X3, y X4 se pueden unir conjuntamente para formar un anillo de cicloalquilo o heterocicloalquilo, (por ejemplo, Xi y X2, X2 y X3, X3 y X4, Xi y X3, X2 y X4 / ó Xi y X4 pueden formar un anillo con 3, 4, 5, 6, 6 7 miembros los cuales pueden ser aromáticos, formando así un sistema bicíclico con el anillo de isoindolilo) ; y R7 y R8 son cada uno independientemente H, alquilo Ci-9, cicloalquilo C3-6, (alquilo Ci-6) - (cicloalquilo C3_6) , (alquilo Ci-6) -N(R7R8) , (alquilo d-6) -OR8, fenilo, bencilo, o arilo; o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, clatrato aceptables farmacéuticamente, o profármacos de los mismos. Los compuestos preferidos incluyen, pero no limitados a: Ácido 3 - (4 -acetilamino-1 , 3-dioxo-l , 3 -dihidro- isoindol -2 -il) -3- (3 -ciclopropilmetoxi- -difluorometoxi -fenil ) -propiónico; 3- (4-Acetilamino- 1 , 3 -dioxo-1 , 3 -dihidro- isoindol -2 -il ) -3 -(3 -ciclopropilmetoxi-4 -difluorometoxi -fenil ) -N, -dimetil -propionamida ; 3- (4-acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3 -dihidro- isoindol -2 -il) -3-(3 ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil) -propionamida; Ácido 3- (3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil) -3-(1, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -propiónico; 3- (3 -Ciclopropilmetoxi-4 -difluorometoxi-fenil) -3 - (1,3-dioxo- 1 , 3 -dihidro-isoindol -2 -il ) -N-hidroxi -propionamida; Ester metílico del ácido 3 - (3 -ciclopropilmetoxi- -difluorometoxi -fenil ) -3 - (7-nitro- 1-oxo- 1 , 3 -dihidro- isoindol -2 -il) -propiónico; Ácido 3- (3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil) -3- (7-nitro-l-oxo-l , 3 -dihidro- isoindol -2 -il) -propiónico ; 3- (3-Ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil-3- (7-nitro-l-oxo-1 , 3-dihidro-isoindol-2-il) -) -N,N-dimetil-propionamida ; 3- (7-Amino-l-oxo-l , 3-dihidro-isoindol-2-il) -3- (3-ciclopropilmetoxi -4 -difluorometoxi-fenil) -N, N-dimetil -propionamida ; Ester metílico del ácido 3- ( -difluorometoxi -3 -etoxi-fenil) -3- (7-nitro-l-oxo-l, 3 -dihidro- isoindol -2 - il ) -propiónico; Ácido éster metílico del 3 - ( 7 -Amino- 1 -oxo- 1 , 3 -dihidro-isoindol-2 -il) -3- ( -difluorometoxi -3 -etoxi - fenil ) -propiónico; Éster metílico del ácido 3- [7- (ciclopropancarbonil-amino) -1-oxo- 1 , 3 -dihidro-isoindol-2 - il] -3- (4-difluorometoxi -3 -etoxi -fenil) -propiónico; Éster metílico del ácido 3 - (7-acetilamino-l-oxo-l , 3-dihidro-isoindol-2-il) -3- (4-difluorometoxi -3 -etoxi -fenil) -propiónico ; Ácido 3 - (7-acetilamino-l-oxo-l , 3 -dihidro- isoindol -2 - il ) -3- (4-difluorometoxi -3 -etoxi -fenil) -propiónico; Ácido 3 - [7- (ciclopropancarbonil-amino) -1-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il] -3- (4-difluorometoxi -3 -etoxi -fenil ) -propiónico; {2- [2-Carbamoil-l- (4 -difluorometoxi -3 -etoxi- fenil ) -etil] -3-???-2 , 3 -dihidro-??- isoindol-4 -il } -amida del ácido ciclopropancarboxilico ,- {2- [1- (4-Difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -2-dimetilcarbamoil-etil] -3 -oxo-2 , 3 -dihidro-1H-isoindol -4 - il } del ácido ciclopropancarboxilico; {2- [1- (4-Difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -2-hidroxicarbamoil-etil] -3-oxo-2 , 3-dihidro-lH-isoindol-4-il } -amida del ácido ciclopropancarboxilico; 3- ( 7 -Acetilamino- 1-oxo-l , 3 -dihidro- isoindol -2 - il ) -3- (4-difluorometoxi-3 -etoxi- fenil ) -propionamida ,- 3- (7-Acetilamino-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -3- (4-difluorometoxi-3 -etoxi-fenil) -N, -dimeti1 -propionamida ; 3- (7-Acetilamino-l-oxo-l , 3 -dihidro-isoindol -2 - il ) -3 - (4 -difluorometoxi- 3 -etoxi- fenil ) -N-hidroxi -propionamida ; Ácido 3 - (4 -acetilamino-1 , 3 -dioxo- 1 , 3 -dihidro-isoindol -2 -il) -3- (4-difluorometoxi -3 -etoxi-fenil) -propiónico; 3- (4-Acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -3-(4 -difluorometoxi- 3 -etoxi -fenil ) -propionamida ,- 3- (4-Acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -3-(4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -N, N-dimetil -propionamida; 3- (4-Acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -3-(4 -difluorometoxi-3 -etoxi -fenil) -N-hidroxi -propionamida ; (2- [1- (4-Difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -2 -metansulfonil -etil] -3-OXO-2 , 3 -dihidro-lH- isoindol-4-il } -amida de ácido ciclopropancarboxílico; N- { 2 - [1- (4 -Difluorometoxi -3 -etoxi-fenil) -2-metansulfonil -etil] -1 , 3 -dioxo-2 , 3-dihidro- lH-isoindol -4 -il } -acetamida; y {2- [2-Carbamoil-l- (4-difluorometoxi -3 -etoxi-fenil) -etil] -7-cloro-3 -oxo-2 , 3 -dihidro- lH-isoindol -4- il } -amida ¾ de ácido ciclopropancarboxílico. Otros fármacos inhibidores selectivos de la citocina, incluyen compuestos de isoindolilo sustituidos con 7-amido encontrados en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/454,155 de G. Muller et al., presentada el 12 de Marzo del 2003, la cual se incorpora aquí en su totalidad como referencia. Los compuestos de isoindolilo sustituidos con 7-amido representativos incluyen los compuestos de la fórmula: en donde : Y es -C(O)-, -CH2, -CH2C(0)- ó S02; X es H, Z es (alquilo Co- ) -C (O) R3, alquilo Ci-4, (alquilo C0-4)-OH, (alquilo C1-4 ) -0 (alquilo Ci_4) , (alquilo Ci_4) -S02 (alquilo Ci-4):, (alquilo C0-4 ) _S0 (alquilo C1-4 ) , (alquilo Co-4)-NH2, (alquilo C0-4 ) - (alquilo C^e)?, (alquilo C0-4) -N (H) (OH) , CH2NS02 ( alquilo C1-4 ) ; R1 y R2 son independientemente alquilo Ci-8, cicloalquilo, o (alquilo C1-4 ) cicloalquilo; R3 es, NR4R5, OH, u 0- (alquilo C0-8) ; R4 es H; R5 es -OH, u -0C(0)R6; R6 es alquilo Ci-8, amino- (alquilo Ci-8) , (alquilo Ci-8)-(cicloalquilo C3_6) , cicloalquilo C3-6, fenilo, bencilo, o arilo; o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, clatrato aceptables farmacéuticamente, o profármacos de los mismos; o la fórmula: en donde: Y es -C(0)-, -CH2, -CH2C(0)-, ó S02; X es halógeno, -CN, -NR7R8, -N02, ó -CF3, es Z es (alquilo C0-4 ) -S02 (alquilo Ci-4) , -(alquilo C0-4)-CN, -(alquilo C0-4 ) -C (O) R3, alquilo Ci-4, (alquilo C0-4)OH, (alquilo C0- )O(alquilo Ci_4) , (alquilo C0-4) SO (alquilo Ci-4) , (alquilo C0- ) H2, (alquilo C0-4) N (alquil Ci-8)2, (alquilo C0-4} N (H) (OH) , ó (alquilo C0-4) NS02 (alquilo C1-4) ; W es cicloalquilo C3-6, - (alquilo Ci-8) - (cicloalquilo C3-6) , -(alquilo C0-8) - (cicloalquilo C3_s) -NR7R8, (alquilo C0-e) -NR7R8, (alquilo C0-4) -CHR9- (alquilo C0-4) -NR7R8, Ri y R2 son independientemente alquilo Co-8 cicloalquilo, ó (alquilo Ci-4) cicloalquilo; R3 es alquilo C1-8, NR4 R5, OH, u O- (alquilo Ci-8) ; R4 y R5 son independientemente H, alquilo Ci-8, (alquilo Co-a) - (cicloalquilo C3-6) , OH, u -OC(0)R6 R6 es alquilo Ci-8, (alquilo C0-8) - (cicloalquilo C3-s) , amino- (alquilo C1-8) , fenilo, bencilo, o arilo; R7 y R8 son cada uno independientemente H, alquilo Ci-8, (alquilo C0-8) - (cicloalquilo C3-6) , fenilo, bencilo, arilo, o se pueden tomar conjuntamente con el átomo que conecta los mismos para formar un anillo de heterocicloalquilo o heteroarilo con 3 a 7 miembros; R9 es alquilo C1-4, (alquilo C0-4) arilo, (alquilo C0-4) - (cicloalquilo C3_6) , (alquilo C0-4) -heterociclo ; o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, clatrato aceptables farmacéuticamente, o profármacos de los mismos. Todavía otros fármacos inhibidores selectivos de la citocina, incluyen compuestos de isoindolilo del ácido N-alquil-hidroxámico encontrados en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/454,149 de G. Muller et al., presentada el 12 de Marzo del 2003, la cual se incorpora aquí en su totalidad como referencia. Los compuestos de isoindolilo del ácido N-alquil-hidroxámico representativos incluyen los compuestos de la fórmula: en donde: Y es -C(0)-, -CH2, -CH2C(0)- ó S02; Ri y R2 son independientemente alquilo Ci-8, CF2H, CE3, CH2CHF2, cicloalquilo, o (alquilo Ci-8) cicloalquilo; Zi es H, alquilo Ci_6, -NH2-NR3R4 u OR5; Z2 es H o C(0)R5; Xi, X2, X3 y X4 son cada uno independientemente H, halóqeno, N02, OR3, CF3, alquilo C1-6, (alquilo C0-4)-(cicloalquilo C3.6) , (alquilo C0_ ) -N- (R8R9) , (alquilo C0-4)-NHC(0)-(R8), (alquilo C0-4 ) -NHC (O) CH (R8 ) (R9) , (alquilo C0-t) -NHC(0)N(R8R9) , (alquilo C0-4) -NHC (O) O (R8) , (alquilo C0-4)-O-R8, (alquilo C0-4 ) -imidazolilo, (alquilo C0-4) -pirrolilo, (alquilo C0-4) -oxidazolilo, (alquilo C0-4) -triazolilo o (alquilo C0-4)-heterociclo; ¾ R- / Y Rs s°n cada uno independientemente H, alquilo C1-6, O-alquilo Ci-g, fenilo, bencilo, o arilo; R6 y R7 son independientemente H ó alquilo Ci-6; R8 y R9 son cada uno independientemente H, alquilo Ci-9í cicloalquilo C3-6, (alquilo Ci_6) - (cicloalquilo C^-e) ¡ (alquilo Co-ß) -N (R4R5) , (alquilo Ci-S) -0R5, fenilo, bencilo, arilo, piperidinilo, piperizinilo, pirolidinilo , morfolino, ó heterocicloalquilo C3-7; y o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, clatrato aceptables farmacéuticamente, o profármacos de los mismos. Los fármacos específicos inhibidores selectivos de la citocina incluyen, pero no están limitados a: 2- [1 (-3-etoxi-4-metoxifenil) -2 -metilsulfoniletil] -isoindolin- l-ona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2- (N, -dimetil -aminosulfonil) etil] isoindolin-l-ona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfoniletil] -isoindolin- 1 , 3 -diona ; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfoniletil] -5-nitroisoindolin- 1 , 3-diona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfoniletil] -4-nitroisoindolín-1, 3-diona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) 2 metilsulfoniletil] -4-aminoisoindolin-1 , 3 -diona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) 2 metilsulfoniletil] -5-metilisoindolin- 1 , 3 -diona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) 2 metilsulfoniletil] -5-acetamidoisoindolin-1 , 3-diona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2 -metilsulfoniletil] -4-dimetilaminoisondolin-1 , 3-diona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2 -metilsulfoniletil] -5-dimetilaminoisoindolin-1 , 3-diona; 2- [1- (3 -etoxi-4-metoxifenil) -2 -metilsulfoniletil] benzo [e] isoindolin-1 , 3 -diona; 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfoniletil] -4-metoxiisoindolin-1 , 3 -diona; 1- (3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfoniletil-amina; 2- [1- (3 -ciclopentiloxi -4 -metoxifenil ) -2-metilsulfoniletil] isoindolin-1 , 3-diona; y 2- [1- (3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfoniletil-4-dimetilaminoisoindolin- 1 , 3 -diona . Los fármacos adicionales, inhibidores selectivos de la citocina, incluyen los compuestos enantioméricamente puros descritos en las solicitudes provisionales de patente de los Estados Unidos Nos. 60/366,515 y 60/366,516 de G. Muller et al., ambas de las cuales se presentaron el 20 de Marzo del 2002, y las solicitudes provisionales de patente de los Estados Unidos Nos. 60/438,450 y 60/438,448 de G. Muller et al., ambas de las cuales se presentaron el 7 de Enero del 2003, y la totalidad de las cuales se incorporan aquí como referencia. Los compuestos preferidos incluyen un enantiómero de 2- [1- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfoniletil ] -4-acetilaminoisoindolin-1 , 3-diona y un enantiómero de 3- (3, 4-dimetoxi-fenil ) -3- (1-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -propionamida . Los fármacos preferidos, inhibidores selectivos de la citocina en la invención son 3- (3, 4-dimetoxi-fenil) -3- ( 1-oxo-1 , 3-dihidro-isoindol-2-il ) -propionamida y { 2- [1- ( 3-etoxi-4-metoxi-fenil ) -2-metansulfonil-etil ] -3-oxo-2, 3-dihidro-lJí-isoindol-4-il } -amida de ácido ciclopropancarboxilico, los cuales están disponibles de Celgene Corp., Warren, NJ. La 3- (3, 4-dimetoxi-fenil) -3- (1-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -propionamida tiene la siguiente estructura química: La { 2- [ 1- (3-etoxi-4-metoxi-fenil) -2-metansulfonil-etil ] -3-OXO-2, 3-dihidro-lH-isoindol-4-il } -amida de ácido ciclopropancarboxilico tiene la siguiente estructura química: Los compuestos de la invención también incluyen, pero no están limitados a, compuestos que inhiben la actividad PDE IV, tal como cilomast, teofilina, zardaverina, rolipram, pentoxifilina, enoximona, isoindol-imidas , fenetilsulfonas , ácidos alcalinohidroxámicos, amidas cíclicas no polipeptídicas , oxoisoindoles , isoindolinas , indazoles, piridinas heterosustituidas , difenilpiridinas , tiofenos de arilo, furanos de arilo, indenos, fenilos trisustituidos , ftalazinonas, bencensulfonamidas, compuestos tetracíclicos y sales, solvatos, isómeros, clatratos, profármacos, hidratos o derivados de los mismos. En una modalidad, el compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico. En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (I): que incluye isómeros, profármacos y sales, hidratos, solvatos, clatratos aceptables farmacéuticamente de los mismos, en donde : Y representa N ó N-óxido; Ri y R2 se selecciona independientemente de: H, alquilo Ci_6 y halo alquilo Ci_6; R3 y Rt¡ se selecciona independientemente de H y alquilo C1-6, ó R3 y R unidas al mismo átomo de carbono tomados conjuntamente representan un átomo de oxigeno, o R3 y R4 unidos a diferentes átomos de carbono considerados en combinación con los átomos de carbono a los cuales los mismos están unidos junto con cualquier átomo de intervención y representa un anillo carbociclico saturado, de 5, 6 ó 7 miembros; R5 y R6 representa independientemente un miembro seleccionado del grupo que consiste de: H, alquilo C1-6, halo alquilo C1-6 y CN; n representa un número entero de 0-6; Ari se selecciona del grupo que consiste de: tienilo, tiazolilo, piridilo, fenilo y naftilo; dicho ARi opcionalmente está substituido con 1-3 miembros seleccionados del grupo que consiste de: halo, alcoxi Ci_6, alquiltio C1- , CN, alquilo Ci_6, hidroxi alquilo Ci-6, -C (O) alquilo 0?-6, -C02H, -C02alquilo Ci_6, NH(S02Me), N(S02Me)2, S02Me, S02NH2, S02NHalquilo C -e, S02N (alquilo Ci_6)2N02, alquenilo C2_6. alquilo C1-6, y NH2; y cuando ARi representa un grupo fenilo o naftilo con dos o tres sustituyentes, dos de tales sustituyentes se puede considerar en combinación y representa un anillo fusionado de lactona con 5 ó 6 miembros. Esta modalidad además abarca compuestos tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 6, 316, 472, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En otra modalidad, los compuestos de la invención tienen la siguiente estructura (II) : que incluye isómeros, profármacos y sales, hidratos, solvatos, clatratos aceptables farmacéuticamente de los mismos, en donde : Ri y R2 representa alquilo Ci_4 ó cicloalquilo C3-10; R3 y R, representa independientemente alquilo C1-4, cicloalquilo, alquílenos C2_4 que tienen un enlace doble, alquílenos C2-4 que tienen un enlace triple, (CH2) nC0 (CH2) mCH3, (CH2)PCN, (CH2)pC02Me, o se toman conjuntamente con un átomo de nitrógeno al cual los mismos están unidos, forman un anillo de 3 a 10 miembros; n y m son 0 a 3 ; p es 1 a 3 ; modalidad además abarca compuestos tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No.. 6, 162, 830, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (III): que incluye isómeros, profármacos y sales, hidratos, solvatos, clatratos aceptables farmacéuticamente de los mismos, en donde : Ri se selecciona independientemente en cada caso del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, alcoxi inferior, hidroxi, alquilo inferior, alquil -mercapto inferior, alquilsulfonilo inferior, alquilamino inferior, di-alquilamino inferior, amino, nitro, nitrilo, alquil-carboxilate inferior, -C02H, y sulfonamido; R2 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo inferior; R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo inferior, hidroxi, y amino; R se selecciona del grupo que consiste de -COM y CH2OH en donde M se selecciona del grupo que consiste de: hidroxi, alcoxi inferior sustituido, amino, alquilamino, dialquilamino, N-morfolino, hidroxialquilamino, polihidroxiamino, dialquilaminoalquilamino, aminoalquilamino, y el grupo OMe, en donde Me es catión; R5 es un alquil-sulfonilo; y n es un número entero de 0 a cuatro. Esta modalidad además abarca los compuestos descritos en la Patente Norteamericana No. 6,177,471, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (IV) : que incluye isómeros, profármacos y sales, hidratos, solvatos, clatratos aceptables farmacéuticamente de los mismos, en donde : R0 representa hidrógeno, halógeno, o alquilo Ci_6; Ri se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno; alquilo Ci-s opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de fenilo, halógeno, -CO2 Ra, -NRaRb, cicloalquilo C3_6, fenilo, y un anillo heterociclico con 5 ó 6 miembros seleccionados del grupo que consiste de piridilo, morfolinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, y piperidinilo, y se substituye opcionalmente por uno o más de alquilo C1-6, y opcionalmente enlazado al átomo de nitrógeno al cual Ri está unido mediante alquilo Ci-6; R2 se selecciona del grupo que consiste de: fenilo opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de -ORa, -NRa, Rb/ halógeno, hidroxi, trifluorometilo, ciano, y nitro; y Ra y b independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-6 incluyendo isómeros, profármacos y sales aceptables farmacéuticamente de los mismos. Esta modalidad además abarca los compuestos tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 6,218, 400, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad . En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (V) : incluyendo isómeros, profármacos y sales, hidratos, solvatos, clatratos aceptables farmacéuticamente de los mismos, en donde : X es S ó O; Ari es un anillo aromático seleccionado opcionalmente de fenilo, piridinilo, o furilo sustituido hasta con dos sustituyentes, cada sustituyente independientemente es: alquilo Ci-6, opcionalmente sustituido con -OH, -C02H, C02alquilo Ci-3, o CN; alcoxi Ci_6; alquiltio Ci_3, alquilsulfonilo Ci_3, fluoroalquilo C1-3, opcionalmente sustituido con -OH; halo, -OH, -C02H, ó -C02 alquilo Ci_3; R2 es hidrógeno ó alquilo Ci_3, y R3 es fenilo, piridinilo, quinolinilo o furilo, opcionalmente sustituido con hasta dos sustituyentes , cada sustituyente independientemente es: alquilo C1-3, fluoro alquilo C1-3, alcoxi C1-6, fluoroalcoxi C1-3, alquiltio C1-3, halo, u -OH. Esta modalidad además abarca los compuestos tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 6,034,089 y Patente Norteamericana No. 6,020,339, las cuales se incorporan aqui como referencia en sus totalidades. En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (VI): incluyendo isómeros, profármacos y sales, hidratos, solvatos,. clatratos aceptables farmacéuticamente de los mismos, en donde : Y es halógeno o un grupo alquilo o -XRa; Z es -0-, -S(0)p- ó -N(Rb)-, en donde p es cero o un número entero 1 ó 2; L es -XR, -C(Rn)C(Ri) (R2) ó - (CHR1X) nCH (R (R2) , en donde n es cero o el número entero 1; cada uno de Ra y Rb es independientemente hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido; R es un grupo alquilo, alquenilo, cicloalquilo o cicloalquenilo opcionalmente sustituido; cada uno de R]_ y R2, los cuales pueden ser los mismos o diferentes, es hidrógeno, fluoro, -CN, -N02, o un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alquiltio, -C02R8, -CONR9R10 ó -CSNR9R10 opcionalmente sustituido, R2 y R2 conjuntamente con el átomo de carbono al cual los mismos están unidos, se enlazan para formar un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo opcionalmente sustituido; R3 es hidrógeno, flúor, hidroxi o un grupo alquilo recto o ramificado opcionalmente sustituido; R4 es hidrógeno, -(CH2)tAr ó - (CH2) t-Ar- (Li) n-Ari , en donde t es cero o un número entero 1, 2 ó 3 ; R5 es -(CH2)tAr ó - (CH2) t-Ar- (Li) n-Ar' ; R6 es hidrógeno, flúor, o un grupo alquilo opcionalmente sustituido ; R7 es hidrógeno, flúor, un grupo recto o ramificado, alquilo opcionalmente sustituido, -ORc, en donde Re es hidrógeno o un grupo alquilo o alquenilo opcionalmente sustituido, o un grupo formilo, alcoxialquilo, alcanoilo, carboxamido o tiocarboxamido ; cada uno R8, Ra y Rio es independientemente hidrógeno o un alquilo, aralquilo o arilo opcionalmente sustituido; y Rn es hidrógeno, flúor o un grupo metilo.

Esta modalidad además abarca los compuestos tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 5, 798, 373, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad . En una modalidad preferida, el compuesto es de estructura (VII): o una sal, hidrato, solvato, clatrato, enantiómero, diastereómero, racemato, o mezcla de los mismos. En otra modalidad preferida, el compuesto es aquél de estructura (VIII): incluyendo isómeros, sales, clatratos, solvatos, hidratos, profármacos y sales aceptables farmacéuticamente de los mismos .

Algunos de estos compuestos pueden estar disponibles comercialmente de Celgene, Inc., Warren, New Jersey. Otros compuestos anteriores se pueden elaborar mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo aquéllos descritos en las patentes citadas anteriormente las cuales se incorporan como referencia en sus totalidades. Los ejemplos adicionales de los inhibidores PDE IV los cuales son útiles en los métodos de la presente invención, incluyen aquéllos descritos en GB 2 063 249 A, EP 0 607 439 Al, Patente Norteamericana No. 6,333,354, Patente Norteamericana No. 6,300,335, Patente Norteamericana No. 6,166,041, Patente Norteamericana No. 6,069,156, Patente Norteamericana No. 6,011,060, Patente Norteamericana No. 5,891,896, Patente Norteamericana No. 5,849,770, Patente Norteamericana No. 5,710,170, Patente Norteamericana No. 4,101,548, Patente Norteamericana No. 4,001,238, Patente Norteamericana No. 4,001,237, Patente Norteamericana No. 3,920,636, Patente Norteamericana No. 4,060,615, WO 97/03985, EP 0 607 439 Al, Patente Norteamericana No. 4,101,548, Patente Norteamericana No. 4,001,238, Patente Norteamericana No. 4,001,237, Patente Norteamericana No. 3,920,636, Patente Norteamericana No. 4,060,615, WO 97/03985, EP 0 395 328, Patente Norteamericana No. 4,209,623, EP 0 395 328, Patente Norteamericana No. 4,209, 623, Patente Norteamericana No. ,354,571, EP O 428 268 A2 , Patente Norteamericana No. 5,354,571, EP 0 428 268 A2 , 807,826, Patente Norteamericana No. 3,031,450, Patente Norteamericana No. 3,322,755, Patente Norteamericana No. 5,401,774, 807,826, Patente Norteamericana No. 3,031,450, Patente Norteamericana No. 3,322,755, Patente Norteamericana No. 5,401,774, Patente Norteamericana No. 5,147,875, PCT WO 93/12095, Patente Norteamericana No. 5,147,875, PCT WO 93/12095, Patente Norteamericana No. 4,885,301, WO 93/07149, EP 0 349 239 A2 , EP 0 352 960 A2 , EP 0 526 004 Al, EP 0 463 756 Al, Patente Norteamericana No. 4,885,301, WO 93/07149, EP 0 349 239 A2 , EP 0352 960 A2 , EP 0 526 004 Al, EP 0 463 756 Al, EP 0 607 439 Al, EP 0 607 439 Al, WO 94/05661, EP 0351 058, Patente Norteamericana No. 4,162,316, EP 0 347 146, Patente Norteamericana No. 4,047,404, Patente Norteamericana No. 5,614,530, Patente Norteamericana No. 5,488,055, WO 97/03985, WO 97/03675, WO 95/19978, Patente Norteamericana No. 4,880,810, WO 98/08848, Patente Norteamericana No. 5,439,895, Patente Norteamericana No. 5,614,627, PCT US94/01728, WO 98/16521, EP 0 722 943 Al, EP 0 722 937 Al, EP 0 722 944 Al, WO 98/17668, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 98/06722, PCT/JP97/03592, WO 98/23597, WO 94/29277, WO 98/14448, WO 97/03070, WO 98/38168, WO 96/32379 y PCT/GB98/03712 , la totalidad de las cuales se incorporan aquí como referencia.

Muchos de los compuestos que se contemplan como parte de la presente invención, se pueden enriquecer en enantiómeros activos óptimamente de los compuestos especificados anteriormente utilizando una resolución estándar o síntesis asimétrica conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Shealy et al., Chem. Indus . 1030 (1965); y Casini et al., Fármaco Ed. Sci. 19:563 (1964) . La presente invención también pertenece a las sales de adición ácida, no tóxicas, aceptables fisiológicas, de los compuestos de las mismas. Tales sales incluyen aquéllas derivadas de ácidos orgánicos e inorgánicos o bases conocidas en la técnica: tales ácidos incluyen por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido maleico, ácido sórbico, ácido aconítico, ácido salicílico, ácido itálico, ácido embólico, ácido enántico, y similares. Los compuestos de la invención que son de naturaleza ácida son capaces de formar sales con diversas bases aceptables farmacéuticamente. Las bases que se pueden utilizar para preparar sales de adición básica, aceptables farmacéuticamente, de tales compuestos ácidos de la invención, son aquéllas que forman sales de adición básica, no tóxica, es decir, sales que contienen cationes aceptables farmacológicamente tales como, pero no limitadas a, sales de metal alcalino o alcal inotérreo y en particular las sales de calcio, magnesio, sodio o potasio. Las bases orgánicas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, N,N-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumaina (N-metilglucamina) , lisina y procaína . Los compuestos de la invención se pueden evaluar por su capacidad para inhibir la PDE IV utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, aquéllos ensayos descritos en la Patente Norteamericana No. Patente Norteamericana No. 6,316,472; Patente Norteamericana No. 6,204, 75; Featherstone R. L. et al. (2000) "Comparison of phosphodiesterase inhibitors of differing isoenzyme selectivity added to St . Thomas' hospital cardioplegic solution used for hypothermic preservation of rat lungs", Am. J. Respir Crit. Care Med. 162:850-6; y Brackeen .F. et al. (1995) "Design and synthesis of conformationally constrained analogues of 4- (3 -butoxy-4 -methoxybenzyl) imidazol idin-2 -one (Ro 20-1724) as potent inhibitors of cA P-specific phosphodiesterase", J. Med. Chem. 38:4848-54, las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Los compuestos de la invención se pueden ya sea adquirir comercialmente o preparar de conformidad con los métodos descritos en las patentes o publicaciones de patente descritas aquí. Además, las composiciones puras ópticamente se pueden sintetizar o resolver asimétricamente utilizando agentes conocidos de resolución o columnas quirales así como otras técnicas estándar de química orgánica sintética. 4.4. MÉTODOS DE CULTIVO DE CÉLULAS MADRE En ciertas modalidades de la invención, las células madre o progenitoras , incluyen aunque no están limitadas a células madre embrionarias, células madre similares a las embrionarias, células progenitoras, células pluripotentes , células totipotentes , células multipotentes , células endógenas a una placenta perfusionada post -parto, células de sangre del cordón umbilical, células madre o progenitoras derivadas de sangre periférica o sangre de adulto, o células de médula ósea, se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse. Estas células se pueden propagar in vi tro utilizando métodos bien conocidos en la técnica, o en forma alternativa, se pueden propagar en una placenta perfusionada post-parto . En ciertas modalidades, se pueden recolectar células endógenas a una placenta perfusionada post-parto de la placenta y el medio de cultivo y cultivar in vi tro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación con respecto al tipo o linaje de célula deseado. Ver la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20030032179, publicada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom" la cual se incorpora aquí en su totalidad. En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras que no se derivan de una placenta perfusionada post-parto sino que por el contrario, se aislan de otras fuentes tales como la sangre del cordón umbilical, médula ósea, sangre periférica o sangre de adulto, se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse. En una modalidad preferida, la diferenciación se realiza in vitro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación en el linaje deseado o tipo de célula. Los compuestos de la invención se utilizan en la diferenciación/medio de cultivo mediante adición, generación in situ, o de cualquier otra manera que permita el contacto de las células madre o progenitoras con los compuestos de la invención. En otra modalidad, las células madre cultivadas, por ejemplo, células madre cultivadas in vitro o en una placenta perfusionada post-parto, se estimulan para proliferar en un cultivo, por ejemplo, mediante la administración de eritropoyetina, citocinas, linfoquinas, interferonas , factores para la estimulación de colonias (CSFs) , interferonas , quimiocinas, interleucinas , factores de crecimiento hematopoyéticos , humanos, recombinantes, que incluyen ligandos, factores de células madre, trombopoyetina (Tpo) , interleucinas, y el factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento. Después de la recolección y/o aislamiento de las células cultivadas, las mismas se pueden identificar y caracterizar mediante un ensayo de la unidad de formación de colonias, el cual es conocido comúnmente en la técnica, tal como medio Mesen Cult™ (células madre de Technologies, Inc., Vancouver British Columbia) . Los métodos para cultivar células madre o progenitoras in vi tro son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ver, Thomson et al., 1998, Science 282:1145-47 (células madre embrionarias); Hirashima et al., 1999, Blood 93(4): 1253-63, y Hatzopoulos et al., 1998, Development 125:1457-1468 (células progenitoras endoteliales) ; Slager et al., 1993, Dev. Genet . 14(3):212-24 (progenitores de neuronas o músculos); Genbachev et al., 1995, Reprod. Toxicol . 9(3):245-55 (citotrofoblastos, es decir, progenitores de las células epiteliales de la placenta); Nadkarni et al. 1984, Tumori 70:503-505, elchner et al., 1985, Blood 66(6) : 1469-1472, publicación PCT internacional WO 00/27999 publicada el 18 de Mayo de 2000, Himori et al., 1984, Intl. J. Cell Cloning 2:254-262, y Douay et al.,^,-1995, Bone Marrow Transplantation 15:769-775 (células progenitoras hematopoyéticas); Shamblott et al., 1998, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 95:13726-31 (células germinales primordiales); Yan et al., 2001, Devel . Biol . 235:422-432 (células madre de trofoblastos) . Tales métodos se pueden adaptar fácilmente para su uso en los métodos de la invención, siempre y cuando el cultivo de las células progenitoras, incluya un paso o pasos para cultivar las células con un compuesto de la invención, en los momentos indicados, para producir la(s) población (s) deseada (s) de células diferenciadas . 4.4.1. Cultivo de Células Madre in vitro Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de células madre o progenitoras in vitro, que comprende incubar las células con un compuesto, tal como una molécula orgánica pequeña de la presente invención, in vitro, que induce las mismas para diferenciarse en células de un linaje particular de células deseadas, después del transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, las células se inducen para diferenciarse en un linaje de células hematopoyéticas.

En ciertas modalidades, las células madre cultivadas de interés se exponen in vitro a una concentración de 0.1 g/ml , 0.2 µ9/t?1 , 0.3 µ9/p?1 , 0.4 ^g/ml, 0.5 9/p?1 , 1 µ9/G?1 , 5 µ?} ó 10 9/??1 de un compuesto de la invención. Preferiblemente, las células de interés se exponen a una concentración del inhibidor PDE IV desde aproximadamente 0.005 9/t?1 hasta aproximadamente 5 mg/ml, o una concentración de SelCID™ desde aproximadamente 0.005 9/?t?1 hasta aproximadamente 5 mg/ml (Celgene Corp., Warren, NJ) (ver también la Sección 4.7, "Composiciones Farmacéuticas"). En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias se inducen para propagarse en el bioreactor de la placenta mediante la introducción de nutrientes, hormonas, vitaminas, factores de crecimiento, o cualquier combinación de los mismos, en la solución de perfusión. Se pueden agregar suero y otros factores de crecimiento a la solución o medio de perfusión de propagación. Los factores de crecimiento usualmente son proteínas e incluyen, pero no están limitados a: citocinas, linfoquinas, interferones , factores para la estimulación de colonias (CSFs) , interferones , quimiocinas, e interleucinas . Otros factores de crecimiento que se pueden utilizar incluyen factores de crecimiento hematopoyéticos , humanos, recombinantes , que incluyen ligandos, factores de células madre, trombopoyetina (Tpo) , factor de estimulación de las colonias de granulocitos (G-CSF) , factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento de fibroblastos básicos, placenta derivada del factor de crecimiento y del factor de crecimiento epidérmico. Los factores de crecimiento introducidos en la solución de perfusión pueden estimular la propagación de células madre similares a las embrionarias no diferenciadas, células progenitoras consignadas, o células diferenciadas (por ejemplo, células hematopoyéticas diferenciadas) . Los factores de crecimiento pueden estimular la producción de materiales biológicos y moléculas bioactivas que incluyen, aunque no están limitadas a, inmunoglobulinas , hormonas, enzimas, o factores de crecimiento como se describió previamente. La placenta cultivada se debe "alimentar" periódicamente para remover el medio consumido, para despoblar las células liberadas, y para agregar un medio fresco. La placenta cultivada se debe almacenar bajo condiciones estériles para reducir la posibilidad de contaminación, y mantener bajo presurización intermitente y periódica para crear condiciones que mantengan un suministro adecuado de nutrientes a las células de la placenta. Se debe reconocer que la perfusión y el cultivo de la placenta pueden ser tanto automatizados como computarizados para una eficiencia y capacidad incrementada. 4.4.2. Cultivo de Células Progenitoras xn vitro Los métodos de la invención también abarcan la regulación y modulación del desarrollo de células progenitoras, particularmente células progenitoras CD34+ y CD133+. En una modalidad de la invención, se inducen células progenitoras para diferenciarse en un linaje de células hematopoyéticas . En una modalidad específica, el linaje es un linaje granulocítico . En una modalidad alternativa, se inducen células CD1334 para diferenciarse en células endoteliales , células del cerebro, células del riñon o células del tracto intestinal . Se pueden cultivar células progenitoras mediante métodos estándar, como se observa anteriormente. Adicionalmente , el cultivo de las células progenitoras puede comprender poner en contacto las células en diferentes momentos o períodos de tiempo durante el cultivo, para impulsar la diferenciación de células las progenitoras a lo largo de diferentes linajes de células . Por consiguiente, en un método para cultivar las células progenitoras CD34+ ó CD133+, las células se colocan en placas en el día 0 en un medio que contiene el factor de las células madre ( SCF) , Flt-3L, GM- CSF y TNF - OÍ y se cultivan durante seis días. En el sexto día, las células se vuelven a colocar en placas en un medio que contiene GM- CSF y TNF-a, y el cultivo se continúa durante unos seis días adicionales. Este método da como resultado la generación de células dendríticas. En una variación de este método, las células inicialmente se colocan en placas en un medio que contiene GM-CSF e IL-4, luego se cambian en el sexto día a un medio acondicionado con monocitos (ver Steinman et al., Publicación Internacional No. WO 97/29182) . Para producir una población de células progenitoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38~CD33" , las células progenitoras se ponen en contacto con un compuesto de la invención en el día 0, y se recolectan las células progenitoras CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38~CD33" en el día 6. Se espera que la tempori zación o gestión del momento oportuno de la adición del (los) compuesto (s) de la invención, particularmente los SelCIDs™, tenga un efecto sustancial en la ruta de diferenciación de las células CD34+ en células de linajes particulares, y en la diferenciación de células CD133+. Las células progenitoras CD34+, se cultivan bajo condiciones estándar, detrás de una ruta o linaje de desarrollo mieloide, es decir, se vuelven células dendríticas dentro de los 12 días después de la colocación en placas inicial (es decir, después del cultivo inicial) . Sin embargo, la adición de un compuesto de la invención en uno de los diversos momentos particulares durante los primeros seis días del cultivo, substancialmente altera esta ruta. Por ejemplo, si las células CD34+, particularmente las CD34+ derivadas de la médula ósea, se exponen a un compuesto de la invención, particularmente los SelCIDs™ en el primer día del cultivo, se podría suprimir la diferenciación a lo largo del linaje mieloide, como se pone en evidencia por el incremento en el número de células CD34+CD38+ y la disminución en el número de células CDla+CD14- en el día 6 del cultivo, en relación a un control no expuesto a un compuesto de la invención (es decir, expuesto a DMSO) . Además, la exposición a un compuesto de la invención podría conducir a la supresión del desarrollo de células que expresan los marcadores de superficie expresados por las células en un linaje de células dendríticas, tales como CD80 y CD86. El contacto en el día inicial del cultivo, o en cualquier momento hasta por tres días después del día inicial del cultivo, con un compuesto de la invención, podría conducir a tal modulación del desarrollo de células progenitoras CD34+. El incremento en el número de células CD34+ se intensificará si las dosis múltiples de un compuesto de la invención se dan entre el día 0 y el día 6, por ejemplo, las dosis en el día 0 y el día 2, el día 0 y el día 4, las dosis en el día 3 y el día 6, ó las dosis en el día 2, el día 4, y el día 6. En un aspecto particularmente útil de la invención, la adición de un compuesto de la invención en el primer día del cultivo de las células progenitoras CD34+, y la continuación de la exposición a través del día 12, conduce al desarrollo de una célula progenitora única que expresa una combinación única de marcadores de superficie celular: CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38"CD33~ . La población de células CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38"CD33" representa una etapa intermediaria en la diferenciación. Esta población es útil como una población expandible de células progenitoras que se pueden transplantar fácilmente a un paciente en necesidad de una población de desarrollo rápido de células de linaje hematopoyético, por ejemplo, células granulocíticas . En otra modalidad, se pueden colocar en placas las células CD34+ y se cultivan durante la fase de proliferación (aproximadamente 6 días) en un medio estándar (es decir, no expuesto a un inhibidor, tal como un SelCID™ o similar) , luego se cambian al mismo o a un medio similar que contenga un SelCID™ o profármaco del mismo, o similar, y se continua el cultivo hasta el día 12. En esta modalidad, las células de diferenciación típicamente muestran una expresión disminuida de CD80, CD86 y CD14, aunque da como resultado una persistencia incrementada de una población de células CDla+ con relación a los controles. Tales células de diferenciación no se bloquean a partir de las células dendríticas procedentes. En otra modalidad, las células CD34+ se tratan durante la fase de proliferación (días 1-6 posteriores a la colocación en placas) durante al menos tres días consecutivos con un SelCID™, u otro compuesto de la invención. En aún otra modalidad, las células progenitoras CD34+ ó CD133+ se tratan dos o más veces con un SelCID™, u otro compuesto de la invención, durante los primeros seis días después de la colocación en placas. Tales tratamientos múltiples darán como resultado un incremento en la proliferación tanto de las poblaciones CD34+ como CD133+. Los tratamientos múltiples con un SelCID™, u otro compuesto de la invención, provocarán un cambio en la diferenciación de las células progenitoras CD34+ alejadas de un linaje CDllc+CD15~ y hacia un linaje CDllc"CD15+, es decir, lejos de un linaje mieloide de células dendríticas y hacia un linaje granulocítico (FIG. 6B) . El tratamiento de las células progenitoras del día 0 del cultivo, particularmente las dosis múltiples entre el día 0 y el día 6, también da como resultado un incremento en el número de células progenitoras CD133+, particularmente un incremento en la población progenitora CD34+CD133+ . El CD133+ es un marcador hematopoyético que es una alternativa al aislamiento CD34, como las células CD133+ se puede expandir de la misma manera que el subconjunto CD34+ y conservar su capacidad de linajes múltiples (ver Kobari et al., J. Hematother. Stem Cell Res. 10(2):273-81 (2001)). Se han reportado que el CD133+ está presente en las células CD34" del tejido de cerebro de un feto humano, y muestran un potente injerto, proliferación, migración, y diferenciación neural cuando se inyectan en ratones neonatales (ver Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 19 : 97 (26) : 14720-5 (2000)). Se ha mostrado que las células madre hematopoyéticas CD133+ enriquecerán su actividad progenitora con una capacidad clonogénica aumentada y un injerto superior en los ratones NOD-SCID. No obstante lo anterior, si un compuesto de la invención se pone en contacto con las células progenitoras CD34+ proliferantes después de tres días de cultivo (es decir, en cualquier momento entre los 3-6 días después del cultivo inicial) , las células progenitoras proliferantes, que ya han comenzado a expresar el marcador de superficie celular CDla, muestran una persistencia substancialmente incrementada de la expresión de este marcador en relación con los controles tratados con DMSO. Es importante notar que la citotoxicidad no está asociada con la persistencia incrementada. En otras palabras, el tratamiento con un inhibidor PDE IV, tal como un SelCID™ no provocará la apoptosis de otras poblaciones de células. El efecto final es un mantenimiento de la capacidad inmune existente y el desarrollo de una nueva capacidad inmune .

Por consiguiente, en una modalidad del método de la invención, se modula (es decir, se suprime) la diferenciación de las células CD34+ en células dendríticas poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención en el día 0 del cultivo (es decir, el primer día del cultivo) . En otra modalidad, se mejora la diferenciación de las células CD34+ en células granulocíticas poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención en el día 0 del cultivo (es decir, el primer día del cultivo. En otra modalidad, se mejora la diferenciación de las células CD34+ en una población de células progenitoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38~CD33~ poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención durante los primeros tres días del cultivo. En otra modalidad, se mejora o incrementa una población CD34+CD133+ poniendo en contacto las células progenitoras con un compuesto de la invención en dosis múltiples desde el 0 hasta el día 6 del cultivo. En otra modalidad, se mejora o incrementa la persistencia de una población de células CDla+ poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención en el día 6 del cultivo, en donde dichas células CD34+ se diferencian en células que exhiben el marcador superficial CDla, y en donde dicho cultivo incluye no ponerlas en contacto con dicho compuesto hasta por seis días.

En las modalidades anteriores, se entenderá que tales variaciones en la administración del SelCID™, o compuestos relacionados, se pueden elaborar para las células progenitoras in vivo, por ejemplo, tal como en un paciente en quien se han transplantado o injertado tales células, así como a las células progenitoras in vitro. Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación in vitro de células madre o células progenitoras, que comprende incubar las células con un compuesto, tal como una pequeña molécula orgánica de la presente invención, in vitro, que induce las mismas para diferenciarse en células de un linaje particular de células deseadas, seguido por un transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, las células se inducen para diferenciarse en un linaje hematopoyético de células. En una modalidad alternativa, se inducen las células CD133+ para diferenciarse en células endoteliales, células del cerebro, células del riñon, células de hígado, o células del tracto intestinal. Se debe notar que los métodos descritos aquí se contemplan para su uso con células progenitoras CD34+ ó CD133+ derivadas de mamíferos, preferiblemente humanos, pero también contempla su uso con células progenitoras de ave o de reptil. Sin embargo, los compuestos de la invención son potencialmente poderosos en forma variable dependiendo de la especie a partir de la cual se derivan las células progenitoras . Por lo tanto también se contempla tal variación en los métodos de cultivo, particularmente con respecto a la concentración del (los) compuesto(s) administrado (s) . Por ejemplo, las células progenitoras de origen murino son menos sensibles a los compuestos de la invención, por ejemplo un SelCID™, y podrían requerir concentraciones superiores para lograr los efectos obtenibles en 1 µ? con células progenitoras de origen humano. Las personas expertas en la técnica podrán entender que tales optimizaciones son rutinarias. 4.5. INGENIERÍA GENÉTICA DE LAS CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras que se diferencian de conformidad con los métodos de la invención se diseñan genéticamente ya sea antes a, o después de la exposición a los compuestos de la invención, utilizando, por ejemplo, un vector viral tal como un vector adenoviral o retroviral, o utilizando medios mecánicos tales como la absorción mediada con liposomas o sustancias químicas del ADN. En modalidades específicas, se diseñan genéticamente las células progenitoras CD34+, luego se tratan con un compuesto de la invención, en modalidades más especificas, dicho compuesto es un SelCID™, o un análogo del mismo. En otra modalidad, dichas células se tratan con un compuesto de la invención, luego se diseñan genéticamente. Se puede introducir un vector que contiene un transgen en una célula de interés mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, transformación, transducción, electroporación, infección, microinyección, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación con fosfato de calcio, liposomas, LIPOFECTIN™, fusión con lisosomas, lípidos catiónicos sintéticos, el uso de un arma o pistola genética o un transportador de vector de ADN, de tal manera que el transgen se transmita a las células hijas, por ejemplo, las células hijas de las células madre similares a las embrionarias o células progenitoras producidas mediante la división de una célula madre similar a la embrionaria. Para las diversas técnicas de trans ormación o transfección de células de mamífero, ver Keown et al., 1990, Methods Enzymol . 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Preferiblemente, se introduce el transgen utilizando cualquier técnica, en tanto que el mismo no sea destructivo para la membrana nuclear de la célula u otros constructos genéticas o celulares existentes. En ciertas modalidades, se inserta el transgen en el material genético nucleico mediante microinyección. La microinyección de células y constructos celulares es comúnmente conocida y practicada en la técnica. Para una transfección estable de células cultivadas de mamífero, tales como el cultivo de células en una placenta, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma . La eficiencia de la integración depende del vector y de la técnica de transfección utilizada. Con el fin de identificar y seleccionar integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a los antibióticos) en la célula madre similar a las embrionaria junto con la secuencia genética de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Se pueden identificar las células transíectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante la selección de fármacos (por ejemplo, las células que tengan incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán) . Tales métodos son particularmente útiles en los métodos que involucran la recombinación homologa en las células de mamíferos (por ejemplo, en células madre similares a las embrionarias) antes de la introducción o transplante de las células recombinantes en un sujeto o paciente.

Se puede utilizar un cierto número de sistemas de selección para seleccionar células madre hospederas, transformadas, tales como células similares a las embrionarias, o células progenitoras , tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+. En particular, el vector puede contener ciertos marcadores detectables o seleccionables. Otros métodos de selección incluyen pero no están limitados a seleccionar otro marcador tal como: los genes de timidina cinasa del virus herpes simple (Wigler et al, 1977, Cell 11: 223) , hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc . Nati. Acad. Sci . : USA 48: 2026), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) que se pueden emplear en las células tk, hgprt ó aprt, respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia a los antimetabolitos como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, el cual confieren resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 3567; 01 Haré et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, el cual confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, el cual confiere resistencia a la aminoglicosida G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol . 150: 1); e hygro, el cual confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).

El transgen se puede integrar en el genoma de la célula de interés, preferiblemente mediante integración aleatoria. En otras modalidades el transgen se puede integrar mediante un método dirigido, por ejemplo, mediante recombinación homologa dirigida (es decir, la "inclusión" o "expulsión" de un gen de interés en el genoma de la célula de interés), Chappel, Patente Norteamericana No. 5,272,071; y publicación PCT No. WO 91/06667, publicada el 16 de Mayo de 1991; Patente Norteamericana 5,464,764; Capecchi et al., expedida el 7 de Noviembre de 1995; Patente Norteamericana 5,627,059, Capecchi et al. expedida el 6 de Mayo de 1997; Patente Norteamericana 5,487,992, Capecchi et al., expedida el 30 de Enero de 1996).

Son conocidos en la técnica métodos para generar células que tengan modificaciones genéticas objetivo a través de una recombinación homologa. El constructo comprenderá al menos una porción de un gen de interés con una modificación genética deseada, e incluirá regiones de homología con el lugar objetivo, es decir, la copia endógena del gen objetivo en el genoma del huésped. Los constructos de ADN para la integración aleatoria, en contraste con aquellas utilizadas para la recombinación homologa, no necesitan incluir regiones de homología para mediar la recombinación. Se pueden utilizar marcadores en el constructo objetivo o constructo aleatorio para realizar una selección positiva y negativa para la inserción del transgen. Para crear una célula recombinante homologa, por ejemplo, una células madre similar a una embrionaria, recombinante, homologa, célula endógena de placenta o célula exógena cultivada en la placenta, se prepara un vector homólogo de recombinación en el cual se flanquea un gen de interés en sus extremos 5' y 3' mediante secuencias genéticas que son endógenas al genoma de la célula objetivo, para permitir que ocurra una recombinación homologa entre el gen de interés portado por el vector y el gen endógeno en el genoma de la célula objetivo. Las secuencias adicionales de ácido nucleico flanqueante son de longitud suficiente para la recombinación homologa exitosa con el gen endógeno en el genoma de la célula objetivo. Típicamente, se incluyen varias kilobases del ADN flanqueante (tanto en los extremos 5' como 3') en el vector. Los métodos para construir vectores de recombinación homologa y animales recombinantes homólogos de células madre recombinantes son comúnmente conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51: 503; Bradley, 1991, Curr. Opin. Bio/Technol . 2: 823-29; y la Publicación PCT Nos. WO 90/11354, WO 91/01140, y WO 93/04169.

En una modalidad específica, los métodos de Bonadio et al. (Patente Norteamericana No. 5,942,496, titulada Methods and compositions for múltiple gene transfer into bone cells, expedida el 24 Agosto de 1999; y la PCT W095/22611, titulada Methods and compositions for stimulating bone cells, publicada el 24 de Agosto de 1995) se utilizan para introducir ácidos nucleicos en una célula de interés, tal como una célula madre, célula progenitora o célula exógena cultivada en la placenta, por ejemplo, células progenitoras de huesos. 4.6. USOS DE CÉLULAS MADRE Y CÉLULAS PROGENITORAS ACONDICIONADAS PARA DIFERENCIACIÓN 4.6.1. Usos Generales Las células madre y el progenitor CD34+ y CD133+ de la invención se pueden inducir para diferenciar su uso en protocolos de transplante y tratamiento ex vivo. En una modalidad, las poblaciones de células madre se diferencian para un tipo particular de célula y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. En otra modalidad, las poblaciones de células progenitoras se expanden hacia las células progenitoras tempranas y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. En otra modalidad, las poblaciones de células progenitoras se diferencian para un tipo particular de célula, y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico.

Los compuestos de la invención también tienen utilidad en situaciones clínicas en las cuales el transplante tiene el principal objetivo de restaurar la producción de las células de glóbulos blancos de la médula ósea, tal como la reversión de la neutropenia y leucopenia, lo cual resulta de un padecimiento y/o mieloablación clínica. Los compuestos también tienen utilidad en la restauración de la producción de células progenitoras tempranas o granulocitos , lo cual resulta de un padecimiento, diversos efectos secundarios terapéuticos conocidos, o mieloablación. Los compuestos de la invención también tienen utilidad en los casos en los cuales se prefiere la supresión de la generación de las células de glóbulos rojos, sin la supresión de la médula ósea. En ciertas modalidades, se administran células madre que se han tratado con los compuestos de la invención junto con células madre no tratadas, tales como células madre de la sangre del cordón umbilical o sangre periférica, a un paciente en necesidad del mismo. En otras modalidades, se administran células CD34+ ó CD133+ que se han tratado con los compuestos de la invención junto con células no tratadas de la sangre del cordón umbilical o sangre periférica, a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad, se administran células progenitoras CD34+, tratadas desde el primer día del cultivo con un compuesto de la invención, con células no tratadas a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad más específica, la célula progenitora transferida es una célula progenitora CD34+CD38+CD33+ ó CD34+CD38"CD33" . Las células madre, por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias o hematopoyéticas , o células progenitoras, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden formular como un inyectable (ver PCT WO 96/39101, incorporada aquí como referencia en su totalidad) . En una modalidad alternativa, las células y tejidos, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden formular utilizando hidrogeles polimerizables o reticulados como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,709,854; 5,516,532; ó 5,654,381, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad . Se pueden utilizar células madre similares a las embrionarias en lugar de clases específicas de células progenitoras (por ejemplo, condorcitos, hepatocitos, células hematopoyéticas , células parenquimales del páncreas, neuroblastos , células progenitoras de músculos, etc.) en protocolos terapéuticos y de investigación en los cuales se podrían utilizar típicamente células progenitoras. 4.6.2. Reemplazo o Aumento de Tejidos Las células madre, particularmente las células madre similares a las embrionarias, y las células progenitoras , de la invención, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar para una amplia variedad de protocolos terapéuticos dirigidos al transplante o infusión de una población deseada de células, tal como una población de células madres o células progenitoras. Las células madre o progenitoras se pueden utilizar para reemplazar o aumentar tejidos existentes, para introducir tejidos nuevos o alterados, o para unir conjuntamente tejidos o constructos biológicos. En una modalidad preferida de la invención, las células madre, tales como las células madre similares a las embrionarias de la placenta, o las células progenitoras tales como las células progenitoras hematopoyéticas , la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar como transplantes hematopoyéticos autólogos y alogénicos, incluyendo el tipo HLA acoplado y desacoplado. De conformidad con el uso de células madre similares a las embrionarias como transplantes hematopoyéticos alogénicos, puede ser preferible tratar el hospedero para reducir el rechazo inmunológico de las células donadoras, tales como aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,800,539, expedida el 1 de Septiembre de 1998; y la Patente Norteamericana No. 5,806,529 expedida el 15 de Septiembre de 1998, ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia. Por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar en protocolos terapéuticos de transplante, por ejemplo, para aumentar o reemplazar las células madre o progenitoras del hígado, páncreas, riñon, pulmón, sistema nervioso, sistema muscular, huesos, médula ósea, timo, bazo, tejido mucoso, gónadas, o cabello. Asimismo, las células progenitoras hematopoyéticas , la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar en lugar de las células progenitoras endoteliales y de la médula ósea. Las células madre, por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar para el aumento, reparación o reemplazo del cartílago, tendones o ligamentos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se recubren las prótesis (por ejemplo, prótesis de la cadera) con los constructos de tejido de cartílago de reemplazo, desarrollados a partir de células madre similares a las embrionarias de la invención. En otras modalidades, se reconstruyen articulaciones (por ejemplo, rodilla) con constructos de tejido de cartílago desarrolladas a partir de las células madre similares a las embrionarias. Los constructos de tejido de cartílago también se pueden emplear en cirugía mayor reconstructiva para diferentes tipos de articulaciones (para protocolos, ver por ejemplo, Resnick, D., y Niwayama, G. , eels., 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d ed. , W. B. Saunders Co . ) . Las células madre y las células progenitoras tratadas de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar para reparar el daño de tejidos y órganos resultantes de un padecimiento. En tal modalidad, se pueden administrar células madre similares a las embrionarias a un paciente para regenerar o restaurar tejidos u órganos los cuales hayan sido dañados como consecuencia de un padecimiento, por ejemplo, para mejorar el sistema inmune después de una quimioterapia o radiación, para reparar el tejido cardiaco después de un infarto del miocardio. Las células madre y/o progenitoras tratadas de conformidad con los métodos, y con los inhibidores PDE IV, de la invención, o administradas en conjunción con los inhibidores PDE IV de la invención, se pueden transplantar en un individuo en necesidad de las mismas para reparar y/o reemplazar el tejido hepático, pancreático o cardiaco.

Las células madre y las células progenitoras tratadas de conformidad con los métodos de la invención, también se pueden utilizar para aumentar o reemplazar las células de la médula ósea en el transplante de médula ósea. Actualmente se utiliza el transplante autólogo y alogénico de la médula ósea humana como una terapia padecimientos tales como la leucemia, linfoma, y otros padecimientos con peligro de muerte. La desventaja de estos procedimientos, sin embargo, es que una gran cantidad de la médula ósea del donador se debe remover para asegurar que existan suficientes células para el injerto.

Las células madre similares a las embrionarias recolectadas de conformidad con los métodos de la invención, pueden proporcionar células madre y células progenitoras que podrían reducir la necesidad de una gran donación de médula ósea. También podrían, de conformidad con los métodos de la invención, obtener una pequeña donación de médula y luego expandir el número de células madre y células progenitoras cultivarlas y expandirlas en la placenta antes de la infusión o transplante en un receptor. Las grandes cifras de células madre similares a las embrionarias y/o progenitoras obtenidas utilizando los métodos de la invención podrían, en ciertas modalidades, reducir la necesidad de grandes donaciones de médula ósea. Aproximadamente 1 x 108 hasta 2 x 108 células mononucleares de médula ósea por kilogramo del peso del paciente, se deben infundir para el injerto en un transplante de médula ósea (es decir, alrededor de 70 mi de médula para un donador de 70 kg) . Para obtener 70 mi se requiere una donación intensiva y una pérdida significativa de sangre en el proceso de la donación. En una modalidad específica, las células de una pequeña donación de médula ósea (por ejemplo, 7-10 mi) se podrían expandir mediante propagación, por ejemplo en un termentador de placenta, antes de su infusión en un receptor. Las células madre, y las células progenitoras , particularmente las células progenitoras CD34+ ó CD133+, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, pueden proporcionar así células madre y/o progenitoras que podrían reducir o eliminar la necesidad de una gran donación de médula ósea. Las células madre similares a las embrionarias aisladas de la placenta se pueden utilizar, en modalidades específicas, en la terapia de reemplazo de enzimas antologas o heterólogas para tratar padecimientos o condiciones específicas, que incluyen, aunque no están limitados, a padecimientos por almacenamiento de lisosomas, tales como los síndromes de Tay-Sachs, Niemarm-Pick, Fabry, Gaucher, Hunter, Hurler, así como otros gangliosidosos, mucopolisacaridosos , y glicogenosos .

En otras modalidades, las células se pueden utilizar como portadores de transgenes autólogos y heterólogos en la terapia genética para corregir errores congénitos de metabolismo tales como adrenoleucodistrofia, fibrosis cística, padecimiento del almacenamiento de glicógenos, hipotiroidismo, anemia por células falciformes, anemia, síndrome de Pearson, padecimiento de Pompe, fenilcetonuria (PKU) , y padecimiento de Tay-Sachs, pórfirías, alergia urinaria por jarabe de arce, homocistinuria, mucopolisacaridenosis , padecimiento crónico granulomatoso , y tirosinemia, o para tratar el cáncer, tumores u otras condiciones patológicas. En otras modalidades, las células se pueden utilizar en terapias o protocolos autólogo o heterólogo de regeneración o reemplazo de tejidos, que incluyen, pero que no están limitados al tratamiento de defectos epiteliales de la córnea, reparación del cartílago, dermoabrasión facial, membranas mucosas, membranas timpánicas, recubrimientos intestinales, estructuras neurológicas (por ejemplo, retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo) , reparación de quemaduras y heridas por lesiones traumáticas de la piel, transplante de cuero (de cabello), o para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos .

Además, un pequeño número de células madre y células progenitoras normalmente circula en la corriente sanguínea. En otra modalidad, se recolectan tales células madre exógenas o células progenitoras exógenas mediante aféresis, un procedimiento en el cual se extrae sangre, se remueven selectivamente uno o más componentes, y el resto de la sangre se re-infunde en el donador. Las células exógenas recuperadas mediante aféresis se expanden mediante los métodos de la invención, eliminando así por completo la necesidad de una donación de médula ósea. En otra modalidad, se utiliza la expansión de células progenitoras hematopoyéticas de conformidad con los métodos de la invención como un tratamiento suplementario además de la quimioterapia. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos utilizados para tratar específicamente y destruir las células cancerígenas actúan exterminando todas las células proliferantes, es decir, las células que atraviesan la división celular. Puesto que la médula ósea es uno de los tejidos más activamente proliferantes, las células madre hematopoyéticas frecuentemente se dañan o destruyen por los agentes quimioterapéuticos y en consecuencia, disminuye o cesa la producción de células sanguíneas. La quimioterapia se debe terminar a intervalos para permitir al sistema hematopoyético del paciente reponer el suministro de células sanguíneas antes de reanudar la quimioterapia. Puede llevar un mes o más el que las células madre anteriormente quiescentes proliferen e incrementen el conteo de células de glóbulos blancos a niveles aceptables a fin de que la quimioterapia se pueda reanudar (cuando de nuevo, se destruyan las células madre de la médula ósea) . Aunque las células sanguíneas se regeneran entre los tratamientos de quimioterapia, no obstante, el cáncer tiene tiempo de crecer y posiblemente volverse más resistente a los fármacos de la quimioterapia debido a la selección natural . En consecuencia, entre más larga sea la quimioterapia y más corta la duración entre los tratamientos, mayores serán las probabilidades de aniquilar exitosamente el cáncer. Para reducir el tiempo entre los tratamientos de quimioterapia, se podrían introducir en el paciente células madre similares a las embrionarias o las células progenitoras diferenciadas de conformidad con los métodos de la invención. Tal tratamiento podría reducir el tiempo en el que el paciente podría exhibir un conteo bajo de células sanguíneas, y podría por lo tanto permitir la reanudación temprana del tratamiento con quimioterapia . En otra modalidad, se pueden utilizar las células madre de la placenta humana para tratar o prevenir padecimientos genéticos tales como un padecimiento granulomatoso. 4.6.3. Mejora de la Inflamación Las células madre y progenitoras , la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se puede utilizar como agentes anti-inflamatorios en general. Los inventores han descubierto que las células madre o progenitoras, por ejemplo, la sangre del cordón umbilical, cuando se transplantan en un paciente, reducen o eliminan sustancialmente la respuesta inflamatoria. Por consiguiente, en una modalidad, los métodos de la invención comprenden administrar a un paciente que tenga una respuesta inflamatoria, o que sea susceptible a desarrollar una respuesta inflamatoria, células madre o células progenitoras cuya diferenciación de las cuales se ha modulado mediante uno o más de los compuestos de la invención. En modalidades específicas, las células madre son células madre similares a las embrionarias, y las células progenitoras son células madre hematopoyéticas , particularmente células progenitoras CD34+ ó CD133+. Los inventores también han descubierto que el tratamiento de un individuo con los compuestos de las invenciones, es decir, los SelCIDs, estimula el desarrollo y la diferenciación de las células que modulan, mejoran o reducen la respuesta inflamatoria. Por consiguiente, otra modalidad de la invención comprende un método para tratar un individuo que tenga una respuesta inflamatoria, o que sea susceptible a desarrollar una respuesta inflamatoria, que comprende administrar una dosis efectiva o uno o más de los compuestos de la invención a dicho individuo. En otra modalidad, el método comprende poner en contacto las células madre o progenitoras con los compuestos de la invención antes de su administración a dicho individuo, luego administrar una dosis efectiva terapéuticamente de dichas células a dicho individuo. Aún en otra modalidad, se puede co-administrar la célula tratada de ese modo con uno o más de los compuestos de la invención a dicho individuo en dosis efectivas terapéuticamente . En otras modalidades, se puede reducir la inflamación mediante la administración de otros compuestos en combinación con los compuestos y/o células de la invención. Por ejemplo, tales compuestos adicionales pueden comprender esteroides, tales como prednisona, o cualquiera de los agentes no esferoidales anti- inflamatorios, tales como los inhibidores cox-l/cox-2 del ácido acetilsalicílico (aspirina) , ibuprofeno, acetaminofen, inhibidores cox-1 específicos, o derivados de cualquiera de estos compuestos. Tales agentes anti-inflamatorios adicionales se pueden suministrar por cualquier ruta estándar, tal como intravenosamente, tópicamente, intradérmicamente , o mediante inhalación, y se pueden suministrar contemporáneamente con los compuestos y/o células de la invención, o en diferentes ocasiones. Los métodos anteriores se pueden utilizar para tratar cualquier padecimiento o condición asociado con, causado por, o como resultado de una inflamación. Por ejemplo, los métodos se pueden utilizar para tratar la inflamación causada por un trauma tal como una lesión accidental. Los métodos también se pueden utilizar para tratar la inflamación causada por o la lesión que está asociada con procedimiento quirúrgicos, en particular procedimientos quirúrgicos relacionados con los vasos tales como injertos de tejido natural, injertos vasculares sintéticos, válvulas coronarias o angioplastias . Los métodos también se pueden utilizar para prevenir la estenosis o restenosis. Los métodos anteriores también se pueden utilizar para tratar la inflamación resultante de cualquier padecimiento o condición, que incluye aunque no está limitado a padecimientos o condiciones tales como padecimientos cardiacos, aterosclerosis , alergia o hipersensibilidad, padecimiento inmune, padecimiento autoinmune tal como la artritis, o inflamaciones debidas a infecciones. Además de tratar una condición inflamatoria que ya exista, las células y/o compuestos de la invención se pueden administrarse a un individuo profilácticamente, para reducir el caso de inflamación. Esto es particularmente útil como una forma de terapia pre-operatoria , por medio de la cual la reducción de la respuesta inflamatoria post-operatoria mejora las oportunidades de un resultado exitoso y reduce el tiempo de estancia en el hospital y los periodos de incapacidad de un individuo. Se puede lograr un monitoreo de la efectividad del efecto anti-inflamatorio de los tratamientos anteriores mediante cualquier método conocido, tal como inspección visual, exploraciones MRI ó CAT, determinación de la temperatura sistémica o local, etc. Debido a que una proteína conocida como proteína reactiva C es un marcador para la inflamación, la efectividad de los métodos de tratamiento anteriores, se puede monitorear evaluando una reducción en la cantidad de proteína reactiva C en un individuo, particularmente en el área que anteriormente experimentaba inflamación. 4.6.4. Producción de Poblaciones de Células Dendríticas y Células Granulocíticas Los compuestos de la invención se pueden administrar específicamente para modular la diferenciación de las células madre y/o progenitoras a lo largo de una ruta de desarrollo de granulocitos contra una ruta de desarrollo de células dendríticas. De manera similar, la célula de la invención se puede modular in vivo o ex vivo para producir poblaciones expandidas de células dendríticas o granulocitos. Se pueden utilizar células dendríticas como reactivos para las terapias con base en la inmunidad. Por ejemplo, se pueden co-cultivar las células dendríticas con linfocitos T y antígenos de proteína in vi tro, impulsando así la activación ex vivo con antígenos específicos de las células T. Las células T activadas se administran entonces autólogamente para generar una respuesta inmune a antígenos específicos in vivo (WO 97/24438) . En otro ejemplo, se pueden activar las células T in vit.ro poniendo en contacto los linfocitos T con las células dendríticas que expresan directamente una proteína antigénica de un constructo recombinante . Las células T activadas se pueden utilizar para una infusión autóloga (WO 97/29183) . Las células T activadas con péptidos o fragmentos de proteínas específicos se vuelven agentes inmunizantes contra las proteínas, células u organismos a partir de los cuales se derivan los péptidos o fragmentos. Por ejemplo, se pueden cargar células dendríticas con péptidos de tumores específicos. La aplicación específica de la activación ex vivo de las células T impulsadas con DC al tratamiento del cáncer de próstata, se describe y reivindica en la Patente Norteamericana No. 5,788,963. Mayordomo et al. demostró que las células dendríticas derivadas de la médula ósea pulsadas con péptidos de tumores sintéticos suscitan una inmunidad anti-tumorígena protectora y terapéutica (Nature Medicine 1:1297-1302 (1995); J. Exp. Med. , 183:1357-1365 (1996)). La Patente Norteamericana No. 5,698,679 describe proteínas de fusión de la inmunoglobulina que suministran péptidos antigénicos a las células que presentan los antígenos objetivo (APCs) , incluyendo las células dendríticas, in vivo. Esta misma metodología se puede utilizar con péptidos o antígenos derivados de virus, bacterias, o parásitos para crear vacunas virales, bacteriales, o parasíticas. Las células dendríticas también son objetivos para la intervención terapéutica en el tratamiento de diversos padecimientos mediados con inmunidad. Por ejemplo, las células dendríticas que se han involucrado como un jugador importante en la patogénesis y patofisiología del SIDA (por ejemplo, sirven como depósitos para el virus VIH) . Ver Zoeteweij et al., 3. Biomed. Sci . 5(4): 253-259 (1998); Grouard et al., Curr. Opin. Immunol . 9(4):563-567 (1997); eissman et al., Clin. Microbiol. Rev. 10 (2 ): 358 -367 (1997). Los métodos in vi tro para la selección de candidatos farmacéuticos que invaliden la infección VIH de DC, se describen en la Patente Norteamericana No. 5,627,025. En otro ejemplo, se pueden manipular las células dendríticas para inducir la impasibilidad de las células T con respecto al tejido u órgano donador en un receptor (ver la Patente Norteamericana No. 6, 375, 950) . Se pueden utilizar granulocitos en las transfusiones de granulocitos en el tratamiento o prevención de infecciones, por ejemplo, sepsis neonatal bacteriana, infecciones asociadas con la neutropenia en pacientes con cáncer, e infecciones potenciales en pacientes que reciben transplantes de médula ósea. También se pueden utilizar granulocitos en la prevención o tratamiento de alergias. Por ejemplo, los granulocitos involucrados en la inflamación mediada con IgE (es decir, granulocitos recubiertos con anticuerpos IgE algunos de los cuales tienen especificidad con el alérgeno) , se pueden inactivar y utilizar para aliviar los síntomas de una respuesta inmune ya establecida contra el alérgeno (ver la Patente Norteamericana No. 6,383,489). Por consiguiente, en una modalidad de la invención, se expande una población de granulocitos en un individuo de las células progenitoras de la invención mediante un método que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, en donde dicha cantidad es suficiente para inducir la producción de una pluralidad de granulocitos de las células CD34+ endógenas a dicho individuo. En otra modalidad, se expande una población de granulocitos dentro de un individuo mediante un método que comprende administrar a dicho individuo una población de células progenitoras CD34+ ó CD133+, en donde dichas células se han puesto en contacto con un compuesto de la invención durante al menos tres días, y administrar dicha población de células a dicho individuo. En otra modalidad, se expande la población de granulocitos dentro de un individuo mediante un método que comprende administrar a dicho individuo una población de células progenitoras CD34+ ó CD133+ y un compuesto de la invención, en donde la dosis de dicho compuesto de la invención es suficiente para provocar la diferenciación de una pluralidad de dicha población de células en granulocitos. En una modalidad especifica de las modalidades anteriores, dichas células progenitoras CD34+ son células CD34+CD38"CD33+. 4.6.5. Tratamiento de Otros Padecimientos y Condiciones La diferenciación de las células madre o progenitoras de la invención, o los compuestos de la invención, también se pueden utilizar, solos o en combinación, para tratar o prevenir una variedad de otros padecimientos o condiciones. En ciertas modalidades, por ejemplo, el padecimiento o desorden incluyen, pero no están limitados a un padecimiento vascular o cardiovascular, aterosclerosis , diabetes, anemia aplástica, mielodisplasia, infarto del miocardio, trastorno convulsivo, esclerosis múltiple, apoplejía, hipotensión, paro cardiaco, isquemia, inflamación, pérdida de la función cognoscitiva relacionada con la edad, daño por radiación, parálisis cerebral, padecimiento neurodegenerativo, padecimiento de Alzheimer, padecimiento de Parkinson, padecimiento de Leigh, demencia asociada con el SIDA, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , padecimiento renal isquémico, trauma del cerebro o espinal dorsal, derivación de corazón-pulmón, glaucoma, isquemia de la retina, trauma de la retina, padecimientos de almacenamiento de lisosomas, tales como los síndromes de Tay-Sachs, Niemann-Pick, Fabry, Gaucher, Hunter y Hurler, así como otros gangliosidosos , mucopolsacaridosos , y glicogenosos , errores congénitos del metabolismo, adrenoleucodistrofia , fibrosis quística, padecimiento del almacenamiento de glicógenos, hipotiroidismo, anemia de células falciformes, síndrome de Pearson, padecimiento de Pompe, fenilcetonuria (PKU) , pórfirías, alergia urinaria por jarabe de arce, homocistinuria, mucoplisacaridosis , padecimiento crónico granulomatoso, y tirosinemia, padecimiento de Tay-Sachs, cáncer, tumores u otras condiciones patológicas o neoplásticas. En otras modalidades, las células de la invención (por ejemplo, las cuales se han expuesto a los compuestos de la invención) se pueden utilizar en el tratamiento de cualquier tipo de lesión debida a un trauma, particularmente un trauma que involucre inflamación. Los ejemplos de tales condiciones con un trauma incluyen daños al sistema nervioso central (CNS) , que incluyen lesiones al cerebro, espina dorsal, o el tejido que rodea las lesiones del CNS al sistema nervioso periférico (PNS) ; o lesiones a cualquier parte del cuerpo. Tal trauma puede ser provocado por un accidente, o puede ser una consecuencia normal o anormal de un procedimiento médico tal como la cirugía o angioplastia . El trauma puede estar relacionado con una ruptura u oclusión de un vaso sanguíneo, por ejemplo, en la apoplejía o flebitis. En modalidades especificas, las células se pueden utilizar en terapias o protocolos autólogos o heterologos de regeneración o reemplazo de tejidos, que incluyen, aunque no están limitados al tratamiento de defectos en el epitelio de la córnea, reparación de cartílago, dermoabrasión facial, membranas mucosas, membranas timpánicas, recubrimientos intestinales, estructuras neurológicas (por ejemplo, retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo) , reparación de quemaduras y heridas por lesiones traumáticas de la piel, o para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos. En una modalidad específica, el padecimiento o desorden en anemia aplástica, mielodisplasia , leucemia, un padecimiento de la médula ósea o un padecimiento o desorden hematopoyético . En otra modalidad específica, el sujeto es un humano. 4.7. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden una dosificación y/o dosificaciones de uno o más de los compuestos de la invención, en donde dicha dosificación o dosificaciones son efectivas en una administración individual o múltiple, antes a o después del transplante de células madre o progenitoras CD34+ ó CD133+ acondicionadas o no acondicionadas de humano, a un individuo, ejerciendo un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciación de las células madre y/o progenitoras en tipos específicos de células, por ejemplo, células de linaje hematopoyético, particularmente células de linaje mieloide . En este contexto, como en alguna otra parte del contexto de esta invención, "individuo" significa cualquier individuo al cual se administran los compuestos o células, por ejemplo, un mamífero, ave o reptil. Por consiguiente, en una modalidad específica, dicha dosificación o dosificaciones de los compuestos de la invención, se administran a un individuo, para modular la diferenciación de las células progenitoras CD34+ endógenas en células dendríticas. En una modalidad más especifica, la dosificación o dosificaciones incrementan el número de células granulocíticas en dicho individual al que se han administrado dichas dosificación o dosificaciones. En otra modalidad más específica, las dosificación o dosificaciones incrementan el número de células progenitoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38"CD33" en un mamífero al cual se ha administrado dicha dosificación o dosi icaciones . En otras modalidades, se transplantan células madre o progenitoras CD34+ ó CD133+ de interés en un sujeto humano o paciente en necesidad de las mismas. Subsecuente al transplante, se administra un compuesto de la invención al sujeto humano o paciente, para modular la diferenciación de las células transplantadas de interés in vivo. En una modalidad específica, tales células se diferencian in vivo en granulocitos . En aún otras modalidades, la diferenciación de las células madre o progenitoras de interés en un sujeto humano o paciente se modula in si tu mediante la administración de un compuesto de la invención. En aún otra modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las poblaciones aisladas de células madre o progenitoras de la sangre de cordón umbilical que se han aumentado con las células progenitoras hematopoyéticas que se han diferenciado por su exposición a compuestos que inhiben la actividad PDE IV, de conformidad con los métodos de la invención. En otra modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la sangre del cordón umbilical que se suplementa con células madre o progenitoras puestas en contacto con los compuestos de la invención, en una modalidad específica, dichas células madre o progenitoras se han diferenciado mediante dichos compuestos. En aún otra modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tanto uno como más de los inhibidores PDE IV de la invención, y las células madre y/o progenitoras de la invención. Tales composiciones se pueden preparar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 días por adelantado de la administración para modular la diferenciación de las células madre y/o progenitoras a lo largo de diferentes rutas de desarrollo/diferenciación. En aún otra modalidad, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender las células madre o progenitoras en si mismas, en donde dichas células se han diferenciado de conformidad con los métodos descritos aquí. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células madre y/o células progenitoras en donde dicha pluralidad de células madre y/o progenitoras se han puesto en contacto con uno o más de los inhibidores PDE IV de la invención en una concentración y durante una duración suficiente para dicho (s) compuestos (s) para modular la diferenciación de dichas células. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden los compuestos de la invención, administrados a un individuo; las células de la invención, administradas a un individuo, en combinación con los compuestos de la invención, administrados por separado; y las células de la invención, se ponen en contacto con los compuestos de la invención, administrados a dicho individuo. La invención proporciona métodos de tratamiento y prevención de un padecimiento o desorden mediante la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto o una composición de la invención a un mamífero, preferiblemente un sujeto humano, con el fin de efectuar la modulación de la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras CD34+ ó CD133+ o células madre transplantadas a, o que residen dentro del sujeto. En una modalidad, la invención proporciona un método para modular la diferenciación de células madre o progenitoras CD34+ y CD133+ para incrementar dentro de un mamífero el número de células granulocíticas. En otra modalidad, cualquier linaje de células que se puede derivar de una células madre o progenitora CD34+ y/o CD133+ se, puede modular mediante la administración de los compuestos de la invención a un mamífero, preferiblemente a un humano. El término "mamífero" como se utiliza aquí, abarca cualquier mamífero. Preferiblemente un mamífero que tenga la necesidad de tal tratamiento o prevención'. Los ejemplos de mamíferos incluyen, aunque no están limitados a, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, monos, etc., más preferiblemente, un humano . La administración de los compuestos de la invención puede ser sistémica o local. En la mayoría de los casos, la administración a un mamífero dará como resultado la liberación sistémica de los compuestos de la invención (es decir, en la corriente sanguínea) . Los métodos de administración incluyen rutas entérales tales como oral, bucal, sublingual, y rectal; administración tópica, tal como transdérmica e intradérmica ; y administración parenteral . Las rutas parenterales adecuadas incluyen la inyección mediante una aguja hipodérmica o catéter, por ejemplo, inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal , intraarterial , intraventricular, intratecal, intraocular e intracameral y rutas no inyectables, tales como administración intravaginal , rectal, o nasal. Preferiblemente, los compuestos y composiciones de la invención se administran oralmente. En modalidades específicas, puede ser deseable administrar uno o más compuestos de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con una venda para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, dicho implante es de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, que incluye membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras . Los compuestos de la invención se pueden administrar a través de sistemas de administración típicos así como no estándares, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas , microcápsulas , cápsulas, etc. Por ejemplo, los compuestos y composiciones de la invención se pueden suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., en Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp . 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid. , pp. 317-327; ver por lo general el ibídem.) . En otro ejemplo, los compuestos y composiciones de la invención se pueden suministrar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC CriL. Ref Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507 Saudek et al., 1989, N. Engl . J. Med. 3:574). En otro ejemplo. se pueden utilizar materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Press., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol . Chem. 2_3:61; ver también Levy et al., 1985, Science 228 ; 190 ; During et al., 1989, Ann. Neurol . 23:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105) . En todavía otro ejemplo, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad al área objetivo a ser tratada, por ejemplo, el hígado, requiriendo así solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol . 2, p . 115-138 (1984)). Se pueden utilizar otros sistemas de liberación controlada descritos en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533) . Cuando se administran como una composición, se formulará un compuesto de la invención con una cantidad adecuada de un vehículo o portador aceptable farmacéuticamente para proporcionar la forma para una administración apropiada al mamífero. El término "aceptable farmacéuticamente" significa aprobado por una agencia de regulación del gobierno federal o de un gobierno estatal, o listado en la Farmacopea Norteamericana u otra farmacopea reconocida generalmente, para su uso en mamíferos, y más particularmente en humanos. El término "vehículo", se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o portador con el cual un compuesto de la invención se formula para su administración a un mamífero. Tales vehículos f rmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, que incluyen aquéllos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los vehículos farmacéuticos pueden ser de solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea, y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizadores, espesantes, lubricantes y colorantes. Preferiblemente, cuando se administran a un mamífero, los compuestos y composiciones de la invención y los vehículos, excipientes o diluyentes aceptables farmacéuticamente, son estériles. Un medio acuoso es un vehículo preferido cuando se administra intravenosamente el compuesto de la invención, tal como agua, soluciones salinas, y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol. Los presentes compuestos y composiciones pueden tener la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, comprimidos, grageas, polvos, granulos, jarabes, elixires, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, o cualquier otra forma adecuada para su administración a un mamífero. En una modalidad preferida, los compuestos y composiciones de la invención se formulan para su administración de conformidad con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración oral o intravenosa a humanos. En una modalidad, el vehículo aceptable farmacéuticamente es una cápsula de gelatina dura. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados y métodos para la formulación de los mismos, se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed. , Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed.( 1995, Capítulos 86, 87, 88, 91, y 92, incorporada aquí como referencia . Los compuestos y composiciones de la invención formulados para suministro oral, preferiblemente están la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, o cualquier forma farmacéutica comprimida. Además, cuando están en la forma de tableta o pildora, los compuestos y composiciones de la invención se pueden recubrir para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal proporcionando de este modo una acción sostenida durante un periodo de tiempo prolongado. Las membranas permeables selectivamente que circundan un compuesto conductor activo osmóticamente, también son adecuados para administrar oralmente compuestos y composiciones de la invención. En estas últimas plataformas, el fluido del ambiente que rodea la cápsula se impregna por el compuesto conductor que se hincha para desplazar el agente o composición de agentes a través de una abertura. Estas plataformas de suministro pueden proporcionar un perfil de suministro esencialmente en el orden de cero a diferencia de los perfiles de elevaciones máximas de las formulaciones de liberación intermediada. También se puede utilizar un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir vehículos, excipientes, y diluyentes estándar, tales como estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, silicato de calcio, celulosa microcristalina , polivinilpirrolidona, agua, jarabe, y metilcelulosa, las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio, aceite mineral, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservadores tales como metil- y propilhidroxibenzoatos. Tales vehículos preferiblemente son de calidad farmacéutica. Los compuestos y composiciones administrados oralmente de la invención pueden incluir opcionalmente uno o más agentes edulcorantes, tales como fructosa, aspartamo o sacarina, uno o más agentes saborizantes tales como hierbabuena, aceite de gaulteria, o cereza; o uno o más agentes colorantes para proporcionar una preparación apetecible farmacéuticamente. Un régimen de dosificación efectiva terapéuticamente para el tratamiento de un desorden o condición particular dependerá de su naturaleza y severidad, y se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar de conformidad con la opinión de un practicante médico. Además, se pueden utilizar ensayos in vi tro o in vivo para ayudar a identificar dosificaciones óptimas. Por supuesto, la cantidad de un compuesto de la invención que constituye una dosis efectiva terapéuticamente también depende de la ruta de administración. En general, los rangos adecuados de dosificación para administración oral son de alrededor de 0.001 miligramos a alrededor de 20 miligramos de un compuesto de la invención por kilogramo del peso corporal por día, preferiblemente, alrededor de 0.7 miligramos hasta alrededor de 6 miligramos, más preferiblemente, desde alrededor de 1.5 miligramos hasta alrededor de 4.5 miligramos. En una modalidad preferida, un mamífero, preferiblemente, un humano se administra oralmente con alrededor de 0.01 mg hasta alrededor de 1000 mg de un compuesto de la invención por día, más preferiblemente, alrededor de 0.1 mg hasta alrededor de 300 mg por día, o alrededor de 1 mg hasta alrededor de 250 mg en dosis individuales o divididas. Las cantidades de dosificación descritas aquí se refieren a cantidades totales administradas; es decir, si se administra más de un compuesto de la invención, las dosificaciones preferidas corresponderán a la cantidad total de los compuestos de la invención administrados. Las composiciones orales preferiblemente contienen de 10% a 95% en peso de un compuesto de la invención. Las formas preferidas de dosificación oral unitaria incluyen pildoras, tabletas, y cápsulas, más preferiblemente cápsulas. Típicamente tales formas de dosificación unitaria contendrán alrededor de 0.01 mg, 0.1 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, ó 500 mg de un compuesto de la invención, preferiblemente, desde alrededor de 5 mg hasta alrededor de 200 mg del compuesto por dosificación unitaria. En otra modalidad, los compuestos y composiciones de la invención se pueden administrar parenteralmente (por ejemplo, mediante rutas intramusculares, intratecales , intravenosas, e intraarteriales) , preferiblemente, intravenosamente. Típicamente, los compuestos y composiciones de la invención para una administración intravenosa, son soluciones en vehículos acuosos, isotónicos, estériles, tales como agua, solución salina, solución de Ringer, o solución de dextrosa. Cuando sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente de solubilización . Las composiciones para administración intravenosa opcionalmente pueden incluir un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Para la administración intravenosa, los compuestos y composiciones de la invención se pueden suministrar como un polvo liofilizado, seco, estéril, o un concentrado libre de agua en un contenedor sellado herméticamente, tal como una ampolleta o sachette, el contenedor indica la cantidad de un agente activo. Tal polvo o concentrado se diluye entonces con un medio acuoso apropiado antes de la administración intravenosa. Se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril, solución salina, otro medio acuoso apropiado con el polvo o concentrado para su dilución antes de la administración. O se pueden suministrar las composiciones en forma pre-mezclada , lista para su administración. Cuando un compuesto y composición de la invención se va a administrar mediante infusión intravenosa, se puede distribuir, por ejemplo, con un frasco de infusión que contenga agua de calidad farmacéutica, solución salina, u otro medio adecuado. Se puede efectuar la administración rectal a través del uso de supositorios formulados a partir de portadores convencionales tales como manteca de cacao, aceites vegetales modificados, y otras bases. Los supositorios se pueden formular mediante métodos bien conocidos utilizando formulaciones bien conocidas, por ejemplo, ver Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed. , 1995, pp . 1591-1597, incorporada aquí como referencia. Para formular y administrar formas de dosificación tópicas, se pueden utilizar medios bien conocidos de suministro transdérmico e intradérmico tales como lociones, cremas, y ungüentos y dispositivos de suministro transdérmicos tales como parches (Ghosh, T.K. Pfister, W.R. ; Yum, S.I. Transder al and Topical Drug Delivery Systems, Interpharm Press, Inc. p. 249-297, incorporada aquí como referencia). Por ejemplo, un diseño de parche de tipo depósito puede comprender una película de respaldo revestida con un adhesivo, y un compartimiento de depósito que comprende un compuesto o composiciones de la invención, que se separa de la piel mediante una membrana semipermeable (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,615,699, incorporada aquí como referencia) . La capa de respaldo revestida con adhesivo se extiende alrededor de los bordes del depósito para proporcionar un sello concéntrico con la piel y para mantener el depósito adyacente a la piel. La invención también proporciona paquetes o equipos farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores rellenos con uno o más compuestos de la invención. Opcionalmente puede estar asociada con tal (es) contenedor (s) , una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuya notificación refleje la aprobación de la agencia de fabricación, para su uso o venta para administración humana. En una modalidad, el equipo contiene más de un compuesto de la invención. En otra modalidad, el equipo comprende un compuesto de la invención y otro agente activo biológicamente. Los compuestos de la invención preferiblemente se evalúan in vi tro e in vivo, para la actividad terapéutica o prolifáctica deseada, antes de su uso en humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos in vi tro para determinar si se prefiere la administración de un compuesto específico de la invención o una combinación de compuestos de la invención. Los compuestos y composiciones de la invención también puede demostrar ser efectiva y seguridad utilizando sistemas con modelos animales. Otros métodos serán conocidos para el experto y están dentro del alcance de la invención. 4.8. ENSAYOS UTILIZANDO LOS MÉTODOS DE LA INVENCIÓN La metodología descrita anteriormente, es decir, el examen del efecto de los SelCIDs sobre la diferenciación en las células progenitoras tempranas, tales como células CD34+, se puede aplicar a cualquier compuesto de interés, el efecto del cual se desea en la diferenciación que es conocida. Esto se puede lograr de diversas maneras . En una modalidad, el compuesto simplemente se puede sustituir por un SelCID o cualquiera de los otros compuestos de la invención. Aquí, las células progenitoras CD34+ y/o células progenitoras CD133+ se pueden poner en contacto con el compuesto de interés, en diversas concentraciones, bajo condiciones que permitan la proliferación y/o diferenciación de las células progenitoras en células consignadas y/o totalmente diferenciadas. Se pueden utilizar los métodos de cultivo descritos aquí, particularmente los métodos de cultivo descritos en la Sección 4.4. El efecto, si existe, del compuesto de interés se determina evaluando el cambio, si existe, en las poblaciones de células que se diferencian de las células progenitoras, donde el cambio se puede monitorear mediante cualquier cambio fenotípico, pero preferiblemente se evalúa determinando los marcadores de superficie celular que están presentes o ausentes. Al igual que los métodos de la invención, el compuesto de interés se puede administrar en una dosis individual en cualquier momento a partir del cultivo inicial para el logro de la(s) célula (s) finalmente diferenciada (s) . Alternativamente, el compuesto de interés se puede administrar en dosis múltiples durante la etapa de proliferación, la etapa de diferenciación, o ambas. El cambio en las características fenotípicas de las células progenitoras de proliferación/diferenciación, preferiblemente se compara con un cultivo de control de células, tales como las células tratadas con DMSO . Podría ser de interés particular cualquier efecto en la proliferación o diferenciación tal como, pero no limitado a: la modulación de la relación de proliferación; la modulación de la relación de diferenciación; la modulación de la diferenciación de las células progenitoras en células precursoras consignadas específicas; el bloqueo de la diferenciación en tipos particulares de células; y la mejora en la diferenciación en tipos particulares de células. En otra modalidad, el cultivo, la proliferación y la diferenciación tienen lugar como se mencionó anteriormente, aunque el compuesto de interés se pone en contacto con la(s) célula (s) progenitora (s) junto con un inhibidor PDE IV, tal como un SelCID™. De esta manera, se pueden determinar los efectos, posiblemente sinérgicos, de los múltiples compuestos. Podría ser de particular interés cualquier compuesto que no tenga, o que tenga un ligero efecto solamente en la proliferación o diferenciación, pero que tengan un efecto significativo en combinación con un SelCID™ o profármaco del mismo. En otra modalidad, cualquiera de los dos compuestos se puede poner en contacto con las células progenitoras bajo condiciones de cultivo, como se mencionó anteriormente, que normalmente permiten la proliferación y diferenciación de las células progenitoras. Aquí, preferiblemente un experimento en el cual las células precursoras se ponen en contacto con dos compuestos de interés, contiene un control en el cual las células progenitoras se ponen en contacto solamente con uno de cada uno de dichos compuestos; un control en el cual las células se ponen en contacto con un inhibidor PDE IV, tal como un SelCID™, y un control en el cual las células no se ponen en contacto con un compuesto, o se ponen en contacto con DMSO . De nuevo, las variaciones en las dosificaciones, y el momento oportuno de dosificación, son como se describen anteriormente en la Sección 4.4. 5. EJEMPLOS DE TRABAJO 5.1. EJEMPLO 1: Efectos de los Inhibidores PDE IV en la Diferenciación de las Células Progenitoras CD34+ El siguiente ensayo se utiliza para determinar los efectos de los inhibidores PDE IV en la diferenciación de las células CD34+ (progenitores hematopoyéticos) y la generación de unidades formadoras de colonias (CFU) . De manera significativa, el ensayo demuestra la capacidad de los inhibidores PDE IV para suprimir específicamente la generación de colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar la generación de colonias formadoras tanto de leucocitos como de plaquetas (CFU-GM) y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias (CFU-Total) . Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de formación de colonias, que proporciona beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción de plaquetas. Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ de sangre de cordón umbilical, se colocan en placas en platos de cultivo 96 pozos a una densidad de 1000 células por pozo en IMDM suplementado con suero de ternera fetal al 20% y citocinas (IL-3, G-CSF y equipo-ligando (R&D Systems, Inc.). Las células se exponen a uno o más inhibidores PDE IV, o DMSO (un compuesto de control), y se dejan cultivar durante 6 días. Las células CD34+ de sangre de cordón umbilical se colocan en placas en platos de cultivo de 96 pozos a una densidad de 1000 células por pozo en IMDM suplementado con suero de ternera fetal al 20% y citocinas (IL-3, G-CSF y equipo-ligand (KL) (R&D Systems, Inc.)). Después del cultivo, las células se tiñen y se clasifican con un clasificador de células activado con fluorescencia (FACS) . Se cosechan 400 ^L de células teñidas y se diluyen a 1.0 mi con suero de ternera fetal al 1% en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se cuantifican las células para determinar el efecto de la modulación de la diferenciación de las células madre. Los resultados mostrarán la supresión de la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , el aumento tanto de la generación de leucocitos como de las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) , y la mejora en la producción total de la unidad formadora de colonias. Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias específicas, proporcionando beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción plaquetas mediante la consignación de las células madre originales hacia los linajes injertables deseados. 5.2. EJEMPLO 2: Efectos de los Inhibidores PDE IV en la Diferenciación de las Células Progenitoras CD34+ de Sangre del Cordón Umbilical de Humano. En el siguiente ejemplo, se estudia el efecto de los inhibidores PDE IV en la proliferación y diferenciación de las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical (CB) en las células mononucleares CD34+ (progenitor hematopoyético) . Las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical, son una población mezclada de células que incluyen una pequeña población de células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) . Un subconjunto de esta pequeña población de células CD34+ incluye una población (aproximadamente 1% del total de las células mononucleares CB) de células CD34+CD38+ y una población aún más pequeña (menos del 1% del total de las células mononucleares CB) de las células CD34+CD38-. En forma significativa, los inhibidores PDE IV provocarán una sobre-regulación (diferenciación incrementada) de células CD34+, y la inhibición o retardo de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas o células progenitoras comparadas con controles positivos y negativos . 5.2.1. Materiales y Métodos Las células CB CD34+ se inician a 4xl04 células/ml en una placa de 24 pozos en FCS IMDM al 20% (suero de ternera fetal/Medio Dulbecco Modificado de Iscove) suplementado con citocinas (IL-3, G-CSF y equipo-ligando) (R&D Systems, Inc.). Se incluyen inhibidores PDE IV en el cultivo en diversas concentraciones. Los mismos volúmenes de DMSO se utilizan como controles. También se utiliza un control negativo sin ningún compuesto. Las células se cultivan a 37 °C y C02 al 5% en un incubador humidificado durante 7 días. Luego las células se cosechan desde cada pozo.

Se determina el número total de células de cada pozo cuantificándolas en un CELL-DY ® 1700 (Abbott Diagnostics) y se analiza la expresión de CXCR4 , CD45, CD34, CD38, CDllb y la expresión de Gly-A mediante teñido por FACS (clasificación de células activadas con fluorescencia) . 5.3. EJEMPLO 3: Efecto de los Inhibidores PDE IV en las Células MNC de Sangre del Cordón Umbilical de Humano Las MNCs de sangre del cordón umbilical que se han criopreservado y descongelado utilizando métodos estándar, se aislan mediante un método estándar de separación de Ficoll y se cultivan en una placa de 24 pozos a 0.5x10s células/ml en un FCS-IMD al 20% con citocinas (10 ng/ml de cada uno de IL6, KL y G-CSF) por triplicado. Los grupos experimentales son Sin Concentración (citocinas solamente), DIVISO (1.7 ul) , y concentraciones diversas de un inhibidor PDE IV en DMSO. Las células cultivadas se cosechan y se analizan mediante el teñido FACS después de 1 semana de cultivo. 5.4. EJEMPLO 4: Efecto de los Inhibidores PDE IV en la Producción de Monocitos Se cultivan células purificadas CD34+ de sangre del cordón umbilical de humano (más del 90% de CD34+) en un medio FCS IMDM al 20% suplementado con citocinas (IL3, IL6, G-CSF, KL y Epo) a 4 x 104 células/ml durante 14 días a 37 °C en un incubador humidificado de C02 al 5%. Los grupos experimentales consisten de un grupo en el cual (i) no se agrega DMSO ni compuestos químicos ("None"), (ii) DMSO solamente, y (iii) un inhibidor PDE IV disuelto en DMSO. Se cosechan y se tiñen las alícuotas de células con un anticuerpo monoclonal conjugado CD34-PE y anticuerpo monoclonal conjugado CD14-FITC. 5.5. EJEMPLO 5: Efecto de los Inhibidores PDE IV en las Células Nucleadas Transplantadas de Sangre de Cordón Umbilical y de la Placenta Este experimento demuestra que el pre-tratamiento con el inhibidor PDE IV incrementa la supervivencia de las células nucleadas transplantadas de placenta (PLNC) , células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y células de médula ósea (BM C) . Las células nucleadas transplantadas de placenta (PLNC) , las células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y las células de médula ósea (BMNC) se obtienen de donadores humanos. Las PLNC y UCBNC se obtienen de la placenta y del cordón umbilical. Las células se pretratan incubando las mismas en DMEM suplementado con suero de CB de humano al 2% con 10 /¿g/ml de un inhibidor PDE IV durante 24 horas. Las células luego se lavan, se resuspenden en plasma autólogo y se administran intravenosamente a ratones adultos SJL/L receptores (Jackson Laboratories) a los que se les ha realizado la extirpación de la médula ósea mediante irradiación letal (900cGy) de conformidad con los métodos estándar. Tal irradiación es mejor que una post- irradiación de 50 días letal a un 90% (Ende et al, 2001, Life Sciences 69 (13) : 1531-1539; Chen y Ende, 2000, J. Med. 31: 21-30; Ende et al., 2000, Life Sci . 67(l):53-9; Ende y Chen, 2000, Am. J. Clin. Pathol . 114:89). 5.6. EJEMPLO 6: Efectos de los SelCIDs™ en la Diferenciación de las Células Progenitoras CD34+ El siguiente ejemplo analiza los efectos de los SelCIDs™ en la diferenciación de las células CD34+ (progenitor hematopoyético) y la generación de unidades formadoras de colonias (CFU) . De manera significativa, los resultados demuestran que los SelCIDs™ se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias (CFU-Total) . Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias, que proporciona beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o producción de plaquetas. Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ de sangre de cordón umbilical, se colocan en placas en platos de cultivo 96 pozos a una densidad de 1000 células por pozo en IMDM suplementado con suero de ternera fetal al 20% y citocinas (IL-3, G-CSF y equipo-conjunto (R&D Systems, Inc.). Las células se exponen a los SelCIDs™ o DMSO (un compuesto de control), y se dejan cultivar durante 6 días. Las células CD34+ de sangre de cordón umbilical se colocan en placas en platos de cultivo de 96 pozos a una densidad de 1000 células por pozo en IMDM suplementado con suero de ternera fetal al 20% y citocinas (IL-3, GCSF y eauipo-ligando (KL) (R&D Systems, Inc.)). Después del cultivo, las células se tiñen y se clasifican con un clasificador de células activado con fluorescencia (FACS) . Se cosechan 400 µL de células teñidas y se diluyen a 1.0 mi con suero de ternera fetal al 1% en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se cuantifican las células para determinar el efecto de la modulación de la diferenciación de las células madre. Los compuestos de la invención son efectivos en la modulación de la consignación de las células madre progenitoras, hematopoyéticas. Por consiguiente, se pueden utilizar los SelCIDs™ para suprimir específicamente la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) , y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias específicas, proporcionando beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción plaquetas mediante la presentación de las células madre de origen hacia los linajes injertables deseados. 5.7. EJEMPLO 7: Efectos de los SelCIDs™ en la Proliferación y Diferenciación de las Células CD34+ de Sangre del Cordón Umbilical de Humano En el siguiente ejemplo, se estudian los efectos de los SelCIDs™ en la proliferación y diferenciación de las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical (CB) en las células mononucleares CD34+ (progenitor hematopoyético) . Las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical, son una población mezclada de células que incluyen una pequeña población de células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) . Un subconjunto de esta pequeña población de células CD34+ incluye una población (aproximadamente 1% del total de las células mononucleares CB) de células CD34+CD38+ y una población aún más pequeña (menos del 1% del total de las células mononucleares CB) de las células CD34+CD38-. Los SelCIDs™ provocan una sobre-regulación (diferenciación incrementada) de células CD34+, y aparentemente pueden inhibir o retardar la diferenciación de las células madre o células progenitoras hematopoyéticas comparadas con controles positivos y negativos. 5.7.1. Materiales y Métodos Las células CB CD34+ se inician a 4xl04 células/ml en una placa de 24 pozos en FCS IMDM al 20% (suero de ternera fetal/Medio Dulbecco Modificado de Iscove) suplementado con citocinas (IL-3, GCSF y equipo-ligando) (R&D Systems, Inc.). Se incluyen SelCIDs™ en el cultivo en tres diferentes concentraciones: 5 µg/ml, 1 /¿g/mL, y 0.3 g/mL. Los mismos volúmenes de DMSO se utilizan como controles. También se utiliza un control negativo sin ningún compuesto. Las células se cultivan a 37°C y C02 al 5% en un incubador humidificado durante 7 días. Luego las células se cosechan desde cada pozo.

Se determina el número total de células de cada pozo cuantificándolas en un CELL-DYN® 1700 (Abbott Diagnostics) y se analiza la expresión de CXCR4 , CD45, CD34, CD38, CD 1 Ib y la expresión de Gly-A mediante teñido por FACS (clasificación de células activada con fluorescencia) . Se cultivan, evalúan y analizan las células CB de dos diferentes donadores (CB2276 y CB2417) . 5.7.2. Resultados y Discusión Se prueban los efectos de los SelCIDs™ en la expansión estimulada con citocinas de las células CD34+. Los SelCIDs™ no tienen un efecto significativo en la proliferación de las células CD34+ que se cultivan en la presencia de IL-3, equipóligand (KL) y G-CSF, cuando se comparan con el control negativo. Sin embargo, se espera que los SelCIDs™ induzcan un rendimiento de un número superior de células, cuando se comparen con el control de DMSO. Los efectos de los SelCIDs™ en la expresión de la diferenciación de células se analizan mediante análisis FACS de proteínas superficiales CXCR4 y CD34. Se espera que lo SelCIDs™ muestren un efecto inhibidor sobre la expresión del CXC4R. Con respecto a la proteína de superficie CD34+, se espera que los SelCIDs™ provoquen una sobre-regulación (proliferación incrementada) de células CD34+. En las células tratadas con SelCID™, la mayoría de las células CD34+ y CD34" serán CD38", mientras que las células en las poblaciones tratadas con DMSO y el control principalmente serán CD38+.

Esto indica que los SelCIDs™ se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) , y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias específicas, proporcionando beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos; y/o la producción plaquetas. Se analiza el efecto de los SelCIDs™ en la expresión de la diferenciación de células mediante un análisis por FACS de las proteínas de superficie de las células que son CD34+CD38-contra las CD34-CD38+ o que son CDllb+. Se disminuye el nivel de la expresión de CD1 Ib en las células tratadas con SelCIDs™, cuando se determina por medio de inmunofluorescencia (MIF) , para indicar que se reprime la expresión de CDllb. Por lo tanto las células CDllb+ están en un estado menos diferenciado cuando se cultivan en la presencia de SelCIDs™. 5.8. EJEMPLO 8: Efectos de los SelCIDs™ en las Células MNC de Sangre de Cordón Umbilical de Humano En los ejemplos previos, se espera que los SelCIDs™ sub-regulen significativamente la expresión del CXCR4 en las células CD34+ de la sangre del cordón umbilical y que incrementen la población de las células CD34+CD38". En este ejemplo, se muestra que los SelCIDs™ tienen actividades similares en las células mononucleadas de la sangre del cordón umbilical (M C) . Las MNCs de la sangre de cordón umbilical que se han criopreservado y descongelado utilizando métodos estándar, se aislan mediante un método estándar de separación de Ficoll y se cultivan en una placa de 24 pozos a 0.5xl06 células/ml en un FCS-IMD al 20% con citocinas (10 ng/ml de cada uno de IL6, KL y G-CSF) por triplicado. Los grupos experimentales son Sin concentración (citocinas solamente), DMSO (1.7 µ?) , SelCIDs™ (5.0 /xg en 1.7 µ? de DMSO). Las células cultivadas se cosechan y se analizan mediante el teñido con FACS después de 1 semana de cultivo. El número total de células de MNCs cultivadas con DMSO, se espera que sea menor que en el grupo de control ("Sin concentración", citocinas solamente). Los cultivos de células que se cultivan con MID 1 deben exhibir un porcentaje superior de células CD34+ que todos los otros grupos, mientras que el número total de células CD34+ debe ser similar en todos los grupos. El número de células CD34+CD38- será significativamente superior en las células tratadas con SelCIDs™, el cual es consistente con los resultados del tratamiento de las células CD34+ purificadas con los compuestos. Es bien aceptado que las células CD34+CD38- sean una célula progenitora hematopoyética menos diferenciada la cual se injerta y prolifera después del transplante en una eficiencia superior que las células CD34+CD38+ (Dao et al. 1998, Blood 91 (4) : 1243-55; Huang et al., 1994, Blood 83(6): 1515-26) . Una mayoría de las células CXCR4+ en los cultivos de las células tratadas con SelCIDs™ son CD45 negativas. Esta población de células es significativamente superior en las células tratadas con SelCIDs™. Los resultados indican que el SelCIDs™ es útil en el acondicionamiento de las células madre para contrarrestar los efectos nocivos de la criopreservación, deshielo y/o exposición a los crioconservadores en las células madre. Los resultados además indican que la supresión mediante DMSO de la producción de células CD34+ y CD14+, se puede contrarrestar tratándola con SelCIDs™, el cual mejora aquella capacidad de proliferativa de las células CD34+ y CD14+. 5.9. EJEMPLO 9: Efectos de los SelCIDs™ en la Producción de Monocitos Se cultivan células purificadas CD34+ de sangre de cordón umbilical de humano (más del 90% de CD34+) en un medio FCS IMDM al 20% suplementado con citocinas (IL3, IL6, G-CSF, KL y Epo) a 4 x 104 células/ml durante 14 días a 37°C en un incubador humidificado con C02 al 5%. Los grupos experimentales consisten de un grupo en el cual (i) no se agrega DMSO o compuestos químicos ("Sin concentración")/ (ii) DMSO solamente, y (iii) SelCIDs™ disueltos en DMSO. Se cosechan y se tiñen las alícuotas de células con un anticuerpo monoclonal conjugado CD34-PE y un anticuerpo monoclonal conjugado CD14-FITC. Se espera que el grupo tratado con SelCIDs™ muestre un porcentaje significativamente superior de células CD34+ al de los grupos de control. Además, la producción de monocitos disminuye, como se pone en evidencia por una disminución en el número de células CD14+. 5.10. EJEMPLO 10: Efecto del Tratamiento con SelCIDs™ en las Células Nucleadas Transplantadas de Sangre de Cordón Umbilical y de Placenta Este experimento demuestra que el pre- tratamiento con SelCIDs™ incrementa la supervivencia de las células nucleadas transplantadas de placenta (PLNC) , células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y células de médula ósea (BMNC) . Las células nucleadas transplantadas de placenta (PLNC) , las células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y las células de médula ósea (BMNC) se obtienen de donadores humanos. Las PLNC y UCBNC se obtienen de la placenta y del cordón umbilical. Las células se pretratan mediante la incubación de las mismas en DMEM suplementado con suero de CB de humano al 2% con 10 g/ml de SelCIDs™ durante 24 horas. Las células luego se lavan, se resuspenden en plasma autólogo y se administran intravenosamente a ratones adultos SJL/L receptores (Jackson Laboratories) a los que se les ha realizado la extirpación de la médula ósea mediante irradiación letal (900cGy) de conformidad con los métodos estándar. Tal irradiación es mejor que una post- irradiación de 50 días letal a un 90% (Ende et al, 2001, Life Sciences 69 (13) : 1531-1539 ; Chen y Ende, 2000, J. Med. 31: 21-30; Ende et al., 2000, Life Sci . 67(l) :53-9; Ende y Chen, 2000, Am. J. Clin. Pathol . 114: 89) . El tratamiento con SelCIDs™ incrementa la supervivencia de las células nucleadas transplantadas de placenta (PLNC) , las células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y de las células de médula ósea (BMNC) . 5.11. EJEMPLO 11: Modulación de la Diferenciación de las Células Progenitoras CD34+ Se obtienen células progenitoras CD34+ de médula ósea y sangre de cordón umbilical de Clonetics y se cultivan en MDM de Iscove con BIT 95000 (StemCell Technologies) en la presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF- durante 6 días, y luego en la presencia de GM-CSF y TNF-OÍ durante 6 días adicionales . Análisis del fenotipo superficial de células: Las células se procesan para un teñido doble (30 min. a 4°C) en el día 6 y día 12 utilizando ttiABs conjugado con FITC y PE. Se utilizan anticuerpos de BD Pharmingen: CD34 (PE) , CD38 (FITC) , CD33 (FITC) , CDla (FITC) , CD86 (PE) , CD14 (PE) , CD83 (PE) , CD54 (PE) , CDllb (PE) , CDllC (PE) , HLA-DR (PE) , CD15 (FITC) , y CD133 (PE) de Miltenyi. Se realiza un análisis de fluorescencia en un citómetro de flujo después de la adquisición de 10,000 casos (Coulter) . Detección de apoptosis : Se determina la exposición de la fosfatidil serina utilizando un teñido Annexin V-FITC en combinación con yoduro de propidio (equipo I de detección de apoptosis de BD Pharmingen) siguiendo las instrucciones del fabricante . Fagocitosis: La actividad endocítica de las células se analiza midiendo la absorción con FITC-dextrano . Se incuban células con 1 mg/ml de dextrano-FITC (Sigma) en un medio completo a 37 °C durante 1 hora y 4°C durante 1 hora como un control negativo. Ensayo de proliferación de las células T: Después de 13 días de cultivo, se recolectan las células DC derivadas de CD34+, y después del tratamiento con mitotnicina C (50 µg/ml, Sigma) , se utilizan como células estimuladoras para las células alogénicas T CD3+ de adulto purificadas de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de voluntarios saludables. Las células T CD3+ de respuesta se utilizan a una concentración de 5 x 104 células/pozo. Se agregan células estimuladoras en dosis graduadas a las células T en placas de cultivo de tejido, de color negro, de 96 pozos, de fondo plano, con fondo claro, para la detección de quimioluminiscencia . Los cultivos se realizan en un medio RPMI 1640 suplementado con FBS inactivado con calor al 10%, glutamina y Penicilina-estreptomicina. Después de 6 días de cultivo, se mide la proliferación de células con el ensayo de quimioluminiscencia BrdU (Roche, Nutley NJ) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan como la media + SD obtenida de los cultivos por triplicado. Los SelCIDs™ pueden alterar significativamente el desarrollo de las DC de los progenitores CD34'. Para estudiar el efecto de los SelCIDs™ en la generación de DC, se cultivan células progenitoras CD34+ con o sin SelCIDs™ (1 µ?) por un periodo de 12 días durante la fase de expansión y maduración (día 1 a día 12) , o un periodo de 16 días durante la fase de maduración (día 6 a día 12) . Se espera que la adición de SelCIDs™ desde el día 1 hasta el día 12 inhiba la adquisición del fenotipo DC y que incremente de manera más importante la población CD34+CD38~, alterando la diferenciación normal de las células CD34+CD38" en las células CD34+CD38+. Sin embargo, se espera que las células CD34+ tratadas con SelCIDs™ adquieran el marcador mieloide CD33, y que estas células presenten un fenotipo CD34+CD38"CD33+ en el día 6. Los SelCIDs™ casi pueden prevenir por completo la generación de células CDla+ en el día 6, y particularmente la generación de células dobles positivas CD86+CDla+. Se cree que esta población positiva doble será la precursora de las DC epidérmicas Langerhans . Los SelCIDs™ también pueden disminuir la generación de células CD14+ CDla" que pueden dar lugar tanto a DC dérmicas como a monocitos/macrófagos . El incremento en la población progenitora temprana (células CD34+CD38") y el bloqueo en los progenitores DC mieloides (células CDla+CD14" y CDla"CD14+) , probablemente dependerá y alcanzará un máximo en 1 µ? de SelCIDs™. Este efecto es reversible y solamente se observa una interferencia con la ruta diferenciación CD34 si los progenitores CD34+ se cultivan durante al menos 3 días con SelCIDs™. Las dosis múltiples de SelCIDs™ entre los días 0 y 6 intensificarán el incremento en la población CD34+. Las células progenitoras CD34+ cultivadas en la presencia de SelCIDs"" también exhiben en el día 12 una expresión disminuida de moléculas co-estimuladoras (CD86, CD80) . La molécula de adhesión CD54 se altera con la expresión disminuida de CD54bri9ht y expresión incrementada de las poblaciones CD54dltn. La expresión de las moléculas HLA-DR se reduce en los progenitores CD34+ tratados con SelCIDs™. Cuando se agrega uno o más SelCIDs™ en el día 6, después del cultivo de los días 0-6 sin tratamiento, y cuando ya ha sido generada la población CDla+, los SelCIDs™ incrementan la persistencia de la población CDla+. El cultivo tratado con SelCIDs™ contiene relativamente más precursores CDla+ en el día 12 que el control DMSO. La adición de SelCIDs™ a las células diferenciadas CD34+ en el día 6 también disminuye considerablemente la generación de precursores CD14+ y la expresión de moléculas co-estimuladoras (CD86, CD80) . SelCIDs™ que promueven la diferenciación granulocítica : Para determinar si el bloqueo en la generación de DC está asociado con un cambio a una ruta diferente de diferenciación mieloide, se puede monitorear la expresión del marcador granulocítico CD15. Se incrementa la expresión de la molécula de superficie CD15 en las células progenitoras CD34+ cultivadas en la presencia de SelCIDs™. En la presencia de un cóctel de citocinas que impulsa la diferenciación DC, la adición de SelCIDs™ desvía la expansión/maduración de células progenitoras en un fenotipo más similar a un granulocito. La oblicuidad en la diferenciación mieloide se puede estudiar monitoreando la expresión de 2 marcadores: CDllc, expresado por los progenitores DC mieloides para las células Langerhans y DC intersticiales, y CD15 expresado por los progenitores de granulocitos . Se asocia una disminución en la población CDllc+CD15- con una incremento concomitante en la población granulocítica CDllc-CD15+. De un modo interesante, las dosis múltiples de SelCIDs™ mejoran el cambio hacia el linaje granulocítico . Bloqueo en la generación DC no mediado por una exterminación específica de los progenitores DC: Para determinar si la disminución en los progenitores DC está mediada por una exterminación específica. Las células progenitoras CD34+ se cultivan durante un periodo de 6 días en la presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-a . En el día 6, se aislan las células CDla+CD14" y CDla"CD14+ (progenitores DC) mediante una clasificación magnética de células (Miltenyi) . Se cultivan poblaciones purificadas durante unos 2 días adicionales en la presencia de GM-CSF y TNF-OÍ con o sin SelCIDs™ (1 µ?) . No existe un incremento significativo en el nivel de poblaciones de anexina V+-PT" (apoptosis temprana) y anexina V+-PT+ (apoptosis tardía) en el tratamiento con SelCIDs™.

Se altera la actividad funcional de las DC generadas de las progenitores CD34+: Se evalúa la capacidad fagocítica de las células derivadas de las células progenitoras CD34+ cultivadas con citocinas con o sin SelCIDs™ mediante la endocitosis mediada con receptores de mannosa de dextrano-FITC en el día 12. Cuando se agrega uno o más SelCIDs™ desde el día 1 hasta el día 12, existe una fuerte disminución en la capacidad fagocítica comparada con el control de DMSO. Cuando se agrega SelCIDs™ desde el día 6 hasta el día 12 la capacidad fagocítica es comparable con las células de control de DMSO. Se evalúa la capacidad de presentación de antígenos (APC) de las células CD34+ cultivadas con citocina con o sin SelCIDs™ midiendo su capacidad para inducir la proliferación de células T alogénicas CD3+ en un ensayo con la Reacción de Leucocitos Mezclados (MLR) en el día 12. Cuando se agrega SelCIDs™ desde el día 1 hasta el día 12, las células CD34+ muestran una capacidad reducida para estimular la proliferación de las células T cuando se compara con el control de DMSO. En contraste, cuando se agrega uno o más SelCIDs™ desde el día 6 hasta el día 12, la capacidad para estimular la proliferación de las células T es comparable con las células del control de DSMO. El SelCIDs™ puede atenuar dramáticamente la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células dendríticas. Como consecuencia, las células tratadas con SelCIDs™ presentarán una capacidad fagocítica baja y una capacidad APC reducida. El SelCIDs™ también incrementará los progenitores hematopoyéticos tempranos, las células CD34+CD38". Aquellos progenitores hematopoy ticos tempranos que han demostrado dar un mejor injerto y repoblación en el modelo de ratón NOD-SCI (Tamaki et al., J. Neurosci. Res. 69(6):975-86 (2002)). Además, el SelCIDs™ bifurca la diferenciación de las células CD34+ cambiando la diferenciación mieloide hacia el linaje granulocítico, aún cuando la presión de la citocina esté a favor de la diferenciación de las células dendríticas. Además, se encontró que el SelCIDs™ no tiene efectos tóxicos en las células CD34+, y no imparte la capacidad de proliferar de las células. Esta modulación de la función de DC y la promoción de la diferenciación granulocítica pueden tener una utilidad terapéutica significativa para el tratamiento de diversos cánceres, padecimientos inmunológicos , y padecimientos infecciosos, y en el transplante de órganos, y la medicina regenerativa . 5.12. EJEMPLO 12: SelCIDs™ que Modulan la Diferenciación de las Células Progenitoras CD133+ Las dosis múltiples de SelCIDs™, además de intensificar el incremento en la población CD34+, también incrementan la expresión de CD133, el cual usualmente se expresa mediante células progenitoras hematopoyéticas CD34bri9ht y algunas subpoblaciones CD34+ primitivas. Los SelCIDs™, al enriquecer las células hematopoyéticas primitivas CD34+CD133+, deben de tener una implicación clínica para la recuperación hematopoyética después del transplante de las células madre. Además, las células madre CD133+ también pueden dar lugar al linaje endotelial y contribuir en términos de la cicatrización de heridas. Las dosis múltiples de SelCIDs'" no exacerban el bloqueo en la generación de precursores DC Langerhans. 5.13. EJEMPLO 13: Generación de Células Dendríticas Murinas de las Células Progenitoras Hematopoyéticas Sea* de la Médula Ósea (BM) Se obtiene la médula ósea de ratones C57BL/6 innatos de Clonetics. Se enriquecen los progenitores hematopoyéticos Sca+Lin- utilizando un cóctel de enriquecimiento de progenitores murinos SpinSep (StemCell Technologies) y se cultivan en DM de Iscove con BIT 95000 (StemCell Technologies) en la presencia de factores de crecimiento de murinos SCF, Flt3L, GM-CSF y M-CSF durante 9 días, para promover la expansión de las células Sca+ y un fenotipo del precursor DC y luego en la presencia de GM-CSF y TNF-a durante 3 días adicionales para conducir las células a un fenotipo DC inmaduro. Las células enriquecidas Sca+Lin- se cultivan en la presencia de DMSO (0.1%), el SelCIDs™ en 10 µ? ó ácido todo-trans retinóico (ATRA) (ICN Biomedicals) en 10 µ? desde el día 0. Se agregan compuestos a las células en el día 0 y el día 9.

Análisis del fenotipo de la superficie celular de murinos: Se procesan las células de murinos para un teñido doble (14 min a RT (TA) ) en el día 9 y día 12; utilizando mABs conjugado con FITC y PE. Se utilizan anticuerpos de BD Pharmingen: Sea (PE), CDllb (FITC), Gr-1 (FITC), CD86 (PE), CD14 (PE), CD80 (PE), I-Ab (PE), CD40 (PE) y CD32.1/16.1 (FITC) de Miltenyi. Se realiza un análisis de fluorescencia en un citómetro de flujo FACScan (Coulter) después de la adquisición de 10,000 casos. Los SelCIDs™ pueden alterar el desarrollo de DC de Murinos de los progenitores Sca+. En el día 9 las células presentarán un fenotipo precursor DC con una expresión de superficie elevada de marcadores dendríticos/mieloides CD32/16 (receptores Fe), CDllb, CD80, expresión baja de I-Ab y CD86, y la carencia de la expresión de los marcadores de linaje como el CD14 y Gr-1. Los SelCIDs™ no mostrarán un efecto significativo en la expresión del marcador de superficie celular en el día 9, mientras que ATRA mostrará una sub-regulación marcada de la expresión de CD80, I-Ab y Sca+ (no se muestran datos) . Sin embargo en el día 12, los SelCIDs™ pueden mostrar una sub-regulación de la expresión de CD86 y brillo I-Ab y la sobre-regulación de la expresión de CDllb. ATRA muestra efectos similares pero más pronunciados que los SelCIDs™. Además, los SelCIDs™ no muestran efectos en la expresión de CD40 y CD80 mientras que ATRA muestra una sub-regulación marcada de estas moléculas. Los SelCIDs™ inhiben la diferenciación de los precursores DC en DC inmaduras sub-regulando la expresión de CD86 y MHC II. No se espera que los efectos del compuesto sean tan dramáticos como aquéllos observados en los progenitores hematopoyéticos de humanos. El efecto de los SelCIDs™ es mucho menos pronunciado que el de ATRA, el cual es un teratógeno en los ratones. 5.1.4. EJEMPLO 14: Aplicación del Ensayo de Diferenciación a Compuestos Distintos de los SelCIDs La metodología descrita anteriormente, es decir, el examen del efecto de los SelCIDs sobre la diferenciación en las células progenitoras tempranas, tales como las células CD34+, se puede aplicar a cualquier compuesto de interés, el efecto del cual sobre la diferenciación se desea conocer. Como un ejemplo de la extensión de este método de ensayo a otros compuestos, se compara el efecto del ácido retinóico (ATRA) y aspirina con los de los SelCIDs™ en la diferenciación de las células CD34+ hacia el linaje DC contra las células de control (tratadas con DIVISO) . Se estudia el ácido retinóico debido a su efecto conocido en la proliferación y diferenciación celular, su uso terapéutico en algún cáncer, y su efecto teratogénico conocido. Por el contrario, se estudia el efecto de la aspirina debido a que es un fármaco ant i -inflamatorio comúnmente utilizado con propiedades no inmuno-moduladoras . Se pueden obtener los resultados en el día 6 de las células progenitoras CD34+ cultivadas en la presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-a, con o sin un compuesto durante un periodo de 6 días . En la literatura se ha mostrado que otros fármacos modulan la diferenciación celular, por ejemplo, un artículo reciente reporta la modulación mediante los cort icosteroides de la generación DC de las células progenitoras CD34+ . El perfil difiere de los SelCIDs™ con un incremento en la población de CDla+ y una disminución en la población CD14+. La presente invención no estará limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas aquí. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquéllas descritas aquí serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. 6. LITERATURA Todas las referencias citadas aquí se incorporan en la misma como referencia en su totalidad y para todos los propósitos para el mismo alcance como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente que se indica específica e individualmente se incorporara como referencia en su totalidad para todos los propósitos. La cita bibliográfica de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no se debe interpretar como una admisión de que la presente invención no está facultada a anteceder tal publicación en virtud de su previa invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. - Un método para la modulación de la diferenciación de una célula madre o célula progenitora de mamífero, caracterizado porque comprende diferenciar dicha célula madre o célula progenitora bajo condiciones adecuadas y en la presencia de un compuesto que inhiba la actividad PDE IV, en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleotido o ácido nucleico.
2. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha célula madre se diferencia en una célula hematopoyética .
3. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha célula madre se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula madre de placenta, una célula madre de sangre del cordón umbilical, una célula madre de sangre periférica, y una célula madre de médula ósea.
4. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho inhibidor PDE IV es un SelCID™ o un profármaco del mismo.
5. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha diferenciación se realiza en un cultivo celular.
6.- El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha diferenciación se realiza dentro de un individuo.
7. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración del compuesto es desde alrededor de 0.005 µ9/p?1 hasta alrededor de 5 mg/ml.
8. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es una célula madre de humano.
9. - Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula progenitora CD34+ ó CD133+ de mamífero, caracterizado porque comprende proliferar o diferenciar dicha célula bajo condiciones adecuadas para su proliferación o diferenciación y en la presencia de un compuesto que inhiba la actividad PDE IV, en donde dicho compuesto no es polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido, o ácido nucleico.
10. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porque dicha' célula madre se selecciona del grupo que consiste de una célula progenitora CD34+ y una célula progenitora CD133+.
11. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porque dichas células progenitoras se diferencian en células CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38~CD33~ y porque dicho compuesto es un SelCID™ o un profármaco del mismo.
12. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porque dicha proliferación o diferenciación se realiza en un cultivo celular.
13. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porque dicha proliferación o diferenciación se realiza dentro de un individuo.
14. - El método de la reivindicación 13, caracterizado porque dichas células progenitoras son células que se han transplantado en dicho individuo.
15. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porque dicho compuesto está presente en una cantidad suficiente para provocar una diferencia detectable en dicha diferenciación o proliferación con relación a un control.
16. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porque dicha célula progenitora CD34+ ó CD133+ se ha criopreservado y descongelado antes de dicha diferenciación.
17. - Un método para expandir una población de células progenitoras en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de células progenitoras CD34+ y un compuesto que inhiba la actividad PDE IV a dicho sujeto mamífero, en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico.
18. - El método de la reivindicación 17, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se diferencian en dicho sujeto mamífero.
19.- El método de la reivindicación 17, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se administran a dicho sujeto mamífero en una preparación de células que está sustancialmente libre de células de glóbulos rojos.
20.- El método de la reivindicación 17, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se administran a dicho sujeto mamífero en una preparación de células que comprende células de médula ósea, células de placenta, o células de médula ósea.
21.- El método de la reivindicación 17, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se administran a dicho sujeto mamífero en conjunción con un portador.
22. - El método de la reivindicación 17, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ son células progenitoras CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38"CD33" .
23. - El método de la reivindicación 17, caracterizado porque dicha célula CD34+ es una célula progenitora CD34+CD133+.
24. - El método de la reivindicación 17, caracterizado porque las células progenitoras expresan material genético incorporado de interés .
25. - Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una célula madre de mamífero y un portador aceptable farmacéuticamente, en donde dicha célula madre se ha puesto en contacto con un compuesto que inhibe la actividad PDE IV durante un tiempo suficiente para provocar la modulación de la diferenciación o proliferación de dicha célula madre, y en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleotido o ácido nucleico.
26. - La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque la célula madre se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula madre de placenta, una célula madre de sangre del cordón umbilical, una célula madre de sangre periférica, y una célula madre de médula ósea.
27. - La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque dicho compuesto es un SelCID™ o un profármaco del mismo.
28.- La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque dicho paso de contacto se realiza en un cultivo celular.
29. - La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque la concentración de dicho compuesto es desde alrededor de 0.005 mg/ml hasta alrededor de 5 mg/ml.
30. - La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque la célula madre es una célula madre de humano .
31.- La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque la diferenciación es la diferenciación en una célula hematopoyética .
32. - La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque dicha célula hematopoyética en una célula hematopoyética CD34+ ó CD38+.
33.- La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque la célula hematopoyética en una célula CDllb+.
34.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende células aisladas de sangre de cordón umbilical y una población aislada de células de glóbulos blancos, en donde las células de glóbulos blancos se generan mediante un método que comprende diferenciar las células madre bajo condiciones adecuadas y en la presencia de un compuesto que inhiba la actividad PDE IV, con la condición de que el compuesto no sea un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico, y aislar las células de glóbulos blancos diferenciadas mediante los mismos.
35.- La composición farmacéutica de la reivindicación 34, caracterizada porque el compuesto es una imida o amida.
36.- La composición farmacéutica de la reivindicación 34, caracterizada porque el paso de diferenciación se realiza en un cultivo celular.
37. - La composición farmacéutica de la reivindicación 34, caracterizada porque la concentración del compuesto es desde alrededor de 0.005 9/p?1 hasta alrededor de 5 mg/ml .
38. - La composición farmacéutica de la reivindicación 34, caracterizada porque la célula madre es una célula madre de humano .
39. - La composición farmacéutica de la reivindicación 34, caracterizada porque la célula madre es una célula progenitora.
40.- La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque la célula progenitora está consignada a un linaje específico de células.
41. - La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque la célula progenitora es una célula progenitora hematopoyética .
42. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende cultivar células progenitoras CD34+ ó CD133+ y un portador aceptable farmacéuticamente, en donde dichas células progenitoras se han puesto en contacto dentro de los primeros seis días del cultivo con un compuesto que inhibe la actividad del PDE IV, bajo condiciones que promueven la proliferación y diferenciación de dichas células progenitoras.
43. - La composición farmacéutica de la reivindicación 42, caracterizada porque dichas células progenitoras se recolectan y criopreservan después de seis días del cultivo.
44. - La composición farmacéutica de la reivindicación 42, caracterizada porque dichas células progenitoras son células CD34+CD38"CD34" ó CD34+CD38"CD34+ .
45. - La composición farmacéutica de la reivindicación 42, caracterizada porque dicho compuesto es un SelCID™.
46. - Un método para transplantar una célula madre de mamífero, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto dicha célula madre con un compuesto inhibidor de PDE IV para producir una célula madre tratada, en donde dicho contacto es suficiente para modular la diferenciación de dicha célula madre; y (b) administrar dicha célula madre tratada a un individuo .
47. - El método de la reivindicación 46, caracterizado porque dicho paso (b) comprende administrar dicha célula madre tratada en combinación con células no tratadas.
48.- El método de la reivindicación 46, caracterizado porque la célula no tratada se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula de placenta, una célula de sangre de cordón umbilical, una célula de sangre periférica, y una célula de médula ósea.
49. - El método de la reivindicación 46, caracterizado porque dicha célula madre se ha criopreservado y descongelado antes de dicha administración.
50. - Un método para transplantar una célula progenitora de mamífero, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto dicha célula progenitora con un compuesto inhibidor de PDE IV para producir una célula progenitora tratada, en donde dicho contacto es suficiente para modular la diferenciación de dicha célula progenitora; y (b) administrar dicha célula progenitora tratada a un individuo .
51. - El método de la reivindicación 50, caracterizado porque el paso (b) comprende administrar dicha célula progenitora tratada en combinación con células no tratadas.
52.- El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la célula no tratada se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula de placenta, una célula de sangre de cordón umbilical, una célula de sangre periférica, y una célula de médula ósea.
53.- El método de la reivindicación 50, caracterizado porque dicha célula madre se ha criopreservado y descongelado antes de dicha administración.
54. - Un método para tratar un individuo que experimente una condición, caracterizado porque administrar a dicho individuo un agente seleccionado del grupo que consiste de: (a) un compuesto que inhiba la actividad PDE IV, en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico; (b) una célula madre diferenciada en la presencia de dicho compuesto; y (c) una célula progenitora diferenciada en la presencia de dicho compuesto, en donde dicho agente detectablemente reduce o mejora dicha condición.
55. - El método de la reivindicación 54, caracterizado porque dicha condición se selecciona del grupo que consiste de inflamación, padecimiento cardiaco, padecimiento vascular, esclerosis lateral amilotrófica, un padecimiento de almacenamiento de lisosomas, y diabetes.
56. - El método de la reivindicación 54, caracterizado porque dicho agente comprende tanto una célula madre como un compuesto que inhibe la actividad PDE IV, en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico.
57. - Un método para tratar un individuo caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de células de glóbulos blancos a dicho sujeto mamífero receptor, en donde dichas células de glóbulos blancos se generan mediante un método que comprende diferenciar una célula madre bajo condiciones adecuadas y en la presencia de compuesto que inhiba la actividad PDE IV, con la condición de que el compuesto no sea un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico.
58.- El método de la reivindicación 57, caracterizado porque las células madre se diferencian in vitro.
59.- El método de la reivindicación 57, caracterizado porque las células madre se diferencian en una placenta perfusionada post-parto.
60. - El método de la reivindicación 57, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran al individuo en una preparación de células que está sustancialmente libre de células de glóbulos rojos.
61. - El método de la reivindicación 57, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran al individuo en una preparación de células que comprende células de médula ósea.
62. - El método de la reivindicación 57, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran al individuo en conjunción con un portador. . : 195
63. - El método de la reivindicación 57, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran para tratar o reparar un defecto en el sujeto mamífero receptor.
64. - El método de la reivindicación 63, caracterizado porque el defecto es un defecto de proliferación de células sanguíneas o hematopoyeticas.
65. - El método de la reivindicación 63, caracterizado porque el defecto de proliferación de células sanguíneas o hematopoyéticas es neutropenia o leucopenia.
66.- El método de la reivindicación 63, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran sistemáticamente .
67. - El método de la reivindicación 63, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran intravenosamente.
68. - El método de la reivindicación 63, caracterizado porque las células de glóbulos blancos expresan un material genético incorporado de interés.
69. - El método de la reivindicación 57, caracterizado porque las células de glóbulos blancos son alogenéicas.
70. - El método de la reivindicación 57, caracterizado porque el sujeto mamífero receptor es un humano.
71. - Un método para elaborar una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto las células progenitoras CD34+ ó CD133+ con un compuesto que inhiba la actividad del PDE IV, en donde dichas células progenitoras se cultivan durante seis días bajo condiciones de cultivo que permitan la proliferación y diferenciación de dichas células progenitoras; (b) recolectar dichas células después de seis días de cultivo; y (c) colectar dichas células en un portador aceptable farmacéuticamente .
72.- El método de la reivindicación 71, caracterizado porque dicho contacto se realiza en el primer día del cultivo.
73.- El método de la reivindicación 71, caracterizado porque dicho contacto se realiza al menos dos veces durante dichos seis días del cultivo.
74.- El método de la reivindicación 71, caracterizado porque dicho compuesto es un SelCID™ o un profármaco del mismo .
75. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque dichas células progenitoras se han aislado de otras células sanguíneas antes de dicho cultivo.
76. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene adicionalmente GM-CSF y TNF-a.
77. - El método de la reivindicación 74, caracterizado porque dicho SelCID™ ó un profármaco del mismo está presente en una concentración de entre 0.1 µ? y 10.0 µ?.
78. - El método de la reivindicación 74, caracterizado porque dicho SelCID™ ó un profármaco del mismo está presente en una concentración de 1.0 µ?.
79. - El método de la reivindicación 74, caracterizado porque dichas células se criopreservan después de dicha recolección.
80.- Una composición farmacéutica elaborada mediante el proceso de la reivindicación 74.
81.- Un método para la modulación de la diferenciación de una célula progenitora CD34+ ó CD133+, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una población de dichas células progenitoras bajo condiciones tales que pueda ocurrir la diferenciación; (b) poner en contacto dichas células progenitoras con un compuesto, en donde dicho compuesto es un inhibidor PDE IV; (c) diferenciar dichas células progenitoras bajo condiciones adecuadas para la diferenciación, en donde dicho compuesto se pone en contacto con dichas células progenitoras durante al menos parte del tiempo en el que se diferencian dichas células progenitoras.
82. - El método de la reivindicación 81, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza en cualquier momento entre el día 0 y el día 6 del cultivo.
83. - El método de la reivindicación 81, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza al inicio del cultivo de dichas células progenitoras.
84. - El método de la reivindicación 81, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza después de que hayan proliferado dichas células progenitoras durante al menos dos días.
85. - El método de la reivindicación 81, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza después de que hayan proliferado dichas células progenitoras durante al menos seis días.
86.- El método de la reivindicación 81, caracterizado porque dichas células progenitoras son células progenitoras CD34+.
87.- El método de la reivindicación 81, caracterizado porque dichas células progenitoras se diferencian en células que exhiben características del marcador de superficie celular seleccionadas del grupo que consiste de: una disminución en la expresión CDllc con relación a un control ; una disminución en la expresión CD38 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD80 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD86 con relación a un control ; una disminución en la expresión CDla con relación a un control ; una disminución en la expresión CD14 con relación a un control; una disminución en la expresión CD54brillante con relación a un control ,· una disminución en la expresión HLA-DR con relación a un control ; una disminución en la expresión CD15 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD33 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD54opaco con relación a un control; una disminución en la expresión CD133 con relación a un control ; y una combinación de cualquiera de las características marcadoras anteriores; en donde dicho control es una célula progenitora CD34+ bajo las mismas condiciones que dicha célula progenitora en la ausencia de dicho compuesto.
88. - El método de la reivindicación 81, caracterizado porque dichas células progenitoras se diferencian en células CD34+CD38~CD33+ Ó CD34+CD38"CD33" .
89. - El método de la reivindicación 81, caracterizado porque dicho inhibidor PDE IV es un SelCID™ o un profármaco del mismo.
90. - Un método para producir células diferenciadas de las células progenitoras CD34+, caracterizado porque comprende cultivar dichas células en un medio de cultivo que permite la proliferación y diferenciación, y poner en contacto dichas células progenitoras con un SelCID™ o un profármaco del mismo.
91. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dicho contacto se realiza en el primer día de dicho cultivo .
92. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dicho contacto tiene lugar al menos dos veces durante los primeros seis días de dicho cultivo.
93. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dicho contacto no tiene lugar antes de dicho primer día de cultivo.
94. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dicha célula diferenciada es una célula dendrítica, un granulocito, una célula CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38~CD33~.
95. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dicha célula progenitora CD34+ es una célula progenitora CD34+CD133+.
96. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dichas células diferenciadas se aislan en el día 6 del cultivo.
97.- El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dichas células diferenciadas se aislan en el día 12 del cultivo .
98. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dichas células CD34+ se han aislado de otras células sanguíneas antes de dicho cultivo.
99. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene adicionalmente GM-CSF y TNF-o¡ .
100. - El método de la reivindicación 90, caracterizado porque dicho SelCID™ ó un profármaco del mismo está presente en una concentración de entre 0.1 µ? y 10.0 µ?.
101. - El método de la reivindicación 86, caracterizado porque dicho SelCID™ ó un profármaco del mismo está presente en una concentración de 1.0 µ?.