CN105076116B - 一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法。本发明提供的细胞冻存液中包括DMSO、胎牛血清、右旋糖酐、海藻糖和白蛋白。该细胞冻存液能够很好的维持巨核祖细胞在冻存期间的细胞活性，降低冻存和复苏过程对细胞造成的损伤。本发明提供的冻存降温程序较为柔和，经过本发明提供的降温程序，再将细胞置于液氮中保存，对细胞活力的影响较小，降低了冻存过程中对细胞造成的伤害。实验表明，采用该冻存液冻存巨核祖细胞一个月后细胞复苏后活力可达94％，且增殖活力良好。显著优于现有技术。

Description

一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法。

背景技术

巨核细胞祖细胞(megakaryocyte progenitor cell)是一种使人们产生巨核细胞的细胞，它是从骨髓祖(CFU-GEMM)而得，简称巨核祖细胞。巨核祖细胞存在于IL-6R-细胞群中，而CD34+细胞可分为两个细胞亚群，表达IL-6R和不表达IL-6R，IL-6R+细胞能被刺激形成粒-巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞，而IL-6R-细胞当被给予IL-6/sIL-6R时可形成红系及巨核系细胞。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形成单位(colonyforming unit-megakaryocyte,CFU-Meg)。巨核系祖细胞分化成为成熟的巨核细胞后，其边缘部分破裂脱落，形成血小板，每个巨核细胞能生成1000-6000个左右的血小板；巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。

如今恶性肿瘤严重危害人类健康的主要疾病之一，目前主要是通过手术治疗并结合放化疗。当患者在接受高剂量放化疗后，骨髓造血功能低下，常会出现血小板减少，严重时会造成患者出血死亡。临床上常采用输注血小板，但血小板来源有限，存活期短，体外易失活，且反复输注血小板易导致输注无效并增加输血传播疾病的危险。

1997年，Bertolini等从外周血中分离CD34+，体外诱导扩增巨核细胞7天，用于患者血小板恢复。结果显示，体外诱导的巨核细胞可替代血小板输入，或减少血小板输入次数。2000年，Paquette等将体外动员的外周血细胞经体外诱导扩增巨核细胞9天后，用于改善大剂量化疗的乳腺癌病人中性粒细胞减少、血小板减少和贫血症状。Van denOudenrijn等对外周血、骨髓、脐血来源的CD34+细胞体外扩增进行比较，发现脐血来源的CD34+具有更强的巨核细胞扩增能力。由于脐血造血干细胞移植后血小板的恢复较外周血、骨髓慢，因此采用体外诱导、扩增巨核祖细胞和巨核细胞，然后输注患者体内，进一步发育成血小板，缩短血小板的恢复期。

可见，将巨核祖细胞用于恶性肿瘤的治疗是目前的研究热点，而为了能够将巨核祖细胞能够在体外长期保存，其冻存方法的研究也显得尤为重要。如今，大多数巨核祖细胞的冻存方法为把细胞加入DMSO：FBS：基础培养基的体积比＝1：2：7的冻存液配方中，分装至冻存管中，然后转入冻存盒放进-80℃冰箱中，最后转入液氮中保存。该方法虽然能够有效地冻存细胞，但是复苏后细胞活力偏低，而且复苏后的细胞状态恢复较慢，因此，研究一种有效的巨核祖细胞的冻存方法，使细胞在东村后仍保持较好的活力十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法，本发明提供的冻存液能够应用于巨核祖细胞的冻存，能够降低冻存期间对细胞造成的损伤，复苏后细胞活力较高。

本发明提供的细胞冻存液，包括DMSO、胎牛血清、右旋糖酐、海藻糖和白蛋白。

在本发明的实施例中，DMSO、胎牛血清的体积比为(0.5～1)：(4～6.5)。

在本发明的实施例中，DMSO、胎牛血清的体积比为(0.5～1)：(4.5～5.5)。

在一些的实施例中，DMSO、胎牛血清的体积比为0.5：5.5。

在一些的实施例中，DMSO、胎牛血清的体积比为1：4.5。

在一些的实施例中，DMSO、胎牛血清的体积比为1：5。

在本发明的实施例中，右旋糖酐、海藻糖和白蛋白的质量比为(50～100)：(10～20)：(80～120)。

在一些实施例中，右旋糖酐、海藻糖和白蛋白的质量比为5：1：12。

在一些实施例中，右旋糖酐、海藻糖和白蛋白的质量比为10：1：12。

在一些实施例中，右旋糖酐、海藻糖和白蛋白的质量比为10：2：8。

在本发明的实施例中，右旋糖酐的终浓度为50mg/mL～100mg/mL；海藻糖的终浓度为10mg/mL～20mg/mL；白蛋白的终浓度为80mg/mL～120mg/mL。

在一些实施例中，右旋糖酐的终浓度为50mg/mL；海藻糖的终浓度为10mg/mL；白蛋白的终浓度为120mg/mL。

在一些实施例中，右旋糖酐的终浓度为100mg/mL；海藻糖的终浓度为10mg/mL；白蛋白的终浓度为120mg/mL。

在一些实施例中，右旋糖酐的终浓度为100mg/mL；海藻糖的终浓度为20mg/mL；白蛋白的终浓度为80mg/mL。

在本发明的实施例中，右旋糖酐为低分子右旋糖苷。

在本发明的实施例中，白蛋白为人血白蛋白。

作为优选，每10mL细胞冻存液中包括DMSO 0.5mL、胎牛血清5.5mL、低分子右旋糖酐50mg、海藻糖10mg、人血白蛋白120mg，余量为水。

作为优选，每10mL细胞冻存液中包括DMSO 1mL、胎牛血清4.5mL、低分子右旋糖酐100mg、海藻糖10mg、人血白蛋白120mg，余量为水。

作为优选，每10mL细胞冻存液中包括DMSO 1mL、胎牛血清5mL、低分子右旋糖酐100mg、海藻糖20mg、人血白蛋白80mg，余量为水。

二甲基亚砜(DMSO)是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，能够提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害。

海藻糖(D-(+)-Trehalose dihydrate)具有稳定生物膜(细胞膜)和蛋白质结构及抗干燥的作用，可用于生物制品保护。

右旋糖酐分为有高分子右旋糖酐(平均分子量10万-20万)、中分子右旋糖酐(平均分子量6万-8万)、低分子右旋糖酐(平均分子量2万-4万)、小分子右旋糖酐(平均分子量1万-2万)。本发明采用的低分子右旋糖酐为右旋糖酐40，其作为药物使用除可以扩充血容量的作用外，还可以降低血液粘滞性，改善微循环。右旋糖酐还有利于降低细胞的粘滞性。

白蛋白(又称清蛋白，albumin，Alb)是血浆中含量最多、分子最小、溶解度大、功能较多的一种蛋白质，具有保护血细胞保护和调节凝血的功能，有利于防止细胞成团。

本发明将胎牛血清和DMSO混合，并在其中添加白蛋白、海藻糖和右旋糖酐，从而能够很好的保护细胞活性不受损伤。实验表明，采用本发明提供的冻存液对巨核祖细胞进行冻存，一个月后，检测细胞复苏后存活率可达94％，且具有良好的增殖效果。

本发明提供的细胞冻存液的制备方法为：将右旋糖酐、海藻糖和白蛋白依次加入胎牛血清后，加入DMSO，制得细胞冻存液。

本发明提供的细胞冻存液于4℃保存。

本发明提供的细胞冻存液在冻存巨核祖细胞中的应用。

本发明提供的细胞冻存液能够很好的维持巨核祖细胞在冻存期间的细胞活性，降低冻存和复苏过程对细胞造成的损伤。实验表明，采用该冻存液冻存巨核祖细胞一个月后细胞复苏后活力可达94％，且增殖活力良好。显著优于现有技术。

本发明还提供了巨核祖细胞的冻存方法，以本发明提供的细胞冻存液冻存巨核祖细胞。

本发明提供的细胞冻存液，包括DMSO、胎牛血清、右旋糖酐、海藻糖和白蛋白。

在本发明的实施例中，细胞冻存液于4℃预冷。

在本发明的实施例中，冻存的降温程序为：4℃保持5min；

以-1℃/min的速度降温至-4℃；

以-12℃/min的速度降温至-50℃；

以15℃/min的速度升温至-28℃；

-28℃保持4min；

以-1℃/min的速度降温至-55℃；

以-10℃/min的速度降温至-90℃；

-90℃保持5min；

-80℃保持7d；

液氮保存。

本发明提供的冻存降温程序较为柔和，经过本发明提供的降温程序，再将细胞置于液氮中保存，对细胞活力的影响较小，降低了冻存过程中对细胞造成的伤害。

在本发明的实施例中，巨核祖细胞在本发明提供的细胞冻存液中的密度为5×10⁶个/mL。

本发明提供了一种细胞冻存液及其在巨核祖细胞冻存中的应用，以及冻存巨核祖细胞的方法，本发明提供的细胞冻存液中包括DMSO、胎牛血清、右旋糖酐、海藻糖和白蛋白。该细胞冻存液能够很好的维持巨核祖细胞在冻存期间的细胞活性，降低冻存和复苏过程对细胞造成的损伤。本发明提供的冻存降温程序较为柔和，经过本发明提供的降温程序，再将细胞置于液氮中保存，对细胞活力的影响较小，降低了冻存过程中对细胞造成的伤害。实验表明，采用该冻存液冻存巨核祖细胞一个月后细胞复苏后活力可达94％，且增殖活力良好。显著优于现有技术。

附图说明

图1示实施例1～3及对比例1提供的冻存液冻存1个月后的巨核祖细胞的增殖曲线；其中，线1示实施例2的冻存液冻存后细胞的增殖曲线；线2示实施例3的冻存液冻存后细胞的增殖曲线；线3示实施例1的冻存液冻存后细胞的增殖曲线；线4示对比例1的冻存液冻存后细胞的增殖曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：

巨核祖细胞分离自脐血，分离方法为利用Ficoll密度梯度离心法分理处单个核细胞，用RPMI 1640培养基清洗细胞两次，根据单个核细胞数加入适量CD34磁珠抗体，4℃避光孵育30min，采用MiniMACS免疫磁性吸附分离装置分离和纯化CD34+细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

配制母液：

低分子右旋糖酐母液：购自上海长征富民金山制药有限公司，质量分数为10％。

海藻糖母液：把10mg的海藻糖粉末充分溶解于0.5ml水中

人血白蛋白母液：把120mg白蛋白充分溶解于3ml水中

把0.5ml低分子右旋糖酐母液、0.5ml海藻糖母液、3ml人血白蛋白母液依次添加至5.5mlFBS中，最后把0.5mlDMSO缓慢滴加至FBS中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

实施例2

配制母液：

低分子右旋糖酐母液：购自上海长征富民金山制药有限公司，质量分数为10％。

海藻糖母液：把10mg的海藻糖粉末充分溶解于0.5ml水中

人血白蛋白母液：把120mg白蛋白充分溶解于3ml水中

把1ml低分子右旋糖酐母液、0.5ml海藻糖母液、3ml人血白蛋白母液依次添加至4.5mlFBS中，最后把1mlDMSO缓慢滴加至FBS中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

实施例3

配制母液：

低分子右旋糖酐母液：购自上海长征富民金山制药有限公司，质量分数为10％。

海藻糖母液：把20mg的海藻糖粉末充分溶解于1ml水中

人血白蛋白母液：把80mg白蛋白充分溶解于2ml水中

把1ml低分子右旋糖酐母液、1ml海藻糖母液、2ml人血白蛋白母液依次添加至5mlFBS中，最后把1mlDMSO缓慢滴加至FBS中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

对比例1

把2mlFBS添加至7mlRPMI1640培养基中，最后把1mlDMSO缓慢滴加至培养基中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

实施例4

把巨核祖细胞按2×10⁷个/管分装至3支分别标记好的15ml离心管中，300g离心5min，离心后弃上清，加入10ml生理盐水进行重悬清洗，200g离心5min，弃上清，重复清洗一遍后，把于4℃预冷的冻存夜(实施例1～3)分别加入以上离心管中，轻轻吹打重悬细胞，分别分装至3支冻存管中，每管密度为5×10⁶cell/ml，1ml/管，并做好相应标记。

将发明组冻存管放入程序降温仪中，设置以下程序：在4℃保持5min，然后按-1℃/min的速度降至-4℃，接着以-12℃/min的速度降至-50℃，然后以15℃/min的速度回升至-28℃后保持4min，紧接着以-1℃/min降至-55℃后以-10℃/min降至-90℃，降至-90℃后保持5min，程序结束后转移至-80℃冰箱放置一周，接着转移至液氮中保存。

对比例2

把巨核祖细胞按2×10⁷个/管分装至1支分别标记好的15ml离心管中，300g离心5min，离心后弃上清，加入10ml生理盐水进行重悬清洗，200g离心5min，弃上清，重复清洗一遍后，把于4℃预冷的冻存夜(对比例1)加入以上离心管中，轻轻吹打重悬细胞，分别分装至3支冻存管中，每管密度为5×10⁶cell/ml，1ml/管，并做好相应标记。

将对照组冻存管放入冻存盒中，转入-80℃冰箱放置一周，最后转入液氮中保存。

对比例3

把巨核祖细胞按2×10⁷个/管分装至3支分别标记好的15ml离心管中，300g离心5min，离心后弃上清，加入10ml生理盐水进行重悬清洗，200g离心5min，弃上清，重复清洗一遍后，把于4℃预冷的冻存夜(实施例1～3)分别加入以上离心管中，轻轻吹打重悬细胞，分别分装至3支冻存管中，每管密度为5×10⁶cell/ml，1ml/管，并做好相应标记。

将对照组冻存管放入冻存盒中，转入-80℃冰箱放置一周，最后转入液氮中保存。

实施例5

将实施例4和对比例2～3在液氮罐中保存一个月的细胞进行复苏，取20μl细胞悬液，按细胞悬液：0.4％台盼蓝体积比为9:1进行染色混匀，通过countstar自动细胞计数仪进行计数，检测其活力，复苏后细胞活力如表1所示

表1细胞活力检测表

*示p<0.05；**示p<0.01

综合以上结果，发明组复苏后的细胞活力平均在90％，远比对照组的细胞活力68％要高，同时也比同一种冻存液配方，不同降温方式所冻存的细胞活力80％要高。

实施例6

对在实施例4和对比例2在液氮罐中保存一个月的细胞进行复苏，将复苏后的细胞以相同条件培养两周，观察其增殖情况。结果如图1.

结果表明，细胞复苏后增殖速度比对照组要快，由此可知本发明提供的对于巨核祖细胞的冻存方法比常规的冻存方法要好，很好的保证细胞活力以及复苏后的增殖状态。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种巨核祖细胞冻存液，其特征在于，每10mL细胞冻存液中包括DMSO 1mL、胎牛血清4.5mL、低分子右旋糖酐100mg、海藻糖10mg、人血白蛋白120mg，余量为水。

2.权利要求1所述的细胞冻存液在冻存巨核祖细胞中的应用。

3.权利要求1所述的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括将右旋糖酐、海藻糖和白蛋白依次加入胎牛血清后，加入DMSO，制得细胞冻存液。

4.一种巨核祖细胞的冻存方法，其特征在于，以权利要求1所述的细胞冻存液冻存巨核祖细胞。

5.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存的降温程序为：4℃保持5min；

以-1℃/min的速度降温至-4℃；

以-12℃/min的速度降温至-50℃；

以15℃/min的速度升温至-28℃；

-28℃保持4min；

以-1℃/min的速度降温至-55℃；

以-10℃/min的速度降温至-90℃；

-90℃保持5min；

-80℃保持7d；

液氮保存。

6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述巨核祖细胞在权利要求1所述细胞冻存液中的密度为5×10⁶个/mL。