WO1994000977A1

WO1994000977A1 - Procede de transformation d'une monocotyledone

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Publication number: WO1994000977A1
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Inventors: Yukou Hiei; Toshihiko Komari
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1992-07-07
Filing date: 1993-07-06
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 1995-01-07
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Description

明細書

単子葉植物の形質転換方法

技術分野

本発明は、単子葉植物の形質転換方法に関する。

ϋ體

単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレクト口ポレーシヨン法、ポリエチレングリコール法（PEG法）、パーティクルガン法その他が知られている。

エレクト口ポレーシヨン法は、プロトプラストと目的の DNAを混合し、電気刺激で細胞膜に穴を開けることにより DNAを細胞内に導入し、形質転換を図る方法である。現在、最も再現性のある手法で、この方法で種々の遺伝子が単子葉植物、特にイネに導入されている (Toriyama R. et al., 1988; Bio/Technol. 6 :1072-1074, Shimamoto R. et al., 1989; Nature 338:274-276, Rhodes C. A. et al., 1989; Science 240:204-207)。しかしながら、この方法は、 1 ) プロトプラストからの個体再生系が確立されている植物種にのみ適用可能である、 2) プロトプラストから個体再生までには数か月を要するので、形質転換体を得るのに時間がかかる、 3) 培養期間が長期化するので、それに伴う培養変異の頻度が高くなり、正常な形質転換体を得る確率が低くなる、という問題点を有する。

PEG法は、目的遺伝子とプロトプラストとを混合し、 PEGで処理することによって遺伝子の導入を図る方法であり、エレクトロポレーシヨン法とは電気刺激が PEGに変わった点で異なる。導入効率はエレクト口ポレーシヨン法よりはいくぶん低いと考えられる。この方法で形質転換体を得た報告はあるものの、広く用いられているとは言い難い。プロトプラストを用いるため、エレクトロボレーシヨン法と同様な問題点を持つ（Zhang W. et al., 1988; Theor. Appl. Gene t. 76:835-840, Datta S.R. et al., 1990; Bio/Technol. 8:736-740) 。

パーティクルガン法は、目的の遺伝子を微細な金属粒子に付着させ、金属粒子を高速で細胞あるいは組織に打ち込むことによって形質転換を行わせる方法である。従って、原理的にはあらゆる組織を対象に形質転換を行うことができ、特に、プロトプラストからの再生系が確立されていない植物種に有効である。形質転換効率は、遺伝子を打ち込んだ後の選抜に依存する。エレクトロボレ一シヨン法と効率を比較したデータはない（Gordon-Ka關 W. J. et al.， 1990; Plant Cell 2:603 - 618， Fromrn M. E. et al.， 1990; Bio/Technol. 8:833-839， Christou P. et al.， 1991; Bio/Technol. 9:957-962) 。

その他の方法としては、 1) 種子、胚と DNAの共存培養（Topfer R. et al.，

1989; Plant Cell 1:133-139， Ledoux L. et al.， 1974 Nature 249:17-21) 、 2 ) 花粉管への処理 (Luo and Wu 1988; Plant Mol. Biol. Rep. 6:165-)、 3) リボソーム法 (Caboche M. 1990; Physiol. Plant. 79:173-176， Gad A. E. et al.， 1990: 177-183)及び 4) マイクロインジェクション法（Neuhaus G. et al.，

1987; Theor. Appl. Genet. 75:30-36)があるが、形質転換の効率、再現性、あるいは汎用性に関して問題があり、一般的な方法とは言い難い。

一方、ァグロパクテリゥム属細菌の T iプラスミドをベクターとして用いた遺伝子導入法は、タバコ、ペチュニア、ナタネ等の双子葉作物の形質転換法として普遍的に用いられている。しかしながら、ァグロパクテリゥム属細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には寄生しないとされている（De Cleene M.

1976; Bot. Rev. 42: 389-466) ₀

ァグロパクテリゥムによる単子葉植物の形質転換に関してはアスパラガス（By tebier B. et al.， 1987: Proc. Natl. Acad. Sci. USA :84 :5345-5349)、そしてャム (Dioscorea bulbifera) (Schaferw, et al. , 1987; Nature 327:529- 532)で報告されているが、その他の単子葉植物、特にイネ科作物にはこの方法を適用できないとされている (Potrykus I. 1990; Bio/Technol. 8:535-543) 。

Grimsley et al, 1987: Nature 325:177-179はァグロパクテリゥムの T一 DN Aの中にトウモロコシス卜リークウィルス（Maize streak virus) の DNAを揷入したものをトウモロコシの生長点に接種したところ、トウモロコシストリークウィルスの感染を確認したことを報告している。トウモロコシストリークウィルスの D N Aを接種しただけではこのような感染症状が認められないことから、上の観察結果はァグロパクテリゥムがトウモロコシに D N Aを導入することができることを示すものと解釈している。しかし、ウィルスは核ゲノムに組み込まれなくても増殖する可能性があるので、この結果は T一 D N A力核に組み込まれたことを示すものではない。その後、感染効率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種した時が最も髙く (Grimsley et al . , 1988; Bio/Technol . 6 : 185-189)、感染にはァグロパクテリゥムのプラスミドの virC遺伝子が必須であることを示した（Gr imsley et al . , Mol . Gen. Genet. 217:309-316)。

Gould J. et al . ( 1991 ; Plant Physio l . 95:426-434) はトウモロコシの茎頂に針で傷をつけた後カナマイシン抵抗性遺伝子と G U S遺伝子を持った強病原性ァグロパクテリゥム E H A 1を接種し、処理後の茎頂組織をカナマイシンで選抜したところ、抵抗性を示す植物体を得た。この後代の種子の一部は導入した遺伝子を持つことをサザン分析で確認した（キメラ現象）。

Mooney P. A. et al . , (1991 ; Plant Cel l, Tissue, Organ Culture 25:209-21 8)は、ァグロパクテリゥムを用いて小麦の胚にカナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試みた。まず、胚を酵素で処理し、細胞壁に傷をつける処理をし、その後ァグ口パクテリゥムを接種した。処理したカルスのうち極めて少数のカナマイシン抵抗性と思われるカルス力 S増殖したが、このカルスからの植物体の再生はできなかつた。また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認したところ、全ての抵抗性力ルスで導入遺伝子の構造変異が見られた。

Raineri et al. (1990; Bio/Technol . 8:33-38) はイネの胚盤に傷をつけた後、強病原性のァグロパクテリゥム A 2 8 1 (pTiBo542) をイネの 8品種に処理したところ、日本晴、藤坂 5号の 2品種で腫瘍状の組織の増殖が見られた。さらに、 T一 D NAからホルモン合成遺伝子を除いた T iプラスミドにカナマイシン抵抗性遣伝子と G U S遺伝子を挿入したプラスミドを持つァグロパクテリゥムをィネの胚に接種したところカナマイシン抵抗性カルスの増殖が見られた。この抵抗性カルスでは G U S遺伝子の発現が認められたが、形質転換植物を得ることはできなかった。これらのことから、ァグロパクテリゥムの T一 D NAがイネ細胞に導入されたと解釈している。

このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科の作物でもァグロバクテリウムによる遺伝子導入が可能であることを示唆する研究報告が現れてきている力まだ、再現性、導入効率、さらには遺伝子の導入の確認についても完全に説得できる結果を示しているとは言い難い（Potrykus I . 1990 ; B io/Techno 1 . 8: 5 35-543) 。

上述のように、イネ科作物における遺伝子導入法は、エレクト口ポレーシヨン法が主流であるが、プロトプラストを用いるため、再生植物を得るまで長期間を要し、多大な労力がかかり、また長期間の培養により高頻度で変異体が出現するという危険性がある。また、この方法はプロトプラストからの再分化系が確立されていない作物、例えばトウモロコシには適用できない。そこで、上述のように、トウモロコシに対しては、生長点組織を用いることが試みられている（Gould J. et al . , 1991)。しかし、生長点を単離する作業は多くの労力を要し、大量に調製することは必ずしも容易ではない。

発明の開示

従って、本発明の目的は、従来の方法に比較して、形質転換から植物体の再生までの時間が短く、プロトプラストからの植物体の再生系が確立されていない植物に対しても普遍的に適用することができ、さらに用いる材料の調製力 s容易な単子葉植物の形質転換方法を提供することである。

本願発明者らは、ァグロパクテリゥムで処理する単子葉の植物組織、ァグロバクテリウムの処理条件、及びバイナリーベクタ一の構成等が遺伝子導入効率に及ぼす影響等を鋭意研究した結果、単子葉植物の培養組織をァグロパクテリゥム属細菌を用いて飛躍的に高い効率で再現性をもって形質転換することができることを見出し、これによれば上記目的を達成することができることを見出し、本発明を完成した。

ずなわち、本発明は、所望の遺伝子を含有するァグロパクテリゥム属細菌で単子葉植物の脱分化過程にある培養組織又は脱分化した培養組織を形質転換することから成る、単子葉植物の形質転換方法を提供する。

本発明の方法により、イネ、トウモロコシ、コムギ、ォォムギ等のイネ科植物を始めとする単子葉植物に目的の外来遺伝子を再現性良く導入すること力 s初めて可能になった。ァグロパクテリゥムを用いた単子葉植物の形質転換方法はこれまでにもある力前述のとおり確立された方法とは言い難い。しかし、本発明ではこれまでに用いられていない培養組織に本発明で改良した方法でァグロパクテリゥムを接種することにより、極めて容易に遺伝子を導入することができた。本発明の方法では、材料調製が容易なカルス等の培養組織を用いるので、生長点を用いる従来技術に比べて供試材料を容易に得ることができる。また、培養組織を形質転換するので、プロトプラストを形質転換する場合に比べて植物体再生までの時間が短く、変異の頻度が低下する。また、スーパ一バイナリーベクターを用いれば、一部のィネの品種のように培養が困難な品種にも高い効率で遺伝子を導入することが可能になった。さらに、後述の実施例に記載するように、適切な接種後の選抜法を採用すれば、目的遺伝子がキメラ状に導入されるキメラ現象を低減させることもできる。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の方法に用いることができるァグロパクテリゥム属細菌に含まれるプラスミドの一例である PT0K162 の構造と本発明の実施例で用いたプラスミド P T O K 2 3 2の構築方法を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の方法により形質転換される単子葉植物は、特に限定されるものではなく、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ、アスパラガスその他、いかなる単子葉植物にも適用可能である。

また、本発明の方法に供される培養組織は、単子葉植物の脱分化過程にある培養組織又は脱分化した培養組織である。ここで、脱分化過程にある培養組織とは、外植片をオーキシン及びサイトカイニン等の植物生長調節物質を含む培地で培養することにより得られる組織で、カルス及び不定胚様組織が形成される前段階の組織を意味し、脱分化した培養組織とは外植片をオーキシン及びサイトカイ二ン等の植物生長調節物質を含む培地で培養することにより得られるカルス及び不定胚様組織を意味する。本発明で用いられる培養組織はいかなる部位由来のものであってもよく、例えば、胚盤、茎頂、幼根、未熟胚、花粉及び蔚由来のものを挙げることができる。本発明で用いられる培養組織としては、脱分化誘導培地に外植片を置床した後 7日以上経過したカルス形成過程にある培養組織、又はカルス及び不定胚様組織を用いることが好ましい。中でも、カルス及び不定胚様組織を培養組織として用いることが最も好ましい。脱分化誘導培地はこの分野において周知であり、例えば N 6培地（Chu C.C. 1987; Proc. Symp. Plant Tissue Cu lture, Science Press Peking, PP.43- 50)の主要無機塩類及びビタミン類に 2 m g/ 1 2, 4一 D、 l gZlカザミノ酸、 30 g/lショ糖、 2gZlゲルラィトを添加した培地及び L S培地（Linsmaier, E. , and Skoog, F. 1965; Physi ol. Plant 18:100-127) の無機塩及びビタミン類に 100 m g/ 1カザミノ酸、 70 OmgZ 1プロリン、 1. 5mg/l 2, 4— D、 208ノ1ショ糖、 2 . 3 gZ 1ゲルライトを添加した培地等を用いることができる。もっとも、本発明の方法に用いる培養組織は必ずしもカルスである必要はなく、懸濁細胞であつてもよい。

形質転換に用いられるァグロパクテリウム属細菌は、従来より双子葉植物の形質転換に用いられているものを用いることができる。これらのものの多くは Agro bacterium tumefaciens 由来の T iフラスミドのヴィルレンス領域（vir領域) 由来の DN A領域を含むベクターを有しており、植物に付与しょうとする形質を担う遺伝子はこのベクター中に挿入されるか又はこのベクターとは別のプラスミド中に存在し、相同組換え等により T iプラスミド中に vivoで揷入されるものである。また、本願発明者らは、先に、 Agrobacterium tumefaciens A281という強病原性の、形質転換効率が極めて髙ぃ株（Hood E.E. et al.， 1984; Bio/Te chnol. 2:702-709, Hood E.E. et al.， 1986; J. Bacterid . 168:1283-1290, R omari T. et al.， 1986; J. Bacterid . 166:88-94, Jin S. et al.， 1987; J. Bacteriol. 169:4417-4425, Romari T. 1989; Plant Science 60:223-229 ATCC3 7394) に含まれる T iプラスミド pT i B o 542 (Jin S. et al.， 1987: J. Bacteriol. 169:4417-4425) のヴィルレンス領域 (vir領域）由来の DNA領域を含むベクター（本明細書において、このベクターを Γスーパーバイナリーべクター J と呼ぶことがある）を開発した（特開平 4— 222527号）。このようなスーパーバイナリーベクターを本発明において好ましく用いることができる。このようなスーパ一バイナリーベクターの例として PT0K162 (特開平 4一 22 2527号、欧州特許公開第 504869号、米国特許出願第 07 854， 8 44号）を挙げることができる。その構造を図 1に示す。このプラスミドは、大腸菌及び Agrobacterium tumefaciens 中で増殖可能である pT0K154 と呼ばれるプラスミド（T iプラスミドから誘導された公知の PGA472プラスミドと pVCKlOl と呼ばれる公知の広宿主域プラスミドから後述の方法により構築された、 T領域を含むプラスミド）に pTiBo542のヴィルレンス領域由来の既にクローン化されていた上記 15. 2キロベースの Kpnl断片（virB、 virG、 virG各遺伝子を含む）を組み込んだものである。この PT0K154 には、 T領域の 2つの境界配列とその間に単子葉植物に導入しょうとする遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子が配列されており、この例は、単子葉植物に導入しょうとする遺伝子力 SpTiBo542のヴィルレンス領域由来のクローン化された DN A断片を含有するプラスミド上に配置されている例である。なお、図 1中の各符号は次の意味を有する。

S P スぺクチノマイシン抵抗性遺伝子

HPT ハイグロマイシン抵抗性遺伝子

NPT カナマイシン抵抗性遺伝子

TC テトラサイクリン抵抗性遺伝子

I G イントロン GUS遺伝子

BR T— DNAの右ボーダー配列

BL T— DNAの左ボ一ダ一配列

V i r B, C, G 強病原性ァグロパクテリゥム A 281由来の v i r領域 OR I Co l E lの複製開始点

COS ラムダファージの COS部位

K 制限酵素 Kpn l部位

H 制限酵素 H i n dill 部位

単子葉植物に組み込もうとする所望の遺伝子は、上記プラスミドの T領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等の適当な選択マーカ一に基づいて選択することができる。もっとも、図 1に示す PT0R162 のように、大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所望の D N Aを T領域内に導入することが必ずしも容易ではないことがある。このような場合には、 Agrobacterium tumefaciens細胞内の vivo 系での相同組換え（Herrera- Estrella L. et al., 1983; EMBO J. 2:987-995, H orsch R. H. et al . , 1984; Science 223:496-498) を利用することにより、目的の D N Aを PT0K162 に導入することが可能になる。すなわち、例えば、先ず、 pT 0K162 を Agrobacterium tumefaciens に導入しておいて、この菌にさらに所望 D N Aを導入した PBR322と呼ばれるプラスミド（類似のプラスミドを含む）を導入する。 PT0K162 の D N Aには PBR322と相同な部分があるので、 pBR322誘導体は相同配列を介した組み換えにより PT0K162 に組み込まれることになる。 pBR322は pT 0K162 と異なり Agrobacterium tumefaciens 中では複製できないので、このような組み込まれた状態（pT0K162: :pBR322誘導体という）でなければ Agrobacteriu m tumefaciens 中で生存することができない。そして、 pT0K162 と pBR322誘導体のそれぞれに特異的な特性（薬剤耐性等）について選抜すれば、 pT0K162_{: :} pBR32 2 謖導体を有する Agrobacterium tumefaciens を得ることができる。さらに、 pT 0R162 を有する Agrobacterium tumefaciens に各種のプラスミドを導入して研究したところ、 PBR322誘導体の選抜マーカ一としては、トランスポゾン T n 7 (De Greve H. H. et al . , 1981 ; Plasmid 6 :235-248)由来のスぺクチノマイシン耐性遺伝子（S P ) が優れていることが判明した。従って、すでに所望の遺伝子が pB R322にクローン化されている場合には、 S P遺伝子をそのプラスミドに揷入すれば、 Agrobacterium tumefaciens 内の相同組換えにより、 pT0K162 の Τ領域に所望の遺伝子を導入することができる。またその他の場合には、 PBR322由籴の D N Αと S P遺伝子から構成されるプラスミドを用意しておいて、これに所望の遺伝子を挿入する方法も考えられる。この際、 T領域の境界配列を活用すれば、最終的に、 PT0K162 上において、カナマイシン耐性遺伝子と所望の遺伝子を別々の T 領域中に配置することも可能である。カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形質転換した場合、両 T領域とも導入される場合も相当の比率で生じるわけであるので、目的遺伝子の導入は十分達成できる。また、両 T領域が別々の染色体に組み込まれる場合もあり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子から分離することも可能となる。

単子葉植物に導入しょうとする所望の遺伝子は、何ら限定されるものではなく、望まれる性質を付与することができるあらゆる遺伝子が包含される。例えば、除草剤抵抗性遺伝子、抗生物質抵抗性遺伝子、ウィルス病抵抗性を付与するためのウィルスのコート蛋白質遺伝子及び胚乳の澱粉形質閧連遺伝子などを挙げることができる力もちろんこれらに限定されるものではない。

寄主となるァグロパクテリゥム属細菌としては、特に限定されないが、 Agroba cterium tumefaciens を好ましく用いることができる。

プラスミドを Agrobacterium tumefaciens 等のァグロパクテリゥム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法（DiU a G. et al .， 1980; Pro Natl . Acad. Sci. USA 77: 7347-7351) により行うことができる。

このようにして調製されるァグロパクテリゥム属細菌には、 PT0K162 由来のヴィルレンス能力の高い D N Aが含まれるので、高い効率で単子葉植物の形質転換を行うことが可能である。

尚、本発明においては、単子葉植物に導入しょうとする遺伝子は、従来の技術と同様に T領域の境界配列の間に配置されるものである力ァグロパクテリゥム属細菌中で、 T iプラスミド上に配置されてもよく又は他のプラスミド上に配置されてもよい。

ァグロパクテリウム属細菌で単子葉植物の培養組織を形質転換する方法は、培養組織をァグロパクテリゥム属細菌と単に接触させることによリ行うことができる。例えば、 1 06 〜1 O il細胞 Zm 1程度の細胞濃度のァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に培養組織を 3〜1 0分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。あるいは、培養組織の培養液中にァグロパクテリゥム属細菌を添加して共存培養することにより形質転換を行うこともできる。このように、本発明の方法では、培養組織を酵素処理や傷つける等の前処理を行わずに形質転換に供することができる。

形質転換に供試した培養組織は、その後、脱分化過程又は脱分化状態で形質転換細胞又は形質転換組織を選抜することが好ましい。これは当該培養組織をォーキシン、サイトカイニン等の植物生長調節物質を含み、ハイグロマイシン等の選抜マーカー及びァグロパクテリゥム属細菌に対する抗生物質を添加した培地で培養することによリ行うことができる。

選抜した細胞又は組織は公知の方法によリ再分化培養を行うことができる。これにより、形質転換により所望の形質を獲得した植物体を再生することができる以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1

(1) 供試培養組織の調製

(0 イネの品種

日本稲品種、朝の光、月の光及びコシヒカリを選定して供試した。

(ii)胚盤、胚盤カルス

イネの完熟種子を 70%エタノールに 1分間、 1 %次亜塩素酸ナトリウムに 3 0分間浸漬することによって消毒した後、 2N6固体培地（N6の無機塩類及びビタミン類（Chu C.C. 1978; Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Pres s Peking, PP.43- 50) 、 l g/1カザミノ酸、 2mg/ 2,4-D、 30 g/lショ糖、 2 g/lゲルライト）に置床した。また、完熟種子を置床後 4日目に種子より胚盤部位を摘出し胚盤として供試した。完熟種子を約 3週間培養後、形成された胚盤由来のカルスを 2 N 6培地に移植し、 4~ 7日経過したカルスを胚盤カルスとして用いた。

(ϋί) 茎頂組織

ィネの完熟種子を上記の方法で消毒した後、 1 2 N 6固体培地（ 1 2量の N 6の主要無機塩類及び微量塩類、 N 6ビタミン類、 l gZlカザミノ酸、 20 gZlショ糖、 2 gZlゲルライト）に置床し、培養 3日後の幼苗から、頂端分裂組織を含む 2~3 mmの組織を切り出し、材料とした。

(iv)幼根組織、幼根カルス

(iii) の方法で得た幼植物体から種子根の先端部を 5〜10mm切り出して材料とした。また、これらの幼根を 2 N 6固体培地上で約 2週間培養して得たカルスを—幼根カルスとして用いた。

(V) 懸濁培養細胞

(ii)の方法で得た胚盤由来のカルスを AA液体培地（AA主要無機塩類、 AAアミノ酸及び AAビタミン類（Toriyama and Hinata 1985; Plant Science 41:179-183, MS微量塩類 (Murashige and Skoog 1962; Physiol. Plant. 15:473-497) 、 0. 5 g/1 カザミノ酸、 l mg/ 1 2,4- D、 0.2 mg/1力イネチン、 0.1 mg/1ジべレリン、 20 gZlショ糖）に移し、 25°C、暗黒下で 1 20 r pmで振盪することによって懸濁培養細胞を得た。なお、培地の更新は 1週間毎に行った。 (2) T iプラスミド（バイナリ一ベクタ一）

ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（HPT) 及び /5— D—グルクロニダーゼ（G US) 遺伝子を T iプラスミドの T一 DN A領域に組み込んだ、以下のプラスミドを作製した。

(i) pIG121 Hm:ヒマのカタラーゼ遺伝子の第 1イントロンを含む GUS遺伝子と、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子と連結したプラスミド（中村ら、 199 1 ；植物バイオテクノロジ一 II (現代化学増刊、 PP.123-132) 、名古屋大学、中村氏より入手）。

(ii) pTOK232 ：

1. イントロン GUS及びハイグロマイシン抵抗性遺伝子の中間べクタ一 p T〇 Κ 229への導入

Τη 7由来のスぺクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む C 1 a I断片（2. 5 k b) をクレノー処理により末端を平滑化し、これを pUC 19の Sma I部位に挿入し、アンピシリン及びスぺクチノマイシン抵抗性遺伝子を持つプラスミド P TOK1 07 (5. 2 k b) を得た。 p T 0 K 1 07を E c o R I、 H i n dll I で処理し、スぺクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む 2. 5 1)断片を 0 4 82の E c oR I、 H i ndlll 断片（2. 7 k b) と連結し、スぺクチノマイシン抵抗性遺伝子と H i n d III 、 H p a I部位を含む p TOK 170 (5. 2 k b) を得た。

35 Sプロモーターにヒマのカタラーゼの第 1イントロンと GUS遺伝子を連結したベクター P I G 221 (Ohta S. et ah, 1990; Plant Cell Physiol. 31 :805-813, 名古屋大学中村氏より譲渡）を Ec o R Iで切断後クレノー酵素により末端を平滑化し H i n dill リンカ一（pCAAGCTTG；タカラ酒造コ一ド 4660 P) を揷入した。 35 Sプロモータ一及びイントロン GUSを含む断片を H i n dill により切り出し、 35 Sプロモータ一にハイグロマイシン抵抗性遺伝子を連結したプラスミド pGL 2 (J. Paszkowski, Friedrich Mieocher Institute より入手）の H i ndlll 部位に挿入し pGL2— I G (7. 6 k b ) を得た。なお、 pGL2は pDH51 (Pietrazak et al., 1986; Nucleic Ac ids Research 14:5857-5868)にハイグロマイシン抵抗性遺伝子（Gritz L. and Da vis J. 1983; Gene 25:179-188) を揷入したものである。 p TOK 1 7 0を H p a I処理して得られた断片を pGL 2— I Gの P v ull断片（5. 2 k b) と連結し P TOK2 29 ( 1 0. 1 k b) を得た。

2 ) スーパ一バイナリーベクター p T OK 1 6 2への導入

バイナリーベクターに強病原性ァグロバクテリゥム A 2 8 1由来の V i r B、 v i r C、 ν i r G遺伝子を挿入して得たスーパーバイナリーベクター p TOK 1 6 2への目的遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、イントロン GU S遺伝子）の導入は相同組換えによって行った。すなわち、両ベクターは大腸菌プラスミド p B R 3 2 2に由来する部位を持つので、スぺクチノマイシン、カナマイシンで選抜された菌には両プラスミドの組換えによって生じたプラスミドのみが含まれることになる。スーパ一バイナリーベクタ一にハイグロマイシン抵抗性遺伝子、イントロン GU S遺伝子力 S組み込まれたプラスミドを ρ ΤΟΚ23 2と呼ぶ (図 1参照）。

(3) 寄主ァグロパクテリゥム

T-DNA 領域を削除した菌系、 LBA4 04と EHA101とを寄主バクテリアとして使用した。 LBA4 04はへルパープラスミド（ vir領域を完全な形で持つ） PAL4404を有する菌系であり、 American Type Culture Colletion より入手可能である（A TCC 3 7 349) 。 EHA101はへルパープラスミドの vir領域が強病原性ァグ口パクテリゥム A281由来であり、 Hood E. E. et al. 1986から入手可能である。

(2) 項で述べた種々のバイナリーベクターをこれら 2種類のァグロパクテリゥムに導入し、以下の菌系を遣伝子導入用として用いた。これらのプラスミドをァグロパクテリゥムに導入する方法は細菌の三系交雑手法（Ditta G. et al. 1980 ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7351)によった。

LBA4404(pT0K232)

LBA4404(pIG121Hm)

EHA101 (pIG121Hm)

(4) ァグロパクテリゥム懸濁液の調製

ハイグロマイシン（50 ^g/ml) とカナマイシン（50 μg/ \) を含む AB培地（ Dr lica R. A. and Kado C. I. 1974; Proc. Natl Acad. Sci. USA 71:3677-3681) 上で 3〜 10日間培養したァグロパクテリゥムのコロニーを白金耳でかきとり、修正 AA培地（前述の AA培地において、ショ糖を 0.2M、グルコースを 0.2Mに変更し、ァセ卜シリンゴンを 100 M 添加、 pH5.2)に懸濁し、菌濃度を 3~5 X109 細胞ノ m 1に調整し接種に用いた。

(5) 接種条件

供試組織を滅菌水で洗浄後、上述のァグロパクテリウムの懸濁液に 3〜 10分間浸漬した。浸漬処理後、茎頂組織は 100 M ァセトシリンゴン、 lOg/1 グルコ一ス、 20g /1ショ糖を含む N6S3固体培地（1/2 N6主要無機塩類、 N6微量塩類、 N6 ビタミン類、 Chu C.C.1978、 AAアミノ酸（Toriyama and Hinata 1985)， 1 g/ 1 カザミノ酸、 0.2 mg NAA、 1.0 mg/1力イネチン、 3 gZlゲルライト）に、胚盤カルスなどのその他の培養組織はァセトシリンゴン、グルコース、ショ糖を同濃度で含む 2N6固体培地に移植し、 25°C、暗黒下で 2〜5日間培養した。その後、接種組織を 250 mg/1 セフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフォタキシムを含むそれぞれの固体培地で培養を続けた。

(6) GUS活性の調査方法

共存培養処理直後、組織を 0.1 Triton X-100 を含む 0.1 Mリン酸緩衝液（p H6.8)に浸漬し、 37 °Cで 1時間静置した。リン酸緩衝液でァグロパクテリゥムを洗浄除去した後、 0.1 mM 5—プロモー 4一クロロー 3—インドリル一 y5— D—グルコン酸（X - glue) 及び 20%メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。 37°Cで 24時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察し、供試組織数に対する百分率で表した。なお、選抜処理後得られた形質転換体と考えられる植物体での GUS活性の判定に際しては、植物体から葉片を採取し、同様な方法に従って GUS染色を行った。個体ごとの発現様式で、葉片全体又は葉片の切り口が一様に青色に呈色するものを陽性個体、キメラ状に呈色するものをキメラ個体とした。

(7) 形質転換細胞、組織の選抜

(i) 茎頂組織

5日間ァグロパクテリゥムと共存培養した茎頂組織を 250 mg/1セフオタキシムを含む N 6 S 3培地で 2週間培養し、生長した茎頂組織を 4 OmgZ 1ハイグロマイシンを含む N 6 S 3培地に移して、形質転換体の選抜を行った。

(ϋ) 胚盤

3曰間共存培養した胚盤を 25 OmgZlセフォタキシムを含む 2N6培地で 1 週間培養した後、 5 OmgZ 1ハイグロマイシンを含む 2 N 6培地で形質転換細胞の選抜を行った。

(iii) 培養組織（胚盤カルス）

3日間共存培養した培養組織を、 25 OmgZ 1セフォタキシムを含む 2N6 培地で 1週間培養した後、同培養組織を 5 OmgZlハイグロマイシンを含む 2 N 6培地で 3週間培養してハイグロマイシン抵抗性の培養組織を選抜した（ 1次選抜）。得られた抵抗性組織をさらに 5 Omg/ 1ハイグロマイシンを含む N 6 一 12培地（N 6無機塩類、 N 6ビタミン類、 2 gZlカザミノ酸、 0.2 mg/1 2 ，4-D、 0.5 mg/1 6 BA、 5 mg/ 1 ABA、 30 gZlソルビトール、 20 g/1ショ糖、 2 gZ 1ゲルライト）で 2~3週間培養し（2次選抜）、この培地上で増殖したカルスを 0、 20、 5 Om 1ハイグロマイシンを含む個体再生用培地 N6 S 3に移した。なお、共存培養後の培地には全て 25 OmgZ 1セフォタキシムを添加した。

(iv) 懸濁培養細胞一

5日間共存培養した懸濁培養細胞を 25 Omg/ 1セフォタキシムを含む 2 N6 培地で 1週間培養した後、 5 OmgZlハイグロマイシンを含む 2 N 6培地で形質転換細胞の選抜を行った。

(8) 形質転換次世代における導入遺伝子の発現

形質転換次世代の種子を 7 Omg/Ιハイグロマイシンを含む 400倍ホーマイ水和剤水溶液中に播種後、 25°Cで 10日間処理し、ハイグロマイシン抵抗性を調査した。また、形質転換次世代の種子を各 20粒づっ播種し、約 3週間後の苗から葉片を採取し、 GUS遺伝子の発現を調査した。

(9) サザン法による導入遺伝子の分析

品種、朝の光、月の光の形質転換体当代について、小鞠らの方法（Komari et al ·, 1989; Theoretical and Applied Genetics 77:547-552) に従い DNAを抽出し、抽出した DNAに制限酵素 Hindmを処理し、 H P T遣伝子をプローブとし、サザン法による導入遺伝子の検出を行った。バイナリ一プラスミド上の HPT遺伝子を含む Hindm断片の長さは、約 5.5 Kbであり、この領域の T一 DNAの内部の Hindmサイトから Lボーダー配列の末端までの DN A領域の長さは、約 5.4 Kbである（図 1) 。なお、サザン法については Molecular Cloning (Sambrook et al. 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press ) に記載の方法に従って行った。また、 " 月の光" の形質転換次世代の 2系統について、 GUS陽性、 G U S陰性、ハイグロマイシン抵抗性の各個体を 2個体づっ供試し、同様な手法によリサザン分析を行った。

( 10)イネでの供試材料の違いによる遺伝子導入効率（共存培養後における G U S 発現）

ァグロパクテリゥムが単子葉作物の細胞に遺伝子を導入することが可能であることを確認するため、強病原性の V i r領域を持つァグロパクテリゥム EHA 1 0 1にハイグロマイシン抵抗性遺伝子と GUS遺伝子を持つバイナリーベクター pIG121Hm (上述）を導入した菌をイネ品種月の光の種々の組織に処理し、共存培養後に GUS活性を調査した。供試組織は茎頂、幼根、胚盤、幼根カルス、胚盤カルス及び懸濁培養細胞である。ァグロパクテリゥムで処理しなかった場合は、いずれの材料でも青色の GU S発現を示すものは認められなかった。一方、ァグ口パクテリゥム EHA 101 (pIG121Hm) で処理した場合には、幼根を除く組織で GUSの発現が確認された。処理組織数に対する青色を呈する組織の割合では胚盤カルスが最も高かった（表 1) 。さらに、 GUSを発現する組織の大きさでも胚盤カルスが優れていた。胚盤カルスに次いで高い導入率を示した組織は茎頂であった。また、胚盤の脱分化組織である胚盤カルスおよび懸濁培養細胞で高い導入率を示したのに対し、胚盤では明らかに導入効率は低かった。このことは、よリ細胞分裂の活性が高い組織に遺伝子が導入されやすいことを示唆するものである。表 1 #¾¾#©¾いによる GUS適導婢 GSS:月 c¾

+ 1% TF ++ 0% 10% h

この実験で使用したバイナリ一ベクタ一 P I G 1 2 1 H mでは G U S遺伝子のプロモーターの中にヒマのィントロンが揷入されているため、ァグロバクテリウムの細胞の中では G U S遺伝子は発現しないことが確認されている（中村ら、 1 9 9 1 ) 。以上のことから、共存培養後の G U S遺伝子の発現を指標とした場合、ァグロパクテリゥムはイネ細胞に遺伝子を導入できることが確認された。

( 1 1 ) 供試材料の違いによる形質転換組織および細胞の出現効率

共存培養処理を行った茎頂、胚盤、胚盤カルスおよび懸濁培養細胞を用いて、ハィグロマイシンによる形質転換組織および形質転換細胞の選抜を行った。その結果、胚盤カルスおよび懸濁培養細胞でハイグロマイシンに抵抗性を示す形質転換細胞の増殖が認められた（表 2 ) 。また選抜された細胞は、 G U S遺伝子を一様に発現した。共存培養後、 G U S発現の調査で高い遺伝子導入効率を示した茎頂組織は、ハイグロマイシンによる選抜の結果、全ての組織が枯死し、抵抗性組織は得られなかった。茎頂は生長点を含む組織である力遺伝子の導入処理を行つた後、抵抗性組織が増殖するためには、遺伝子が限られた生長点に導入される必要がある。ァグロパクテリゥムとの共存培養処理後、茎頂には多数の遺伝子が導入されているものの抵抗性組織が得られなかったことは、生長点近傍に導入される確率が低いことによると考えられる。また、生長点近傍に遺伝子が導入され形質転換細胞が得られたとしても、得られる植物体がキヌラ性を示す可能性が高いことは容易に推測される。これらのことから、 Gould et al. (1991) により報告されている茎頂を用いた形質転換方法は、カルスなど脱分化組織を用いる方法に比べ、技術的な困難性が高く、再現性の低い手法であると考えられる。

完熟種子の胚盤に由来する培養組織である胚盤カルスや懸濁培養細胞で形質転換細胞が得られたのに対し、胚盤では抵抗性細胞の増殖は認められなかった。また、 Raineri et al. (1990) の方法に従い、傷をつけた胚盤を供試組織として遺伝子導入を試みたが、遺伝子導入効率の向上はみられず、形質転換細胞も得られなかった。これに対し、胚盤カルスを供試組織とした場合には、傷をつけるなどの処理も必要なく、再現性良く、しかも高頻度で形質転換細胞が得られた。これらのことから、ァグロパクテリゥムによる形質転換の供試組織として、脱分化状態または脱分化過程にある培養組織が好適であると判断される。表 2 供試材料の違いによる形質転換組織および細胞の出現効率

(品種：月の光）

( 12)イネの品種による遺伝子導入効率の違い（共存培養後における G U S発現）培養細胞の確立、培養細胞から個体再生に関しては大きな品種間差異が存在する（Mikami and Rinoshita 1988; Plant Cel l Tissue Organ Cult. 12:311-314) 。日本稲の中ではコシヒカリは培養が困難とされている。一方、前項で用いた月の光は比較的培養が容易である。ァグロパクテリゥムによる形質転換法を用いる場合、このような品種間差異があると実用的には不都合である。この点を明らかにするため、コシヒカリと月の光の培養容易性の異なる 2品種を用いてァグロバクテリゥムによる遺伝子導入効率の差異を調査した。供試組織は胚盤カルスとし、ァグロパクテリゥムとしては E H A 1 0 1 (pIG121Hm) 及び L B A 4 4 0 4 ( pIG121Hm) を用いた。

月の光では各実験を通じて 9 0 %以上のカルスで G U S活性が認められたが、コシヒカリではこれより低い率で G U S活性力 S認められた（表 3 ) 。従って、 E H A 1 0 1 (pIG121Hm) あるいは L B A 4 4 0 4 (pIG121Hm) を用いた場合には、導入効率に関する品種間差異があるものと解釈される。 3 ァグロパクテリゥムの！ ¾とイネ π口 © t、による GU S遺 5?©¾λ»

LBA4404(pIG121Hm) EHA101(pIG121Hm) LBA4404(p而 32) 月喊 1 67/70 (96) 78/87 (90) 64/66 (97) 月 ¾ 2 72/86 (84) 68/73 (93) 82/82 (100)

3シヒカリ 1 46/135 (34) 43/116 (37) 124/131 (95) コシヒカリ 2 28/107 (26) 81/143 (57) 102/103 (99)

(13)ァグロバクテリウムの菌系による遺伝子導入効率の違い（共存培養後における GUS発現）

EHA101 (pIG121Hm) はへルパープラスミドに強病原性ァグロバクテリウム A28 1の V i r領域を持つ。 LBA4404 (pIG121Hm) は通常の v i r領域を持つ。一方、 LBA4404 (PT0K232)はへルパープラスミドの V i r領域は通常型である力バイナリ一ベクターに強病原性ァグロパクテリゥム A 281 の v i r領域の一部の遺伝子を有する。そして、このバイナリーベクターは pTOK 162から派生したもので、 LBA4404 (_ΡΤ0Κ162)は双子葉作物の中でも形質転換の困難な植物種に極めて高率で形質転換を可能とした（Saito Y. et al.， 1 992; Theor. Appl. Genet. 83:679-683). このように、強病原性の v i r領域の存在そのもの、あるいは存在形態は形質転換の効率に大きく影響する可能性がある。そこで、強病原性の V i r遺伝子に関して異なる上記の 3種類のァグロパクテリゥムを用いて、 GUS遺伝子の発現に関する導入効率を比較した。なお、供試材料はコシヒカリ、月の光の胚盤カルスである。

強病原性の V i r領域を持たない LBA4404 (_PIGI21Hm) でも両品種とも G U S活性を示す組織が認められたが、コシヒカリではその率は 30 %程度と低かった。ヘルパープラスミドに強病原性の V i rを持つ E HA 101 (pIG121Hm ) ではコシヒカリの導入率はやや上昇した。バイナリーベクターに強病原性の V i rを持つ LBA4404 (pT0K232)ではコシヒカリでも月の光と同様に 95 % 以上の組織で GUS活性が認められた（表 3) 。さらに、 GUS活性を示すそれぞれの組織での青色領域の面積に関しては、 LBA4404 (ΡΤ0Κ232)で最も大きく、高い導入率を示すことが観察された。

(14)菌系の違いによる選抜効率（ハイグロマイシン耐性カルス）

上項と同じ 3つの菌系を用いて、月の光、コシヒカリの胚盤カルスとの共存培養後のハイグロマイシン抵抗性カルスの選抜率に関する比較を行った。抵抗性力ルスの出現率に関しては LBA4404 (ΡΤ0Κ232)が最も高く、抵抗性カルスの選抜率に関する品種間差異は認められなかった（表 4) 。 LBA4404 (pIGl 21Hm) あるいは EHA 101 (pIG121Hm) の 2つの菌系では、選抜率は低く、さらに培養困難なコシヒカリではハイグロマイシン抵抗性カルスの出現は 2 %程度にとどまった。従って、イネの形質転換に用いるァグロパクテリゥムとしてはバイナリーベクターに強病原性の V i r遣伝子の一部を持つ L B A 4 4 0 4 (pTOK 232)が最も優れていると判定される。

ァグロバクテリウムの縣の違いによる形: 率の違い讓カルス）

ノ、ィグロマイシン^:性力ルス力ルス数（％) 菌系難 LBA4404(pIG121Hm) EHA101 (pIG121Hm) LBA4404(pT0K232) 月の光 1 91/338 (27) 139/301 (46) 169/305 (55) 月の光 2 59/421 (14) 66/425 (16) 110/360 (31) 月の光 3 10/521 ( 2) 174,644 ( 27) 月 4 20/349 ( 6) 100/349 (29) コシヒカリ 1 6/269 ( 2) 65/283 (23)

( 15)ハイグロマイシン耐性形質転換体における G U S遺伝子の発現様式このようにして得られた抵抗性カルスをさらに 2次選抜にかけ、抵抗性カルスから個体を再生させた。再分化用の培地 N 6 S 3にハイグロマイシンを添加した区と無添加の区を設定したが、無添加の場合には、 G U S活性がない個体あるいはキメラ状に活性を示す個体が多数出現した。しかし、再分化培地にハイグロマィシンを添加した場合はこのような個体は大幅に減少し、個体全体で G U S活性を示す再生個体力 S増加した（表 5、表 6、表 7 ) 。なお、ァグロパクテリゥムで処理しなかった場合には、ハイグロマイシン抵抗性あるいは G U S活性を示す個体は得られなかった。従って、このようなハイグロマイシン抵抗性カルスから再生した G U S活性を全面に示す個体は形質転換体と考えられる。

表 5 ハイグロマイシン抵抗性カルスから再分化した植物における G U S遺伝子の発現（品種：朝の光）

(固体の再分化まで培地にはハイグロマイシンを添加）表 6 ハイグロマイシン抵抗性カルスから再分化した植物における G U S 遺伝子の発現（品種：月の光）

(個体の再分化まで培地にハイグロマイシンを添加）表 7 ハイグロマイシン抵抗性カルスから再分化した植物における G U S 遺伝子の発現（品種：朝の光）

(個体の再分化まで培地にハイグロマイシンを添加） ( 1 6 ) 形質転換体の倍数性および種子稔性

得られた形質転換体は、温室内で栽培することにより正常な生長を示し、外観から 4倍体や奇形を示す個体は全く認められなかった。種子稔性についても、一部に部分不稔ゃ完全不稔を示す個体もみられたが、大部分の個体がほぼ正常な稔性を示した。

( 1 7 ) 形質転換当代および次世代における導入遺伝子の発現と分析

形質転換体の全 D NAを Hindmで切断した D NA断片に対して、 H P T遺伝子をプローブとしたサザン法により形質転換体当代における導入遺伝子の検出を行つた。その結果、供試した全ての個体で 1〜数コピーの導入遺伝子の存在が認められた（表 8，表 9 ) 。プラスミド PT0K232 の中では H P T遣伝子を含む HindlH断片は 5.5 Kb であるのに対し、供試したすべての形質転換体には、約 6 Kb 以上のバンドが認められた。このことは、 T一 D NAが植物染色体へ組み込まれたことを裏付けるものである。なお、検出された D N A断片の長さが個体で各々異なつていたことは、ィネの染色体への遣伝子導入箇所がそれぞれ異なることを示すものであり、植物体内でのパクテリァの残存によるものではないことが確認された。

形質転換次世代個体のハイダロマイシン抵抗性を調査したところ、対照品種の種子では、ほとんど発芽を示さないかもしくは発芽後の生長は著しく阻害された。これに対し、形質転換体から得られた種子の多くは、正常な発芽と生長を示した（表 8 , 表 9 ) 。また、これら.のハイグロマイシン抵抗性個体は、 G U S遺伝子の発現も認められた。多くの系統ではハイグロマイシン抵抗性、 G U S遺伝子の発現ともに 1因子分離にほぼ適合する逍伝的分離を示した。表 8における" 朝の光" の形質転換系統 1一 2および 3— 2は、分離比から 2因子以上の導入遺伝子の存在が推測されるが、サザン解析の結果も 2 因子分離に適合していた。表 8 の 2— 1の形質転換個体では、 2コピーの導入遣伝子の存在を確認したが、このうちの一本のバンドは 5 Kb より短い断片であり、 T一 D NAが不完全な形で組み込まれたものと推測される。従って、この個体は次世代でハイグロマイシン抵抗性について 1因子様の分離を示したものと考えられる。

表 9では" 月の光" の形質転換系統の多く力次世代でハイグロマイシン抵抗性および G U S遺伝子の発現について 1因子様の分離を示した。しかし、当代のサザン分析では一部の個体が 1コピーであったほかは、複数のコピー数を示した。形質転換当代のサザン分析により、導入遺伝子が 1 コピーであった 1 8 aおよび 2コピーであった 1 6 cの次世代 2系統について、 G U S陽性、 G U S陰性、ハイグロマイシン抵抗性の各個体を 2個体づっ供試し、サザン分析を行った。その結果、 G U S陰性の個体を除くすべての個体で、形質転換当代の個体と同一のバンドが検出され、導入遺伝子が形質転換次世代に遺伝していることが示された。 2コピーの導入遺伝子を持つ系統 1 6 cについても、 G U S陽性およびハイグロマイシン抵抗性の各次世代個体で、いずれも同一な 2コピーの導入遺伝子を有していたことは、同一の染色体または遺伝子座に複数の遺伝子が組み込まれたことを示唆するものである。

これらの結果は、ァグロパクテリゥムによりイネに導入された遺伝子力植物細胞の核に組み込まれ、メンデルの法則に従って、後代に遺伝したことを示すものである。

8 サザン解析による形質転換体における導入遺伝子のコピー数および形質転換次世代における導入遺伝子の発現（品種：朝の光）

* 2コピーの導入遺伝子のうち 1つは制限断片が短く、導入遺伝子は不完全

9 サザン解析による形質転換体における導入遗伝子のコピー数および形質転換次世代における導入遺伝子の発現（品種：月の光）次世代個体数導入遺伝子ハイグロマイシン抵抗性 G U S発現形質転換個体コピー数

抵抗性感受性陽性陰性対照一 0 6 0 0 2 0

1 1 4 6 2 6 1 5 5

2 a 2 3 3 1 8 1 3 5

2 b 2 3 1 9 1 5 5

3 2 2 9 1 0 1 6 3

4 a 3 2 2 2 1 1 3 7

4 b 3 4 8 1 1 1 6 3

5 a 3 2 6 1 3 1 7 3

5 b 3 3 6 1 4 1 7 3

5 c 3 2 4 9 1 7 2

6 2 4 7 1 3

7 1 5 6 2 0 1 4 5

8 4 4 5 2 2

9 1 5 2 1 8 1 8 2

1 0 4 5 3 1 0

1 1 2 7 5 1 5 1 8 2

1 2 3 4 4 7 1 4 6

1 3 a 2 3 3 1 8 1 5 5

1 3 b 2 3 2 8 1 3 7 表 9 (続き）

*次世代についてサザン法による導入遺伝子の分析を行った。

実施例 2

( 1 ) トウモロコシ品種

トウモロコシ品種 A188， Fl (A188 x Black Mexican Sweet), Fl (A 188 x B73Ht) , Fl (B73Ht x A188) , Fl P3732 を材料として選定した。 A188， Black Mexican Sweet, B73Htのいずれの各品種は農林水産省生物資源研究所から、また、 P3732 は磐田酪農協同組合から各々入手した。

( 2 ) 生長点近傍組織の調製

完熟種子を 70% エタノールに 1分間、 1 次亜塩素酸ナトリウムに 5分間浸漬した。滅菌水で 3回洗浄後、 LS固体培地（Linsmaier and Skoog の無機塩およびビタミン類； Linsmaier, E. and Skoog, F. 1965; Physiol. Plant 18: 100-127、 10 O mg/1カザミノ酸、 700 mg/lプロリン、 20 g/1ショ糖、 2.3 g/1 ゲルライト）に置床した。 25°C、暗黒下で 4日間培養後、発芽した幼苗から頂端分裂組織を含む約 0.1 X 0.3腿の組織を切り出し以下の実験に供試した。

(3) 未熟胚由来カルスの調整

未熟胚を L S D 1. 5固体培地（Linsmaier and Skoog の無機塩およびビタミン類、 100mg/l カザミノ酸、 700mg/l プロリン、 1.5mg/l 2,4-D 、 20g/l ショ糖、 2.3g/lゲルライト）に置床した。 3週間培養後、形成された胚盤由来カルスを以下の実験に供試した。

(4) ァグロパクテリゥムの菌系

実施例 1に示したァグロバクテリウムの菌系のうち、 LBA 404(pTOK232)および EH A101(pIG121Hm)を用いた。

(5) ァグロパクテリゥム懸濁液の調整

ハイグロマイシン（50 mg/l ) とカナマイシン（50 mg/l ) を含む AB培地上で 3-10日間培養したァグロパクテリゥムのコロニーを白金耳でかきとり、実施例 1に示した修正 A A培地に懸濁し、菌濃度を 3〜5X 109 細胞/ m lに調整 ,し接種に用いた。

( 6 ) 生長点近傍組織への接種、培養条件

切り出した組織をガラス針で穿刺後、上述のァグロパクテリゥム懸濁液に 3~ 1 0分間浸漬した。浸漬処理後、 100 ァセトシリンゴン、 20 g/1 ショ糖、 1 0 g/1 グルコースを含む修正 L S固体培地（Linsmaier and Skoog の無機塩類、 Murashige and Skoog のヒタミン； Murashige, T. and Skoog, F. 1962; Phys iol. Plant. 15:473-497, 0.1 mg/l 力イネチン、 1.0 mg/l カザミノ酸、 2.3 g/1 ゲルライト）に移植し、 25°C、照明下で 2~3日間培養した。その後、 250 mg/lセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフォタキシムを含む L S 固体培地で培養を続けた。

(7) カルスへの接種、培養条件

カルスを前述のァグロパクテリゥム懸濁液に約 5分間浸漬後、実施例 1に示したァセトシリンゴンを含む 2N 6固体培地に移植し、 25°C、暗黒下で 3日間共存培養をおこなった。その後カルスを 250mg/l セフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフオタキシムおよび 30mgハハイグロマイシンを含む L SD 1 · 5 固体培地で培養を続け、形質転換カルスの選抜を行った。

(8) G US活性の調査方法

共存培養処理直後の茎頂組織およびカルス、その後培養を継続した茎頂組織およびカルスについて実施例 1の方法にもとづき GU S活性を調査した。

(9) 茎頂組織への遺伝子導入

Gould らの報告（Gould J., et al. 1991; Plant Physiol. 95:426-434) による生長点組織（茎頂組織）を材料とした形質転換が可能である事を確認するため、前述のァグロバクテリウム菌系 EHA101(pIG121Hm)を単離した茎頂組織に処理し、生長した植物体での G US活性を調査した。ァグロパクテリゥム非処理の組織では、いずれも GU S遺伝子の発現はみられなかったが、ァグロパクテリゥム処理した組織では針で穿剌した部分に G U S遺伝子の発現が小さな点状に認められた。し力、し、その後培養を続けた植物体で GUS活性を調査したところ、 GUS遺伝子の発現を示すものは全くなかった。生長点近傍は非常に微細な組織であり、そこに穿刺しァグロパクテリゥムを感染させることは容易でない。本実験の結果から生長点近傍へのァグロバクテリゥムによる形質転換には生長点の切リ出し、穿刺などに熟練した技術が必要であると考えられた。

10 トウモロコシ茎頂組織への遺伝子導入

供試品種はいずれも P 3732

( 10) トウモロコシの品種および供試菌系による遺伝子導入効率の違い供試したいずれの品種でも高頻度で GU S遺伝子の発現がみられた。 EHA 10

1 (pIG121Hm)、 LBA4404 (pT0R232) の菌系間での遺伝子発現効率の差は認められなかった（表 10) 。処理カルスに対する GUS染色部位の大きさも 10 %以上のものが多く、広範囲の細胞で遺伝子発現が示された。供試したァグロバクテリウムのバイナリベクター P I G 12 l Hmおよび PTOK232は GUS 遺伝子中にヒマのィントロンが介在しているため、ァグロパクテリゥムの細胞の中では GU S遺伝子を発現しない。このことから、トウモロコシのカルスにおいて認められた G U S遺伝子の発現は、ァグロパクテリゥムにより高頻度で遺伝子導入が行われたことを示すものである。共存培養後、ハイグロマイシンを含む固体培地上で培養することにより、供試カルスの一部でコンパクトでこぶ状のカルスカ S増殖した。増殖した細胞は GUS遺伝子の発現を示したことから、形質転換細胞であると考えられる。これらのコンパクトでこぶ状の形質転換カルスは Lupo tto らの方法（Lupotto, E. and Lusardi, M. C. 1988; Maydica XXXI 11 : 163-17 7 ) により再分化可能である。

表 1 1 トウモロコシカルスへの GUS遺伝子の導入効率

BMS: Black Mexican Sweet

菌系 l:EHA101(pIG121Hm)， 2:LBA4404(pT0R232)

Claims

口 s求 - の範囲

I . 所望の遺伝子を含有するァグロパクテリゥム属細菌で単子葉植物の脱分化過程にある培養組織又は脱分化した培養組織を形質転換することから成る単子葉植物の形質転換方法。

2 . 前記単子葉植物がィネ科植物である請求項 1記載の方法。

3 . 前記単子葉植物がイネである請求項 1記載の方法。

4 . 前記の単子葉植物がトウモロコシである請求項 1記載の方法。

5 . 前記ァグロパクテリゥム属細菌は、 T iまたは R iプラスミドを持つァグロバクテリウム属細菌であって、 Agrobacterium tumefaciens の T iプラスミド P T i B o 5 4 2のヴィルレンス領域由来の D N A断片を含むプラスミドを導入したァグロパクテリゥム属細菌である請求項 1ないし 4いずれか 1項に記載の方法。

6 . 前記 D N A断片を含むプラスミドは PT0K162又はその誘導体である請求項 5記載の方法。

7 . 前記ァグロパクテリゥム属細菌は、 Agrobacterium tumefaciens である請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法。

8 . 形質転換操作に用いるァグロパクテリゥム属細菌の菌濃度が 1 06 ~ 1 0 u細胞 Zm 1である請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の方法。

9 . 前記の培養組織を酵素処理や傷つけるなどの前処理を行わず形質転換に供する請求項 1ないし 8のいずれか 1項に記載の方法。

1 0 . 前記の培養組織を形質転換に供試した後、脱分化過程または脱分化状態で形質転換細胞または形質転換組織を選抜する請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の方法。

I I . 前記脱分化過程にある培養組織は、外植片を脱分化誘導培地に置床後 7 日以上のカルス形成過程にある培養組織である請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の方法。

1 2 . 前記培養組織が単子葉植物の体細胞由来の培養組織である請求項 1ないし 1 1のいずれか 1項に記載の方法。

1 3 . 培養組織が正常な個体を再生する能力を有する組織である請求項 1ないし 1 2のいずれか 1項に記載の方法。